CN117244048A - 一种禽流感病毒mRNA疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种禽流感病毒mRNA疫苗及其制备方法和应用。该mRNA疫苗包括T7启动子、5’端非翻译区、密码子优化后的HA抗原编码基因、3’端非翻译区和多聚腺苷酸；其中，密码子优化后的HA抗原编码基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.10所示。本发明中的动物试验表明，禽流感mRNA疫苗对禽流感毒株具有良好的保护作用，单独接种mRNA疫苗对异源禽流感毒株攻击能够提供100％的保护，且通过本发明mRNA疫苗与HA亚单位疫苗序贯免疫的方式，发现序贯免疫与单独免疫mRNA疫苗同样有效。因此，本发明中的禽流感病毒mRNA疫苗可用于预防H5亚型禽流感病毒感染。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，特别涉及一种禽流感病毒mRNA疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
禽流感是严重威胁禽类养殖业和公共卫生安全的重大问题。禽流感病毒(AvianInfluenza virus，AIV)是有囊膜、单股负链分节段的RNA病毒，属于正黏病毒科，流感病毒属。禽流感病毒聚合酶缺乏5’-3’外切酶活性，不具有校正功能，在复制过程中容易发生突变，且禽流感基因组由8条单股RNA组成，两种病毒感染同一宿主细胞时，可能发生病毒间基因片段的交换而产生新的病毒，故禽流感病毒变异较快且变异类型较多。为提高疫苗保护效力，研制疫苗时需要参考病毒流行情况，不断更新疫苗毒株。当前禽流感疫苗以全病毒灭活疫苗为主，由于该疫苗的生产涉及活病毒的培养和增殖，可能具有一定的生物安全风险。
mRNA疫苗与其他传统类型疫苗相比，具有研发周期短、容易大批量制造、无需添加佐剂等突出优势，且由于mRNA疫苗的体内过程不涉及病毒的增殖和逆转录，能够同时诱导体液和细胞免疫反应，而细胞免疫有助于提高疫苗的交叉保护性，故具有安全、高效的突出优点。随着技术进步，mRNA疫苗可以制成冻干粉，进一步降低运输和储存要求，便于临床应用。因此，mRNA疫苗是公认的最具潜力的疫苗类型之一。mRNA疫苗在预防新型冠状病毒流行中的应用，充分证明了mRNA疫苗巨大的发展和应用潜力。禽流感病毒对禽类养殖业公共卫生带来了严重威胁，开发新型的禽流感mRNA疫苗，是防控禽流感流行的重要选择。
mRNA疫苗的序列设计是影响mRNA疫苗免疫效果的关键因素之一。疫苗mRNA的5’UTR区的结构对mRNA的胞内翻译效率具有重要影响。5’UTR区必须短而松，避免形成高稳定性的二级结构继而阻止小核糖体结合翻译起始位点。在蛋白编码区前端添加Kozak序列可以提高翻译效率。3’UTR区域与mRNA的稳定性有关，3'UTRs中富含AU(AREs)的序列、AUUUA重复序列和富含GU的序列(GREs)是导致mRNA不稳定的常见因素。2019年，David M.Mauger等人发表文章mRNA structure regulates protein expression through changes infunctional half-life，证实mRNA的5’UTR和CDS区域前十个密码子形成的二级结构越少，剩余的CDS区域和3’UTR形成的二级结构越多，序列编码蛋白的表达量越高。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种禽流感病毒mRNA疫苗。
本发明的另一目的在于提供所述禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述禽流感病毒mRNA疫苗的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种禽流感病毒mRNA疫苗，所述的mRNA疫苗包括T7启动子、5’端非翻译区(5’UTR)、密码子优化后的HA抗原编码基因、3’端非翻译区(3’UTR)和多聚腺苷酸(poly A)；其中，密码子优化后的HA抗原编码基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.10所示。
所述的密码子优化后的HA抗原编码基因序列如SEQ ID NO.6和/或SEQ ID NO.9所示。
所述的T7启动子的核苷酸序列优选为如SEQ ID NO.2所示。
