CN113583114B - 针对SARS-CoV-2的抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域,特别是SARS‑CoV‑2的诊断、预防和治疗领域。具体而言,本发明涉及抗SARS‑CoV‑2的单克隆抗体,以及包含所述抗体的组合物(例如,诊断剂和治疗剂)。此外,本发明还涉及所述抗体的用途。本发明的抗体可用于诊断、预防和/或治疗SARS‑CoV‑2感染和/或由所述感染引起的疾病(例如,COVID‑19)。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域,特别是SARS-CoV-2 的诊断、预防和治疗领域。具体而言,本发明涉及抗SARS-CoV-2的单克隆抗体,以及包含所述抗体的组合物(例如,诊断剂和治疗剂)。此外,本发明还涉及所述抗体的用途。本发明的抗体可用于诊断、预防和/或治疗SARS-CoV-2感染和/或由所述感染引起的疾病(例如, COVID-19)。
背景技术
冠状病毒(coronavirus)感染可导致人类发生呼吸系统疾病,轻症冠状病毒感染可导致流感样症状,重症感染则可发展为严重病毒性肺炎,威胁人类生命健康。冠状病毒可同时感染人类与动物,一些动物源冠状病毒如果突破宿主屏障感染人类,可能在人群中快速扩散并导致严重疾病。
目前,尚无批准用于预防或治疗SARS-CoV-2感染的特效药物。应对SARS-CoV-2感染引起的肺炎患者仅给予一般的支持性治疗,氧疗措施和抗病毒治疗,如α-干扰素、洛匹那韦/利托那韦、磷酸氯喹等,这些措施带来的临床效果有限。研究发现,在新冠肺炎的恢复者体内通常伴随着较高水平的SARS-CoV-2中和抗体产生。在国家卫健委发布的新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)中,对病情进展较快、重型和危重型患者推荐进行康复者血浆治疗。有研究数据表明,对确证患有 COVID-19并同时伴有严重呼吸窘迫综合征(ARDS)的危重症患者使用含有中和抗体的康复期血浆治疗后,病人体内的病毒载量迅速降低,患者的临床症状得到有效改善。这些研究表明了体液免疫在SARS- CoV-2中的重要性,且表明了除了疫苗研发外,应当研制一种能够高效和特异性中和SARS-CoV-2的单克隆抗体,用于COVID-19的短期预防和有效治疗,这对我国乃至全球防治COVID-19具有重要意义。
SARS-CoV-2是一个含包膜的单链正义RNA病毒,基因组与 SARS-CoV和一些蝙蝠冠状病毒高度同源。SARS-CoV-2至少含有三种膜蛋白,包括表面刺突蛋白(S)、整合膜蛋白(M)和膜蛋白(E)。 SARS-CoV-2的受体与SARS-CoV一样,均是通过S蛋白上的受体结合结构域(Receptor binding domain,RBD)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ACE2)特异性结合后接到了病毒的膜融合和入胞,在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。因此,通过干扰S蛋白与ACE2 的结合就能中和病毒的感染。所以,S蛋白尤其是RBD区域是冠状病毒中和抗体的主要来源和识别区域,RBD蛋白是制备SARS-CoV-2中和抗体的理想抗原。
目前,SARS-CoV-2正在席卷全球,极大的影响了人类社会经济发展,给人民生命安全造成巨大的威胁。因此,发展能够治疗或预防 SARS-CoV-2感染的抗体等药物对防控相关疫情具有重要意义。
发明内容
在本申请中,发明人开发了具有优良性质的人源抗体,其能够中和 SARS-CoV-2,阻断或抑制SARS-CoV-2与受体ACE2的结合,且不易引发人受试者的免疫原性反应。因此,本发明的抗体具有用于预防和/ 或治疗SARS-CoV-2感染或由SARS-CoV-2感染所导致的疾病的潜力,具有重大的临床价值。
本发明的抗体
在第一方面,本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段,其特异性结合SARS-CoV-2的S蛋白的受体结合区(RBD),所述抗体或其抗原结合片段包含:
(a)包含下述3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs) 的重链可变区(VH):
(i)VH CDR1,其由下述序列组成:SEQ ID NO:3,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,
(ii)VH CDR2,其由下述序列组成:SEQ ID NO:4,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,和
(iii)VH CDR3,其由下述序列组成:SEQ ID NO:5,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;
和/或,
(b)包含下述3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs) 的轻链可变区(VL):
(iv)VL CDR1,其由下述序列组成:SEQ ID NO:6,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,
(v)VL CDR2,其由下述序列组成:SEQ ID NO:7,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,和
(vi)VL CDR3,其由下述序列组成:SEQ ID NO:8,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中,(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含:如下3个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs:序列为SEQ ID NO:3的VH CDR1,序列为SEQ ID NO:4的VH CDR2,序列为SEQ ID NO:5 的VH CDR3;和/或,如下3个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs:序列为SEQID NO:6的VL CDR1,序列为SEQ ID NO:7的VL CDR2,序列为SEQ ID NO:8的VL CDR3。
在某些实施方案中,如上所述的抗体或其抗原结合片段,其包含:
(a)如下3个重链CDRs:序列为SEQ ID NO:3的VH CDR1,序列为SEQ ID NO:4的VHCDR2,序列为SEQ ID NO:5的VH CDR3;和/或,如下3个轻链CDRs:序列为SEQ ID NO:6的VLCDR1,序列为SEQ ID NO:7的VL CDR2,序列为SEQ ID NO:8的 VL CDR3;
或,
(b)如SEQ ID NO:1所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;优选地,所述VH中含有的3个CDR和/或所述VL中含有的3个CDR 由Kabat、IMGT或Chothia编号系统定义。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列。在某些实施方案中,所述人免疫球蛋选自人重排抗体序列或人胚系抗体序列。在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含:来源于人重排抗体序列的重链框架区序列,以及来源于人重排抗体序列的轻链框架区序列。在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含:来源于人重链胚系序列的重链框架区序列,以及来源于人轻链胚系序列的轻链框架区序列。
在某些实施方案中,如上所述的抗体或其抗原结合片段,其包含:
(a)重链可变区(VH),其包含选自下列的氨基酸序列:
(i)SEQ ID NO:1所示的序列;
(ii)与SEQ ID NO:1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;或
(iii)与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列;
和
(b)轻链可变区(VL),其包含选自下列的氨基酸序列:
(iv)SEQ ID NO:2所示的序列;
(v)与SEQ ID NO:2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;或
(vi)与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少80%、至少85%、至少 90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。
在某些实施方案中,(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含:包含如SEQ ID NO:1所示的序列的VH和包含如SEQ ID NO:2所示的序列的VL。
在第二方面,本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段,其特异性结合SARS-CoV-2的S蛋白的受体结合区(RBD),所述抗体或其抗原结合片段包含:
(a)包含下述3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs) 的重链可变区(VH):
(i)VH CDR1,其由下述序列组成:SEQ ID NO:11,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,
(ii)VH CDR2,其由下述序列组成:SEQ ID NO:12,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,和
(iii)VH CDR3,其由下述序列组成:SEQ ID NO:13,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;
和/或,
(b)包含下述3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs) 的轻链可变区(VL):
(iv)VL CDR1,其由下述序列组成:SEQ ID NO:14,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,
(v)VL CDR2,其由下述序列组成:SEQ ID NO:15,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,和
(vi)VL CDR3,其由下述序列组成:SEQ ID NO:16,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中,(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含:如下3个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs:序列为SEQ ID NO:11的VH CDR1,序列为SEQ ID NO:12的VH CDR2,序列为SEQ ID NO:13 的VH CDR3;和/或,如下3个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs:序列为SEQ ID NO:14的VL CDR1,序列为SEQ ID NO:15的VL CDR2,序列为SEQ ID NO:16的VLCDR3。
在某些实施方案中,如上所述的抗体或其抗原结合片段,其包含:
(a)如下3个重链CDRs:序列为SEQ ID NO:11的VH CDR1,序列为SEQ ID NO:12的VHCDR2,序列为SEQ ID NO:13的VH CDR3;和/或,如下3个轻链CDRs:序列为SEQ ID NO:14的VLCDR1,序列为SEQ ID NO:15的VL CDR2,序列为SEQ ID NO:16 的VL CDR3;
或,
(b)如SEQ ID NO:9所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;优选地,所述VH中含有的3个CDR和/或所述VL中含有的3个CDR 由Kabat、IMGT或Chothia编号系统定义。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列。在某些实施方案中,所述人免疫球蛋选自人重排抗体序列或人胚系抗体序列。在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含:来源于人重排抗体序列的重链框架区序列,以及来源于人重排抗体序列的轻链框架区序列。在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含:来源于人重链胚系序列的重链框架区序列,以及来源于人轻链胚系序列的轻链框架区序列。
在某些实施方案中,如上所述的抗体或其抗原结合片段,其包含:
(a)重链可变区(VH),其包含选自下列的氨基酸序列:
(i)SEQ ID NO:9所示的序列;
(ii)与SEQ ID NO:9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;或
(iii)与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列;
和
(b)轻链可变区(VL),其包含选自下列的氨基酸序列:
(iv)SEQ ID NO:10所示的序列;
(v)与SEQ ID NO:10所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;或
