CN117756653A - 一种阳离子脂质化合物及其组合物和用途 - Google Patents

一种阳离子脂质化合物及其组合物和用途 Download PDF

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CN117756653A CN202311726156.3A CN202311726156A CN117756653A CN 117756653 A CN117756653 A CN 117756653A CN 202311726156 A CN202311726156 A CN 202311726156A CN 117756653 A CN117756653 A CN 117756653A
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张世超
钱佳乐
陈宇浩
孟丽苹
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Crystal Pharmatech Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种阳离子脂质化合物及其组合物和用途。所述化合物如下式(I)所示。本发明还提供了以所述化合物为关键组分的脂质纳米颗粒在核酸递送方面的用途，包含递送载体的组分、制备方法和使用方法。

Description

一种阳离子脂质化合物及其组合物和用途
技术领域
本发明涉及脂质递送载体领域。具体的说，本发明涉及用于递送核酸的阳离子脂质化合物及其组合物和用途。
背景技术
基因治疗是通过将外源基因导入靶细胞或组织，替代、补偿、阻断或修正特定基因，以达到治疗和预防疾病的目的。但是，外源基因在体内循环时间短、易被降解，从而难以进入靶细胞或者靶组织。因此，寻找良好的基因递送载体，提高基因药物的体内递送效率，是提高基因治疗产品有效性的关键方向之一。
目前，应用最广的基因递送载体是脂质纳米颗粒，它可以保护核酸在体内不被迅速降解，延长循环时间，增强靶向递送。脂质纳米颗粒由不同的脂质组分组成，包括阳离子脂质化合物、结构脂质、磷脂和PEG脂质等。其中阳离子脂质化合物在核酸包载和释放中起关键作用，因此研发新型、高效、低毒的阳离子脂质化合物至关重要。
为克服现有技术的缺点，仍然需要一种符合基因治疗产品递送需求的新型阳离子脂质化合物，以用于含基因治疗产品的开发。本申请的发明人设计合成本发明提供的阳离子脂质化合物，由其构成的脂质纳米颗粒组合物在包封率，生物安全性，细胞和生物体内转染效率，蛋白质表达等方面中的至少一方面存在优势，解决了现有技术存在的问题，对基因治疗产品的开发具有非常重要的意义。
发明内容
本发明提供一种新型阳离子脂质化合物及其组合物和用途。
根据本发明的目的，本发明提供一种式(I)所示的阳离子脂质化合物或其药学上可接受的盐、异构体、稳定的同位素衍生物，
其中，
L1和L2各自独立地选自-C(＝O)O-和-OC(＝O)-；
X1和X2各自独立地选自
G1和G2各自独立地选自C5-7的烷基；
R1和R2各自独立地选自C10-17烷基。
发明的效果
本发明提供的阳离子脂质化合物的合成工艺简单、稳定性好，其兼具高效(可体现为高转染效率)和低毒性；同时稳定均一、易于制备；可用于各种细胞系转染。从而具备优秀的传递性，可将活性物质(如示例的siRNA、mRNA)高效递送到细胞、组织、器官中，实现活性物质的高效调控。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。
一方面，本发明提供一种式(I)所示的阳离子脂质化合物或其药学上可接受的盐、异构体、稳定的同位素衍生物，
其中，
L1和L2各自独立地选自-C(＝O)O-和-OC(＝O)-；
X1和X2各自独立地选自
G1和G2各自独立地选自C5-7的烷基；
R1和R2各自独立地选自C10-17烷基。
在某些实施方案中，所述G1选自未取代的C5烷基、C6烷基和C7烷基。
在某些实施方案中，所述G2选自未取代的C5烷基、C6烷基和C7烷基。
在某些实施方案中，所述G1选自
在某些实施方案中，所述G2选自
在某些实施方案中，所述R1选自未取代的C10烷基、C11烷基、C15烷基、C16烷基和C17烷基。
在某些实施方案中，所述R2选自未取代的C10烷基、C11烷基、C15烷基、C16烷基和C17烷基。
在某些实施方案中，所述R1选自
在某些实施方案中，所述R2选自
本发明提供一种阳离子脂质化合物或其药学上可接受的盐、异构体、稳定的同位素衍生物，其特征在于，所述阳离子脂质化合物具有以下所示的结构之一：
另一方面，本发明提供一种脂质纳米颗粒组合物，包含上述阳离子脂质化合物或其药学上可接受的盐、异构体、稳定的同位素衍生物。
在某些实施方案中，所述脂质纳米颗粒组合物还包含治疗剂和/或预防剂、结构脂质、磷脂或PEG脂质的一种或多种组分。
在某些实施方案中，所述治疗剂和/或预防剂选自核酸。
在某些实施方案中，所述核酸可列举：siRNA、miRNA、shRNA表达载体、反义寡核苷酸、mRNA、核酶等。
在某些实施方案中，所述核酸可列举：siRNA、miRNA、mRNA。
在某些实施方案中，所谓磷脂意指在生理性pH值下以不带电或中性的两性离子的任一种形式存在的脂质。作为中性脂质，可列举：二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二花生酰磷脂酰胆碱(DAPC)、二山萮酰磷脂酰胆碱(DBPC)、二(木蜡酰)磷脂酰胆碱(DLPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、神经鞘磷脂、脑酰胺、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-顺丁烯二酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)等。中性脂质可单独使用1种，或者亦可将2种以上混合而使用。
在某些实施方案中，作为PEG脂质，可列举：PEG2000-DMG(PEG2000-二肉豆蔻基甘油)、PEG2000-DPG(PEG2000-二棕榈酰甘油)、PEG2000-DSG(PEG2000-二硬脂酰甘油)、PEG5000-DMG(PEG5000-二肉豆蔻基甘油)、PEG5000-DPG(PEG5000-二棕榈酰甘油)、PEG5000-DSG(PEG5000-二硬脂酰甘油)、PEG-cDMA(N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)胺甲酰基]-1，2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺)、PEG-C-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)胺甲酰基]-1，2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺)、聚乙二醇(PEG)-二酰甘油(DAG)、PEG-二烷基氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂质、PEG-脑酰胺(Cer)、ALC-0159(2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺)等。
