ES2948971T3 - Lípido catiónico - Google Patents

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Abstract

La presente invención proporciona un lípido catiónico que puede usarse para el suministro de ácido nucleico al citoplasma. Un lípido catiónico según la presente invención es, por ejemplo, un compuesto representado por la fórmula (1a) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. (En la fórmula (1a), cada uno de L1 y L2 representa independientemente un grupo alquileno que tiene de 3 a 10 átomos de carbono; cada uno de R1 y R2 representa independientemente un grupo alquilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono o un grupo alquenilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono. ; X1 representa un enlace sencillo o -CO-O-; y el anillo P representa una de las fórmulas (P-1) a (P-5).) (En las fórmulas (P-1) a (P-5), R3 representa un grupo alquilo que tiene de 1 a 3 átomos de carbono). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Lípido catiónico
Campo técnico
La presente invención se refiere a un lípido catiónico novedoso.
Antecedentes técnicos
Los ácidos nucleicos, tales como los vectores de expresión de ARNip (ARN interferente pequeño), miARN (microARN) y ARNhp (ARN de horquilla corta o ARN de horquilla pequeña), y los oligonucleótidos de antisentido inducen el silenciamiento génico específico de secuencia in vivo y son conocidos como agentes terapéuticos oligonucleotídicos. Entre los agentes terapéuticos oligonucleotídicos, los ARNip han atraído una atención particular. Los ARNip son ARN bicatenarios que consisten en 19 a 23 pares de bases e inducen el silenciamiento génico específico de secuencia denominado interferencia por ARN (iARN).
Los ARNip son químicamente estables; sin embargo, los ARNip plantean problemas en aplicaciones terapéuticas, tales como ser susceptibles a ser descompuestos por RNasa (ribonucleasa) en plasma y ser tener poca probabilidad de atravesar la membrana celular en solitario (por ejemplo, véase el documento de patente 1).
Para tratar los problemas anteriores, se sabe que mediante la encapsulación de ARNip en una partícula fina que contiene un lípido catiónico, el ARNip encapsulado se protege de la descomposición en el plasma sanguíneo y puede penetrar en la membrana celular lipófila (por ejemplo, véase el documento de patente 1).
El documento de patente 2 a 5 divulgan lípidos catiónicos donde se usan para la administración de agentes terapéuticos oligonucleotídicos, tales como ARNip y que tienen biodegradabilidad mejorada.
Las partículas finas que contienen lípidos catiónicos tienen un problema de estabilidad tal que es probable que las partículas se agreguen durante el almacenamiento, y se conoce un método para prevenir la agregación añadiendo lípidos modificados con polietilenglicol (PEG-lípidos) a las partículas finas. Además, el documento de patente 6 divulga un método para prevenir la agregación y mejorar la eficiencia de administración de ácidos nucleicos al configurar las partículas finas que comprenden un PEG-lípido específico, que es PEG-DPG, y una preparación que comprende las partículas finas y un disolvente desionizado.
Lista de citas
Documentos de patente
Documento de patente 1: WO 2010/144740
Documento de patente 2: WO 2011/153493
Documento de patente 3: WO 2013/086354
Documento de patente 4: WO 2013/158579
Documento de patente 5: WO 2015/095346
Documento de patente 6: WO 2014/089239
Sumario de la invención
Problema técnico
Sin embargo, a pesar de los recientes avances, todavía existe la necesidad de un lípido catiónico que se pueda usar para la administración de ácidos nucleicos al citoplasma.
Solución al problema
La presente invención se refiere a [1] a [15] indicados a continuación.
[1] Un compuesto representado por la fórmula (1a) a continuación o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000003_0001
en donde L1 y L2 independientemente representan un grupo alquileno que tiene de 3 a 10 átomos de carbono; R1 y R2 independientemente representan un grupo alquilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono o un grupo alquenilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono; X1 representa un enlace sencillo o -CO-O-; y el anillo P representa cualquiera de las fórmulas (P-1) a (P-5) a continuación:
Figure imgf000003_0002
en donde R3 representa un grupo alquilo que tiene de 1 a 3 átomos de carbono.
[2] El compuesto de acuerdo con [1] representado por la fórmula (1) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000003_0003
en donde L1 y L2 independientemente representan un grupo alquileno que tiene de 3 a 10 átomos de carbono; R1 y R2 independientemente representan un grupo alquilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono o un grupos alquenilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono; y X1 representa un enlace sencillo o -CO-O-.
[3] El compuesto de acuerdo con [1] o [2] seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por las fórmulas (A1) a (A22) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Figure imgf000003_0004
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000005_0001
[4] El compuesto de acuerdo con cualquiera de [1] a [3] representado por la fórmula (A1) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000005_0002
[5] El compuesto de acuerdo con cualquiera de [1] a [3] representado por la fórmula (A2) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000005_0003
[6] El compuesto de acuerdo con cualquiera de [1] a [3] representado por la fórmula (A3) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000006_0001
[7] El compuesto de acuerdo con cualquiera de [1] a [3] representado por la fórmula (A4) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000006_0002
[8] El compuesto de acuerdo con cualquiera de [1] a [3] representado por la fórmula (A5) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000006_0003
[9] El compuesto de acuerdo con cualquiera de [1] a [3] representado por la fórmula (A9) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000006_0004
[10] El compuesto de acuerdo con cualquiera de [1] a [3] representado por la fórmula (A12) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000007_0001
[11] El compuesto de acuerdo con cualquiera de [1] a [3] representado por la fórmula (A15) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000007_0002
[12] El compuesto de acuerdo con cualquiera de [1] a [3] representado por la fórmula (A20) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000007_0003
[13] Un complejo de lípido que contiene: (I) el compuesto de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [12] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol.
[14] Una composición que contiene: (I) el compuesto de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [12] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol; y (III) un ácido nucleico.
[15] Un método para producir una composición, incluyendo el método: la etapa de mezclar una solución acuosa que contiene disolvente orgánico polar que contiene (I) el compuesto de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [12] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol con una solución acuosa que contiene (III) un ácido nucleico para obtener una solución mixta; y la etapa de reducir el contenido porcentual del disolvente orgánico polar en la solución mixta.
Efecto de la invención
El lípido catiónico de la presente invención tiene uno o más efectos indicados a continuación:
(1) El lípido catiónico de la presente invención permite la liberación eficaz de ácidos nucleicos al citoplasma; (2) El lípido catiónico de la presente invención puede prevenir un aumento en el diámetro de partícula del complejo de lípido durante el almacenamiento durante un determinado periodo de tiempo.
Por lo tanto, el lípido catiónico de la presente invención se puede aplicar como un lípido usado para administrar un ácido nucleico al citoplasma.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1] La figura 1 es un gráfico que ilustra el resultado del ejemplo de ensayo 1.
[Figura 2] La figura 2 es un gráfico que ilustra el resultado del ejemplo de ensayo 2.
Descripción de realizaciones
La presente invención se describe a partir de ahora en este documento en detalle mediante la presentación de realizaciones y ejemplos.
(Lípido catiónico)
En una realización, la presente invención es un compuesto representado por la fórmula (1a) a continuación o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y puede usarse como lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Figure imgf000008_0001
En la fórmula (1a), el anillo P representa cualquiera de las fórmulas (P-1) a (P-5) a continuación.
Figure imgf000008_0002
En las fórmulas (P-1) a (P-5) anteriores, R3 representa un grupo alquilo que tiene de 1 a 3 átomos de carbono. En una realización, el anillo P representa cualquiera de la fórmula (P-1), fórmulas (P-2), (P-4) y (P-5).
En una realización, el anillo P representa la fórmula (P-1).
En una realización, la presente invención es un compuesto representado por la fórmula (1) a continuación o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y puede usarse como lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Figure imgf000008_0003
En la fórmula (1a) y fórmula (1), L1 y L2 independientemente representan un grupo alquileno que tiene de 3 a 10 átomos de carbono; R1 y R2 independientemente representan un grupo alquilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono o un grupos alquenilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono; y X1 representa un enlace sencillo o -CO-O-.
Como se usa en este documento, "alquilo" significa un grupo de hidrocarburo alifático saturado lineal, cíclico o ramificado que tiene un número indicado de átomos de carbono.
Como se usa en este documento, "alquenilo" significa un grupo de hidrocarburo lineal o ramificado que tiene un número indicado de átomos de carbono y al menos un doble enlace carbono-carbono. Ejemplos de los mismo incluyen monoenos, dienos, trienos y tetraenos.
Como se usa en este documento, "alquileno" significa un grupo de hidrocarburo alifático saturado bivalente lineal, cíclico o ramificado que tiene un número indicado de átomos de carbono.
Como se usa en este documento, "halógeno" significa F, Cl, Br o I.
Una realización de la presente invención es un compuesto representado por la fórmula (1a) o fórmula (1) anterior, en donde L1 y L2 independientemente representan un grupo alquileno que tiene de 3 a 10 átomos de carbono (por ejemplo, de 5 a 10 átomos de carbono o de 3 a 8 átomos de carbono); R1 y R2 independientemente representan un grupo alquilo que tiene de 4 a 18 átomos de carbono o un grupo alquenilo que tiene de 4 a 18 átomos de carbono; y X1 representa un enlace sencillo o -CO-O-, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y puede usarse como lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Una realización de la presente invención es un compuesto representado por la fórmula (1a) o fórmula (1) anterior, en donde L1 y L2 independientemente representan un grupo alquileno lineal que tiene de 3 a 10 átomos de carbono (por ejemplo, de 5 a 10 átomos de carbono o de 3 a 8 átomos de carbono); R1 y R2 independientemente representan un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 4 a 18 átomos de carbono o un grupo alquenilo lineal que tiene de 4 a 18 átomos de carbono; y X1 es -CO-O-, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y puede usarse como lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Por lo tanto, una realización de la presente invención es un compuesto representado por la fórmula (1b) a continuación o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000009_0001
En la fórmula (1b), R1 y R2 independientemente representan un grupo alquilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono o un grupo alquenilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono, preferiblemente un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 4 a 18 átomos de carbono o un grupo alquenilo lineal que tiene de 4 a 18 átomos de carbono; y n1 y n2 independientemente representan un número entero de 3 a 10 (por ejemplo, de 5 a 10 o de 3 a 8).
En una realización de la presente invención, la presente invención es un compuesto de fórmula (1a) o fórmula (1) anterior, en donde X1 es -CO-O-; L1 es igual que L2; y R1 es igual que R2 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y puede usarse como lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal. En una realización de la presente invención, la presente invención es un compuesto de fórmula (1a) o fórmula (1) anterior, en donde L1 y L2 independientemente representan un grupo alquileno lineal que tiene de 5 a 10 átomos de carbono; R1 es un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 4 a 18 átomos de carbono o un grupo alquenilo lineal que tiene de 4 a 18 átomos de carbono; R2 es un grupo alquilo lineal que tiene de 4 a 18 átomos de carbono; y X1 es un enlace sencillo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En la presente realización, el número total de átomos de carbono de L2 y R2 es preferiblemente de 9 a 12. El compuesto de la presente realización puede usarse como lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Por lo tanto, una realización de la presente invención es un compuesto representado por la fórmula (1c) a continuación o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000010_0001
En la fórmula (1c), R1 es un grupo alquilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono o un grupo alquenilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono, preferiblemente un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 4 a 18 átomos de carbono o un grupo alquenilo lineal que tiene de 4 a 18 átomos de carbono; n1 representa un número entero de 3 a 10 (por ejemplo, de 5 a 10 o de 3 a 8); y n2 representa un número entero de 8 a 25, preferiblemente de 8 a 11.
Ejemplos del compuesto de acuerdo con la realización se indican a continuación.
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Figure imgf000011_0001
Una realización de la presente invención es un compuesto representado por cualquiera de las fórmulas (A1) a (A22) anteriores o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y puede usarse como lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Una realización de la presente invención es un compuesto representado por cualquiera de las fórmulas (A1) a (A5) y (A9) a (A22) anteriores, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y puede usarse como lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Una realización de la presente invención es un compuesto representado por cualquiera de las fórmulas (A1), (A2), (A3), (A4), (A5), (A9), (A12), (A15), (A16), (A17), (A19), (A20) y (A22) anteriores, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y puede usarse como lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Una realización de la presente invención es un compuesto representado por cualquiera de las fórmulas (A1), (A2), (A3), (A4), (A5), (A9), (A12), (A15) y (A20) anteriores, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y puede usarse como lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Una realización de la presente invención es un compuesto representado por cualquiera de las fórmulas (A1), (A2), (A3), (A4) y (A5) anteriores o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y puede usarse como lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Una realización de la presente invención es un compuesto representado por cualquiera de las fórmulas (A6), (A7) y (A8) anteriores o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y puede usarse como lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Como se usa en este documento, "lípido catiónico" es una molécula anfífila que tiene una región lipófila que contiene uno o más grupos hidrocarbonados y una región hidrófila que contiene un grupo polar que experimenta protonación a un pH fisiológico. Concretamente, el lípido catiónico de la presente invención puede protonarse para formar un catión. Por ejemplo, el compuesto representado por la fórmula (1) anterior abarca el compuesto (catión) representado por la fórmula (1)' a continuación en que un ion hidrógeno se coordina con un par de electrones solitario en el átomo de nitrógeno en el anillo de piperidina.
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El anión que puede incluirse en el lípido catiónico de la presente realización al formar un par con el catión no está particularmente limitado siempre que el anión sea farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de los mismos incluyen iones inorgánicos tales como un ion cloruro, un ion yoduro, un ion nitrato, un ion sulfato y un ion fosfato; iones de ácido orgánico tales como un ion acetato, un ion oxalato, un ion maleato, un ion fumarato, un ion citrato, un ion benzoato y un ion metanosulfonato.
El lípido catiónico de la presente invención puede tener un estereoisómero, tal como un isómero geométrico y un isómero óptico, o un tautómero. El lípido catiónico de la presente invención engloba todos los posibles isómeros que incluyen los anteriores y las mezclas de los mismos.
(Método de producción del lípido catiónico)
Ahora se describe el método para producir el lípido catiónico de la presente invención. Se indican realizaciones del esquema sintético del lípido catiónico en las fórmulas (10) y (11) a continuación. Todos los compuestos descritos en este documento están englobados por la presente invención como los compuestos. El compuesto de la presente invención puede sintetizarse de acuerdo con al menos un método ilustrado en los esquemas indicados a continuación.
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En la fórmula, L1 y R1 respectivamente se definen como anteriormente; y R es -L2-X1-R2 (en donde L2, X1 y R2 respectivamente se definen como anteriormente) en la fórmula (1).
El lípido catiónico de fórmula (1) (compuesto en donde X1 es un enlace sencillo) puede sintetizarse, por ejemplo, de acuerdo con el esquema 1 ilustrado en la fórmula (10) anterior.
(Etapa 1-1: esterificación)
En primer lugar, el alcohol (a1) y un ácido alquilcarboxílico halogenado X-L1-COOH (X es un átomo de halógeno y L1 se define como anteriormente) (preferiblemente un ácido alquilcarboxílico bromado) se hacen reaccionar en presencia de un agente de condensación para obtener éster halogenado (a2). Ejemplos del agente de condensación incluyen clorhidrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDC), N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y similares. Opcionalmente, puede añadirse una base. Ejemplos de la base incluyen NMM, TEA, DIPEA, DMAP, piridina, picolina, lutidina y similares. Ejemplos del disolvente incluyen tetrahidrofurano (THF), cloruro de metileno, cloroformo, benceno, hexano y acetato de etilo.
(Etapa 1-2: introducción de la cadena de alquilo)
A continuación, se hace reaccionar el éster halogenado (a2) y malonato de di-terc-butilo en presencia de una base. Mediante la reacción, un átomo de hidrógeno de metileno activo en el diéster malónico se sustrae para introducir una cadena de éster alquílico, obteniendo de ese modo el compuesto (a3). Ejemplos de la base incluyen NaH. Ejemplos del disolvente incluyen éteres tales como dioxano, tetrahidrofurano, éter ciclopentil metílico y 1,2-dimetoxietano. (Etapa 1-3: introducción de la cadena de alquilo)
A continuación, el compuesto (a3) y un haluro de alquilo (preferiblemente yoduro) se hacen reaccionar en presencia de una base para introducir una cadena alquilo, obteniendo de ese modo el compuesto (a4). la base y el disolvente pueden ser similares a los de la etapa 1-2 anterior.
(Etapa 1-4: desprotección)
A continuación, el grupo terc-butilo del compuesto (a4) se desprotege en condiciones de hidrólisis ácida para obtener el compuesto (a5). Ejemplos del ácido usado para la desprotección incluyen ácido trifluoroacético (TFA) y ácido clorhídrico. Ejemplos del disolvente incluyen cloruro de metileno.
(Etapa 1-5: descarbonatación)
A continuación, se obtiene ácido carboxílico (a6) por descarbonatación del compuesto (a5). La reacción de descarbonatación puede realizarse, por ejemplo, por calentamiento en un disolvente. Ejemplos del disolvente incluyen hidrocarburos aromáticos tales como benceno, tolueno y xileno.
(Etapa 1-6: etapa de reducción)
El grupo carboxilo del compuesto (a6) se reduce en un grupo hidroxilo en presencia de un agente reductor para obtener el compuesto (a7). Ejemplos del agente reductor incluyen complejos de borano, tales como complejo de borano (BH3)-tetrahidrofurano y complejo de borano-sulfuro de dimetilo. Ejemplos del disolvente incluyen éteres tales como éter dietílico, tetrahidrofurano y dioxano; hidrocarburos halogenados tales como cloroformo, cloruro de metileno y dicloroetano; hidrocarburos tales como hexano, benceno y tolueno; y disolventes mixtos de los mismos.
(Etapa 1-7: esterificación)
El alcohol obtenido (a7) y ácido 1-metil-piperidin-4-carboxílico o un derivado del mismo (haluro de hidrógeno y similares) se hacen reaccionar en presencia de un agente de condensación y una base para obtener un producto final, el compuesto (a8) (R=L2-X1-R2) (compuesto correspondiente al lípido catiónico de fórmula (1)). El agente de condensación y la base usada pueden ser similares a los de la etapa 1-1.
