ES2926075T3 - Lípido catiónico - Google Patents

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Yuta Suzuki
Yoshinori Takahashi
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Eisai R&D Management Co Ltd
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Abstract

La presente invención proporciona un lípido catiónico que se puede utilizar para el suministro de ácidos nucleicos al citoplasma. Un lípido catiónico según la presente invención es, por ejemplo, un compuesto representado por la fórmula (1) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en la que L1 y L2 representan independientemente un grupo alquileno que tiene de 3 a 10 átomos de carbono; R1 y R2 representan independientemente un grupo alquilo de 4 a 24 átomos de carbono o un grupo alquenilo de 4 a 24 átomos de carbono; R3 representa un grupo alquilo que tiene de 1 a 3 átomos de carbono; y X1 representa un enlace simple o CO-O-. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

d e s c r ip c ió n
Lípido catiónico
Campo técnico
La presente invención se refiere a un novedoso lípido catiónico.
Antecedentes de la técnica
Los ácidos nucleicos, tales como los vectores de expresión de ARNip (ARN interferente pequeño), miARN (microARN) y ARNhp (ARN de horquilla corta o ARN de horquilla pequeña), y los oligonucleótidos antisentido inducen el silenciamiento génico específico de secuencia in vivo y son conocidos como terapéuticos de oligonucleótido.
Entre los terapéuticos de oligonucleótido, los ARNip han atraído una atención particular. Los ARNip son ARN bicatenarios que consisten en 19 a 23 pares de bases e inducen el silenciamiento génico específico de secuencia denominado interferencia por ARN (iARN).
Los ARNip son químicamente estables; sin embargo, los ARNip plantean problemas en aplicaciones terapéuticas, tales como ser susceptibles a ser descompuestos por RNasa (ribonucleasa) en plasma y ser poco probables de atravesar la membrana celular sola (por ejemplo, véase la Literatura de patentes 1).
Para tratar los problemas anteriores, se sabe que mediante la encapsulación de ARNip en una partícula fina que contiene un lípido catiónico, el ARNip encapsulado se protege de la descomposición en el plasma sanguíneo y puede penetrar en la membrana celular lipófila (por ejemplo, véase la Literatura de patentes 1).
La Literatura de patentes 2 a 6 desvela lípidos catiónicos donde se usan para la administración de terapéuticos de oligonucleótido, tales como ARNip y que tienen biodegradabilidad mejorada.
Las partículas finas que contienen lípidos catiónicos tienen un problema de estabilidad tal que es probable que las partículas se agreguen durante el almacenamiento, y se conoce un método de prevención de la agregación añadiendo lípidos modificados con polietilenglicol (PEG-lípidos) a las partículas finas. Además, la Literatura de patentes 7 desvela un método de prevención de la agregación y mejora de la eficiencia de administración de ácidos nucleicos por configuración de las partículas finas que comprenden un PEG-lípido específico, que es PEG-DPG, y una preparación que comprende las partículas finas y un disolvente desionizado. La Literatura de patentes 8 desvela ácidos pirrolidin-3-carboxílicos esterificados por grupos de lípido que forman complejos con ácidos nucleicos.
Lista de citas
Literatura de patentes
Literatura de patentes 1: WO 2010/144740
Literatura de patentes 2: WO 2011/153493
Literatura de patentes 3: WO 2013/086354
Literatura de patentes 4: WO 2013/158579
Literatura de patentes 5: WO 2015/095346
Literatura de patentes 6: WO 2016/104580
Literatura de patentes 7: WO2014/08939
Literatura de patentes 8: WO 2015/095351
Sumario de la invención
Sin embargo, a pesar de los recientes desarrollos, todavía existe la necesidad de un lípido catiónico que se pueda usar para la administración de ácido nucleico al citoplasma.
La presente invención se refiere a [1] a [14] indicados a continuación.
1. [1] Un compuesto representado por la fórmula (1) que sigue o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000003_0001
en donde Li y L2 representan independientemente un grupo alquileno que tiene 3 a 10 átomos de carbono; Ri y R2 representan independientemente un grupo alquilo que tiene 4 a 24 átomos de carbono o un grupo alquenilo que tiene 4 a 24 átomos de carbono; R3 representa un grupo alquilo que tiene 1 a 3 átomos de carbono; y X1 representa un enlace sencillo o CO-O-.
2. [2] El compuesto según [1] seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por las fórmulas (A1) a (A9) que siguen, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Figure imgf000003_0002
Figure imgf000004_0001
[2a] El compuesto según [2] seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por las fórmulas (A1), (A2), (A3), (A4), (A5), (A6), (A8) y (A9) anteriores, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
[2b] El compuesto según [2] seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por las fórmulas (A1), (A2), (A3), (A4), (A5), (A6) y (A9) anteriores, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
[2c] El compuesto según [2] seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por las fórmulas (A1), (A2), (A4) y (A6) anteriores, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
[2d] El compuesto según [1] representado por las fórmulas (2) o (3) que siguen, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000004_0002
[2e] El compuesto según [1] o [2d] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R3 es un grupo metilo.
. [3] El compuesto según [1] o [2] representado por la fórmula (A1) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000004_0003
. [4] El compuesto según [1] o [2] representado por la fórmula (A2) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000005_0001
. [5] El compuesto según [1] o [2] representado por la fórmula (A3) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000005_0002
. [6] El compuesto según [1] o [2] representado por la fórmula (A4) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000005_0003
. [7] El compuesto según [1] o [2] representado por la fórmula (A5) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000005_0004
. [8] El compuesto según [1] o [2] representado por la fórmula (A6) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000006_0001
. [9] El compuesto según [1] o [2] representado por la fórmula (A7) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000006_0002
0. [10] El compuesto según [1] o [2] representado por la fórmula (A8) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000006_0003
1. [11] El compuesto según [1] o [2] representado por la fórmula (A9) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000006_0004
12. [12] Un complejo de lípido que contiene: (I) el compuesto según uno cualquiera de [1] a [11] y [2a] a [2e] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol.
13. [13] Una composición que contiene: (I) el compuesto según uno cualquiera de [1] a [11] y [2a] a [2e] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol; y (III) un ácido nucleico.
14. [14] Un método de producción de una composición, incluyendo el método: la etapa de mezclar una disolución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar que contiene (I) el compuesto según una cualquiera de [1] a [11] y [2a] a [2e] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol con una disolución acuosa que contiene (III) un ácido nucleico para obtener una disolución mixta; y la etapa de reducir el porcentaje de contenido del disolvente orgánico polar en la disolución mixta.
Efectos de la invención
El lípido catiónico de la presente invención tiene uno o más efectos indicados a continuación:
(1) El lípido catiónico de la presente invención permite la liberación eficaz de ácidos nucleicos al citoplasma; (2) El lípido catiónico de la presente invención puede prevenir un aumento en el diámetro de partículas del complejo de lípido durante el almacenamiento durante un cierto periodo de tiempo.
Por lo tanto, el lípido catiónico de la presente invención se puede aplicar como un lípido usado para el suministro de un ácido nucleico en el citoplasma.
Breve descripción de los dibujos
[Fig. 1] La Figura 1 es un gráfico que ilustra el resultado del Ejemplo de prueba 1.
[Fig. 2] La Figura 2 es un gráfico que ilustra el resultado del Ejemplo de prueba 2.
Descripción de las realizaciones
La presente invención se describe en lo sucesivo en detalle mediante la presentación de realizaciones y ejemplos. Sin embargo, la presente invención no se limita a las realizaciones y ejemplos descritos que siguen ni a ninguna modificación que se pueda hacer dentro del alcance que no se desvíe del concepto de la presente invención. Todos los documentos y las publicaciones citados en la presente memoria descriptiva se incorporan por completo en el presente documento como referencia independientemente del fin de la misma.
<Lípido catiónico>
En una realización, la presente invención es un compuesto representado por la fórmula (1) que sigue o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y se puede usar como un lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Figure imgf000007_0001
En la fórmula (1), L1 y L2 representan independientemente un grupo alquileno que tiene 3 a 10 átomos de carbono; R1 y R2 representan independientemente un grupo alquilo que tiene 4 a 24 átomos de carbono o un grupo alquenilo que tiene 4 a 24 átomos de carbono; R3 representa un grupo alquilo que tiene 1 a 3 átomos de carbono; y X1 representa un enlace sencillo o CO-O-.
Como se usa en el presente documento, "alquilo" significa un grupo de hidrocarburo alifático saturado lineal, cíclico o ramificado que tiene un número indicado de átomos de carbono.
Como se usa en el presente documento, "alquenilo" significa un grupo de hidrocarburo lineal o ramificado que tiene un número indicado de átomos de carbono y al menos un doble enlace carbono-carbono. Los ejemplos del mismo incluyen monoenos, dienos, trienos y tetraenos; sin embargo, el término no se limita a esto.
Como se usa en el presente documento, "alquileno" significa un grupo de hidrocarburo alifático saturado bivalente lineal, cíclico o ramificado que tiene un número indicado de átomos de carbono.
Como se usa en el presente documento, "halógeno" significa F, Cl, Br o I.
Los átomos asimétricos (tales como carbonos) en el compuesto de la presente invención pueden estar presentes en forma de compuestos racémicos o enantiómeros concentrados, tales como la configuración (R), (S) o (R,S).
Una realización de la presente invención es un compuesto representado por la fórmula (2) o (3) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000008_0001
En la fórmula (2) o (3), L1 y L2 , R1 a R3 y X1 se definen como antes en la fórmula (1). El compuesto según la presente realización se puede usar como un lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Una realización de la presente invención es un compuesto de las fórmulas (1) a (3) anteriores, en donde L1 y L2 representan independientemente un grupo alquileno que tiene 3 a 10 átomos de carbono (por ejemplo, 3 a 8 átomos de carbono); R1 y R2 representan independientemente un grupo alquilo que tiene 4 a 24 átomos de carbono o un grupo alquenilo que tiene 4 a 24 átomos de carbono; R3 representa un grupo alquilo que tiene 1 a 3 átomos de carbono; y X1 representa un enlace sencillo o -CO-O-, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y se puede usar como un lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Una realización de la presente invención es un compuesto de las fórmulas (1) a (3) anteriores, en donde L1 y L2 representan independientemente un grupo alquileno lineal que tiene 3 a 10 átomos de carbono (por ejemplo, 3 a 8 átomos de carbono); R1 y R2 representan independientemente un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene 4 a 24 átomos de carbono o un grupo alquenilo lineal que tiene 4 a 24 átomos de carbono; R3 es un grupo alquilo que tiene 1 a 3 átomos de carbono; y X1 es -CO-O-, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y se puede usar como un lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Una realización específica de la presente invención es un compuesto representado por la fórmula (1a) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000008_0002
En la fórmula (1a), R1 y R2 es independientemente un grupo alquilo que tiene 4 a 24 átomos de carbono o un grupo alquenilo que tiene 4 a 24 átomos de carbono; R3 es un grupo alquilo que tiene 1 a 3 átomos de carbono; y n1 y n2 representan independientemente un número entero de 3 a 10 (por ejemplo, 3 a 8).
En una realización de la presente invención, la presente invención es un compuesto de las fórmulas (1) a (3) anteriores, en donde X1 es -CO-O-; L1 es el mismo que L2 ; y R1 es el mismo que R2 , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y se puede usar como un lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
En una realización de la presente invención, la presente invención es un compuesto de las fórmulas (1) a (3) anteriores, en donde L1 y L2 es independientemente un grupo alquileno lineal que tiene 3 a 10 átomos de carbono (por ejemplo, 3 a 8 átomos de carbono); R1 es un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene 4 a 24 átomos de carbono o un grupo alquenilo lineal que tiene 4 a 24 átomos de carbono; R2 es un grupo alquilo lineal que tiene 4 a 24 átomos de carbono; R3 es un grupo alquilo que tiene 1 a 3 átomos de carbono; y X1 es un enlace sencillo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En la presente realización, el número total de átomos de carbono en L2 y R2 es preferentemente 9 a 12. El compuesto de la presente realización se puede usar como un lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Una realización específica de la presente invención es un compuesto representado por la fórmula (1b) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000009_0001
En la fórmula (1b), R1 es un grupo alquilo que tiene 4 a 24 átomos de carbono o un grupo alquenilo que tiene 4 a 24 átomos de carbono; R3 es un grupo alquilo que tiene 1 a 3 átomos de carbono; n1 representa un número entero de 3 a 10 (por ejemplo, 3 a 8 ); y n2 representa un número entero de 6 a 33, preferentemente 8 a 11.
Los ejemplos de un compuesto según una realización de la presente invención se indican a continuación.
Figure imgf000009_0002
Figure imgf000010_0001
Una realización de la presente invención es un compuesto representado por cualquiera de las fórmulas (A1), (A2), (A3), (A4), (A5), (A6), (A8) y (A9) anteriores, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y se puede usar como un lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Una realización de la presente invención es un compuesto representado por cualquiera de las fórmulas (A1), (A2), (A3), (A4), (A5), (A6) y (A9) anteriores, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y se puede usar como un lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Una realización de la presente invención es un compuesto representado por cualquiera de las fórmulas (A1), (A2), (A4) y (A6) anteriores, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y se puede usar como un lípido catiónico. El lípido catiónico puede ser un hidrato de la sal o un solvato de la sal.
Como se usa en el presente documento, "lípido catiónico" es una molécula anfífila que tiene una región lipófila que contiene uno o más grupos hidrocarburo y una región hidrófila que contiene un grupo polar que es neutro o se somete a protonación a un pH fisiológico. Concretamente, el lípido catiónico de la presente invención se puede protonar para formar un catión. Por ejemplo, el compuesto representado por la fórmula (1) anterior engloba el compuesto (compuesto catiónico) representado por la fórmula (1)' que sigue en la que un ion hidrógeno se coordina con un único par de electrones en el átomo de nitrógeno en el anillo de pirrolidina. El compuesto catiónico puede formar una sal representada por la fórmula (1)' que sigue y un hidrato o solvato de la sal junto con un anión.
Figure imgf000010_0002
En la fórmula (1)', L1 y L2 , R1 a R3 y X1 se definen como antes en la fórmula (1). Z es un anión (contraión). El compuesto de la presente realización se puede usar como un lípido catiónico.
El anión (Z en la fórmula (1)' anterior) que se puede incluir en el lípido catiónico de la presente realización formando un par con el compuesto catiónico no está particularmente limitado en tanto que el anión sea farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos del mismo incluyen iones inorgánicos, tales como un ion cloruro, un ion bromuro, un ion nitrato, un ion sulfato y un ion fosfato; iones ácido orgánico, tales como un ion acetato, un ion oxalato, un ion maleato, un ion fumarato, un ion citrato, un ion benzoato y un ion metanosulfonato o similares.
El lípido catiónico de la presente invención puede tener un estereoisómero, tal como un isómero geométrico y un isómero óptico, o un tautómero. El lípido catiónico de la presente invención engloba todos los posibles isómeros que incluyen los anteriores y las mezclas de los mismos.
<Método de producción del lípido catiónico>
Ahora se describe el método de producción del lípido catiónico de la presente invención. Una realización del esquema de síntesis del lípido catiónico se indica a continuación. Todos los compuestos descritos en el presente documento están englobados por la presente invención como los compuestos. El compuesto de la presente invención se puede sintetizar según al menos un método ilustrado en los esquemas indicados a continuación. El lípido catiónico de la presente invención puede tener uno o más centros asimétricos, y así el compuesto sintetizado se puede producir como un estereoisómero (R) o (S) o una mezcla de los mismos (R,S). A menos que se indique específicamente, se pretende que las citas de compuestos específicos en el presente documento engloben tanto los enantiómeros individuales como las mezclas racémicas de los mismos. Los métodos de determinación de la estereoquímica y la separación de estereoisómeros se conocen bien por un experto en la técnica.
Figure imgf000011_0001
En las fórmulas, L1 y R1 se definen respectivamente como antes en la fórmula (1); X e Y son respectivamente un átomo de halógeno; y R es -L2-X1-R2--(L2 , X1 y R2 se definen respectivamente como antes en la fórmula (1)) en la fórmula (1).
El lípido catiónico de la fórmula (1) (compuesto en donde X1 es un enlace sencillo) se puede sintetizar, por ejemplo, según el Esquema 1 anterior.
(Etapa 1-1: esterificación)
En primer lugar, se hacen reaccionar el alcohol (a1) y un ácido carboxílico halogenado X-L1-COOH (X es un átomo de halógeno y L1 se define como antes) (preferentemente un ácido carboxílico bromado) en presencia de un agente de condensación para obtener el éster halogenado (a2). Los ejemplos del agente de condensación incluyen clorhidrato de 1 -[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDC), N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o similares. Opcionalmente, se puede añadir una base. Los ejemplos de la base incluyen N-metilmorfolina (NMM), trietilamina (TEA), N,N-diisopropiletilamina (DIPEA), 4-(dimetilamino)piridina (DMAP), piridina, picolina, lutidina o similares. Los ejemplos del disolvente incluyen tetrahidrofurano (THF), cloruro de metileno, cloroformo, tolueno, hexano, acetato de etilo o similares.