(vi)与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。
在某些实施方案中,(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含:包含如SEQ ID NO:9所示的序列的VH和包含如SEQ ID NO:10所示的序列的VL。
在第三方面,本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段,其特异性结合SARS-CoV-2的S蛋白的受体结合区(RBD),所述抗体或其抗原结合片段包含:
(a)包含下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):
(i)VH CDR1,其由下述序列组成:SEQ ID NO:19,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,
(ii)VH CDR2,其由下述序列组成:SEQ ID NO:20,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,和
(iii)VH CDR3,其由下述序列组成:SEQ ID NO:21,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;
和/或,
(b)包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):
(iv)VL CDR1,其由下述序列组成:SEQ ID NO:22,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,
(v)VL CDR2,其由下述序列组成:SEQ ID NO:23,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,和
(vi)VL CDR3,其由下述序列组成:SEQ ID NO:24,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中,(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含:如下3个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs:序列为SEQ ID NO:19的VH CDR1,序列为SEQ ID NO:20的VH CDR2,序列为SEQ ID NO:21 的VH CDR3;和/或,如下3个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs:序列为SEQ ID NO:22的VL CDR1,序列为SEQ ID NO:23的VL CDR2,序列为SEQ ID NO:24的VLCDR3。
在某些实施方案中,如上所述的抗体或其抗原结合片段,其包含:
(a)如下3个重链CDRs:序列为SEQ ID NO:19的VH CDR1,序列为SEQ ID NO:20的VHCDR2,序列为SEQ ID NO:21的VH CDR3;和/或,如下3个轻链CDRs:序列为SEQ ID NO:22的VLCDR1,序列为SEQ ID NO:23的VL CDR2,序列为SEQ ID NO:24 的VL CDR3;
或,
(b)如SEQ ID NO:17所示的重链可变区(VH)中含有的3个 CDR;和/或,如SEQ IDNO:18所示的轻链可变区(VL)中含有的3 个CDR;优选地,所述VH中含有的3个CDR和/或所述VL中含有的 3个CDR由Kabat、IMGT或Chothia编号系统定义。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列。在某些实施方案中,所述人免疫球蛋选自人重排抗体序列或人胚系抗体序列。在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含:来源于人重排抗体序列的重链框架区序列,以及来源于人重排抗体序列的轻链框架区序列。在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含:来源于人重链胚系序列的重链框架区序列,以及来源于人轻链胚系序列的轻链框架区序列。
在某些实施方案中,如上所述的抗体或其抗原结合片段,其包含:
(a)重链可变区(VH),其包含选自下列的氨基酸序列:
(i)SEQ ID NO:17所示的序列;
(ii)与SEQ ID NO:17所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;或
(iii)与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列;
和
(b)轻链可变区(VL),其包含选自下列的氨基酸序列:
(iv)SEQ ID NO:18所示的序列;
(v)与SEQ ID NO:18所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;或
(vi)与SEQ ID NO:18所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。
在某些实施方案中,(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含:包含如SEQ ID NO:17所示的序列的VH和包含如SEQ ID NO:18所示的序列的 VL。
在第一至第三方面中任一方面的某些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的恒定区。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含来源于人免疫球蛋白(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的重链恒定区,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于人免疫球蛋白(例如κ或λ) 的轻链恒定区。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含:
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体,所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如,至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合;例如1个,2个,3个,4个或 5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合);和/或
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体,所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如,至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合;例如1个,2个,3个,4个或 5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)。
在某些实施方案中,所述重链恒定区是IgG重链恒定区,例如 IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。
在某些实施方案中,所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含:人 IgG重链恒定区(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区)或其变体,所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换 (例如,例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换),并且,所述变体与其所源自的野生型序列相比具有基本不变的效应子功能(例如, ADCC和/或CDC活性),或者具有改变的效应子功能(例如,增强、降低或消除的ADCC活性,和/或,增强、降低或消除的CDC活性)。
在某些示例性实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:25所示的重链恒定区(CH)。
在某些示例性实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:26所示的轻链恒定区(CL)。
在第一至第三方面中任一方面的某些实施方案中,所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体 (diabody)和单域抗体(sdAb)。
在第一至第三方面中任一方面的某些实施方案中,所述抗体为人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
在第一至第三方面中任一方面的某些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段具备以下特征中的1项、2项、3项、4项、5项、6项或全部7项:
(1)特异性结合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD;
(2)以小于约100nM,例如小于约50nM、40nM、30nM、20nM或更低的KD结合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD;优选地,所述KD通过表面等离子共振技术(例如Biacore)测定;
(3)以小于约100ng/mL,例如小于约90ng/mL、80ng/mL或更小的EC50结合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD;优选地,所述EC50可以通过ELISA法测定;
(4)阻断或抑制SARS-CoV-2对Ace2受体的结合,和/或阻断或抑制SARS-CoV-2对细胞的感染;
(5)不影响或基本上不影响SARS-CoV-1对Ace2受体的结合;
(6)在体外或受试者(例如人)体内中和SARS-CoV-2;
(7)预防和/或治疗SARS-CoV-2感染或由SARS-CoV-2感染所导致的疾病(例如COVID-19)。
在本文中,本发明任一方面所述的抗体或其抗原结合片段可以包括这样的变体,所述变体与其所源自的抗体或其抗原结合片段相比差异仅在于一个或多个(例如,至多20个、至多15个、至多10个、或至多5 个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换,或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性,且基本保留了其所源自的抗体或其抗原结合片段的上述生物学功能。
衍生的抗体
本发明任一方面所述的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化,例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常,单克隆抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如,标记)不会不利影响其对SARS- CoV-2的结合。因此,本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如,可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团,例如另一个抗体(例如,形成双特异性抗体),检测试剂,药用试剂,和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如,抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。此外,本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生,例如聚乙二醇 (PEG),甲基或乙基,或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性,例如增加血清半衰期。
在某些实施方案中,本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如异硫氰酸素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
在本文中,本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的,其实例包括但不限于,酶(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶,等)、放射性核素(例如,3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如,异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如 Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质,如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如,)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如,聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶,等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如,链霉亲和素)的生物素。
