CN114272369A - 用于预防水痘-带状疱疹病毒的mRNA疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水痘‑带状疱疹病毒mRNA疫苗及其制备方法。本发明的水痘‑带状疱疹病毒mRNA疫苗在细胞水平表达效率高，在小鼠体内可有效激活CD4⁺T细胞免疫应答，本发明的水痘‑带状疱疹病毒mRNA疫苗的制备方法具有易于放大生产规模，适于标准化生产的优点。

Description

用于预防水痘-带状疱疹病毒的mRNA疫苗组合物

技术领域

本发明涉及属于生物医药和病毒学领域，具体涉及针对水痘-带状疱疹病毒的mRNA疫苗组合物及其制备方法。

背景技术

水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster virus,VZV)属于疱疹病毒科(Herpesviridae)，α-疱疹病毒亚科(α-herpesviridae)，水痘病毒属(Varicellovirus)。VZV病毒感染可表现出两种不同的临床症状。其初次感染主要发生于儿童，临床症状一般表现为水痘。水痘- 带状疱疹病毒具有亲神经性，感染后长期潜伏于脊髓神经后根神经节的神经元内。在年老、免疫力衰退或因疾病、药物导致免疫抑制等情况下，潜伏的病毒会被重新激活，沿神经轴顺行至该神经支配的皮肤，进行大量复制形成病灶，表现为带状疱疹。

带状疱疹常伴随剧烈的疱疹后神经痛，疼痛可持续数年之久，极大影响患者生活质量。且带状疱疹和疱疹后神经痛的发生概率随年龄增大而增大。据估计，85岁以上老人约有一半发生至少一次带状疱疹。根据美国疾控中心的统计，在美国每3个人中就有1人会在他们的一生中发生带状疱疹。

针对带状疱疹，国际上目前有两款疫苗，其一为2006年获批上市的默克公司开发的减毒活疫苗，商品名：Zostervax，；另一种为葛兰素史克(GSK)公司开发的亚单位佐剂疫苗(商品名：Shingrix)，于2017年在北美首次获批上市。但这两种疫苗在效果上均具有不足之处。

对带状疱疹疫苗Zostervax而言，其使用的毒株为水痘-带状疱疹病毒Oka株，与预防水痘的疫苗使用的是同一毒株。Zostervax的效价比水痘疫苗高出＞10倍。因此Zostervax是一种浓缩的Oka减毒配制物，可以使随年龄增长而对VZV病毒免疫原性消逝的老年人体内引发免疫反应，起到预防带状疱疹的作用。

Zostervax的缺点在于，当用于60岁以上的人群时其平均保护率仅有约50％左右。并且其保护率与年龄相关，年龄越大，保护率越低，在80岁以上人群中保护效率低，仅18％。且不能用于免疫系统有缺陷的人群。即，对于最需要进行预防保护的高龄、免疫缺陷人群而言，Zostervax不是足够好的。

另一种疫苗Shingrix为重组亚单位疫苗，由VZV病毒表面糖蛋白gE(CHO细胞表达)，辅以AS01_b佐剂(主要成分为单磷酰脂A(MPL)和QS21的脂质体佐剂)制备。施用方式通常为肌肉注射，两针免疫。Shingrix疫苗克服了Zostervax疫苗对于年龄更大的接种者保护率降低的问题，对50岁以上和70岁以上人群带状疱疹的保护率分别为 97.2％和89.8％，受年龄影响不明显，在80岁以上人群仍有89.1％的保护率。

Shingrix的缺点在于，其作为亚单位疫苗在激活细胞免疫应答方面天然不足，需要使用佐剂。临床研究发现，带状疱疹的保护效果主要与疫苗诱导的CD4⁺T细胞免疫反应相关。但是，亚单位疫苗在激活细胞免疫应答方面较弱，为了能够诱导比减毒活疫苗更强的细胞免疫应答，必须添加十分强效的佐剂，如AS01_b佐剂。而佐剂AS01_b的加入使得Shingrix疫苗毒性增加，副反应增加。据报道，在Shingrix临床研究中，有＞10％的受试者发生三级不良反应，包括疲劳和疼痛等头痛等，(参考文献)。

综上，现有主流疫苗具有这样的问题：减毒疫苗对老年患者效果不佳，且不能用于免疫缺陷人群；亚单位疫苗对老年患者效果好，但副作用较大。亟需一种副作用小或无副作用，免疫效果优良的带状疱疹疫苗。