Alternativamente, se puede hacer reaccionar un ácido carboxílico halogenado X-L1-COOH (X es un átomo de halógeno y Li se define como antes) (preferentemente un ácido carboxílico bromado) con un agente de halogenación electrófilo, tal como cloruro de oxalilo, opcionalmente en presencia de dimetilformamida para convertirse en un cloruro de ácido carboxílico y el cloruro de ácido carboxílico y un alcohol se pueden hacer reaccionar adicionalmente para obtener el éster halogenado (a2). Los ejemplos del disolvente incluyen tetrahidrofurano, cloruro de metileno, cloroformo, tolueno, hexano o similares.
(Etapa 1-2: introducción de la cadena de alquilo)
A continuación, se hace reaccionar el éster halogenado (a2) y malonato de di-terc-butilo en presencia de una base. Mediante la reacción, se extrae un átomo de hidrógeno del metileno activo en el diéster malónico para introducir una cadena de éster de alquilo, obteniéndose así el compuesto (a3). Los ejemplos de la base incluyen hidruro de sodio (NaH). Los ejemplos del disolvente incluyen dioxano, tetrahidrofurano, ciclopentil metil éter, 1,2-dimetoxietano, DMF, N-metilpirrolidinona o similares.
(Etapa 1-3: introducción de la cadena de alquilo)
A continuación, se hace reaccionar el compuesto (a3) y haluro de alquilo (R-Y) (preferentemente yoduro) en presencia de una base para introducir una cadena de alquilo, obteniéndose así el compuesto (a4). Se puede usar una base y disolvente similares a los de la etapa 1-2 anterior.
(Etapa 1-4: desprotección)
A continuación, se desprotege el grupo terc-butilo (tBu) del compuesto (a4) en condiciones de hidrólisis ácida para obtener el compuesto (a5). Los ejemplos del ácido usado para la desprotección incluyen ácido trifluoroacético (TFA), ácido clorhídrico o similares. Los ejemplos del disolvente incluyen cloruro de metileno o similares.
(Etapa 1-5: descarboxilación)
A continuación, se obtiene ácido monocarboxílico (a6) por descarboxilación del compuesto (a5). La reacción de descarboxilación se puede realizar, por ejemplo, calentando en un disolvente. Los ejemplos del disolvente incluyen hidrocarburos aromáticos, tales como tolueno y xileno.
(Etapa 1-6: reducción)
El grupo carboxilo del compuesto (a6) se reduce dando un grupo hidroxi en presencia de un agente reductor para obtener el compuesto (a7). Los ejemplos del agente reductor incluyen complejos de borano, tales como complejo de borano (BH3)-tetrahidrofurano y complejo de borano-sulfuro de dimetilo. Los ejemplos del disolvente incluyen éteres tales como dietil éter, tetrahidrofurano y dioxano; hidrocarburos halogenados, tales como cloroformo, cloruro de metileno y dicloroetano; hidrocarburos, tales como hexano y tolueno; y disolventes mixtos de los mismos.
(Etapa 1-7: esterificación)
Se hace reaccionar el alcohol (a7) obtenido y ácido 1 -metil-pirrolidin-3-carboxílico o un derivado del mismo (haluro de hidrógeno o similares) en presencia de un agente de condensación y una base para obtener un producto final, el compuesto (a8) (R=L2-X1-R2) (el compuesto correspondiente al lípido catiónico de la fórmula (1)). Se puede usar un agente de condensación y base similares a los de la etapa 1 -1.
Cuando se sintetiza el compuesto en donde X1 es -CO-O-, se pueden preparar en la etapa 1-3 en el Esquema 1 anterior un compuesto cuyo grupo carboxilo se protege según la etapa 2-1 descrita a continuación (el éster halogenado), el compuesto se puede hacer reaccionar con el compuesto (a3), el compuesto obtenido se puede someter adicionalmente de una etapa 1-4 a una etapa 1-7 y finalmente se puede realizar la desprotección del grupo carboxilo y la esterificación (reacción con R2-OH).
Figure imgf000013_0001
En las fórmulas, Li y Ri se definen respectivamente como antes en la fórmula (1); X e Y son respectivamente un átomo de halógeno; y R es -L2-X1-R2--(L2 , X1 y R2 se definen respectivamente como antes en la fórmula (1)) en la fórmula (1).
El Esquema 2 anterior ilustra otro método de síntesis del lípido catiónico de la fórmula (1) (compuesto en donde X1 es un enlace sencillo) usado por un experto en la técnica.
(Etapa 2-1: esterifioaoión)
En primer lugar, se someten alcohol bencílico y un ácido carboxílico halogenado X-L1-COOH (X es un átomo de halógeno y L1 se define como antes) a una reacción de esterificación para obtener el éster halogenado (b1). Las condiciones de esterificación son similares a las de la etapa 1-1.
(Etapa 2-2: introducción de la cadena de alquilo)
A continuación, similar a la etapa 1-2, se hace reaccionar el éster halogenado (b1) y malonato de di-terc-butilo en presencia de una base para obtener el compuesto (b2).
(Etapa 2-3: introducción de la cadena de alquilo)
A continuación, similar a la etapa 1 -3, se hace reaccionar el compuesto (b2) y el haluro de alquilo (R-Y) en presencia de una base para obtener el compuesto (b3).
(Etapa 2-4: desprotección)
A continuación, similar a la etapa 1-4, se desprotege el grupo terc-butilo (tBu) del compuesto (b3) en condiciones de hidrólisis ácida para obtener el compuesto (b4).
(Etapa 2-5: descarboxilación)
A continuación, similar a la etapa 1-5, se obtiene el ácido monocarboxílico (b5).
(Etapa 2-6: etapa de reducción)
Además, similar a la etapa 1-6, se reduce el ácido monocarboxílico (b5) en presencia de un agente reductor para obtener el compuesto (b6).
(Etapa 2-7: esterificación)
Se someten el compuesto obtenido (b6) y el ácido 1 -metil-pirrolidin-3-carboxílico o un derivado del mismo (haluro de hidrógeno o similares) a una reacción de esterificación en presencia de un agente de condensación y una base para obtener el compuesto (b7). Se puede usar un agente de condensación y base similares a los de la etapa 1 -1.
(Etapa 2-8: desprotección)
A continuación, en condiciones reductoras, se desprotege el grupo protector de bencilo para obtener el compuesto (b8). La desprotección se puede realizar, por ejemplo, por reacción de hidrogenación catalítica en presencia de un catalizador metálico, tal como paladio/carbono.
(Etapa 2-9: esterificación)
Finalmente, se puede hacer reaccionar el compuesto (b8) con un alcohol (R1-OH) en presencia de un agente de condensación y una base para obtener el compuesto (b9) (R=L2-X1-R2) (compuesto correspondiente al lípido catiónico de la fórmula (1)). Se puede usar un agente de condensación y base similares a los de la etapa 1 -1.
En el Esquema 2 anterior, el compuesto (b6) obtenido en la etapa 2-6 se esterifica con ácido 1 -metil-pirrolidin-3-carboxílico o un derivado del mismo (etapa 2-7), y luego se realiza la reacción de esterificación con un alcohol (R1-OH) (etapa 2-9). Sin embargo, como se ilustra en el Esquema 2' que sigue, el grupo hidroxi del compuesto (b6) obtenido en la etapa 2-6 se puede proteger, el grupo bencilo se puede desproteger y la reacción de esterificación con un alcohol (R1-OH) se puede realizar y luego se puede realizar la reacción de esterificación con ácido 1 -metil-pirrolidin-3-carboxílico o un derivado del mismo.
ESQUEMA 2
ETAPA 2-7
Figure imgf000015_0001
CO
Figure imgf000015_0002
S DE
Figure imgf000015_0003
DE ION
b11 b12
ETAPA 2-10'
Figure imgf000015_0004
CONDICIONES DE
Figure imgf000015_0006
CONDICIONES DE DESPROTECCION ESTERIFICACION
b13 (a7)
Figure imgf000015_0005
R - Lo X i R2
En las fórmulas, Li y Ri se definen respectivamente como antes en la fórmula (1); y R es -L2-X1-R2-(L2 , Xi y R2 se definen respectivamente como antes en la fórmula (1)) en la fórmula (1).
(Etapa 2-7': protección)
Se protege el grupo hidroxi del compuesto (b6) obtenido en la etapa 2-6. Por ejemplo, se hace reaccionar cloruro de terc-butildimetilsililo (TBDMS-Cl) con el mismo en un disolvente, tal como N,N-dimetilformamida, en presencia de una base, tal como imidazol, para obtener el compuesto (b10) cuyo grupo hidroxi está protegido con un grupo tercbutildimetilsililo (TBDMS).
(Etapa 2-8': desprotección)
A continuación, el grupo protector de bencilo se desprotege en condiciones reductoras para obtener el compuesto (b11). La desprotección se puede realizar, por ejemplo, por reacción de hidrogenación catalítica en presencia de un catalizador metálico, tal como paladio/carbono.
(Etapa 2-9': esterificación)
El compuesto obtenido (b11) se hace reaccionar con un alcohol (R1-OH) en presencia de un agente de condensación y una base para obtener el compuesto (b12). Se puede usar un agente de condensación y base similares a los de la etapa 1-1.
(Etapa 2-10': desprotección)
A continuación, el grupo TBDMS se desprotege para obtener el compuesto (b13). La desprotección se puede realizar, por ejemplo, por reacción con una sal de fluoruro, tal como fluoruro de tetra-n-butilamonio (TBAF), en un disolvente orgánico, tal como tetrahidrofurano.
(Etapa 2-11': esterificación)
Finalmente, similar a la etapa 1-7, se hace reaccionar el alcohol (b13) obtenido y el ácido 1-metil-pirrolidin-3-carboxílico o un derivado del mismo (haluro de hidrógeno o similares) en presencia de un agente de condensación y una base para obtener un producto final, compuesto (b14) (R=L2-X1-R2) (compuesto correspondiente al lípido catiónico de la fórmula (1)).
ESQUEMA 2"
Figure imgf000016_0001
ETAPA 2-12'
CONDICIONES DE DESPROTECCION
Figure imgf000016_0002
R - Lj X i R2
En la fórmula, Li y Ri se definen respectivamente como antes en la fórmula (1); y R es - L2-X1-R2 (L2 , Xi y R2 se definen respectivamente como antes en la fórmula (1)) en la fórmula (1).
(Etapa 2-11": esterifioaoión)
Alternativamente, en lugar de la etapa 2-11', se pueden hacer reaccionar un ácido carboxílico o un derivado del mismo, en el que el átomo de nitrógeno en el anillo de pirrolidina está protegido con un grupo protector (tal como un grupo terc-butoxicarbonilo (tBu-O-CO-; Boc)) y un alcohol (b13) en presencia de un agente de condensación y una base similares a la etapa 1 -7 para obtener el compuesto (b15).
(Etapa 2-12": desproteooión/aminaoión reduotora)
A continuación, se desprotege el grupo terc-butoxicarbonilo (Boc) del compuesto (b15) y se metila por aminación reductora. Específicamente, el grupo Boc del compuesto (b15) se desprotege por reacción con un ácido fuerte, tal como ácido trifluoroacético (TFA), para obtener NH, que se hace reaccionar con formaldehído para generar una imina (catión iminio), que se hace reaccionar adicionalmente con un agente reductor, tal como NaBH(OAc)3 o NaBH3CN, obteniéndose así un producto final, el compuesto de amina (b14) (R=L2-X1-R2) (compuesto correspondiente al lípido catiónico de la fórmula (1)).
En la etapa 2-11' o la etapa 2-11" anteriores, como ácido carboxílico o derivado del mismo se puede usar un material de partida en el que la configuración del átomo de carbono en la posición 3 del anillo de pirrolidina está controlada, tal como ácido (3S)-1-metil-pirrolidin-3-carboxílico o ácido (3R)-1 -metil-pirrolidin-3-carboxílico, o un derivado de los mismos, para controlar la configuración del anillo de pirrolidina en el compuesto de la fórmula (1).
Cuando se sintetiza el compuesto en donde X1 es -CO-O-(por ejemplo, el compuesto de la fórmula (1a)), se puede preparar un compuesto cuyo grupo carboxilo se protege según la etapa 2-1 anterior (compuesto de éster) en el Esquema 2, el compuesto se puede hacer reaccionar con el compuesto (b2) en la etapa 2-3, el compuesto obtenido se puede someter adicionalmente a etapas posteriores, y se puede realizar la desprotección y la esterificación en la etapa 2-8 y la etapa 2-9 o la etapa 2-8' y la etapa 2-9'. Usando diferentes tipos de grupos protectores que se pueden desproteger en condiciones de desprotección diferentes entre sí para dos grupos carboxilo, se puede obtener un compuesto en el que R1 y R2 son diferentes.
En los esquemas anteriores, se ilustran a modo de ejemplo métodos de síntesis en los que R3 en la fórmula (1) es un grupo metilo. Sin embargo, el compuesto en donde R3 es distinto del grupo metilo también se puede sintetizar según los esquemas anteriores usando ácido 1 -alquil-pirrolidin-3-carboxílico en lugar de ácido 1-metil-pirrolidin-3-carboxílico en la etapa 1-7 o la etapa 2-7 anteriores.
En la síntesis del compuesto de la presente invención, a menos que se cite particularmente la producción de materiales de partida, los compuestos son conocidos o se pueden preparar según métodos similares que se conocen bien en la técnica o que se describen en los Ejemplos que siguen. Un experto en la técnica entiende que los esquemas anteriores son simplemente métodos de preparación típicos del compuesto de la presente invención y se pueden aplicar a otros métodos bien conocidos.
En la preparación del compuesto de la presente invención, puede ser necesaria y/o deseable la protección de un grupo funcional de una molécula. Esto se puede llevar a cabo con un grupo protector convencional que es bien conocido por un experto en la técnica. El grupo protector se puede eliminar según un método bien conocido en la técnica en cualquier etapa apropiada posterior. Los grupos protectores (tales como un grupo protector de terc-butilo, un grupo protector de terc-butoxicarbonilo, un grupo protector de bencilo y un grupo protector de terc-butildimetilsililo) indicados en los esquemas anteriores se pueden sustituir por otros grupos protectores que son bien conocidos por un experto en la técnica.
<Complejo de lípido>
La presente invención proporciona un complejo de lípido que contiene (I) el lípido catiónico descrito anteriormente y (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol. El complejo de lípido según una realización de la presente invención contiene (I) el lípido catiónico descrito anteriormente, (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol y (III) un ácido nucleico. Por lo tanto, el complejo de lípido de la presente invención puede o puede no contener un ácido nucleico. El complejo de lípido de la presente realización permite la liberación eficaz de un ácido nucleico en el citoplasma. El complejo de lípido de la presente realización previene un aumento en el diámetro de partículas después del almacenamiento durante un cierto periodo de tiempo (por ejemplo, 1 mes, 1,5 meses o 3 meses) y puede presentar excelente estabilidad física.
Los ejemplos de la forma del complejo formado a partir del lípido que contiene el lípido catiónico y un ácido nucleico incluyen un complejo de un ácido nucleico y una membrana (micela inversa) formada de una monocapa lipídica (capa molecular individual), un complejo de un ácido nucleico y un liposoma, un complejo de un ácido nucleico y una micela, o similares. En el complejo de lípido según una realización de la presente invención, un ácido nucleico se encapsula en una partícula fina formada con un lípido que contiene el lípido catiónico.
El complejo de lípido de la presente realización contiene, basándose en el contenido de lípido total del complejo de lípido, el lípido catiónico en, por ejemplo, del 10 % al 100 % por mol, tal como del 20 % al 90 % por mol, tal como del 40 % al 80 % por mol. El lípido catiónico usado se puede usar solo o como una mezcla de dos o más.
Los ejemplos del ácido nucleico incluyen vector de expresión de ARNip, miARN, ARNhp, oligonucleótido antisentido, ARNm, ribozima o similares. En una realización, el ácido nucleico puede ser ARNip, miARN o ARNm.
El complejo de lípido de la presente realización contiene, con respecto al peso total del complejo de lípido, el ácido nucleico en, por ejemplo, del 0,01 % al 50 % en peso, tal como del 0,1 % al 30 % en peso, tal como del 1 % al 10 % en peso.
El complejo de lípido de la presente realización contiene, como componentes de lípido, (I) el lípido catiónico y (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol. El complejo de lípido de la presente realización contiene, con respecto al peso total del complejo de lípido, los componentes de lípido en, por ejemplo, del 50 % al 100 % en peso, tal como del 70 % al 99,99 % en peso, tal como del 90 % al 99 % en peso.