在某些实施方案中,所述可检测的标记能够适用于免疫学检测(例如,酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。
在某些实施方案中,可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段,以降低潜在的位阻。
抗体的制备
本发明任一方面所述的抗体可以本领域已知的各种方法来制备,例如通过基因工程重组技术来获得。例如,通过化学合成或PCR扩增 (例如,巢氏PCR)获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内,然后转染宿主细胞。然后,在特定条件下培养转染后的宿主细胞,并表达本发明的抗体。
本发明任一方面所述的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto et al.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117 (1992)and Brennan etal.,Science 229:81(1985))。另外,这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed in Hudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999);Little et al.,Immunol.Today,21:364-370 (2000))。比如,Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得;可以将Fab’片段化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外,Fv、Fab或F(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
因此,在另一个方面,本发明提供了一种分离的核酸分子,其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段,或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在某些实施方案中,所述分离的核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段,或其重链可变区和/或轻链可变区。
在另一个方面,本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体),其包含本发明的分离的核酸分子。在某些实施方案中,本发明的载体是例如质粒,粘粒,噬菌体等。
在另一个方面,本发明提供了一种宿主细胞,其包含本发明的分离的核酸分子或本发明的载体。此类宿主细胞包括但不限于,原核细胞例如大肠杆菌细胞,以及真核细胞例如酵母细胞,昆虫细胞,植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞,例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些实施方案中,本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞,例如CHO(例如 CHO-K1、CHO-S、CHODG44)。
在另一个方面,提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法,其包括,在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下,培养本发明的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
检测方法和试剂盒
在另一个方面,本发明提供了一种试剂盒,其包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。在某些实施方案中,所述试剂盒还包括第二抗体,其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中,所述第二抗体还包括可检测的标记。
在某些实施方案中,所述试剂盒可以进一步包含用于使相应可检测的标记被检测到的试剂。例如,当所述可检测的标记为酶时,所述试剂盒还可以包含相应酶的显色底物,例如用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺 (OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS或鲁米诺类化合物,或用于碱性磷酸酶的对硝基苯磷酸酯(p-NPP)或AMPPD。例如当所述可检测的标记为化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)时,所述试剂盒还可以包含用于化学发光的预激发液和/或激发液。
在另一个方面,本发明提供了检测SARS-CoV-2或其S蛋白或S蛋白的RBD在样品中的存在或其水平的方法,其包括使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中,所述检测是免疫学检测,例如酶免疫测定法 (例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。
在某些实施方案中,所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂 (例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如异硫氰酸素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
在某些实施方案中,所述方法还包括,使用携带可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如异硫氰酸素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素的第二抗体来检测所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中,所述方法包括:(1)将所述样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触;(2)检测抗原-抗体免疫复合物的形成或检测所述免疫复合物的量。所述免疫复合物的形成表明存在SARS- CoV-2或其S蛋白或S蛋白的RBD。
在某些实施方案中,所述方法可以用于诊断目的,例如可以根据 SARS-CoV-2或其S蛋白或S蛋白的RBD在样品中的存在或其水平来诊断受试者是否感染了SARS-CoV-2。在此类实施方案中,所述样品可以为来自受试者(例如哺乳动物,优选人)的血液样品(例如,全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。
在某些实施方案中,所述方法可以用于非诊断目的,例如所述样品并非来自受试者的样品,例如疫苗样品。
在某些实施方案中,所述受试者是哺乳动物,例如人。
在另一个方面,提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测SARS-CoV-2或其S蛋白或S蛋白的 RBD在样品中的存在或其水平,和/或用于诊断受试者是否感染了 SARS-CoV-2。
在某些实施方案中,所述检测是免疫学测定,例如酶免疫测定法 (例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。
在某些实施方案中,所述试剂盒通过如上所述的检测方法来检测SARS-CoV-2或其S蛋白或S蛋白的RBD在样品中的存在或其水平,以及任选地根据所述检测结果诊断受试者是否感染了SARS-CoV-2。
在某些实施方案中,所述样品为来自受试者(例如哺乳动物,优选人)的血液样品(例如,全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。
治疗方法和药物组合物
在另一个方面,本发明提供了一种药物组合物,其含有本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段,以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些实施方案中,所述药物组合物还包含另外的药学活性剂,例如另外的抗病毒剂,如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等。
在某些实施方案中,在所述药物组合物中,本发明的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为单一组合物的组分提供。因此,本发明的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。
在某些示例性实施方案中,所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中,此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9%(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5%葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01%聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
在另一个方面,本发明提供了用于中和SARS-CoV-2的方法,其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。所述方法可用于在体外或受试者(例如人)体内中和SARS-CoV-2。
在某些实施方案中,所述方法用于中和样品中SARS-CoV-2的毒力。在某些实施方案中,所述方法包括:将包含SARS-CoV-2的样品与本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物接触。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段单独使用,或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂,如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等)联合使用。
在另一个方面,本发明提供了用于预防或治疗受试者的SARS- CoV-2感染或与SARS-CoV-2感染相关的疾病(例如COVID-19)的方法,其包括:给有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段单独使用,或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂,如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等)联合使用。
在某些实施方案中,所述受试者是哺乳动物,例如人。
在另一个方面,本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途,所述药物用于:
(1)在体外或受试者(例如人)体内中和SARS-CoV-2;和/或
(2)用于预防或治疗受试者的SARS-CoV-2感染或与SARS-CoV-2 感染相关的疾病(例如COVID-19)。
在某些实施方案中,所述单克隆抗体或其抗原结合片段单独使用,或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂,如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等)联合使用。
在某些实施方案中,所述受试者是哺乳动物,例如人。
本发明的抗体或其抗原结合片段、或者本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型,例如,片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如,可通过下述方法来制备无菌注射溶液:在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的重组蛋白,以及任选地,同时掺入其他期望的成分(包括但不限于,pH调节剂,表面活性剂,佐剂,离子强度增强剂,等渗剂、防腐剂、稀释剂,或其任何组合),随后过滤除菌。此外,可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如,通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中,例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9%(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5%葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01%聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