近年来，开发了作为新型疫苗形式的mRNA疫苗，通过将mRNA直接递送至细胞内，利用宿主自身的蛋白表达系统表达抗原而激活细胞免疫应答，发挥效用。与传统减毒及灭活病毒疫苗相比，mRNA疫苗能够诱导T细胞免疫应答，在激活细胞免疫应答的方面具有天然优势。

mRNA疫苗的关键技术在近几年取得突破性进展，其在安全性、快速制备和免疫原性方面具有颠覆性的优势。其安全性高，不存在减毒疫苗具有的回复突变的潜在风险，不存在灭活疫苗灭活不彻底的风险，也不存在DNA疫苗被整合到宿主基因组中并导致基因突变的可能。一般传统疫苗开发需要至少5-6个月的时间，而mRNA疫苗可以实现标准化生产，在10天内便可生产出所需疫苗，在应对新发突发传染病方面具有无可比拟的优点。

然而，现在并没有成熟的针对水痘-带状疱疹病毒的mRNA类疫苗。

发明内容

本发明人基于以上现有问题，利用mRNA疫苗技术，基于VZV的gE糖蛋白进行了序列设计和改造，并通过使用微流控技术进行包封而获得mRNA疫苗纳米颗粒，从而制备了新型的水痘-带状疱疹病毒疫苗，解决了技术问题。

具体而言，本发明基于VZV的gE糖蛋白制备了VZV mRNA疫苗：利用可编码带状疱疹病毒VZV的抗原性多肽或免疫原性片段的mRNA和药学上可接受的载体，并选择纳米颗粒进行包装递送，从而获得用于预防或治疗带状疱疹病毒VZV感染的信使核糖核酸(mRNA)疫苗。

本发明的内容包括：

1.包含至少一种mRNA序列的疫苗组合物，在所述mRNA序列中包含至少一种编码水痘-带状疱疹病毒VZV的抗原性多肽或免疫原性片段的序列，其中，

所述抗原性多肽为VZV糖蛋白或其抗原性片段或多肽，所述VZV糖蛋白为VZV gE，优选为胞外段VZV gE多肽，更优选为SEQ ID NO:2所示的多肽。

2.如项1所述的疫苗组合物，其mRNA序列进一步包含编码信号肽的序列，优选为来源于人HLA I的信号肽，更优选为示于SEQ ID NO:1的序列。

3.如项1或2所述的疫苗组合物，其mRNA序列进一步包含SEQ ID NO:3所示的来源于人HLA I的跨膜区和胞内段多肽。

4.如项1～3中任一项所述的疫苗组合物，其中所述水痘-带状疱疹病毒VZV的抗原性多肽的氨基酸序列SEQ ID NO:4所示，或为与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的序列。

5.如项1～3中任一项所述的疫苗组合物，其中所述水痘-带状疱疹病毒VZV的抗原性多肽的核苷酸序列SEQ ID NO:5所示，或为与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的序列。

6.如项1～5中任一项所述的疫苗组合物，其中，mRNA序列还包含5’-帽子，5’和3’-UTR元件和聚腺苷酸序列。

7.如项6所述的疫苗组合物，其中，所述5’-帽子结构选自m⁷GpppG，m₂ ^7,3′-OGpppG，m⁷Gppp(5')N1(pN)_x-OH(3')或m⁷Gppp(m^2′-O)N1(pN)_x-OH(3')。

8.如项6或7所述的疫苗组合物，其中，所述5’–UTR元件选自SEQ ID NO:6-8所示的核酸序列所对应的RNA序列，或其同源物、片段或变体。

9.如项6～8中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述3’–UTR元件选自SEQ ID NO:9-12 所示的核酸序列所对应的RNA序列，或其同源物、片段或变体。

10.如项6～9中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述聚腺苷酸序列包含约25至约400 个腺苷酸的序列，优选约50至约400个腺苷酸的序列，更优选约50至约300个腺苷酸的序列，甚至更优选约50至约250个腺苷酸的序列，最优选约60至约200个腺苷酸的序列。

11.如项1～10中任一项所述的疫苗组合物，其中所述至少一种mRNA序列中包含选自 SEQ ID NO:13-21所示的序列。

12.如项1～11中任一项所述的疫苗组合物，其中所述mRNA序列包含至少一种化学改性，

所述化学改性选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基T-甲基- 假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、 4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、 5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷，优选为假尿苷或N1-甲基假尿苷或N1-乙基假尿苷，进一步优选为假尿苷。