在某些实施方案中，作为PEG-二烷基氧基丙基，可列举：PEG-二月桂基氧基丙基、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基、PEG-二棕榈基氧基丙基、PEG-二硬脂基氧基丙基等。聚乙二醇修饰脂质可单独使用1种，或者亦可将2种以上混合而使用。
在某些实施方案中，作为结构脂质，可列举：胆固醇、二氢胆固醇、羊毛固醇、β-植固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、麦角固醇、海藻固醇、3β-[N-(N′，N′-二甲胺基乙基)胺甲酰基]胆固醇(DC-Chol)等。固醇可单独使用1种，或者亦可将2种以上混合而使用。
在某些实施方案中，本实施例的组合物以组合物所含的全部脂质为基准，而含有例如10～80摩尔％、例如20～70摩尔％、例如30～60摩尔％的上述的阳离子脂质化合物。阳离子脂质化合物可单独使用1种，或者亦可将2种以上混合而使用。
在某些实施方案中，本实施例的组合物以组合物所含的全部脂质为基准，而可含有例如0～50摩尔％、例如0～40摩尔％、例如0～30摩尔％、例如0～15摩尔％的磷脂。
在某些实施方案中，本实施例的组合物以组合物所含的全部脂质为基准，而可含有例如0～10摩尔％、例如0～5摩尔％、例如0～3摩尔％、例如0～2摩尔％、例如0.5～2摩尔％的PEG脂质。
在某些实施方案中，本实施例的组合物以组合物所含的全部脂质为基准，而可含有例如0～70摩尔％、例如10～60摩尔％、例如20～50摩尔％的结构脂质。
在某些实施方案中，本实施例的组合物相对于组合物的总重量，而含有例如1～30重量％、例如2～25重量％、例如3～20重量％的核酸、例如4～15重量％的核酸。
另一方面，本发明提供上述阳离子脂质化合物或其药学上可接受的盐、异构体、稳定的同位素衍生物或上述脂质纳米颗粒组合物具有下述1)-4)中任一种功能的产品中的应用：
1)包封活性物质；
2)将活性物质递送至细胞、组织或器官；
3)使活性物质在细胞、组织或器官中发挥活性；
4)预防、诊断和/或治疗疾病。
在某些实施方案中，本发明提供上述阳离子脂质化合物或其药学上可接受的盐、异构体、稳定的同位素衍生物或上述脂质纳米颗粒组合物在制备将治疗剂和/或预防剂递送至细胞的药物载体中的用途。
术语解释：
除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
本发明中所用到的缩写的解释如下：
采集数据所用的仪器及方法：
核磁共振氢谱数据(1H NMR)采自于Bruker Avance IIDMX 400M Hz核磁共振波谱仪。称量1-5mg样品，用0.5mL氘代二甲亚砜溶解，配成2-10mg/mL的溶液。
质谱数据(MS)采自于Waters H-Class Xevo TQ-S micro液质谱联用仪，使用大气压化学电离离子源(APCI)模式收集数据。HPLC流动相为0.05％甲酸/水溶液及0.05％甲酸/乙腈溶液。流速为0.3mL/min，进样量为1μL,色谱柱为：Welch Ultimate SiO2 3.0x50mm,5μm。将1-2mg样品，用1mL甲醇溶解，配成约1mg/mL的溶液。
本发明所述“对比化合物1”为：
本发明所述“对比化合物2”为：
本发明所述“对比化合物3”为：
本发明所述“MC3”为二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯,其结构为：
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至25个碳原子的直链或支链基团。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自氘原子、卤素、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基。
上述烷基从母体原子上除去一个氢原子所衍生的残基，即“亚烷基”。
术语“烯基”指分子中含有至少一个碳碳双键的烷基化合物，其中烷基的定义如上所述。烯基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷氧基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基。
术语“炔基”指分子中含有至少一个碳碳三键的烷基化合物，其中烷基的定义如上所述。炔基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷氧基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基。
本公开的化合物包含其同位素衍生物。术语“同位素衍生物”指结构不同仅在于存在一种或多种同位素富集原子的化合物。例如，具有本公开的结构，用“氘”或“氚”代替氢，或者用18F-氟标记(18F同位素)代替氟，或者用11C-，13C-，或者14C-富集的碳(11C-，13C-，或者14C-碳标记；11C-，13C-，或者14C-同位素)代替碳原子的化合物处于本公开的范围内。这样的化合物可用作例如生物学测定中的分析工具或探针，或者可以用作疾病的体内诊断成像示踪剂，或者作为药效学、药动学或受体研究的示踪剂。本公开的各种氘化形式的化合物是指与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换。本领域技术人员能够参考相关文献合成氘化形式的化合物。在制备氘代形式的化合物时可使用市售的氘代起始物质，或它们可使用常规技术采用氘代试剂合成，氘代试剂包括但不限于氘代硼烷、三氘代硼烷四氢呋喃溶液、氘代氢化锂铝、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。氘代物通常可以保留与未氘代的化合物相当的活性，并且当氘代在某些特定位点时可以取得更好的代谢稳定性，从而获得某些治疗优势。
“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为1～5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下(通过实验或理论)确定可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
“阳离子脂质”是指在其环境的任何pH值或氢离子活性下带正电，或能够响应于其环境(例如其预定用途的环境)的pH值或氢离子活性而带正电的脂质。因此，术语“阳离子”涵盖“永久性阳离子”和“可阳离子化”。在某些实施方案中，阳离子脂质中的正电荷源自季氮原子的存在。在某些实施方案中，阳离子脂质在其预定用途的环境中(例如在生理pH值下)带正电荷。。在某些实施方案中，阳离子脂质是如本文所描述的一种或多种式(I)的脂质。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