"Lípido neutro" significa un lípido que existe en forma sin carga o en ion anfótero neutro a un pH fisiológico. Los ejemplos del lípido neutro incluyen dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoil oleoil fosfatidilcolina (POPC), fosfatidilcolina de huevo (EPC), dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), diestearoil fosfatidilcolina (DSPC), diaraquidoil fosfatidilcolina (DAPC), dibehenoil fosfatidilcolina (DBPC), dilignoceroil fosfatidilcolina (DLPC), dioleoil fosfatidilcolina (DOPC), esfingomielina, ceramida, dioleoil fosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoil fosfatidilglicerol (DPPG), fosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE-mal) o similares. El lípido neutro se puede usar solo o como una mezcla de dos o más.
El complejo de lípido de la presente realización puede contener, basado en el contenido de lípido total en el complejo de lípido, el lípido neutro en, por ejemplo, del 0 % al 50 % por mol, tal como del 0 % al 40 % por mol, tal como del 0 % al 30 % por mol.
Los ejemplos del lípido modificado con polietilenglicol incluyen PEG2000-DMG (PEG2000-dimiristil glicerol), PEG2000-DPG (PEG2000-dipalmitoil glicerol), PEG2000-DSG (PEG2000-diestearoil glicerol), PEG5000-DMG (PEG5000-dimiristil glicerol), PEG5000-DPG (PEG5000-dipalmitoil glicerol), PEG5000-DSG (PEG5000-diestearoil glicerol), PEG-cDMA (N-[(metoxipoli(etilenglicol)2000)carbamil]-1,2-dimiristil oxilpropil-3-amina), PEG-C-DOMG (R-3-[(w-metoxi-poli(etilenglicol)2000)carbamoil]-1,2-dimiristil oxilpropil-3-amina), polietilenglicol (PEG)-diacil glicerol (DAG), PEG-dialquiloxipropilo (DAA), PEG-fosfolípido, PEG-ceramida (Cer) o similares.
Los ejemplos del PEG-dialquiloxipropilo incluyen PEG-dilauriloxipropilo, PEG-dimiristiloxipropilo, PEG-dipalmitiloxipropilo, PEG-diesteariloxipropilo o similares.
El lípido modificado con polietilenglicol se puede usar solo o como una mezcla de dos o más. El lípido modificado con polietilenglicol puede tener un extremo de PEG (polietilenglicol) que está metoxilado (MPEG; metoxi(polietilenglicol)). El complejo de lípido de la presente realización puede contener, basado en el contenido de lípido total en el complejo de lípido, el lípido modificado con polietilenglicol en, por ejemplo, del 0 % al 30 % por mol, tal como del 0 % al 20 % por mol, tal como del 0 % al 10 % por mol.
El esterol es un alcohol que tiene un esqueleto esteroideo. Los ejemplos del esterol incluyen colesterol, dihidrocolesterol, lanosterol, p-sitosterol, campesterol, estigmasterol, brassicasterol, ergocasterol, fucosterol, 3p-[N-(N',N'-dimetilaminoetil)carbamoil]colesterol (DC-Chol) o similares. El esterol se puede usar solo o como una mezcla de dos o más.
El complejo de lípido de la presente realización puede contener, basado en el contenido de lípido total en el complejo de lípido, el esterol en, por ejemplo, del 0 % al 90 % por mol, tal como del 10 % al 80 % por mol, tal como del 20 % al 50 % por mol.
Los componentes de lípido en el complejo de lípido de la presente realización se pueden combinar sin limitación, y los ejemplos de la combinación incluyen una combinación del lípido catiónico, el lípido neutro y el esterol descrito anteriormente, una combinación del lípido catiónico, el lípido neutro, el lípido modificado con polietilenglicol y el esterol descrito anteriormente o similares.
El "diámetro de partículas promedio" del complejo de lípido de la presente realización se puede calcular según cualquiera del promedio en volumen, el promedio en número y el promedio Z. El complejo de lípido de la presente realización puede tener un diámetro de partículas promedio (promedio Z) de, por ejemplo, 10 a 1000 nm, tal como 30 a 500 nm, tal como 30 a 200 nm.
El complejo de lípido de la presente realización es preferentemente tal que se minimice el aumento en el diámetro de partículas del complejo de lípido durante el periodo de almacenamiento en comparación con el de antes del almacenamiento. Por ejemplo, es preferible que el diámetro de partículas promedio (promedio Z) después de un almacenamiento a 4 °C durante 1,5 meses sea 1,25 veces o menos, más preferentemente 1,2 veces o menos, y particularmente preferentemente 1,1 veces o menos, el diámetro de partículas antes del almacenamiento.
Desde el punto de vista de prevenir la adsorción no específica y la reacción inmunitaria, el complejo de lípido de la presente realización casi no tiene preferentemente carga superficial en un entorno de pH de aproximadamente 7,4, tal como en la sangre. Además, desde el punto de vista de mejorar la eficiencia de fusión con una membrana endosómica durante la incorporación en células por endocitosis, es preferible que el complejo de lípido se cargue positivamente en un entorno de pH bajo (por ejemplo, 3,5 a 7,0).
<Composición>
La presente invención proporciona una composición que incluye (I) el lípido catiónico descrito anteriormente, (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol, y (III) un ácido nucleico. En una realización de la presente invención, la composición incluye el complejo de lípido que contiene el ácido nucleico como se ha descrito anteriormente. La composición de la presente realización permite la eficaz liberación de un ácido nucleico en el citoplasma. La composición de la presente realización puede contener el complejo de lípido descrito anteriormente, un medio farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros aditivos. El medio farmacéuticamente aceptable y otros aditivos se describen en lo sucesivo.
La composición de la presente invención contiene, basada en el contenido de lípido total en la composición, el lípido catiónico en, por ejemplo, del 10 % al 100 % por mol, tal como del 20 % al 90 % por mol, tal como del 40 % al 70 % por mol. El lípido catiónico se puede usar solo o como una mezcla de dos o más.
Los ejemplos del ácido nucleico incluyen los descritos anteriormente. La composición de la presente invención contiene, con respecto al peso total de la composición, el ácido nucleico en, por ejemplo, del 0,01 % al 50 % en peso, tal como del 0,1 % al 30 % en peso, tal como del 1 % al 10 % en peso.
La composición de la presente invención contiene, como componentes de lípido, (I) el lípido catiónico descrito anteriormente y (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol.
Los ejemplos del lípido neutro incluyen los descritos anteriormente. La composición de la presente invención puede contener, basado en el contenido de lípido total en la composición, el lípido neutro en, por ejemplo, del 0 % al 50 % por mol, tal como del 0 % al 40 % por mol, tal como del 0 % al 30 % por mol.
Los ejemplos del lípido modificado con polietilenglicol incluye los descritos anteriormente. La composición de la presente invención puede contener, basado en el contenido de lípido total en la composición, el lípido modificado con polietilenglicol en, por ejemplo, del 0 % al 30 % por mol, tal como del 0 % al 20 % por mol, tal como del 0 % al 10 % por mol.
Los ejemplos del esterol incluyen los descritos anteriormente. La composición de la presente invención puede contener, basado en el contenido de lípido total en la composición, el esterol en, por ejemplo, del 0 % al 90 % por mol, tal como del 10 % al 80 % por mol, tal como del 20 % al 50 % por mol.
Los componentes de lípido en la composición de la presente invención se pueden combinar sin limitación, y los ejemplos de los mismos incluyen una combinación del lípido catiónico, el lípido neutro y el esterol descritos anteriores, una combinación del lípido catiónico, el lípido neutro, el lípido modificado con polietilenglicol y el esterol descritos anteriormente o similares.
La composición de la presente invención puede contener, como otros aditivos, sacáridos, tales como sacarosa, glucosa, sorbitol y lactosa; aminoácidos, tales como glutamina, ácido glutámico, glutamato sódico e histidina; sales de ácidos, tales como ácido cítrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido láctico, ácido carbónico y ácido tartárico o similares.
La composición de la presente invención se puede formular como una composición farmacéutica. Los ejemplos de la forma farmacéutica de la composición farmacéutica incluyen un inyectable.
La composición de la presente invención puede estar, por ejemplo, en un estado de polvo obtenido retirando un disolvente por liofilización o similares o en un estado líquido. La composición según una realización de la presente invención es una composición en polvo que contiene el complejo de lípido según la realización descrita anteriormente. La composición en polvo se puede preparar a partir de una composición en un estado líquido (dispersión) retirando un disolvente, por ejemplo, por filtración o centrifugación, o preparar por liofilización de la dispersión. Cuando la composición está en un estado en polvo, la composición se puede suspender o disolver en un medio farmacéuticamente aceptable antes de usar la misma como un inyectable. La composición según una realización de la presente invención es una composición líquida que contiene el complejo de lípido según la realización descrita anteriormente y un medio farmacéuticamente aceptable. Cuando la composición está en un estado líquido, la composición se puede usar directamente o como un inyectable después de disolver la composición en un medio farmacéuticamente aceptable.
Los ejemplos de medio farmacéuticamente aceptable incluyen agua estéril; solución salina; disoluciones isotónicas que contienen un adyuvante, tal como glucosa, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro sódico; tampones, tales como tampón fosfato, tampón citrato y tampón acetato; o similares. La composición de la presente realización puede contener aditivos adicionales que incluyen un adyuvante en disolución, tal como alcoholes que incluyen etanol, propilenglicol y polietilenglicol, un agente estabilizante, un antioxidante, un antiséptico, un vehículo que se usa, en general, en la producción de fármacos, una carga, un agente de carga, un aglutinante, un humectante, un disgregante, un lubricante, un tensioactivo, un dispersante, un conservante, un aromatizante, un calmante o similares.
La composición se puede administrar a un paciente por vías parenterales, tales como una inyección intrarterial, una inyección intravenosa y una inyección hipodérmica. La dosis de la composición puede variar según el sujeto al que se administre, el órgano diana, el síntoma o el modo de administración. El sujeto al que se administra la composición no está limitado y la composición se puede administrar a diversos animales. Particularmente, la composición se puede administrar a un mamífero, preferentemente a un humano y a un animal experimental en pruebas clínicas, cribado y experimentos de laboratorio.
<Método de producción de la composición>
En una realización, la presente invención proporciona un método de producción de una composición, incluyendo el método: la etapa (a) de mezclar una disolución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar que contiene (I) el lípido catiónico descrito anteriormente, (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol con una disolución acuosa que contiene (III) un ácido nucleico para obtener una disolución mixta; y la etapa (b) de reducir el porcentaje de contenido del disolvente orgánico polar en la disolución mixta. El método de producción según la presente realización permite la producción de la composición que puede liberar eficazmente un ácido nucleico en el citoplasma.
El complejo de lípido que contiene ácidos nucleicos encapsulados en partículas finas formado con los lípidos se puede formar por la interacción electrostática entre ácidos nucleicos solubles en agua y el lípido catiónico y la interacción hidrófoba entre lípidos. Por ejemplo, reduciendo el porcentaje de contenido del disolvente orgánico polar en la disolución mixta, se puede cambiar la solubilidad de los componentes de lípido que incluyen (I) el lípido catiónico descrito anteriormente y (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol en la disolución acuosa que contiene disolvente orgánico polar, formándose así el complejo de lípido. Los ejemplos de disolvente orgánico polar incluyen alcoholes, tales como etanol.
En primer lugar, en la etapa (a), se mezclan una disolución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar que contiene (I) el lípido catiónico y (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol disuelto en él y una disolución acuosa que contiene (III) un ácido nucleico para obtener una disolución mixta. La concentración del disolvente orgánico polar en la disolución acuosa que contiene el disolvente orgánico polar no está particularmente limitada, en tanto que las moléculas de lípido se puedan solubilizar incluso después de ser mezcladas con la disolución acuosa del ácido nucleico. Por ejemplo, la concentración de disolvente orgánico polar en la disolución acuosa que contiene el disolvente orgánico polar en la etapa (a) puede ser del 0 % al 60 % en peso.
A continuación, en la etapa (b), se añade agua o similares a la disolución mixta para reducir el porcentaje de contenido del disolvente orgánico polar. Como resultado, se puede formar el complejo de lípido. Para formar el complejo de lípido eficazmente, es preferible que se reduzca rápidamente el porcentaje de contenido del disolvente orgánico polar. Por ejemplo, la concentración del disolvente orgánico polar en la disolución acuosa final que contiene el disolvente orgánico polar en la etapa (b) puede ser del 0 % al 5 % en peso.
Alternativamente, la disolución mixta obtenida en la etapa (a) se puede someter a diálisis para retirar el disolvente orgánico polar y sustituir el disolvente por un medio farmacéuticamente aceptable. Debido a que el porcentaje de contenido del disolvente orgánico polar en la disolución disminuye durante el proceso de diálisis, el complejo de lípido se puede formar como resultado.
Según el método de producción de la composición de la presente realización, se puede obtener el complejo de lípido que contiene un ácido nucleico encapsulado eficazmente en partículas finas. El complejo de lípido puede tener excelente estabilidad física. Por ejemplo, después del almacenamiento durante un cierto periodo de tiempo (por ejemplo, 1 mes o 3 meses), se puede minimizar un aumento en el diámetro de partículas.
Cuando el ácido nucleico encapsulado en la composición es un terapéutico de oligonucleótido, la composición se puede usar como una composición farmacéutica. Por ejemplo, la composición de la presente invención se puede usar en la terapia (tal como genoterapia) para introducir un ácido nucleico deseado al citoplasma diana (tal como el citoplasma que causa una enfermedad) in vivo o in vitro. Por lo tanto, la presente invención según una realización proporciona un método (particularmente un método de terapia génica) de terapia de diversas enfermedades usando la composición farmacéutica que contiene el complejo de lípido. El sujeto a administrar, el método y la condición de administración son los mismos que antes.
Una realización de la presente invención puede ser un kit para administrar un ácido nucleico terapéutico, conteniendo el kit el lípido catiónico. El kit también se puede usar preferentemente en la terapia (tal como genoterapia) de diversas células diana. En el kit de la presente realización, el estado de almacenamiento del lípido catiónico no está particularmente limitado, y puede ser cualquier estado, tal como disolución o polvo, teniendo en cuenta la estabilidad (propiedad de almacenamiento), conveniencia de uso o similares. El kit de la presente realización puede contener, además del lípido catiónico, por ejemplo, diversos ácidos nucleicos, diversos medios (medios farmacéuticamente aceptables, tampones), instrucciones (manual de instrucciones) o similares. El kit de la presente realización se usa para preparar una composición o un complejo de lípido que contiene un ácido nucleico deseado a introducir en las células diana y lípidos que contienen el lípido catiónico anterior. La composición o complejo de lípido preparado se puede usar eficientemente para la administración del ácido nucleico a las células diana. Además, una realización de la presente invención puede ser un kit para administrar un ácido nucleico terapéutico, conteniendo el kit una composición farmacéutica que contiene el lípido catiónico. El kit de la presente realización puede contener, además de la composición farmacéutica, por ejemplo, diversos medios (medios farmacéuticamente aceptables), instrucciones (manual de instrucciones) o similares.
e j e m p l o s
La presente invención se describe más específicamente en lo sucesivo a modo de Ejemplos, Ejemplos de producción y Ejemplos de prueba. Sin embargo, la presente invención no se limita a estos ejemplos. En los Ejemplos y Ejemplos de producción, la nomenclatura de los compuestos se obtiene en el software (nombre de producto "ChemDraw Plugin ver. 15.1", producido por PerkinElmer Co., Ltd.).
Todos los materiales de partida, reactivos, ácidos, bases, agentes deshidratantes, disolventes y catalizadores que se usan para la síntesis de los compuestos de la presente invención están comercialmente disponibles o se pueden producir según los métodos de síntesis orgánica que son bien conocidos por un experto en la técnica. Además, los compuestos de la presente invención pueden ser producidos, como se demuestra en los Ejemplos que siguen, según los métodos de síntesis orgánica que son bien conocidos por un experto en la técnica.
Las abreviaturas usadas en los Ejemplos son convencionales y bien conocidas por un experto en la técnica. Algunas de las abreviaturas se indican a continuación.
DIPEA: N,N-Diisopropiletilamina
DMAP: 4-(Dimetilamino)piridina
DMSO: Sulfóxido de dimetilo
DMF: N,N-Dimetilformamida
EDC-HCl: Clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
n-: Normal
tere-: Terciario
TFA: Ácido trifluoroacético
THF: Tetrahidrofurano
LAH: Hidruro de litio y aluminio
TBAF: Fluoruro de tetra-n-butilamonio
RMN 1H: Espectrometría de resonancia magnética nuclear de protones
En los Ejemplos y Ejemplos de producción que siguen, "temperatura ambiente" indica, en general, desde aproximadamente 10 °C hasta aproximadamente 35 °C. % indica el porcentaje en peso, a menos que se establezca de otro modo.