Cuando se sintetiza el compuesto en donde X1 es -CO-O-, puede prepararse un compuesto cuyo grupo carboxilo está protegido de acuerdo con la etapa 2-1 descrita a continuación en la etapa 1-3 del esquema 1 anterior, el compuesto puede hacerse reaccionar con el compuesto (a3) y finalmente puede realizarse desprotección y esterificación.
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En la fórmula, L1 y R1 respectivamente se definen como anteriormente; R es -L2-X1-R2 (L2, X1 y R2 respectivamente se definen como anteriormente) en la fórmula (1).
El esquema 2 anterior ilustra otro método para sintetizar el lípido catiónico de fórmula (1) (compuesto en donde X1 es un enlace sencillo) usado por un experto en la materia.
(Etapa 2-1: esterificación)
En primer lugar, se condensan alcohol bencílico y un ácido alquilcarboxílico halogenado para obtener éster halogenado (b1). Las condiciones de esterificación son las mismas que en la etapa 1-1.
(Etapa 2-2: introducción de la cadena de alquilo)
A continuación, similar a la etapa 1-2, se hace reaccionar el éster halogenado (b1) y malonato de di-terc-butilo en presencia de una base para obtener el compuesto (b2).
(Etapa 2-3: introducción de la cadena de alquilo)
A continuación, similar a la etapa 1-3, el compuesto (b2) y un haluro de alquilo se hacen reaccionar en presencia de una base para obtener el compuesto (b3).
(Etapa 2-4: desprotección)
A continuación, similar a la etapa 1-4, el grupo terc-butoxicarbonilo del compuesto (b3) se desprotege en condiciones de hidrólisis ácida para obtener compuesto (b4).
(Etapa 2-5: descarbonatación)
A continuación, similar a la etapa 1-5, se obtiene ácido carboxílico (b5).
(Etapa 2-6: etapa de reducción)
Además, similar a la etapa 1-6, el producto de la etapa previa se reduce en presencia de un agente reductor para obtener el compuesto (b6).
(Etapa 2-7: esterificación)
El compuesto (b6) obtenido y ácido 1-metil-piperidin-4-carboxílico o un derivado del mismo (haluro de hidrógeno) se esterifican en presencia de un agente de condensación y una base para obtener el compuesto (b7).
(Etapa 2-8: desprotección)
A continuación, en condiciones reductoras, se desprotege el grupo protector de bencilo para obtener el compuesto (b8). La desprotección puede realizarse, por ejemplo, por reacción de hidrogenación catalítica en presencia de un catalizador metálico, tal como paladio/carbono.
(Etapa 2-9: esterificación)
Finalmente, el compuesto (b8) puede hacerse reaccionar con un alcohol (R1OH) para obtener el compuesto (b9) (R=L2-X1-R2) (compuesto correspondiente al lípido catiónico de fórmula (1)).
Cuando se sintetiza el compuesto en donde X1 es -CO-O-, puede hacerse reaccionar un compuesto cuyo grupo carboxilo está protegido de acuerdo con la etapa 2-1, con el compuesto (b2) en la etapa 2-3 del esquema 2 anterior, y el producto puede desprotegerse en la etapa 2-8.
El compuesto de fórmula (1a) anterior también puede sintetizarse de acuerdo con el esquema 1 o 2 anterior. Específicamente, cuando el anillo P tiene una estructura de fórmula (P-1), (P-4) o (P-5), puede usarse un ácido carboxílico correspondiente a la estructura de fórmula (P-1), (P-4) o (P-5) para la reacción de esterificación en, por ejemplo, la etapa 1-7 o etapa 2-7 en lugar de ácido 1-metil-piperidin-4-carboxílico. Cuando el anillo P tiene una estructura de fórmula (P-2) o (P-3), el compuesto representado por la fórmula (1a) puede obtenerse haciendo reaccionar, en lugar de la etapa 1-7, el compuesto a7 obtenido en la etapa 1-6, un reactivo de carbonilación (por ejemplo, un éster cloroformiato tal como cloroformiato de 4-nitrofenilo), y N-alquilpiperazina o N-alquilhomopiperazina (compuesto que tiene la estructura de fórmula (P-2) o (P-3)) en presencia de una base (véase el ejemplo A-8 a continuación).
En la síntesis del compuesto de la presente invención, a menos que se cite particularmente la producción de materiales de partida, los compuestos son conocidos o pueden prepararse de acuerdo con métodos similares que son bien conocidos en la técnica o como se describe en los ejemplos a continuación. Un experto en la materia entiende que los esquemas anteriores son simplemente métodos de preparación típicos del compuesto de la presente invención y que pueden aplicarse otros métodos bien conocidos.
En la preparación del compuesto de la presente invención, puede ser necesaria y/o deseable la protección de un grupo funcional de una molécula. Esto puede realizarse con un grupo protector convencional que es bien conocido por un experto en la materia. El grupo protector puede eliminarse de acuerdo con un método bien conocido en la técnica en cualquier etapa apropiada posterior. Los grupos protectores (tal como un grupo protector de terc-butilo y un grupo protector de bencilo) indicados en los esquemas anteriores pueden remplazarse por otros grupos protectores que son bien conocidos por los expertos en la materia.
(Complejo de lípido)
La presente invención proporciona un complejo de lípido que contiene (I) el lípido catiónico descrito anteriormente y (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol. El complejo de lípido de acuerdo con una realización de la presente invención contiene (I) el lípido catiónico descrito anteriormente, (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol y (III) un ácido nucleico. Por tanto, el complejo de lípido de la presente invención puede contener o no contener un ácido nucleico. El complejo de lípido de la presente realización permite la liberación eficaz de un ácido nucleico en el citoplasma. El complejo de lípido de la presente realización evita que aumente su diámetro de partícula después de almacenamiento durante un determinado periodo de tiempo (por ejemplo, 1 mes o 3 meses) y puede presentar excelente estabilidad física.
Ejemplos de la forma del complejo formado a partir del lípido que contiene el lípido catiónico y un ácido nucleico incluyen un complejo de un ácido nucleico y una membrana (micela inversa) formado a partir de una monocapa lipídica (capa molecular individual), un complejo de un ácido nucleico y un liposoma, un complejo de un ácido nucleico y una micela. En el complejo de lípido de acuerdo con una realización de la presente invención, un ácido nucleico se encapsula en una partícula fina formada con un lípido que contiene el lípido catiónico.
El complejo de lípido de la presente realización contiene, basado en el contenido de lípido total del complejo de lípido, el lípido catiónico a, por ejemplo, un 10 % a un 100 % en moles, tal como un 20 % a un 90 % en moles, tal como un 40 % a un 80 % en moles. El lípido catiónico usado puede usarse solo o como una mezcla de dos o más.
Ejemplos del ácido nucleico incluyen ARNip, miARN, vector de expresión de ARNhp, oligonucleótido de antisentido, ARNm, ribozima y similares. En una realización, el ácido nucleico puede ser ARNip, miARN o ARNm.
El complejo de lípido de la presente realización contiene, con respecto al peso total del complejo de lípido, el ácido nucleico a, por ejemplo, un 0,01 % a un 50 % en peso, tal como un 0,1 % a un 30 % en peso, tal como un 1 % a un 10 % en peso.
El complejo de lípido de la presente realización contiene, como componentes lipídicos, (I) el lípido catiónico y (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol. El complejo de lípido de la presente realización contiene, con respecto al peso total del complejo de lípido, los componentes lipídicos a, por ejemplo, un 50 % a un 100 % en peso, tal como un 70 % a un 99,99 % en peso, tal como un 90 % a un 99 % en peso.
"Lípido neutro" significa un lípido que existe en forma sin carga o en ion anfótero neutro a un pH fisiológico. Ejemplos del lípido neutro incluyen dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoil oleoil fosfatidilcolina (POPC), fosfatidilcolina de huevo (EPC), dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), diestearoil fosfatidilcolina (DSPC), diaraquidoil fosfatidilcolina (DAPC), dibehenoil fosfatidilcolina (DBPC), dilignoceroil fosfatidilcolina (DLPC), dioleoil fosfatidilcolina (DOPC), esfingomielina, ceramida, dioleoil fosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoil fosfatidilglicerol (DPPG), fosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE-mal). El lípido neutro puede usarse solo o como una mezcla de dos o más.
El complejo de lípido de la presente realización puede contener, basado en el contenido de lípido total en el complejo de lípido, el lípido neutro a, por ejemplo, un 0 % a un 50 % en moles, tal como un 0 % a un 40 % en moles, tal como un 0 % a un 30 % en moles.
Ejemplos del lípido modificado con polietilenglicol incluyen PEG2000-DMG (PEG2000-dimiristil glicerol), PEG2000-DPG (PEG2000-dipalmitoil glicerol), PEG2000-DSG (PEG2000-diestearoil glicerol), PEG5000-DMG (PEG5000-dimiristil glicerol), PEG5000-DPG (PEG5000-dipalmitoil glicerol), PEG5000-DSG (PEG5000-diestearoil glicerol), PEG-cDMA (N-[(metoxipoli(etilenglicol)2000) carbamil]-1,2-dimiristiloxilpropil-3-amina), PEG-C-DOMG (R-3-[(ω-metoxipoli(etilenglicol)2000)carbamoil]-1,2-dimiristiloxilpropil-3-amina), polietilenglicol (PEG)-diacil glicerol (DAG), PEG-dialquiloxipropilo (DAA), PEG-fosfolípido, PEG-ceramida (Cer).
Ejemplos del PEG-dialquiloxipropilo incluyen PEG-dilauriloxipropilo, PEG-dimiristiloxipropilo, PEG-dipalmitiloxipropilo, PEG-diesteariloxipropilo. El lípido modificado con polietilenglicol puede usarse solo o como una mezcla de dos o más. El complejo de lípido de la presente realización puede contener, basado en el contenido de lípido total en el complejo de lípido, el lípido modificado con polietilenglicol a, por ejemplo, un 0 % a un 30 % en moles, tal como un 0 % a un 20 % en moles, tal como un 0 % a un 10 % en moles.
El esterol es un alcohol que tiene una cadena principal esteroidea. Ejemplos del esterol incluyen colesterol, dihidrocolesterol, lanosterol, β-sitosterol, campesterol, estigmasterol, brasicasterol, ergocasterol, fucosterol, 3β-[N-(N',N'-dimetilaminoetil)carbamoil]colesterol (DC-Chol). El esterol puede usarse solo o como una mezcla de dos o más.
El complejo de lípido de la presente realización puede contener, basado en el contenido de lípido total en el complejo de lípido, el esterol a, por ejemplo, un 0 % a un 90 % en moles, tal como un 10 % a un 80 % en moles, tal como un 20 % a un 50 % en moles.
Los componentes lipídicos en el complejo de lípido de la presente realización pueden combinarse sin ninguna limitación, y ejemplos de la combinación incluyen una combinación del lípido catiónico, el lípido neutro y el esterol descritos anteriormente, una combinación del lípido catiónico, el lípido neutro, el lípido modificado con polietilenglicol y el esterol descritos anteriormente.
(Composición)
En una realización, la presente invención proporciona una composición que contiene (I) el lípido catiónico, (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro descrito anteriormente, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol y (III) un ácido nucleico. La composición de la presente realización permite la liberación eficaz de un ácido nucleico en el citoplasma. La composición de la presente realización puede contener el complejo de lípido descrito anteriormente, un medio farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros aditivos. El medio farmacéuticamente aceptable y otros aditivos se describen a partir de ahora en este documento.
La composición de la presente realización contiene, basado en el contenido de lípido total en la composición, el lípido catiónico a, por ejemplo, un 10 % a un 100 % en moles, tal como un 20 % a un 90 % en moles, tal como un 40 % a un 70 % en moles. El lípido catiónico puede usarse solo o como una mezcla de dos o más.
Ejemplos del ácido nucleico incluyen los descritos anteriormente. La composición de la presente realización contiene, con respecto al peso total de la composición, el ácido nucleico a, por ejemplo, un 0,01 % a un 50 % en peso, tal como un 0,1 % a un 30 % en peso, tal como un 1 % a un 10 % en peso.
La composición de la presente realización contiene, como componentes lipídicos, (I) el lípido catiónico descrito anteriormente y (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol.
Ejemplos del lípido neutro incluyen los descritos anteriormente. La composición de la presente realización puede contener, basado en el contenido de lípido total en la composición, el lípido neutro a, por ejemplo, un 0 % a un 50 % en moles, tal como un 0 % a un 40 % en moles, tal como 0 % a un 30 % en moles.
Ejemplos del lípido modificado con polietilenglicol incluyen los descritos anteriormente. La composición de la presente realización puede contener, basado en el contenido de lípido total en la composición, el lípido modificado con polietilenglicol a, por ejemplo, un 0 % a un 30 % en moles, tal como un 0 % a un 20 % en moles, tal como un 0 % a un 10 % en moles.
Ejemplos del esterol incluyen los descritos anteriormente. La composición de la presente realización puede contener, basado en el contenido de lípido total en la composición, el esterol a, por ejemplo, un 0 % a un 90 % en moles, tal como un 10 % a un 80 % en moles, tal como un 20 % a un 50 % en moles.
Los componentes lipídicos en la composición de la presente realización pueden combinarse sin ninguna limitación, y ejemplos de los mismos incluyen una combinación del lípido catiónico, el lípido neutro y el esterol descritos anteriormente, una combinación del lípido catiónico, el lípido neutro, el lípido modificado con polietilenglicol y el esterol descritos anteriormente.
La composición de la presente realización puede contener, como otros aditivos, sacáridos tales como sacarosa, glucosa, sorbitol y lactosa; aminoácidos tales como glutamina, ácido glutámico, glutamato de sodio e histidina; sales de ácidos tales como ácido cítrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido láctico, ácido carbónico y ácido tartárico. La composición de la presente realización puede formularse como una composición farmacéutica. Ejemplos de la forma farmacéutica de la composición farmacéutica incluyen un inyectable.
La composición de la presente realización puede estar, por ejemplo, en un estado en polvo obtenido al eliminar un disolvente por liofilización o similares o en un estado líquido. La composición de acuerdo con una realización de la presente invención es una composición en polvo que contiene el complejo de lípido de acuerdo con la realización descrita anteriormente. La composición en polvo puede prepararse a partir de una composición en un estado líquido (dispersión) al eliminar un disolvente, por ejemplo, por filtración o centrifugación, o prepararse por liofilización de la dispersión. Cuando la composición está en un estado en polvo, la composición puede suspenderse o disolverse en un medio farmacéuticamente aceptable antes de usar la misma como un inyectable. La composición de acuerdo con una realización de la presente invención es una composición líquida que contiene el complejo de lípido de acuerdo con la realización descrita anteriormente y un medio farmacéuticamente aceptable. Cuando la composición está en un estado líquido, la composición puede usarse directamente o como un inyectable después de disolver la composición en un medio farmacéuticamente aceptable.
Ejemplos del medio farmacéuticamente aceptable incluyen agua estéril; solución salina; soluciones isotónicas que contiene un adyuvante tal como glucosa, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio; tampones tales como tampón fosfato, tampón citrato y tampón acetato. La composición de la presente realización puede contener además aditivos que incluyen un adyuvante de disolución tal como alcoholes que incluyen etanol, propilenglicol y polietilenglicol, un agente estabilizante, un antioxidante, un antiséptico, un vehículo que se usa en general en la producción de fármacos, un relleno, un espesante, un aglutinante, un humectante, un disgregante, un lubricante, un tensioactivo, un dispersante, un conservante, un aromatizante, un relajante.
La composición puede administrarse a un paciente por vías parenterales, tales como una inyección intrarterial, una inyección intravenosa y una inyección hipodérmica. La dosis de la composición puede variar de acuerdo con el sujeto al que se administre, el órgano diana, el síntoma o el modo de administración. El sujeto al que se administra la composición no está limitado y la composición puede administrarse a diversos animales. Particularmente, la composición puede administrarse a un mamífero, preferiblemente a un ser humano y a un animal experimental en pruebas clínicas, cribado y experimentos de laboratorio.
La composición de la presente realización forma un complejo de lípido que contiene un ácido nucleico encapsulado en partículas finas formadas con lípidos que contienen el lípido catiónico. El "diámetro promedio de partícula" del complejo de lípido puede calcularse de acuerdo con cualquiera del promedio en volumen, el promedio en número y el promedio Z. En la composición de la presente realización, el complejo de lípido puede tener un diámetro promedio de partícula (promedio Z) de, por ejemplo, 10 a 1000 nm, tal como de 30 a 500 nm, tal como de 30 a 200 nm.
La composición de la presente realización es preferiblemente tal que el diámetro de partícula del complejo de lípido apenas aumenta durante un periodo de almacenamiento en comparación con antes del almacenamiento. Por ejemplo, es preferible que el diámetro promedio de partícula (promedio Z) después de un almacenamiento a 4 °C durante 3 meses sea preferiblemente 1,3 veces o menos, más preferiblemente 1,2 veces o menos y de forma particular preferiblemente 1,1 veces o menos del diámetro de partícula antes del almacenamiento.
Desde el punto de vista de suprimir la adsorción no específica y la reacción inmunitaria, la composición de la presente realización preferiblemente tiene casi nada de carga superficial en un entorno de pH de aproximadamente 7,4 tal como en la sangre. Desde el punto de vista de mejorar la eficacia de fusión con una membrana endosómica durante la incorporación en las células por endocitosis, es preferible que la composición esté cargada positivamente en un entorno de bajo pH (por ejemplo, de 3,5 a 7,0).
(Método de producción de la composición)
En una realización, la presente invención proporciona un método para producir una composición, incluyendo el método: la etapa (a) de mezclar una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar que contiene (I) el lípido catiónico descrito anteriormente, (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol con una solución acuosa que contiene (III) un ácido nucleico para obtener una solución mixta; y la etapa (b) de reducir el contenido porcentual del disolvente orgánico polar en la solución mixta. El método de producción de acuerdo con la presente realización permite la producción de la composición que puede liberar eficazmente un ácido nucleico en el citoplasma.