本发明的抗体或其抗原结合片段、或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用,包括但不限于,口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部 (如,粉剂、药膏或滴剂),或鼻腔途径。但是,对于许多治疗用途而言,优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注,皮下注射,腹膜内注射,肌内注射)。技术人员应理解,给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段、或药物组合物通过静脉注射或推注给予。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段。“预防有效量”是指,足以预防,阻止,或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指,足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明的抗体或其抗原结合片段的治疗有效量可根据如下因素发生变化:待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄,体重和性别,药物的施用方式,以及同时施用的其他治疗等等。
在本发明中,可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如,可以单次给药,可以在一段时间内多次给药,或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。
在本发明中,所述受试者可以为哺乳动物,例如人。
术语定义
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的,“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)”,旧称为“新型冠状病毒”或“2019-nCov”,属于其β冠状病毒属,为含包膜的单链正义RNA病毒。SARS-CoV-2的基因组序列是本领域技术人员已知的,可参见例如GenBank:MN908947。SARS-CoV-2至少含有三种膜蛋白,包括表面刺突蛋白(S)、整合膜蛋白(M)和膜蛋白(E)。 SARS-CoV-2的受体与SARS-CoV一样,均是通过S蛋白上的受体结合结构域(Receptor binding domain,RBD)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ACE2)特异性结合后接到了病毒的膜融合和入胞,在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。
如本文中所使用的,术语“新型冠状病毒肺炎”和“COVID-19”是指,因SARS-CoV-2感染而导致的肺炎,二者具有相同的含义,可互换使用。
如本文中所使用的,术语“S蛋白”和“spike蛋白”是指, SARS-CoV-2的表面刺突蛋白,其上具有受体结合结构域(RBD)。“S 蛋白”和“spike蛋白”二者具有相同的含义,可互换使用。
如本文中所使用的,术语“抗体”是指,通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包含大约 3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区 (CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域 CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q) 的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区 (CDR)),其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991)),或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如,其包括,重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体,例如,IgG(例如,IgG1,IgG2,IgG3或IgG4亚型),IgA1,IgA2,IgD,IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的,术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。这些氨基酸残基的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义,例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol. 196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体,本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且,不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如,可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
在本发明中,本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT 编号系统确定。在某些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat编号系统确定。
在一些情况下,抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv),其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见,例如,Bird等人,Science 242:423 426(1988)和Huston 等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879 5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构:NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL- COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如,可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头,但也可使用其变体(Holliger等人(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444- 6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi等人(2001),Eur.J.Immunol.31:94-106,Hu等人 (1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov等人(1999),J.Mol. Biol.293:41-56和Roovers等人(2001),CancerImmunol.描述。
在一些情况下,抗体的抗原结合片段是双抗体,即,双价抗体,其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达,但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对,从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见,例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444 6448(1993),和Poljak R.J. 等人,Structure 2:1121 1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如,重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体获得抗体的抗原结合片段(例如,上述抗体片段),并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中,除非上下文明确指出,否则当提及术语“抗体”时,其不仅包括完整抗体,而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的,术语“单克隆抗体”是指,来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段,也即,除可能自发出现的自然突变外,一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的,其通常包含至少2种或更多种的不同抗体,这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。
如本文中所使用的,术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指,这样的抗体,其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类),且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类),但无论如何,其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P4,816,567to Cabilly et al.;Morrison et al.,Proc.Natl. Acad.Sci.USA,81:68516855(1984))。例如,术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体,其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如个体人抗体序列),而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例如人共有胚系抗体序列)。
为制备嵌合抗体,可使用本领域已知的方法将一个抗体的可变区连接至另一个抗体(例如人免疫球蛋白)的恒定区。例如,将编码 VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区的另一DNA分子以获得全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242),包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区,但是通常优选为IgG1或 IgG4恒定区。例如,将编码VL的DNA可操作的连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子以获得全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242),包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR 扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区,但通常优选为κ恒定区。
如本文中所使用的,术语“人源化抗体”是指,经基因工程改造的非人源抗体,其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言,人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体 (供体抗体),全部或部分的非CDR区(例如,可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质,包括但不限于,抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。供体抗体可以是有预期性质(例如,抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如,食蟹猴)抗体。
如本文中所使用的,术语“胚系抗体基因(germline antibody gene)”或“胚系抗体基因片段(germline antibody gene segment)”是指,存在于生物体的基因组中的编码免疫球蛋白的序列,其没有经历过能够导致表达特异性免疫球蛋白的遗传学重排及突变的成熟过程。相应地,术语“重排抗体序列”是指,已经历过能够导致表达特异性免疫球蛋白的遗传学重排及突变的成熟过程而产生的特异性抗体的序列。在本发明中,表述“重链胚系基因”是指,编码免疫球蛋白重链的胚系抗体基因或基因片段,其包括V基因(variable)、D基因 (diversity)、J基因(joining)和C基因(constant);类似地,表述“轻链胚系基因”是指,编码免疫球蛋白轻链的胚系抗体基因或基因片段,其包括V基因(variable)、J基因(joining)和C基因(constant)。在本发明中,由所述胚系抗体基因或胚系抗体基因片段所编码的氨基酸序列也称为“胚系序列(germline sequence)”,由重链胚系基因所编码的氨基酸序列称为重链胚系序列,由轻链胚系基因所编码的氨基酸序列称为轻链胚系序列。胚系抗体基因或胚系抗体基因片段及其相应的胚系序列是本领域技术人员熟知的,并且可从专业数据库(例如,IMGT、 UNSWIg、NCBI或VBASE2)获得或查询。