所述的5’端非翻译区(5’UTR)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述的3’端非翻译区(3’UTR)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述的多聚腺苷酸(poly A)含有50～150个碱基A；优选为含有101个碱基A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
所述的mRNA疫苗优选为包括如SEQ ID NO.12和/或SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列。
所述的禽流感病毒mRNA疫苗，还包含疫苗载体。
所述的疫苗载体为可被mRNA利用的脂质体纳米颗粒，所述的mRNA包封于所述脂质体纳米颗粒中。
所述的质体纳米颗粒包含阳离子脂质、二硬酯酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇和DMG-PEG2000中的至少一种。
所述的阳离子脂质优选为阳离子脂质SM102。
所述的禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)将mRNA疫苗基因序列克隆到pUC57-Kan载体上，得到重组质粒；其中，mRNA疫苗基因序列如SEQ ID NO.9和/或SEQ ID NO.10所示；
(2)将重组质粒用Bsa I限制性核酸内切酶，回收线性化质粒，并利用mRNA转录试剂盒进行转录，利用加帽试剂盒进行加帽处理，得到目的mRNA；
(3)将目的mRNA利用脂质体进行包装，得到mRNA脂质体纳米颗粒疫苗，即所述禽流感病毒mRNA疫苗。
步骤(3)中所述的利用脂质体进行包装优选为通过如下步骤实现：
a、将脂质按阳离子脂质、二硬酯酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇和DMG-PEG2000按质量比50:10:38.5:1.5溶于无水乙醇中，作为醇相；
b、将目的mRNA溶于缓冲溶液中，作为水相；
c、将醇相和水相按体积比1:3的比例混合包裹，然后用PBS缓冲液稀释，并用超滤管进行浓缩换液后，加入蔗糖溶液，滤膜过滤，得到mRNA脂质体纳米颗粒疫苗。
步骤a中所述的阳离子脂质优选为阳离子脂质SM102。
步骤b中所述的缓冲溶液为柠檬酸缓冲液；优选为pH4.0、50mM的柠檬酸缓冲液。
步骤c中所述的超滤管优选为截留分子量为30KD的超滤管。
步骤c中所述的蔗糖的加入量为按其在体系的终浓度为质量百分比10％添加计算。
步骤c中所述的滤膜优选为0.22μm滤膜。
所述的禽流感病毒mRNA疫苗在制备用于预防H5亚型禽流感病毒(H5N1)感染的药物中的应用。
所述的H5亚型禽流感病毒(H5N1)；优选为A/Chicken/Guangdong/D889/2015(H5N1)。
一种H5N1亚型禽流感病毒疫苗，包括上述禽流感病毒mRNA疫苗和HA亚单位疫苗；其中，所述的HA亚单位疫苗由HA蛋白和疫苗佐剂混合得到；所述的HA蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.14所示。
所述的疫苗佐剂优选为MontanideTM ISA 71VG佐剂。
所述的HA蛋白和疫苗佐剂的体积比为3：7。
所述的H5N1亚型禽流感病毒疫苗的使用方式为：先接种禽流感病毒mRNA疫苗，免疫3周后利用HA亚单位疫苗的加强免疫。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明根据目前禽流感流行情况，选取禽流感病毒HA抗原编码序列并进行优化设计，构建mRNA疫苗：首先将禽流感2.3.2.1c分支毒株的HA蛋白信号肽编码序列替换为强信号肽编码序列，去掉HA蛋白跨膜区，并添加3×GGGGS的柔性Linker，以实现HA蛋白的分泌表达；然后将序列进行禽源密码子优化后，序列前端添加T7启动子、5’端非翻译区(5’UTR)和Kozak序列，序列后端添加3’端非翻译区(3’UTR)和多聚腺苷酸尾(poly A)，构成mRNA疫苗候选序列；再进一步预测各候选序列的二级结构，挑选出2条二级结构中5’UTR处于相对游离状态的mRNA序列，将对应的DNA序列分别连接在质粒载体上构成重组质粒，并将重组质粒进行线性化、转录、加帽，并用LNP技术包装，制成禽流感mRNA疫苗。