El complejo de lípido que contiene ácidos nucleicos encapsulados en partículas finas formado con los lípidos puede formarse por la interacción electrostática entre ácidos nucleicos solubles en agua y el lípido catiónico y la interacción hidrófoba entre lípidos. Por ejemplo, al reducir el contenido porcentual del disolvente orgánico polar en la solución mixta, puede cambiarse la solubilidad de los componentes lipídicos que incluyen (I) el lípido catiónico descrito anteriormente y (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol en la solución acuosa que contiene disolvente orgánico polar, formando de ese modo el complejo de lípido. Ejemplos de disolvente orgánico polar incluyen alcoholes, tales como etanol.
En primer lugar, en la etapa (a), se mezcla una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar que contiene (I) el lípido catiónico y (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol disuelto en el mismo y una solución acuosa que contiene (III) un ácido nucleico para obtener una solución mixta. La concentración del disolvente orgánico polar en la solución acuosa que contiene el disolvente orgánico polar no está particularmente limitada, siempre que las moléculas de lípido puedan solubilizarse incluso después de mezclarse con la solución acuosa del ácido nucleico. Por ejemplo, la concentración de disolvente orgánico polar en la solución acuosa que contiene el disolvente orgánico polar en la etapa (a) puede ser de un 0 % a un 60 % en peso.
A continuación, en la etapa (b), se añade agua a la solución mixta para reducir el contenido porcentual del disolvente orgánico polar. Como resultado, puede formarse el complejo de lípido. Para formar el complejo de lípido eficazmente, es preferible que se reduzca rápidamente el contenido porcentual del disolvente orgánico polar. Por ejemplo, la concentración del disolvente orgánico polar en la solución acuosa final que contiene el disolvente orgánico polar en la etapa (b) puede ser de un 0 % a un 5 % en peso.
Como alternativa, la solución mixta obtenida en la etapa (a) puede someterse a diálisis para eliminar el disolvente orgánico polar y sustituir el disolvente por un medio farmacéuticamente aceptable. Debido a que el contenido porcentual del disolvente orgánico polar en la solución disminuye durante el proceso de diálisis, puede formarse el complejo de lípido como resultado.
De acuerdo con el método para producir la composición de la presente realización, puede obtenerse el complejo de lípido que contiene un ácido nucleico encapsulado eficazmente en partículas finas. El complejo de lípido puede tener excelente estabilidad física. Por ejemplo, después del almacenamiento durante un determinado periodo de tiempo (por ejemplo, 1 mes o 3 meses), puede suprimirse un aumento del diámetro de partícula.
Cuando el ácido nucleico encapsulado en la composición es un agente terapéutico oligonucleotídico, la composición puede usarse como composición farmacéutica. Por ejemplo, la composición de la presente invención puede usarse en tratamiento (tal como genoterapia) para introducir un ácido nucleico deseado en el citoplasma diana (tal como el citoplasma que provoca una enfermedad) in vivo o in vitro. Por tanto, la presente invención puede usarse en un método (particularmente un método de genoterapia) de tratamiento de diversas enfermedades usando la composición farmacéutica que contiene el complejo de lípido. El sujeto al que se le administra, el método y la condición de administración son los mismos que antes.
La presente invención puede usarse como kit para administrar un oligonucleótido terapéutico, que contiene el lípido aniónico anterior. El kit también puede usarse preferiblemente en tratamiento (tal como genoterapia) de diversas células diana. En el kit, puede estar en cualquier estado tal como solución o polvo, tendiendo en cuenta la estabilidad (propiedad de almacenamiento), conveniencia de uso. El kit puede contener, además del lípido aniónico anterior, por ejemplo, diversos ácidos nucleicos, diversos medios (medios farmacéuticamente aceptables, tampones) e instrucciones (manual de instrucciones). El kit se usa para preparar una composición o un complejo de lípido que contiene un ácido nucleico deseado a introducir en células diana y lípidos que contienen el lípido aniónico anterior. La composición preparada o complejo de lípido puede usarse de forma eficaz para administrar el ácido nucleico a las células diana. Además, la presente invención puede usarse como kit para administrar un oligonucleótido terapéutico, que contiene una composición farmacéutica que contiene el lípido aniónico. El kit puede contener, además de la composición farmacéutica, por ejemplo, diversos medios (medios farmacéuticamente aceptables) es instrucciones (manual de instrucciones).
Ejemplos
La presente invención se describe más específicamente a partir de ahora en este documento a modo de ejemplos, ejemplos de producción y ejemplos de prueba. En los ejemplos y ejemplos de producción, la nomenclatura de los compuestos se obtiene en el programa informático (nombre de producto "ChemDraw Ultra ver. 12.0", producido por PerkinElmer Co., Ltd.).
Todos los materiales de partida, reactivos, ácidos, bases, agentes deshidratantes, disolventes y catalizadores que se usan para la síntesis de los compuestos de la presente invención están disponibles en el mercado o pueden producirse de acuerdo con los métodos de síntesis orgánica que son bien conocidos por un experto en la materia. Además, los compuestos de la presente invención pueden producirse, como se demuestra en los ejemplos a continuación, de acuerdo con los métodos de síntesis orgánica que son bien conocidos por un experto en la materia.
Las abreviaturas usadas en los ejemplos son convencionales y bien conocidas por un experto en la materia. Algunas de las abreviaturas se indican a continuación.
DIPEA: N,N-Diisopropiletilamina
DMAP: 4-(Dimetilamino)piridina
DMF: N,N-Dimetilformamida
EDC: Clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
n-: Normal
terc-: Terciario
EtOAc: Acetato de etilo
TFA: Ácido trifluoroacético
THF: Tetrahidrofurano
RMN de 1H: Espectrometría de resonancia magnética nuclear de protones
En los ejemplos y ejemplos de producción a continuación, "temperatura ambiente" indica, en general, de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 35 °C. % indica el porcentaje en peso, a menos que se establezca de otro modo.
Los desplazamientos químicos de la espectrometría de resonancia magnética nuclear de protones se registran en la unidad δ (ppm) de tetrametilsilano. Las abreviaturas en los patrones son como se indican a continuación:
s: singulete, d: doblete, t: triplete, c: cuadruplete, quin: quintuplete, m: multiplete, a: ancho.
Para cromatografía, se usó Parallel Prep producido por YAMAZEN Corporation {columna: producida por YAMAZEN Corporation, columna Hi-FlashTM (gel de sílice), tamaño; S (16 × 60 mm), M (20 × 75 mm), L (26 × 100 mm), 2L (26 × 150 mm)}, o sistema de purificación ultrarrápida automático IsoleraTM producido por Biotage {columna: SNAP Cartridge KP-Sil (10 g, 25 g, 50 g, 100 g, 340 g)}.
A. Síntesis de lípido catiónico
[Ejemplo de producción 1]
Síntesis de 9-bromononanoato de 2-butiloctilo
Figure imgf000021_0001
Se disolvieron ácido 9-bromononanoico (1,1 g, 4,7 mmol), DIPEA (0,91 ml, 5,3 mmol) y DMAP (76 mg, 0,63 mmol) en cloruro de metileno (13 ml) y en enfriamiento con hielo, se añadió EDC (1,0 g, 5,3 mmol). Se añadió 2-butil-1-octanol (0,58 g, 3,1 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se añadió a una solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio saturado y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo) obteniéndose el compuesto del título (1,2 g, 2,96 mmoles). 400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,82-0,95(m,6H),1,17-1,49(m,24H),1,52-1,70(m,3H),1,7 5-1,93(m,2H),2,23-2,36(m,2H),3,34-3,47(m,2H),3,91-4,02(m,2H).
[Ejemplo de producción 2]
Síntesis de 9-bromononanoato de bencilo
Figure imgf000021_0002
Se disolvieron alcohol bencílico (0,50 ml, 4,84 mmol), ácido 9-bromononanoico (1,38 g, 5,80 mmol) y DMAP (59 mg, 0,48 mmol) en cloruro de metileno (9,6 ml) y en enfriamiento con hielo, se añadió EDC (1,16 g, 6,05 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se añadió a una solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio saturado y se extrajo con éter dietílico. La capa orgánica se lavó con una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (nheptano/acetato de etilo) para obtener el compuesto del título (1,49 g, 4,55 mmol).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):1,22-1,48(m,8H),1,58-1,71(m,2H),1,78-1,90(m,2H),2,30-2,40(m,2H),3,35-3,44(m,2H),5,12(s,2H),7,26-7,45(m,5H).
[Ejemplo de producción 3]
Síntesis de 8-bromooctanoato de bencilo
Figure imgf000022_0001
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 2, el compuesto del título (4,8 g, 15,3 mmol) se obtuvo a partir de alcohol bencílico (1,85 ml, 17,9 mmol), ácido 8-bromooctanoico (4,0 g, 17,9 mmol), EDC (3,78 g, 19,7 mmol), DMAP (0,22 g, 1,79 mmol) y cloruro de metileno (36 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):1,22-1,48(m,6H),1,58-1,71(m,2H),1,78-1,90(m,2H),2,30-2,38(m,2H),3,33-3,45(m,2H),5,12(s,2H),7,28-7,44(m,5H).
[Ejemplo de producción 4]
Síntesis de 8-pentiltridecan-1-ol
Figure imgf000022_0002
(1) Síntesis de bromuro de (6-carboxihexil)trifenilfosfonio
Figure imgf000022_0003
Se suspendieron ácido 7-bromoheptanoico (2,0 g, 9,57 mmol) y trifenilfosfina (2,5 g, 9,57 mmol) en acetonitrilo (20 ml) y se llevaron a reflujo en calentamiento durante 18 horas. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida para obtener el compuesto del título (4,1 g, 8,66 mmol).
1H-RMN(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1,22-1,59(m,8H),2,12-2,25(m,2H),3,47-3,62(m,2H),7. 19-7,28(m,2H),7,34-7,44(m,2H),7,71-7,85(m,10H),7,85-7,94(m,3H),11,97(s a,1H).
(2) Síntesis de ácido 8-pentil-7-tridecenoico
Figure imgf000022_0004
El compuesto (4,65 g, 9,87 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 4-(1) se disolvió en THF (15 ml) y se añadió solución de bis(trimetilsilil)amida de sodio/THF (1 M, 19,7 ml, 19,7 mmol) a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno. La solución de reacción se calentó hasta 45 °C y después se agitó durante 30 minutos. Se añadió una solución de undecan-6-ona (1,7 ml, 8,22 mmol) en THF (5 ml) gota a gota seguido de reflujo por calentamiento. La mezcla de reacción se agitó durante 22 horas, y después se añadió cuidadosamente ácido clorhídrico (2 M) hasta pH 2. Después de la adición de agua (100 ml) y la extracción con éter dietílico, la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/ciclohexano) para obtener una mezcla 1:1 (1,36 g) del compuesto del título y undecan-6-ona.
1H-RMN(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0,80-0,89(m,6H),1,16-1,38(m,18H),1,43-1,53(m,2H), 1,89-1,99(m,4H),2,17(t,J=7,43Hz,2H),5,07(t,J=6,90Hz,1H),11,83(s a,1H).
(3) Síntesis de ácido 8-pentiltridecílico
Figure imgf000023_0001
El compuesto (1,36 g) obtenido en el ejemplo de producción 4-(2) y paladio al 10 %-carbono (0,06 g, 0,060 mmol) se suspendieron en etanol (5 ml), y la suspensión se agitó durante 18 horas en una atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente a presión normal. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite y se lavó con etanol. El filtrado se concentró a presión reducida para obtener el compuesto del título (0,60 g, 2,18 mmol).
1H-RMN(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0,85(t,J=7,1Hz,6H),1,14-1,32(m,25H),1,42-1,52(m,2 H),2,18(t,J=7,43Hz,2H). (4) Síntesis de 8-pentiltridecan-1-ol
Figure imgf000023_0002
A una solución de hidruro de litio y aluminio/THF (2,4 M, 1,3 ml, 3,15 mmol), en una atmósfera de nitrógeno, se añadió una solución del compuesto (1,36 g) obtenido en el ejemplo de producción 4-(3) en THF (5 ml) gota a gota en enfriamiento con hielo. Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas, se añadió ácido clorhídrico (1 M, 8 ml) gota a gota y la mezcla se agitó durante 1 hora. La capa orgánica se extrajo con éter dietílico y después se lavó secuencialmente con una solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio saturado y una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/ciclohexano) para obtener el compuesto del título (0,28 g, 1,02 mmol).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,88(t,J=7,24Hz,6H),1,13-1,41(m,28H),1,54-1,60(m,2H), 3,59-3,68(m,2H).
[Ejemplo de producción 5]
Síntesis de 4-noniltridecan-1-ol
Figure imgf000023_0003
(1) Síntesis de (3-bromopropoxi)(terc-butil)dimetilsilano
Figure imgf000023_0004
Se disolvió 3-bromo-1-propanol (6,5 ml, 71,9 mmol) en cloruro de metileno (250 ml) y se añadió imidazol (7,84 g, 115,0 mmol) a temperatura ambiente y se disolvió completamente. Se añadió cloruro de terc-butildimetilsililo (13,0 g, 86,3 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. La solución de reacción se filtró y después se concentró a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico (300 ml), se lavó secuencialmente con una solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio saturado y una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (ciclohexano) para obtener el compuesto del título (16,2 g, 64,0 mmol).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,08(s,6H),0,91(s,9H),2,05(quin,J=6,05Hz,2H),3,53(t,J=6 .42Hz,2H),3,75(t,J=5,69Hz,2H).
(2) Síntesis de bromuro de {3-[(terc-butildimetilsilil)oxi]propil}trifenilfosfonio
Figure imgf000024_0001
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 4-(1), el compuesto del título (21,2 g, 41,1 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (16,2 g, 63,9 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 5-(1), trifenilfosfina (16,8 g, 63,9 mmol) y acetonitrilo (125 ml).
1H-RMN(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0,01(s,6H),0,84(s,9H),1,65-1,75(m,2H),3,48-3,57(m,2 H),3,69(t,J=6,14Hz,2H),7,73-7,84(m,12H),7,87-7,93(m,3H).
(3) Síntesis de terc-butildimetil[(4-nonil-3-tridecen-1-il)oxi]silano
Figure imgf000024_0002
El compuesto (4,38 g, 8,50 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 5-(2) se disolvió en THF (15 ml) y en una atmósfera de nitrógeno, se añadió una solución de bis(trimetilsilil)amida de sodio/THF (1 M, 8,5 ml, 8,5 mmol) a temperatura ambiente. La solución de reacción se calentó hasta 45 °C y después se agitó durante 30 minutos. Se añadió una solución de nonadecan-10-ona (2,0 g, 7,08 mmol) en THF (10 ml) gota a gota y se llevó a reflujo en calentamiento durante 21 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente, después se le añadió éter dietílico y se lavó secuencialmente con agua y una solución de cloruro de sodio saturado y la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (ciclohexano) para obtener el compuesto del título (1,16 g).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,07(s,6H),0,90(m,15H),1,21-1,41(m,28H),1,92-2,04(m,4 H),2,24(c,J=7,34Hz,2H),3,58(t,J=7,24 Hz,2H),5,09(t,J=7,15Hz,1H).
(4) Síntesis de 4-noniltridecan-1-ol
Figure imgf000024_0003
El compuesto (1,16 g, 2,64 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 5-(3) y paladio al 10 %-carbono (0,28 g, 0,26 mmol) se suspendieron en acetato de etilo (10 ml) y ácido acético (0,15 ml, 2,64 mmol) y la suspensión se agitó en una atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite y se lavó con etanol, y el filtrado entonces se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/ciclohexano) para obtener el compuesto del título (0,35 g, 1,08 mmol). 1H-RMN(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0,80-0,90(m,6H), 1,13-1,30(m,35H), 1,32-1,39(m,2H), 3,32-3 .38(m,2H),4,30(t,J=5,23Hz, 1H).
[Ejemplo de producción 6]
Síntesis de 4-heptilundecan-1-ol
Figure imgf000025_0001
(1) Síntesis de terc-butil[(4-heptil-3-undecen-1-il)oxi]dimetilsilano
Figure imgf000025_0002
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 5-(3), el compuesto del título (0,83 g, 2,17 mmol) se obtuvo a partir de bromuro de {3-[(terc-butildimetilsilil)oxi]propil}trifenilfosfonio (3,0 g, 5,83 mmol), THF (10 ml), solución de bis(trimetilsilil)amida de sodio/THF (1 M, 5,8 ml, 5,8 mmol) y pentadecan-8-ona (1,1 g, 4,86 mmol).
1H-RMN(600Hz,CDCl3 )δ(ppm):0,07(s,6H),0,84-0,95(m,15H),0,89(s,1H),1,21-1,41(m,20H), 1,92-2,05(m,4H),2,24(c,J=7,34Hz,2H),3,58(t,J=7,24Hz,2H),5,09(t,J=7,24Hz,1H).
(2) Síntesis de 4-heptilundecan-1-ol
Figure imgf000025_0003
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 5-(4), el compuesto del título (0,42 g, 1,56 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (0,83 g, 2,17 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 6-(1), paladio al 10 %-carbono (0,23 g, 0,22 mmol), acetato de etilo (10 ml) y ácido acético (0,25 ml, 4,35 mmol).
1H-RMN(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0,82-0,89(m,6H),1,14-1,31(m,27H),1,33-1,39(m,2H), 3,32-3,38(m,2H),4,30(t,J=5,14 Hz,1H).
[Ejemplo de producción 7]
Síntesis de 4-pentilnonan-1-ol
Figure imgf000025_0004
(1) Síntesis de terc-butildimetilsilil[(4-pentil-3-nonen-1-il)oxi]silano
Figure imgf000025_0005
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 5-(3), el compuesto del título (1,16 g) se obtuvo a partir de bromuro de {3-[(terc-butildimetilsilil)oxi]propil}trifenilfosfonio (5,0 g, 9,72 mmol), THF (4 ml), solución de bis(trimetilsilil)amida de sodio/THF (1 M, 9,7 ml, 9,7 mmol) y undecan-6-ona (1,7 ml, 8,10 mmol).
1H-RMN(600Hz,CDCl3 )δ(ppm):0,07(s,6H),0,90(m,15H),1,19-1,43(m,13H),1,92-2,05(m,4H ),2,21-2,29(m,2H),3,58(t,J=7,24Hz,2H),5,10(t,J=7,15Hz,1H).
n ess e -pen nonan- -o
Figure imgf000026_0001
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 5-(4), el compuesto del título (0,22 g, 1,02 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (1,12 g, 3,43 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 7-(1), paladio al 10 %-carbono (0,37 g, 0,34 mmol), acetato de etilo (15 ml) y ácido acético (0,39 ml, 6,86 mmol).