如本文中所使用的,术语“载体(vector)”是指,可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的,包括但不限于:质粒;噬菌粒;人工染色体,例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于,逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件,包括但不限于,启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的,术语“宿主细胞”是指,可用于导入载体的细胞,其包括但不限于,如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等的原核细胞,如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞,或者如纤维原细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa细胞,BHK细胞,HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中使用的,术语“特异结合”是指,两分子间的非随机的结合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中,特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指,抗体以小于大约10-5M,例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或 10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本文中所使用的,术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数,其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小,抗体-抗原结合越紧密,抗体与抗原之间的亲和力越高。通常,抗体以小于大约10-5M的解离平衡常数(KD)结合抗原。例如,本发明的单克隆抗体3C11、5C6、6G9能够以大约10-8M(nM水平)的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如,新型冠状病毒的S蛋白)。
如本文中所使用的,术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合,从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性,具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增,从而抑制或消除病毒的感染。
如本文中所使用的,术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如,两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据,或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据),那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如,如果两个序列的10个位置中有6个匹配,那么这两个序列具有60%的同一性。例如,DNA序列CTGACT和 CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常,在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用,例如,可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.,4:11-17(1988))的算法,使用PAM120权重残基表(weight residuetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外,可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法,使用Blossum 62矩阵或PAM250 矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、 4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的,术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如,可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换,例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质,包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸) 的氨基酸。因此,优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的 (参见,例如,Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993); Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc. NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997),其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如,Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren, Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),其以引用的方式并入本文中。在本发明中,术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中,氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如,丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的,术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂,其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995),并且包括但不限于:pH调节剂,表面活性剂,佐剂,离子强度增强剂,稀释剂,维持渗透压的试剂,延迟吸收的试剂,防腐剂。例如,pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子,阴离子或者非离子型表面活性剂,例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂,例如对羟苯甲酸酯,三氯叔丁醇,苯酚,山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水,水性缓冲液(如缓冲盐水),醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂,例如硫柳汞,2-苯氧乙醇,对羟苯甲酸酯,三氯叔丁醇,苯酚,山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义,其能够稳定药物中的活性成分的期望活性,包括但不限于谷氨酸钠,明胶,SPGA,糖类(如山梨醇,甘露醇,淀粉,蔗糖,乳糖,葡聚糖,或葡萄糖),氨基酸(如谷氨酸,甘氨酸),蛋白质(如干燥乳清,白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中,所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中,此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9%(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液 (例如5%葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01%聚山梨醇20)、 pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
如本文中所使用的,术语“预防”是指,为了阻止或延迟疾病或病症或症状在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的,术语“治疗”是指,为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的,有益或所需的临床结果包括但不限于,减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即,不再恶化)疾病的状态,延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部),无论是可检测或是不可检测的。此外,“治疗”还可以指,与期望的存活期相比(如果未接受治疗),延长存活期。
如本文中所使用的,术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如,预防疾病有效量是指,足以预防,阻止,或延迟疾病的发生的量;治疗疾病有效量是指,足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如,对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄,体重和性别,药物的施用方式,以及同时施用的其他治疗等等。
发明的有益效果
本申请的单克隆抗体(例如3C11抗体、5C6抗体、6G9抗体)能够以高亲和力与新型冠状病毒S蛋白结合,并且对新型冠状病毒具有很强的中和活性。因此,本申请的单克隆抗体(例如3C11抗体、5C6抗体、6G9抗体)具有诊断、预防和治疗新型冠状病毒感染的临床应用价值。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。
附图说明
图1显示了单克隆抗体3C11与S2P蛋白的ELISA检测结果。
图2显示了单克隆抗体5C6与S2P蛋白的ELISA检测结果。
图3显示了单克隆抗体6G9与S2P蛋白的ELISA检测结果。
图4显示了上清(3C11-Sup)与RBD蛋白的动力学分析结果。
图5显示了上清(5C6-Sup)与RBD蛋白的动力学分析结果。
图6显示了上清(6G9-Sup)与RBD蛋白的动力学分析结果。
图7显示了单克隆抗体(3C11)与RBD蛋白的动力学分析结果。
图8显示了单克隆抗体(5C6)与RBD蛋白的动力学分析结果。
图9显示了单克隆抗体(6G9)与RBD蛋白的动力学分析结果。
图10显示了单克隆抗体3C11与SARS-CoV2 VSVpp假病毒的中和活性;其中,nCoV-3C11为单抗,MOCK为对照。
图11显示了不同浓度的单克隆抗体3C11与SARS-CoV2 VSVpp假病毒的中和活性。
图12显示了不同浓度的单克隆抗体5C6与SARS-CoV2 VSVpp假病毒的中和活性。
图13显示了不同浓度的单克隆抗体6G9与SARS-CoV2 VSVpp假病毒的中和活性。
图14显示了单克隆抗体3C11对于RBD蛋白和ACE2结合的阻断结果。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1:序列的描述
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具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明,本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法,基本上参照J.Sambrook等人,分子克隆:实验室手册,第2 版,冷泉港实验室出版社,1989,以及F.M.Ausubel等人,精编分子生物学实验指南,第3版,John Wiley&Sons,Inc.,1995中所述的方法进行;限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓,实施例以举例方式描述本发明,且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1:单克隆抗体序列的获得
采集新冠患者的咽拭子进行荧光定量PCR检测,间隔一周再次检测,若两次均为阴性则判定为新冠恢复者。采集新冠恢复者的静脉血 10mL,使用含EDTA的抗凝管保存。
1.外周血单个核细胞(PBMC)的制备:
采用密度梯度离心法,在采集的静脉血中按1:1的比例加入 1640细胞培养基。吹吸混匀后以与静脉血相同体积的Ficoll溶液作为底层溶液,缓慢加入静脉血与培养基的混合溶液置于上层。400g,4℃下分别进行2次40min离心,离心完成后收集Ficoll和培养基交界处的悬浮细胞,即为PBMC。800g,4℃下进行10min离心,以与静脉血相同体积的10%DMSO冻存液重悬细胞,将细胞1mL每管分装于细胞冻存管中,保存于液氮罐。
2.抗RBD蛋白的特异性B细胞筛选:
RBD-小鼠Fc蛋白分别标记FITC荧光和Biotin,使用ELISA检测标记效果。取冻存于液氮罐的细胞,1500rpm,4℃离心3min吸去上清,保留细胞。使用PBS重悬细胞以洗涤冻存液,以1mL的量分装到EP管中,重复上述离心操作,吸去上清后每管加入100uL如表 2所示的染料体系吹吸混匀,置于4℃避光冰浴30min。
表2.染料体系
拿出冰浴完成的细胞,重复上述离心操作后吸去上清,每管加入 100uL如表3所示的染料体系吹吸混匀进行第二轮染色,置于4℃避光冰浴30min。
表3.染料体系