2、本发明中的动物试验表明，禽流感mRNA疫苗对禽流感毒株具有良好的保护作用，单独接种mRNA疫苗对异源禽流感毒株攻击能够提供100％的保护，且通过本发明mRNA疫苗+HA蛋白的序贯免疫的方式，发现序贯免疫与单独免疫mRNA疫苗同样有效，因此，该H5亚型禽流感mRNA疫苗可为禽流感的防控提供重要的技术储备。
附图说明
图1是实施例2中的重组质粒线性化酶切产物的电泳鉴定图。
图2是实施例2中转录加帽后mRNA的电泳鉴定图。
图3是实施例3中表达出的HA抗原蛋白的Western Blot检测结果图。
图4是实施例4中mRNA-LNP包装后制剂分析结果图。
图5是本发明中的疫苗毒株(Vaccine HA)和攻毒毒株A/Chicken/Guangdong/D889/2015(H5N1)的HA序列亲缘关系分析结果图(疫苗毒株和攻毒毒株均属于2.3.2.1c分支)。
图6是实施例5中HA蛋白的Western Blot验证结果图。
图7是实施例5中小鼠攻毒后的平均体重变化结果图。
图8是实施例6中小鼠攻毒后的平均体重变化结果图。
图9是实施例6中小鼠肺脏排毒量检测结果图。
图10是实施例7中的小鼠HI抗体效价结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1禽流感病毒mRNA疫苗的抗原表达载体的构建
禽流感病毒mRNA疫苗序列包含以下元件：T7启动子、5’端非翻译区(5’UTR)、信号肽序列、HA抗原编码基因、3’端非翻译区(3’UTR)和多聚腺苷酸(poly A)。
参考禽流感病毒H5N1 2.3.2.1c分支的4个毒株(GISAID数据库的登录号EPI ISL503026|A/duck/China/0935/2017|A/H5N1|2017-09-22；登录号EPI ISL 14223927|A/chicken/Sabah/6123/2018|A/H5N1|2018-07-01；登录号EPI ISL 198848|A/environment/Jilin/04.25MHK010/2015(H5N1)|A/H5N1|2015-04-25；登录号EPI ISL 219736|A/Environment/Chongqing/47495/2015|A/H5N1|2015-11-18)的HA基因编码序列(https://gisaid.org/)，设计本发明中mRNA疫苗的HA抗原编码序列；其中，Vaccine HA(本发明疫苗原始毒株)序列如SEQ ID NO.1所示。
在上述HA抗原编码序列的基础上，更换HA蛋白N端的信号肽编码序列为IgE信号肽序列(氨基酸序列为MDWTWILFLVAAATRVHD)，同时在HA蛋白的C端加入His标签。为了实现HA蛋白的分泌表达并增强免疫原性，去掉HA蛋白的跨膜区，用3×GGGGS的柔性Linker将胞内区与胞外区连接，并将序列进行禽源(HA-3/4)密码子优化，密码子优化为南京金斯瑞生物科技有限公司在线软件OptimumGene进行密码子优化。
mRNA疫苗的抗原表达重组质粒序列如下：
(1)本发明包含T7启动子序列为：
TAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID NO.2)。
(2)本发明包含的5’UTR序列为：
GAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCGCTAGCCTCGAG(SEQ IDNO.3)。
(3)本发明包含的3’UTR序列为：
GGTACCGATATCTGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCC CAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGA(SEQ ID NO.4)。
(4)本发明包含的poly A序列为含有50～150个碱基A，优选为含有101个碱基A，序列为：
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO.5)。
(5)优化后的HA基因的序列如下：
优化后的HA-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，优化后的HA-3对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.7
所示，其中包含IgE信号肽序列(氨基酸序列为：MDWTWILFLVAAATRVHD，SEQ IDNO.8)；