本文所用的术语“药学上可接受的”是指这些化合物、材料、组合物和/或剂型，在合理的医学判断范围内，适用于与患者组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，具有合理的获益/风险比，并且对预期的用途是有效。
“药学上可接受的盐”是指本公开化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性。可以在化合物的最终分离和纯化过程中，或通过使合适的基团与合适的碱或酸反应来单独制备盐。通常用于形成药学上可接受的盐的碱包括无机碱，以及有机碱。通常用于形成药学上可接受的盐的酸包括无机酸以及有机酸。
术语“异构体”意思指化合物的任何几何异构体、互变异构体、两性离子、立体异构体、对映异构体或非对映异构体。化合物可以包括一个或多个手性中心和/或双键，并因此呈立体异构体，如双键异构体(即，几何E/Z异构体)或非对映异构体(例如对映异构体(即，(+)或(-))或顺式/反式异构体)形式存在。本公开涵盖本文所描述的化合物的任何和所有异构体，包括立体异构纯形式(例如几何异构纯、对映异构纯或非对映异构纯)以及对映异构体和立体异构体混合物，例如外消旋物。化合物的对映异构体和立体异构体混合物以及将其拆分成其组成对映异构体或立体异构体的方式是众所周知的。
本文所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数引用，反之亦然，除非上下文另外明确指出。
以上对本发明的涉及的术语进行了定义，本领域技术人员还可以结合现有技术对以上术语进行理解，以下基于本发明的内容以及对术语的定义进一步进行描述。
所述“室温”不是特定的温度值，是指10-30℃温度范围。
本发明中术语“约”，当用来指可测量的数值时，例如质量、时间、温度等，意味着可围绕具体数值有一定的浮动的范围，该范围可以为±10％、±5％、±1％、±0.5％、或±0.1％。
本公开的合成工艺可以容许多个官能团，因此可以使用各种被取代的起始物质。这些工艺大体上提供了在整个工艺结束或快结束时所希望的最终化合物，不过在某些情况下可能需要将该化合物进一步转化成其药学上可接受的盐。
本公开的化合物可以使用可商购的起始物质、文献中已知的化合物，或由易于制备的中间物，通过采用标准合成方法和本领域技术人员已知或技术人员根据本文的传授内容显而易见的程序，以多种方式制备。用于制备有机分子的标准合成方法和程序以及官能团转化和操作可以从相关科学文献或从本领域的标准教科书获得。尽管不局限于任一或若干来源，但以引用的方式并入本文中的经典教科书，如Smith,M.B.,March,J.,March’Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,第5版,John。
在本文所描述的反应方案中，可以制造出多种立体异构体。当未指示特定立体异构体时，这应理解为意思指可以由该反应制造的所有可能的立体异构体。本领域普通技术人员应认识到，所述反应可以被优化以优先得到一种异构体，或可以设计出新的方案以制造单一异构体。如果制造出混合物，则可以使用如制备型薄层色谱法、制备型HPLC、制备型手性HPLC或制备型SFC等技术分离异构体。
实施例1化合物T14的合成
向化合物6-溴己酸(4.4864g)、2-己基-1-癸醇(5.0754g)与DCM(50mL)的混合物中依次加入DCC(5.1434g)、DMAP(2.5291g)，室温搅拌18小时，滤饼用DCM(20mL)洗一遍，滤液旋蒸。残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)分离提纯，得到化合物T14。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.97(d,J＝5.8Hz,2H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H),2.32(t,J＝7.4Hz,2H),1.88(dt,J＝14.3,6.9Hz,2H),1.66(dt,J＝15.3,7.4Hz,3H),1.54–1.44(m,2H),1.33–1.21(m,24H),0.88(t,J＝6.7Hz,6H).
实施例2化合物T15的合成
向9-十七醇(5.0075g)与7-溴庚酸(4.4718g)、DCM(50mL)的混合物中加入DCC(6.8020g)与DMAP(2.3812g)，在室温搅拌24h。将反应体系过滤后旋蒸去除溶剂，残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)分离提纯，得到化合物T15。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.96(d,J＝5.8Hz,2H),3.39(t,J＝6.8Hz,2H),2.30(t,J＝7.5Hz,2H),1.85(p,J＝6.9Hz,2H),1.69–1.58(m,3H),1.52–1.41(m,2H),1.39–1.19(m,28H),0.87(t,J＝6.6Hz,6H).
实施例3化合物T16的合成
向化合物7-溴庚酸(10.01g)与2-己基-1-癸醇(11.36g)、DMAP(6.65g)、DCM(250mL)的混合物中加入DCC(15.68g)，室温搅拌16小时。将反应体系用DCM(200mL)稀释，减压过滤后旋蒸。残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)分离提纯，得到化合物T16。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.97(d,J＝5.8Hz,2H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H),2.31(t,J＝7.4Hz,2H),1.86(dt,J＝14.4,6.9Hz,2H),1.68–1.59(m,3H),1.51–1.42(m,2H),1.40–1.33(m,2H),1.27(d,J＝3.7Hz,24H),0.88(t,J＝6.8Hz,6H).
实施例4化合物T23的合成
向2-己基癸酸(15.38g)的DCM(150mL)溶液中依次加入DCC(14.51g)，DMAP(7.80g)与6-溴己醇(9.72g)，在室温搅拌24h。向反应体系中加入石油醚(150mL)，振荡后过滤，滤液浓缩后残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)分离提纯，得到化合物T23。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.07(t,J＝6.6Hz,2H),3.41(t,J＝6.8Hz,2H),2.31(tt,J＝9.0,5.3Hz,1H),1.93–1.81(m,2H),1.65(dt,J＝14.0,6.7Hz,2H),1.52–1.36(m,6H),1.36–1.20(m,20H),0.88(t,J＝6.8Hz,8H).
