CN106562934A - 猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法 - Google Patents

猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，包括以下步骤：称取以下重量份的原料：山药多糖5‑15份、麦冬黄酮1‑5份、大黄素1‑5份、脂质体5‑10份、冻干保护剂10‑30份；各原料组分混合均匀后，加入到pH=7的磷酸盐缓冲液中振荡水化，形成均一溶液；将均一溶液过滤所得的滤液置于‑40℃环境中冷冻，再置于室温环境中自然融化，反复进行3~6次后，置于‑40℃环境中预冻4‑8h，再置于真空冻干机中进行干燥，即得猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品。本发明不仅可以降低半成品间的批次差异，还可以促进猪流行性腹泻病毒的繁殖，提高其病毒含量，进而增强疫苗的免疫原性。

Description

猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法。
背景技术
猪流行性腹泻病(Porcine epidemic diarrhea , PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea, PEDV）引起的以严重肠炎、呕吐、水样腹泻、脱水和高死亡率为特征的一种急性、高度接触性传染病。该病主要危害1-2周龄健康哺乳仔猪，死亡率可高达100%，给养猪业造成了巨大的经济损失，而疫苗免疫接种是预防该病发生的最有效的方法。
兽用生物制品质量评定最重要的指标之一就是批次间的稳定性，然而在实际生产过程中难以控制半成品的批次间稳定性，究其原因主要是在接种活体生物时的比例不确定，也就是说接种量不稳定导致生产出半成品有较大的差异，从而影响病毒的繁殖和病毒含量，使得疫苗免疫接种不能高效地预防猪流行性腹泻病的发生。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，本发明可有效减少猪流行性腹泻病毒增殖过程中批次间差异，促进病毒的繁殖，提高病毒的病毒含量，增强疫苗的免疫原性。
为解决上述技术问题，本发明包括以下步骤：
（1）称取以下重量份的原料：山药多糖5-15份、麦冬黄酮1-5份、大黄素1-5份、脂质体5-10份、海藻糖5-15份和甘露醇5-15份；
（2）将步骤（1）中的各原料组分混合均匀后，加入到pH=7的磷酸盐缓冲液中振荡水化，形成均一溶液；
（3）冻干：对步骤（2）中的均一溶液进行过滤，所得的滤液置于-40℃环境中冷冻，再置于室温环境中自然融化，即冷冻—融化步骤；所述冷冻—融化步骤重复进行3~6次后，置于-40℃环境中预冻4-8h，再置于真空冻干机中进行干燥，即得猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品。
进一步的，所述步骤（3）为：步骤（2）中均一溶液经0.22um过滤器过滤后，将所得滤液置于-40℃低温冰箱快速冷冻，再置于室温环境中自然融化，即冷冻—融化步骤；所述冷冻—融化步骤重复进行4次后，将滤液分装于冻干瓶，置于-40℃低温冰箱中预冻4-8h，再置于真空冻干机中进行干燥，即得猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品。
进一步的，所述步骤（1）中所述麦冬黄酮提取过程如下：称取适量麦冬，按料液比1:14加入90%乙醇，设置微波炉的功率为900W，微波提取4min，水浴回流30min，所得提取液经过滤后蒸干，即得麦冬黄酮。
进一步的，所述步骤（1）中所述脂质体由以下方法制备：
A．称取大豆卵磷脂2-4g、胆固醇3-4g置于容器中，并加入无水乙醇500-800mL中，在60℃水浴条件下搅拌至完全溶解，形成均一溶液；
B．步骤A中所得均一溶液经减压蒸馏去除无水乙醇后得脂质体膜，向脂质体膜中加入pH=7的磷酸盐缓冲液200-320mL，经超声处理得脂质体。
进一步的，所述pH=7的磷酸盐缓冲液的制备方法如下：
a．称取下列原料组分：氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g和六水氯化镁0.05-0.2g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