优化后的HA-4的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，优化后的HA-4对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，其中包含IgE信号肽序列(氨基酸序列为：MDWTWILFLVAAATRVHD，SEQ ID NO.11)。
(6)mRNA疫苗序列如下，由南京金斯瑞生物科技公司合成，并克隆至pUC57-Kan载体(购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司)。
序列C：包含T7启动子、5’端非翻译区(5’UTR)、经密码子优化的HA基因(HA-3)、3’端非翻译区(3’UTR)和多聚腺苷酸(poly A)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
序列D：包含T7启动子、5’端非翻译区(5’UTR)、经密码子优化的HA基因(HA-4)、3’端非翻译区(3’UTR)和多聚腺苷酸(poly A)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
所合成的DNA序列经测序比对验证后，使用质粒提取试剂盒提取2种质粒，并将质粒分别命名为pUC-H5N1-HA-3(pUC57-Kan+序列C)和pUC-H5N1-HA-4(pUC57-Kan+序列D)，使用紫外分光光度计检测质粒浓度和纯度，备用。
实施例2mRNA转录验证试验
将实施例1中所获得的质粒(pUC-H5N1-HA-3和pUC-H5N1-HA-4)分别用Bsa I限制性核酸内切酶进行酶切，使质粒线性化，随后电泳鉴定质粒，结果如图1所示，目的条带约5000bp，与预期大小一致。使用常规胶回收试剂盒回收线性化质粒，并用无RNA酶的洗脱液洗脱，得到线性化质粒溶液，使用紫外分光光度计检测质粒溶液浓度和纯度。
使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的T7 High Yield RNA TranscriptionKit(N1-Me-Pseudo UTP)的mRNA转录试剂盒和南京诺唯赞生物科技股份有限公司的Vaccinia Capping System加帽试剂盒，按照说明书进行操作，制备含有N1-pseudoUTP的mRNA后，将所得的mRNA溶于无RNA酶的水中，用分光光度计检测质粒溶液浓度和纯度。
将RNA样品与2×RNA上样缓冲液1：1(体积比)混匀，将混合液先用70℃金属浴热变性10分钟，再冰浴5分钟，使用变性RNA凝胶电泳(120V，20min)验证产物，结果如图2所示，目的mRNA pUC-H5N1-HA-3和pUC-H5N1-HA-4约为2000nt，与预期相符。
实施例3HA蛋白表达验证试验
使用RNA转染试剂盒，将实施例2中所得的mRNA转染至6孔板中的BHK细胞(购广州自吉妮欧生物科技有限公司)中，每孔转染1μg mRNA。转染48h后，收集细胞上清液，用浓缩管浓缩后进行SDS-PAGE电泳，转膜封闭后，分别用抗His标签抗体鉴定HA蛋白产物，结果如图3所示，与对照组相比，转染了pUC-H5N1-HA-3和pUC-H5N1-HA-4mRNA的试验组中均出现了约75kDa的明显的条带，与预期相符。
实施例4制备mRNA疫苗
对于实施例2中所获得的与pUC-H5N1-HA-3和pUC-H5N1-HA-4质粒分别对应的2种mRNA，分别使用脂质体包装技术分别进行包装，制备mRNA脂质体纳米颗粒疫苗，具体步骤为：将脂质按阳离子脂质(阳离子脂质SM102):二硬酯酰磷脂酰胆碱(DSPC):胆固醇：DMG-PEG2000(四种脂质均购自赛诺邦格)＝50:10:38.5:1.5(质量比)的比例溶于无水乙醇，作为醇相；将mRNA溶于50mM的柠檬酸缓冲液(pH4.0)，作为水相；随后将醇相和水相按1:3(体积比)的比例用微流控系统进行混合包裹，获得制剂后用PBS缓冲液稀释，并用30KD超滤管进行浓缩换液，调整mRNA浓度为120ug/ml后，按等体积加入蔗糖浓度为20％(w/v)的PBS溶液，使mRNA浓度为60ug/ml，蔗糖浓度为10％(w/v)，并用0.22μm滤膜，获得pUC-H5N1-HA-3mRNA疫苗和pUC-H5N1-HA-4mRNA疫苗制剂，并于4℃储存备用。最后鉴定疫苗的LNP粒径、Zeta电位和包封率。采用粒度分析仪检测最终疫苗制剂的粒径，分散系数(PDI)和透射电镜分析的代表性结果如图4所示，包封率约为90％。