Los desplazamientos químicos de la espectrometría de resonancia magnética nuclear de protones se registran en la unidad 5 (ppm) de tetrametilsilano. Las abreviaturas en los patrones son como se indican a continuación:
s: singlete, d: doblete, t: triplete, q: cuadruplete, quin: quintuplete, m: multiplete, a: ancho.
Para la cromatografía, se usó Parallel Prep producido por YAMAZEN Corporation {columna: producida por YAMAZEN Corporation, columna Hi-Flash (gel de sílice), tamaño; S (16 x 60 mm), M (20 x 75 mm), L (26 x 100 mm), 2L (26 x 150 mm)}, o el sistema de purificación automática ultrarrápida Isolera producido por Biotage {columna: SNAP Cartridge KP-Sil (10 g, 25 g, 50 g, 100 g, 340 g)}.
a . Síntesis de lípido oatiónioo
[Ejemplo de producción 1]
Síntesis de 9-bromononanoato de benoilo
Figure imgf000021_0001
Se disolvió alcohol bencílico (1,3 ml, 12,6 mmoles), ácido 9-bromononanoico (3,0 g, 12,65 mmoles) y DMAP (155 mg, 1,27 mmoles) en cloruro de metileno (25 ml), al que se añadió EDC-HCl (2,67 g, 13,92 mmoles) con enfriamiento con hielo, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se añadió a una disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio y se extrajo con dietil éter. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (nheptano/acetato de etilo) obteniéndose el compuesto del título (3,7 g, 11,31 mmoles).
1H-RMN (400 MHz, CDCh)5(ppm): 1,22-1,48(m,8H), 1,58-1,71(m,2H), 1,78-1,90(m,2H), 2,30-2,40(m,2H), 3,35-3,44(m,2H), 5,12(s,2H), 7,26-7,45(m,5H).
[Ejemplo de producción 2]
Síntesis de 4-pentilnonan-1-ol
Figure imgf000022_0001
Se disolvió ácido 2-pentilheptanoico (2,0 g, 9,98 mmoles) en THF (50 ml), al que se añadió gota a gota a -78 °C el complejo de borano-THF (1,0 M, 25,0 ml, 25,0 mmoles). La mezcla se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La mezcla se enfrió nuevamente hasta -78 °C, se añadió adicionalmente complejo de borano-THF (1,0 M, 10,0 ml, 10,0 mmoles) y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se añadió una disolución acuosa saturada de cloruro de amonio y se extrajo con dietil éter. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano/acetato de etilo) obteniéndose el compuesto del título (1,40 g, 7,49 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCb)5(ppm): 0,89(t,J=7,2Hz,6H), 1,24-1,35(m,19H), 1,45-1,47(m,1H), 1,62-1,71(m,1H), 3,54(a d,J=5,5Hz,2H).
(2) Síntesis de 2-pentilheptanal
A una disolución de cloruro de oxalilo (1,3 ml, 15,0 mmoles) en cloruro de metileno (1,0 ml) se añadió gota a gota a -78 °C una disolución de DMSO (2,1 ml, 30,0 mmoles) en cloruro de metileno (1,0 ml). Después de agitar durante 30 minutos, se añadió una disolución del compuesto (1,40 g, 7,49 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 2-(1) en cloruro de metileno (2,0 ml). Después de agitar durante 1 hora, se añadió trietilamina (5,2 ml, 37,5 mmoles). Después de calentar hasta temperatura ambiente, la mezcla se agitó durante 2 horas y se añadió agua para separar una fase orgánica. La fase orgánica se lavó con agua y una disolución saturada de cloruro sódico, y el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano/dietil éter) obteniéndose el compuesto del título (1,26 g, 6,82 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCl3)5(ppm): 0,89(t,J=6,8Hz,7H), 1,19-1,34(m,13H), 1,40-1,47(m,4H), 1,57(s,1H), 1,58-1,66(m,2H), 2,15-2,28(m,1 H), 2,66(s,1 H), 9,56(d,J=3,3Hz,1 H).
(3) Síntesis de 4-pentilnonan-2-enoato de etilo
A una disolución de bromuro de etoxicarbonilmetil(trifenil)fosfonio (2,23 g, 5,19 mmoles) en THF (14 ml) se añadió gota a gota a -78 °C una disolución de hexametildisilazano de sodio-THF (1 M, 5,2 ml, 5,19 mmoles). Después de calentar hasta 0 °C durante 2 horas, se añadió gota a gota a través de una cánula una disolución del compuesto (0,48 g, 2,59 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 2-(2) en THF (4,0 ml). Después de agitar durante la noche a temperatura ambiente, la mezcla se sometió a reflujo con calentamiento durante 4 horas. Se añadió agua y se extrajo con dietil éter. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano/dietil éter) obteniéndose el compuesto del título (0,28 g, 1,09 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCl3)5(ppm): 0,89(a t,J=7,2Hz,5H), 0,87(a t,J=7,0Hz,6H), 1,18-1,35(m,26H), 1,38-1,46(m,3H), 1,53-1,64(m,4H), 2,09-2,24(m,1H), 2,38(t,J=7,5Hz,3H), 4,19(c,J=7,0Hz,2H), 5,76(d,J=15,8Hz,1H), 6,74(dd,J=15,6,9,4Hz,1 H).
(4) Síntesis de 4-pentilnonan-1-ol
A una disolución del compuesto (0,28 g, 1,10 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 2-(3) en THF (2,2 ml), se añadió gota a gota bajo una atmósfera de nitrógeno a 0 °C una disolución de LAH-THF (1 M, 2,2 ml, 2,2 mmoles). La mezcla se calentó hasta temperatura ambiente y se sometió a reflujo con calentamiento durante 18 horas. A 0 °C, la mezcla se diluyó con terc-butil metil éter (4,6 ml) y luego se añadieron sucesivamente agua (0,078 ml), una disolución acuosa de hidróxido sódico (15 %, 0,078 ml) y agua (0,234 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos, se filtró a través de Celite y se lavó con dietil éter. El filtrado se concentró y el residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano/dietil éter) obteniéndose el compuesto del título (0,048 g, 0,22 mmoles). 1H RMN(600MHz,CDCb)5(ppm): 0,89(t,J=7,2Hz,6H), 1,19-1,33(m,21H), 1,43(s,1H), 1,47(s a,1H), 1,50-1,58(m,2H), 3,62(t,J=6,8Hz,2H).
[Ejemplo de producción 3]
Síntesis de 9-bromononanoato de 3-pentiloctilo
Figure imgf000023_0001
A una disolución de ácido 9-bromononanoico (1,61 g, 6,77 mmoles) en cloruro de metileno (35 ml) se añadió cloruro de oxalilo (0,95 ml, 10,8 mmoles) con enfriamiento con hielo y luego se añadió DMF (0,050 ml, 0,68 mmoles) durante 40 minutos. Después de agitar a temperatura ambiente durante 40 minutos, la mezcla se concentró a presión reducida y se destiló azeotrópicamente con tolueno. El residuo se disolvió en cloruro de metileno (35 ml), se añadió 3-pentiloctan-1-ol (1,36 g, 6,77 mmoles) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se añadió a una disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio y se extrajo con dietil éter. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. T ras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano/dietil éter) obteniéndose el compuesto del título (2,22 g, 5,28 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,89(t,J=7,3Hz,6H), 1,22-1,35(m,22H), 1,37-1,47(m,3H), 1,53-1,66(m,5H), 1,86(quin,J=7,2Hz,2H), 2,29(t,J=7,5Hz,2H), 3,41(t,J=7,0Hz,2H), 4,09(t,J=7,2Hz,2H).
[Ejemplo de producción 4]
Síntesis de 3-octilundecan-1-ol
Figure imgf000023_0002
A una suspensión de 2-(dietoxifosforil)acetato de etilo (5,0 ml, 25,3 mmoles) en THF (40 ml) se añadió gradualmente con enfriamiento con hielo 60 % de hidruro de sodio (0,93 g, 23,2 mmoles). Después de 30 minutos, se añadió gota a gota una disolución de nonilaldehído (3,6 ml, 21,1 mmoles) en THF (40 ml) y se agitó durante 30 minutos. Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas, la mezcla se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, y tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. A una suspensión de 2-(dietoxifosforil)acetato de etilo (2,5 ml, 12,7 mmoles) en THF (20 ml), se añadió gradualmente con enfriamiento con hielo 60 % de hidruro de sodio (1,0 g, 25,0 mmoles) y luego se añadió gota a gota la disolución del producto en bruto obtenida como antes en THF (20 ml). Después de agitar durante 1 hora, se añadió agua y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, y tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano/dietil éter) obteniéndose el compuesto del título (3,07 g, 14,6 mmoles).1
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 1,22-1,35(m,14H), 1,41-1,50(m,2H), 2,15-2,23(m,2H), 4,14-4,22(m,2H), 5,81 (dt,J=15,6,1,5Hz,1H), 6,96(dt,J=15,6,7,0Hz,1H).
(2) Síntesis de 3-octilundecanoato de etilo
Se suspendieron en THF (40 ml) bromuro de cobre(I) (0,21 g, 1,45 mmoles) y cloruro de litio (0,12 g, 2,89 mmoles) y se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Con enfriamiento con hielo, se añadieron sucesivamente el compuesto (3,07 g, 14,46 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 4-(1) y clorotrimetilsilano (2,2 ml, 17,4 mmoles) y se agitó durante 20 minutos. Se añadió gota a gota una disolución de bromuro de octilmagnesio-THF (2,0 M, 8,7 ml, 17,4 mmoles) y se agitó durante 1,5 horas adicionales. Se añadió una disolución acuosa saturada de cloruro de amonio y se extrajo con dietil éter. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano/dietil éter) obteniéndose el compuesto del título (4,43 g,13,58 mmoles). 1H-RMN(600MHz,CDCl3)ó(ppm): 0,88(t,J=7,1 Hz,6H), 1,19-1,33(m,34H), 1,35-1,35(m,1H), 1,84(a d,J=5,0Hz,1 H), 2,21 (d,J=7,0Hz,2H), 4,12(c,J=7,2Hz,2H).
(3) Síntesis de 3-ootilundeoan-l-ol
A una disolución del compuesto (4,43 g, 13,56 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 4-(2) en THF (30 ml), se añadió gota a gota a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno una disolución de LAH-THF (2 M, 13,6 ml, 27,1 mmoles). Después de calentar a 65 °C durante 5 horas, se añadieron sucesivamente agua (1 ml), una disolución acuosa de hidróxido sódico (2 M, 1 ml) y agua (2 ml) con enfriamiento con hielo. La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos, se filtró a través de Celite y se lavó con dietil éter. El filtrado se concentró a presión reducida y el residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano/dietil éter) obteniéndose el compuesto del título (4,43 g, cuant).
1H-RMN(600MHz,CDCh)ó(ppm): 0,88(t,J=7,1Hz,6H), 1,12(s a,1H), 1,19-1,33(m,30H), 1,39-1,44(m,2H), 1,49-1,54(m,2H), 3,62-3,71(m,2H).
[Ejemplo de producción 5]
Síntesis de 6-bromohexanoato de 3-ootilundeoilo
Figure imgf000024_0001
Se disolvieron en cloruro de metileno (22 ml) el compuesto (3,46 g, 12,16 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 4, ácido 6-bromohexanoico (2,61 g, 13,38 mmoles) y DMAP (0,15 g, 1,22 mmoles), al que se añadió EDC-HCl (2,91 g, 15,20 mmoles) con enfriamiento con hielo, y la mezcla se agitó durante 3 días a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y se diluyó con dietil éter. La mezcla de reacción se lavó con una disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio, agua y una disolución acuosa al 10 % de ácido cítrico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo) obteniéndose el compuesto del título (4,67 g, 10,09 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCl3)5(ppm): 0,88(t,J=7,0Hz,6H), 1,21-1,32(m,30H), 1,39(s a,1H), 1,44-1,51(m,2H), 1,57(c,J=7,0Hz,2H), 1,66(quin,J=7,6Hz,2H), 1,84-1,91(m,2H), 2,31(t,J=7,4Hz,2H), 3,40(t,J=6,7Hz,2H), 4,09(t,J=7,2Hz,2H).
[Ejemplo de produooión 6]
Síntesis de 4-bromobutanoato de benoilo
Figure imgf000024_0002
A una disolución de ácido 4-bromobutanoico (2,94 g, 17,61 mmoles) en cloruro de metileno (88 ml) se añadieron sucesivamente cloruro de oxalilo (1,6 ml, 18,5 mmoles) y DMF (0,40 ml, 1,8 mmoles) a temperatura ambiente. Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos, se añadió alcohol bencílico (1,90 g, 17,61 mmoles) y se agitó durante 15 minutos. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y el residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano/dietil éter) obteniéndose el compuesto del título (3,64 g, 14,09 mmoles).1 1H-RMN(600MHz,CDCl3)ó(ppm): 1,61 (s,1 H), 2,21(quin,J=6,8Hz,2H), 2,57(t,J=7,3Hz,2H), 3,47(t,J=6,4Hz,2H), 5,15(s,2H), 7,33-7,40(m,5H).
[Ejemplo de produooión 7]
Síntesis de 4-noniltrideoan-1-ol
Figure imgf000025_0001
(1) Síntesis de 2-dodeoenoato de (E)-etilo
A una suspensión de hidruro de sodio al 60 % (1,28 g, 32,0 mmoles) en 1,2-dimetoxietano (70 ml) se añadió gota a gota con enfriamiento con hielo 2-(dietoxifosforil)acetato de etilo (6,4 ml, 32,0 mmoles). Después de 20 minutos, se añadió una disolución de decilaldehído (5,0 ml, 32,0 mmoles) en 1,2-dimetoxietano (30 ml) y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se añadió una disolución acuosa saturada de cloruro de amonio y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y tras la filtración el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y tras la filtración el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (n-pentano/dietil éter) obteniéndose el compuesto del título (5,18 g, 23,0 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCl3)5(ppm): 0,88(t,J=7,06Hz,4H), 1,25-1,32(m,18H), 1,45(dt,J=14,5,7,3Hz,2H), 2,15-2,22(m,2H), 4,15-4,26(m,2H), 5,72-5,90(m,1H), 6,96(dt,J=15,6,7,0Hz,1H).
(2) Síntesis de 3-nonildodeoanoato de etilo
Según el método en el Ejemplo de producción 4-(2), el compuesto del título (2,76 g, 7,84 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (2,22 g, 9,80 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 7-(1), bromuro de cobre(I) (0,141 g, 0,98 mmoles), cloruro de litio (0,083 g, 1,96 mmoles), clorotrimetilsilano (1,4 ml, 10,8 mmoles), una disolución de bromuro de nonilmagnesio-THF (1,0 M, 10,8 ml, 10,8 mmoles) y THF (53 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCh)ó(ppm): 0,77(t,J=7,0Hz,9H), 1,04(a d,J=7,3Hz,1H), 1,11-1,26(m,48H), 1,29-1,39(m,1H), 1,44(s,1 H), 1,68-1,84(m,1 H), 2,05-2,09(m,1H), 2,09-2,16(m,2H), 3,46(t,J=6,8Hz,1H), 3,42-3,49(m,1H), 4,01 (c,J=7,0Hz,2H), 4,07(c,J=7,3Hz,1 H), 5,70(dt,J=15,7,1,5Hz,1H), 6,85(dt,J=15,8,7,0Hz,1H), 7,15(s,1H).
(3) Síntesis de 3-nonildodeoan-1-ol
Según el método en el Ejemplo de producción 4-(3), el compuesto del título (1,34 g, 4,29 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (2,76 g, 7,80 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 7-(2), una disolución de LAH-THF (1 M, 10,1 ml, 10,1 mmoles) y THF (15 ml). 1H-RMN(600MHz,CDCl3)5(ppm): 0,89(t,J=7,0Hz,6H), 1,18(s a,2H), 1,23-1,33(m,33H), 1,43(a d,J=9,9Hz,1H), 1,53(c,J=6,8Hz,2H), 1,59(s a,1 H), 3,67(t,J=7,2Hz,2H).
(4) Síntesis de 3-nonildodeoanal
Según el método en el Ejemplo de producción 2-(2), el compuesto del título (0,30 g, cuant) se obtuvo a partir del compuesto (0,30 g, 0,97 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 7-(3), cloruro de oxalilo (0,17 ml, 1,94 mmoles), DMSO (0,27 ml, 3,88 mmoles) y trietilamina (0,68 ml, 4,85 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCl3)5(ppm): 0,89(t,J=7,0Hz,6H), 1,15-1,38(m,1H), 1,44(s,9H), 1,55(s,1H), 1,95(s a,1H), 2,33(dd,J=6,6,2,6Hz,2H), 9,77(t,J=2,4Hz,1 H).