1H-RMN(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0,87-0,93(m,6H),1,18-1,36(m,19H),1,37-1,45(m,2H), 3,36-3,42(m,2H),4,3 5(t, J=5,23Hz, 1H).
[Ejemplo de producción 8]
Síntesis de 4-bromobutanoato de bencilo
Figure imgf000026_0002
Se disolvieron alcohol bencílico (2,84 ml, 27,3 mmol), ácido 4-bromobutanoico (5,01 g, 30,0 mmol) y DMAP (0,33 g, 2,73 mmol) en cloruro de metileno (50 ml), se le añadió EDC (6,5 g, 34,1 mmol) en enfriamiento con hielo y se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y después se disolvió en éter dietílico. La solución se lavó secuencialmente con una solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio saturado, agua y una solución acuosa de ácido cítrico al 10 % y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Después de la filtración, el disolvente se retiró por destilación a presión reducida para obtener el compuesto del título (6,41 g, 24,9 mmol).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):2,20(quin,J=6,83Hz,2H),2,56(t,J=7,15Hz,2H),3,46(t,J=6. 51Hz,2H),5,13(s,2H),7,28-7,42(m,5H).
[Ejemplo de producción 9]
Síntesis de 6-bromohexanoato de bencilo
Figure imgf000026_0003
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 8, el compuesto del título (5,43 g, 19,0 mmol) se obtuvo a partir de alcohol bencílico (1,93 ml, 18,5 mmol), ácido 6-bromohexanoico (4,33 g, 22,2 mmol), DMAP (0,23 g, 1,85 mmol), EDC (4,43 g, 23,1 mmol) y cloruro de metileno (35 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):1,44-1,51(m,2H),1,64-1,72(m,2H),1,83-1,90(m,2H),2,38( t,J=7,43 Hz,2H),3,39(t,J=6,69 Hz,2H),5,12(s,2H),7,30-7,40(m,5H).
[Ejemplo de producción 10]
Síntesis de clorhidrato del ácido (1R,SS,6r)-3-metil-3-azabiciclo[3.1.0]hexano-6-carboxílico
Figure imgf000026_0004
(1) Síntesis de 3-metil-3-azabiciclo[3.1.0]hexano-6-carboxilato de (1R,5S,6r)-etilo
Se disolvió 3-azabiciclo[3.1.0]hexano-6-carboxilato de (1R,5S,6r)-etilo (CAS 174456-77-0) (0,89 g, 5,74 mmol) en THF (20 ml), a lo que se añadió secuencialmente ácido acético (0,49 ml, 8,6 mmol) y una solución de formaldehído (11,7 ml, 161,5 mol) a temperatura ambiente, y la mezcla se agitó durante 30 minutos. Se añadió tri(acetoxi)borohidruro de sodio (2,43 g, 11,5 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida, después se le añadió una solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio saturado y se extrajo con cloruro de metileno. La mezcla se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (cloruro de metileno/metanol) para obtener el compuesto del título (0,70 g, 4,14 mmol).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):1,25(t,J=7,2Hz,3H),1,94(s a,2H),2,01(s a,1H),2,29(s,3H),2,35(d,J=9,2Hz,2H),3,05(d,J=9,2Hz,2H),4,09(c,J=7,2Hz,2H).
(2) Síntesis de clorhidrato del ácido (1R,SS,6r)-3-metil-3-azabiciclo[3.1.0]hexano-6-carboxílico
Se añadió ácido clorhídrico concentrado (10 ml) al compuesto (0,60 g, 3,55 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 10-(1) y se agitó a 70 °C durante 12 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para obtener el compuesto del título (0,52 g, 3,05 mmol).
1H-RMN(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):2,14(s a,2H),2,25(s a, 1H),2,74(s a,3H),3,25-3,37(m,2H),3,56-3,67(m,2H),10,91(s a,1H),12,49(s a,1H).
[Ejemplo de producción 11]
Síntesis de clorhidrato del ácido (1R,5S,6s)-3-metil-3-azabiciclo[3.1.0]hexano-6-carboxílico
Figure imgf000027_0001
(1) Síntesis de 3-metil-3-azabiciclo[3.1.0]hexano-6-carboxilato de (1R,5S,6s)-etilo
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 10-(1), el compuesto del título (2,5 g, 14,8 mmol) se obtuvo a partir de 3-azabiciclo[3.1.0]hexano-6-carboxilato de (1R,5S,6s)-etilo (CAS 1144099-54-6) (2,5 g, 16,1 mmol), ácido acético (1,4 ml, 24,2 mmol), una solución de formaldehído (10,0 ml, 134,3 mmol), tri(acetoxi)borohidruro de sodio (6,8 g, 32,2 mmol) y THF (50 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):1,23(t,J=7,1Hz,3H),1,48-1,68(m,3H),2,22(s,3H),2,33(a d,J=8,8Hz,2H),3,02(d,J=8,8Hz,2H),4,10(c,J=7,1Hz,2H).
(2) Síntesis de clorhidrato del ácido (1R,5S,6s)-3-metil-3-azabiciclo[3.1.0]hexano-6-carboxílico
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 10-(2), el compuesto del título (350 mg, 1,97 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (500 mg, 2,96 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 10-(2) y ácido clorhídrico concentrado (10 ml).
1H-RMN(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1,88-1,94(m,0,45H),1,94-2,00(m,0,55H),2,35-2,45(m, 2H),2,68(s a,1,65H),2,67(s a,1,35H),3,08-3,18(m,1,1H),3,45-3,57(m,0,9H),3,73-3,88(m, 2H),9,16(s a,1H),11,52(s a,1H).
(Síntesis de lípido catiónico (1))
[Ejemplo A-1]
1-Metilpiperidin-4-carboxilato de 2-{9-[(2-butiloctil)oxi]-9-oxononil}dodecilo (lípido catiónico 1)
Figure imgf000028_0001
(1) Síntesis de 9-(2-butiloctil)nonano-1,1,9-tricarboxilato de 1,1-di-terc-butilo
Se suspendió hidruro de sodio al 60 % (59 mg, 1,48 mmol) en 1,4-dioxano (6,5 ml), a lo que se añadió gradualmente malonato de di-terc-butilo (0,30 ml, 1,35 mmol) a temperatura ambiente, y la mezcla se agitó durante 20 minutos. Al compuesto (573 mg, 1,41 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 1 se le añadió 1,4-dioxano (1 ml) y la mezcla se agitó a 70 °C durante 3 horas y 95 °C durante 15 horas. La mezcla de reacción se enfrió en un baño de agua helada, se añadió una solución acuosa de cloruro de amonio saturado y se extrajo con n-heptano. La capa orgánica se lavó con una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo) para obtener el compuesto del título (490 mg, 0,91 mmol).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,80-0,98(m,6H),1,18-1,38(m,24H),1,39-1,54(m,2H),1,46(s, 18H), 1,55-1,69(m,3H), 1,71-1,87(m,2H),2,24-2,35(m,2H),3,06-3,15(m, 1H),3,91-4,02(m,2 H).
(2) Síntesis de 1-(2-butiloctil)nonadecano-1,9,9-tricarboxilato de 9,9-di-terc-butilo
El compuesto (490 mg, 0,91 mmol) obtenido en el ejemplo A-1-(1) se disolvió en 1,4-dioxano (4 ml), a lo que se añadió hidruro de sodio al 60 % (47 mg, 1,18 mmol) en enfriamiento con agua, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió 1-yododecano (0,39 ml, 1,81 mmol) y la mezcla se agitó a 80 °C durante 15 horas. La mezcla de reacción se enfrió en un baño de agua helada, se añadió una solución acuosa de cloruro de amonio saturado y se extrajo con n-heptano. La capa orgánica se lavó con una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo) para obtener el compuesto del título (450 mg, 0,66 mmol).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,80-0,96(m,9H),1,05-1,36(m,40H),1,39-1,49(m,2H),1,44(s,18H), 1,53-1,68(m,3H), 1,70-1,82(m,4H),2,23-2,34(m,2H),3,92-4,01(m,2H).
(3) Síntesis de ácido 2-{9-[(2-butiloctil)oxi]-9-oxononil}dodecanoico
El compuesto (450 mg, 0,66 mmol) obtenido en el ejemplo A-1-(2) se disolvió en cloruro de metileno (2 ml), a lo que se añadió TFA (1 ml) en enfriamiento con hielo y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. A la mezcla de reacción se le añadió tolueno y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida. La adición y destilación de tolueno se repitió dos veces para secar la reacción, obteniendo de ese modo un producto en bruto de ácido 2-{9-[(2-butiloctil)oxi]-9-oxononil}-2-decilmalónico. El producto en bruto obtenido se disolvió en xileno (5 ml) y la solución se agitó a 150 °C durante 8 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna (n-heptano/acetato de etilo) para obtener el compuesto del título (240 mg, 0,46 mmol).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,80-0,97(m,9H),1,16-1,70(m,49H),2,22-2,41(m,3H),3,92-4,02(m,2H).
(4) Síntesis de 10-(hidroximetil)icosanoato de 2-butiloctilo
El compuesto (240 mg, 0,46 mmol) obtenido en el ejemplo A-1-(3) se disolvió en THF (4 ml), a lo que se añadió complejo de borano-THF 0,92 M (0,75 ml, 0,69 mmol) gota a gota a -15 °C, y la mezcla se agitó a 0 °C durante 2 horas. Se añadió una solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio saturado y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (nheptano/acetato de etilo) para obtener el compuesto del título (197 mg, 0,39 mmol).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,80-0,98(m,9H),1,10-1,39(m,46H),1,39-1,50(m,1H),1,5 4-1,69(m,4H),2,23-2,36(m,2H),3,48-3,59(m,2H),3,92-4,02(m,2H).
(5) Síntesis de 1-metilpiperidin-4-carboxilato de 2-{9-[(2-butiloctil)oxi]-9-oxononil}dodecilo
El compuesto (38 mg, 0,074 mmol) obtenido en el ejemplo A-1-(4), DIPEA (0,054 ml, 0,31 mmol), clorhidrato del ácido 1-metil-piperidin-4-carboxílico (27 mg, 0,15 mmol) y DMAP (1,8 mg, 0,015 mmol) se disolvieron en cloruro de metileno (0,8 ml), a lo que se añadió EDC (31 mg, 0,16 mmol) en enfriamiento con hielo, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. La mezcla de reacción se añadió a una solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio saturado y se extrajo con cloroformo. La capa orgánica se lavó con una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo/metanol) para obtener el compuesto del título (38 mg, 0,060 mmol).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,77-0,97(m,9H),1,13-1,41(m,46H),1,50-1,69(m,4H),1,6 9-1,85(m,2H), 1. 85-2,09(m,4H),2,18-2,35(m,3H),2,27(s,3H),2,72-2,88(m,2H),3,90-4,03(m,4 H).
(Síntesis de lípido catiónico (2))
[Ejemplo A-2]
1-Metilpiperidin-4-carboxilato de 2-{9-oxo-9-[(3-pentiloctil)oxi]nonil}dodecilo (lípido catiónico 2)
Figure imgf000029_0001
(1) Síntesis de 1,1-di-terc-butil nonano-1,1,9-tricarboxilato de 9-bencilo
Se suspendió hidruro de sodio al 60 % (83 mg, 2,07 mmol) en 1,4-dioxano (9,4 ml), a lo que se añadió gradualmente malonato de di-terc-butilo (0,42 ml, 1,88 mmol) a temperatura ambiente, y la mezcla se agitó durante 10 minutos. Se añadió compuesto (650 mg, 1,99 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 2 y la mezcla se agitó a 95 °C durante 13 horas. La mezcla de reacción se enfrió en un baño de agua helada, se añadió una solución acuosa de cloruro de amonio saturado y se extrajo con n-heptano. La capa orgánica se lavó con una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo) para obtener el compuesto del título (536 mg, 1,16 mmol).
(2) Síntesis de 9,9-di-terc-butil nonandecano-1,9,9-tricarboxilato de 1-bencilo
De acuerdo con el método del ejemplo A-1-(2), el compuesto del título (470 mg, 0,78 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (590 mg, 1,28 mmol) obtenido en el ejemplo A-2-(1), 1-yododecano (0,54 ml, 2,55 mmol), hidruro de sodio al 65 % (71 mg, 1,91 mmol) y 1,4-dioxano (5 ml). 1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,83-0,93(m,3H),1,05-1,36(m,26H),1,44(s,18H),1,57-1,68(m,2H), 1.71-1,82(m,4H),2,29-2,39(m,2H),5,11(s,2H), 7,28-7,42(m,5H).
(3) Síntesis de ácido 2-[9-(benciloxi)-9-oxononil]dodecanoico
De acuerdo con el método del ejemplo A-1-(3), el compuesto del título (286 mg, 0,64 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (470 mg, 0,78 mmol) obtenido en el ejemplo A-2-(2), cloruro de metileno (2 ml), TFA (1 ml) y xileno (2 ml).1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,81-0,95(m,3H),1,18-1,37(m,26H),1,39-1,52(m,2H),1,5 4-1,69(m,4H),2,28-2,41(m,3H),5,11(s,2H),7,28-7,40(m,5H).
(4) Síntesis de 10-(hidroximetil)icosanoato de bencilo
De acuerdo con el método del ejemplo A-1-(4), el compuesto del título (223 mg, 0,52 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (285 mg, 0,64 mmol) obtenido en el ejemplo A-2-(3), complejo de borano-THF 0,92 M (1,0 ml, 0,96 mmol) y THF (3,2 ml). 1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,81-0,95(m,3H),1,12-1,38(m,31H),1,39-1,50(m,1H),1,5 8-1,72(m,2H),2,23-2,36(m,2H),3,48-3,59(m,2H),5,11(s,2H),7,28-7,41(m,5H).
(5) Síntesis de 1-metilpiperidin-4-carboxilato de 2-[9-(benciloxi)-9-oxononil]dodecilo
De acuerdo con el método del ejemplo A-1-(5), el compuesto del título (128 mg, 0,23 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (114 mg, 0,26 mmol) obtenido en el ejemplo A-2-(4), clorhidrato del ácido 1-metil-piperidin-4-carboxílico (95 mg, 0,53 mmol), EDC (111 mg, 0,58 mmol), DIPEA (0,090 ml, 0,53 mmol), DMAP (6,4 mg, 0,053 mmol) y cloruro de metileno (1,3 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,81-0,96(m,3H),1,15-1,41(m,31H),1,52-1,70(m,2H),1,7 0-1,84(m,2H),1,85-2,06(m,4H),2,18-2,40(m,3H),2,27(s,3H),2,73-2,89(m,2H),3,92-4,03(m,2 H),5,12(s,2H),7,28-7,44(m,5H).
(6) Síntesis de ácido 10-{[(1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}icosanoico
El compuesto (127 mg, 0,23 mmol) obtenido en el ejemplo A-2-(5) se disolvió en acetato de etilo (2 ml), a lo que se añadió paladio al 10 %-carbono (24 mg, que contenía un 50 % de agua) a temperatura ambiente, y la mezcla se agitó en una atmósfera de hidrógeno a presión normal durante 3 horas. La solución de reacción se filtró y se lavó con acetato de etilo. El filtrado se concentró a presión reducida, el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna (cloroformo/metanol) para obtener el compuesto del título (94 mg, 0,20 mmol).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,81-0,95(m,3H),1,12-1,44(m,31H),1,53-1,71(m,2H),1,7 4-1,95(m,2H),1,97-2,10(m,2H),2,11-2,37(m,SH),2,40(s,3H),3,11-3,28(m,2H),3,79-3,92(m,1 H),4.14-4,25(m, 1H).
(7) Síntesis de 1-metilpiperidin-4-carboxilato de 2-{9-oxo-9-[(3-pentiloctil)oxi]nonil}dodecilo
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 2, el compuesto del título (103 mg, 0,16 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (93 mg, 0,20 mmol) obtenido en el ejemplo A-2-(6), 3-pentiloctan-1-ol (CAS 1443519-63-8) (60 mg, 0,30 mmol), EDC (42 mg, 0,22 mmol), DMAP (4,9 mg, 0,040 mmol) y cloruro de metileno (1,5 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,82-0,95(m,9H),1,14-1,46(m,46H),1,50-1,68(m,6H),1,7 0-1,84(m,2H),1,85-2,06(m,4H),2,19-2,33(m,3H),2,27(s,3H),2,74-2,87(m,2H),3,93-4,02(m,2 H),4,03-4,14(m,2H).
(Síntesis de lípido catiónico (3))
[Ejemplo A-3]
1-Metilpiperidin-4-carboxilato de 2-nonil-11-oxo-11-[(3-pentiloctil)oxi]undecilo (lípido catiónico 3)
Figure imgf000031_0001
(1) Síntesis de 9,9-di-terc-butil octadecano-1,9,9-tricarboxilato de 1-bencilo
El compuesto (536 mg, 1,16 mmol) obtenido en el ejemplo A-2-(1) se disolvió en THF (6 ml), a lo que se añadió hidruro de sodio al 60 % (58 mg, 1,45 mmol) en enfriamiento con agua, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió 1-yodononano (0,23 ml, 1,16 mmol) y la mezcla se agitó a 80 °C durante 20 horas. La mezcla de reacción se enfrió en un baño de agua helada, se añadió una solución acuosa de cloruro de amonio saturado y se extrajo con n-heptano. La capa orgánica se lavó con una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo) para obtener el compuesto del título (340 mg, 0,577 mmol).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,82-0,92(m,3H),1,03-1,36(m,24H),1,44(s,18H),1,57-1,6 8(m,2H),1,71-1,81(m,4H),2,28-2,40(m,2H),5,11(s,2H),7,28-7,41(m,5H).
(2) Síntesis de ácido 11-(benciloxi)-2-nonil-11-oxoundecanoico
De acuerdo con el método del ejemplo A-1-(3), el compuesto del título (96 mg, 0,22 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (340 mg, 0,58 mmol) obtenido en el ejemplo A-3-(1), cloruro de metileno (2 ml), TFA (1 ml) y xileno (2 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,80-0,95(m,3H),1,12-1,74(m,30H),2,28-2,41(m,3H),5,11 (s,2H), 7,28-7,40(m,5H).