13.如项12所述的疫苗组合物，其中所述mRNA序列中50％-100％的尿嘧啶具有化学改性。

14.如项1～13中任一项所述的疫苗组合物，其包含药学上可接受的递送载体，所述递送载体为纳米颗粒，优选为阳离子脂质纳米颗粒，进一步优选所述阳离子脂质纳米颗粒的平均直径为50-200nm。

15.如项14所述的疫苗组合物，其中，所述阳离子脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、PEG 修饰脂质、固醇和非阳离子脂质，

其中所述阳离子脂质选自以下一种或多种成分：2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯 (DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯 -1-基)酯(L319)，

所述PEG修饰脂质选自PEG-DMG、PEG-DSG和PEG-DMPE中的至少一种。所述PEG修饰脂质的PEG长度为0.5-200KDa，优选为1-50KDa，进一步优选为1-5KDa，更进一步优选为2KDa。

16.如项15所述的疫苗组合物，其中所述阳离子脂质纳米颗粒含有约20％～60％的阳离子脂质、约5％～25％的非阳离子脂质、约25％～55％的固醇以及约0.5％～15％PEG修饰脂质的摩尔比。

17.如项16所述的疫苗组合物，其中，所述纳米颗粒具有小于0.4的多分散性系数值，且所述纳米颗粒在中性pH值下具有净中性电荷。

18.水痘-带状疱疹病毒VZV的抗原性多肽表达载体，其包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，或包含编码SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

19.如项18所述的表达载体在制备水痘-带状疱疹病毒疫苗中的用途，所述疫苗可引起机体对水痘-带状疱疹病毒的免疫应答。

20.疫苗组合物的制备方法，其中，所述疫苗组合物为项1～17中任一项所述的疫苗组合物，包括

使用线性化质粒如pUC57载体作为mRNA转录模板制备mRNA，并在mRNA转录合成中引入化学改性的核糖核苷酸；

将获得的mRNA使用微流控技术包封为纳米颗粒，使得纳米颗粒的平均直径为 50-200nm；其中，

包封过程中使用的水相为mRNA，浓度50-100μg/ml，乙醇相为脂质混合液，在包封时，水相和乙醇相的总流速为12ml/min，水相和乙醇相的体积比为3：1至1:1， mRNA与脂质的质量比为0.05：1至0.5：1。

本发明的一个方面中，合成了可编码VZV抗原性多肽或免疫原性片段的mRNA 所需的质粒模板。在本发明的一些实施方案中，所述的mRNA质粒模板是以pUC57 载体为基础改造获得，其关键元件按照5’→3’顺序依次包括：T7启动子、5’UTR序列、 VZV抗原性多肽或免疫原性片段的编码区、3’UTR序列、多聚腺苷酸序列和线性化酶切位点。

本发明第一方面提供mRNA，其包括包含编码水痘-带状疱疹病毒(VZV)的抗原性多肽或其抗原性片段、变体或衍生物的编码区，其中所述抗原性多肽选自VZV的gE 糖蛋白，

优选地，所述抗原性多肽与VZV的糖蛋白gE序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％的同源性，

其中所述mRNA中部分或全部的尿嘧啶和/或胞嘧啶进行了能够提高所述mRNA 在生物体内稳定性的化学改性。

在本发明的一些实施方案中，所述化学改性包括利用以下物质置换所述mRNA中的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶，

其中，置换尿嘧啶的物质选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基 T-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基- 假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基- 假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷或5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷中的至少一种，优选假尿苷或N1-甲基假尿苷或2-硫基-二氢假尿苷，进一步优选N1-甲基假尿苷；

和/或，所述化学改性包括利用5-甲基胞嘧啶置换所述mRNA中的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶。

在本发明的另一些实施方案中，所述mRNA编码的抗原性多肽包含SEQ ID NO:1 所示的来源于人I类人类白细胞抗原(HLA I)的信号肽序列。

在本发明的另一些实施方案中，所述mRNA编码的抗原性多肽包含SEQ ID NO:2 所示的VZV的gE糖蛋白的胞外段。

在本发明的另一些实施方案中，所述mRNA编码的抗原性多肽包含SEQ ID NO:3 所示的来源于人I类人类白细胞抗原(HLA I)的跨膜区和胞内段序列。

在本发明的另一些实施方案中，所述mRNA编码的抗原性多肽氨基酸序列SEQ IDNO:4所示，或与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％的同源性的序列。

在本发明的一些实施方案中，所述mRNA编码的抗原性多肽核苷酸序列SEQ ID NO:5所示，或与与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％的同源性的序列。

