CN117414418A - 一种新型冠状病毒变异株的mRNA疫苗及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒变异株mRNA疫苗及其应用。所述mRNA疫苗能够对抗SARS‑CoV‑2病毒、Delta毒株病毒的感染，能够引起强烈且持续的新型冠状病毒抗体滴度，且毒副作用更小、安全性更高。

Description

一种新型冠状病毒变异株的mRNA疫苗及其应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种新型冠状病毒变异株mRNA疫苗及其应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-COV-2)属于冠状病毒科，能够引起严重的传染性疾病，具有传染性高、致死率高的特点，并且还突变进化出许多不同的变异株，特别是诸如Delta、Omicron等变异株的传播能力更强，危险程度更高。有效的疫苗是应对冠状病毒感染的最佳手段。
mRNA疫苗与重组蛋白亚单位疫苗、灭活或者DNA疫苗等传统疫苗相比，具有更高的有效保护率、更高的安全性，并且能够快速地更新迭代以应对不断出现的变异毒株，可以更快速的开发和大规模生产针对新病毒的疫苗，能够更有效应对新病毒的爆发及控制突发型传染病。
尽管mRNA疫苗具有良好的特异性及体内表达，但是以mRNA作为疫苗的活性成分具有循环时间短、易被降解和难以进入靶细胞的缺点，虽然采用阳离子脂质或可质子化脂质作为递送系统等手段可实现核酸药物的功能，但仍存在细胞毒性高、转染效率低等问题。
因此，开发一种安全、有效的新型的针对新型冠状病毒突变株的mRNA疫苗尤为重要。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供一种针对新型冠状病毒变异株，特别是针对Delta、Omicron变异株均有显著免疫作用的mRNA疫苗，该疫苗具有良好生物安全性，在体内可以高效表达抗原蛋白，更有效的诱导机体对新型冠状病毒突变株的中和抗体反应，达到预防或治疗的目的。
在第一方面，本发明提供一种新型mRNA疫苗，该疫苗含有S蛋白的编码mRNA以及递送载体。
在一些实施方案中，所述mRNA编码新型冠状病毒S蛋白，所述S蛋白包含SEQ IDNO: 3所示的氨基酸序列，优选地，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
优选地，所述mRNA包含SEQ ID NO: 2所示的核酸序列；更优选地，所述mRNA的核酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
在一些实施方案中，所述mRNA中的部分或全部胞嘧啶和/或尿嘧啶进行了可提高所述mRNA在生物体内稳定性的化学改性。
在一些实施方案中，所述化学改性包括以下：
所述mRNA中的一个或多个尿嘧啶核苷，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个尿嘧啶核苷或者至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶核苷被至少一种选自以下的核苷替换：假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'- 硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基T-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷或5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷中的至少一种，优选假尿苷或N1-甲基假尿苷或N1-乙基假尿苷，进一步优选N1-甲基假尿苷；和/或
所述mRNA中的一个或多个胞嘧啶核苷，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个胞嘧啶核苷或者至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶核苷被5-甲基胞嘧啶核苷替换。
在一些实施方案中，所述mRNA中的全部或部分尿嘧啶核苷被假尿苷，优选N1-甲基假尿苷替换；优选地，所述SEQ ID NO: 2所示的核酸序列中的全部或部分尿嘧啶核苷被假尿苷，优选N1-甲基假尿苷替换。
在一些实施方案中，所述SEQ ID NO: 2所示的核酸序列中的全部尿嘧啶核苷被N1-甲基假尿苷替换。
在某些实施方案中，所述mRNA还包含5’-帽结构、5’-UTR、3’-UTR和polyA中的至少一种。
优选地，所述5’-UTR包括SEQ ID NO: 4 所示核酸序列相对应的RNA序列或由SEQID NO: 4所示核酸序列相对应的RNA序列组成；所述3’-UTR包含SEQ ID NO: 5所示核酸序列相对应的RNA序列或由SEQ ID NO: 5所示核酸序列相对应的RNA序列组成；和/或所述polyA包含SEQ ID NO: 6所示核酸序列相对应的RNA序列或由SEQ ID NO: 6所示核酸序列相对应的RNA序列组成。