分选RBD特异性的记忆B细胞到每孔含有25uL如表4所示的裂解液的96孔板中,每孔一个细胞。完成后吸取含有单个细胞的20uL 裂解液到PCR板中,进行反转录。反转录完成后,进行巢氏PCR,分别扩增抗体轻、重链可变区序列。第一轮扩增完成后,使用第一轮产物进行第二轮巢氏PCR。扩增结束后,挑取重链和轻链配对的 PCR产物,使用凝胶回收试剂盒回收,送测序,将测序结果在两个数据库进行比对和分析,数据库网址如下:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast;
http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquestlivret=0&Option=humanIg。
表4.裂解液体系
3.表达单克隆抗体的重组质粒的构建
在VH基因的上、下游引物5’端分别加上Age I酶切位点和Sal I 酶切位点;VL基因的上、下游引物5’端分别加入Age I酶切位点和 BsiW I酶切位点。在保证引物特异性的前提下(特异性结合区建议设为 18-25nt),在引物的5’端加入交叠序列(overlap)。使用引物分别扩增编码抗体VH和VL的核苷酸序列,对载体进行酶切,采用Gibson 装配的方式将扩增的VH和VL序列分别构建到哺乳动物表达载体 PTT5-H(SEQ ID NO:27)和PTT5-K(SEQ IDNO:28)上。将抗体重链可变区序列插入PTT5-H的Age I和Sal I酶切位点之间,抗体轻链可变区序列插入PTT5-K的Age I和BsiW I酶切位点之间。
表达载体构建完成后,脂质体法瞬时转染HEK293T细胞,进行单克隆抗体的表达。转染前12小时,将104细胞接种到96孔细胞培养板中。A管:10μL Opti-MEM中加入0.2μg IgH质粒和0.2μg IgK 质粒,B管:10μL Opti-MEM中加入0.4μL Transfection Reagent (诺唯赞公司2000)。将A、B管分别轻柔混匀,室温静置 5min,再将稀释好的质粒(A管)滴加至稀释的转染试剂(B管)中,轻柔混匀,室温孵育10min。将质粒-转染试剂复合物滴加至细胞中,置于细胞培养箱中培养。48h后,收集细胞上清,3000rpm,4℃下离心5min。取上清,弃去细胞碎片沉淀。抗SARS-CoV-2受体结合区蛋白RBD阳性单克隆抗体通过间接法ELISA进行筛选,筛选与RBD 具有特异反应性的单克隆抗体。
4.单抗序列的获得
经过上述实验,获得了三株特异性反应单克隆抗体,将其命名为 3C11、5C6及6G9。经测序,人源单克隆抗体3C11重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,3C11轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示;人源单克隆抗体5C6重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示,5C6轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示;人源单克隆抗体6G9重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示, 6G9轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
进一步,还使用Kabat等人描述的方法(Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,Public Health Service,美国国立卫生研究院,贝塞斯达、马里兰州(1991),第647-669页),确定了3C11、5C6及6G9的CDR序列。其中,3C11的重链CDR1-3 如SEQ ID NO:3-5所示,3C11的轻链CDR1-3如SEQ ID NO:6-8所示;5C6的重链CDR1-3如SEQ ID NO:11-13所示,5C6的轻链 CDR1-3如SEQ ID NO:14-16所示;6G9的重链CDR1-3如SEQ ID NO:19-21所示,6G9的轻链CDR1-3如SEQ ID NO:22-24所示。
实施例2:单克隆抗体的制备与纯化
准备处于对数生长期的悬浮细胞ExpiCHOTM,将其置于125rpm, 37℃,8%CO2的细胞摇床进行培养,至密度为6×106/mL,活细胞率>98%。取25mL细胞置于新的细胞培养瓶中,作为一个转染体系。 A管:1mL ExpiCHOTM Expresssion Medium中包含12.5ug IgH质粒和12.5ug Igκ质粒,B管:1mL ExpiCHOTM Expresssion Medium中包含80uLExpiFectamineTM CHO Transfection Kit中的转染试剂。将A管与B管混合,室温静置2min,2min后将混合液倒入 25mL准备好的转染细胞体系中。置于125rpm,37℃,8%CO2细胞摇床进行培养18-22h。每瓶加入ExpiFectamineTM CHO Transfection Kit中的150uL增强剂以及4mL辅料,置于125rpm,32℃,5%CO2的细胞摇床培养8-15d。培养完成后,4℃,4000rpm离心10min,收集细胞上清。
用0.22um滤器过滤上述上清。打开AKTA仪器,先分别用A液 (200mM十二水合磷酸氢二钠)和B液(100mM一水柠檬酸)冲洗A管道和B管道,装上protein A柱子。用A液以8mL/min的流速平衡 protein A柱子15min以上,待仪器检测的UV值、pH值和电导率稳定后进行下一步。以6-10mL/min流速上样,随后UV值会上升,该峰为穿透峰,并继续用A液洗柱,同时收集穿透峰样品待检测。待 pH值不再变化后用B液以6-10mL/min流速进液,随后pH值下降,UV值上升,该峰为洗脱峰,抗体主要存在于洗脱峰中。收取洗脱峰样品待检测。用A液平衡柱子,再用20%乙醇充满管道和protein A柱子,取下柱子,4℃保存。将穿透峰和洗脱峰的样品进行纯化,并进行SDS–PAGE鉴定(对样品进行沸水煮5min,可以使抗体重链和轻链间的二硫键打开,见《分子克隆实验指南》第二版)。纯化的单克隆抗体用20mM PBS缓冲液透析过夜,并采用紫外分光或者BCA测取浓度,分装至1.5mL管中,存放于-20℃备用。
实施例3:单抗与S2P蛋白的特异反应性
参考SARS-CoV-2基因序列(Genbank:NC_045512.2),选取S 蛋白的胞外段编码第15-1213位氨基酸的核苷酸序列,在其C端添加凝血酶折叠序列,T4三聚化原件和His纯化标签。并将编码S蛋白的第682到685位氨基酸的核苷酸序列用“AGAG”替代,编码第986- 987位用氨基酸的核苷酸序列用“PP”替代,将该克隆命名为S-2P。将其克隆至杆状病毒昆虫表达载体pAcgp67B上进行重组杆状病毒制备,利用载体上的信号肽在昆虫细胞中进行分泌表达,利用亲和层析纯化获得S2P蛋白。
将S2P蛋白用pH9.6的50mM CB缓冲液(NaHCO3/Na2CO3缓冲液,终浓度为50mM,pH值为9.6)稀释,终浓度为0.5μg/mL。在 96孔酶标板的每孔中加入100μL的包被液,2~8℃包被16~24小时后,再37℃包被2小时。用PBST洗涤液(20mM PB7.4,150mM NaCl,0.1%Tween20)洗涤1次。然后每孔加入200μL的封闭液 (含有20%小牛血清及1%酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液),放入37℃封闭2小时,弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。
取实施例1中获得的单克隆抗体3C11、5C6及6G9,以SD-1溶液从100ug/mL为起始浓度开始5倍梯度稀释,共稀释8个梯度。取已包被S2P的酶标板,每孔加入100μL已稀释的抗体样品,置于37℃温箱反应60分钟。将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4,150mM NaCl,0.1%Tween20)洗涤5遍,每孔加入100μL辣根过氧化物酶 (HRP)标记的羊抗人IgG反应液,置于37℃温箱反应30分钟。完成酶标记物反应步骤后,将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4,150mMNaCl,0.1%Tween20)洗涤5遍,每孔加入50μL TMB显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司),置于37℃温箱反应15分钟。完成显色反应步骤后,在反应完的酶标板中每孔加入50μL终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司),并于酶标仪上检测各孔的 OD450/630值。人源单克隆抗体3C11、5C6及6G9与S2P的反应性判定:根据反应后的读值进行判定。若检测值/本底值大于5,则判定为阳性。
结果分析:ELISA实验结果如图1、2、3所示。检测结果显示, 3C11、5C6及6G9与S2P重组蛋白的EC50数值分别为0.07402ug/mL、 0.001414ug/mL和0.01124ug/mL,具有良好的结合活性。
实施例4:单克隆抗体与RBD蛋白的特异结合能力
使用Biacore 8K系统对单克隆抗体和抗原进行结合的动力学分析 (参照操作手册进行),所有步骤都在PBS缓冲液下进行。采用该公司配套的Protein A芯片捕获1:50稀释的小量表达上清和稀释为 25nM的单克隆抗体。检测小量表达上清时将RBD抗原分别稀释为200nM、100nM、50nM、25nM和12.5nM五个梯度,按照下述程序进行:捕获(Captue)60s,分析(Analyte)60s,解离(Dissociation)60s,再生(Regeneration)30s。检测单克隆抗体时抗原分别稀释为200nM、 175nM、150nM、125nM、100nM五个梯度,按照下述程序进行:捕获(Captue)60s,分析(Analyte)120s,解离(Dissociation)200s,再生(Regeneration)60s。采用仪器配套数据采集和分析软件进行亲和力平衡解离常数的计算。
上清(3C11-Sup、5C6-Sup、6G9-Sup)与RBD蛋白结合的动力学分析如图4、5、6所示,单抗(3C11、5C6、6G9)与RBD蛋白结合的动力学分析如图7、8、9所示。具体计算结果如下所示,小量表达上清(3C11-Sup、5C6-Sup、6G9-Sup)与RBD蛋白的KD值分别为5.42x10-9、2.82x10-9和1.12x10-8,单抗3C11、5C6及6G9与RBD 蛋白的KD值分别为1.98x10-8、1.22x10-10和4.38x10-9。
实施例5:单克隆抗体与SARS-CoV-2VSVpp假病毒的中和活性
为构建携带SARS-CoV-2spike蛋白(S蛋白)的VSV假病毒,根据人密码子偏好性,对SARS-CoV-2毒株的spike基因(序列来源 GenBank:MN908947)的序列进行密码子优化,以在人细胞中表达。将SARS-CoV-2的S蛋白的C末端截短18个氨基酸,将此蛋白命名为SARS-CoV-2Sde18,并将此蛋白的核苷酸序列克隆到真核表达载体pCAG中,将此载体命名为pCAG-nCoVSde18。将载体pCAG- nCoVSde18转染到Vero-E6细胞中,以表达SARS-CoV-2Sde18蛋白。转染48小时后,将VSVdG-EGFP-G(获自Addgene,31842)病毒接种到上述细胞中,孵育1小时。然后去除上清液中的VSVdG- EGFP-G病毒,并加入抗VSV-G大鼠血清以阻断残留的VSVdG-EGFP-G的感染。获得的子代病毒为携带SARS-CoV-2Sde18蛋白的 VSV假病毒,将假病毒命名为SARS-CoV-2VSVpp。VSVdG-EGFP- G感染24小时后,收集细胞上清,然后离心并过滤(孔径为0.45-μm, Millipore,SLHP033RB)以去除细胞碎片,-80℃下保存备用。
通过PiggyBac转座子系统在BHK21细胞中整合hACE2的基因。将含有hACE2基因的转座子载体(SBI system biosciences,PB514B- 2)和转座酶质粒共转染到BHK21细胞中,通过嘌呤霉素抗性和红色荧光进行筛选,获得稳定表达hACE2的细胞BHK21-hACE2。将抗体3C11、5C6及6G9稀释到2ug/mL作为梯度1,3倍向下梯度稀释,共6个梯度,将梯度稀释的抗体与稀释的SARS-CoV-2VSVpp假病毒 (MOI=0.05)混合,并在37℃孵育1h(所有样品和病毒均用10% FBS-DMEM稀释)。将上述80μL混合物加入预先铺板的BHK21- hACE2细胞中。孵育12小时后,采用基于转盘共聚焦的高内涵成像系统(Opera phenix或Operetta CLS,购自Perkinelmer公司)对感染后的细胞进行荧光成像。完成后采用Columbus图像管理分析软件对所获荧光图像进行定量分析检测绿色荧光阳性细胞数量。计算出与未处理的对照孔相比,抗体处理组的GFP阳性细胞数量减少的百分比,计算抑制率。
结果如图10-13所示,与对照相比,单抗3C11、5C6及6G9具有显著的中和活性,尤其在浓度为0.22μg/mL的条件下仍能阻断80%的假病毒感染。其半抑制浓度(IC50)分别为62.87ng/mL、 4.064ng/mL和0.5602ng/mL。
实施例6:单克隆抗体交叉阻断能力分析
参考SARS-CoV2-2全基因序列(MN908947.3),将编码RBD蛋白核苷酸序列按人类偏好的密码子进行优化,获得其优化的核苷酸序列。在密码子优化的RBD核苷酸序列的N端连接上编码信号肽的核苷酸序列,C端连接上编码绿色荧光蛋白mGamillus(简称mGam) 的核苷酸序列,将此核苷酸序列的C端连接上便于亲和层析纯化的多聚组氨酸多肽(6×His或8×His),最终获得融合荧光蛋白探针的 RBD,简称为SARS-CoV2-RBG。将编码SARS-CoV2-RBG的核苷酸序列连接到真核表达载体中,把构建好的重组载体转染至ExpiCHO 细胞(购自Thermofisher公司)中进行表达纯化。
