CN106176633A - 一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法 - Google Patents

一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。每1000mlPBS溶液包含以下组分：姬松茸多糖5‑10g、银杏黄酮2‑8g、雷公藤红素4‑8g、脂质体5‑10g、甘露醇5‑15g和乳糖5‑15g。本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以降低半成品的批间差异。本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以促进猪传染性胃肠炎病毒的繁殖，提高病毒含量，增强疫苗的免疫原性。

Description

一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备 方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法。
背景技术
猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenteritis, TGE)是由传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus ,TGEV）引起的一种急性、高度接触性胃肠道传染病。该病主要引起病猪发热、腹泻、呕吐、脱水等临床症状，尤其是２周龄内仔猪病死率可高达100%，造成巨大经济损失，而疫苗免疫接种是预防该病发生的最有效的方法。
脂质体(liposome)是由单层或多层脂质双分子膜以同心圆的形式包封而成，类似细胞膜的微球体，其主要成分为磷脂和胆固醇。脂质体作为药物载体具有使药物靶向网状内皮系统，对正常细胞和组织无损害和抑制作用，还可以表现出良好的细胞亲和性和组织相容性、降低药物毒性和提高疗效等优点。
多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具 有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力。
黄酮类化合物是自然界中存在的多元酚类活性的物质，它是指具有15个碳原子并以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物，是植物在长期自然选择中产生的二级代谢产物，现在已分离鉴定的有4000多种。它广泛存在于果蔬、中草药中，无毒副作用，它具有显著的清除机体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂降血压等药理保健功能，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂，这些抗氧化活性物质可以减少和清除机体内自由基，具有预防疾病的作用。
兽用生物制品质量评定最重要的指标之一就是批次间的稳定性，然而在实际生产过程中难以控制半成品的批次间稳定性，究其原因主要是在接种活体生物时的比例不确定，也就是说接种量不稳定导致生产出半成品有较大的差异，本发明宗旨在于减少猪传染性胃肠炎病毒增殖过程中批次间差异，促进病毒的繁殖，提高病毒的病毒含量。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法的技术方案。
所述的一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每1000mlPBS溶液包含以下组分：姬松茸多糖5-10g、银杏黄酮2-8g、雷公藤红素4-8g、脂质体5-10g、甘露醇5-15g和乳糖5-15g。
所述的一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每1000mlPBS包含以下组分：姬松茸多糖6-8g、银杏黄酮4-6g、雷公藤红素5-7g、脂质体6-8g、甘露醇8-12g和乳糖8-12g。
所述的一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的脂质体通过以下步骤制得：称取大豆卵磷脂和胆固醇，放入至烧杯中，并加入无水乙醇中， 在60℃水浴下搅拌至完全溶解，形成均一溶液；通过减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，使壁上形成均匀脂质体膜，向脂质体膜中加入pH 7的PBS溶液，进行超声处理，超声处理条件：功率300-400W，时间20-30min，即得脂质体。
所述的一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的姬松茸多糖通过以下步骤制得：称取姬松茸加入蒸馏水并混匀，调 pH 至 7.0，再进行进行微波提取，微波提取过程为间歇微波处理，每次 2min，中间停 1 min，补加损失的水分使提取液体积保持相对恒定，处理后将提取液过滤，按同样条件重复提取 1 次，合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩到四分之一体积， 加入终浓度体积分数为 80%的乙醇，于 4 ℃静置 12 h，离心收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀，真空干燥得姬松茸粗多糖。
所述的一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的微波提取时间为8min、微波功率为640W、液料比为1:80g/ml。
所述的一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的PBS溶液通过以下步骤制得：取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
所述的一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将所述重量的组分充分混合后，加入到1000ml pH 7的 PBS溶液中振荡水化，形成均一溶液；经过0.22um的滤器进行过滤后，先放置于-40℃低温冰箱快速冷冻，室温缓慢融化，反复进行四次，再置于-40℃预冻4-8h；最后在真空冻干机中进行干燥，即得猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品。
所述的一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于所述的PBS溶液通过以下步骤制得：取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
本发明中银杏黄酮由湖北远成药业有限公司生产销售，雷公藤红素由成都普菲德生物技术有限公司生产销售。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以降低半成品的批间差异。
2、本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以促进猪传染性胃肠炎病毒的繁殖，提高病毒含量，增强疫苗的免疫原性。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
实施例1：PBS溶液的制备
取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
实施例2：姬松茸多糖的制备
