ES2226932T3 - Lipido cationico neutro destinado a la aportacion de acidos nucleicos y de farmacos. - Google Patents

Lipido cationico neutro destinado a la aportacion de acidos nucleicos y de farmacos.

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ES2226932T3 ES00970729T ES00970729T ES2226932T3 ES 2226932 T3 ES2226932 T3 ES 2226932T3 ES 00970729 T ES00970729 T ES 00970729T ES 00970729 T ES00970729 T ES 00970729T ES 2226932 T3 ES2226932 T3 ES 2226932T3
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Abstract

Lípido que presenta la fórmula: en la que cada uno de R1 y R2 es independientemente una cadena de alquilo o alquenilo que presenta entre 8 y 24 átomos de carbono; n=0-20; L se selecciona de entre el grupo que consiste en (i) ¿X- (C=O)-Y-, (ii) ¿X-(C=O)-, e (iii) ¿X-, donde X e Y se seleccionan independientemente de entre oxígeno, NH y una unión directa; y Z es una fracción que presenta un pK inferior a 7, 4 y superior a 4, 0 y se trata de una fracción imidazol, una amina aromática o un aminoazúcar.

Description

Lípido catiónico neutro destinado a la aportación de ácidos nucleicos y de fármacos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un lípido que presenta una fracción que responde al pH de manera que el lípido es esencialmente neutro a pH fisiológico, y presenta una carga predominantemente positiva a un pH inferior al fisiológico. La invención se refiere asimismo a una composición liposomal preparada con el lípido.
Antecedentes de la invención
La transmisión de materiales biológicamente activos a células es un componente esencial de una gran variedad de terapias. Tales terapias incluyen suministrar a una célula una proteína que presente una actividad biológica necesaria, proporcionar una molécula de ácido nucleico (es decir, ADN, ARN, ADNc) a una célula (terapia génica), inmunizar un sujeto contra una proteína foránea (vacunación), inmunizar a un sujeto contra una proteína foránea mediante la introducción de un gen que codifica la proteína (vacunación génica), e inhibir la producción de una proteína en una célula proporcionando a la célula una molécula de ácido nucleico en antisentido, es decir, complementaria, a un ARNm que codifica la proteína o interfiriendo de alguna manera con el ARNm que codifica la proteína.
Sin embargo, existen varios obstáculos para la aportación de tales agentes a una célula, incluyendo el hecho de que la bicapa fosfolipídica que contiene la membrana externa de la mayoría de células prohíbe la entrada indiscriminada de materiales a la célula. Entre los enfoques descritos para introducir agentes activos en las células se incluyen, por ejemplo, la microinyección y electroporación. Otros enfoques implican la vectores virales y la introducción por medios químicos.
Otro enfoque para la aportación de agentes activos a las células, descrito en la técnica, es la aportación basada en liposomas. En particular, la aportación de material genético a las células utilizando liposomas ha sido ampliamente estudiada. Se entiende generalmente que las vesículas liposomales son incorporadas por las células vía endocitosis y entran en la ruta de degradación lisosomal. Así, se han dedicado algunos esfuerzos al diseño de liposomas que eviten la degradación. Un enfoque ha consistido en introducir en el liposoma un lípido sensible al pH, tal como palmitoilhomocisteína (Connor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 1715 (1984); Chu y Szoka, J. Liposome Res. 4(1): 361 (1994)). Tales lípidos sensibles al pH se encuentran cargados negativamente a pH neutro y se incorporan de forma estable en las bicapas lipídicas de los liposomas. Sin embargo, a un pH débilmente ácido (pH inferior a aproximadamente 6,8) el lípido adquiere carga neutra y se producen cambios en su estructura suficientes para desestabilizar las bicapas del liposoma. El lípido, cuando se incorpora en un liposoma que ha sido incorporado en un endosoma, donde se ha descrito que el pH se encuentra entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,0, se desestabiliza y causa una expulsión del contenido del liposoma.
También se ha informado ampliamente sobre la utilización de lípidos catiónicos, p. ej. derivados de glicolípidos con un amonio cargado positivamente o un grupo de cabeza que contiene un ión sulfonio, para la aportación de biomoléculas cargadas negativamente, tales como oligonucleótidos o fragmentos génicos, como componentes de la bicapa lipídica del liposoma. El grupo de cabeza del lípido cargado positivamente interacciona con la superficie celular cargada negativamente, facilitando el contacto y la aportación de la biomolécula a la célula.
A pesar de estos esfuerzos, la aportación de biomoléculas a las células, tales como oligonucleótidos y otros materiales, aún no es posible en la técnica. La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para mejorar la transferencia de un agente, tal como un ácido nucleico, a las células.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una composición liposomal para la aportación de un agente a una célula.
La invención proporciona asimismo un lípido para su utilización en una composición liposomal para la aportación de un agente a una célula.