在本发明的另一些实施方案中，所述mRNA还包含：

1)5’帽结构；

2)5’UTR序列；

3)3’UTR序列；以及

4)多聚腺苷酸序列，其中，所述mRNA按照5’→3’方向依次包括如下元件：5’帽结构，5’UTR序列，VZV 的抗原性多肽或其抗原性片段、变体或衍生物，3’UTR序列和多聚腺苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述5’帽结构选自m⁷GpppG、m₂ ^7,3′-OGpppG、 m⁷Gppp(5')N1或m⁷Gppp(m^2′-O)N1中的至少一种。

根据不同mRNA的需求，可在mRNA 5’端灵活添加不同的5’帽结构。

“m⁷G”代表7-甲基鸟苷帽核苷，“ppp”代表帽核苷的5′碳和初级RNA转录物的第一个核苷酸之间的三磷酸键，N1是最5′的核苷酸，“G”代表鸟嘌呤核苷，“m7”代表在鸟嘌呤的7-位上的甲基,“m^2′-O”代表核苷酸2′-O位上的甲基。

在本发明的一些实施方案中，所述5’UTR序列选自SEQ ID NO:6-8中任意一个所述的核酸序列所对应的RNA序列或其同源物、片段或变体。

在本发明的另一些实施方案中，所述3’UTR序列选自SEQ ID NO:9-12中任意一个所述的核酸序列所对应的RNA序列或其同源物、片段或变体。

在本发明的一些实施方案中，所述多聚腺苷酸序列包含25-400个腺苷酸的序列。

在本发明的一些优选的实施方案中，所述多聚腺苷酸序列包含50-400个腺苷酸的序列。

在本发明的一些进一步优选的实施方案中，所述多聚腺苷酸序列包含50-300个腺苷酸的序列。

在本发明的另一些进一步优选的实施方案中，所述多聚腺苷酸序列包含50-250个腺苷酸的序列。

在本发明的另一些更进一步优选的实施方案中，所述多聚腺苷酸序列包含60-200个腺苷酸的序列。

在本发明的一些实施方案中，所述mRNA具有选自SEQ ID NO:13-21所示的 mRNA序列，或与SEQ ID NO:13-21的mRNA序列具有至少80％、、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的mRNA。

本发明第二方面提供药物组合物，其包含第一方面所述的mRNA中的至少一种，和任选的递送载体。

在本发明的一些实施方案中，所述递送载体为纳米颗粒。

在本发明的一些优选的实施方案中，所述递送载体为脂质纳米颗粒。

在本发明的另一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒在中性pH值下具有净中性电荷。

在本发明的一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒具有50-200nm的平均直径，且具有小于0.4的多分散性系数值。

本发明中提供的纳米颗粒，可高效递送mRNA，并具有如下特点和优势：例如，在包封mRNA时，酸性pH条件使可电离的阳离子脂质带有正电荷，压缩带负电荷的 mRNA分子，进而获得较高的包封率；在生理pH条件下，可电离的脂质纳米颗粒具有电中性，不与带负电的细胞膜作用，生物相容性高；可电离的脂质纳米颗粒通过细胞内吞作用形成内涵体进入细胞后，内涵体中的酸性条件使纳米颗粒再次带上正电荷，与带有负电荷的内涵体膜发生静电相互作用，从而有利于mRNA的释放。

在本发明的一些实施方案中，所述mRNA与递送载体的质量比为A：B，其中A 选自0.05-2，B选自1-100，优选A为0.05，B为1；或者A为1，B为100；或者A 为2，B为1；或者A为1，B为50；或者A为1，B为5。

在本发明的另一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包括阳离子脂质和选自非阳离子脂质、固醇、PEG修饰脂质中的至少一种。

在本发明的一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒为阳离子脂质、非阳离子脂质、固醇和PEG修饰脂质，其摩尔比为20-60:5-25:25-55:0.5-15，优选 30-60:5-20:30-50:0.5-10，进一步优选40-60:5-15:35-45:0.5-5。

在本发明的另一些实施方案中，所述阳离子脂质为可电离的阳离子脂质，选自以下一种或多种成分：2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯和9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯。

在本发明的一些实施方案中，所述非阳离子脂质为中性脂质，选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰基卵磷脂(DOPC)和二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)中的至少一种，优选为DSPC。