实施例5化合物T31的合成
向8-溴辛酸(3.1429g)的DCM(50mL)溶液中依次加入DCC(3.1352g)，DMAP(2.0727g)与4-正癸醇(2.0050g)，在室温搅拌16h。向反应体系中加入石油醚(50mL)，振荡后过滤，滤液浓缩后残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯＝50:1)分离提纯，得到化合物T31。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.89(ddd,J＝12.5,7.0,5.5Hz,1H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H),2.28(t,J＝7.4Hz,2H),1.85(p,J＝7.0Hz,2H),1.70–1.57(m,2H),1.48(ddddd,J＝18.4,15.2,9.5,6.6,3.3Hz,5H),1.38–1.19(m,15H),0.89(dt,J＝9.9,7.2Hz,6H).
实施例6化合物T32的合成
向化合物6-溴己酸(10.30g)与十一醇(8.91g)，DCM(200mL)的混合物中加入DCC(12.76g)与DMAP(6.62g)，室温搅拌17小时。将反应体系用DCM稀释，抽滤后旋蒸。残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)分离提纯，得到化合物T32。
实施例7化合物T33的合成
向化合物8-溴辛酸(10.07g)与9-十七醇(11.60g)，DCM(200mL)的混合物中加入DCC(11.19g)与DMAP(5.76g)，室温搅拌17小时。将反应体系用DCM稀释，抽滤后旋蒸。残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)分离提纯，得到化合物T33。
实施例8化合物H12TF的合成
向L-半胱氨酸(10.10g)与DMF(120mL)的混合物中加入三苯基氯甲烷(24.77g)，65℃搅拌16.0h。反应体系冷却到室温，加入10％的醋酸钠溶液(300mL),析出白色固体，过滤，并用H2O(800mL)与丙酮(500mL)分别洗涤。过滤，旋蒸，得到化合物H12TF-1。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.38–7.15(m,15H),2.93(dd,1H),2.57(dd,J＝12.5,4.4Hz,1H),2.41(dd,J＝12.5,9.1Hz,1H).
实施例9化合物H24T23的合成
步骤1：化合物H24T23-1的合成
向化合物T23(1.0018g)与EtOH(10mL)的混合物中加入N-乙基乙醇胺(2.1366g)，升温至70℃搅拌18小时。将反应体系用乙酸乙酯和水萃取，抽滤后旋蒸。得到化合物H24T33-1。
MS m/z(APCI):[M+H]:428.68
步骤2：化合物H24T23-2的合成
向化合物H24T23-1(0.9739g)，NEt3(0.4721g)，DMAP(0.0302g)与DCM(10mL)的混合物中加入TsCl(0.6589g)，室温搅拌18小时。将反应体系旋蒸。残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，得到化合物H24T23-2。
步骤3：化合物H24T23的合成
向化合物H24T23-2(0.5183g)与加入到MeCN(10mL)的混合物中加入4-氨基-1-丁醇(1.1748g)，在70℃搅拌过夜18h。将反应体系用乙酸乙酯和水萃取，抽滤后旋蒸。得到化合物H24T23。
MS m/z(APCI):[M+H]:499.69
实施例10化合物H24T33的合成
步骤1：化合物H24T33-1的合成
向化合物T33(2.02g)与MeCN(30mL)的混合物中加入N-乙基乙醇胺(3.88g)，升温至75℃搅拌16小时。将反应体系用乙酸乙酯和水萃取，抽滤后旋蒸。得到化合物H24T33-1。
MS m/z(APCI):[M+H]:470.71
步骤2：化合物H24T33-2的合成
向化合物H24T33-1(2.0443g)，NEt3(0.8849g)，DMAP(0.0544g)与DCM(30mL)的混合物中加入TsCl(1.9529g)，室温搅拌16小时。将反应体系旋蒸。残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)分离提纯，得到化合物H24T33-2。
步骤3：化合物H24T33的合成
向化合物H24T33-2(0.6127g)与MeCN(5mL)的混合物中加入4-氨基-1-丁醇(0.8883g)，升温至75℃搅拌16小时。将反应体系用乙酸乙酯和水萃取，抽滤后旋蒸。得到化合物H24T33。
MS m/z(APCI):[M+H]:541.72
实施例11化合物H25T14的合成
步骤1：化合物H25T14-1的合成
向化合物T14(5.02g)与MeCN(80mL)的混合物中加入2-(异丙基氨)乙醇(6.18g)，升温至70℃搅拌18小时。将反应体系用乙酸乙酯和水萃取，抽滤后旋蒸。得到化合物H25T14-1。
步骤2：化合物H25T14-2的合成
向化合物H25T14-1(5.1920g)，NEt3(2.4095g)，DMAP(0.1540g)与DCM(100mL)的混合物中加入TsCl(3.4010g)，室温搅拌15小时。将反应体系旋蒸。残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)分离提纯，得到化合物H25T14-2。
步骤3：化合物H25T14的合成
向化合物H25T14-2(1.8056g)与MeCN(35mL)的混合物中加入乙醇胺(1.8655g)，升温至70℃搅拌15小时。将反应体系用乙酸乙酯和水萃取，抽滤后旋蒸。得到化合物H25T14。
MS m/z(APCI):[M+H]:485.81
实施例12化合物H25T23的合成
步骤1：化合物H25T23-1的合成
向化合物T23(2.05g)与MeCN(30mL)的混合物中加入2-(异丙基氨)乙醇(2.48g)，升温至70℃搅拌18小时。将反应体系用乙酸乙酯和水萃取，抽滤后旋蒸。得到化合物H25T23-1。
步骤2：化合物H25T23-2的合成
向化合物H25T23-1(2.0519g)，NEt3(0.9558g)，DMAP(0.0741g)与DCM(100mL)的混合物中加入TsCl(1.3668g)，室温搅拌15小时。将反应体系旋蒸。残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)分离提纯，得到化合物H25T23-2。
步骤3：化合物H25T23的合成