(5) Síntesis de 10-(3-metoxialil)nonadeoano
A una disolución de cloruro de (metoximetil)trifenilfosfonio (1,10 g, 3,21 mmoles) en THF (5,0 ml), se añadió gota a gota a -78 °C una disolución de hexametildisilazano de sodio-THF (1 M, 3,2 ml, 3,2 mmoles). Después de 15 minutos, la mezcla se añadió a una disolución del compuesto (0,50 g, 1,60 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 7-(4) en THF (2,0 ml) con enfriamiento con hielo a través de una cánula. Después de agitar durante 1,5 horas, se añadió agua y se extrajo con dietil éter. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano/dietil éter) obteniéndose el compuesto del título (0,33 g, 0,98 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,89(t,J=7,0Hz,6H), 1,20-1,35(m,28H), 1,41-1,48(m,1H), 1,55(s,1H), 1,88(t,J=6,4Hz,1 H), 1,96-2,11 (m 1H), 3,52(s,1H), 3,57(s,1H), 4,32(c,J=7,3Hz,1H), 4,69(dt,J=12,7,7,4Hz,1H), 5,91 (d,J=6,2Hz,1 H), 6,25(d,J=12,8Hz,1 H).
(6) Síntesis de 4-noniltrideoanal
El compuesto (0,33 g, 0,97 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 7-(5) se disolvió en THF (2,0 ml) y se añadió ácido clorhídrico 1 N (2,95 ml, 2,95 mmoles) a temperatura ambiente y se calentó a 70 °C. Después de 36 horas, se añadió agua y se extrajo con dietil éter. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida obteniéndose el compuesto del título (0,28 g, 0,87 mmoles). 1H-RMN(600MHz,CDCta)5(ppm): 0,89(t,J=7,0Hz,7H), 1,20-1,34(m,39H), 1,44(s,1H), 1,54-1,62(m,3H), 2,37-2,43(m,2H), 9,78(t,J=1,8Hz,1H).
(7) Síntesis de 4-noniltrideoan-1-ol
El compuesto (0,28 g, 0,88 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 7-(6) se disolvió en etanol (13 ml), al que se añadió a 0 °C borohidruro de sodio (0,13 g, 3,50 mmoles). Después de 1,5 horas, se añadió una disolución acuosa saturada de cloruro de amonio y se extrajo con cloruro de metileno. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y tras la filtración el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida obteniéndose el compuesto del título (0,28 g, 0,86 mmoles). 1 H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,89(t,J=7,0Hz,6H), 1,20-1,33(m,37H), 1,44(s,1H), 1,49-1,65(m,3H), 3,63(t,J=6,8Hz,2H).
[Ejemplo de producción 8]
Síntesis de 5-bromopentanoato de bencilo
Figure imgf000026_0001
Según el método en el Ejemplo de producción 6, el compuesto del título (5,39 g, 19,89 mmoles) se obtuvo a partir de ácido 5-bromopentanoico (4,0 g, 22,1 mmoles), alcohol bencílico (2,3 ml, 22,1 mmoles), cloruro de metileno (110 ml), cloruro de oxalilo (2,0 ml, 23,2 mmoles) y Dm F (0,17 ml, 2,21 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 1,62(s,1H), 1,79-1,85(m,2H), 1,88-1,93(m,2H), 2,41(t,J=7,3Hz,2H), 3,41 (t,J=6,6Hz,2H), 5,14(s,2H), 7,33-7,40(m,5H).
[Ejemplo de producción 9]
Síntesis de 3-hexilnonan-1-ol
Figure imgf000026_0002
(1) Síntesis de 3-hexilnonanoato de metilo
Según el método en el Ejemplo de producción 4-(2), el compuesto del título (4,18 g, 16,27 mmoles) se obtuvo a partir de (E)-2-nonenoato de metilo (3,6 ml, 18,92 mmoles), bromuro de cobre(I) (0,275 g, 1,92 mmoles), cloruro de litio (0,160 g, 3,76 mmoles), clorotrimetilsilano (2,7 ml, 21,27 mmoles), una disolución de bromuro de hexilmagnesio-THF (2,0 M, 10,5 ml, 21,0 mmoles) y THF (50 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,86-0,91(m,7H), 1,12-1,37(m,25H), 1,79-1,87(m,1H), 2,23(d,J=6,8Hz,2H), 3,66(s,3H).
(2) Síntesis de 3-hexilnonan-1-ol
Según el método en el Ejemplo de producción 4-(3), el compuesto del título (2,33 g, 10,14 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (4,0 g, 15,6 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 9-(1), una disolución de LAH-THF (2,4 M, 13,0 ml, 31,2 mmoles) y THF (60 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3)5(ppm): 0,88(t,J=7,0Hz,6H), 1,13(s a,1H), 1,19-1,34(m,20H), 1,41 (s a,1H), 1,49-1,57(m,4H), 3,66(a d,J=5,5Hz,2H).
[Ejemplo de producción 10]
Síntesis de 8-bromooctanoato de bencilo
Figure imgf000027_0001
Según el método en el Ejemplo de producción 1, se disolvieron alcohol bencílico (1,3 ml, 12,5 mmoles), ácido 8-bromooctanoico (3,06 g, 12,73 mmoles) y DMAP (0,15 g, 1,25 mmoles) en cloruro de metileno (60 ml), al que se añadió con enfriamiento con hielo EDC-HCl (2,99 g, 15,61 mmoles), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se añadió a una disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio y se extrajo con dietil éter. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo) obteniéndose el compuesto del título (3,91 g, 12,5 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 1,22-1,48(m,6H), 1,58-1,71(m,2H), 1,78-1,90(m,2H), 2,30-2,38(m,2H), 3,33-3,45(m,2H), 5,12(s,2H), 7,28-7,44(m,5H).
<Síntesis de lípido catiónico (1)>
[Ejemplo A-1]
Síntesis de 1-metilpirrolidin-3-carboxilato de (3S)-2-{9-oxo-9-[(3-pentiloctil)oxi]nonil}dodecilo (lípido catiónico 1) 1
Figure imgf000027_0002
(1) Síntesis de 1,1 -di-terc-butil nonano-1,1,9-tricarboxilato de 9-bencilo
Se suspendió hidruro de sodio (60 %, 0,43 g, 10,85 mmoles) en DMF (40 ml), al que se añadió gradualmente con enfriamiento con hielo malonato de di-terc-butilo (2,2 ml, 9,87 mmoles), y la mezcla se agitó durante 5 minutos y durante 20 minutos después de retirar baño de refrigeración. Con enfriamiento con hielo, se añadieron sucesivamente yoduro de sodio (0,44 g, 2,96 mmoles) y el compuesto (3,39 g, 10,36 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 1 y se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. La mezcla de reacción se enfrió en un baño de agua con hielo, se añadió agua y se extrajo con dietil éter. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo) obteniéndose el compuesto del título (3,6 g, 7,78 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCl3)5(ppm): 1,25-1,33(m,9H), 1,36(s,1H), 1,39(s,1H), 1,44-1,49(m,16H), 1,56-1,67(m,3H), 1,79(c,J=6,7Hz,2H), 2,35(t,J=7,5Hz,2H), 3,11(t,J=7,7Hz,1H), 5,12(s,2H), 7,32-7,39(m,5H).
(2) Síntesis de nonadeoano-1,9,9-trioarboxilato de 1-bencil 9,9-di-tero-butilo
Se disolvió el compuesto (3,6 g, 7,78 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-1-(1) en DMF (36 ml), al que se añadió con enfriamiento con agua 60 % de hidruro de sodio (0,47 g, 11,67 mmoles), y la mezcla se agitó durante 10 minutos y luego durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se añadió 1-yododecano (3,3 ml, 15,56 mmoles) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se enfrió en un baño de agua con hielo, se añadió una disolución acuosa saturada de cloruro de amonio y se extrajo con n-heptano. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo) obteniéndose el compuesto del título (3,4 g, 5,64 mmoles). 1H-RMN(400MHz,CDCh)5(ppm): 0,83-0,93(m,3H), 1,05-1,36(m,26H), 1,44(s,18H), 1,57-1,68(m,2H), 1,71-1,82(m,4H), 2,29-2,39(m,2H), 5,11(s,2H), 7,28-7,42(m,5H).
(3) Síntesis de ácido 2-[9-(benciloxi)-9-oxononil]dodecanoico
Se disolvió el compuesto (3,4 g, 5,64 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-1 -(2) en cloruro de metileno (11,2 ml), al que se añadió gota a gota con enfriamiento con hielo TFA (5,6 ml), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Se añadió tolueno a la mezcla de reacción y el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se secó repitiendo la adición y retirada por destilación de tolueno doble para obtener un producto en bruto de ácido 2-{9-[(2-butiloctil)oxi]-9-oxononil}-2-decilmalónico. El producto en bruto obtenido se disolvió en xileno (12 ml) y se agitó a 150 °C durante 8 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna (n-heptano/acetato de etilo) obteniéndose el compuesto del título (2,26 g, 5,06 mmoles).
1H-RMN(400MHz,CDCla)5(ppm): 0,81-0,95(m,3H), 1,18-1,37(m,26H), 1,39-1,52(m,2H), 1,54-1,69(m,4H), 2,28­ 2,41 (m,3H), 5,11 (s,2H), 7,28-7,40(m,5H).
(4) Síntesis de 10-(hidroximetil)icosanoato de bencilo
Se disolvió el compuesto (2,2 g, 4,93 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-1-(3) en THF (25 ml), al que se añadió gota a gota a -15 °C el complejo de borano-THF (0,92, 8,0 ml, 7,39 mmoles), y la mezcla se agitó a 0 °C durante 2 horas. Se añadió una disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo) obteniéndose el compuesto del título (1,86 g, 4,30 mmoles).
1H-RMN(400MHz,CDCla)5(ppm): 0,81-0,95(m,3H), 1,12-1,38(m,31H), 1,39-1,50(m,1H), 1,58-1,72(m,2H), 2,23-2,36(m,2H), 3,48-3,59(m,2H), 5,11(s,2H), 7,28-7,41(m,5H).
(5) Síntesis de 10-{[(terc-butildimetilsilil)oxi]metil}icosanoato de bencilo
Se disolvió el compuesto (700 mg, 1,62 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-1-(4) en DMF (3,2 ml), al que se añadió imidazol (165 mg, 2,43 mmoles), y se disolvió a temperatura ambiente. Con enfriamiento con hielo, se añadió cloruro de terc-butildimetilsililo (293 mg, 1,94 mmoles) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Se añadió agua a la mezcla de reacción y entonces se extrajo con dietil éter. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo) obteniéndose el compuesto del título (810 mg, 1,48 mmoles).1
1H-RMN(400MHz,CDCl3)5(ppm): 0,02(s,6H), 0,77-0,97(m,12H), 1,06-1,47(m,31H), 1,64(s a,2H), 2,35(t,J=7,5Hz,2H), 3,45(d,J=5,7Hz, 2H), 5,11(s,2H), 7,27-7,42(m,5H).
(6) Síntesis de 10-{[(terc-butildimetilsilil)oxi]metil}icosanoato de 3-pentiloctilo
Se disolvió el compuesto (810 mg, 1,48 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-1-(5) en acetato de etilo (10 ml), al que se añadió a temperatura ambiente 10 % de paladio-carbono (158 mg, que contenía 50 % de agua), y la mezcla se agitó en una atmósfera de hidrógeno con presión normal durante 4,5 horas. La mezcla de reacción se filtró y se lavó con acetato de etilo. El filtrado se concentró a presión reducida obteniéndose un producto en bruto de ácido carboxílico (680 mg).
Se disolvieron el ácido carboxílico obtenido, 3-pentiloctan-1-ol (CAS 1443519-63-8) (416 mg, 2,08 mmoles) y DMAP (36 mg, 0,30 mmoles) en cloruro de metileno (7,4 ml), al que se añadió EDC-HCl (341 mg, 1,78 mmoles) con enfriamiento con hielo, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se añadió a una disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo) obteniéndose el compuesto del título (926 mg, 1,45 mmoles). 1H-RMN(400MHz,CDCh)5(ppm): 0,02(s,5H), 0,88(s,17H), 1,12-1,46(m,46H), 1,55(s,8H), 2,21-2,34(m,2H), 3,39-3,52(m,2H), 4,00-4,13(m,2H).
(7) Síntesis de 10-(hidroximetil)ioosanoato de 3-pentilootilo
Se disolvió el compuesto (925 mg, 1,45 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-1-(6) en THF (4,5 ml), al que se añadió gradualmente con enfriamiento con hielo disolución de TBAF/THF (1 M, 3,6 ml), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió agua a la mezcla de reacción y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo) obteniéndose el compuesto del título (584 mg, 1,11 mmoles).
1H-RMN(400MHz,CDCh)5(ppm): 0,78-0,99(m,9H), 1,26(d,J=2,9Hz,55H), 1,50-1,75(m,8H), 2,28(t,J=7,6Hz,2H), 3,53(s,2H), 4,08(t,J=7,0Hz,2H).
(8) Síntesis de 1-metilpirrolidin-3-oarboxilato de (3S)-2-{9-oxo-9-[(3-pentilootil)oxi]nonil}dodeoilo
Se disolvió el compuesto (50 mg, 0,095 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-1-(7), DIPEA (0,036 ml, 0,21 mmoles), clorhidrato de ácido (3S)-1 -metilpirrolidin-3-carboxílico (32 mg, 0,19 mmoles) y DMAP (2,3 mg, 0,019 mmoles) en cloruro de metileno (0,8 ml), al que se añadió con enfriamiento con hielo EDC-HCl (40 mg, 0,21 mmoles), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. La mezcla de reacción se añadió a una disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo/metanol) obteniéndose el compuesto del título (47 mg, 0,074 mmoles).
1H-RMN(400MHz,CDCh)5(ppm): 0,82-0,96(m,9H), 1,14-1,48(m,49H), 1,51-1,73(m,4H), 2,03-2,16(m,2H), 2,28(t,J=7,5Hz,2H), 2,35(s,3H), 2,49(d,J=9,0Hz,1H), 2,58-2,71(m,2H), 2,76-2,92(m,1H), 2,97-3,12(m,1H), 3,98(d,J=5,7Hz,2H), 4,08(s,2H).
<Síntesis de lípido oatiónioo (2)>
[Ejemplo A-2]
Síntesis de 1-metilpirrolidin-3-oarboxilato de (3R)-2-{9-oxo-9-[(3-pentilootil)oxi]nonil}dodeoilo (lípido oatiónioo 2)
Figure imgf000029_0001
(1) Síntesis de 3-(2-{9-oxo-9-[(3-pentilootil)oxi]nonil}dodeoil)pirrolidin-1,3-dioarboxilato de (3R)-1-tero-butilo Según el método en el Ejemplo A-1 -(8), el compuesto del título (80 mg, 0,11 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (60 mg, 0,11 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-1-(7), ácido (R)-1-(terc-butoxicarbonil)pirrolidin-3-carboxílico (49 mg, 0,23 mmoles), EDC-HCl (48 mg, 0,25 mmoles), DIPEA (0,039 ml, 0,23 mmoles), d Ma P (2,8 mg, 0,023 mmoles) y cloruro de metileno (0,80 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCl3)5(ppm): 0,88(t,J=7,0Hz,9H), 1,10-1,38(m,53H), 1,46(s,9H), 1,50-1,72(m,4H), 1,99-2,19(m,2H), 2,28(s,2H), 2,90-3,17(m,1H), 3,24-3,75(m,4H), 3,97-4,03(m,2H), 4,05-4,12(m,2H).
(2) Síntesis de l-metilpirrolidin-3-oarboxilato de (3R)-2-{9-oxo-9-[(3-pentilootil)oxi]nonil}dodeoilo
Se disolvió el compuesto (80 mg, 0,11 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-2-(1) en cloruro de metileno (2,2 ml), al que se añadió gota a gota a temperatura ambiente TFA (1,1 ml), y la mezcla se agitó durante 0,5 horas. A la mezcla de reacción se añadió tolueno, y el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se disolvió en cloruro de metileno (1 ml), al que se añadió a temperatura ambiente una disolución de formaldehído (37 %, 0,25 ml, 3,3 mmoles) y sulfato de sodio (0,79 g, 5,54 mmoles), y la mezcla se agitó durante 10 minutos. Se añadió tri(acetoxi)borohidruro de sodio (117 mg, 0,55 mmoles) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se añadió a una disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio y se extrajo con cloroformo. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (acetato de etilo/metanol) obteniéndose el compuesto del título (20 mg, 0,031 mmoles).
1H-RMN(400MHz,CDCh)5(ppm): 0,82-0,96(m,9H), 1,14-1,48(m,49H), 1,51-1,73(m,4H), 2,03-2,16(m,2H), 2,23-2,32(m,2H),, 2,35(s,3H), 2,49(d,J=9,0Hz,1H), 2,58-2,71(m,2H), 2,76-2,92(m,1H), 2,97-3,12(m,1H), 3,98(d,J=5,7Hz,2H), 4,04-4,12(m,2H).