En un aspecto, la invención incluye una composición liposomal que contiene un lípido representado por la fórmula:
1
en la que cada uno de R^{1} y R^{2} es una cadena de alquilo o alquenilo que presenta entre aproximadamente 8 y aproximadamente 24 átomos de carbono; n=1-20; L se selecciona de entre el grupo que consiste en (i) -X-(C=O)-Y-, (ii) -X-(C=O)-, y (iii) -X-, donde X e Y se seleccionan independientemente de entre oxígeno, NH y una unión directa; y Z es una fracción que presenta un pK inferior a aproximadamente 7,4 y superior a aproximadamente 4,0 y se trata de una fracción imidazol, una amina aromática o un aminoazúcar.
En una forma de realización específica, X es NH e Y es oxígeno. En otras formas de realización, L es un enlace carbamato (NH-(C=O)-O-CH_{2}), un enlace éster o un enlace carbonato. En una forma de realización preferida, Z es un imidazol. Preferentemente, R^{1} y R^{2} son una cadena alquilo o alquenilo no ramificada que presenta entre aproximadamente 8 y aproximadamente 24 átomos de carbono, y en una forma de realización preferida, R^{1} y R^{2} son cada uno grupos estearilo (C_{17}H_{35}). En otra forma de realización preferida, n se encuentra comprendida entre 1 y 10.
Los liposomas, en una forma de realización, incluyen entre aproximadamente un 1 y aproximadamente un 80 de porcentaje molar del lípido que presenta la fórmula mostrada anteriormente.
En otra forma de realización, Z es una fracción que presenta un valor de pK comprendido entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,5.
En una forma de realización preferida, los liposomas que presentan el lípido representado por la fórmula anterior incluyen un compuesto terapéutico atrapado en los liposomas. En una forma de realización, el agente terapéutico es un ácido nucleico, tal como ADN, ARN o fragmentos de los mismos. Los liposomas también pueden incluir un ligando para dirigir los liposomas a un sitio diana, tal como un ligando que presenta afinidad de unión para células tumorales endoteliales y que resulta internalizado por tales células, tal como E-selectina, Her-2 y FGF.
En otra forma de realización, los liposomas incluyen entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 moles por ciento de un lípido formador de vesículas derivatizado con una cadena polimérica hidrofílica. En una forma de realización preferida la cadena polimérica hidrofílica es polietilenglicol (PEG).
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra un esquema de síntesis para la preparación de un lípido que presenta un enlace carbamato y un grupo Z imidazol;
Las figuras 2A-2D muestran unos esquemas de reacción de síntesis para la preparación de lípidos que responden al pH;
Las figuras 3A-3D muestran varias estructuras de lípidos que responden al pH;
La figura 4 es un gráfico que muestra el potencial zeta, en mV, en función del pH del medio para liposomas preparados con el lípido de la invención (triángulos abiertos), un lípido catiónico (diamantes cerrados) y un lípido neutro (cuadrados cerrados);
La figura 5 es una micrografia de un gel de electroforesis de liposomas preparados con el lípido que responde al pH de la invención que tiene ADN atrapado, donde los liposomas se expusieron a DNAsa I durante 30 minutos (carril 1); liposomas preparados con el lípido que responde al pH de la invención que tiene ADN atrapado (carril 2); ADN expuesto a DNAsa I durante 30 minutos (carril 3); ADN (carril 4); marcador de ADN de 1 kB (carril 5); y
Las figuras 6A-6D son imágenes de células tumorales de pulmón humano in vitro después de la transfección con liposomas preparados con el lípido que responde al pH de la presente invención y un anticuerpo específico. Los liposomas incluyen un plásmido atrapado que codifica para la proteína fluorescente verde, donde la figura 6A muestra las células transfectadas observadas con un microscopio de fluorescencia y la figura 6B muestra las células transfectadas observadas con un microscopio óptico. Las figuras 6C-6D son micrografías de las células después de la transfección con liposomas similares que no presentan el anticuerpo específico, donde las células después de la incubación con los liposomas se muestran bajo un microscopio de fluorescencia en la figura 6C y bajo un microscopio óptico en la figura 6D.
Descripción detallada de la invención
I. En la descripción de la presente invención se utilizará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones expuestas a continuación.
"Ácido nucleico" tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una forma polimérica lineal de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos como desoxinucleótidos, e incluye ADN y ARN de una hebra y de dos hebras. Un ácido nucleico puede incluir tanto regiones codificantes como no codificantes que pueden ser obtenidas directamente a partir de una fuente natural (p. ej. un microorganismo) o pueden ser preparadas con ayuda de técnicas de recombinación o técnicas sintéticas. Una molécula de ácido nucleico puede ser equivalente a un fragmento de ácido nucleico o puede tratarse de un fragmento de ácido nucleico además de uno o más nucleótidos distintos, oligonucleótidos o polinucleótidos. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico de la invención puede ser un vector o un plásmido tal como un vector o un plásmido de expresión o de clonaje.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un lípido "neutro" no tiene carga, es decir, no presenta un carácter iónico.
Un lípido "cargado" presenta carga positiva o negativa, es decir presenta carácter iónico.