向化合物H25T23-2(0.9654g)与MeCN(20mL)的混合物中加入乙醇胺(0.9421g)，升温至70℃搅拌15小时。将反应体系用乙酸乙酯和水萃取，抽滤后旋蒸。得到化合物H25T23。
MS m/z(APCI):[M+H]:485.94
实施例13化合物H25T33的合成
步骤1：化合物H25T33-1的合成
向化合物T33(1.0184g)与EtOH(10mL)的混合物中加入2-(异丙基氨)乙醇(2.2226g)，升温至70℃搅拌18小时。将反应体系用乙酸乙酯和水萃取，干燥，抽滤后旋蒸，得到化合物H25T33-1。
MS m/z(APCI):[M+H]:484.76
步骤2：化合物H25T33-2的合成
向化合物H25T33-1(1.0008g)，NEt3(0.4219g)，DMAP(0.0260g)与DCM(20mL)的混合物中加入TsCl(0.5978g)，室温搅拌18小时。将反应体系旋蒸，残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM)分离提纯，得到化合物H25T33-2。
步骤3：化合物H25T33的合成
向化合物H25T33-2(0.2096g)与EtOH(10mL)的混合物中加入乙醇胺(0.3046g)，升温至70℃搅拌18小时。将反应体系用乙酸乙酯和水萃取，干燥，抽滤后旋蒸，得到化合物H25T33。
MS m/z(APCI):[M+H]:527.73
实施例14化合物HL-01的合成
步骤1：化合物HL-01-1的合成
向化合物H12TF(4.98g)与油醇(1.58g)、DCM(100mL)的混合物中加入DCC(1.44g)与DMAP(0.72g)，室温搅拌20小时。将反应体系用DCM稀释，抽滤后旋蒸。残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)分离提纯，得到化合物HL-01-1。
MS m/z(APCI):[M+Na]:858.52
步骤2：化合物HL-01-2的合成
向化合物HL-01-1(0.4998g)与DCM(10mL)的混合物中加入TFA(3.32mL)与TIPS(0.36mL)，0℃搅拌2小时。将反应体系旋蒸。残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)分离提纯，得到化合物HL-01-2。
MS m/z(APCI):[M+H]:594.71
步骤3：化合物HL-01的合成
向化合物HL-01-2(0.3054g)与DMF(4mL)的混合物中加入哌啶(0.8mL)，室温搅拌2小时。将反应体系用乙酸乙酯稀释，用水萃取。残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，得到化合物HL-01。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45–5.30(m,2H),4.13(t,J＝6.8Hz,2H),3.79(dd,J＝7.7,4.6Hz,1H),3.14(dd,J＝13.6,4.5Hz,1H),2.91(dd,J＝13.6,7.7Hz,1H),1.98(dq,J＝18.9,6.3Hz,4H),1.69-1.62(m,9H),1.36–1.26(m,18H),0.88(t,J＝6.7Hz,3H).
实施例15化合物HL-02的合成
步骤1：化合物HL-02-1的合成
向化合物Boc-L-天冬氨酸-4-苄酯(5.01g)与油醇(4.18g)、DCM(200mL)的混合物中加入DCC(3.96g)与DMAP(1.91g)，室温搅拌16小时。将反应体系用DCM稀释，抽滤后旋蒸。残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)分离提纯，得到化合物HL-02-1。
步骤2：化合物HL-02-2的合成
向化合物HL-02-1(8.64g)与DCM(100mL)的混合物中加入TFA(20mL)，室温搅拌1小时。将反应体系用DCM稀释，用饱和碳酸氢钠溶液调节pH至7.0，萃取。残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，得到化合物HL-02-2。
MS m/z(APCI):[M+H]:474.61
步骤3：化合物HL-02-3的合成
向化合物HL-02-2(0.6791g)，1-金刚烷乙酸(0.4426g)与DMF(30mL)的混合物中加入HATU(0.6866g)，DIEA(0.2359g)室温搅拌16小时。将反应体系用乙酸乙酯稀释，用水萃取。残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)分离提纯，得到化合物HL-02-3。
MS m/z(APCI):[M+H]:650.66
步骤4：化合物HL-02的合成
向化合物HL-02-3(0.9961g)与MeOH(30mL)的混合物中加入Pd/C，H2环境下室温搅拌17小时。将反应体系用DCM稀释，抽滤经旋蒸，得到化合物HL-02。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.44(d,J＝8.0Hz,1H),4.86(dt,J＝8.4,4.4Hz,1H),4.15(td,J＝6.8,2.3Hz,2H),1.99-1.97(m,8H),1.70-1.63(m,14H),1.25(s,29H),0.88(t,J＝6.8Hz,3H).
MS m/z(APCI):[M+H]:562.52
实施例16化合物HL-03的合成
步骤1：化合物HL-03-1的合成
向化合物Boc-L-谷氨酸-5-叔丁酯(3.0128g)、DCC(2.0373g)与DMAP(0.9935g)、DCM(50mL)的混合物中加入油醇(2.2503g)，室温搅拌反应18h。过滤，滤饼用DCM(20mL)洗涤，将滤液旋蒸，残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，得到化合物HL-03-1。
MS m/z(APCI):[M-100-55]:398.62
步骤2：化合物HL-03的合成
冰水浴下向化合物HL-03-1(1.02g)与DCM(10mL)的混合物中加入HCl/1,4-dioxane(9mL)，室温搅拌反应22h。冰水浴下缓慢滴加三乙胺调节pH＝7，浓缩，加入5mL甲醇溶清，逐滴加入到50mL去离子水中，搅拌，有固体析出，过滤，取滤饼，干燥，制备液相制备，得到化合物HL-03。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.46–5.28(m,2H),4.29(s,2H),4.15(q,J＝6.6Hz,2H),3.86(s,1H),2.50(s,2H),2.01(q,J＝6.6Hz,4H),1.64(t,J＝7.0Hz,2H),1.30(m,24H),1.02–0.78(m,3H).