实施例5攻毒实验
为验证上述实施例4中获得的禽源密码子优化后的pUC-H5N1-HA-3mRNA疫苗和pUC-H5N1-HA-4mRNA疫苗的免疫效果，实施小鼠动物试验。将购自广州谨为生物科技有限公司的体重为18-20g的40只6周龄SPF BALB/c雌性小鼠随机分成4组，每组10只小鼠，分别为pUC-H5N1-HA-3mRNA疫苗组(第1组)、pUC-H5N1-HA-4mRNA疫苗组(第2组)、pUC-H5N1-HA-4mRNA疫苗组+HA蛋白的序贯免疫组(第3组)和PBS空白对照组(第4组)：
第1组、第2组和第4组小鼠经左和右后腿(即总注射量为20μg/只，两只后腿各注射一半的剂量10μg)内侧肌肉分别注射10μg pUC-H5N1-HA-3mRNA疫苗、10μg pUC-H5N1-HA-4mRNA疫苗、以及与mRNA疫苗等体积的PBS缓冲液，这3组实验在首次免疫3周后实施等剂量(相同药物)的加强免疫。
第3组小鼠首先经左和右后腿内侧肌肉分别注射10μg pUC-H5N1-HA-4mRNA疫苗，免疫3周后实施HA亚单位疫苗的加强免疫，免疫剂量为每只小鼠30μl血凝效价为12log2的HA蛋白，免疫前与MontanideTM ISA 71VG佐剂乳化(体积比为3：7)；其中，HA亚单位疫苗由本实验室按照常规杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备：
(1)将实施例1中Vaccine HA(SEQ ID NO.1)在线序列优化网站(www.vectorbuilder.cn/tool/codon-optimization.html)进行密码子优化(优化后的Vaccine HA的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)，并送华大基因合成，并克隆至pFastBac1载体。挑取单克隆菌落，提取质粒将重组质粒pFastBac1-HA转化DH10Bac，通过蓝白斑筛选，挑取白色菌落进行特异性PCR，将鉴定正确的菌落命名为Bacmid-HA，大提质粒保存在-20℃，备用。
(2)利用常规脂质体介导转染法，将制得的重组杆状病毒质粒Bacmid-HA转染sf9昆虫细胞(Invitrogen公司)，于27℃培养；培养至72h时，细胞出现病变，收集细胞培养上清，即分别获得第一代重组杆状病毒(P1)BV-HA。将P1代重组杆状病毒接种sf9细胞，待细胞病变明显时，收集细胞上清(即P2代重组杆状病毒)，依次方法，继续获得P3代HA重组杆状病毒。
(3)将P3代HA重组杆状病毒按照MOI＝1接种悬浮培养的High five细胞(Invitrogen公司)，接种96h收获细胞，离心后获得细胞；细胞重悬后破碎，离心收获细胞内破碎上清；经测细胞破碎上清血凝效价为12log2。取少量进行WB检测目的蛋白表达情况，结果如图6所示，结果表明HA蛋白大小约为75kDa，表明HA蛋白成功表达。剩余样品通过Ni柱纯化，并保存在-20℃备用。
上述4组实验，在首次免疫后第5周，分别使用0.1mL 106EID50剂量的H5亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/D889/2015(H5N1)毒株对各试验小鼠进行滴鼻攻毒。攻毒后两周内每日观察小鼠的发病或死亡情况并记录体重变化，小鼠体重降低至80％以下则判定小鼠死亡，并进行安乐死，最后分析疫苗的保护率。其中，该攻毒D889毒株由华南农业大学人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室提供，已在中国专利申请(申请号为“201910117092.4”、申请名称为“基于MultiBac杆状病毒表达系统的禽流感疫苗及制备与应用”)中公开(文中命名为：H5亚型禽流感病毒H5N1)，D889毒株HA蛋白氨基酸序列(D889毒株的HA基因编码序列如SEQ ID NO.15所示)与本发明中的mRNA疫苗HA蛋白的氨基酸同源性(percent identity)为94.2％(HA基因亲缘关系见图5)。
攻毒保护情况如图7所示，攻毒后，PBS组小鼠体重持续降低，并在攻毒后第5天全部死亡。pUC-H5N1-HA-3mRNA疫苗组、pUC-H5N1-HA-4mRNA疫苗组以及pUC-H5N1-HA-4mRNA疫苗组+HA蛋白的序贯免疫组小鼠的体重在两周内先降低，然后恢复至攻毒前体重。pUC-H5N1-HA-3和pUC-H5N1-HA-4mRNA疫苗组疫苗保护率均为100％。