<Síntesis de lípido oatiónioo (3)>
[Ejemplo A-3]
Síntesis de 1-metilpirrolidin-3-oarboxilato de 2-{9-oxo-9-[(3-pentilootil)oxi]nonil}dodeoilo (lípido oatiónioo 3)
Figure imgf000030_0001
(1) Síntesis de 1-metilpirrolidin-3-oarboxilato de 2-[9-(benoiloxi)-9-oxononil]dodeoilo
Se disolvió el compuesto (0,20 g,0,46 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-1-(4), DIPEA (0,161 ml, 0,92 mmoles) y clorhidrato de ácido 1 -metilpirrolidin-3-carboxílico (0,15 g, 0,92 mmoles) en cloruro de metileno (2,0 ml), al que se añadió EDC-HCl (0,19 g, 1,02 mmoles), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y el residuo se purificó entonces por cromatografía en columna de gel de sílice (acetato de etilo/metanol) obteniéndose el compuesto del título (0,15 g, 0,28 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,89(t,J=7,0Hz,3H), 1,27(s,40H), 1,61-1,67(m,3H), 1,74-1,86(m,1H), 2,07-2,13(m,2H), 2,34-2,38(m,6H), 2,47-2,52(m,1H), 2,61-2,66(m,2H), 2,85(t,J=8,8Hz,1H), 3,02-3,07(m,1H), 3,99(d,J=5,9Hz,2H), 5,08(s,1 H), 5,12(s,2H), 7,31-7,38(m,5H).
(2) Síntesis de 1-metilpirrolidin-3-oarboxilato de 2-{9-oxo-9-[(4-pentilnonil)oxi]nonil}dodeoilo
Según el Ejemplo A-1-(6), se obtuvo un producto en bruto de ácido carboxílico a partir del compuesto (0,15 g, 0,28 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-3-(1), 10 % de paladio/carbono (0,30 g, que contenía 50 % agua) y acetato de etilo (5 ml).
El compuesto del título (0,081 g, 0,14 mmoles) se obtuvo a partir del ácido carboxílico obtenido, el compuesto (0,048 g, 0,23 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 2-(4), EDC-HCl (0,086 g, 0,45 mmoles), DMAP (0,005 g, 0,05 mmoles) y cloruro de metileno (1,0 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3)5(ppm): 0,86-0,91(m,9H), 1,20-1,33(m,54H), 1,56-1,65(m,5H), 2,05-2,14(m,2H), 2,29(t,J=7,7Hz,2H), 2,36(s,3H), 2,50(c,J=7,7Hz,1H),2,60-2,67(m,2H), 2,86(t,J=8,8Hz,1H), 3,01-3,07(m,1 H), 3,99(d,J=5,9Hz,2H), 4,05(t,J=6,8Hz,2H), 4,52(d,J=4,8Hz,1 H), 5,30(s,1 H), 5,40(a d,J=4,0Hz,1 H), 5,47-5,53(m,1H). <Slntesis de lípido oatiónioo (4)>
[Ejemplo A-4]
Síntesis de 1-metilpirrolidin-3-oarboxilato de 2-nonil-11-oxo-11-[(3-pentilootil)oxi]undeoilo (lípido oatiónioo 4)
Figure imgf000031_0001
(1) Síntesis de 9-(3-pentilootil)nonano-1,1,9-trioarboxilato de 1,1 -di-tero-butilo
Se disolvió malonato de di-terc-butilo (1,20 g, 5,56 mmoles) en THF (26 ml), al que se añadió con enfriamiento con hielo 60 % de hidruro de sodio (0,22 g, 5,56 mmoles), y la mezcla se agitó durante 15 minutos. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos y entonces se añadió a una disolución del compuesto (2,22 g, 5,29 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 3 en THF (3 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas, se le añadió agua y se extrajo con dietil éter. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano/dietil éter) obteniéndose el compuesto del título (1,79 g, 3,39 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,89(t,J=7,2Hz,6H), 1,26(s a,12H), 1,27-1,34(m,13H), 1,46(s,13H), 1,48(s,8H), 1,54-1,64(m,5H), 1,79(a d,J=7,0Hz,2H), 2,28(t,J=7,5Hz,2H), 3,11(t,J=7,7Hz,1H), 3,19(s,1H), 3,41(s,1H), 4,08(t,J=7,2Hz,2H).
(2) Síntesis de 1-(3-pentilootil)ootadeoano-1,9,9-trioarboxilato de 9,9-di-tero-butilo
Se disolvió el compuesto (0,96 g,1,72 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-4-(1) en THF (7,6 ml), al que se añadió con enfriamiento con hielo 60 % de hidruro de sodio (0,076 g, 1,89 mmoles), y la mezcla se agitó durante 20 minutos. Después de agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos, se añadió una disolución de 1-yodononano (0,44 g, 1,72 mmoles) en THF (2 ml). Después del reflujo con calentamiento durante 6 horas, se añadió agua y se extrajo con dietil éter. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano/dietil éter) obteniéndose el compuesto del título (0,59 g, 0,86 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,83-0,94(m,12H), 1,13(s a,6H), 1,27(a d,J=16,5Hz,43H), 1,31-1,36(m,4H), 1,41-1,48(m,28H), 1,51 -1,65(m,5H), 1,70-1,85(m,6H), 2,22-2,34(m,2H), 4,02-4,15(m,2H).
(3) Síntesis de ácido 2-nonil-11-oxo-11-[(3-pentilootil)oxi]undeoanoioo
Según el método en el Ejemplo A-1 -(3), el compuesto del título (0,18 g, 0,35 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (0,59 g, 0,86 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-4-(2), cloruro de metileno (2 ml), TFA (1 ml) y xileno (2 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,84-0,92(m,9H), 1,17-1,33(m,42H), 1,36-1,51(m,4H), 1,54-1,66(m,6H), 2,24-2,37(m,3H), 4,09(t,J=7,2Hz,2H).
(4) Síntesis de 1Q-(hidroximetil)nonadeoanoato de 3-pentilootilo
Según el método en el Ejemplo de producción 2-(1), el compuesto del título (0,068 g, 0,14 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (0,093 g, 0,18 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-4-(3), complejo de borano-THF (1 M, 0,35 ml, 0,35 mmoles), complejo de borano-THF (1 M, 0,53 ml, 0,53 mmoles) y THF (2,0 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,87-0,90(m,10H), 1,27(a dd,J=11,4,7,3Hz,52H), 1,40-1,46(m,7H), 1,56-1,63(m,4H), 2,28(t,J=7,5Hz,2H), 3,53(d,J=5,5Hz,2H), 4,08(t,J=7,2Hz,2H).
(5) Síntesis de l-metilpirrolidin-3-oarboxilato de 2-nonil-11-oxo-11-[(3-pentilootil)oxi]undeoilo
Se disolvió el compuesto (0,069 g, 0,13 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-4-(4), DIPEA (0,047 ml, 0,27 mmoles), clorhidrato de ácido 1 -metilpirrolidin-3-carboxílico (0,044 g, 0,27 mmoles) y DMAP (3 mg, 0,03 mmoles) en cloruro de metileno (1 ml) y THF (1 ml), al que se añadió EDC-HCl (0,057 g, 0,30 mmoles), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y el residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (acetato de etilo/metanol) obteniéndose el compuesto del título (0,046 g, 0,072 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,89(t,J=7,0Hz,3H), 0,89(t,J=7,2Hz,6H), 1,19-1,33(m,46H), 1,41 (s a,1H), 1,58(c,J=7,0Hz,2H), 1,60-1,66(m,3H), 1,70(s a,1H), 2,07-2,17(m,2H), 2,29(t,J=7,5Hz,2H), 2,36(s,3H), 2,50(c,J=8,0Hz,1 H), 2,58-2,69(m,2H), 2,85(t,J=9,0Hz,1H), 3,05(tt,J=8,8,6,7Hz,1H), 3,99(d,J=5,9Hz,2H), 4,09(t,J=7,2Hz,2H).
<Síntesis de lípido oatiónioo (5)>
[Ejemplo A-5]
Síntesis de 1-metilpirrolidin-3-oarboxilato de 2-{6-[(3-ootilundeoil)oxi]-6-oxohexil}dodeoilo (lípido oatiónioo 5)
Figure imgf000032_0001
(1) Síntesis de 6-(3-ootilundeoil)hexano-1,1,6-trioarboxilato de 1,1-di-tero-butilo
Se suspendió en THF (21 ml) hidruro de sodio (60 %, 0,43 g, 10,62 mmoles), al que se añadió gota a gota con enfriamiento con hielo malonato de di-terc-butilo (2,4 ml, 10,6 mmoles). La mezcla se calentó hasta temperatura ambiente durante 30 minutos, se añadió el compuesto (4,67 g, 10,12 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 5 y yoduro de sodio (0,15 g, 1,01 mmoles) con enfriamiento con hielo y se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción se añadió a agua y se extrajo con dietil éter. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano/dietil éter) obteniéndose el compuesto del título (2,9 g, 5,10 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,88(t,J=7,0Hz,6H), 1,19-1,31(m,31H), 1,31-1,36(m,5H), 1,41-1,51(m,26H), 1,55-1,58(m,2H), 1,59-1,67(m,2H), 1,79(c,J=7,3Hz,2H), 2,27(t,J=7,5Hz,2H), 3,10(t,J=7,5Hz,1 H), 4,07(t,J=7,2Hz,2H). (2) Síntesis de 1-(3-ootilundeoil)hexadeoano-1,6,6-trioarboxilato de 6,6-di-tero-butilo
Según el método en el Ejemplo A-4-(2), el compuesto del título (0,99 g, 1,32 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (2,25 g, 3,78 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-5-(1), 1-yododecano (1,0 g, 3,78 mmoles), 60 % de hidruro de sodio (0,17 g, 4,15 mmoles) y THF (16,7 ml).1
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,01 (s,1 H), 0,89(td,J=7,1,2,8Hz,9H), 1,06-1,23(m,6H), 1,26(a d,J=7,0Hz,34H), 1,30-1,37(m,5H), 1,40(s a,1H), 1,42-1,49(m,18H), 1,52-1,65(m,6H), 1,71-1,85(m,4H), 2,28(t,J=7,5Hz,2H), 4,08(t,J=7,2Hz,2H).
(3) Síntesis de ácido 2-{6-[(3-octilundecil)oxi]-6-oxohexil}dodecanoico
Según el método en el Ejemplo A-1-(3), se obtuvo un producto en bruto (1,01 g) de ácido dicarboxílico a partir del compuesto (0,99 g, 1,34 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-5-(2), cloruro de metileno (3 ml) y TFA (1,4 ml). El compuesto del título (0,31 g, 0,55 mmoles) se obtuvo a partir del producto en bruto obtenido (0,84 g) y xileno (3 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,89(t,J=7,0Hz,11H), 1,23-1,36(m,60H), 1,40(s a,1H), 1,48(a dd,J=13,8,6,1Hz,2H), 1,56-1,66(m,7H), 2,29(t,J=7,5Hz,2H), 2,33-2,36(m,1H), 4,09(t,J=7,2Hz,2H).
(4) Síntesis de 7-(hidroximetil)heptadecanoato de 3-octilundecilo
Según el método en el Ejemplo de producción 2-(1), el compuesto del título (0,19 g, 0,33 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (0,31 g, 0,54 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-5-(3), complejo de borano-THF (1 M, 1,1 ml, 1,1 mmoles) y THF (6,0 ml). 1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,89(t,J=7,0Hz,10H), 1,22-1,37(m,55H), 1,40(s a,1H), 1,43-1,47(m,1 H), 1,57(c,J=6,6Hz,3H), 1,61 -1,70(m,2H), 2,29(t,J=7,5Hz,2H), 3,54(d,J=5,5Hz,2H), 4,09(t,J=7,2Hz,2H). (5) Síntesis de 1-metilpirrolidin-3-carboxilato de 2-{6-[(3-octilundecil)oxi]-6-oxohexil}dodecilo
Según el método en el Ejemplo A-4-(5), el compuesto del título (0,055 g, 0,083 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (0,19 g, 0,33 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-5-(4), clorhidrato de ácido 1 -metilpirrolidin-3-carboxílico (0,11 g, 0,67 mmoles), EDC-HCl (0,14 g, 0,73 mmoles), DIPEA (0,116 ml, 0,67 mmoles), DMAP (8 mg, 0,07 mmoles) y cloruro de metileno (1,5 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,89(t,J=7,0Hz,9H),1,20-1,34(m,53H),1,40(s a,1H), 1,57(c,J=6,8Hz,2H), 1,61-1,66(m,3H), 2,05-2,17(m,2H), 2,29(t,J=7,5Hz,2H), 2,37(s,3H), 2,45-2,56(m,1H), 2,64(dd,J=9,5,7,0Hz,1H), 2,68(dt,J=9,1,6,5Hz,1 H), 2,90(t,J=8,8Hz,1H), 3,06(quin,J=7,8Hz,1 H), 3,99(d,J=5,9Hz,2H), 4,08(t,J=7,2Hz,2H).
<Síntesis de lípido catiónico (6)>
[Ejemplo A-6]
Síntesis de 1-metilpirrolidin-3-carboxilato de 2-{4-[(4-noniltridecil)oxi]-4-oxobutil}dodecilo (lípido catiónico 6)
Figure imgf000033_0001
(1) Síntesis de 1,1 -di-terc-butil butano-1,1,4-tricarboxilato de 4-bencilo
Según el método en el Ejemplo A-4-(1), el compuesto del título (2,93 g, 7,46 mmoles) se obtuvo a partir de malonato de di-terc-butilo (2,65 g, 12,25 mmoles), THF (58 ml), 60 % de hidruro de sodio (0,49 g, 12,25 mmoles) y el compuesto (3,00 g, 11,67 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 6.
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 1,43-1,48(m,20H), 1,66-1,72(m,2H), 1,82-1,86(m,2H), 2,40(t,J=7,5Hz,2H), 3,13(t,J=7,5Hz,1 H), 5,12(s,2H), 7,31-7,38(m,5H).
(2) Síntesis de tetradecano-1,4,4-tricarboxilato de 1-bencil 4,4-di-terc-butilo
El compuesto (2,93 g, 7,46 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-6-(1) se disolvió en THF (38 ml), al que se añadió con enfriamiento con hielo 60 % de hidruro de sodio (0,31 g, 7,83 mmoles), y la mezcla se agitó durante 1 hora. Se añadió una disolución de 1-yododecano (2,10 g, 7,83 mmoles) en THF (5 ml) y se sometió a reflujo con calentamiento durante la noche. Se añadió agua y se extrajo con dietil éter. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (ciclohexano/dietil éter) obteniéndose el compuesto del título (2,59 g, 4,85 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCla)5(ppm): 0,89(t,J=7,2Hz,3H), 1,09-1,20(m,2H), 1,22-1,33(m,15H), 1,45(s,18H), 1,48-1,56(m,2H), 1,59(s,1H), 1,76-1,84(m,4H), 2,37(t,J=7,3Hz,2H), 5,12(s,2H), 7,32-7,38(m,5H).
(3) Síntesis de ácido 2-[4-(benoiloxi)-4-oxobutil]dodeoanoioo
Según el método en el Ejemplo A-1-(3), un producto en bruto (2,34 g) de ácido dicarboxílico se obtuvo a partir del compuesto (2,59 g, 4,87 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-6-(2), cloruro de metileno (11 ml) y TFA (5 ml). El compuesto del título (1,58 g, 4,21 mmoles) se obtuvo a partir del producto en bruto obtenido (2,05 g) y xileno (11 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCla)5(ppm): 0,89(t,J=7,0Hz,3H), 1,07-1,22(m,1H), 1,24-1,32(m,16H), 1,41-1,57(m,2H), 1,60-1,74(m,4H), 2,34-2,41 (m,3H), 5,10-5,15(m,2H), 7,31-7,40(m,5H).
(4) Síntesis de 1-metilpirrolidin-3-carboxilato de 2-{4-[(4-noniltridecil)oxi]-4-oxobutil}dodecilo
Según el método en el Ejemplo de producción 2-(1), el compuesto del título (1,29 g, 3,54 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (1,58 g, 4,21 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-6-(3), complejo de borano-THF (1 M, 8,4 ml, 8,4 mmoles) y THF (48 ml). 1H-RMN(600MHz,CDCla)5(ppm): 0,89(t,J=7,0Hz,3H), 1,24-1,34(m,22H), 1,35-1,42(m,2H), 1,46-1,50(m,1 H), 1,67(quin,J=7,7Hz,3H), 2,36-2,39(m,2H), 3,51-3,58(m,2H), 5,13(s,2H), 7,32-7,39(m,5H).