MS m/z(APCI):[M+1]:398.66
实施例17化合物HL-04的合成
步骤1：化合物HL-04-1的合成
向化合物芴甲氧羰基-L-谷氨酸-5-叔丁酯(5.01g)、HATU(6.10g)与DIEA(2.05g)、DMF(50mL)的混合物中加入三环[3,3,1,13,7]癸烷-1-胺(1.64g)，室温搅拌反应18h。加入乙酸乙酯(100mL)，水(100mL)，萃取，水相再用乙酸乙酯(50mL)萃取一次，合并有机相，依次用水和饱和食盐水各洗一遍(50mL),干燥，将滤液旋蒸，残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)分离提纯，得到化合物HL-04-1。
MS m/z(APCI):[M-100-55]:559.62
步骤2：化合物HL-04-2的合成
向化合物HL-04-1(5.6362g)与DMF(10mL)的混合物中加入哌啶(2mL)，室温搅拌反应18h。加入乙酸乙酯(100mL)，水(100mL)，萃取，有机相依次用水和饱和食盐水各洗一遍(50mL),干燥，将滤液旋蒸，残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，得到化合物HL-04-2。
MS m/z(APCI):[M+1]:337.43
步骤3：化合物HL-04-3的合成
向化合物亚油酸(0.5726g)、DCC(0.3978)与DMAP(0.1887g)、DCM(20mL)的混合物中加入HL-04-2(0.5076)，室温搅拌反应18h。过滤，滤饼用DCM(20mL)洗涤，将滤液旋蒸，残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)分离提纯，得到化合物HL-04-3。
MS m/z(APCI):[M+1]:599.75
步骤4：化合物HL-04的合成
向化合物HL-04-3(0.7241g)与DCM(10mL)的混合物中加入HCl/1.4-dioxane(8.5mL)，室温搅拌反应22h。旋蒸，残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，制备液相制备，得到化合物HL-04。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.77–6.48(m,2H),5.44–5.18(m,4H),4.58(q,J＝7.8Hz,1H),2.77(t,J＝6.5Hz,2H),2.53–2.31(m,2H),2.22(t,J＝7.6Hz,2H),2.12–1.96(m,14H),1.90(dd,J＝13.4,7.4Hz,2H),1.73–1.54(m,8H),1.35–1.22(m,13H),0.89(t,J＝6.7Hz,3H).
MS m/z(APCI):[M+1]:543.68
实施例18化合物HL-05的合成
步骤1：化合物HL-05-1的合成
向化合物亚油酸(1.1056g)、HATU(1.899g)与DIEA(1.3301g)、DMF(20mL)的混合物中加入L-谷氨酸二叔丁酯盐酸盐(1.0125g)，室温搅拌反应18h。加入乙酸乙酯(100mL)，水(100mL)，萃取，水相再用乙酸乙酯(50mL)萃取一次，合并有机相，依次用水和饱和食盐水各洗一遍(50mL),干燥，将滤液旋蒸，残留物经硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)分离提纯，得到化合物HL-05-1。
MS m/z(APCI):[M+1]:522.63
步骤2：化合物HL-05的合成
向化合物HL-05-1(0.9987g)与DCM(20mL)的混合物中加入HCl/1.4-dioxane(9.5mL)，室温搅拌反应24h。旋蒸，残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，得到化合物HL-05。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.59(d,J＝7.3Hz,1H),5.56–5.09(m,4H),3.73(q,J＝7.0Hz,1H),2.76(t,J＝6.5Hz,2H),2.49(s,2H),2.25(t,J＝7.8Hz,2H),2.04(q,J＝7.0Hz,4H),1.62(t,J＝7.4Hz,2H),1.42–1.17(m,16H),0.88(t,J＝6.7Hz,3H).
MS m/z(APCI):[M+1]:410.57
实施例19化合物1的合成
向化合物H24T23(0.4359g)与T23(0.5407g)、MeCN(10mL)的混合物中加入K2CO3(0.2436g)，升温至70℃搅拌反应18h。过滤，滤饼用DCM洗涤，将滤液旋蒸，残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，得到化合物1。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.05(td,J＝6.7,2.4Hz,4H),3.56(t,J＝4.3Hz,2H),2.55(d,J＝15.0Hz,6H),2.44(ddd,J＝9.7,7.6,5.3Hz,6H),2.29(td,J＝8.9,4.5Hz,2H),1.75–1.55(m,12H),1.52–1.34(m,12H),1.25(m,44H),1.02(t,J＝7.1Hz,3H),0.87(t,J＝6.7Hz,12H).
MS m/z(APCI):[M+H]:838.17
实施例20化合物2的合成
向化合物H25T33(0.2560g)与T32(0.2053g)、MeCN(10mL)的混合物中加入K2CO3(0.1413g)，升温至75℃搅拌反应18h。过滤，滤饼用DCM(20mL)洗涤，将滤液旋蒸，残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，得到化合物2。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.86(p,J＝6.3Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.55(t,J＝5.0Hz,2H),3.05(m,1H),2.60(q,J＝5.9,5.5Hz,4H),2.51(t,J＝7.5Hz,6H),2.28(dt,J＝9.8,7.5Hz,4H),1.61(p,J＝7.7,7.0Hz,5H),1.49(dd,J＝10.0,4.4Hz,8H),1.35–1.19(m,50H),1.03(d,J＝6.5Hz,6H),0.87(td,J＝6.9,1.6Hz,9H).
MS m/z(APCI):[M+H]:796.21
实施例21化合物3的合成
向化合物H25T23(0.1001g)与T23(0.1358g)、MeCN(10mL)的混合物中加入K2CO3(0.0616g)，升温至70℃搅拌反应18h。过滤，滤饼用DCM(20mL)洗涤，将滤液旋蒸，残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，得到化合物3。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.05(td,J＝6.6,1.3Hz,4H),3.60(d,J＝5.1Hz,2H),2.65(t,J＝5.0Hz,4H),2.54(t,J＝7.6Hz,4H),2.39–2.25(m,3H),1.69–1.53(m,10H),1.48–1.39(m,7H),1.25(d,J＝4.3Hz,50H),1.11(s,6H),0.87(t,J＝6.7Hz,12H).