Un "lípido formador de vesículas" se refiere a un lípido amfipático que contiene fracciones del grupo de cabeza hidrofóbicas y polares, el cual puede formar espontáneamente una vesícula bicapa en agua, por ejemplo un fosfolípido, o se incorpora de forma estable en bicapas lipídicas, con la fracción hidrofóbica en contacto con la región hidrofóbica interior de la membrana bicapa, y la fracción del grupo de cabeza polar orientada hacia la superficie polar exterior de la membrana. El lípido formador de vesículas de este tipo típicamente incluye una o dos cadenas hidrofóbicas de acil hidrocarburo o un grupo esteroide, y puede contener un grupo químicamente reactivo, tal como una amina, ácido, éster, aldehído o alcohol, en el grupo de cabeza polar. Incluidos en esta clase se encuentran los fosfolípidos, tales como fosfatidil colina (PC), fosfatidil etanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA), fosfatidil inositol (PI) y espingomielina (SM), donde las dos cadenas de hidrocarburo presentan típicamente entre aproximadamente 14 y aproximadamente 22 átomos de carbono de longitud, y presentan grados variables de insaturación. También se incluyen dentro del alcance del término "lípido formador de vesículas" un glicolípido, tal como un cerebrosido y un gangliosido, y un esterol, tal como colesterol.
"Alquilo" se refiere a un radical monovalente completamente saturado que contiene carbono e hidrógeno, el cual puede ser una cadena ramificada o lineal. Los ejemplos de grupos alquilo son metilo, etilo, n-butilo, t-butilo, n-heptilo e isopropilo. "Alquilo inferior" se refiere a un radical alquilo de entre uno y seis átomos de carbono, como por ejemplo metilo, etilo, n-butilo, i-butilo, t-butilo, isoamilo, n-pentilo e isopentilo.
"Alquenilo" se refiere a un radical monovalente que contiene carbono e hidrógeno, el cual puede ser una cadena ramificada o lineal, que contiene uno o más dobles enlaces.
Abreviaciones: PEG: polietilenglicol; mPEG: polietilenglicol metoxi-terminado; Chol: colesterol; PC: fosfatidil colina; PHPC: fosfatidil colina parcialmente hidrogenada; PHEPC: fosfatidil colina de huevo parcialmente hidrogenada; HSPC: fosfatidil colina de soja hidrogenada; DSPE: distearoil fosfatidil etanolamina; APD: 1-amino-2,3-propanodiol; DTPA: ácido dietilentetramina pentaacético; Bn: bencilo.
II. Lípido catiónico-neutro
En un aspecto, la presente invención incluye lípidos representados por la estructura mostrada a continuación:
2
en la que cada uno de R^{1} y R^{2} es una cadena de alquilo o alquenilo que presenta entre aproximadamente 8 y aproximadamente 24 átomos de carbono; n=1-20, y en una forma de realización preferida se encuentra entre 1 y 10; L se selecciona de entre el grupo que consiste en (i) -X-(C=O)-Y-, (ii) -X-(C=O)- y (iii) -X-, donde X e Y se seleccionan independientemente de entre oxígeno, NH y una unión directa; y Z es una fracción que presenta un pK inferior a aproximadamente 7,4 y superior a aproximadamente 4,0 y se trata de una fracción imidazol, una amina aromática o un aminoazúcar.
La fracción Z débilmente básica resulta en un lípido que a un pH fisiológico de aproximadamente 7,4 es predominantemente, por ejemplo, en una cantidad de por lo menos 50%, de carga neutra, pero a un pH seleccionado o especificado, presenta un valor inferior al pH fisiológico y tiende a una carga positiva. Por ejemplo, en una forma de realización, Z es una fracción imidazol, que presenta un pK de aproximadamente 6,0. Al pH fisiológico de 7,4, esta fracción es predominantemente neutra, pero a valores de pH inferiores a 6,0, la fracción se convierte en predominantemente positiva. Tal como se describe a continuación, se preparó un lípido que presentaba un fracción imidazol y se utilizó en la preparación de liposomas.
En otra forma de realización, Z es una fracción que presenta un valor de pK comprendido entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 7,0, más preferentemente entre aproximadamente 4,8 y aproximadamente 6,5, y aún más preferentemente entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,0.
Los lípidos de la invención incluyen un enlace neutro, L, que une la fracción Z y la porción de la cola del lípido. El enlace L puede variar, pero en una forma de realización se selecciona de entre un carbamato, un éster, una amida, un carbonato, una urea, una amida y un éter. En un lípido preparado preferido, se emplea un enlace carbamato, en el que L es -X-(C=O)-Y, X es NH e Y es oxígeno.
En la porción de la cola del lípido, R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes. R^{1} y R^{2} pueden ser cadenas alquilo o alquenilo no ramificadas que presentan entre aproximadamente 8 y aproximadamente 24 átomos de carbono. Preferentemente, los grupos R^{1} y R^{2} presentan una longitud comprendida entre aproximadamente 12 y aproximadamente 22 átomos de carbono, con R^{1} = R^{2} = C_{17}H_{35} (de forma que el grupo es un grupo estearilo), y R^{1}= R^{2} = C_{17}H_{33} (de forma que el grupo es un grupo oleoílo).