其中，脂质体(Lipsomes)是一种内部包含水相的闭合囊泡状结构，它是由天然磷脂或磷脂类似物在水中自发形成的单层或多层脂质双分子膜，类似细胞膜的微球体。脂质体是由亲油和亲水的双亲分子所构成这一性质，使得脂溶性和水溶性的药物都可以被脂质体包封，被包封的药物均可以在体内呈现出药物本身不同的特点。脂质体作为药物载体，具有靶向性、与细胞的亲和性、缓释性、无毒性、长效性、给药途径多样性等优势。
多糖是一类天然大分子物质，广泛存在于动物、植物和微生物细胞中，是构成生命的四大基本物质之一。多糖参与了细胞的各种生命活动的调节，如免疫细胞间信息的传递和感受。多糖作为非细胞毒物质，参与生命现象中细胞的各种活动，对正常细胞几乎无毒副作用。
黄酮类化合物是自然界中存在的多元酚类活性的物质，它是指具有15个碳原子并以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物，是植物在长期自然选择中产生的二级代谢产物，现在已分离鉴定的有4000多种。它广泛存在于果蔬、中草药中，无毒副作用，它具有显著的清除机体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂降血压等药理保健功能，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂，这些抗氧化活性物质可以减少和清除机体内自由基，具有预防疾病的作用。
本发明中涉及的山药多糖、大黄素和海藻糖均为现有产品，其中山药多糖由上海永叶生物科技有限公司生产销售，大黄素和海藻糖由百灵威科技有限公司生产销售。
本发明的有益效果如下：本发明所述脂质体稀释液冻干制品的制备方法可以降低半成品的批间差异，促进猪流行性腹泻病毒的繁殖，提高病毒含量，增强疫苗的免疫原性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体说明。
实施例1：
（1）配制磷酸盐缓冲液：
a．称取下列原料组分：氯化钠6g、氯化钾0.05g、磷酸氢二钠1g、磷酸二氢钾0.05g、氯化钙0.05g和六水氯化镁（MgCl2·6H2O）0.05g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
（2）麦冬黄酮的提取：
称取5g麦冬，按料液比1:14加入90%乙醇，设置微波炉的功率为900W，微波提取4min，水浴回流30min，所得提取液经过滤后蒸干，即得麦冬黄酮。
（3）脂质体的制备
A．称取2g大豆卵磷脂和3g胆固醇置于烧杯中，并加入500mL无水乙醇中，在60℃水浴条件下搅拌至完全溶解，形成均一溶液；
B．步骤A中所得均一溶液经减压蒸馏去除无水乙醇，使得烧杯壁上形成均匀脂质体膜，向脂质体膜中加入200mL pH=7的磷酸盐缓冲液，经薄膜分散-超声法处理得脂质体。
（4）猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品的制备
1）称取以下重量份的原料：山药多糖5份、麦冬黄酮1份、大黄素1份、脂质体5份、海藻糖5份和甘露醇5份；
2）将步骤1）中的各原料组分混合均匀后，加入到pH=7的磷酸盐缓冲液中振荡水化，形成均一溶液；
3）冻干：将步骤2）中均一溶液经0.22um过滤器过滤后，将所得滤液置于-40℃低温冰箱快速冷冻，再置于室温环境中自然融化，即冷冻—融化步骤；所述冷冻—融化步骤反复进行3次后，将滤液分装于冻干瓶，置于-40℃低温冰箱中预冻8h，再置于真空冻干机中进行干燥，即得猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品。
实施例2:
（1）配制磷酸盐缓冲液：
a．称取下列原料组分：氯化钠8g、氯化钾0.3g、磷酸氢二钠1.1g、磷酸二氢钾0.25g、氯化钙0.1g和六水氯化镁（MgCl2·6H2O）0.13g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
（2）麦冬黄酮的提取：
称取5g麦冬，按料液比1:14加入90%乙醇，设置微波炉的功率为900W，微波提取4min，水浴回流30min，所得提取液经过滤后蒸干，即得麦冬黄酮。
（3）脂质体的制备
A．称取4g大豆卵磷脂和4g胆固醇置于烧杯中，并加入800mL无水乙醇中，在60℃水浴条件下搅拌至完全溶解，形成均一溶液；
B．步骤A中所得均一溶液经减压蒸馏去除无水乙醇，使得烧杯壁上形成均匀脂质体膜，向脂质体膜中加入320mL pH=7的磷酸盐缓冲液，经薄膜分散-超声法处理得脂质体。