MS m/z(APCI):[M+H]:824.12
实施例22化合物4的合成
向化合物H25T23(0.2061g)与T15(0.2618g)、MeCN(5mL)的混合物中加入K2CO3(0.1207g)，在75℃搅拌16小时。将反应体系用DCM稀释，抽滤后旋蒸。残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，得到化合物4。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.85(p,J＝6.3Hz,1H),4.05(t,J＝6.7Hz,2H),3.64(t,J＝4.9Hz,2H),2.91–2.46(m,14H),2.31–2.23(m,3H),1.61(td,J＝12.5,10.7,6.3Hz,7H),1.54–1.40(m,8H),1.33–1.14(m,56H),0.87(t,J＝6.7Hz,12H).
MS m/z(APCI):[M+H]:852.22
实施例23化合物5的合成
向化合物H25T23(0.2013g)与T16(0.2510g)、MeCN(5mL)的混合物中加入K2CO3(0.1302g)，在75℃搅拌16小时。将反应体系用DCM稀释，抽滤后旋蒸。残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，得到化合物5。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.05(t,J＝6.7Hz,2H),3.96(d,J＝5.8Hz,2H),3.54(t,J＝5.0Hz,2H),2.68–2.37(m,11H),2.29(dd,J＝8.9,5.9Hz,4H),1.60(tt,J＝13.8,7.6Hz,7H),1.50–1.40(m,5H),1.37–1.23(m,52H),1.01(d,J＝6.6Hz,6H),0.87(dt,J＝7.0,3.3Hz,12H).
MS m/z(APCI):[M+H]:838.29
实施例24化合物6的合成
向化合物H25T14(0.2044g)与T31(0.2214g)、乙腈(15mL)的混合物中加入K2CO3(0.1195g)，升温至75℃搅拌反应22h。过滤，将滤液旋蒸，残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，得到化合物6。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.88(ddd,J＝12.6,7.0,5.4Hz,1H),3.96(d,J＝5.7Hz,2H),3.54(t,J＝5.1Hz,2H),3.18–2.93(m,1H),2.64–2.55(m,4H),2.53–2.41(m,6H),2.28(dt,J＝12.4,7.5Hz,4H),1.70–1.57(m,5H),1.55–1.41(m,8H),1.36–1.20(m,42H),1.02(d,J＝6.6Hz,6H),0.94–0.83(m,12H).
MS m/z(APCI):[M+H]:768.17
实施例25化合物7的合成
向化合物H25T14(0.2076g)与T33(0.2244g)、乙腈(15mL)的混合物中加入K2CO3(0.1154g)，升温至75℃搅拌反应16h。过滤，将滤液旋蒸，残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，得到化合物7。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.01–4.70(m,1H),3.95(d,J＝5.7Hz,2H),3.56(t,J＝5.0Hz,2H),3.11(m,1H),2.62(t,J＝5.1Hz,4H),2.52(dt,J＝15.2,6.6Hz,6H),2.28(dt,J＝14.4,7.5Hz,4H),1.70–1.57(m,5H),1.57–1.41(m,8H),1.26(dd,J＝7.6,4.3Hz,56H),1.05(d,J＝6.5Hz,6H),0.87(td,J＝6.9,2.1Hz,12H).
MS m/z(APCI):[M+H]:866.27
实施例26化合物8的合成
向化合物H25T14(0.2021g)与T14(0.2091g)、MeCN(6mL)的混合物中加入K2CO3(0.1152g)，升温至70℃搅拌反应16h。过滤，滤饼用DCM(20mL)洗涤，将滤液旋蒸，残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，得到化合物8。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.96(d,J＝5.7Hz,4H),3.56(t,J＝5.0Hz,2H),3.11(m,1H),2.62(t,J＝5.0Hz,4H),2.56–2.48(m,6H),2.30(td,J＝7.5,1.9Hz,4H),1.62(dp,J＝11.3,3.7Hz,7H),1.46(td,J＝14.7,14.0,6.8Hz,3H),1.36–1.21(m,52H),1.05(d,J＝6.5Hz,6H),0.87(t,J＝6.6Hz,12H).
MS m/z(APCI):[M+H]:824.24
实施例27化合物9的合成
向化合物H25T14(0.2029g)与T15(0.2323g)、MeCN(10mL)的混合物中加入K2CO3(0.1157g)，升温至75℃搅拌反应19h。反应溶液经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，得到化合物9。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.85(q,J＝6.3Hz,1H),3.96(d,J＝5.8Hz,2H),3.54(q,J＝6.2,5.6Hz,2H),3.06(m,1H),2.60(dt,J＝10.5,5.1Hz,4H),2.49(dd,J＝16.2,8.4Hz,6H),2.29(dt,J＝11.7,7.5Hz,4H),1.70–1.57(m,5H),1.49(p,J＝8.7,7.2Hz,8H),1.26(dd,J＝7.6,4.1Hz,54H),1.03(d,J＝6.5Hz,6H),0.87(td,J＝6.8,2.1Hz,12H).
MS m/z(APCI):[M+H]:852.34
实施例28化合物10的合成
向化合物H25T14(218.1mg)与T16(228.5mg)、MeCN(10mL)的混合物中加入K2CO3(128.4mg)，升温至70℃搅拌反应18h。过滤，滤饼用DCM(20mL)洗涤，将滤液旋蒸，残留物经硅胶柱(洗脱剂为DCM/MeOH)分离提纯，得到化合物10。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.96(d,J＝5.8Hz,4H),3.55(t,J＝5.0Hz,2H),3.04(m,1H),2.66–2.56(m,4H),2.54–2.42(m,6H),2.30(td,J＝7.5,3.2Hz,4H),1.62(p,J＝7.5Hz,6H),1.54–1.41(m,4H),1.35–1.20(m,54H),1.02(d,J＝6.6Hz,6H),0.94–0.82(m,12H).