在本发明的另一些实施方案中，所述固醇为胆固醇。

在本发明的一些实施方案中，所述PEG修饰脂质选自PEG-DMG、PEG-DSG和 PEG-DMPE中的至少一种。

在本发明的另一些实施方案中，所述PEG修饰脂质的PEG长度为0.5-200KDa，优选为1-50KDa，进一步优选为1-5KDa，更进一步优选为2KDa。

在本发明的一些实施方案中，所述药物组合物任选的含有佐剂。

本发明第三方面提供试剂盒，其包含本发明第一方面所述的mRNA和/或本发明第二方面所述的药物组合物。

本发明第四方面提供本发明第一方面所述的mRNA，本发明第二方面所述的药物组合物，本发明第三方面所述的试剂盒在制备预防和/或治疗VZV病毒感染的药物中的应用。

本发明第五方面提供本发明第一方面所述的mRNA，本发明第二方面所述的药物组合物，本发明第三方面所述的试剂盒的制备方法，包括对其中含有的mRNA中的包括包含编码VZV的抗原性多肽或其抗原性片段、变体或衍生物的编码区中的部分或全部的尿嘧啶和/或胞嘧啶进行化学改性的步骤，其中所述抗原性多肽选自VZV的gE糖蛋白。

在本发明的一些实施方案中，所述化学改性包括利用以下物质置换所述mRNA的编码区中的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶，其中，置换尿嘧啶的物质选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、 4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基T-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷或5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷中的至少一种，优选假尿苷或N1-甲基假尿苷或N1-乙基假尿苷，进一步优选假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1- 乙基假尿苷或2-硫尿苷；最优选假尿苷

和/或，所述化学改性包括利用5-甲基胞嘧啶置换所述mRNA中的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶。

本发明的水痘-带状疱疹病毒mRNA疫苗不需配合具有毒性的佐剂也能达到足够的免疫效果，并且不存在现有水痘-带状疱疹病毒亚单位疫苗的副作用。

另外，与传统疫苗相比，mRNA疫苗还具有不会插入基因突变，可以被正常细胞降解，安全性好；不需要表达纯化抗原蛋白，开发周期短；灵活高效且易于放大生产等诸多优势。

本发明中的编码VZV抗原性多肽或免疫原性片段的mRNA的制备方法的优点在于：(1)选择线性化质粒作为mRNA转录模板，与以PCR产物作模板相比，转录过程中产生的错误副产物更少，并且质粒容易大量获得且质量稳定；(2)根据不同mRNA的需求，该方法可在其5’端灵活添加不同的帽子；(3)在mRNA转录合成中引入化学改性的核糖核苷酸可降低mRNA在生物体内的免疫原性，延长mRNA半衰期进而提高目的抗原表达量，最终提高mRNA疫苗的免疫保护效果；(4)由于质粒模板中含有多聚腺苷酸序列，mRNA的加尾步骤可在转录中同时完成，疫苗生产工艺更简单；(5)产率高， 1μg模板最后可获得100-150μg mRNA。

本发明提供基于微流控技术的纳米颗粒包封mRNA的制备方法具有如下优点：快速，可在4小时内完成24L纳米颗粒的制备；制备出的纳米颗粒粒径均一，多分散性系数值小于0.4；容易放大，实验室规模的制备参数和条件基本可直接用于中试和大规模生产。

附图说明

下面将结合附图来说明本发明。

图1.mRNA转录模板pUC57-T-gE质粒示意图；

图2.mRNA转染293T细胞后gE表达的Western blot图；

图3.mRNA疫苗免疫C57BL/6小鼠血清抗原特异性抗体滴度；

图4.mRNA疫苗免疫C57BL/6小鼠CD4⁺T细胞免疫应答水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的分子克隆实验指南(科学出版社出版的第三版)或按照制造商所建议的条件。实验所用到的试剂，如无特殊说明，均可试剂公司购买到。

RNA的分离纯化

RNA的分离纯化可通过多种方法进行，如醋酸铵沉淀法、LiCl沉淀法、有机溶剂抽提-醋酸铵沉淀法和RNA结合柱纯化等。

以LiCl沉淀法为例说明：

a)RNA溶液中加入7.5M LiCl，使LiCl终浓度为2.5M；

b)-20℃过夜；

c)12000rpm/min离心15分钟，弃溶液；

d)向沉淀中加入-20℃预冷的75％乙醇，清洗沉淀，然后12000rpm/min离心1分钟，弃乙醇溶液，重复清洗三次；

e)室温晾干RNA沉淀，然后用无RNase水溶解RNA。使用Nanodrop(ThermoScientific)测定RNA浓度后，-80℃保存。

实施例

实施例1：mRNA的体外合成

(1)mRNA转录模板获取

将VZV gE糖蛋白的SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列添加T7启动子、5’UTR、 3’UTR和polyA序列后，将由北京擎科新业生物技术有限公司进行序列全合成后，将得到的DNA序列克隆至pUC57载体(购自北京擎科新业生物技术有限公司，质粒)，获得作为mRNA转录模板的pUC57-T-gE。pUC57-T-gE的示意图见图1。