（4）猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品的制备
1）称取以下重量份的原料：山药多糖8份、麦冬黄酮3份、大黄素3份、脂质体8份、海藻糖6份和甘露醇8份；
2）将步骤1）中的各原料组分混合均匀后，加入到pH=7的磷酸盐缓冲液中振荡水化，形成均一溶液；
3）冻干：将步骤2）中均一溶液经0.22um过滤器过滤后，将所得滤液置于-40℃低温冰箱快速冷冻，再置于室温环境中自然融化，即冷冻—融化步骤；所述冷冻—融化步骤反复进行4次后，将滤液分装于冻干瓶，置于-40℃低温冰箱中预冻6h，再置于真空冻干机中进行干燥，即得猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品。
实施例3：
（1）配制磷酸盐缓冲液：
a．称取下列原料组分：氯化钠10g、氯化钾0.5g、磷酸氢二钠1.2g、磷酸二氢钾0.5g、氯化钙0.2g和六水氯化镁（MgCl2·6H2O）0.2g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
（2）麦冬黄酮的提取：
称取5g麦冬，按料液比1:14加入90%乙醇，设置微波炉的功率为900W，微波提取4min，水浴回流30min，所得提取液经过滤后蒸干，即得麦冬黄酮。
（3）脂质体的制备
A．称取4g大豆卵磷脂和4g胆固醇置于烧杯中，并加入800mL无水乙醇中，在60℃水浴条件下搅拌至完全溶解，形成均一溶液；
B．步骤A中所得均一溶液经减压蒸馏去除无水乙醇，使得烧杯壁上形成均匀脂质体膜，向脂质体膜中加入320mL pH=7的磷酸盐缓冲液，经薄膜分散-超声法处理得脂质体。
（4）猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品的制备
1）称取以下重量份的原料：山药多糖15份、麦冬黄酮5份、大黄素5份、脂质体10份、海藻糖15份和甘露醇15份；
2）将步骤1）中的各原料组分混合均匀后，加入到pH=7的磷酸盐缓冲液中振荡水化，形成均一溶液；
3）冻干：将步骤2）中均一溶液经0.22um过滤器过滤后，将所得滤液置于-40℃低温冰箱快速冷冻，再置于室温环境中自然融化，即冷冻—融化步骤；所述冷冻—融化步骤反复进行6次后，将滤液分装于冻干瓶，置于-40℃低温冰箱中预冻4h，再置于真空冻干机中进行干燥，即得猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品。
试验例：本发明脂质体稀释液冻干制品的应用。
1.材料准备
试验材料为本发明实施例1至3所制备的脂质体稀释液冻干制品。猪流行性腹泻病毒CV777株购自中国菌种保藏中心，非洲绿猴传代肾细胞（Vero）细胞系购自ATCC。试验对象为21-28日龄仔猪，其在试验前体内流行性腹泻病毒抗体为阴性。
2．试验内容
2.1包封率的测定
分别取本发明实施例1至3所制备的脂质体稀释液冻干制品，用磷酸盐缓冲液进行复溶，得三组试验样品，其中，第一组试验样品为实施例1中的脂质体稀释液冻干制品，第二组试验样品为实施例2中的脂质体稀释液冻干制品，第三组试验样品为实施例3中的脂质体稀释液冻干制品。将10mL试验样品溶液置于超滤杯中，密封后用氮气加压至0.3MPa，接取流出液，经高效液相色谱法测定流出液中的药物含量w，平均每个样品测3次，分别编号1，2，3；测定空白、未经处理的冻干脂质体中的药物含量w0，利用包封率的计算公式 (w0 -w)/w0×100%，计算得出实验样品的包封率，结果如表1。
表1包封率测定结果
2.2 形态和粒径观测
将2.1中所得的3组脂质体稀释液制品复溶后的溶液分别置于透射电镜（×20000）下进行观察，观察结果如表2所示，本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品均为单室脂质体、粒度规则、圆形，且粒径基本一致。
表2 形态观察和粒径测定结果
2.3 细胞培养及接毒
按常规细胞培养方法培养Vero细胞，在细胞传代后分为12瓶，共分4组，每组3瓶，将本发明实施例1至3制备的脂质体稀释液冻干制品置于磷酸盐缓冲液进行复溶，分别将A、B、C3种不同批次的病毒稀释成1000 TCID50/mL、1500 TCID50/mL、2000 TCID50/mL，进行接种。第一组：采用本发明实施例1制备的脂质体稀释液冻干制品的复溶液对3种不同批次的PEDV进行稀释接种；第二组：采用本发明实施例2制备的脂质体稀释液冻干制品的复溶液对3种不同批次PEDV进行稀释接种；第三组：采用本发明实施例3制备的脂质体稀释液冻干制品的复溶液对3种不同批次PEDV进行稀释接种；第四组：对照组，采用无血清的细胞培养液对3种不同批次PEDV进行稀释接种，将以上各组分别置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养72h之后进行收毒，得四组病毒液。