称取姬松茸加入蒸馏水并混匀，调 pH 至 7.0，再进行进行微波提取，微波提取时间为8min、微波功率为640W、液料比为1:80g/ml，微波提取过程为间歇微波处理，每次 2min，中间停 1 min，共进行4次，补加损失的水分使提取液体积保持相对恒定，处理后将提取液过滤，按同样条件重复提取 1 次，合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩到四分之一体积， 加入终浓度体积分数为 80%的乙醇，于 4 ℃静置 12 h，离心收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀，真空干燥得姬松茸粗多糖。
实施例3：脂质体的制备
称取大豆卵磷脂4g和胆固醇4g，放入至烧杯中，并加入无水乙醇500g中， 在60℃水浴下搅拌至完全溶解，形成均一溶液；通过减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，使壁上形成均匀脂质体膜，向脂质体膜中加入pH 7的PBS溶液（实施例1制得）200ml，超声处理（功率300W，25min），即得脂质体。
实施例4：脂质体的制备
称取大豆卵磷脂5g和胆固醇2.5g，放入至烧杯中，并加入无水乙醇625g中， 在60℃水浴下搅拌至完全溶解，形成均一溶液；通过减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，使壁上形成均匀脂质体膜，向脂质体膜中加入pH 7的PBS溶液（实施例1制得）250ml，超声处理（功率400W，20min），即得脂质体。
实施例5：一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品的制备
取姬松茸多糖（实施例2制得）5 g、银杏黄酮2 g、雷公藤红素4 g、脂质体（实施例3制得）5 g 、甘露醇5g和乳糖5g；
将所述重量的组分充分混合后，加入到1000ml pH 7的 PBS溶液中振荡水化，形成均一溶液；经过0.22um的滤器进行过滤后，先放置于-40℃低温冰箱快速冷冻，室温缓慢融化，反复进行四次，再置于-40℃预冻6h；最后在真空冻干机中进行干燥，即得猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品。
实施例6：一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品的制备
取姬松茸多糖（实施例2制得）6 g、银杏黄酮4 g、雷公藤红素5 g、脂质体（实施例4制得）6 g 、甘露醇8g和乳糖8g；
将所述重量的组分充分混合后，加入到1000ml pH 7的 PBS溶液中振荡水化，形成均一溶液；经过0.22um的滤器进行过滤后，先放置于-40℃低温冰箱快速冷冻，室温缓慢融化，反复进行四次，再置于-40℃预冻4h；最后在真空冻干机中进行干燥，即得猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品。
实施例7：一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品的制备
取姬松茸多糖（实施例2制得）10 g、银杏黄酮8 g、雷公藤红素8g、脂质体（实施例4制得）10g 、甘露醇12g和乳糖15g；
将所述重量的组分充分混合后，加入到1000ml pH 7的 PBS溶液中振荡水化，形成均一溶液；经过0.22um的滤器进行过滤后，先放置于-40℃低温冰箱快速冷冻，室温缓慢融化，反复进行四次，再置于-40℃预冻4h；最后在真空冻干机中进行干燥，即得猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品。
试验例1 本发明脂质体稀释液冻干制品的应用
1材料
1.1猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品
按本发明实施例5-7制得。
1.2 猪传染性胃肠炎病毒华毒毒株购自中国兽医药品监察所，ST细胞购自ATCC。
1.3 ６周龄NH小鼠（雌雄各半，清洁级）
2 方法
2.1包封率的测定
分别取空白的冻干脂质体和处理过的脂质体冻干粉，用磷酸盐缓冲液进行复溶，超速离心，取上清，按一定比例稀释，测定其吸光度（参考兽药典），平均每个样品测3次，算其平均值。
2.2 形态观察和粒径
脂质体稀释液冻干粉复溶后，在透射电镜（×20000）下观察
2.3 细胞培养及接毒
按常规细胞培养方法培养ST细胞；在细胞传代后分为12瓶，共分4组，每组3瓶，将本发明实施例3-5制备的脂质体稀释液冻干制品置于磷酸盐缓冲液进行复溶，分别将A、B、C 3种不同批次的病毒稀释成1000 TCID50/ml、1500 TCID50/ml、2000 TCID50/ml ，进行接种。第一组，采用本发明实施例5制备的脂质体稀释液对3种不同批次的TGEV进行稀释接种；第二组，采用本发明实施例6制备的脂质体稀释液对3种不同批次TGEV进行稀释接种；第三组，采用本发明实施例7制备的脂质体稀释液对3不同批次TGEV进行稀释接种；第四组，对照组，采用无血清的细胞培养液对3不同批次TGEV进行稀释接种，将以上各组分别置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养72h之后进行收毒。
2.4 TCID50测定
将传代消化后的细胞稀释成105～ 106 个/m L之后，转入96孔培养板中，按 0. 2 m L/孔；将收获的四组病毒液分别作连续的10倍稀释 ，按0.2 mL /孔 接种，置37℃、5% CO2中培养，每天观察细胞病变并记录，按Reed-Muench 法计算TCID50。
2.5 免疫原性测定
2.5.1 IgG抗体测定
收获2.3提到的培养72h 任一批次四组病毒液经检验合格，分别进行灭活、乳化后制作成疫苗成品用来测定疫苗的免疫原性。选用32只NH小鼠，分4组，每组8只。第Ⅰ组采用经本发明实施例5制备的脂质体稀释液处理过的TGEV灭活乳化后制成的疫苗进行免疫；第Ⅱ组采用经本发明实施例6制备的脂质体稀释液处理过的TGEV灭活乳化后制成的疫苗免疫；第Ⅲ组为采用经本发明实施例7制备的脂质体稀释液处理过的TGEV灭活乳化后制成的疫苗免疫；第Ⅳ组，疫苗对照组，未经脂质体处理灭活后制成的疫苗免疫；各组均按0.1ml/只进行免疫，14d后再以同等剂量加强免疫一次。分别于免疫前及首免后的14d、35d、42d断尾采血，分离血清，运用间接ELISA进行测定TGEV IgG抗体。
2.5.2 外周血CD4+、 CD8+ 淋巴细胞百分比含量的测定
在小鼠首免后的第42d，扑杀小鼠摘除眼球采血，采用流式细胞仪测定免疫小鼠的外周血淋巴细胞中CD3+、CD4+以及 CD8+T淋巴细亚群数量。
3 结果
3.1包封率结果
按照公式：包封率（％）＝系统中包封的药量（A1）/ 系统中包封与未包封的总药量（A2）×100％，结果见表1。
表1包封率测定结果
3.2 形态观察和粒径
脂质体稀释液冻干制品为单室脂质体，粒度规则，为圆形，粒径基本一致。
表2 形态观察和粒径测定结果
3.3 TCID50测定结果
表3 TCID50测定结果
3.4 IgG抗体测定结果
3.5 外周血CD4+、 CD8+ 淋巴细胞百分比含量的测定
4 结论
综上所述，本发明猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品的制作工艺具有很好的重复性，该脂质体稀释液冻干制品不仅可以降低半成品间的批次差异，还可以促进猪传染性胃肠炎病毒的繁殖，提高其病毒含量，进而增强疫苗的免疫原性。