pUC-H5N1-HA-3mRNA疫苗组和pUC-H5N1-HA-4mRNA疫苗组均能对异源的毒株感染起到100％的保护作用，结合攻毒前后的体重变化趋势，pUC-H5N1-HA-3mRNA疫苗组的体重减小的波动明显小于pUC-H5N1-HA-4mRNA疫苗组。因此，pUC-H5N1-HA-3mRNA疫苗的序列设计明显优于pUC-H5N1-HA-4mRNA疫苗。通过分析pUC-H5N1-HA-4mRNA疫苗组以及pUC-H5N1-HA-4mRNA疫苗组+HA蛋白的序贯免疫组小鼠的体重变化趋势类似，说明通过序贯免疫组能够达到有效的保护效果。
实施例6
为进一步评价了pUC-H5N1-HA-3mRNA候选疫苗的有效接种剂量，针对性实施免疫不同剂量的小鼠动物试验。将21只6周龄SPF BALB/c小鼠随机分成5组，其中第1-4组每组4只小鼠，第5组为5只小鼠。第1-4组小鼠经小鼠左和右后腿内侧肌肉分别注射免疫不同剂量的pUC-H5N1-HA-3mRNA疫苗，免疫剂量分别为40+20μg、10+10μg、5+5μg、2+2μg，第5组小鼠经小鼠左和右后腿肌肉分别注射与mRNA疫苗组等体积的PBS缓冲液作为空白对照。首次免疫3周后进行加强免疫。
在首次免疫后第5周，分别使用0.1mL 106EID50剂量的H5亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/D889/2015(H5N1)毒株对各试验小鼠进行滴鼻攻毒。攻毒后两周内每日观察小鼠发病或死亡情况并记录体重变化，统计疫苗保护情况。小鼠体重降低至80％以下则判定为死亡，并进行安乐死。攻毒后第5天处死三只小鼠，分离肺组织检测肺脏的病毒载量。
攻毒保护率结果如图8所示，攻毒后，PBS组小鼠体重持续降低，并在攻毒后第5天全部死亡。免疫不同剂量pUC-H5N1-HA-3mRNA疫苗的小鼠体重先略微降低，然后恢复至攻毒前体重。在两周观察期内，所有疫苗免疫组保护率均为100％。
检测小鼠EID50分析肺脏排毒情况，结果如图9所示，免疫pUC-H5N1-HA-3mRNA疫苗的各组小鼠平均排毒量均远低于PBS组。免疫剂量40+20μg、10+10μg和5+5μg的分组均未检测到小鼠排毒，免疫剂量2+2μg的分组有一只小鼠检测到了排毒，经检测EID50分别为0.75。综上，本发明pUC-H5N1-HA-3mRNA疫苗以最低2μg的剂量、间隔3周免疫小鼠两次，攻毒后可以对异源毒株100％保护，并且可以明显降低攻毒后肺脏载毒量。
实施例7
为进一步评价了pUC-H5N1-HA-3mRNA候选疫苗免疫后抗体产生水平，针对性实施免疫不同剂量的小鼠动物试验。将15只6周龄SPF BALB/c小鼠随机分成3组，每组5只小鼠。第1-2组小鼠经小鼠左和右后腿内侧肌肉分别注射免疫不同剂量的pUC-H5N1-HA-3mRNA疫苗，免疫剂量分别为10+10μg和2+2μg，第3组小鼠经小鼠左和右后腿肌肉分别注射与mRNA疫苗组等体积的PBS缓冲液作为空白对照。首次免疫2周后进行加强免疫。首次免疫后10天以及加强免疫后10通过小鼠眼眶静脉丛采血，采集后在4℃孵育过夜，3000×g离心10分钟，收集并小量分装血清，-20℃保存。将采集血清，加入3倍体积的受体破坏酶(RDE)(购自北京兰易科技有限公司)(1:3稀释)，37℃孵育18h，56℃灭活30min。
在微量反应板的第1孔至11孔中分别加入25μl PBS，第12孔加入50μl PBS；吸取25μl的血清加入到第一孔，混匀，依次倍比稀释至第10孔，弃25μl混合液；然后在第1至11孔均加入4HAU抗原液(A/Chicken/Guangdong/D889/2015(H5N1)毒株)(四单位抗原配制：测定禽流感病毒抗原的血凝效价，以完全血凝的最高稀释倍数为终点，终点稀释倍数除以4即为4HAU的稀释倍数，使用PBS缓冲液将抗原稀释至4HAU。4HAU复核：准备96孔V型板，每孔加入25μL PBS缓冲液；第1孔加入25μL的4HAU，连续2倍倍比稀释至第3孔；加入25μL的1％鸡红细胞悬液，室温静置30min，观察结果)25μl，室温放置1h；每孔均加入25μl 1％鸡红细胞悬液或每孔均加入50μl 0.5％鸡红细胞悬液，振荡混匀，室温放置1h(40min-1h)观察结果，对照红细胞将呈纽扣状沉于孔底。以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数为HI滴度；只有阴阳性对照组均成立的情况下，实验结果才有效。