优选地，所述mRNA包括SEQ ID NO: 7所示的核酸序列；优选地，所述mRNA的核酸序列如SEQ ID NO: 7所示。SEQ ID NO: 7序列本身已包含帽子结构：cap G1G2 = m7G+-5'-ppp-5'-Gm2'-3'-p- [m7 = 7-CH3; m2' = 2'-O-CH3; -ppp- = -PO2H-O-PO2H-O-PO2H)-; -p- = -PO2H-]。需要注意的是，根据核苷酸或氨基酸序列表WIPO标准ST.26，序列表中RNA序列 (例如SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 7)中的t(胸腺嘧啶)实际上是u(尿嘧啶)。
在一些实施方案中，所述mRNA中的全部或部分尿嘧啶核苷被假尿苷，优选N1-甲基假尿苷替换；优选地，所述SEQ ID NO: 7所示的核酸序列中的全部或部分尿嘧啶核苷被假尿苷，优选N1-甲基假尿苷替换。
在一些实施方案中，所述SEQ ID NO: 7所示的核酸序列中的全部尿嘧啶核苷被N1-甲基假尿苷替换。
在一些实施方案中，所述S蛋白包含SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，优选地，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
在一些实施方案中，所述递送载体包括阳离子脂质体、阳离子蛋白、阳离子聚合物或阳离子脂质纳米颗粒中的一种，优选为阳离子脂质纳米颗粒。
优选地，所述阳离子脂质纳米颗粒包括可质子化阳离子脂质、辅助脂质、结构脂质和PEG-脂质中的一种或多种。
优选地，所述可质子化阳离子脂质为氨基脂质化合物，选自SX-104、SM102、ALC-0315、Dlin-MC3-DMA、Dlin-KC2-DMA、DODMA、c12-200或DlinDMA中的一种或多种，优选为SX-104，其中，SX-104的结构如下所示：
。
所述辅助脂质为磷脂类物质，这部分磷脂类物质通常是半合成的，也可以来源天然，也可以被化学修饰，包括但不限于DSPC、DOPE、DOPC、DOPS、DSPG、DPPG、DPPC、DGTS或溶血磷脂等，优选为DSPC。
优选地，所述结构脂质是选自胆固醇、胆固醇酯、固醇类激素、固醇类维生素、胆汁酸、胆甾醇、麦角甾醇、β-谷甾醇和氧化胆固醇衍生物中的一种或多种，优选是胆固醇(CHO-HP)。
优选地，所述PEG-脂质选自DMG-PEG和DSPE-PEG，优选为DMG-PEG；优选地，所述DMG-PEG中PEG的平均分子量为约2000至约5000道尔顿，所述DMG-PEG优选为DMG-PEG 2000。
优选地，所述脂质纳米颗粒含有可质子化阳离子脂质、辅助脂质、结构脂质和PEG-脂质中的一种或多种。
在某些实施方案中，以可质子化阳离子脂质、辅助脂质、结构脂质和PEG-脂质的总量计，按照摩尔百分比计，所述脂质纳米颗粒包含25-75％可质子化阳离子脂质，优选为45%-55%，更优选为49.5%。
在某些实施方案中，以可质子化阳离子脂质、辅助脂质、结构脂质和PEG-脂质的总量计，按照摩尔百分比计，所述脂质纳米颗粒包含5-20％辅助脂质，优选为8%-12%，更优选为10%。
在某些实施方案中，以可质子化阳离子脂质、辅助脂质、结构脂质和PEG-脂质的总量计，按照摩尔百分比计，所述脂质纳米颗粒包含0-50％结构脂质，优选为35%-45%，更优选为39%。
在某些实施方案中，以可质子化阳离子脂质、辅助脂质、结构脂质和脂质缀合物的总量计，按照摩尔百分比计，所述脂质纳米颗粒包含0.5-5%PEG-脂质，优选为1.0%-3.0%，更优选为1.5%。
在某些实施方案中，所述mRNA疫苗中可质子化阳离子脂质和mRNA的质量比为(5-30)：1，例如可以为但不限于为5:1、10:1、15:1、20:1、25:1或 30:1，优选为(8-12)：1，更优先为10:1。
在某些实施方案中，所述mRNA疫苗还可含有缓冲液。在某些实施方案中，所述缓冲液可包括磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液，优选磷酸盐缓冲液。在某些实施方案中，所述缓冲液浓度可为5mmol/L-30 mmol/L，优选为10 mmol/L。
优选地，在某些实施方案中，所述mRNA疫苗还可含有冷冻保护剂。在某些实施方案中，所述冷冻保护剂可选自蔗糖、海藻糖，优选蔗糖。在某些实施方案中，冷冻保护剂的浓度可为5mg/ml-100mg/ml，优选为80mg/ml。
在第二方面，本发明提供制备上述mRNA疫苗的方法。例如，所述方法可以包括如下步骤：
(1)配制包含核酸的水相；
(2)配制包含可质子化阳离子脂质、辅助脂质、结构脂质和PEG-脂质中的一种或多种的有机相(例如乙醇相)；