2.4 TCID50测定
将2.3中所得传代后的Vero细胞稀释成105～106个/mL后，按0.2 mL/孔转入96孔培养板中；将2.3中所获得的四组病毒液分别作连续的10倍稀释，按0.2mL/孔接种，并置于37℃、5% CO2条件下进行培养，每天观察细胞病变情况并进行记录。按Reed-Muench法计算TCID50，结果如表3所示。
表3 TCID50测定结果
2.5 免疫原性测定
采用体内流行性腹泻病毒抗体为阴性的21-28日龄仔猪20头，每组4头，随机分为５组，分别记为第Ⅰ组、第Ⅱ组、第Ⅲ组、第Ⅳ组和对照组。其中，第Ⅰ组、第Ⅱ组、第Ⅲ组和第Ⅳ组分别在后海穴接种2.3所获得的培养72h后经检验合格的任一批次四组病毒液（均稀释至106.0TCID50/ml），对照组不进行接种。在病毒接种30d后，用108.0TCID50/ml的猪流行性腹泻强毒株对仔猪进行滴鼻攻毒，按1mL/头进行接种，观察15d，并记录临床症状。结果如表4所示。
表4 免疫原性检测结果
注：“-”表示有轻微临床症状，“+”表示有严重临床症状。
综上所述，本发明猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品的制作工艺具有很好的重复性，该脂质体稀释液冻干制品不仅可以降低半成品间的批次差异，还可以促进猪流行性腹泻病毒的繁殖，提高其病毒含量，进而增强疫苗的免疫原性。

Claims (5)

1.猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）称取以下重量份的原料：山药多糖5-15份、麦冬黄酮1-5份、大黄素1-5份、脂质体5-10份、海藻糖5-15份和甘露醇5-15份；
（2）将步骤（1）中的各原料组分混合均匀后，加入到pH=7的磷酸盐缓冲液中振荡水化，形成均一溶液；
（3）冻干：对步骤（2）中的均一溶液进行过滤，所得的滤液置于-40℃环境中冷冻，再置于室温环境中自然融化，即冷冻—融化步骤；所述冷冻—融化步骤重复进行3~6次后，置于-40℃环境中预冻4-8h，再置于真空冻干机中进行干燥，即得猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于所述步骤（3）为：步骤（2）中均一溶液经0.22um过滤器过滤后，将所得滤液置于-40℃低温冰箱中快速冷冻，再置于室温环境中自然融化，即冷冻—融化步骤；所述冷冻—融化步骤重复进行4次后，将滤液分装于冻干瓶，置于-40℃低温冰箱中预冻4-8h，再置于真空冻干机中进行干燥，即得猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品。
3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中所述麦冬黄酮提取过程如下：称取适量麦冬，按料液比1:14加入90%乙醇，设置微波炉的功率为900W，微波提取4min，水浴回流30min，所得提取液经过滤后蒸干，即得麦冬黄酮。
4.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中所述脂质体由以下方法制备：
A．称取大豆卵磷脂2-4g、胆固醇3-4g置于容器中，并加入无水乙醇500-800mL中，在60℃水浴条件下搅拌至完全溶解，形成均一溶液；
B．步骤A中所得均一溶液经减压蒸馏去除无水乙醇后得脂质体膜，向脂质体膜中加入pH=7的磷酸盐缓冲液200-320mL，经超声处理得脂质体。
5.根据权利要求1或4所述的猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于所述pH=7的磷酸盐缓冲液的制备方法如下：
a．称取下列原料组分：氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g和六水氯化镁0.05-0.2g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
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