(2)mRNA转录

使用限制性内切酶BamHI对转录模板pUC57-T-gE进行酶切线性化后，然后用胶回收试剂盒回收线性化转录模板。

按下表配制mRNA体外转录反应体系(试剂购自美国Thermo fisher公司)：

其中NTPs premix为采用试剂盒中的A，T，C，U和假尿苷按一定比例配制成的碱基混合物。

于37℃反应4小时后，加入1μl无RNase的DNase I，37℃反应15分钟。然后使用LiCl沉淀法进行RNA的分离纯化。得到体外转录的mRNA。

(3)mRNA的加帽

a)取体外转录的mRNA50-60μg，用无RNase水稀释至67μl；

b)65℃孵育5-10分钟，之后置于冰上冷却；

c)按下表配制反应体系混合液；

d)将b)中冷却的mRNA加入至c)的混合液中，再加入4μl加帽酶，37℃反应半小时。

然后对加帽后的mRNA进行分离纯化。具体方法如“RNA的分离纯化”中所述获得加帽后的mRNA，下文中也将其称为mRNA-gE。

实施例2：mRNA-gE的纳米颗粒的包装

通过微流控技术对mRNA进行纳米颗粒包装。使用的水相为mRNA，mRNA-gE 的浓度为100μg/ml(50mM醋酸钠缓冲溶液，pH 4.0)。乙醇相为脂质混合液，由可电离的阳离子脂质、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇修饰磷脂按摩尔比 50:10:38.5:1.5比例配制。包装时使用的仪器为(Benchtop,Precison Nanosystems)

包装时，水相和乙醇相的总流速为12ml/min，水相和乙醇相体积比为3：1，mRNA 与脂质的质量比为0.05：1。

对于包装完成的mRNA-gE纳米颗粒，使用超滤浓缩管(Millipore)将缓冲液置换成PBS后，获得mRNA-gE-LNP。然后使用RiboGreen试剂(Thermo Scientific)测定包封的 mRNA浓度后，置于4℃保存待用。

经测定，本实施例中得到的包封的mRNA浓度为0.15mg/ml，本实施例中得到的mRNA-gE纳米颗粒的粒径大小在(84nm)，多分散性系数值为(0.114)包封率为(98％)

可知，通过该制备方法能以极高的包封率获得疫苗组合物，得到的mRNA-gE纳米颗粒的粒径小，多分散性系数良好，mRNA浓度高。

实施例3：疫苗的免疫原性测定

体内攻毒

将14只C57BL/6小鼠(雄)分成3组，每组4只，分别免疫PBS、mRNA-gE和 mRNA-gE+氟伐他汀，以下如无特别说明，则“他汀”均为氟伐他汀。mRNA-gE组小鼠注射的mRNA-gE剂量为20ug/只，在mRNA-gE+氟伐他汀组中，注射mRNA-gE 20 ug/只，氟伐他汀20ug/只，PBS组注射20ul无菌PBS。免疫方式为肌肉注射，注射位置为股直肌。将首次免疫日作为第1日。

在首次免疫后的第4周(即，第28日)进行加强免疫，各组的加强免疫方式及剂量均与首次免疫时相同。其中，在第28日进行注射前从小鼠尾部取血。按常规方法从血中分离血清，在56℃灭活3

0分钟后保存于-80℃待用。

在加强免疫后的第4周(即，第56日)从小鼠尾部取血，同上分离血清并灭活后保存于-80℃。对小鼠注射三溴乙醇实施安乐死，取脾脏，以常规方法分离脾细胞备用，用于后续胞内流式染色技术(ICS)测定。

抗原特异性细胞免疫

(1)免疫小鼠外周血的抗原特异性抗体滴度测定

将VZV gE蛋白(NCBI Reference Sequence：NP_040190.1的31-537位，为VZV gE蛋白胞外段，本实验室构建，采用酵母系统表达后纯化)用ELISA包被液稀释至1μg/ml 后加入96孔板中，每孔加入100μl，4℃放置过夜。第二天，用含5％脱脂牛奶的 PBS(PBSM)封闭ELISA板，将从各组小鼠获得的血清用PBSM按照2倍梯度稀释后，加入到ELISA板中，37℃孵育1小时。