(3)包封：将合适量的所述水相与所述有机相混合包封；
(4)置换：将所述两相混合物中的溶液置换为另一个包含有冷冻保护剂的缓冲液；和
(5)除菌过滤获得所述mRNA疫苗。
在第三方面，本发明提供上述mRNA疫苗在预防或治疗由新型冠状病毒引起的疾病的应用。优选地，所述新型冠状病毒包括Alpha(如B.1.1.7变体及其后代谱系)、Beta(如B.1.351变体及其后代谱系)、Gamma(如P.1变体及其后代谱系)、Delta (如B.1.617.2及AY谱系)以及Omicron等。
在第四方面，本发明提供了用于在施用对象中预防或治疗新型冠状病毒感染，或者控制、预防或治疗由新型冠状病毒引起的感染性疾病的方法，其包括向施用对象施用预防或治疗有效量的上述mRNA疫苗。
在一些实施方案中，施用对象是人类或非人类哺乳动物。在一些实施方案中，所述施用对象是成人、老人、儿童或幼儿。在一些实施方案中，所述施用对象处于冠状病毒感染的风险中或对其有易感性。在一些实施方案中，施用对象已经被诊断冠状病毒感染阳性或是无症状的。
在一些实施方案中，提供了上述mRNA疫苗在制备用于预防或治疗新型冠状病毒感染的产品(例如预防性疫苗或治疗性疫苗)中的用途。
在一些实施方案中，所述mRNA疫苗的给药方式包括静脉注射、肌肉注射或皮内注射。
经动物体内实验研究证实，所述mRNA疫苗在体内能够刺激动物产生新型冠状病毒S1抗体(IgG)、新型冠状病毒Delta株(假病毒)以及新型冠状病毒Omicron株(假病毒)中和抗体，同时能够对抗SARS-CoV-2病毒、Delta毒株病毒的感染，有效降低病毒的体内复制，保护组织免受病毒的侵扰，能够引起强烈且持续的新型冠状病毒抗体滴度，有效保护组织免于病毒侵袭；同时，所制备的LNP的粒径分布(PDI)和颗粒大小、形态，更符合递送要求，该疫苗毒副作用小，安全性高，临床应用前景好。
附图说明
图1为本发明中质粒H的质粒谱图。
图2为本发明中工程质粒的谱图。
图3为实施例1中制备的mRNA疫苗的透射电镜图。
图4显示实施例4制备的mRNA疫苗在ACE2-IRES-luc转基因(hACE2)小鼠SARS-CoV-2病毒感染模型中的保护作用。
图5显示实施例4制备的mRNA疫苗在K18-hACE2 KI转基因小鼠2019-nCov Delta变种(B.1.617.2)病毒感染模型中的保护作用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明生物实验中使用到的化合物：SM102、ALC-0315、SX-104结构如下所示：
其中，SM102、ALC-0315可市购获得，也可以按照本领域公知技术制备获得；化合物SX-104可以按照如下步骤制备获得：
步骤一
9-十七烷基-8-溴辛酸酯在乙醇中与(1S,3R)-3-氨基环己醇，在50℃下反应15h，反应结束后，蒸除溶剂，加入EA，水洗，有机相浓缩，浓缩物经柱层析纯化得到9-十七烷基-8-(((1R,3S)-3-羟基环己基)氨基)辛酸酯。
核磁数据：
1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 4.91-4.81 (m, 1H), 3.86-3.82 (m, 1H), 2.84-2.81 (m, 1H), 2.69-2.54 (qt, J = 11.2, 7.3 Hz, 2H), 2.29-2.26 (t, J = 7.5 Hz,2H), 1.93-1.86 (m, 1H), 1.77-1.74(d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.72-1.57 (m, 6H),1.54-1.45 (m, 6H), 1.37-1.30 (m, 8H), 1.30-1.22 (m, 24H), 0.88 (t, J = 7.0Hz, 6H).
LCMS：496.7 [M+H]。
步骤二
上述9-十七烷基-8-(((1R,3S)-3-羟基环己基)氨基)辛酸酯在乙腈和环戊甲醚混合溶剂中，在碳酸钾、碘化钾的作用下与8-溴辛酸壬酯在90℃下反应24h，反应完毕，过滤，浓缩粗产品，粗产品最后经柱层析纯化得到化合物SX-104。
核磁数据：
1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 4.93-4.84 (m, 1H), 4.09 (t, J = 6.8 Hz,2H), 3.68-3.61 (m, 1H), 2.62-2.54 (m, 1H), 2.53-2.41 (m, 4H), 2.31-2.26 (q, J= 7.4 Hz, 4H), 1.97 (m, 1H), 1.91-1.78 (m, 2H), 1.71-1.61 (m, 7H), 1.54 (d, J= 6.0 Hz, 4H), 1.43-1.37 (m, 4H), 1.39-1.23 (m, 52H), 0.91 (m, 9H).