(3) Síntesis de 10-(hidroximetil)nonadecanoato de bencilo
De acuerdo con el método del ejemplo A-1-(4), el compuesto del título (80 mg, 0,19 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (96 mg, 0,22 mmol) obtenido en el ejemplo A-3-(2), complejo de borano-THF 0,92 M (0,36 ml, 0,33 mmol) y THF (1,1 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,81-0,94(m,3H),1,09-1,38(m,29H),1,38-1,50(m,1H),1,5 8-1,71(m,2H),2,30-2,40(m,2H),3,48-3,58(m,2H),5,11(s,2H),7,29-7,42(m,5H).
(4) Síntesis de 1-metilpiperidin-4-carboxilato de 11-(benciloxi)-2-nonil-11-oxoundecilo
De acuerdo con el método del ejemplo A-1-(5), el compuesto del título (97 mg, 0,18 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (80 mg, 0,19 mmol) obtenido en el ejemplo A-3-(3), clorhidrato del ácido 1-metil-piperidin-4-carboxílico (69 mg, 0,38 mmol), EDC (81 mg, 0,42 mmol), DIPEA (0,066 ml, 0,38 mmol), DMAP (4,7 mg, 0,038 mmol) y cloruro de metileno (1,0 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,83-0,94(m,3H),1,15-1,39(m,29H),1,52-1,70(m,2H),1,7 0-1,85(m,2H),1,85-2,07(m,4H),2,19-2,40(m,3H),2,27(s,3H),2,73-2,88(m,2H),3,94-4,02(m,2 H),5,12(s,2H),7,28-7,43(m,5H).
(5) Síntesis de ácido 10-{[(1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}nonadecanoico
De acuerdo con el método del ejemplo A-2-(6), el compuesto (96 mg, 0,18 mmol) obtenido en el ejemplo A-3-(4) se disolvió en acetato de etilo (2 ml), a lo que se añadió paladio al 10 %-carbono (19 mg, que contenía un 50 % de agua) a temperatura ambiente, y la mezcla se agitó en una atmósfera de hidrógeno a presión normal durante 3 horas. La solución de reacción se filtró y se lavó con acetato de etilo. El filtrado se concentró a presión reducida, el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna (cloroformo/metanol) para obtener el compuesto del título (74 mg, 0,163 mmol).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,81-0,95(m,3H),1,12-1,44(m,29H),1,53-1,71(m,2H),1,7 4-1,94(m,2H),1,98-2,08(m,2H),2,08-2,38(m,5H),2,39(s,3H),3,10-3,30(m,2H),3,80-3,91(m,1 H),4,14-4,25(m,1H).
(6) Síntesis de 1-metilpiperidin-4-carboxilato de 2-nonil-11-oxo-11-[(3-pentiloctil)oxi]undecilo
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 2, el compuesto del título (81 mg, 0,13 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (74 mg, 0,16 mmol) obtenido en el ejemplo A-3-(5), 3-pentiloctan-1-ol (CAS 1443519-63-8) (49 mg, 0,25 mmol), EDC (38 mg, 0,20 mmol), DMAP (4,0 mg, 0,033 mmol) y cloruro de metileno (1,2 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,81-0,95(m,9H),1,15-1,47(m,44H),1,50-1,68(m,6H),1,7 0-1,84(m,2H),1,84-2,06(m,4H),2,18-2,33(m,3H),2,27(s,3H),2,73-2,87(m,2H),3,94-4,01(m,2 H),4,04-4,12(m,2H).
(Síntesis de lípido catiónico (4))
[Ejemplo A-4]
9-{[(1-Metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}heptadecanodioato de bis(3-pentiloctilo) (lípido catiónico 4)
Figure imgf000032_0001
(1) Síntesis de 1,1-di-terc-butil octano-1,1,8-tricarboxilato de 8-bencilo
Se suspendió hidruro de sodio al 60 % (59 mg, 1,48 mmol) en DMF (5,4 ml), a lo que se añadió gradualmente malonato de di-terc-butilo (0,30 ml, 1,35 mmol) en enfriamiento con huelo, y la mezcla se agitó a 0 °C durante 5 minutos y después durante 20 minutos, después se retiró el baño. En enfriamiento con hielo, se añadió yoduro de sodio (61 mg, 0,40 mmol) y el compuesto (443 mg, 1,41 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 3 y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. La mezcla de reacción se enfrió en un baño de agua helada, se le añadió agua y se extrajo con éter dietílico. La capa orgánica se lavó con una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo) para obtener el compuesto del título (456 mg, 1,02 mmol).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):1,23-1,36(m,8H),1,45(s,18H),1,58-1,69(m,2H),1,72-1,84( m,2H),2,30-2,40(m,2H),3,05-3,15(m,1H),5,11(s,2H),7,28-7,41(m,5H).
(2) Síntesis de 8,8-di-terc-butil pentadecano-1,8,8,15-tetracarboxilato de 1,15-dibencilo
De acuerdo con el método del ejemplo A-4-(1), el compuesto del título (380 mg, 0,56 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (456 mg, 1,02 mmol) obtenido en el ejemplo A-4-(1), el compuesto (478 mg, 1,53 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 3, yoduro de sodio (46 mg, 0,31 mmol), hidruro de sodio al 60 % (49 mg, 1,22 mmol) y DMF (3,3 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):1,03-1,17(m,4H),1,23-1,36(m,12H),1,43(s,18H),1,56-1,6 8(m,4H), 1. 70-1,80(m,4H),2,29-2,38(m,4H),5,11(s,4H), 7,27-7,41(m, 10H).
(3) Síntesis de ácido 10-(benciloxi)-2-[8-(benciloxi)-8-oxooctil]-10-oxodecanoico
De acuerdo con el método del ejemplo A-1-(3), el compuesto del título (234 mg, 0,45 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (380 mg, 0,56 mmol) obtenido en el ejemplo A-4-(2), cloruro de metileno (2 ml), TFA (1 ml) y xileno (2 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):1,18-1,37(m,16H),1,38-1,71(m,8H),2,26-2,41(m,5H),5,11(s,4H),7,28-7,43(m,10H).
(4) Síntesis de 9-(hidroximetil)heptadecanodioato de dibencilo
De acuerdo con el método del ejemplo A-1-(4), el compuesto del título (188 mg, 0,37 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (234 mg, 0,45 mmol) obtenido en el ejemplo A-4-(3), complejo de borano-THF 0,92 M (0,73 ml, 0,67 mmol) y THF (1,8 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):1,12-1,51(m,22H),1,56-1,72(m,4H),2,29-2,41(m,4H),3,4 7-3,58(m,2H),5,11(s,4H),7,28-7,44(m,10H).
(5) Síntesis de 9-{[(1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}heptadecanodioato de dibencilo
De acuerdo con el método del ejemplo A-1-(5), el compuesto del título (217 mg, 0,34 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (188 mg, 0,37 mmol) obtenido en el ejemplo A-4-(4), clorhidrato del ácido 1-metil-piperidin-4-carboxílico (132 mg, 0,74 mmol), EDC (155 mg, 0,81 mmol), DIPEA (0,126 ml, 0,74 mmol), DMAP (9,0 mg, 0,074 mmol) y cloruro de metileno (1,9 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):1,16-1,38(m,21H),1,53-1,69(m,4H),1,70-1,84(m,2H),1,8 5-2,04(m,4H),2,19-2,40(m,5H),2,26(s,3H),2,74-2,86(m,2H),3,92-4,01(m,2H),5,11(s,4H),7,28 -7,41(m,10H).
(6) Síntesis de 9-{[(1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}heptadecanodioato de bis(3-pentiloctilo)
El compuesto (217 mg, 0,34 mmol) obtenido en el ejemplo A-4-(5) se disolvió en THF (4 ml) y metanol (2 ml), a lo que se añadió paladio al 10 %-carbono (19 mg, que contenía un 50 % de agua) a temperatura ambiente, y la mezcla se agitó en una atmósfera de hidrógeno a presión normal durante 2 horas. El sistema de reacción se remplazó con nitrógeno y la solución de reacción se filtró y se lavó con metanol. El filtrado se concentró a presión reducida para obtener un producto en bruto de ácido 9-{[(1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}heptadecanodioico (160 mg).
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 2, el compuesto del título (34 mg, 0,041 mmol) se obtuvo a partir del producto en bruto obtenido (40 mg), 3-pentiloctan-1-ol (CAS 1443519-63-8) (44 mg, 0,22 mmol), EDC (37 mg, 0,19 mmol), DMAP (2,1 mg, 0,018 mmol) y THF (1 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,83-0,94(m,12H),1,14-1,48(m,53H),1,51-1,67(m,10H),1 .70-1,84(m,2H),1,85-2,07(m,4H),2,18-2,34(m,5H),2,27(s,3H),2,74-2,88(m,2H),3,93-4,01(m, 2H),4,03-4,12(m,4H).
(Síntesis de lípido catiónico (5))
[Ejemplo A-5]
9-{[(1-Metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}heptadecanodioato de di[(Z)-2-nonen-1-ilo] (lípido catiónico 5)
Figure imgf000033_0001
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 2, el compuesto del título (76 mg, 0,11 mmol) se obtuvo a partir del producto en bruto (60 mg) de ácido 9-{[(1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}heptadecanodioico obtenido en el ejemplo A-4-(6), cis-2-nonen-1-ol (0,066 ml, 0,40 mmol), EDC (56 mg, 0,29 mmol), DMAP (3,2 mg, 0,026 mmol) y THF (1,3 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,81-0,96(m,6H),1,15-1,44(m,35H),1,52-1,68(m,6H),1,7 0-1,84(m,2H),1,85-2,05(m,4H),2,05-2,15(m,4H),2,21-2,35(m,5H),2,27(s,3H),2,74-2,88(m,2 H),3,93-4,01(m,2H),4,57-4,67(m,4H),5,47-5,58(m,2H),5,59-5,70(m,2H).
(Síntesis de lípido catiónico (6))
[Ejemplo A-6]
3-Metil-3-azabiciclo[3.1.0] hexano-6-carboxilato de (1R,5S,6r)-2-{9-[(2-butiloctil)oxi]-9-oxononil}dodecilo (lípido catiónico 6)
Figure imgf000034_0001
De acuerdo con el método del ejemplo A-1-(5), el compuesto del título (40 mg, 0,063 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (40 mg, 0,078 mmol) obtenido en el ejemplo A-1-(4), el compuesto (28 mg, 0,16 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 10-(2), EDC (33 mg, 0,17 mmol), DIPEA (0,027 ml, 0,16 mmol), DMAP (1,9 mg, 0,016 mmol) y cloruro de metileno (1,0 ml).1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,80-1,00(m,9H),1,16-1,40(m,46H),1,52-1,70(m,4H),1,8 9-1,97(m,2H),1.98-2,06(m,1H),2,23-2,42(m,4H),2,30(s,3H),3.00-3.12(m,2H),3.87-4,03 (m,4 H).
(Síntesis de lípido catiónico (7))
[Ejemplo A-7]
3-Metil-3-azabiciclo[3.1.0] hexano-6-carboxilato de (1R,5S,6s)-2-{9-[(2-butiloctil)oxi]-9-oxononil}dodecilo (lípido catiónico 7)
Figure imgf000034_0002
De acuerdo con el método del ejemplo A-1-(5), el compuesto del título (38 mg, 0,060 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (40 mg, 0,078 mmol) obtenido en el ejemplo A-1-(4), el compuesto (27,8 mg, 0,16 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 11-(2), EDC (33 mg, 0,17 mmol), DIPEA (0,027 ml, 0,157 mmol), DMAP (1,9 mg, 0,016 mmol) y cloruro de metileno (1,0 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,81-0,97(m,9H),1,15-1,40(m,46H),1,46-1,70(m,7H),2,2 1(s,3H),2,24-2,38(m,4H),2,96-3,07(m,2H),3,85-4,02(m,4H).
(Síntesis de lípido catiónico (8))
[Ejemplo A-8]
4-Metilpiperazin-1-carboxilato de 2-{9-[(2-butiloctil)oxi]-9-oxononil}dodecilo (lípido catiónico 8)
Figure imgf000034_0003
El compuesto (11 mg, 0,022 mmol) obtenido en el ejemplo A-1-(4) y piridina (0,0043 ml, 0,054 mmol) se disolvieron en cloruro de metileno (0,8 ml), a lo que se añadió cloroformiato de 4-nitrofenilo (12 mg, 0,060 mmol) en enfriamiento con hielo, y la mezcla se agitó a la misma temperatura durante 10 minutos y a temperatura ambiente durante 1,5 horas. A la solución de reacción se le añadió 1-metilpiperazina (0,010 ml, 0,090 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción se añadió a una solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio saturado y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo) para obtener el compuesto del título (11 mg, 0,017 mmol).
1H-RMN(400MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,80-0,98(m,9H),1,16-1,42(m,46H),1,52-1,77(m,4H),2,2 3-2,44(m,6H),2,30(s,3H),3,42-3,57(m,4H),3,90-4,04(m,4H).
(Síntesis de lípido catiónico (9))
[Ejemplo A-9]
1-Metilpiperidin-4-carboxilato de 2-[9-(hexiloxi)-9-oxononil]dodecilo (lípido catiónico 9)
Figure imgf000035_0001
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 2, el compuesto del título (102 mg, 0,19 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (100 mg, 0,21 mmol) obtenido en el ejemplo A-2-(6), hexan-1-ol (32 µl, 0,26 mmol), EDC (49 mg, 0,26 mmol), DMAP (5,0 mg, 0,050 mmol) y cloruro de metileno (5,0 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,85-0,92(m,6H),1,19-1,39(m,37H),1,57-1,66(m,5H),1,7 3-1,84(m,2H),1,87-1,94(m,2H),1,96-2,07(m,2H),2,22-2,32(m,6H),2,73-2,87(m,2H),3,98(d,J= 5,50Hz,2H),4,06(t,J=6,79Hz,2H).
(Síntesis de lípido catiónico (10))
[Ejemplo A-10]
1-Metilpiperidin-4-carboxilato de 2-[9-(octiloxi)-9-oxononil]dodecilo (lípido catiónico 10)
Figure imgf000035_0002
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 2, el compuesto del título (109 mg, 0,19 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (200 mg, 0,42 mmol) obtenido en el ejemplo A-2-(6), octan-1-ol (67 mg, 0,51 mmol), EDC (98 mg, 0,51 mmol), DMAP (10 mg, 0,09 mmol) y cloruro de metileno (10 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,91(t,J=6,97Hz,6H),1,23-1,40(m,40H),1,60-1,68(m,5H), 1,76-1,85(m,2H),1,89-1,95(m,2H),1,97-2,06(m,2H),2,25-2,33(m,6H),2,78-2,86(m,2H),4,00(d ,J=5,69 Hz,2H),4,08(t,J=6,79 Hz,2H).
(Síntesis de lípido catiónico (11))
[Ejemplo A-11]
1-Metilpiperidin-4-carboxilato de 2-[9-(deciloxi)-9-oxononil]dodecilo (lípido catiónico 11)
Figure imgf000035_0003
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 2, el compuesto del título (153 mg, 0,25 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (200 mg, 0,42 mmol) obtenido en el ejemplo A-2-(6), decan-1-ol (100 µl, 0,51 mmol), EDC (98 mg, 0,51 mmol), DMAP (10 mg, 0,09 mmol) y cloruro de metileno (10 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,91(t,J=7,06Hz,6H),1,17-1,42(m,44H),1,60-1,68(m,5H), 1,75-1,86(m,2H),1,88-1,96(m,2H),1,97-2,07(m,2H),2,24-2,35(m,6H),2,78-2,87(m,2H),4,00(d ,J=5,50Hz,2H),4,08(t,J=6,79 Hz,2H).
(Síntesis de lípido catiónico (12))
[Ejemplo A-12]
1-Metilpiperidin-4-carboxilato de 2-{9-oxo-9-[(4-pentilnonil)oxi]nonil}dodecilo (lípido catiónico 12)
Figure imgf000036_0001
De acuerdo con el método del ejemplo de producción 2, el compuesto del título (212 mg, 0,32 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (200 mg, 0,42 mmol) obtenido en el ejemplo A-2-(6), el compuesto (115 mg, 0,60 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 7-(2), EDC (98 mg, 0,51 mmol), DMAP (10 mg, 0,09 mmol) y cloruro de metileno (10 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,85-0,92(m,9H),1,16-1,34(m,49H),1,51-1,66(m,5H),1,7 3-1,84(m,2H),1,86-1,94(m,2H),1,95-2,05(m,2H),2,23-2,31(m,6H),2,75-2,85(m,2H),3,98(d,J= 5,50Hz,2H),4,04(t,J=6,79 Hz,2H).
(Síntesis de lípido catiónico (13))
[Ejemplo A-13]
1-Metilpiperidin-4-carboxilato de 2-(4-oxo-4-(trideciloxi)butil)dodecilo (lípido catiónico 13)
Figure imgf000036_0002
(1) Síntesis de 1,1-di-terc-butil butano-1,1,4-tricarboxilato de 4-bencilo
Figure imgf000037_0001
Se suspendió hidruro de sodio al 60 % (1,05 g, 26,2 mmol) en THF (50 ml), a lo que se añadió malonato de di-terc-butilo (5,86 ml, 26,2 mmol) gota a gota en enfriamiento con hielo, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos. En enfriamiento con hielo, se añadió yoduro de sodio (0,37 g, 2,49 mmol), después se añadió el compuesto (6,41 g, 24,9 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 8 gota a gota y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción se diluyó con éter dietílico y se lavó con agua, y la capa acuosa entonces se extrajo con éter dietílico. Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con una solución de cloruro de sodio saturado y se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. Después de la filtración, el disolvente se retiró por destilación a presión reducida para obtener el compuesto del título (9,88 g, 25,2 mmol).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):1,42-1,49(m,18H),1,65-1,72(m,2H),1,80-1,87(m,2H),2,3 9(t,J=7,52 Hz,2H),3,13(t,J=7,52Hz,1H),5,11(s,2H),7,29-7,40(m,5H).