Claims (8)

1.一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每1000mlPBS溶液包含以下组分：姬松茸多糖5-10g、银杏黄酮2-8g、雷公藤红素4-8g、脂质体5-10g、甘露醇5-15g和乳糖5-15g。
2.如权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每1000mlPBS包含以下组分：姬松茸多糖6-8g、银杏黄酮4-6g、雷公藤红素5-7g、脂质体6-8g、甘露醇8-12g和乳糖8-12g。
3.如权利要求1或2所述的一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的脂质体通过以下步骤制得：称取大豆卵磷脂和胆固醇，放入至烧杯中，并加入无水乙醇中， 在60℃水浴下搅拌至完全溶解，形成均一溶液；通过减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，使壁上形成均匀脂质体膜，向脂质体膜中加入pH 7的PBS溶液，进行超声处理，超声处理条件：功率300-400W，时间20-30min，即得脂质体。
4.如权利要求1或2所述的一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的姬松茸多糖通过以下步骤制得：称取姬松茸加入蒸馏水并混匀，调 pH 至 7.0，再进行进行微波提取，微波提取过程为间歇微波处理，每次 2min，中间停 1 min，补加损失的水分使提取液体积保持相对恒定，处理后将提取液过滤，按同样条件重复提取 1 次，合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩到四分之一体积， 加入终浓度体积分数为 80%的乙醇，于 4 ℃静置 12 h，离心收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀，真空干燥得姬松茸粗多糖。
5.如权利要求4所述的一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的微波提取时间为8min、微波功率为640W、液料比为1:80g/ml。
6.如权利要求1或2所述的一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的PBS溶液通过以下步骤制得：取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
7.如权利要求1或2所述的一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将所述重量的组分充分混合后，加入到1000ml pH 7的 PBS溶液中振荡水化，形成均一溶液；经过0.22um的滤器进行过滤后，先放置于-40℃低温冰箱快速冷冻，室温缓慢融化，反复进行四次，再置于-40℃预冻4-8h；最后在真空冻干机中进行干燥，即得猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品。
8.如权利要求7所述的一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于所述的PBS溶液通过以下步骤制得：取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
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