LCMS：765.2 [M+H]。
实施例1 新型冠状病毒S蛋白编码序列的构建及制备
对新型冠状病毒突变位点进行分析并设计了如SEQ ID NO: 1所示的新型冠状病毒S蛋白的编码核酸序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，其mRNA序列如SEQ IDNO: 2所示，其中全部尿嘧啶核苷被N1-甲基假尿苷替换。提供该核酸序列(SEQ ID NO: 1)委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，金斯瑞QC放行。
表征数据是：金斯瑞QC放行结果显示序列正确。
实施例2 工程质粒的构建
通过PCR的方式在序列如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒S蛋白编码序列两端引入同源臂序列，然后将此PCR产物与质粒H (图1)进行BamHI和KpnI双酶切跑胶回收的大分子片段进行同源重组，进行感受态细胞DH5a转化，挑选单克隆，测序验证，最终获得正确的工程质粒。该工程质粒使用的是如SEQ ID NO: 4序列所示的5’UTR；如SEQ ID NO: 5序列所示的3’UTR，如SEQ ID NO: 6序列所示的polyA。
数据表征：从质粒H开始，进行测序验证确认。结果显示核苷酸序列完全插入正确位置，且与理论序列完全一致。工程质粒的质粒谱图如图2所示。
实施例3 新型冠状病毒疫苗mRNA的制备
1. 提取实施例1制备的工程质粒模板，保证质粒超螺旋率达90%以上。
2. 质粒线性化
3. 线性化质粒纯化:使用Takara回收试剂盒回收
4. 酚氯仿抽提(去RNA酶、蛋白类等)
5. mRNA的体外转录(参考诺唯赞IVT反应试剂盒)
(1) 实验区域清理：首先用紫外对生物安全柜进行灭菌0.5h，之后用酒精棉球将安全柜擦干净，喷上RNase抑制剂。待5min之后，用酒精棉球将抑制剂擦干净，开始RNA实验。
(2) 体系的配置：配制体系前，将各组分试剂取出，在振荡器上涡旋混匀，离心，放置到冰盒中备用。
注：配置体系的过程中，全程在冰上操作，将质粒模板与IVT体系分来配制。
(3) IVT体系配制：将除了质粒模板的各个组分加入到体系液面以下，最后加T7酶，涡旋混匀,其中尿嘧啶(U)用甲基假尿嘧啶替代(N1-Me-Pseudo UTP)。
(4) 取出需要质粒的量到新的PCR管中，和IVT体系一起孵育5min，最后将两者的体系混合到一起，涡旋震荡混匀，离心之后37℃孵育2h。
(5) 将体系配制到0.2mL平盖薄壁管中，混匀后置于PCR仪中进行反应，反应条件为37℃ 2h。备注：反应体系也可根据所需要的生产量进行同步放大生产
(6) 使用DNase去除线性化质粒模板，加入(20μL体系)1μL/(100μL体系)5μLDNase于反应体系中，37℃孵育15min。
6. 纯化方式：(参考Thermo MEGAclear Kit试剂盒)
柱纯化
(1) 重复步骤5
(2) 去除Wash Solution，继续离心，最高转速离心1 min，去除残留的WashSolution；
(3) 加入适量(80-100μl)事先预热的RNase-Free Distilled Water入滤芯，盖上盖子，70℃静置10min，12000g离心1min，可根据需要增加洗脱次数。
(4) 浓度测定，用onedrop或Qubit测定浓度(稀释10倍后测定)
7. 鉴定：取5μl稀释的纯化样品与NorthernMax Formaldehyde Load Dye混合75℃孵育10min,然后置于冰上保存。然后使用1%琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，确定mRNA大小正确，条带无弥散，可进行下一步加帽反应。
8. 加帽反应
mRNACap1型加帽反应：
Cap1型帽子结构和反应原理如下：
pppN1(p)Nx-OH(3') → ppN1(pN)x-OH(3') + Pi
ppN1(pN)x-OH(3') + GTP → G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + PPi
G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + AdoMet → m7G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') +AdoHyc
m7GpppN1(pN)x-OH(3') + AdoMet → m7Gppp[m2’-O]N1(pN)x-OH(3') + AdoHyc
5‘-Cap1型帽子结构：