之后用含0.05％吐温20的PBS(PBST)清洗三次后，加入羊抗鼠HRP二抗(购自北京中杉金桥生物技术公司)，37℃孵育1小时后，PBST清洗三次，加入TMB显色液显色，并用2M盐酸终止，在酶标仪上在OD450处读值，将统计图示于图3。

结果显示，如图3所示，与PBS组相比，mRNA-gE组与mRNA-gE+氟伐他汀组在首次免疫后4周时(初免)、加强免疫后4周时(加强)均有效地诱导了抗体滴度的升高。其中，在mRNA-gE组中，在首次免疫后4周时小鼠外周血中的VZVgE特异性抗体滴度即高达约10^4，进一步，在加强免疫后4周时外周血中的VZV抗体滴度进一步增高，可提高约100倍(***，表示P<0.01)。同时，加强免疫后4周时，在mRNA-gE组与mRNA-gE+氟伐他汀组之间，抗体滴度没有显著差异(n.s.)。

由此可知本发明的mRNA-gE纳米颗粒疫苗能够通过免疫诱导小鼠免疫应答，效果优异；并且，采用加强免疫的方式能够有效地增强诱导效应，可以期待通过加强免疫使得抗体在小鼠中以更高水平、更长地维持。同时，发明人也观察到，当以加强免疫方式接种本发明的mRNA-gE纳米颗粒疫苗时，即使不使用他汀佐剂也并不影响最终的免疫效果。

(2)ICS测定疫苗诱导的CD4⁺T细胞免疫应答水平

在圆底96孔板中每孔加入悬浮在培养基1640中的1×10⁶个小鼠脾脏细胞，然后加入gE多肽库(由北京中科亚光生物科技公司合成，每条多肽浓度为2μg/ml)刺激细胞作为试验组，分别设置加入PMA(佛波酯,2μg/ml)的组为阳性对照，不加任何刺激物的组为阴性对照。

刺激4小时后，加入Golgiplug(BD公司)并接着在细胞培养箱中培养14小时。然后离心收集细胞，进行抗体染色，其中操作步骤完全按照BD公司Cytofix/Cytoperm^TMFixation/Permeabilization Kit说明书操作。之后，使用FACSCanton流式细胞仪检测了细胞荧光。检测了分泌抗原特异性的IFNγ、TNF-α或IL-2阳性的CD4⁺T细胞比例，将结果示于图4。

结果显示，如图4所示，在加强免疫后4周时，与PBS组相比，mRNA-gE组 (gE-mRNA)和mRNA-gE+氟伐他汀组(gE-mRNA-氟伐他汀)中分泌IFNγ、TNF-α或IL-2 的CD4⁺T细胞均出现了增加；其中，与mRNA-gE组相比，mRNA-gE+氟伐他汀组中分泌TNF-α或IL-2的的CD4⁺T细胞均有所增加，特别是分泌IL-2的CD4⁺T细胞增加程度最高。

由此可知，使用本发明的mRNA-gE纳米颗粒疫苗两针加强免疫小鼠后，成功地诱导了CD4⁺T细胞免疫应答。并且，同时使用他汀佐剂能够使CD4⁺T细胞免疫应答水平进一步提高。这表明本发明的mRNA-gE纳米颗粒疫苗有效地激活了Th1型细胞免疫应答，利于抑制或清除胞内感染的VZV病毒。

CD4⁺T细胞免疫应答水平为带状疱疹疫苗评价的最重要的免疫评价指标，预示着VZV mRNA疫苗具有良好的保护效果。

工业实用性

本发明的VZV mRNA疫苗组合物可用于预防由水痘-带状疱疹病毒感染引起的带状疱疹，其细胞水平的表达效率高，并在小鼠体内可有效激活CD4⁺T细胞免疫应答，，具有很大的开发潜力。可用于老年人群的预防卫生接种，也可以用于制备研究VZV感染相关机制的动物模型，及直接用于科研。

Claims (20)

1.包含至少一种mRNA序列的疫苗组合物，在所述mRNA序列中包含至少一种编码水痘-带状疱疹病毒VZV的抗原性多肽或免疫原性片段的序列，其中，

所述抗原性多肽为VZV糖蛋白或其抗原性片段或多肽，所述VZV糖蛋白为VZV gE，优选为胞外段VZV gE多肽，更优选为SEQ ID NO:2所示的多肽。

2.如权利要求1所述的疫苗组合物，其mRNA序列进一步包含编码信号肽的序列，优选为来源于人HLA I的信号肽，更优选为示于SEQ ID NO:1的序列。

3.如权利要求1或2所述的疫苗组合物，其mRNA序列进一步包含SEQ ID NO:3所示的来源于人HLA I的跨膜区和胞内段多肽。

4.如权利要求1～3中任一项所述的疫苗组合物，其中所述水痘-带状疱疹病毒VZV的抗原性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或为与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的序列。