El lípido de la invención se puede preparar utilizando procedimientos sintéticos estándar. Se preparó un lípido que presentaba la estructura mostrada anteriormente, en la que Z es un imidazol, N = 2, L es un carbamato, y R^{1} = R^{2} = C_{17}H_{35}. En la figura 1 se muestra un esquema de reacción para la preparación de este lípido. En el Ejemplo 1 se proporcionan todos los detalles de la síntesis. Brevemente, se preparó para-nitrofenil carbonato de 1,2-diestearoil glicerol (compuesto III) a partir de 1,2-diestearoil-sn-glicerol (compuesto I) y para-nitrofenil cloroformato (compuesto II) y se hizo reaccionar con histamina (compuesto IV), para proporcionar un lípido (compuesto VI) que presentaba una fracción imidazol unida a una cola diestearoílo vía un enlace carbamato. También se puede utilizar una síntesis similar, utilizando glicerol en lugar de 1-amino-2,3-propanodiol, para preparar un producto enlazado por carbamato (L = -O-(C=O)-O-CH_{2}- ó -O-(C=O)-CH_{2}-).
Con los consejos y ejemplos proporcionados en la presente memoria, un experto en la técnica puede realizar fácilmente otras síntesis de un lípido que presente otros enlaces. Otros enlaces incluyen, por ejemplo, enlaces éter (L = O-CH_{2}-) o éster (L = -O-(C=O)-), así como también enlaces urea amida y enlaces amina (es decir, donde L = -NH-(C=O)-NH-, -NH-(C=O)-, o -NH-). También se puede preparar un enlace ceto, donde X es una unión directa. Las figuras 2A-2B ilustran la preparación de un lípido enlazado por amino (fig. 2A) y un lípido que presenta un enlace que contiene NH- (fig. 2B) respectivamente. En la fig. 2A, la amina terminal de la histamina se hace reaccionar con un cloruro de glicidilo, hidrolizando el epóxido resultante y acilando el diol resultante.
En la fig. 2B, se prepara un lípido que presenta un enlace que contiene NH, por ejemplo, haciendo reaccionar histamina con un derivado activado de ácido glicérico acetonida (ácido 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-carboxílico) o el homólogo de cuatro carbonos, ácido 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-acético. A continuación se desprotege el diol y se acila.
Las figuras 2C y 2D muestran esquemas de reacción adicionales para la preparación de lípidos que responden al pH de acuerdo con la presente invención.
Las figuras 3A-3D muestran varias estructuras de lípidos que responden al pH, donde las figuras 3A-3B muestran lípidos que presentan una amina aromática como fracción "Z". Las figuras 3C-3D muestran lípidos que presentan un aminoazúcar unido a un lípido.
III. Composición del liposoma A. Componentes del liposoma
Se pueden preparar liposomas que contienen el lípido descrito anteriormente mediante una variedad de técnicas, tales como las descritas en Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980), y a continuación se describen ejemplos específicos de liposomas preparados. Típicamente, los liposomas son vesículas multilamelares (MLVs) que se pueden formar mediante técnicas simples de hidración lípido-película. En este procedimiento, se disuelve una mezcla de lípidos formadores de liposomas, del tipo detallado a continuación, en un disolvente orgánico apropiado que seguidamente se evapora en un recipiente para formar una fina película. Seguidamente, la película lipídica se cubre con un medio acuoso, produciéndose la hidración para formar MLVs, típicamente con tamaños comprendidos entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 micras.
Los liposomas preparados en la presente invención incluyen, por ejemplo, liposomas que presentan entre aproximadamente 1 y aproximadamente 80 moles por ciento del lípido de la estructura mostrada anteriormente. En formas de realización preferidas, los liposomas incluyen entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50 moles por ciento del lípido. El resto de los componentes lipídicos del liposoma pueden incluir, por ejemplo, una variedad de lípidos formadores de vesículas, es decir, lípidos que se convierten espontáneamente en vesículas bicapa en agua, como por ejemplo los fosfolípidos. Los lípidos formadores de vesículas de este tipo son preferentemente los que presentan dos cadenas de hidrocarburos, típicamente cadenas acilo, y un grupo cabeza que puede ser polar o apolar. Existe una variedad de lípidos formadores de vesículas sintéticos y lípidos formadores de vesículas naturales, incluyendo los fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol y esfingomielina, donde las dos cadenas de hidrocarburos presentan una longitud comprendida típicamente entre aproximadamente 12 y aproximadamente 22 átomos de carbono, y presentan grados variables de instauración.
Los liposomas también pueden incluir un lípido que se incorpore de forma estable en la bicapa lipídica del liposoma, tal como diacilgliceroles, liso-fosfolípidos, ácidos grasos, glicolípidos, cerebrósidos y esteroles, tal como el colesterol.