cap G1G2 = m7G+-5'-ppp-5'-Gm2'-3'-p- [m7 = 7-CH3; m2' = 2'-O-CH3; -ppp- =-PO2H-O-PO2H-O-PO2H)-; -p- = -PO2H-]，37℃ 5min或者65℃ 5min(CELL SCRIPT)。
9. 纯化方式：同体外转录后产物纯化方式一致。
表征数据：用onedrop或Qubit测定浓度。
实验结果：获得编码新型冠状病毒S蛋白的mRNA终产物，其序列为将SEQ ID NO: 7中的全部尿嘧啶(U)核苷用N1-甲基假尿苷替代后所获得的序列。
实施例4 mRNA疫苗的制备
水相的配制：称取190mg的实施例3制备的mRNA，以及89.06ml醋酸-醋酸钠缓冲液(0.2mol/L，pH=5)，用加无酶水定容至712.5ml，制备得到mRNA浓度约为0.267mg/ml的水相。
醇相的配制：称取1.9078g 化合物SX-104，0.3985g 的DSPC脂质，0.7575g 的CHO-HP脂质，以及0.1972g 的M-DMG-2000，按照摩尔比为49.5:10:39:1.5的比例，SX-104和mRNA的质量比为1:10，用无水乙醇溶解，并定容至237.5ml，制备得到化合物SX-104、DSPC脂质、CHO-HP脂质和M-DMG-2000的总浓度为13.73mg/mL的醇相。
包封：以水相：醇相的体积比为3:1，包封流速分别为20ml/min进行包封，弃去初包封部分药液后，收集备用。
切向流过滤：将包封好的药液，按照TMP为0.2bar，进液流速为300ml/min的参数进行超滤置换。置换所用的透析液含有8mg/ml的氯化钠、0.2mg/ml的氯化钾、0.2mg/ml的磷酸二氢钾、1.15mg/ml的磷酸氢二钠二水合物及80mg/ml的蔗糖。
除菌过滤和灌装：采用0.2μm的PES过滤器进行除菌过滤，并灌装至灭菌后的西林瓶中，密封。制备得到mRNA浓度为0.2mg/mL的mRNA疫苗。
检测结果如表1所示：
表1mRNA疫苗检测结果
外观 pH值 包封率 粒径nm PDInm
乳白色液体 7.2 74% 119.4 0.1331
透射电镜图如图3所示。
结果显示，其颗粒形态良好，呈所设计的球形，粒径大小均一，分散性良好，包封率符合要求。
实施例5 空白脂质体(LNP)疫苗的制备
在水相的配置步骤中未加入mRNA，其它过程同实施例4，制备得到不含有mRNA的空白脂质体(LNP)疫苗。
实施例6 毒理测试
采用实施例4、实施例5制备得到的mRNA疫苗和空白脂质体(LNP)疫苗进行毒理测试，其中以空白脂质体(LNP)疫苗为对照，进行如下测试：
测试1：mRNA疫苗在Balb/c小鼠中的免疫原性
36只Balb/c小鼠，随机分为3组，雌雄各半，分别为空白脂质体(LNP)对照组、低剂量组、高剂量组，每组12只动物，以肌肉注射方式给药一次。低、高剂量组分别给予的剂量为5、10μg/只。在注射后第14/21/28/35/42天采血分离血清后检测新型冠状病毒S1抗体(IgG)、新型冠状病毒Delta株(假病毒)中和抗体。
测试结果如表2、表3所示：
表2 mRNA疫苗对小鼠血清新型冠状病毒S1抗体(IgG)滴度影响
注：“H1组、L1组”给予实施例4制备的mRNA疫苗；“CV1组”给予空白LNP。
表3 mRNA疫苗对小鼠血清新型冠状病毒Delta株(假病毒)中和抗体滴度影响
注：“H1组、L1组”给予实施例4制备的mRNA疫苗；“CV1组”给予空白LNP。
从表2和表3中可以看出，在各剂量注射后，在第21天，抗体阳性率均为100%，新型冠状病毒S1抗体(IgG)、新型冠状病毒Delta株(假病毒)中和抗体在免疫后第21天后表现出强烈的免疫反应，在42天内均维持较高水平。这说明本发明所述mRNA疫苗能够引起强烈的免疫滴度。已公开的临床前研究显示，BNT162b2、mRNA-1273等新型冠状病毒mRNA疫苗免疫动物后，新型冠状病毒S1抗体(IgG)滴度或中和抗体滴度通常于第28天、第14天达到平台，随后相应滴度均出现不同程度降低，而本品在第42天时同样有着强烈的免疫作用。
测试2：mRNA疫苗在恒河猴中的免疫原性
18只恒河猴，随机分为3组，雌雄各半，分别为mRNA疫苗低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组6只动物，以肌肉注射方式给药。mRNA疫苗低、中、高剂量组给予的剂量为10、30、90 μg/只，每2周给药一次，连续给药4周(共给药3次)，恢复期4周。试验期间，检测动物血清的新型冠状病毒Delta、Omicron株(假病毒)中和抗体滴度。
表4 mRNA疫苗对新型冠状病毒Delta、Omicron(假病毒)中和抗体滴度影响
结果表明，mRNA疫苗组(10 μg /只，30 μg /只，90 μg /只)动物的新型冠状病毒Delta(假病毒)、Omicron(假病毒)几何平均中和抗体滴度随免疫次数增加而升高，基本呈剂量依赖性。mRNA疫苗诱导抗体针对Delta、Omicron两种不同变异株的假病毒具有中和活性，具有预防潜力。