(5) Síntesis de 1-metilpirrolidin-3-carboxilato de 2-[4-(benciloxi)-4-oxobutil]dodecilo
Según el método en el Ejemplo A-4-(5), el compuesto del título (0,33 g, 0,71 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (0,50 g, 1,4 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-6-(4), clorhidrato de ácido 1 -metilpirrolidin-3-carboxílico (0,46 g, 2,76 mmoles), EDCHCl (0,58 g, 3,03 mmoles), DIPEA (0,48 ml, 2,76 mmoles), DMAP (34 mg, 0,28 mmoles) y cloruro de metileno (2 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3)5(ppm): 0,88(t,J=7,0Hz,3H), 1,23-1,36(m,23H), 1,42(s,5H), 1,63-1,69(m,3H), 1,85(dt,J=6,3,3,3Hz,1 H), 2,06-2,11(m,2H), 2,33-2,36(m,6H), 2,49(c,J=7,7Hz,1H), 2,59-2,64(m,2H), 2,82(t,J=8,8Hz,1H), 2,94(s,1H), 3,02(a t,J=8,3Hz,1H), 3,74(a t,J=6,2Hz,1H), 3,96-4,00(m,2H), 5,11(s,2H), 7,31-7,37(m,5H).
(6) Síntesis de 1-metilpirrolidin-3-carboxilato de 2-{4-[(4-noniltridecil)oxi]-4-oxobutil}dodecilo
Según el Ejemplo A-1 -(6), se obtuvo un producto en bruto (0,15 g) de ácido carboxílico a partir del compuesto (0,18 g, 0,37 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-6-(5), 10 % de paladio/carbono (0,20 g, que contenía 50 % agua) y acetato de etilo (9 ml).
El compuesto del título (9 mg, 0,014 mmoles) se obtuvo a partir del ácido carboxílico obtenido (0,086 g, 0,23 mmoles), el compuesto (0,050 g, 0,16 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 7-(7), EDCHCl (0,086 g, 0,45 mmoles), DIPEA (0,074 ml, 0,45 mmoles) y cloruro de metileno (1,0 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3)5(ppm): 0,89(t,J=7,0Hz,9H), 1,21-1,37(m,57H), 1,57-1,70(m,7H), 2,06-2,15(m,2H), 2,30(t,J=7,5Hz,2H), 2,36(s,3H), 2,45-2,57(m,1 H), 2,64(ddd,J=9,4,6,8,2,9Hz,2H), 2,85(t,J=8,8Hz,1 H), 3,00-3,08(m,1 H), 3,97-4,07(m,4H).
<Síntesis de lípido catiónico (7)>
[Ejemplo A-7]
Síntesis de 6-{[(1-metilpirrolidin-3-carbonil)oxi]metil}undecanodioato de bis(3-nonildodecilo) (lípido catiónico 7)
Figure imgf000035_0001
(1) Síntesis de pentano-1,1,5-trioarboxilato de 5-benoil-1,1-di-tero-butilo
Según el método en el Ejemplo A-4-(1), el compuesto del título (2,09 g, 5,77 mmoles) se obtuvo a partir de malonato de di-terc-butilo (2,34 g, 10,84 mmoles), THF (52 ml), 60 % de hidruro de sodio (0,26 g, 10,8 mmoles) y el compuesto (2,8 g, 10,3 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 8.
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 1,26-1,41(m,3H), 1,43-1,49(m,20H), 1,55-1,60(m,1H), 1,69(quin,J=7,6Hz,2H), 1,78-1,86(m,2H), 2,37(t,J=7,5Hz,2H), 3,11(t,J=7,5Hz,1H), 5,11(s,2H), 7,31-7,40(m,5H).
(2) Síntesis de nonano-1,5,5,9-tetraoarboxilato de 1,9-dibenoil-5,5-di-tero-butilo
El compuesto (2,09 g, 5,14 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-7-(1) se disolvió en THF (23 ml), al que se añadieron sucesivamente a temperatura ambiente 60 % de hidruro de sodio (0,23 g, 5,66 mmoles) y yoduro de sodio (0,077 g, 0,51 mmoles), y la mezcla se agitó durante 30 minutos. La mezcla de reacción se añadió a una disolución del compuesto (1,39 g, 5,14 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 8 en THF (2 ml) y se calentó a 65 °C. Después de 3 días, se añadió agua con hielo y se extrajo con dietil éter. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Tras la filtración, el disolvente se retiró mediante destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (dietil éter/n-pentano) obteniéndose el compuesto del título (2,27 g, 3,80 mmoles).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 1,13-1,20(m,4H), 1,42(s,17H), 1,58-1,70(m,4H), 1,74-1,80(m,4H), 2,35(t,J=7,6Hz,4H), 5,10(s,4H), 7,29-7,39(m,10H).
(3) Síntesis de ácido 7-(benoiloxi)-2-[5-(benoiloxi)-5-oxopentil]-7-oxopentanoioo
Según el método en el Ejemplo A-1-(3), se obtuvo un producto en bruto (2,02 g) de ácido dicarboxílico a partir del compuesto (2,27 g, 3,80 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-7-(2), cloruro de metileno (9 ml) y TFA (4,1 ml). El compuesto del título (1,47 g, 3,34 mmoles) se obtuvo a partir del producto en bruto obtenido y xileno (10 ml). 1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 1,27-1,41 (m,5H), 1,42-1,50(m,6H), 1,59-1,70(m,7H), 2,31 -2,40(m,5H), 5,12(s,4H), 7,31 -7,38(m,10H).
(4) Síntesis de 6-(hidroximetil)undeoanodioato de dibenoilo
Según el método en el Ejemplo de producción 2-(1), el compuesto del título (1,14 g, 2,70 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (1,47 g, 3,33 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-7-(3), complejo de borano-THF (1 M, 6,7 ml, 6,7 mmoles) y THF (38 ml). 1H-RMN(600MHz,CDCL)5(ppm): 1,24-1,38(m,10H), 1,42-1,47(m,3H), 1,65(quin,J=7,2Hz,4H), 1,71 (s a,1 H), 2,37(t,J=7,5Hz,4H), 3,50(a d,J=4,0Hz,2H), 5,12(s,4H), 7,31-7,39(m,7H).
(5) Síntesis de 6-{[(1-metilpirrolidin-3-oarbonil)oxi)metil]undeoanodioato de dibenoilo
Según el método en el Ejemplo A-4-(5), el compuesto del título (0,56 g, 1,05 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (1,14 g, 2,68 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-7-(4), clorhidrato de ácido 1 -metilpirrolidin-3-carboxílico (0,89 g, 5,36 mmoles), EDC-HCl (1,13 g, 5,90 mmoles), DIPEA (0,93 ml, 5,36 mmoles), DMAP (0,066 g, 0,54 mmoles) y cloruro de metileno (12 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 1,26-1,38(m,9H), 1,59-1,70(m,5H), 1,81 (s a,1H), 2,06-2,14(m,2H), 2,34-2,40(m,7H), 2,47-2,55(m,1H), 2,58-2,68(m,2H), 2,84(t,J=8,8Hz,1H), 3,04(quin,J=7,7Hz,1H), 3,98(d,J=5,9Hz,2H), 5,13(s,4H), 5,32(s,1H), 7,28(s,1H), 7,32-7,40(m,10H).
(6) Síntesis de 6-{[(1-metilpirrolidin-3-oarbonil)oxi)metil]undeoanodioato de bis(3-nonildodeoilo)
Según el Ejemplo A-1-(6), se obtuvo un producto en bruto (0,24 g) de ácido dicarboxílico a partir del compuesto (0,56 g, 1,03 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-7-(5), 10 % de paladio/carbono (0,55 g, que contenía 50 % agua) y acetato de etilo (27 ml).
El compuesto del título (0,029 g, 0,030 mmoles) se obtuvo a partir del ácido carboxílico obtenido (0,055 g, 0,15 mmoles), el compuesto (0,096 g, 0,31 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 7-(3), EDC-HCl (0,118 g, 0,62 mmoles), DIPEA (0,11 ml, 0,62 mmoles), DMAP (4 mg, 0,031 mmoles) y cloruro de metileno (0,7 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3)5(ppm): 0,88(t,J=7,0Hz,13H), 1,12-1,45(m,84H), 1,48-1,70(m,12H), 2,09(c,J=7,3Hz,2H), 2,28(t,J=7,6Hz,4H), 2,36(s,3H), 2,45-2,57(m,1H), 2,63(a dd,J=8,9,6,9Hz,2H), 2,83(a t,J=8,6Hz,1H), 3,03(quin,J=7,7Hz,1 H), 3,94-4,02(m,2H), 4,07(t,J=7,2Hz,4H).
<Síntesis de lípido oatiónioo (8)>
[Ejemplo A-8]
Síntesis de 9-{[(1 -metilpirrolidin-4-oarbonil)oxi]metil}heptadeoanodioato de bis(3-pentilootilo) (lípido oatiónioo 8)
Figure imgf000036_0001
(1) Síntesis de ootano-1,1,8-trioarboxilato de 8-benoil-1,1-di-tero-butilo
Según el método en el Ejemplo A-5-(1), el compuesto del título (1,60 g, 3,57 mmoles) se obtuvo a partir de malonato de di-terc-butilo (1,5 ml, 6,70 mmoles), el compuesto (2,0 g, 6,39 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 10, 60 % de hidruro de sodio (0,27 g, 6,70 mmoles), yoduro de sodio (0,096 g, 0,64 mmoles) y THF (60 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCl3)5(ppm): 1,23-1,36(m,8H), 1,45(s,18H), 1,58-1,69(m,2H), 1,72-1,84(m,2H), 2,30-2,40(m,2H), 3,05-3,15(m,1H), 5,11(s,2H), 7,28-7,41(m,5H).
(2) Síntesis de pentadeoano-1,8,8,15-tetraoarboxilato de 1,15-dibenoil-8,8-di-tero-butilo
Según el método en el Ejemplo A-7-(2), el compuesto del título (1,4 g, 2,07 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (1,6 g, 3,57 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-8-(1), el compuesto (1,17 g, 3,75 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 10, yoduro de sodio (0,053 g, 0,36 mmoles), 60 % de hidruro de sodio (0,16 g, 4,0 mmoles) y THF (15 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCh)ó(ppm): 1,03-1,17(m,4H), 1,23-1,36(m,12H), 1,43(s,18H), 1,56-1,68(m,4H), 1,70-1,80(m,4H), 2,29-2,38(m,4H), 5,11(s,4H), 7,27-7,41(m,10H).
(3) Síntesis de ácido 10-(benoiloxi)-2-[8-(benoiloxi)-8-oxoootil]-10-oxodeoanoioo
Según el método en el Ejemplo A-1-(3), se obtuvo un producto en bruto (1,17 g) de ácido dicarboxílico a partir del compuesto (1,40 g, 2,06 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-8-(2), cloruro de metileno (10 ml) y TFA(2,4 ml). El compuesto del título (0,83 g, 1,61 mmoles) se obtuvo a partir del producto en bruto obtenido y xileno (25 ml).
1 H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 1,18-1,37(m,16H), 1,38-1,71 (m,8H), 2,26-2,41 (m,5H), 5,11 (s,4H), 7,28-7,43(m,10H).
(4) Síntesis de 9-(hidroximetil)heptadeoanodioato de dibenoilo
Según el método en el Ejemplo de producción 2-(1), el compuesto del título (0,72 g, 1,43 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (0,83 g, 1,59 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-8-(3), un complejo de borano-THF (1 M, 4,0 ml, 4,0 mmoles) y THF (6,0 ml). 1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 1,12-1,51 (m,22H), 1,56-1,72(m,4H), 2,29-2,41 (m,4H), 3,47-3,58(m,2H),5,11 (s,4H), 7,28-7,44(m,10H).
(5) Síntesis de 9-{[(1-metilpirrolidin-3-oarbonil)oxi)metil]heptadeoanodioato de dibenoilo
Según el método en el Ejemplo A-4-(5), el compuesto del título (0,81 g, 1,30 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (0,73 g, 1,43 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-8-(4), clorhidrato de ácido 1 -metilpirrolidin-3-carboxílico (0,36 g, 2,14 mmoles), EDC-HCl (0,438 g, 2,29 mmoles), DIPeA (0,37 ml, 2,14 mmoles), DMAP (0,035 g, 0,29 mmoles) y cloruro de metileno (6 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 1,13-1,35(m,22H), 1,58-1,69(m,5H), 2,04-2,14(m,2H), 2,29-2,39(m,7H), 2,43-2,54(m,1 H), 2,57-2,67(m,2H), 2,84(t,J=8,8Hz,1 H), 2,99-3,08(m,1 H), 3,97(d,J=5,7Hz,2H), 5,11 (s,4H), 7,29-7,40(m,9H).
(6) Síntesis de 9-{[(1-metilpirrolidin-3-oarbonil)oxi)metil]heptadeoanodioato de bis(3-hexilnonilo)
Según el Ejemplo A-1-(6), se obtuvo un producto en bruto (0,66 g) de ácido dicarboxílico a partir del compuesto (0,81 g, 1,30 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-8-(5), 10 % de paladio/carbono (0,028 g, que contenía 50 % de agua) y acetato de etilo (15 ml).
El compuesto del título (0,077 g, 0,090 mmoles) se obtuvo a partir del ácido dicarboxílico obtenido (0,10 g, 0,23 mmoles), el compuesto (0,124 g, 0,54 mmoles) obtenido en el Ejemplo de producción 9-(2), EDC-HCl (0,113 g, 0,59 mmoles), DIPEA (0,10 ml, 0,59 mmoles), DMAP (6 mg, 0,050 mmoles) y cloruro de metileno (5 ml).
1H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,88(t,J=7,0Hz,13H), 1,18-1,35(m,64H), 1,37-1,42(m,2H), 1,52-1,66(m,9H), 2,06-2,13(m,2H), 2,25-2,32(m,4H), 2,36(s,3H), 2,45-2,53(m,1H), 2,59-2,66(m,2H), 2,85(t,J=8,8Hz,1H), 3,00-3,08(m,1H), 3,98(d,J=5,9Hz,2H), 4,08(t,J=7,1 Hz,4H).
<Síntesis de lípido oatiónioo (9)>
[Ejemplo A-9]
Síntesis de 9-{[(1 -metilpirrolidin-3-oarbonil)oxi]metil}heptadeoanodioato de bis(3-pentilootilo) (lípido oatiónioo 9)
Figure imgf000037_0001
Según el Ejemplo A-1-(6), el compuesto del título (0,089 g, 0,11 mmoles) se obtuvo a partir del ácido dicarboxílico (0,10 g, 0,23 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-8-(6), 3-pentiloctan-1-ol (Ca s 1443519-63-8) (0,11 g, 0,54 mmoles), EDC-HCl (0,11 g, 0,59 mmoles), DIPEA (0,10 ml, 0,59 mmoles), DMAP (6 mg, 0,050 mmoles) y cloruro de metileno (5 ml). 1 H-RMN(600MHz,CDCh)5(ppm): 0,88(t,J=7,2Hz,13H), 1,17-1,34(m,56H), 1,37-1,43(m,2H), 1,53-1,69(m,10H), 2,06-2,14(m,2H), 2,28(t,J=7,5Hz,4H), 2,36(s,3H), 2,45-2,53(m,1H), 2,58-2,66(m,2H), 2,84(t,J=8,9Hz,1H), 3,00-3,08(m,1 H), 3,98(d,J=5,7Hz,2H), 4,08(t,J=7,1Hz,4H).
<Síntesis de lípido oatiónioo (10)>
[Ejemplo comparativo A'-1]
Síntesis de 1-metilazepano-4-oarboxilato de 2-{9-oxo-9-[(3-pentilootil)oxi]nonil}dodeoilo (lípido oatiónioo 10)
Figure imgf000038_0001
(1) Síntesis de 4-(2-{9-oxo-9-[(3-pentiloctil)oxi]nonil}dodecil)azepano-1,4-dicarboxilato de 1-tero-butilo Según el método en el Ejemplo A-1 -(8), el compuesto del título (81 mg, 0,11 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (60 mg, 0,11 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-1-(7), ácido 1-(terc-butoxicarbonil)azepano-4-carboxílico (56 mg, 0,23 mmoles), EDC-HCl (48 mg, 0,25 mmoles), DIPEA (0,039 ml, 0,23 mmoles), DMAP (2,8 mg, 0,023 mmoles) y cloruro de metileno (0,80 ml).
(2) Síntesis de 1-metilazepano-4-carboxilato de 2-{9-oxo-9-[(3-pentiloctil)oxi]nonil}dodecilo
Según el método en el Ejemplo A-2-(2), el compuesto del título (51 mg, 0,077 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (81 mg, 0,11 mmoles) obtenido en el Ejemplo comparativo A'-1 (1), TFA (1,1 ml), THF (1 ml), una disolución de formaldehído (37 %, 0,080 ml, 1,1 mmoles), sulfato de sodio (460 mg, 3,23 mmoles) y tri(acetoxi)borohidruro de sodio (69 mg, 0,32 mmoles).