(2) Síntesis de 4,4-di-terc-butil tetradecano-1,4,4-tricarboxilato de 1-bencilo
Figure imgf000037_0002
El compuesto (9,88 g, 25,2 mmol) obtenido en el ejemplo A-13-(1) se disolvió en THF (100 ml), a lo que se añadió hidruro de sodio al 60 % (1,51 g, 37,8 mmol) en enfriamiento con agua, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadió 1-yododecano (10,7 ml, 50,4 mmol) gradualmente y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se añadió con una solución acuosa de cloruro de amonio saturado y se extrajo con n-pentano. La capa orgánica se lavó con una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (n-heptano/éter dietílico) para obtener el compuesto del título (4,31 g, 8,09 mmol).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,85-0,91(m,3H),1,07-1,17(m,2H),1,21-1,33(m,16H),1,4 4(s,18H),1,49-1,54(m,2H),1,74-1,84(m,4H),2,36(t,J=7,34Hz,2H),5,11(s,2H),7,28-7,38(m,5H)
(3) Síntesis de ácido 2-[4-(benciloxi)-4-oxobutil]dodecanoico
Figure imgf000037_0003
El compuesto (4,31 g, 8,09 mmol) obtenido en el ejemplo A-13-(2) se disolvió en cloruro de metileno (20 ml), a lo que se añadió TFA (10 ml) gota a gota en enfriamiento con hielo y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida seguido de la adición de tolueno y destilación azeótropa dos veces. El producto en bruto obtenido se disolvió en xileno (25 ml) y se llevó a reflujo en calentamiento durante 8 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna (ciclohexano/acetato de etilo) para obtener el compuesto del título (2,74 g, 7,28 mmol).
1H-RMN(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0,82-0,89(m,3H),1,17-1,3 1(m,16H),1,32-1,42(m,3H), 1,43-1,57(m,4H),2,16-2,22(m,1H),2,32-2,38(m,2H),5,08(s,2H),7,29-7,40(m,5H),12,06(s a,1H).
(4) Síntesis de 5-(hidroximetil)pentadecanoato de bencilo
Figure imgf000038_0001
El compuesto (2,74 g, 7,28 mmol) obtenido en el ejemplo A-13-(3) se disolvió en THF (30 ml), a lo que se añadió complejo de borano-THF (1 M, 16,9 ml, 16,9 mmol) gota a gota a -78 °C. La mezcla se agitó a 0 °C durante 8 horas y después a 15 °C durante 22 horas. La mezcla se añadió a una solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio saturado y se extrajo con éter dietílico. La capa orgánica se lavó con una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (ciclohexano/acetato de etilo) para obtener el compuesto del título (2,30 g, 6,34 mmol).
1H-RMN(600MHz,DMSO-d6)8(ppm):0,85(t,J=6,88Hz,3H),1,08-1,37(m,18H),1,49-1,58(m,2 H),2,27-2,36(m,2H),3,21-3,29(m,2H),4,28(t,J=5,14Hz, 1H),5,01-5,12(m,2H), 7,30-7,40(m,5H)
(5) Síntesis de 1-metilpiperidin-4-carboxilato de 2-(4-(benciloxi)-4-oxobutil)dodecilo
Figure imgf000038_0002
El compuesto (2,30 g, 6,34 mmol) obtenido en el ejemplo A-13-(4), DIPEA (2,2 ml, 12,7 mmol), clorhidrato del ácido 1-metil-piperidin-4-carboxílico (2,28 g, 12,7 mmol) y DMAP (0,16 g, 1,27 mmol) se disolvieron en cloruro de metileno (30 ml), a lo que se añadió EDC (2,68 g, 13,9 mmol) en enfriamiento con hielo, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y se disolvió en éter dietílico. La solución se lavó en serie con una solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio saturado y agua y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Después de la filtración, el disolvente se retiró por destilación a presión reducida para obtener el compuesto del título (2,97 g, 6,09 mmol).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,88(t,J=7,06Hz,3H),1,17-1,38(m,21H),1,60-1,70(m,3H), 1,77-1. 87(m,2H),1,89-1,99(m,2H),2,23-2,38(m,6H),2,74-2,91(m,2H),3,94-4,02(m,2H),5,09-5.13(m,2H),7,30-7,41(m,5H).
(6) Síntesis de ácido 5-{[(1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}pentadecanoico
Figure imgf000038_0003
El compuesto (2,97 g, 6,09 mmol) obtenido en el ejemplo A-13-(5) se disolvió en acetato de etilo (35 ml), a lo que se añadió paladio al 10 %-carbono (0,65 g, 0,61 mmol, que contenía un 50 % de agua) a temperatura ambiente, y la mezcla se agitó en una atmósfera de hidrógeno a presión normal durante 3 horas. La solución de reacción se filtró y se lavó con acetato de etilo. El filtrado se concentró a presión reducida para obtener el compuesto del título (2,31 g, 5,81 mmol).
1H-RMN(600MHz,DMSO-d6)8(ppm):0,85(t,J=6,88Hz,3H),1,21-1,32(m,20H),1,44-1,66(m,5 H), 1,75-1,83(m,2H), 1,95-1,98(m, 1H), 1,99-2,06(m, 1H),2,13-2,23(m,5H),2,23-2,30(m, 1H),2,64-2,77(m,2H),3,88-3,97(m,2H).
(7) Síntesis de 1-metilpiperidin-4-carboxilato de 2-(4-oxo-4-(trideciloxi)butil)dodecilo
Figure imgf000039_0001
El compuesto (200 mg, 0,50 mmol) obtenido en el ejemplo A-13-(6), tridecan-1-ol (121 mg, 0,60 mmol) y DMAP (12 mg, 0,10 mmol) se disolvieron en cloruro de metileno (5 ml), a lo que se añadió EDC (116 mg, 0,60 mmol) a temperatura ambiente y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (metanol/acetato de etilo) para obtener el compuesto del título (170 mg, 0,29 mmol).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,88(t,J=6,7Hz,6H),1,26(s a,41H),1,57-1,69(m,6H), 1,73-1,82(m,2H),1,90(a dd,J=13,5,3,03Hz,2H),1,94-2,04(m,2H),2,22-2,34(m,6H), 2,67-2,90(a d,J=9,8Hz,2H),3,95-4,02(m,2H),4,03-4,08(t,J=6,8Hz,2H).
(Síntesis de lípido catiónico (14))
[Ejemplo A-14]
1-Metilpiperidin-4-carboxilato de 2-(4-oxo-4-((8-pentiltridecil)oxi)butil)dodecilo (lípido catiónico 14)
Figure imgf000039_0002
De acuerdo con el método del ejemplo A-13-(7), el compuesto del título (133 mg, 0,21 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (120 mg, 0,30 mmol) obtenido en el ejemplo A-13-(6), el compuesto (90 mg, 0,33 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 4-(4), EDC (64 mg, 0,33 mmol), DMAP (4,0 mg, 0,033 mmol) y cloruro de metileno (1,5 ml).
1H-RMN(600MHz,CD3OD)δ(ppm):0,87-0,97(m,9H),1,18-1,45(m,47H),1,60-1,73(m,5H),1,7 3-1,83(m,2H),1,88-1,99(m,2H),2,06-2,19(m,2H),2,23-2,43(m,6H),2,77-2,89(m,2H),3,99-4,15 (m,4H).
(Síntesis de lípido catiónico (15))
[Ejemplo A-15]
1-Metilpiperidin-4-carboxilato de 2-{4-[(4-noniltridecil)oxi]-4-oxobutil}dodecilo (lípido catiónico 15)
Figure imgf000039_0003
De acuerdo con el método del ejemplo A-13-(7), el compuesto del título (106 mg, 0,15 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (110 mg, 0,28 mmol) obtenido en el ejemplo A-13-(6), el compuesto (99 mg, 0,30 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 5-(4), EDC (58 mg, 0,30 mmol), DMAP (4,0 mg, 0,033 mmol) y cloruro de metileno (1,3 ml).
1H-RMN(600MHz,CD3OD)δ(ppm):0,85-0,99(m,9H),1,15-1,44(m,55H),1,56-1,84(m,7H),1,9 4(m,J=13,2Hz,2H),2,06-2,19(m,2H),2,23-2,44(m,6H),2,76-2,90(m,2H),3,96-4,14(m,4H).
(Síntesis de lípido catiónico (16))
[Ejemplo A-16]
9-{[(1-Metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}heptadecanodioato de dioctilo (lípido catiónico 16)
Figure imgf000040_0001
(1) Síntesis de ácido 9-{[(1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}heptadecanodioico
Figure imgf000040_0002
El compuesto (0,80 g, 1,25 mmol) obtenido en el ejemplo A-4-(5) se disolvió en etanol (5 ml), a lo que se añadió paladio al 10 %-carbono (0,13 g, 0,13 mmol, que contenía un 50 % de agua) a temperatura ambiente, y la mezcla se agitó en una atmósfera de hidrógeno a presión normal durante 18 horas. La solución de reacción se filtró a través de Celite y se lavó con etanol. El filtrado se concentró a presión reducida para obtener el compuesto del título (0,58 g, 1,26 mmol).
1H-RMN(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1,17-1,30(m,20H),1,43-1,52(m,4H),1,52-1,62(m,3H), 1,77-1. 82(m,2H),1,92-2,03 (m,2H),2,12-2,22(m,7H),2,23-2,33 (m,1H),2.66-2,75(m, 2H),3,93 (d ,J=5,50Hz,2H).
(2) Síntesis de 9-{[(1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}heptadecanodioato de dioctilo
Figure imgf000040_0003
El compuesto (100 mg, 0,22 mmol) obtenido en el ejemplo A-16-(1), octan-1-ol (83 µl, 0,53 mmol) y DMAP (11 mg, 0,09 mmol) se disolvieron en cloruro de metileno (5 ml), a lo que se añadió EDC (101 mg, 0,53 mmol) a temperatura ambiente y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y después se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (metanol/acetato de etilo) para obtener el compuesto del título (101 mg, 0,15 mmol).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,83-0,92(m,6H),1,21-1,39(m,40H),1,55-1,66(m,9H),1,7 2-1,83(m,2H),1,85-1,95(m,2H),1,95-2,06(m,2H),2,22-2,33(m,8H),2,75-2,87(m,2H),3,97(d,J= 5,69Hz,2H),4,05(t,J=6,69Hz,4H).
(Síntesis de lípido catiónico (17))
[Ejemplo A-17]
9-{[(1-Metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}heptadecanodioato de bis(4-pentilnonilo) (lípido catiónico 17)
Figure imgf000041_0001
De acuerdo con el método del ejemplo A-16-(2), el compuesto del título (0,23 g, 0,27 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (0,20 g, 0,44 mmol) obtenido en el ejemplo A-16-(1), el compuesto (0,23 g, 1,05 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 7-(2), EDC (0,20 g, 1,05 mmol), DMAP (11 mg, 0,09 mmol) y cloruro de metileno (5 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,88(t,J=7,24Hz,12H),1,17-1,35(m,58H),1,58-1,65(m,9H ),1,73-1,83(m,2H),1,87-1,93(m,2H),1,95-2,04(m,2H),2,23-2,32(m,8H),2,75-2,86(m,2H),3,97 (d,J=5,50Hz,2H),4,04(t,J=6,79 Hz,4H).
(Síntesis de lípido catiónico (18))
[Ejemplo A-18]
5-{[(1-Metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}nonanodioato de ditridecilo (lípido catiónico 18)
Figure imgf000041_0002
(1) Síntesis de 4,4-di-terc-butil heptano-1,4,4,7-tetracarboxilato de 1,7-dibencilo
Figure imgf000042_0001
El compuesto (3,84 g, 9,78 mmol) obtenido en el ejemplo A-13-(1) se disolvió en THF (30 ml), a lo que se añadió hidruro de sodio al 60 % (0,43 g, 10,8 mmol) en enfriamiento con agua, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Una solución de 4-bromobutanoato de bencilo (3,02 g, 11,7 mmol) en THF (10 ml) se añadió y se llevó a reflujo en calentamiento durante 18 horas. La solución de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se diluyó con éter dietílico. La capa orgánica se lavó secuencialmente con agua y una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/ciclohexano) para obtener el compuesto del título (1,88 g, 3,31 mmol).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):1,43(s,18H),1,47-1,54(m,4H),1,78-1,85(m,4H),2,36(t,J=7 .34Hz,4H),5,10(s,4H),7,27-7,40(m,10H).
(2) Síntesis de ácido 6-(benciloxi)-2-[4-(benciloxi)-4-oxobutil]-6-hexanoico
Figure imgf000042_0002
De acuerdo con el método del ejemplo A-13-(3), el compuesto del título (1,01 g, 2,45 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (1,88 g, 3,31 mmol) obtenido en el ejemplo A-18-(1), TFA (4 ml), cloruro de metileno (8 ml) y xileno (10 ml).
1H-RMN(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1,31-1,58(m,8H),2,19-2,25(m,1H),2,33-2,37(m,4H),5. 05-5,11(m,4H),7,27-7,40(m,10H),12,14(s a,1H).
(3) Síntesis de 5-(hidroximetil)nonanodioato de dibencilo
Figure imgf000042_0003
El compuesto (1,01 g, 2,45 mmol) obtenido en el ejemplo A-18-(2) se disolvió en THF (10 ml), a lo que se añadió complejo de borano-THF (1 M, 4,9 ml, 4,9 mmol) gota a gota a -78 °C. La mezcla se agitó a 0 °C durante 16 horas, se le añadió solución acuosa de cloruro de amonio saturado y se extrajo con éter dietílico. La capa orgánica se lavó con una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (ciclohexano/acetato de etilo) para obtener el compuesto del título (0,59 g, 1,47 mmol).
1H-RMN(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1,09-1,37(m,6H),1,48-1,56(m,4H),2,32(t,J=7,34Hz,4 H),3,26(t,J=5,23Hz,2H),4,32(t,J=5,14Hz,1H),5,08(s,4H),7,28-7,41(m,10H).
(4) Síntesis de 5-{[(1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}nonanodioato de dibencilo
Figure imgf000043_0002
De acuerdo con el método del ejemplo A-13-(5), el compuesto del título (0,62 g, 1,19 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (0,58 g, 1,47 mmol) obtenido en el ejemplo A-18-(3), DIPEA (0,51 ml, 2,95 mmol), clorhidrato del ácido 1-metil-piperidin-4-carboxílico (0,52 g, 2,95 mmol), DMAP (36 mg, 0,30 mmol), EDC (0,62 g, 3,24 mmol) y cloruro de metileno (7 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):1,27-1,38(m,4H),1,59-1,69(m,5H),1,70-1,81(m,2H),1,85-1,92(m,2H),1,92-2,02(m,2H),2,26(s,4H),2,33(t,J=7,34Hz,4H),2,74-2,83(m,2H),3,97(d,J=5,69 Hz,2H),5,11(s,4H),7,28-7,39(m,10H). (5) Síntesis de ácido 5-[{(1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi}metil]nonanodioico
Figure imgf000043_0003
De acuerdo con el método del ejemplo A-16-(1), el compuesto del título (0,41 g, 1,19 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (0,62 g, 1,19 mmol) obtenido en el ejemplo A-18-(4), paladio al 10 %-carbono (62 mg, 0,06 mmol, que contenía un 50 % de agua) y etanol (2 ml).
1H-RMN(600MHz,DMSO-d6)5(ppm):1,20-1,31(m,4H),1,44-1,66(m,7H),1,72-1,81(m,4H),1. 88-1,97(m,2H),2,13(s,3H),2,16-2,22(m,4H),2,22-2,30(m,1H),2,64-2,71(m,2H),3,93(d,J=5,32 Hz,2H).
(6) Síntesis de
5-{[(1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}nonanodioato de ditridecilo
Figure imgf000043_0001
De acuerdo con el método del ejemplo A-13-(7), el compuesto del título (107 mg, 0,15 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (135 mg, 0,39 mmol) obtenido en el ejemplo A-18-(5), tridecan-1-ol (189 mg, 0,94 mmol), DMAP (9 mg, 0,08 mmol), EDC (166 mg, 0,87 mmol) y cloruro de metileno (5 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,88(t,J=7,06Hz,6H),1,20-1,41(m,45H),1,58-1,71(m,9H), 1,71-1,82(m,2H),1,86-1,94(m,2H),1,95-2,04(m,2H),2,23-2,30(m,8H),2,77-2,83(m,2H),4,00(d ,J=5,5Hz,2H),4,05(t,J=6,88Hz,4H).
(Síntesis de lípido catiónico (19))
[Ejemplo A-19]
5-{[(1-Metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}nonanodioato de bis(8-pentiltridecilo) (lípido catiónico 19)
Figure imgf000044_0001
De acuerdo con el método del ejemplo A-13-(7), el compuesto del título (79 mg, 0,09 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (80 mg, 0,23 mmol) obtenido en el ejemplo A-18-(5), el compuesto (151 mg, 0,56 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 4-(4), DMAP (6 mg, 0,05 mmol), EDC (98 mg, 0,51 mmol) y cloruro de metileno (5 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,88(t,J=7,24Hz,12H),1,15-1,40(m,60H),1,59-1,71(m,10 H),1,72-1,82(m,2H),1,86-1,94(m,2H),1,94-2,04(m,2H),2,23-2,32(m,8H),2,77-2,85(m,2H),4,00(d,J=5,5Hz,2H),4,05(t,J=6,88Hz,4H).