测试3：mRNA疫苗在食蟹猴中的肌肉注射安全性
60只食蟹猴，随机分为6组，雌雄各半，分别为阴性对照(氯化钠注射液)组；空白LNP低、高剂量组和mRNA疫苗低、高剂量组。空白LNP低、高剂量组，每组5只/性别，低、高剂量组分别给予的剂量为150、600μL/只，mRNA疫苗低、高剂量组，每组以5只/性别，低、高剂量组分别给予的剂量为30、120μg/只，以肌肉注射方式给药，每2周给药一次，连续给药4周(共给药3次)。试验期间，对动物进行临床观察、体重、体温、血液学指标等进行检测，试验结束时进行大体解剖观察和组织病理学检查。
结果表明，试验期间，各给药组均未见明显临床观察和体重、体温等指标的异常。血液学指标检测、大体解剖观察和组织病理学检查发现，除部分动物注射部位存在可恢复的轻微的炎症，各组均无其他明显的改变。说明本发明所述mRNA疫苗在食蟹猴多次给药时，除了注射部位的可恢复炎性病变变化外，没有其他安全风险。对比现有新型冠状病毒mRNA疫苗的公开资料，在重复给药研究中，通常存在动物的体温升高；较普遍的血常规、淋巴细胞异常(中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞等)；脾、肝等脏器的重量、组织病理学改变，以及注射部位红斑、水肿等，而本发明所述mRNA疫苗显示的毒性改变远远低于现有mRNA疫苗，具有更好的安全性。
表5 食蟹猴肌肉注射安全性试验
测试4：mRNA疫苗在ACE2-IRES-luc转基因(hACE2)小鼠SARS-CoV-2病毒感染模型中的保护作用
采用实施例4制备的mRNA疫苗进行实验。20只人ACE2-IRES-luc转基因(hACE2)雌性小鼠，随机分为4组，雌雄各半，分别为PBS对照组、mRNA疫苗低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组5只动物，以肌肉注射方式给药。mRNA疫苗低、中、高剂量组给予的剂量为1、5、10 μg/只，攻毒前第35和第14天给药两次。末次给药后14天使用 SARS-CoV-2病毒滴鼻感染，感染后3天取小鼠肺组织评价小鼠肺组织病毒拷贝数。
测试结果如图4所示，从图4可以看出，在感染后3天，小鼠肺组织病毒拷贝数明显降低，具有显著统计学差异(P＜0.01)，说明本申请的mRNA疫苗能够保护SARS-CoV-2病毒感染。结果见图5。
测试5：mRNA疫苗在K18-hACE2 KI转基因小鼠2019-nCov Delta变种(B.1.617.2)病毒感染模型中的保护作用
采用实施例4制备的mRNA疫苗进行实验。50只K18-hACE2 KI转基因雌性小鼠，随机分为4组，雌雄各半，分别为空白对照组、空LNP对照组、mRNA疫苗低剂量组、中剂量组、高剂量组，空白对照组、空LNP对照组每组7只、IN002低、中、高剂量组为12只/组，以肌肉注射方式给药。mRNA疫苗低、中、高剂量组给予的剂量为1、5、10μg/只，间隔21天免疫两次。末次给药后14天使用2019-nCov Delta变种(B.1.617.2)病毒滴鼻感染，分别于感染后第7天对空白对照组、空LNP对照组全部小鼠以及mRNA疫苗各剂量组一半小鼠、感染后第14天对mRNA疫苗各剂量组剩余小鼠取小鼠组织，评价病毒拷贝数。
测试结果如图5所示，由图5可以看出，在感染后14天，各剂量组小鼠组织病毒载量完全消失。说明本申请的mRNA疫苗能够保护新冠病毒Delta变种病毒感染。
实施例7 可质子化阳离子脂质SX-104与mRNA的质量比筛选
水相的配制：移取1mg的mRNA，0.469ml醋酸钠缓冲液(0.2mol/L，pH=5)，用无酶水定容至3.75ml，混匀备用。
醇相的配制：按照SX-104:DSPC:胆固醇: M-DMG-2000摩尔比为50:10:38.5:1.5的比例进行配制醇相，将各个脂质溶于1.25ml的无水乙醇中，混匀备用；其中不同mRNA和SX-104的质量比处方见表6。
包封：采用微流控设备将两相注入微流控芯片，按照水相:醇相为3:1的体积比，包封流速为12ml/min，进行包封，弃去部分前端体积，收集包封好的mRNA-LNP药液。
透析：将包封好的mRNA-LNP药液装至透析袋，并置于含有8mg/ml的氯化钠、0.2mg/ml的氯化钾、0.2mg/ml的磷酸二氢钾、1.15mg/ml的磷酸氢二钠二水合物及80mg/ml的蔗糖的透析液进行置换以除去残留的乙醇等成分，在室温避光下，磁力搅拌透析2小时(每隔1小时更换一次透析液)。
除菌过滤：将透析后的mRNA-LNP药液，采用一次性使用无菌针头过滤器进行过滤，获得不同mRNA和SX-104质量比处方的疫苗。
表6 不同mRNA和SX-104质量比的处方
表7 不同mRNA和SX-104质量比处的疫苗检测结果：