1H-RMN(400MHz,CDCb)5(ppm): 0,88(t,J=7,0Hz,9H), 1,14-1,49(m,49H), 1,51-1,71 (s,4H), 1,73-2,10(m,5H), 2,23­ 2,31 (m,2H), 2,34(s,3H), 2,45-2,76(m,5H), 3,92-3,98(m,2H), 4,03-4,12(m,2H).
<Síntesis de lípido catiónico (11)>
[Ejemplo comparativo A'-2]
Síntesis de 9-bromononanoato de 2-butiloctilo (lípido catiónico 11)
Figure imgf000038_0002
Según el método en el Ejemplo A-1 -(8), el compuesto del título (30 mg, 0,048 mmoles) se obtuvo a partir del compuesto (50 mg, 0,095 mmoles) obtenido en el Ejemplo A-1-(7), ácido 1-metil-3-azetidincarboxílico (22 mg, 0,19 mmoles), EDC-HCl (40 mg, 0,21 mmoles), DIPEA (0,033 ml, 0,19 mmoles), DMAP (2,3 mg, 0,019 mmoles) y cloruro de metileno (0,80 ml).
1H-RMN(400MHz,CDCh)5(ppm): 0,88(t,J=6,9Hz,9H), 1,14-1,47(m,44H), 1,61(s,8H), 2,30(s,5H), 3,26(s,3H), 3,46-3,64(m,2H), 3,99(d,J=5,9Hz,2H), 4,08(t,J=7,1Hz,2H).
Los lípidos catiónicos sintetizados 1 a 11 se indican en la Tabla A que sigue.
Tabla A: Lípidos catiónicos sintetizados 1 a 11
Figure imgf000038_0003
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000041_0001
B. Preparación y análisis de composiciones
<Preparación de composiciones (1)>
[Ejemplo B-1]
Se preparó una composición con el lípido catiónico 1 del Ejemplo A-1. Como ácido nucleico, se usó ARNip hibridado (GeneDesign Inc., en lo sucesivo también denominado "ARNip del factor VII") que silencia la expresión del gen del factor VII (factor de coagulación VII de la sangre) y consiste en una hebra codificante que tiene una secuencia de bases: 5'-GGAfUfCAfUfCfUfCAAGfUfCfUfUAfCTT-3' (T: ADN, fU, fC= 2'-fluoro-ARN, *= enlace fosforotioato) (SEQ ID NO: 1) y una hebra no codificante que tiene una secuencia de bases: 5'-GfUAAGAfCfUfUGAGAfUGAfUfCfCTT-3' (T: ADN, fU, fC= 2'-fluoro-ARN, *= enlace fosforotioato) (SEQ ID NO: 2).
Se disolvió ARNip del factor VII en disolución acuosa 25 mM de acetato sódico (pH 4,0) a 80 pg/ml para obtener una disolución diluida de ARNip. Se disolvieron el lípido catiónico 1, DSPC (Nippon Fine Chemical Co., Ltd.), colesterol (Nippon Fine Chemical Co., Ltd.), MPEG2000-DMG (NOF Corporation, metoxi(polietilenglicol, peso molecular=2000)-dimiristilglicerol) en etanol en una relación de 60/8,5/30/1,5 (relación molar) de manera que la concentración de lípido total se estableciera en 7,2 mM, y luego se obtuvo una disolución de lípidos. La disolución diluida de ARNip y la disolución de lípido se alimentaron y se mezclaron en caudales de 3 ml/min y 1 ml/min, respectivamente, para obtener una disolución acuosa de complejo de lípido. La disolución acuosa de complejo de lípido obtenida se sometió a diálisis usando una membrana de diálisis (nombre de producto "Float-A-Lyzer G2", SPECTRUM, Inc., 100K MWCO) para sustituir la disolución externa con tampón fosfato (PBS, pH 7,4). Después de realizarse la diálisis, la concentración y la esterilización por filtración, se obtuvo así una composición líquida del Ejemplo B-1.
[Ejemplo B-2]
Se obtuvo una composición del Ejemplo B-2 del mismo modo que en el Ejemplo B-1, excepto que como lípido catiónico se usó el lípido catiónico 2 del Ejemplo A-2 en lugar del lípido catiónico 1.
[Ejemplo comparativo B'-1]
Se obtuvo una composición del Ejemplo comparativo B'-1 del mismo modo que en el Ejemplo B-1, excepto que como lípido catiónico se usó el lípido catiónico 10 del Ejemplo comparativo A'-1 en lugar del lípido catiónico 1.
[Ejemplo comparativo B'-2]
Se obtuvo una composición del Ejemplo comparativo B'-2 del mismo modo que en el Ejemplo B-1, excepto que como lípido catiónico se usó el lípido catiónico 11 del Ejemplo comparativo A'-2 en lugar del lípido catiónico 1.
<Análisis de composiciones (1)>
En las composiciones del Ejemplo B-1, Ejemplo B-2, Ejemplo comparativo B'-1 y Ejemplo comparativo B'-2, se midió la tasa de encapsulación de ARNip en complejos de lípido.
Específicamente, se estableció la concentración de ARNip (A) medida con el reactivo de ARN Quant-iT RiboGreen (Invitrogen) después de diluir una composición con agua sin RNasa como la concentración de ARNip presente en la disolución externa del complejo de lípido. La concentración de ARNip (B) medida después de diluir la composición con 1 % de Triton X-100 se estableció como la concentración de ARNip total en la composición. A continuación, según la fórmula (F1) que sigue, se calculó la tasa de encapsulación del ácido nucleico.
Tasa de encapsulación (%) = 100 -(A/B) * 100 (Fl)
Se midió el diámetro de partículas promedio de los complejos de lípido usando un analizador del diámetro de partículas (nombre de producto "Zetasizer Nano ZS", producido por Malvern Panalytical Ltd.).
La Tabla 1 muestra la tasa de encapsulación de ARNip y el diámetro de partículas promedio (promedio Z) y el índice de polidispersión de los complejos de lípido.
Tabla 1
Figure imgf000042_0001
Se confirma que las composiciones del Ejemplo B-1 y Ejemplo B-2 presentan elevadas altas de encapsulación de ARNip, equivalentes a las de las composiciones del Ejemplo comparativo B'-1 y Ejemplo comparativo B'-2.
<Preparación de composiciones (2)>
[Ejemplo B-3]
Se obtuvo una composición del Ejemplo B-3 del mismo modo que en el Ejemplo B-1 en la preparación de la composición (1), excepto que como lípido catiónico se usó el lípido catiónico 3 del Ejemplo A-3 en lugar del lípido catiónico 1.
[Ejemplo B-4]
Se obtuvo una composición del Ejemplo B-4 del mismo modo que en el Ejemplo B-3, excepto que como lípido catiónico se usó el lípido catiónico 4 del Ejemplo A-4 en lugar del lípido catiónico 3.
[Ejemplo B-5]
Se obtuvo una composición del Ejemplo B-5 del mismo modo que en el Ejemplo B-3, excepto que como lípido catiónico se usó el lípido catiónico 5 del Ejemplo A-5 en lugar del lípido catiónico 3.
[Ejemplo B-6]
Se obtuvo una composición del Ejemplo B-6 del mismo modo que en el Ejemplo B-3, excepto que como lípido catiónico se usó el lípido catiónico 6 del Ejemplo A-6 en lugar del lípido catiónico 3.
[Ejemplo B-7]
Se obtuvo una composición del Ejemplo B-7 del mismo modo que en el Ejemplo B-3, excepto que como lípido catiónico se usó el lípido catiónico 7 del Ejemplo A-7 en lugar del lípido catiónico 3.
[Ejemplo B-8]
Se obtuvo una composición del Ejemplo B-8 del mismo modo que en el Ejemplo B-3, excepto que como lípido catiónico se usó el lípido catiónico 8 del Ejemplo A-8 en lugar del lípido catiónico 3.
[Ejemplo B-9]
Se obtuvo una composición del Ejemplo B-9 del mismo modo que en el Ejemplo B-3, excepto que como lípido catiónico se usó el lípido catiónico 9 del Ejemplo A-9 en lugar del lípido catiónico 3.
[Ejemplo B-10]
Se obtuvo una composición del Ejemplo B-10 del mismo modo que en el Ejemplo B-3, excepto que como lípido catiónico se usó el lípido catiónico 1 del Ejemplo A-1 en lugar del lípido catiónico 3.
[Ejemplo comparativo B'-3]
Se obtuvo una composición del Ejemplo comparativo B'-3 del mismo modo que el Ejemplo B-3, excepto que como lípido catiónico se usó el 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-nonan-2-en-1-ilo) (en lo sucesivo también denominado "ALN-319") representado por la fórmula (i) desvelado a continuación en la Literatura de patentes 2 que se sintetizó según el método desvelado en la Literatura de patentes 2, en lugar del lípido catiónico 3.
Figure imgf000043_0001
<Análisis de composiciones (2)>
Del mismo modo que en el análisis de composiciones (1), se midieron la tasa de encapsulación de ARNip en complejos de lípido y el diámetro de partículas promedio de complejos de lípido para las composiciones del Ejemplo B-3 a Ejemplo B-10 y Ejemplo comparativo B'-3. La Tabla 2 muestra la tasa de encapsulación de ARNip y el diámetro de partículas promedio (promedio Z) y el índice de polidispersión de los complejos de lípido.
Tabla 2
Figure imgf000043_0002
<Análisis de composiciones (4)>
Las composiciones del Ejemplo B-3 a Ejemplo B-9 y Ejemplo comparativo B'-3 se guardaron además en viales sellados a 4 °C durante 1,5 meses y se midió el diámetro de partículas promedio (diámetro de partículas promedio post­ almacenamiento) de los complejos de lípido del mismo modo que en el análisis de composiciones (1). La Tabla 3 muestra el cambio en el diámetro de partículas promedio (promedio Z) de complejos de lípido. En la tabla, el cambio (%) en el diámetro de partículas promedio se calculó por el diámetro de partículas promedio postalmacenamiento/diámetro de partículas promedio pre-almacenamiento x 100.
Tabla 3
Figure imgf000043_0003
Figure imgf000044_0001
Se demostró que las composiciones del Ejemplo B-3 a Ejemplo B-9 casi no tuvieron cambio en los diámetros de partículas promedio después de un almacenamiento durante 1,5 meses y fueron físicamente más estables que la composición del Ejemplo comparativo B'-3. Este resultado indica que el lípido catiónico de la presente invención puede minimizar un aumento en el diámetro de partículas del complejo de lípido después de un almacenamiento durante un cierto periodo de tiempo.
C. Ejemplos de prueba
[Ejemplo de prueba 1]
Se diluyeron las composiciones del Ejemplo B-1, Ejemplo B-2, Ejemplo comparativo B'-1 y Ejemplo comparativo B'-2 con PBS de manera que la concentración de ARNip del factor VII encapsulado en los complejos de lípido fuera 3 o 30 pg/ml. Las composiciones se administraron a ratones ICR (n=3) por la vena de la cola en una dosis de 10 ml/kg, y la sangre se recogió con anestesia 1 día después de la administración. El plasma se separó de la sangre por centrifugación y se ensayó la concentración de proteína del factor VII en el plasma usando un kit comercialmente disponible (nombre de producto "BIOPHEN FVII", HYPHEN BioMed). Como control negativo, se llevó a cabo el mismo tratamiento en un grupo al que se administró PBS.
Cuando se estableció al 100 % la concentración de proteína del factor VII del grupo al que se administró PBS (control negativo), se calculó la concentración de proteína del factor VII de los grupos a los que se administraron las composiciones como un valor relativo. Los resultados se muestran en la Fig. 1 y la Tabla 4.
Tabla 4
Figure imgf000044_0002
Se confirma que las composiciones del Ejemplo B-1 y Ejemplo B-2 tienen mayor efecto inhibidor sobre la expresión de proteínas del factor VII que las composiciones del Ejemplo comparativo B'-1 y Ejemplo comparativo B'-2. Este resultado indica que las composiciones de los ejemplos liberan eficazmente los ácidos nucleicos en el citoplasma.
[Ejemplo de prueba 2]
Del mismo modo que en el Ejemplo de prueba 1, las composiciones del Ejemplo B-3 al Ejemplo B-10 y Ejemplo comparativo B'-3 se administraron a ratones ICR (n=3) y se calculó el valor relativo de la concentración de proteína del factor VII en el plasma 1 día después de administración estableciendo como el 100 % la concentración de proteína del factor VII en el grupo al que se administró PBS (control negativo). Los resultados se muestran en la Fig. 2 y la Tabla 5.
Tabla 5
Figure imgf000045_0001
Los resultados en los Ejemplos de prueba 1 y 2 muestran que las composiciones de los ejemplos pueden liberar ácidos nucleicos en el citoplasma.
Los resultados en los Ejemplos de prueba 1 y 2 también indican que las composiciones del Ejemplo B-1, Ejemplo B-2, Ejemplo B-3, Ejemplo B-4, Ejemplo B-5, Ejemplo B-6, Ejemplo B-8, Ejemplo B-9 y Ejemplo B-10 (lípidos catiónicos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 y 9) tienen un excelente efecto inhibidor de la expresión de proteínas del factor VII (particularmente cuando la dosis de ARNip es relativamente alta). Se confirma de los resultados que las composiciones liberan eficazmente los ácidos nucleicos en el citoplasma.
Los resultados en los Ejemplos de prueba 1 y 2 también indican que las composiciones del Ejemplo B-1, Ejemplo B-2, Ejemplo B-3, Ejemplo B-4, Ejemplo B-5, Ejemplo B-6, Ejemplo B-9 y Ejemplo B-10 (lípidos catiónicos 1,2, 3, 4, 5, 6 y 9) inhibieron la expresión de proteínas del factor VII incluso cuando la dosis de ARNip fue baja. Se confirma de los resultados que las composiciones liberan eficazmente los ácidos nucleicos en el citoplasma.
Particularmente, las composiciones del Ejemplo B-1, Ejemplo B-2, Ejemplo B-4, Ejemplo B-6 y Ejemplo B-10 (lípidos catiónicos 1,2, 4 y 6) tienen un mayor efecto inhibidor de la expresión de proteínas del factor VII que la composición del Ejemplo comparativo B'-3. Se sugiere que las composiciones pueden liberar más eficazmente los ácidos nucleicos en el citoplasma.
De los resultados anteriores, según el lípido catiónico de una realización de la presente invención, es posible liberar eficazmente ácidos nucleicos en el citoplasma. Además, según el lípido catiónico de una realización de la presente invención, es posible minimizar un aumento en el diámetro de partículas de los complejos de lípido después de un almacenamiento durante un cierto periodo de tiempo.

Claims (14)

r e iv in d ic a c io n e s
1. Un compuesto representado por la fórmula (1) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000048_0001
en donde L1 y L2 representan independientemente un grupo alquileno que tiene 3 a 10 átomos de carbono; R1 y R2 representan independientemente un grupo alquilo que tiene 4 a 24 átomos de carbono o un grupo alquenilo que tiene 4 a 24 átomos de carbono; R3 representa un grupo alquilo que tiene 1 a 3 átomos de carbono; y X1 representa un enlace sencillo o CO-O-.
2. El compuesto según la reivindicación 1 seleccionado del grupo que consiste en compuestos representados por las fórmulas (A1) a (A9) que siguen, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000048_0002
Figure imgf000049_0001
3. El compuesto según la reivindicación 1 o 2 representado por la fórmula (A1) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000049_0002
4. El compuesto según la reivindicación 1 o 2 representado por la fórmula (A2) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000049_0003
5. El compuesto según la reivindicación 1 o 2 representado por la fórmula (A3) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000050_0001
6. El compuesto según la reivindicación 1 o 2 representado por la fórmula (A4) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000050_0002
7. El compuesto según la reivindicación 1 o 2 representado por la fórmula (A5) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000050_0003
8. El compuesto según la reivindicación 1 o 2 representado por la fórmula (A6) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000050_0004
9. El compuesto según la reivindicación 1 o 2 representado por la fórmula (A7) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000051_0001
10. El compuesto según la reivindicación 1 o 2 representado por la fórmula (A8) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000051_0002
11. El compuesto según la reivindicación 1 o 2 representado por la fórmula (A9) que sigue, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000051_0003
12. Un complejo de lípido que comprende:
(I) el compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y
(II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol.
13. Una composición que comprende:
(I) el compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol; y
(III) un ácido nucleico.
14. Un método de producción de una composición, comprendiendo el método:
la etapa de mezclar una disolución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar que contiene (I) el compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y (II) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido modificado con polietilenglicol y un esterol con una disolución acuosa que contiene (III) un ácido nucleico para obtener una disolución mixta; y
la etapa de reducir el porcentaje de contenido del disolvente orgánico polar en la disolución mixta.
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