(Síntesis de lípido catiónico (20))
[Ejemplo A-20]
5-{[(1-Metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}nonanodioato de bis(4-noniltridecilo) (lípido catiónico 20)
Figure imgf000044_0002
De acuerdo con el método del ejemplo A-13-(7), el compuesto del título (46 mg, 0,05 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (80 mg, 0,23 mmol) obtenido en el ejemplo A-18-(5), el compuesto (198 mg, 0,61 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 5-(4), DMAP (6 mg, 0,05 mmol), EDC (98 mg, 0,51 mmol) y cloruro de metileno (5 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,88(t,J=6,97Hz,12H),1,17-1,41(m,77H),1,57-1,72(m,9H ),1,72-1,81(m,2H),1,85-1,94(m,2H),1,94-2,03(m,2H),2,23-2,31(m,8H),2,80(m,J=10,50Hz,2H ),4,00(d,J=5,50Hz,2H),4,03(t,J=6,88 Hz,4H). (Síntesis de lípido catiónico (21))
[Ejemplo A-21]
7-{[(1-Metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}tridecanodioato de diundecilo (lípido catiónico 21)
Figure imgf000045_0001
(1) Síntesis de 1,1-di-terc-butil hexano-1,1,6-tricarboxilato de 6-bencilo
Figure imgf000045_0002
Se suspendió hidruro de sodio al 60 % (0,80 g, 20,0 mmol) en THF (35 ml), a lo que se añadió malonato de di-terc-butilo (4,48 ml, 20,0 mmol) gota a gota en enfriamiento con hielo, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. En enfriamiento con hielo, se añadió yoduro de sodio (0,29 g, 1,90 mmol) y después se añadió una solución del compuesto (5,43 g, 19,0 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 9 en THF (10 ml) gota a gota y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción se extrajo con éter dietílico y se lavó con agua y la capa acuosa se diluyó con éter dietílico. Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con una solución de cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (ciclohexano/acetato de etilo) para obtener el compuesto del título (6,01 g, 14,3 mmol).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm): 1,27-1,38(m,4H),1,45(s,18H),1,62-1,68(m,2H),1,73-1,82( m,2H),2,35(t,J=7,52Hz,2H),3,09(t,J=7,61Hz,1H),5,11(s,2H),7,29-7,40(m,5H).
(2) Síntesis de 6,6-di-terc-butil undecano-1,6,6,11-tetracarboxilato de 1,11-dibencilo
Figure imgf000045_0003
De acuerdo con el método del ejemplo A-18-(1), el compuesto del título (5,18 g, 8,29 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (4,0 g, 9,51 mmol) obtenido en el ejemplo A-21-(1), hidruro de sodio al 60 % (0,42 g, 10,5 mmol), el compuesto (3,25 g, 11,4 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 9 y THF (30 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):1,09-1,19(m,4H),1,28-1,36(m,5H),1,43(s,18H),1,60-1,69( m,4H),1,72-1,80(m,4H),2,34(t,J=7,52Hz,4H),5,05-5,15(m,4H),7,28-7,41(m,9H).
(3) Síntesis de ácido 8-(benciloxi)-2-[6-(benciloxi)-6-oxohexil]-8-oxooctanoico
Figure imgf000046_0001
De acuerdo con el método del ejemplo A-13-(3), el compuesto del título (2,49 g, 5,31 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (5,18 g, 8,29 mmol) obtenido en el ejemplo A-21-(2), TFA (10 ml), cloruro de metileno (20 ml) y xileno (25 ml).
1H-RMN(600MHz,DMSO-d6)5(ppm):1,15-1,57(m,16H),2,11-2,20(m,1H),2,33(t,J=7,34Hz,4 H),5,08(s,4H),7,23-7,43(m,10H),12,01(s a,1H).
(4) Síntesis de 7-(hidroximetil)tridecanodioato de dibencilo
Figure imgf000046_0002
De acuerdo con el método del ejemplo A-18-(3), el compuesto del título (1,95 g, 4,29 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (2,49 g, 5,31 mmol) obtenido en el ejemplo A-21-(3), complejo de borano-THF (1 M, 13,2 ml, 13,2 mmol) y THF (20 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):1,11-1,36(m,13H),1,39-1,46(m,1H),1,60-1,70(m,4H),2,3 5(t,J=7,52 Hz,4H),3,51(d,J=5,32Hz,2H),5,11(s,4H),7,29-7,40(m,10H).
(5) Síntesis de 7-{[(1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}tridecanodioato de dibencilo
Figure imgf000046_0003
De acuerdo con el método del ejemplo A-13-(5), el compuesto del título (2,97 g, 6,09 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (1,95 g, 4,29 mmol) obtenido en el ejemplo A-21-(4), DIPEA (1,5 ml, 8,58 mmol), clorhidrato del ácido 1-metil-piperidin-4-carboxílico (1,54 g, 8,58 mmol), DMAP (0,11 g, 0,86 mmol), EDC (1,81 g, 9,44 mmol) y cloruro de metileno (20 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):1,22-1,35(m,12H),1,61-1,68(m,4H),1,70-1,84(m,3H),1,8 5-1,93(m,2H),1,95-2,06(m,2H),2,21-2,30(m,4H),2,35(t,J=7,52Hz,4H),2,74-2,85(m,2H),3,96( d,J=5,50Hz,2H),5,11(s,4H),7,29-7,39 (m,10H).
(6) Síntesis de ácido 7-{[(1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}tridecanodioico
Figure imgf000047_0002
De acuerdo con el método del ejemplo A-16-(1), el compuesto del título (1,34 g, 3,35 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (2,28 g, 3,93 mmol) obtenido en el ejemplo A-21-(5), paladio al 10 %-carbono (0,42 g, 0,39 mmol, que contenía un 50 % de agua) y etanol (20 ml).
1H-RMN(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1,19-1,30(m,12H),1,44-1,53(m,4H),1,53-1,63(m,3H), 1,72-1,81(m,2H),1,90-1,98(m,2H),2,14(s,3H),2,18(t,J=7,43Hz,4H),2,23-2,31(m,1H),2,64-2,73(m,2H),3,93(d,J=5,50Hz,2H).
(7) Síntesis de 7-{[(1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}tridecanodioato de diundecilo
Figure imgf000047_0003
El compuesto (200 mg, 0,50 mmol) obtenido en el ejemplo A-21-(6), undecan-1-ol (83 µl, 1,20 mmol) y DMAP (24 mg, 0,20 mmol) se disolvieron en cloruro de metileno (10 ml), a lo que se añadió EDC (230 mg, 1,20 mmol) a temperatura ambiente y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla se añadió a una solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio saturado y se extrajo con cloruro de metileno, y la capa orgánica entonces se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/ciclohexano/metanol) para obtener el compuesto del título (220 mg, 0,32 mmol).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,88(t,J=7,06Hz,6H),1,19-1,39(m,44H),1,57-1,68(m,9H) 1,71-1,86(m,2H), 1,84-1,95(m,2H), 1,95-2,06(m,2H),2,21-2,34(m,8H),2,75-2,87(m,2H),3,97(d ,J=5,69Hz,2H),4,05(t,J=6,79Hz,4H).
(Síntesis de lípido catiónico (22))
[Ejemplo A-22]
7-{[(1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi]metil}tridecanodioato de bis(4-heptilundecilo) (lípido catiónico 22)
Figure imgf000047_0001
De acuerdo con el método del ejemplo A-16-(2), el compuesto del título (88 mg, 0,10 mmol) se obtuvo a partir del compuesto (200 mg, 0,25 mmol) obtenido en el ejemplo A-21-(6), el compuesto (160 mg, 0,60 mmol) obtenido en el ejemplo de producción 6-(2), DMAP (12 mg, 0,10 mmol), EDC (120 mg, 0,60 mmol) y cloruro de metileno (5 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3 )δ(ppm):0,88(t,J=6,97Hz,12H),1,11-1,36(m,66H),1,49-1,67(m,9H ),1,71-1,84(m,2H),1,84-1,95(m,2H),1,95-2,05(m,2H),2,21-2,33(m,8H),2,74-2,88(m,2H),3,97 (d,J=5,50Hz,2H),4,04(t,J=6,88Hz,4H).
Los lípidos catiónicos sintetizados 1 a 22 se indican en la tabla A a continuación.
[Tabla A-1]
Tabla A: Lípidos catiónicos sintetizados 1 a 22
Figure imgf000048_0001
[Tabla A-2]
Figure imgf000049_0001
[Tabla A-3]
Figure imgf000050_0001
[Tabla A-4]
Figure imgf000051_0001
[Tabla A-5]
Figure imgf000052_0001
B. Preparación y análisis de composiciones
(Preparación de composiciones (1))
[Ejemplo B-1]
Se preparó una composición con el lípido catiónico 1 del ejemplo A-1. Como ácido nucleico, se usó ARNip hibridado (GeneDesign Inc., a partir de ahora en este documento también denominado "ARNip del factor VII") que silencia la expresión del gen del factor VII (factor de coagulación VII de la sangre) y consiste en una hebra codificante que tiene una secuencia de bases: 5'-GGAfUfCAfUfCfUfCAAGfUfCfUfUAfCT∗T-3' (T: ADN, fU, fC= 2'-fluoro ARN, *= enlace fosforotioato) (SEQ ID NO: 1) y una hebra no codificante que tiene una secuencia de bases: 5'-GfUAAGAfCfUfUGAGAfUGAfUfCfCT*T-3' (T: ADN, fU, fC= 2'-fluoro ARN, *= enlace fosforotioato) (SEQ ID NO: 2). El ARNip del factor VII se disolvió en acetato de sodio 25 mM (pH 4,0) a 80 µg/ml para obtener una solución de ARNip diluido. Se disolvieron lípido catiónico 1, DSPC (Nippon Fine Chemical Co., Ltd.), colesterol (Nippon Fine Chemical Co., Ltd.), MPEG2000-DMG (NOF Corporation) en etanol a una relación de 60/8,5/30/1,5 (relación molar) de modo que la concentración de lípido total se estableciera en 7,2 mM, y después se obtuvo una solución de lípido. La solución de ARNip diluido y la solución de lípido se suministraron y mezclaron a caudales de 3 ml/min y 1 ml/min, respectivamente, para obtener una solución acuosa de complejo de lípido. La solución acuosa de complejo de lípido obtenida se sometió a diálisis usando una membrana de diálisis (nombre de producto "Float-A-Lyzer G2", SPECTRUM, Inc., 50K MWCO) para remplazar la solución externa con tampón fosfato (PBS, pH 7,4). Después de la diálisis, se realizó la concentración y esterilización en filtro, obteniendo de ese modo una composición líquida del ejemplo B-1.
[Ejemplo B-2]
Se obtuvo una composición del ejemplo A-7 de la misma manera que el ejemplo B-1 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 2 del ejemplo A-2 en lugar de lípido catiónico 1.
[Ejemplo B-3]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-3 de la misma manera que el ejemplo B-1 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 3 del ejemplo A-3 en lugar de lípido catiónico 1.
[Ejemplo B-4]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-4 de la misma manera que el ejemplo B-1 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 4 del ejemplo A-4 en lugar de lípido catiónico 1.
[Ejemplo B-5]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-5 de la misma manera que el ejemplo B-1 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 5 del ejemplo A-5 en lugar de lípido catiónico 1.
[Ejemplo B-6]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-6 de la misma manera que el ejemplo B-1 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 6 del ejemplo A-6 en lugar de lípido catiónico 1.
[Ejemplo B-7]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-7 de la misma manera que el ejemplo B-1 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 7 del ejemplo A-7 en lugar de lípido catiónico 1.
[Ejemplo B-8]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-8 de la misma manera que el ejemplo B-1 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 8 del ejemplo A-8 en lugar de lípido catiónico 1.
[Ejemplo comparativo B-1]
Se obtuvo una composición de ejemplo comparativo B-1 de la misma manera que en el ejemplo B-1 excepto que, como lípido catiónico, se usó 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (a partir de ahora en este documento denominado "ALN-319") representado por la fórmula (12) a continuación divulgado en el documento de patente 2 que se sintetizó de acuerdo con el método divulgado en el documento de patente 2, en lugar de lípido catiónico 1.
Figure imgf000053_0001
(Análisis de composiciones (1))
En las composiciones del ejemplo B-1 al ejemplo B-8 y el ejemplo comparativo B-1, se midió la tasa de encapsulación de ARNip en complejos de lípido.
Específicamente, se estableció la concentración de ARNip (A) medida con el reactivo de ARN Quant-iT RiboGreen (Invitrogen) después de diluir una composición con agua sin RNasa como la concentración de ARNip presente en la solución externa del complejo de lípido. La concentración de ARNip (B) medida después de diluir la composición con Triton X-100 al 1 % se estableció como la concentración de ARNip total en la composición. A continuación, de acuerdo con la fórmula (F 1) a continuación, se calculó la tasa de encapsulación del ácido nucleico.
Se midió el diámetro promedio de partícula de los complejos de lípido usando un analizador del diámetro de partícula (nombre de producto "Zetasizer Nano ZS", producido por Malvern Panalytical Ltd.).
La tabla 1 muestra la tasa de encapsulación de ARNip y el diámetro promedio de partícula (promedio Z) y el índice de polidispersión de los complejos de lípido.
[Tabla 1]
Tabla 1
Figure imgf000053_0002
Se confirma que las composiciones del ejemplo B-1 al ejemplo B-8 presentan altas tasas de encapsulación de ARNip, equivalente a las de la composición del ejemplo comparativo B-1.
(Preparación de composiciones (2))
[Ejemplo B-9]
Se preparó una composición con el lípido catiónico 1 del ejemplo A-1. Como ácido nucleico, se usó ARNm de luciferasa de luciérnaga (FLuc) (TriLink Biotechnologies, a partir de ahora en este documento también denominado "ARNm de FLuc").
El ARNm de FLuc se disolvió en acetato de sodio 50 mM (pH 4,0) a 27 µg/ml para obtener una solución de ARNm diluido. Se disolvieron lípido catiónico 1, DSPC (Nippon Fine Chemical Co., Ltd.), colesterol (Nippon Fine Chemical Co., Ltd.), MPEG2000-DMG (NOF Corporation) en etanol a una relación de 60/8,5/30/1,5 (relación molar) de modo que una concentración de lípido total se estableciera en 2,4 mM, y se obtuvo una solución de lípido. La solución de ARNm diluido y la solución de lípido se suministraron y mezclaron a caudales de 3 ml/min y 1 ml/min, respectivamente, para obtener una solución acuosa de complejo de lípido. La solución acuosa de complejo de lípido obtenida se sometió a diálisis usando una membrana de diálisis (nombre de producto "Float-A-Lyzer G2", SPECTRUM, Inc., 50K MWCO) para remplazar la solución externa con tampón fosfato (PBS, pH 7,4). Después de la diálisis, se realizó la concentración y esterilización en filtro, obteniendo de ese modo una composición del ejemplo B-9.
[Ejemplo B-10]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-10 de la misma manera que el ejemplo B-9 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 2 del ejemplo A-2 en lugar de lípido catiónico 1.
[Ejemplo comparativo B-2]
Se obtuvo una composición del ejemplo comparativo B-2 de la misma manera que el ejemplo B-9 excepto que, como lípido catiónico, se usó ALN-319 descrito anteriormente en lugar de lípido catiónico 1.
(Análisis de composiciones (2))
De la misma manera que en el análisis de las composiciones (1), se midió la tasa de encapsulación de ARNm en complejos de lípido y el diámetro promedio de partícula de los complejos de lípido para las composiciones del ejemplo B-9, ejemplo B-10 y ejemplo comparativo B-2. La tabla 2 muestra la tasa de encapsulación de ARNm y el diámetro promedio de partícula (promedio Z) de complejos de lípido.
[Tabla 2]
Tabla 2
Figure imgf000054_0001
Se confirma que las composiciones del ejemplo B-9 y ejemplo B-10 presentan altas tasas de encapsulación de ARNm, equivalentes a las de la composición del ejemplo comparativo B-2.
(Preparación de composiciones (3))
[Ejemplo B-11]
Se preparó una composición con el lípido catiónico 2 del ejemplo A-2. Se obtuvo una composición del ejemplo B-11 de la misma manera que en el ejemplo B-9 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 2 en lugar de lípido catiónico 1 y, como ácido nucleico, se usó ARNm de eritropoyetina humana (hEPO) (TriLink Biotechnologies, a partir de ahora en este documento también denominado "ARNm de EPO") en lugar de ARNm de FLuc.
[Ejemplo comparativo B-3]
Se obtuvo una composición del ejemplo comparativo B-3 de la misma manera que en el ejemplo B-11 excepto que, como lípido catiónico, se usó ALN-319 descrito anteriormente en lugar de lípido catiónico 2.
(Análisis de composiciones (3))
De la misma manera que en el análisis de las composiciones (1), se midió la tasa de encapsulación de ARNm en complejos de lípido y el diámetro promedio de partícula de los complejos de lípido para las composiciones del ejemplo B-11 y ejemplo comparativo B-3. La tabla 3 muestra la tasa de encapsulación de ARNm y el diámetro promedio de partícula (promedio Z) de complejos de lípido.
[Tabla 3]
Tabla 3
Figure imgf000055_0001
Se confirma que la composición del ejemplo B-11 presenta una alta tasa de encapsulación de ARNm, equivalente a la de la composición del ejemplo comparativo B-3.
(Preparación de composiciones (4))
[Ejemplo B-12]
De la misma manera que en la preparación de composiciones (1), se obtuvo una composición del ejemplo B-12 que contiene ARNip del factor VII usando lípido catiónico 1 del ejemplo A-1.
[Ejemplo B-13]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-13 de la misma manera que en el ejemplo B-12 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 2 del ejemplo A-2 en lugar de lípido catiónico 1.
[Ejemplo comparativo B-4]
Se obtuvo una composición del ejemplo comparativo B-4 de la misma manera que en el ejemplo B-12 excepto que, como lípido catiónico, se usó ALN-319 descrito anteriormente en lugar de lípido catiónico 1.
(Análisis de composiciones (4))
De la misma manera que en el análisis de composiciones (1), se midió el diámetro promedio de partícula (diámetro promedio de partícula prealmacenamiento) de complejos de lípido para las composiciones del ejemplo B-12, ejemplo B-13 y ejemplo comparativo B-4. Las composiciones se almacenaron adicionalmente en viales sellados a 4 °C durante 3 meses y se midió el diámetro promedio de partícula (diámetro promedio de partícula posalmacenamiento) de complejos de lípido. La tabla 4 muestra el cambio en el diámetro promedio de partícula (promedio Z) de complejos de lípido. En la tabla, se calculó el cambio (%) en el diámetro promedio de partícula mediante diámetro promedio de partícula posalmacenamiento/diámetro promedio de partícula prealmacenamiento × 100.
[Tabla 4]
Tabla 4
Figure imgf000055_0002
Se demostró que las composiciones del ejemplo B-12 y ejemplo B-13 tenían diámetros promedio de partícula que apenas cambiaban después de un almacenamiento durante 3 meses y eran físicamente más estables que la composición del ejemplo comparativo B-4.