由表7可以看出，在SX-104与mRNA的各个质量比中，粒径及PDI均良好，包封率均符合要求。
实施例8 可质子化阳离子脂质的活性比较
测试样品：实施例4制备得到的mRNA疫苗；
对照样品的制备：
将SX-104替换为ALC-0315，其它制备方法与测试样品的制备方法相同，制备获得脂质为ALC-0315，其它组分与测试样品均相同的mRNA疫苗。
将测试样品和对照样品分别对5只小鼠进行给药，检测其活性，数据如表8所示：
表8 测试样品与对照样品的活性数据(lgG结合滴度)
从表8中可以看出，测试样品和对照样品在小鼠体内均表现出良好的活性，证明该组合物的能够有效的将mRNA递送进入体内并表达，而对照样品的平均结合滴度低于测试样品，说明采用SX-104作为可质子化阳离子脂质的mRNA疫苗的体内递送具有更好的优势。
如上述实施例中经动物体内实验研究所证明的，所述mRNA疫苗在体内能够刺激动物产生新型冠状病毒S1抗体(IgG)、新型冠状病毒Delta株(假病毒)以及新型冠状病毒Omicron株(假病毒)中和抗体，所述中和抗体在免疫后第21天后表现出强烈的免疫反应，在42天内仍维持较高水平。同时，所述mRNA疫苗能够对抗SARS-CoV-2病毒、Delta毒株病毒的感染，能够引起强烈且持续的新型冠状病毒抗体滴度，且毒副作用更小、安全性更高。

Claims (21)

1. 一种mRNA疫苗，其包含表达新型冠状病毒S蛋白的mRNA和递送载体，其中所述S蛋白包含SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列；优选地，所述mRNA包含SEQ ID NO: 2所示的核酸序列；更优选地，所述mRNA的核酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
2. 根据权利要求1所述的mRNA疫苗，其中所述mRNA中的一个或多个尿嘧啶核苷，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个尿嘧啶核苷或者至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶核苷被至少一种选自以下的核苷替换：假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基T-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲 氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷或5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷中的至少一种，优选假尿苷或N1-甲基假尿苷或N1-乙基假尿苷，进一步优选N1-甲基假尿苷；和/或，
所述mRNA中的一个或多个胞嘧啶核苷，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个胞嘧啶核苷或者至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶核苷被5-甲基胞嘧啶核苷替换。
3. 根据权利要求1或2所述的mRNA疫苗，其中所述mRNA中的全部或部分尿嘧啶核苷被假尿苷，优选N1-甲基假尿苷替换；优选地，所述SEQ ID NO: 2所示的核酸序列中的全部或部分尿嘧啶核苷被假尿苷，优选N1-甲基假尿苷替换；更优选地，所述SEQ ID NO: 2所示的核酸序列中的全部尿嘧啶核苷被N1-甲基假尿苷替换。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的mRNA疫苗，其中所述mRNA还包含5’-帽结构、5’-UTR、3’-UTR和polyA中的至少一种。
5. 根据权利要求4所述的mRNA疫苗，其中所述5’-UTR包含SEQ ID NO: 4 所示核酸序列相对应的RNA序列或由SEQ ID NO: 4所示核酸序列相对应的RNA序列组成；和/或
其中所述3’-UTR包含SEQ ID NO: 5所示核酸序列相对应的RNA序列或由SEQ ID NO: 5所示核酸序列相对应的RNA序列组成；和/或
其中所述polyA包含SEQ ID NO: 6所示核酸序列相对应的RNA序列或由SEQ ID NO: 6所示核酸序列相对应的RNA序列组成。
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的mRNA疫苗，其中所述mRNA包含SEQ ID NO: 7所示的核酸序列；优选地，所述mRNA的核酸序列如SEQ ID NO: 7所示。
7. 根据权利要求6所述的mRNA疫苗，其中所述mRNA中的全部或部分尿嘧啶核苷被假尿苷，优选N1-甲基假尿苷替换；优选地，所述SEQ ID NO: 7所示的核酸序列中的全部或部分尿嘧啶核苷被假尿苷，优选N1-甲基假尿苷替换；更优选地，所述SEQ ID NO: 7所示的核酸序列中的全部尿嘧啶核苷被N1-甲基假尿苷替换。