En una forma de realización, los liposomas de la invención incluyen un revestimiento de la superficie de una cadena polimérica hidrofílica. "Revestimiento de la superficie", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un revestimiento de un polímero hidrofílico sobre la superficie de los liposomas. El polímero hidrofílico se incluye en el liposoma incluyendo en una composición de liposoma uno o más lípidos formadores de vesículas derivatizados con una cadena polimérica hidrofílica.
Los liposomas que presentan tal revestimiento son conocidos en la técnica, y han sido descritos, por ejemplo, en la patente US nº 5.013.556. El revestimiento de la superficie con cadenas poliméricas hidrofílicas resulta eficaz para incrementar la vida de circulación en sangre in vivo de los liposomas en comparación con liposomas que no presentan tal revestimiento.
Entre los ejemplos de lípidos formadores de vesículas apropiados para derivatización con un polímero hidrofílico se incluyen cualquiera de los lípidos mencionados anteriormente, y, en particular, fosfolípidos, tal como diestearoil fosfatidiletanolamina (DSPE).
Entre los ejemplos de polímeros hidrofílicos apropiados para la derivatización con un lípido formador de vesículas se incluyen, polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, polihidroxipropilmetacrilato, polihidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietilenglicol, poliaspartamida y secuencias peptídicas hidrofílicas. Los polímeros pueden ser empleados como homopolímeros o copolímeros de bloque o al azar.
Una cadena polimérica hidrofílica preferida es el polietilenglicol (PEG), que preferentemente presente un peso molecular comprendido entre aproximadamente 500 y aproximadamente 10.000 daltons, más preferentemente entre aproximadamente 1.000 y aproximadamente 5.000 daltons. Los análogos del PEG recubiertos de metoxi o etoxi también son polímeros hidrofílicos preferidos. Estos polímeros se encuentran disponibles comercialmente en una variedad de tamaños poliméricos, por ejemplo, entre aproximadamente 120 y aproximadamente 20.000 daltons.
La preparación de lípidos formadores de vesículas derivatizados con polímeros hidrofílicos se ha descrito, por ejemplo, en la patente US nº 5.395.619, y en Zalipsky STEALTH LIPOSOMES (D. Lasic y F. Martin, Eds, CRC Press, capítulo 9 (1995)).
Preferentemente, los liposomas que presentan tal revestimiento contienen entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 moles por ciento del lípido derivatizado con resto de componentes formadores del liposoma, p. ej., lípidos formadores de vesícula. Se han descrito ejemplos de procedimientos para preparar lípidos derivatizados y para preparar liposomas revestidos con polímeros en las patentes en copropiedad US nº 5.013.556, 5.631.018 y 5.395.619. El polímero hidrofílico se puede acoplar al lípido de forma estable, o se puede acoplar a través de un enlace inestable que permite que los liposomas revestidos se desprendan del revestimiento de cadenas poliméricas a medida que éstos circulan por el torrente sanguíneo o en respuesta a un estímulo.
Los liposomas también pueden incluir un agente atrapado, donde el término "atrapado" incluye la encapsulación de un agente en el núcleo acuoso y los espacios acuosos de los liposomas, así como también el atrapado de un agente en la bicapa(s) lipídica de los liposomas.
Los agentes útiles en la composición de la invención son ampliamente variados, e incluyen, por ejemplo, agentes para aplicaciones terapéuticas así como también para aplicaciones de diagnóstico. El agente terapéutico o de diagnóstico seleccionado puede ser incorporado en los liposomas mediante procedimientos estándar, incluyendo: (i) atrapado pasivo de un compuesto soluble en agua mediante hidración de una película lipídica con una solución acuosa del agente; (ii) atrapado pasivo de un compuesto lipofílico mediante hidración de una película lipídica que contiene el agente; y (iii) cargar un fármaco ionizable contra un gradiente de pH entre el interior y el exterior del liposoma. Entre otros procedimientos apropiados se incluye la preparación de liposomas mediante evaporación en fase inversa.
En una forma de realización preferida, los liposomas incluyen un ácido nucleico, seleccionado de entre una variedad de ácidos nucleicos basados en ADN y ARN, incluyendo fragmentos, es decir, truncaciones, mutaciones y análogos de los mismos. En la técnica se han descrito diversos genes para el tratamiento de varias afecciones, y a partir de bancos de datos de ADN, tales como GenBank o EMBL, se pueden obtener secuencias codificantes y/o pautas abiertas de lectura para genes específicos de interés. Por ejemplo, se han descrito polinucleótidos para el tratamiento de enfermedades víricas, malignas e inflamatorias, y afecciones tales como la fibrosis cística, deficiencia en adenosina desaminasa y SIDA. Se contempla el tratamiento de cánceres mediante la administración de genes supresores de tumores, tales como APC, DPC4, NF-1, NF-2, MTS1, RB, p53, WT1, BRCA1, BRCA2 y VHL.