(Preparación de composiciones (5))
[Ejemplo B-14]
De la misma manera que en la preparación de composiciones (1), se obtuvo una composición del ejemplo B-14 que contiene ARNip del factor VII usando lípido catiónico 9 del ejemplo A-9.
[Ejemplo B-15]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-15 de la misma manera que en el ejemplo B-14 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 10 del ejemplo A-10 en lugar de lípido catiónico 9.
[Ejemplo B-16]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-16 de la misma manera que en el ejemplo B-14 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 11 del ejemplo A-11 en lugar de lípido catiónico 9.
[Ejemplo B-17]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-17 de la misma manera que en el ejemplo B-14 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 12 del ejemplo A-12 en lugar de lípido catiónico 9.
[Ejemplo B-18]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-18 de la misma manera que en el ejemplo B-14 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 13 del ejemplo A-13 en lugar de lípido catiónico 9.
[Ejemplo B-19]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-19 de la misma manera que en el ejemplo B-14 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 14 del ejemplo A-14 en lugar de lípido catiónico 9.
[Ejemplo B-20]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-20 de la misma manera que en el ejemplo B-14 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 15 del ejemplo A-15 en lugar de lípido catiónico 9.
[Ejemplo B-21]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-21 de la misma manera que en el ejemplo B-14 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 2 del ejemplo A-2 en lugar de lípido catiónico 9.
(Análisis de composiciones (5))
De la misma manera que en el análisis de composiciones (1), se midió la tasa de encapsulación de ARNip en complejos de lípido y el diámetro promedio de partícula de complejos de lípido para las composiciones del ejemplo B-14 al ejemplo B-21. La tabla 5 muestra la tasa de encapsulación de ARNip y el diámetro promedio de partícula (promedio Z) y el índice de polidispersión de los complejos de lípido.
Tabla 5
Figure imgf000057_0001
(Preparación de composiciones (6))
[Ejemplo B-22]
De la misma manera que en la preparación de composiciones (1), se obtuvo una composición del ejemplo B-22 que contiene ARNip del factor VII usando lípido catiónico 16 del ejemplo A-16.
[Ejemplo B-23]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-23 de la misma manera que en el ejemplo B-22 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 17 del ejemplo A-17 en lugar de lípido catiónico 16.
[Ejemplo B-24]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-24 de la misma manera que en el ejemplo B-22 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 18 del ejemplo A-18 en lugar de lípido catiónico 16.
[Ejemplo B-25]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-25 de la misma manera que en el ejemplo B-22 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 19 del ejemplo A-19 en lugar de lípido catiónico 16.
[Ejemplo B-26]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-26 de la misma manera que en el ejemplo B-22 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 20 del ejemplo A-20 en lugar de lípido catiónico 16.
[Ejemplo B-27]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-27 de la misma manera que en el ejemplo B-22 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 21 del ejemplo A-21 en lugar de lípido catiónico 16.
[Ejemplo B-28]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-28 de la misma manera que en el ejemplo B-22 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 22 del ejemplo A-22 en lugar de lípido catiónico 16.
[Ejemplo B-29]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-29 de la misma manera que en el ejemplo B-22 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 2 del ejemplo A-2 en lugar de lípido catiónico 16.
(Análisis de composiciones (6))
De la misma manera que en el análisis de composiciones (1), se midió la tasa de encapsulación de ARNip en complejos de lípido y el diámetro promedio de partícula de complejos de lípido para las composiciones del ejemplo B-22 al ejemplo B-29. La tabla 6 muestra la tasa de encapsulación de ARNip y el diámetro promedio de partícula (promedio Z) y el índice de polidispersión de los complejos de lípido.
[Tabla 6]
Tabla 6
Figure imgf000058_0001
(Preparación de composiciones (7))
[Ejemplo B-30]
De la misma manera que en la preparación de composiciones (1), se obtuvo una composición del ejemplo B-30 que contiene ARNip del factor VII usando lípido catiónico 1 del ejemplo A-1.
[Ejemplo B-31]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-30 de la misma manera que en el ejemplo B-30 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 2 del ejemplo A-2 en lugar de lípido catiónico 1.
[Ejemplo B-32]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-32 de la misma manera que en el ejemplo B-30 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 3 del ejemplo A-3 en lugar de lípido catiónico 1.
[Ejemplo B-33]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-33 de la misma manera que en el ejemplo B-30 excepto que, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 4 del ejemplo A-4 en lugar de lípido catiónico 1.
[Ejemplo comparativo B-5]
Se obtuvo una composición del ejemplo comparativo B-5 de la misma manera que en el ejemplo B-30 excepto que, como lípido catiónico, se usó ALN-319 descrito anteriormente en lugar de lípido catiónico 1.
(Análisis de composiciones (7))
De la misma manera que en el análisis de composiciones (1), se midió el diámetro promedio de partícula (diámetro promedio de partícula prealmacenamiento) de complejos de lípido para las composiciones del ejemplo B-30 al ejemplo B-33 y ejemplo comparativo B-5. Las composiciones se almacenaron adicionalmente en viales sellados a 4 °C y se midió el diámetro promedio de partícula (diámetro promedio de partícula posalmacenamiento) de complejos de lípido después de 3 meses y 6 meses. La tabla 7 muestra el cambio en el diámetro promedio de partícula (promedio Z) de complejos de lípido. En la tabla, se calculó el cambio (%) en el diámetro promedio de partícula mediante diámetro promedio de partícula posalmacenamiento (después de 6 meses)/diámetro promedio de partícula prealmacenamiento × 100.
[Tabla 7]
Tabla 7
Figure imgf000059_0001
Se demostró que las composiciones del ejemplo B-30 al ejemplo B-33 tenían diámetros promedio de partícula que apenas cambiaban después de un almacenamiento de 6 meses y eran físicamente más estables que la composición del ejemplo comparativo B-5.
(Preparación de composiciones (8))
[Ejemplo B-34]
Se preparó una composición con el lípido catiónico 2 del ejemplo A-2. Como ácido nucleico, se usó ARNm de EPO. El ARNm de EPO disolvió en citrato de sodio 10 mM (pH 4,0) a 80 µg/ml para obtener una solución de ARNm diluido. Se disolvieron lípido catiónico 2, DOPE (NOF Corporation), colesterol (Nippon Fine Chemical Co., Ltd.), MPEG2000-DMG (NOF Corporation) en etanol a una relación de 60/5,0/33,5/1,5 (relación molar) de modo que la concentración de lípido total se estableciera en 2,25 mM, y después se obtuvo una solución de lípido. La solución de ARNm diluido y la solución de lípido se suministraron y mezclaron a caudales de 3 ml/min y 1 ml/min, respectivamente, para obtener una solución acuosa de complejo de lípido. La solución acuosa de complejo de lípido obtenida se sometió a diálisis usando una membrana de diálisis (nombre de producto "Float-A-Lyzer G2", SPECTRUM, Inc., 50K MWCO) para remplazar la solución externa con tampón fosfato (PBS, pH 7,4). Después de la diálisis, se realizó la concentración y esterilización en filtro, obteniendo de ese modo una composición del ejemplo B-34.
[Ejemplo B-35]
Se obtuvo una composición del ejemplo B-35 de la misma manera que en la preparación de composiciones (1) excepto que, como ácido nucleico, se uso ARNip de luciferasa en lugar de ARNip de factor VII y, como lípido catiónico, se usó lípido catiónico 2 del ejemplo A-2 en lugar de lípido catiónico 1. El ARNip de luciferasa era ARNip hibridado (GeneDesign Inc.) que consiste en una hebra codificante que tiene una secuencia de bases: 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAT*T-3' (T: ADN, *= enlace fosforotioato) (SEQ ID NO: 3) y una hebra no codificante que tiene una secuencia de bases: 5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGT*T-3'(T: ADN, *= enlace fosforotioato) (SEQ ID NO: 4).
(Análisis de composiciones (8))
De la misma manera que en el análisis de composiciones (1), se midió la tasa de encapsulación de ARNm o ARNip en complejos de lípido y el diámetro promedio de partícula de complejos de lípido para las composiciones del ejemplo B-34 y ejemplo B-35. La tabla 8 muestra la tasa de encapsulación de ARNm o ARNip y el diámetro promedio de partícula (promedio Z) de complejos de lípido.
[Tabla 8]
Tabla 8
Figure imgf000060_0001
Se confirma que las composiciones del ejemplo B-34 y ejemplo B-35 presentan altas tasas de encapsulación de ácido nucleico. Este resultado indica que las composiciones de los ejemplos pueden usarse para administrar ácido nucleico independientemente del tipo de ácidos nucleicos.
C. Ejemplos de prueba
[Ejemplo de prueba 1]
Las composiciones del ejemplo B-1 al ejemplo B-3 y ejemplo comparativo B-1 se diluyeron con PBS de modo que la concentración de ARNip del factor VII encapsulado en los complejos de lípido fuera 1 µg/ml o 5 µg/ml. Las composiciones se administraron a ratones ICR (5 semanas de edad, hembra, peso promedio: 25 g, n = 3) mediante la vena de la cola a una dosificación de 10 ml/kg, y se recogieron la sangre y el hígado con anestesia 24 horas después de la administración. El plasma se separó de la sangre por centrifugación y se ensayó la concentración de proteína factor VII en el plasma usando un kit disponible en el mercado (nombre de producto "BIOPHEN FVII", HYPHEN BioMed). Como control negativo, se realizó el mismo tratamiento en un grupo al que se administró PBS.
Cuando se establece la concentración de proteína factor VII del grupo al que se administró PBS al 100 %, se calcularon las concentraciones de proteína factor VII de los grupos a los que se administraron las composiciones como un valor relativo. Los resultados se muestran en la figura 1 y la tabla 9.
[Tabla 9]
Tabla 9
Figure imgf000060_0002
Se confirma que las composiciones del ejemplo B-1 al ejemplo B-3 tienen un efecto inhibidor mayor sobre la expresión de proteína factor VII que la composición del ejemplo comparativo B-1. Este resultado indica que las composiciones de los ejemplos liberan eficazmente los ácidos nucleicos en el citoplasma.
[Ejemplo de prueba 2]
De la misma manera que en el ejemplo de prueba 1, las composiciones del ejemplo B-4 y ejemplo comparativo B-1 se administraron a ratones ICR (5 semanas de edad, hembra, peso promedio: 25 g, n = 3) y se calculó el valor relativo de concentración de proteína factor VII en el plasma 24 horas después de la administración. Los resultados se muestran en la figura 2 y la tabla 10.
[Tabla 10]
Tabla 10
Figure imgf000061_0001
Se confirma que la composición del ejemplo B-4 tiene un mayor efecto inhibidor sobre la expresión de proteína factor VII que la composición del ejemplo comparativo B-1. Este resultado indica que las composiciones de los ejemplos liberan eficazmente los ácidos nucleicos en el citoplasma.
[Ejemplo de prueba 3]
De la misma manera que en el ejemplo de prueba 1, la composición del ejemplo B-5 se administró a ratones ICR (5 semanas de edad, hembra, peso promedio: 25 g, n = 3) y se calculó el valor relativo de concentración de proteína factor VII en el plasma 24 horas después de la administración. Los resultados se muestran en la tabla 11.
[Tabla 11]
Tabla 11
Figure imgf000061_0002
Se confirma que la composición del ejemplo B-5 tiene un elevado efecto inhibidor sobre la expresión de proteína factor VII. Este resultado indica que las composiciones de los ejemplos liberan eficazmente los ácidos nucleicos en el citoplasma.
[Ejemplo de prueba 4]
Las composiciones del ejemplo B-11 y ejemplo comparativo B-3 se diluyeron con PBS de modo que la concentración de ARNm de hEPO encapsulado en complejos de lípido fuera de 1 µg/ml o 3 µg/ml. Las composiciones se administraron a ratones ICR (5 semanas de edad, hembra, peso promedio: 25 g, n = 3) mediante la vena de la cola a una dosificación de 10 ml/kg, y se recogió la sangre con anestesia 24 horas después de la administración. El plasma se separó de la sangre por centrifugación y se ensayó la concentración de proteína hEPO en el usando un kit disponible en el mercado (nombre de producto "Human Erythropoietin Quantikine IVD ELISA Kit", R&D Systems). Como control negativo, se realizó el mismo tratamiento en un grupo de ratones sin administración (sin tratamiento) y un grupo de ratones a los que se administró PBS. Los resultados se muestran en la tabla 12.
[Tabla 12]
Tabla 12
Figure imgf000061_0003
Se confirma que la composición del ejemplo B-11 tiene un mayor efecto de la expresión de proteína hEPO que la composición del ejemplo comparativo B-3. Este resultado indica que las composiciones de los ejemplos liberan eficazmente los ácidos nucleicos en el citoplasma.
[Ejemplo de prueba 5]
Las composiciones del ejemplo B-14 al ejemplo B-21 se diluyeron con PBS de modo que la concentración de ARNip del factor VII encapsulado en complejos de lípido fuera de 3 µg/ml o 30 µg/ml. Las composiciones se administraron a ratones ICR (5 semanas de edad, hembra, peso promedio: 25 g, n = 3) mediante la vena de la cola a una dosificación de 10 ml/kg, y se recogieron la sangre y el hígado con anestesia 24 horas después de la administración. El plasma se separó de la sangre por centrifugación y se ensayó la concentración de proteína factor VII en el plasma usando un kit disponible en el mercado (nombre de producto "BIOPHEN FVII", HYPHEN BioMed). Como control negativo, se realizó el mismo tratamiento en un grupo al que se administró PBS.
Cuando se estableció la concentración de proteína factor VII del grupo al que se administró PBS al 100 %, se calcularon las concentraciones de proteína factor VII de los grupos a los que se administraron las composiciones como un valor relativo. Los resultados se muestran en la tabla 13.
[Tabla 13]
Tabla 13
Figure imgf000062_0001
[Ejemplo de prueba 6]
De la misma manera que en el ejemplo de prueba 5, las composiciones del ejemplo B-22 al ejemplo B-29 se administraron a ratones ICR (5 semanas de edad, hembra, peso promedio: 25 g, n = 3) y se calculó el valor relativo de concentración de proteína factor VII en el plasma 24 horas después de la administración. Los resultados se muestran en la tabla 14.
[Tabla 14]
Tabla 14
Figure imgf000063_0001
[Ejemplo de prueba 7]
La composición del ejemplo B-34 que encapsula ARNm de EPO se diluyó con PBS de modo que la concentración de ARN encapsulado en el complejo de lípido fuera de 30 µg/ml. Las composiciones se administraron a ratones BALB/c (hembra, n = 4) mediante la vena de la cola a una dosificación de 10 ml/kg, y se recogió la sangre con anestesia 1 día y 4 días después de la administración. El plasma se separó de la sangre por centrifugación y se ensayó la concentración de proteína hEPO en el usando un kit disponible en el mercado (nombre de producto "Human Erythropoietin Quantikine IVD ELISA Kit", R&D Systems). También se midió el número de reticulocitos. Como controles negativos, se realizó el mismo tratamiento en un grupo de ratones sin administración (sin tratamiento) y un grupo de ratones al que se administró la composición del ejemplo B-35 que encapsula ARNip de luciferasa. Los resultados se muestran en la tabla 15.
[Tabla 15]
Tabla 15
Figure imgf000063_0002
En el grupo sin tratamiento y el grupo de administración de ARNip de Luc, no se detectó hEPO, mientras que en el grupo de administración de ARNm de EPO, se detectó hEPO 1 día después de la administración. También se confirmó que, debido a la acción de la EPO generada, el número de reticulocitos aumentó 4 días después de la administración. Este resultado indica que las composiciones de los ejemplos liberan eficazmente los ácidos nucleicos en el citoplasma.
A partir de los resultados anteriores, de acuerdo con el lípido catiónico de la presente invención, es posible liberar ácidos nucleicos eficazmente en el citoplasma. Además, de acuerdo con el lípido catiónico de la presente invención, es posible suprimir un aumento en el diámetro de partícula de complejos de lípido después de un almacenamiento durante un determinado periodo de tiempo.
Aplicabilidad industrial
De acuerdo con la presente invención, es posible proporcionar un lípido catiónico que puede liberar eficazmente ácidos nucleicos en el citoplasma.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1.Un compuesto representado por la fórmula (1a) a continuación o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000065_0003
en donde L1 y L2 independientemente representan un grupo alquileno que tiene de 3 a 10 átomos de carbono; R1 y R2 independientemente representan un grupo alquilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono o un grupo alquenilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono; X1 representa un enlace sencillo o -CO-O-; y el anillo P representa cualquiera de las fórmulas (P-1) a (P-5) a continuación:
Figure imgf000065_0001
en donde R3 representa un grupo alquilo que tiene de 1 a 3 átomos de carbono.
2.El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, representado por la fórmula (1) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000065_0004
en donde L1 y L2 independientemente representan un grupo alquileno que tiene de 3 a 10 átomos de carbono; R1 y R2 independientemente representan un grupo alquilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono o un grupo alquenilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono; y X1 representa un enlace sencillo o -CO-O-.
3.El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por las fórmulas (A1) a (A22) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Figure imgf000065_0002
Figure imgf000066_0001
Figure imgf000067_0001
4.El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, representado por la fórmula (A1) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000067_0003
5.El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, representado por la fórmula (A2) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000067_0002
6.El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, representado por la fórmula (A3) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000067_0004
7.El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, representado por la fórmula (A4) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000068_0001
8.El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, representado por la fórmula (A5) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000068_0002
9.El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, representado por la fórmula (A9) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000068_0003
10.El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, representado por la fórmula (A12) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000068_0004
11.El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, representado por la fórmula (A15) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000068_0005
12.El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, representado por la fórmula (A20) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000069_0001
13.Un complejo de lípido que comprende:
(I) el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y
(II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol.
14.Una composición que comprende:
(I) el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
(II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol; y
(III) un ácido nucleico.
15.Un método de producción de una composición, comprendiendo el método:
la etapa de mezclar una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar que contiene (I) el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol con una solución acuosa que contiene (III) un ácido nucleico para obtener una solución mixta; y
la etapa de reducir el contenido porcentual del disolvente orgánico polar en la solución mixta.
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