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的mRNA疫苗，其中所述S蛋白包含SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，优选地，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的mRNA疫苗，其中所述递送载体包括阳离子脂质体、阳离子蛋白、阳离子聚合物或阳离子脂质纳米颗粒中的一种，优选为阳离子脂质纳米颗粒。
10.根据权利要求9所述的mRNA疫苗，其中所述阳离子脂质纳米颗粒包括可质子化阳离子脂质、辅助脂质、结构脂质和PEG-脂质中的一种或多种。
11.根据权利要求10所述的mRNA疫苗，其中所述可质子化阳离子脂质选自SX-104、SM102、ALC-0315、Dlin-MC3-DMA、Dlin-KC2-DMA、DODMA、c12-200或DlinDMA中的一种或多种，优选为SX-104，其中，S104的结构如下所示：
。
12.根据权利要求10或11所述的mRNA疫苗，其中所述辅助脂质选自DSPC、DOPE、DOPC、DOPS、DSPG、DPPG、DPPC、DGTS和溶血磷脂中的一种或多种，优选是选自DSPC、DOPE、DOPC和DOPS中的一种或多种，更优选是DSPC。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的mRNA疫苗，其中所述结构脂质是选自胆固醇、胆固醇酯、固醇类激素、固醇类维生素、胆汁酸、胆甾醇、麦角甾醇、β-谷甾醇和氧化胆固醇衍生物中的一种或多种，优选是胆固醇(CHO-HP)。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的mRNA疫苗，其中所述PEG-脂质选自DMG-PEG和DSPE-PEG，优选为DMG-PEG；优选地，所述DMG-PEG中PEG的平均分子量为约2000至约5000道尔顿；所述DMG-PEG优选为M-DMG-2000。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的mRNA疫苗，其中以可质子化阳离子脂质、辅助脂质、结构脂质和PEG-脂质的总量计，按照摩尔百分比计，
所述脂质纳米颗粒包含25-75％可质子化阳离子脂质，优选为45%-55%，更优选为49.5%；
所述脂质纳米颗粒包含5-20％辅助脂质，优选为8%-12%，更优选为10%；
所述脂质纳米颗粒包含0-50％结构脂质，优选为35%-45%，更优选为39%；和/或
所述脂质纳米颗粒包含0.5-5%PEG-脂质，优选为1.0%-3.0%，更优选为1.5%。
16.根据权利要求10-15中任一项所述的mRNA疫苗，其中所述mRNA疫苗中可质子化阳离子脂质和mRNA的质量比为(5-30)：1，优选为5:1、10:1、15:1、20:1、25:1或30:1，优选为(8-12)：1，更优先为10:1。
17. 根据权利要求1-16中任一项所述的mRNA疫苗，其中所述mRNA疫苗还含有缓冲液，优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液，优选磷酸盐缓冲液；优选地，所述缓冲液浓度为5mmol/L-30 mmol/L，优选为10 mmol/L。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的mRNA疫苗，其中所述mRNA疫苗还含有冷冻保护剂；优选地，所述冷冻保护剂选自蔗糖或海藻糖，优选为蔗糖；更优选地，所述冷冻保护剂的浓度为5mg/ml-100mg/ml，优选为80mg/ml。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的mRNA疫苗，其中所述mRNA疫苗的给药方式包括静脉注射、肌肉注射或皮内注射。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的mRNA疫苗在制备用于预防或治疗新型冠状病毒感染的产品中的用途。
21.制备权利要求1-19任一项所述的mRNA疫苗的方法，其特征在于，
(1)配制包含mRNA的水相；
(2)配制包含可质子化阳离子脂质、辅助脂质、结构脂质和PEG-脂质中的一种或多种的有机相；
(3)将合适量的所述水相与所述有机相混合包封；
(4)将所述两相混合物中的溶液置换为另一个包含有冷冻保护剂的缓冲液；和
(5)除菌过滤获得所述mRNA疫苗。
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