Entre los ejemplos de ácidos nucleicos específicos para el tratamiento de una afección específica se incluyen: HLA-B7, tumores, carcinoma colorectal, melanoma; IL-2, cánceres, especialmente el cáncer de mama, cáncer de pulmón, y tumores; IL-4, cáncer; TNF, cáncer; IGF-1 antisentido, tumores cerebrales; IFN, neuroblastoma; GM-CSF, carcinoma de célula renal; MDR-1, cáncer, especialmente cáncer avanzado, cánceres de mama y de ovario; y HSV timidina quinasa, tumores cerebrales, tumores de cabeza y cuello, mesotelioma, cáncer de ovario.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser "ácidos nucleicos antisentido" compuestos por secuencias complementarias a su diana, típicamente un ARN mensajero (ARNm) o un precursor de ARNm. Típicamente, el ARNm contiene información genética en la orientación funcional, o en sentido, y la unión del polinucleótido antisentido puede inactivar el ARNm objetivo y evitar la traducción a proteína. Tales ácidos nucleicos antisentido se determinan en base a experimentos bioquímicos que muestran que las proteínas se traducen a partir de ARNs específicos. Una vez se conoce la secuencia del ARN, se puede diseñar un ácido nucleico antisentido que se unirá al ARN a través de los pares de bases complementarios de Watson-Crick. Típicamente, tales ácidos nucleicos antisentido contienen entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 pares de bases, más preferentemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 25 pares de bases y aún más preferentemente entre aproximadamente 15 y aproximadamente 20 pares de bases.
El ácido nucleico antisentido se puede modificar para mejorar la resistencia a la hidrólisis por nucleasas. Tales análogos incluyen, por ejemplo, oligonucleótidos fosforotioato, metilfosfonato, fosfodiéster, y p-etoxi (ver, por ejemplo, el documento WO 97/07784). El agente atrapado también puede ser un ribozima o un RNA catalítico.
El ácido nucleico también puede insertarse en un plásmido o un vector, preferiblemente uno que sea una molécula circularizada o una molécula cerrada de dos hebras que presente un tamaño comprendido en el intervalo entre 5 y 40 Kbp (kilo pares de bases). Tales plásmidos o vectores se construyen según procedimientos bien conocidos e incluyen un ácido nucleico o gen terapéutico, es decir, el gen o ácido nucleico a expresar en la terapia génica, bajo el control de un promotor y potenciador apropiado, y otros elementos necesarios para la replicación dentro de la célula huésped y/o integración en el genoma de la célula huésped. Los procedimientos para preparar plásmidos y vectores útiles para la terapia génica son ampliamente conocidos y descritos en la técnica.
Los ácidos nucleicos, tal como ADN plasmídico, se pueden atrapar en un liposoma mediante atrapado pasivo durante la hidración de la película lipídica del liposoma. Entre otros procedimientos para atrapar ácidos nucleicos se incluyen, por ejemplo, la condensación de ácido nucleico en forma de una molécula única, en la que el ácido nucleico se suspende en un medio acuoso que contiene agentes tales como sulfato de protamina, espermina, espermidina, histona, lisina, o mezclas de los mismos, u otros agentes de condensación policatiónicos apropiados, bajo condiciones que resultan eficaces para condensar el ácido nucleico en partículas pequeñas. La solución de moléculas de ácido nucleico condensado se utiliza para rehidratar la película lipídica seca para formar liposomas con el ácido nucleico condensado atrapado.
En otra forma de realización, los liposomas se pueden preparar para que contengan grupos de superficie, tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, moléculas pequeñas efectoras para interactuar con receptores de la superficie celular, antígenos, y otros compuestos similares para conseguir las propiedades deseadas de unión a poblaciones celulares específicas. Tales ligandos se pueden introducir en los liposomas incluyendo en los lípidos liposomales un lípido derivatizado con la molécula específica, o un lípido que presenta un grupo químico de cabeza polar que puede derivatizarse con la molécula específica en liposomas preformados.
Los lípidos se pueden derivatizar con un ligando específico uniendo covalentemente el ligando al extremo distal libre de una cadena polimérica hidrofílica, la cual se une por su extremo proximal a un lípido formador de vesícula. Existe una gran diversidad de técnicas para unir un polímero hidrofílico seleccionado a un lípido seleccionado y activar el extremo libre no unido del polímero para que reaccione con un ligando seleccionado. En particular, se ha estudiado extensamente el polímero hidrofílico PEG (Allen, T.M., et al., Biochemicia et Biophysica Acta 1237: 99-108 (1995); Zalipsky, S., Bioconjugate Chem., 4(4): 296-299 (1993); Zalipsky, S., et al., FEBS Lett. 353: 71-74 (1994); Zalipsky, S. et al., Bioconjugate Chemistry., 705-708 (1995); Zalipsky, S. en STEALTH LIPOSOMES (D. Lasic y F. Martin, Eds), capítulo 9, CRC Press, Boca Raton, FL (1995)).