MS m/z(APCI):[M+H]:838.23
实施例29纳米脂质颗粒(LNP)的制备
将本发明中所述的阳离子脂质化合物与二硬酯酰磷脂酰胆碱、胆固醇和2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺按照50:10:38.5:1.5的摩尔比溶于乙醇，制备混合脂质乙醇溶液。将Fluc-mRNA溶解在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH＝4.4)中。
使用两个微量注射泵，将混合脂质乙醇溶液与mRNA柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH＝4.4)溶液按1:3的体积比(阳离子脂质与mRNA的质量比为15:1)制备纳米脂质颗粒组合物的混合溶液。用PBS缓冲液稀释混合溶液至原体积的30倍后，使用100KDa超滤管超滤浓缩，再使用PBS缓冲液定容至一定体积，得到纳米脂质颗粒组合物溶液。
实施例30纳米脂质颗粒包封率、粒径及多分散系数(PDI)的测定
使用Quant-iT Ribogreen RNA定量测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific,UK)，根据试剂盒的说明，确定脂质纳米颗粒组合物(根据实施例37制备)的包封率。
取60μL纳米脂质颗粒组合物溶液，加入微量样品池，使用马尔文公司的Zetasizernano仪器(90°散射角，25℃)测定粒径及多分散系数(PDI)，每个样品重复测定2次，结果取两次的平均值。结果如表1所示。
表1
从表1中可以看出，采用本发明所述阳离子脂质制备的纳米脂质颗粒的多分散系数为0.05～0.2，表明纳米脂质颗粒尺寸均一，分散性良好，均可用于递送mRNA；进一步，采用本发明所述阳离子脂质制备的纳米脂质颗粒的包封率高。包封率是脂质体的关键质量属性，能够反映出脂质体中药物包封程度的高低。本发明所述的纳米脂质颗粒包封率高，有助于高效包载活性物质(如siRNA、mRNA)，提高载药量。
实施例31体内验证脂质纳米颗粒组合物递送mRNA性能
每组随机选取3只6～8周龄，重量20～25g的雌性ICR小鼠，按100μg/kg体重的用量，尾静脉注射脂质纳米颗粒组合物溶液。6小时后，分别向每只小鼠体内通过腹腔注射200μL 15mg/mL的D-荧光素钾盐。10分钟后，将小鼠放置于IVIS Lumina XRMS series III活体成像系统下，观察每只小鼠总的荧光强度并拍照记录。结果如表2所示。
表2
阳离子脂质 尾静脉注射转染强度(p/s) 优于MC3表达
化合物1 7.7E+10 4.1
化合物2 2.3E+10 1.2
化合物3 1.3E+11 6.8
化合物4 1.3E+11 6.8
化合物5 9.5E+10 5.0
化合物6 6.9E+10 3.6
化合物7 6.6E+10 3.5
化合物8 9.8E+10 5.2
化合物9 9.1E+10 4.8
化合物10 5.8E+10 3.1
MC3 1.9E+10 1.0
对比化合物1 1.0E+10 0.5
对比化合物2 2.8E+10 1.5
对比化合物3 2.8E+10 1.5
从表2可以看出，由本发明所述的阳离子脂质制备的脂质纳米颗粒组合物，其递送mRNA的性能好，可使得mRNA在小鼠体内进行高效表达。与本领域已知的标准阳离子脂质化合物MC3相比，优于MC3表达高达约7倍。与对比化合物相比，本发明由本发明所述的阳离子脂质制备的脂质纳米颗粒组合物，其递送mRNA的性能也更好。
实施例32体内验证脂质纳米颗粒组合物递送hEPO性能
通过尾静脉注射将0.5mg/kg剂量的包封人促红细胞生成素(hEPO)mRNA的包含下表中的化合物的脂质纳米颗粒经全身施用于6-8周龄的雌性ICR小鼠，并在施用后的特定时间点(例如6小时)时收集小鼠血液样品。除前述测试组外，还将相同剂量的包封hEPO mRNA的包含MC3的脂质纳米颗粒以类似方式施用于年龄和性别相当组的小鼠作为阳性对照。
在最后一个取样时间点后，通过超剂量CO2对小鼠实施安乐死。通过在4℃下以1000g离心10分钟，自全血分离出血清，急速冷冻并在-80℃下储存以进行分析。使用可商购试剂盒(ab274397,Abcam)，根据制造商的说明书，进行ELISA分析。自测试组测量的测试脂质纳米颗粒的特征，包括优于MC3的表达水平列于下表3中。
表3
阳离子脂质 优于MC3表达
化合物1 3.6
化合物3 3.2
MC3 1
结果表明，由本发明所述的阳离子脂质制备的脂质纳米颗粒组合物，其递送hEPOmRNA的性能好，可使得mRNA在小鼠体内进行高效表达。与本领域已知的标准阳离子脂质化合物MC3相比，优于MC3表达高达约4倍。
应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。

Claims (10)

1.一种式(I)所示的阳离子脂质化合物或其药学上可接受的盐，
其中，
L1和L2各自独立地选自-C(＝O)O-和-OC(＝O)-；
X1和X2各自独立地选自
G1和G2各自独立地选自C5-7的烷基；
R1和R2各自独立地选自C10-17烷基。
2.根据权利要求1所述的式(I)所示的阳离子脂质化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述G1选自未取代的C5烷基、C6烷基和C7烷基。
3.根据权利要求1所述的式(I)所示的阳离子脂质化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述G2选自未取代的C5烷基、C6烷基和C7烷基。
4.根据权利要求1所述的式(I)所示的阳离子脂质化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述R1选自未取代的C10烷基、C11烷基、C15烷基、C16烷基和C17烷基。
5.根据权利要求1所述的式(I)所示的阳离子脂质化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述R2选自未取代的C10烷基、C11烷基、C15烷基、C16烷基和C17烷基。
6.根据权利要求2所述的式(I)所示的阳离子脂质化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述G1选自
7.根据权利要求3所述的式(I)所示的阳离子脂质化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述G2选自
8.根据权利要求4所述的式(I)所示的阳离子脂质化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述R1选自
9.根据权利要求5所述的式(I)所示的阳离子脂质化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述R2选自
10.一种阳离子脂质化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述阳离子脂质化合物具有以下所示的结构之一：
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