结果如图10所示：实验结果表明，初免10天，所有实验组均未检测到抗体；加强免疫后10天，10μg组均检测到抗体HI效价，HI效价分别为5log2，5log2，4log2，8log2，3log2；2μg组有两只小鼠检测到抗体HI效价，HI效价分别为5log2，4log2。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种禽流感病毒mRNA疫苗，其特征在于：所述的mRNA疫苗包括T7启动子、5’端非翻译区、密码子优化后的HA抗原编码基因、3’端非翻译区和多聚腺苷酸；其中，密码子优化后的HA抗原编码基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的禽流感病毒mRNA疫苗，其特征在于：所述的密码子优化后的HA抗原编码基因序列如SEQ ID NO.6和/或SEQ ID NO.9所示。
3.根据权利要求1所述的禽流感病毒mRNA疫苗，其特征在于：
所述的T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的5’端非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的3’端非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的多聚腺苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.根据权利要求3所述的禽流感病毒mRNA疫苗，其特征在于：所述的mRNA疫苗包括如SEQ ID NO.12和/或SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1～4任一项所述的禽流感病毒mRNA疫苗，其特征在于：所述的禽流感病毒mRNA疫苗还包含疫苗载体；所述的疫苗载体为可被mRNA利用的脂质体纳米颗粒。
6.权利要求1～5任一项所述的禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将mRNA疫苗基因序列克隆到pUC57-Kan载体上，得到重组质粒；其中，mRNA疫苗基因序列如SEQ ID NO.9和/或SEQ ID NO.10所示；
(2)将重组质粒用Bsa I限制性核酸内切酶，回收线性化质粒，并利用mRNA转录试剂盒进行转录，利用加帽试剂盒进行加帽处理，得到目的mRNA；
(3)将目的mRNA利用脂质体进行包装，得到mRNA脂质体纳米颗粒疫苗，即所述禽流感病毒mRNA疫苗。
7.根据权利要求6所述的禽流感病毒mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的利用脂质体进行包装通过如下步骤实现：
a、将脂质按阳离子脂质、二硬酯酰磷脂酰胆碱、胆固醇和DMG-PEG2000按质量比50:10:38.5:1.5溶于无水乙醇中，作为醇相；
b、将目的mRNA溶于缓冲溶液中，作为水相；
c、将醇相和水相按体积比1:3的比例混合包裹，然后用PBS缓冲液稀释，并用超滤管进行浓缩换液后，加入蔗糖溶液，滤膜过滤，得到mRNA脂质体纳米颗粒疫苗；
步骤a中所述的阳离子脂质为阳离子脂质SM102；
步骤b中所述的缓冲溶液为柠檬酸缓冲液；
步骤c中所述的超滤管为截留分子量为30KD的超滤管；
步骤c中所述的蔗糖的加入量为按其在体系的终浓度为质量百分比10％添加计算。
8.权利要求1～5任一项所述的禽流感病毒mRNA疫苗在制备用于预防H5亚型禽流感病毒(H5N1)感染的药物中的应用。
9.一种H5N1亚型禽流感病毒疫苗，其特征在于：包括权利要求1～5任一项禽流感病毒mRNA疫苗和HA亚单位疫苗；其中，所述的HA亚单位疫苗由HA蛋白和疫苗佐剂混合得到；所述的HA蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.14所示。
10.根据权利要求9所述的H5N1亚型禽流感病毒疫苗，其特征在于：
所述的疫苗佐剂为MontanideTM ISA 71VG佐剂；
所述的HA蛋白和疫苗佐剂的体积比为3：7；
所述的H5N1亚型禽流感病毒疫苗的使用方式为：先接种禽流感病毒mRNA疫苗，免疫3周后利用HA亚单位疫苗的加强免疫。
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