Los ligandos específicos son bien conocidos por los expertos en la técnica, y en una forma de realización preferida, el ligando específico es tal que presenta afinidad de unión a células tumorales endoteliales, y preferentemente resulta internalizado por las células. Frecuentemente, tales ligandos se unen a un dominio extracelular de un receptor de un factor de crecimiento.
Entre los ejemplos de receptores se incluyen el producto protéico c-erbB-2 del encogen HER2/neu, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), el receptor del factor de crecimiento fibroblástico básico (FGF básico) y el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular, receptores de E-, L- y P-selectina, receptores de folato, receptor de CD4, receptor de CD19, receptores de \alpha\beta integrina y receptores de quemocina.
De acuerdo con la invención, los liposomas preparados pueden presentar unos tamaños sustancialmente homogéneos dentro de un intervalo de tamaños seleccionado, típicamente entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,5 \mum (micras), más preferentemente entre aproximadamente 0,03 y aproximadamente 0,40 \mum (micras). Un procedimiento eficaz para determinar el tamaño para REVs y MLVs implica la extrusión de una suspensión acuosa de los liposomas a través de una serie de membranas de policarbonato que presentan un tamaño de poro uniforme comprendido en el intervalo entre aproximadamente 0,03 y aproximadamente 0,20 \mum (micras), típicamente aproximadamente 0,05, 0,08, 0,10 ó 0,20 \mum (micras). El tamaño del poro de la membrana corresponde aproximadamente a los tamaños mayores de los liposomas preparados mediante extrusión a través de tal membrana, particularmente cuando la preparación se extruye dos o más veces a través de la misma membrana. Los procedimientos de homogenización también resultan útiles para reducir el tamaño de los liposomas hasta tamaños de 100 nm o inferiores (Martin, F.J., en SPECIALIZED DRUG DELIVERY SYSTEMS-MANUFACTURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY, (p. Tyle, Ed) Marcel Dekker, New York, pp. 267-316 (1990)).
B. Preparación y caracterización de composiciones ejemplificativas
Los liposomas, descritos en el Ejemplo 1, que presentaban una fracción imidazol unida a una cola diestearoílo vía un enlace carbamato se prepararon tal como se describe en el Ejemplo 2. Los liposomas estaban compuestos por 60 moles por ciento de fosfatidilcolina de soja (PHSPC) parcialmente hidrogenada y 40 moles por ciento del lípido imidazol-carbamato-diestearoílo. Los liposomas de la composición presentaban un tamaño medio de partícula de 80 nanómetros (nm) después de sonicar.
El potencial zeta de estos liposomas se midió en función del pH y los resultados se muestran en la figura 4 (triángulos abiertos). Con fines comparativos, se prepararon dos composiciones de liposomas que no contenían el lípido de la invención. Una composición incluía un lípido catiónico, mientras que la otra composición consistía en un lípido neutro único, PHSPC. La composición del liposoma catiónico estaba compuesta de 55 moles por ciento de dimetildioctadecilamonio (DDAB) y 45 moles por ciento de colesterol.
Los valores del potencial zeta proporcionan una medida de la carga aparente sobre la superficie exterior de los liposomas. Más específicamente, el potencial zeta es una medida del potencial creado a través de la interfase entre una capa límite líquida en contacto con un sólido y la capa difusa movible en el cuerpo del líquido, p. ej., el plano de cizalla. Los valores del potencial zeta se midieron tal como se expone más adelante en la sección de procedimientos, utilizando un aparato disponible comercialmente.
En la figura 4, un liposoma preparado con el lípido imidazol-carbamato-diestearoílo (triángulos abiertos) mostró una estrecha relación entre el potencial zeta y el pH del medio circundante. Según se observó, a valores de pH inferiores a 5,0, el potencial zeta era relativamente constante a aproximadamente 65 milivoltios (mV). A medida que aumentaba el pH del medio, el potencial zeta decrecía rápidamente. Por el contrario, los liposomas catiónicos (p. ej., liposomas de DDAB-colesterol, diamantes sólidos) y la formulación de liposomas neutros (cuadrados sólidos) presentaban menos cambios en el potencial zeta a medida que incrementaba el pH del medio de suspensión.
El cambio rápido en el potencial zeta de los liposomas que contenían lípidos imidazol-carbamato-diestearoílo como el pH del medio de suspensión, incrementaban debido a la propiedad de pK de la fracción imidazol. El pK del imidazol es aproximadamente de pH 6,0. A un pH inferior a 6,0, la fracción imidazol presenta predominantemente, p. ej., más del 50%, una carga positiva, y el potencial zeta de los liposomas que contienen el lípido imidazol-carbamato-distearoílo tiende a ser positivo. A un pH superior a 6,0, el imidazol cambia a carga neutra, p. ej., más del 50% neutro, y el potencial zeta positivo de los liposomas que contienen lípidos imidazol-carbamato-distearoílo decrece o tiende a ser neutro.