5.如权利要求1～3中任一项所述的疫苗组合物，其中所述水痘-带状疱疹病毒VZV的抗原性多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，或为与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的序列。

6.如权利要求1～5中任一项所述的疫苗组合物，其中，mRNA序列还包含5’-帽子，5’和3’-UTR元件和聚腺苷酸序列。

7.如权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述5’-帽子结构选自m⁷GpppG，m₂ ^7,3′-OGpppG，m⁷Gppp(5')N1(pN)_x-OH(3')或m⁷Gppp(m^2′-O)N1(pN)_x-OH(3')。

8.如权利要求6或7所述的疫苗组合物，其中，所述5’–UTR元件选自SEQ ID NO:6-8所示的核酸序列所对应的RNA序列，或其同源物、片段或变体。

9.如权利要求6～8中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述3’–UTR元件选自SEQ IDNO:9-12所示的核酸序列所对应的RNA序列，或其同源物、片段或变体。

10.如权利要求6～9中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述聚腺苷酸序列包含约25至约400个腺苷酸的序列，优选约50至约400个腺苷酸的序列，更优选约50至约300个腺苷酸的序列，甚至更优选约50至约250个腺苷酸的序列，最优选约60至约200个腺苷酸的序列。

11.如权利要求1～10中任一项所述的疫苗组合物，其中所述至少一种mRNA序列中包含选自SEQ ID NO:13-21所示的序列。

12.如权利要求1～11中任一项所述的疫苗组合物，其中所述mRNA序列包含至少一种化学改性，

所述化学改性选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基T-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷，优选为假尿苷或N1-甲基假尿苷或N1-乙基假尿苷，进一步优选为假尿苷。

13.如权利要求12所述的疫苗组合物，其中所述mRNA序列中50％-100％的尿嘧啶具有化学改性。

14.如权利要求1～13中任一项所述的疫苗组合物，其包含药学上可接受的递送载体，所述递送载体为纳米颗粒，优选为阳离子脂质纳米颗粒，进一步优选所述阳离子脂质纳米颗粒的平均直径为50-200nm。

15.如权利要求14所述的疫苗组合物，其中，所述阳离子脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、PEG修饰脂质、固醇和非阳离子脂质，

其中所述阳离子脂质选自以下一种或多种成分：2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)，

所述PEG修饰脂质选自PEG-DMG、PEG-DSG和PEG-DMPE中的至少一种。

所述PEG修饰脂质的PEG长度为0.5-200KDa，优选为1-50KDa，进一步优选为1-5KDa，更进一步优选为2KDa。

16.如权利要求15所述的疫苗组合物，其中所述阳离子脂质纳米颗粒含有约20％～60％的阳离子脂质、约5％～25％的非阳离子脂质、约25％～55％的固醇以及约0.5％～15％PEG修饰脂质的摩尔比。

17.如权利要求16所述的疫苗组合物，其中，所述纳米颗粒具有小于0.4的多分散性系数值，且所述纳米颗粒在中性pH值下具有净中性电荷。

18.水痘-带状疱疹病毒VZV的抗原性多肽的表达载体，其包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，或包含编码SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

19.如权利要求18所述的表达载体在制备水痘-带状疱疹病毒疫苗中的用途，所述疫苗可引起机体对水痘-带状疱疹病毒的免疫应答。

20.疫苗组合物的制备方法，其中，所述疫苗组合物为权利要求1～17中任一项所述的疫苗组合物，包括

使用线性化质粒如pUC57载体作为mRNA转录模板制备mRNA，并在mRNA转录合成中引入化学改性的核糖核苷酸；优选pUC57载体的关键元件按照5’→3’顺序依次包括：T7启动子、5’UTR序列、VZV抗原性多肽或免疫原性片段的编码区、3’UTR序列、多聚腺苷酸序列和线性化酶切位点；

将获得的mRNA使用微流控技术包封为纳米颗粒，使得纳米颗粒的平均直径为50-200nm；其中，

包封过程中使用的水相为mRNA，浓度50-100μg/ml，乙醇相为脂质混合液，在包封时，水相和乙醇相的总流速为12ml/min，水相和乙醇相的体积比为3：1至1:1，mRNA与脂质的质量比为0.05：1至0.5：1。

Images