参考Genebank上已经公布的病毒基因组序列SARS-CoV-1 (AAP13567.1),将其RBD序列参考上述SARS-CoV2-RBG的方法构建RBD与mGamillus的融合荧光蛋白探针,简称为SARS-CoV1- RBG。将SARS-CoV1-RBG的编码序列连接到真核表达载体中,把构建好的重组质粒转染至ExpiCHO细胞(购自Thermofisher公司)中进行表达纯化。
在ACE2基因(NM_021804.1)的C端融合编码表达红色荧光蛋白mRuby3(中间以柔性氨基酸linker连接)的核苷酸序列,获得的序列简称为hACE2mRb3,将该序列克隆至本室构建的PiggyBac(PB) 转座子载体MIHIP-CMVmie载体,获得MIHIP-CMVmie- hACE2mRb3载体,该载体可在细胞内表达hACE2mRb3蛋白。使用Lipofectamine 3000转染试剂(购自Thermofisher公司)将MIHIP-CMVmie-hACE2mRb3载体与Super PiggyBac Transposase表达质粒 (购自System Biosciences公司)共同转染至293T细胞中(按照质量比4:1),转染4小时后换液,继续培养24小时后将细胞传代至 10cm细胞培养皿,并更换为含有2μg/mL嘌呤霉素(购自InvivoGen 公司)加压筛选,每24小时更换含杀伤抗性培养液。含嘌呤霉素培养液6-7天后,存活的细胞经过显微镜观察确认为mRuby3红色荧光蛋白阳性,表明成功整合。将稳转的细胞株命名为293T-ACE2iRb3。
将293T-ACE2iRb3细胞按照15000细胞/孔的密度铺板至黑色玻璃底,培养12-24小时,待其贴壁备用。将SARS-CoV2-RBG探针稀释至合适浓度(20-30nM),与不同稀释倍数的抗体稀释液混合,使抗体终浓度以50nM为梯度1,2倍梯度稀释,共10个梯度。移去原细胞培养板中的50μL培养基,将制备好的混合液,50μL加入细胞培养板中,37℃孵育60分钟。不经洗涤直接使用Opera Phenix共聚焦型高内涵系统进行成像分析,成像荧光通道包括Ex488/Em510(绿色荧光蛋白检测通道,探针信号)、Ex561/Em592(红色荧光蛋白检测通道,ACE2)、Ex641/Em670(近红外荧光蛋iRFP670成像通道,细胞核),使用20倍或者40倍水浸镜头至少拍摄25个视野(共聚焦模式)。完成后将数据上传至Columbus图像管理分析软件,并使用该软件进行定量图像分析。分析参数包括:细胞核iRFP670阳性细胞数(N,要求>1000个)、细胞膜红色荧光(ACE2-mRuby3,用于质细胞孔间差异)信号强度(均值)、细胞质绿色荧光信号强度(均值、SD,反映被细胞结合并摄入的蛋白探针的量)。
实验结果如图14所示,单克隆抗体3C11可阻断SARS-CoV-2受体结合区RBD蛋白对ACE2受体的结合,未能阻断SARS-CoV-1受体结合区RBD蛋白对ACE2受体的结合。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公布的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 养生堂有限公司;厦门大学
<120> 针对SARS-CoV-2的抗体及其用途
<130> IDC210055
<150> 202010366324.2
<151> 2020-04-30
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 3C11重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Leu Val Ala Ser Tyr Arg Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 3C11轻链可变区(VL)的氨基酸序列
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Val
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 3C11重链CDR1的氨基酸序列
<400> 3
Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn Tyr
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 3C11重链CDR2的氨基酸序列
<400> 4
Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 3C11重链CDR3的氨基酸序列
<400> 5
Ala Arg Gly Leu Val Ala Ser Tyr Arg Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 3C11轻链CDR1的氨基酸序列
<400> 6
Gln Asp Ile Thr Asn Tyr
1 5
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 3C11轻链CDR2的氨基酸序列
<400> 7
Asp Ala Ser
1
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 3C11轻链CDR3的氨基酸序列
<400> 8
His Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Val Thr
1 5
<210> 9
<211> 124
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 5C6重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Met Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Val Ala Ala Ala Gly Ser Ser Ser Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 5C6轻链可变区(VL)的氨基酸序列
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Tyr
85 90 95
Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 5C6重链CDR1的氨基酸序列
<400> 11
Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr Ala
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 5C6重链CDR2的氨基酸序列
<400> 12
Met Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 5C6重链CDR3的氨基酸序列
<400> 13
Ala Arg Glu Gly Val Ala Ala Ala Gly Ser Ser Ser Asp Ala Phe Asp
1 5 10 15
Ile
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 5C6轻链CDR1的氨基酸序列
<400> 14
Gln Ser Ile Ser Asn Phe
1 5
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 5C6轻链CDR2的氨基酸序列
<400> 15
Ala Ala Ser
1
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 5C6轻链CDR3的氨基酸序列
<400> 16
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Tyr Ser
1 5
<210> 17
<211> 127
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 6G9重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Ile Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Pro Pro Tyr Asn Trp Asn Gly Pro Leu Arg Ser Gln
100 105 110
Arg Phe Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 6G9轻链可变区(VL)的氨基酸序列
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Asn Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 6G9重链CDR1的氨基酸序列
<400> 19
Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 6G9重链CDR2的氨基酸序列
<400> 20
Ile Asn Pro Ile Ser Gly Gly Thr
1 5
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 6G9重链CDR3的氨基酸序列
<400> 21
Ala Arg Asp Leu Pro Pro Tyr Asn Trp Asn Gly Pro Leu Arg Ser Gln
1 5 10 15
Arg Phe Asp Cys
20
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 6G9轻链CDR1的氨基酸序列
<400> 22
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 23
<211> 3
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 6G9轻链CDR2的氨基酸序列
<400> 23
Asp Ala Ser
1
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 6G9轻链CDR3的氨基酸序列
<400> 24
Gln His Tyr Asp Asn Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 25
<211> 330
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 人IgG1重链恒定区
<400> 25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 人κ轻链恒定区
<400> 26
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 27
<211> 1150
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PTT5-H(AgeI/ SalI)
<400> 27
cttgagtgac atgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccaggtccaa 60
gtttaaacgg atctctagcg aattcgccgc caccatggga tggtcatgta tcatcctttt 120
tctagtagca actgcaaccg gtgtacactc gagcgtagcg tcgaccaagg gcccatcggt 180
cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct 240
ggtcaaggac tacttccccg aacctgtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag 300
cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt 360
ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa 420
gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac 480
atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc 540
aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga 600
cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca 660
taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt 720
cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa 780
caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga 840
accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct 900
gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg 960
gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt 1020
cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg 1080
ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc 1140
gggtaaatag 1150
<210> 28
<211> 477
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PTT5-K(AgeI/ BsiwI)
<400> 28
cttgagtgac atgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccaggtccaa 60
gtttaaacgg atctctagcg aattcgccgc caccatggga tggtcatgta tcatcctttt 120
tctagtagca actgcaaccg gtgtacactc gagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 180
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 240
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggatagcgc cctccaatcg 300
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 360
agcaccctga cgctgagcaa ggcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 420
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 477
Claims (49)
1.抗体或其抗原结合片段,其特异性结合SARS-CoV-2的S蛋白的受体结合区(RBD),所述抗体或其抗原结合片段包含:
(a)包含下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):
(i)VH CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,
(ii)VH CDR2,其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,和
(iii)VH CDR3,其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示;
和,
(b)包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):
(iv)VL CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,
(v)VL CDR2,其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,和
(vi)VL CDR3,其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中,(i)-(vi)任一项中所述的CDR根据Kabat编号系统定义。
3.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其包含:
(a)如下3个重链CDRs:序列为SEQ ID NO:3的VH CDR1,序列为SEQ ID NO:4的VH CDR2,序列为SEQ ID NO:5的VH CDR3;和,如下3个轻链CDRs:序列为SEQ ID NO:6的VL CDR1,序列为SEQ ID NO:7的VL CDR2,序列为SEQ ID NO:8的VL CDR3;
或,
(b)如SEQ ID NO:1所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和,如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;其中,所述VH中含有的3个CDR和所述VL中含有的3个CDR由Kabat编号系统定义。
4.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其进一步包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列。
5.权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段,所述人免疫球蛋白的框架区序列选自人重排抗体的框架区序列或人胚系抗体的框架区序列。
6.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包含:来源于人重排抗体序列的重链框架区序列,以及来源于人重排抗体序列的轻链框架区序列。
7.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包含:来源于人重链胚系序列的重链框架区序列,以及来源于人轻链胚系序列的轻链框架区序列。
8.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其包含:
包含如SEQ ID NO:1所示的序列的VH和包含如SEQ ID NO:2所示的序列的VL。
9.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的恒定区。
10.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含来源于人免疫球蛋白的重链恒定区,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于人免疫球蛋白的轻链恒定区。
11.权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。
12.权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于κ或λ的轻链恒定区。
13.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包含:
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体,所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合;和/或
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体,所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合。
14.权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:25所示的重链恒定区(CH)。
15.权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:26所示的轻链恒定区(CL)。
16.权利要求1-15任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体或其抗原结合片段具有选自下列(1)或(2)的任意一项特征:
(1)所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv或双抗体(diabody);
(2)所述抗体为人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
17.权利要求1-15任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体或其抗原结合片段具备以下特征中的一项或多项:
(a)特异性结合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD;
(b)阻断或抑制SARS-CoV-2对Ace2受体的结合,和/或阻断或抑制SARS-CoV-2对细胞的感染;
(c)在体外或受试者体内中和SARS-CoV-2;
(d)预防和/或治疗SARS-CoV-2感染或与SARS-CoV-2感染相关的疾病。
18.权利要求17所述的抗体或其抗原结合片段,其中,与SARS-CoV-2感染相关的疾病是新型冠状病毒肺炎。
19.分离的核酸分子,其编码权利要求1-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
20.载体,其包含权利要求19所述的核酸分子。
21.权利要求20所述的载体,其中,所述载体为克隆载体或表达载体。
22.宿主细胞,其包含权利要求19所述的核酸分子或权利要求20或21所述的载体。
23.制备权利要求1-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法,其包括,在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下,培养权利要求22所述的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
24.试剂盒,其包括权利要求1-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
25.权利要求24所述的试剂盒,其中,所述抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。
26.权利要求24所述的试剂盒,其中,所述试剂盒还包括第二抗体,其特异性识别所述抗体或其抗原结合片段;任选地,所述第二抗体还包括可检测的标记。
27.权利要求25或26所述的试剂盒,其中,所述可检测的标记选自酶、化学发光试剂、荧光染料、放射性核素或生物素。
28.权利要求27所述的试剂盒,其中所述试剂盒具有选自下列的一项或多项特征:
(1)所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶;
(2)所述化学发光试剂为吖啶酯类化合物;
(3)所述荧光染料为异硫氰酸素或荧光蛋白。
29.非诊断目的的用于检测SARS-CoV-2或其S蛋白或S蛋白的RBD在样品中的存在或其水平的方法,其包括使用权利要求1-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
30.权利要求29所述的方法,其中,所述检测是酶免疫测定法、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。
31.权利要求29所述的方法,所述抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。
32.权利要求31所述的方法,所述方法还包括,使用携带可检测的标记的第二抗体来检测所述抗体或其抗原结合片段。
33.权利要求31或32所述的方法,其中,所述可检测的标记选自酶、化学发光试剂、荧光染料、放射性核素或生物素。
34.权利要求33所述的方法,其中所述方法具有选自下列的一项或多项特征:
(1)所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶;
(2)所述化学发光试剂为吖啶酯类化合物;
(3)所述荧光染料为异硫氰酸素或荧光蛋白。
35.权利要求1-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测SARS-CoV-2或其S蛋白或S蛋白的RBD在样品中的存在或其水平,或用于诊断受试者是否感染了SARS-CoV-2。
36.权利要求35所述的用途,所述试剂盒通过权利要求29-34任一项所述的方法来检测SARS-CoV-2在样品中的存在或其水平。
37.权利要求35所述的用途,所述样品为来自受试者的血液样品、排泄物、口腔或鼻腔分泌物或肺泡灌洗液。
38.权利要求37所述的用途,其中,所述受试者为哺乳动物。
39.权利要求37所述的用途,其中,所述受试者为人。
40.权利要求35所述的用途,其中,所述样品为全血、血浆或血清。
41.药物组合物,其包含权利要求1-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段,以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
42.权利要求41所述的药物组合物,其中,所述药物组合物还包含另外的药学活性剂。
43.权利要求42所述的药物组合物,其中,所述另外的药学活性剂选自法匹拉韦,瑞德西韦或干扰素。
44.用于在体外中和样品中SARS-CoV-2的毒力的方法,其包括,将包含SARS-CoV-2的样品与权利要求1-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触。
45.权利要求1-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途,所述药物用于预防或治疗受试者的SARS-CoV-2感染或与SARS-CoV-2感染相关的疾病。
46.权利要求45所述的用途,其中,所述受试者为哺乳动物。
47.权利要求45所述的用途,其中,所述受试者为人。
48.权利要求45所述的用途,所述抗体或其抗原结合片段单独使用,或与另外的药学活性剂联合使用。
49.权利要求48所述的用途,所述另外的药学活性剂选自干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦或瑞德西韦。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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