En otro experimento, se prepararon liposomas que incluían el lípido imidazol-carbamato-diestearoílo (preparado tal como se describe en el Ejemplo 1) y que contenían ADN atrapado. Tal como se describe en el Ejemplo 3A, un ADN plasmídico condensado se puso en contacto con liposomas que contenían una relación molar de 60/40 de PHSPC y el lípido imidazol-carbamato-diestearoílo. El pH de la solución de liposomas se ajustó a aproximadamente 4,0 antes de ponerla en contacto con el ADN condensado. A un pH de aproximadamente 4,0, el grupo de cabeza imidazol en el lípido se encuentra cargado positivamente de forma que el ADN cargado negativamente se une electrostáticamente al lípido. Con agitación constante, se forman liposomas alrededor del ADN atrapando el ADN dentro de la bicapa lipídica. Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento para atrapar de forma eficaz un agente cargado negativamente mediante la preparación de liposomas con un lípido que responde al pH y poniendo en contacto el agente con el liposoma bajo condiciones en las que el lípido que responde al pH tiende a la carga positiva.
Los liposomas que tenían ADN atrapado se compararon con una muestra que únicamente contenía ADN. Estas dos muestras se trataron con DNasa I durante 30 minutos (ver Ejemplo 3B). Al finalizar el periodo de tratamiento, se cargó una alícuota de cada muestra en un gel de agarosa que contenía bromuro de etidio y se sometió a electroforesis. En el gel de agarosa también se cargaron muestras de los mismos liposomas y del ADN sin tratar con DNasa I.
La fig. 5 es una micrografía del ensayo de electroforesis en gel de estas muestras. El carril 1 corresponde a los liposomas tratados con DNasa; El carril 2 corresponde a los liposomas (sin tratar con DNasa I); el carril 3 corresponde al ADN tratado con DNasa I; el carril 4 es el DNA; y el carril 5 es un marcador estándar de peso molecular de ADN de 1 kB.
La fig. 5 muestra que el ADN atrapado en los liposomas se encontraba protegido contra la digestión de la DNasa I, (comparando el carril 1 y el carril 3, donde se digirió ADN solo con la DNasa I).
En otro estudio, se prepararon liposomas que incluían un lípido que responde al pH y un anticuerpo específico. Estos liposomas se utilizaron para la transfección in vitro de células tumorales de pulmón humano.
Específicamente, un vector plasmídico de ADN reportero pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto, CA) que contenía el gen de la proteína fluorescente verde se atrapó en liposomas de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3A. La relación de lípidos totales respecto al ADN en los liposomas era de aproximadamente 14 nanomoles de lípidos por 1 microgramo (\mug) de ADN. Después de atrapar el ADN en los liposomas, el anticuerpo anti-integrina 1F11 Fab' se insertó en la bicapa lipídica mediante la incubación de los liposomas con micelas de 1F11-Fab'-conjugado a polietilenglicol-DSPE (PEG-DSPE). El conjugado 1F11-Fab'-PEG-DSPE se preparó utilizando tecnología convencional uniendo el anticuerpo a la maleimida N-terminal del PEG-DSPE, tal como se describe, por ejemplo, en Zalipsky, STEALTH LIPOSOMES, (D.Lasic y F. Martin, Eds, CRC Press, Capítulo 9 (1995)). Las micelas que contenían el anticuerpo se incubaron con los liposomas durante una noche a temperatura ambiente.
La línea celular 2E9 de células tumorales de pulmón humano, que presentaban un receptor de integrina, se incubaron con los liposomas in vitro. Los liposomas que contenían el conjugado 1F11-PEG-DSPE y liposomas control que no poseían el anticuerpo (que contenían PDG-DSPE sin el anticuerpo) se incubaron con las células a una concentración de 5 \mug de ADN/70 nmoles de lípido por ml durante 4 horas a 37ºC. Al finalizar el periodo de incubación, el medio se cambió para extraer los liposomas.
La fluorescencia verde se examinó a las 24 horas después de la transfección, y los resultados se muestran en las figs. 6A-6D. Las figs. 6A-6B son micrografías de las células transfectadas con liposomas conjugados a 1F11. La fig. 6A muestra las células vistas bajo un microscopio de fluorescencia y la fig. 6B muestra las células vistas bajo un microscopio óptico. La fig. 6A muestra que las células fueron transfectadas, tal como ponen en evidencia las regiones luminosas, que corresponden a células fluorescentes. Las figs. 6C-6D son imágenes de las células transfectadas con la formulación control que no presenta el anticuerpo espec. No se produjo transfección, tal como pone en evidencia la falta de fluorescencia cuando las células se observaron con un microscopio de fluorescencia (fig. 6C).
El lípido de la invención incluye una fracción que responde al pH de forma que a un pH de aproximadamente 7,4 el lípido es esencialmente neutro. Así, cuando los liposomas se administran a un sujeto, tal como un mamífero, por ejemplo, un humano, éstos no tienen carga, lo cual permite prolongar el tiempo de circulación en sangre respecto al tiempo conseguido con liposomas cargados. Los liposomas que resultan endocitados o que alcanzan una región específica in vivo donde el pH es inferior, adquieren carga a medida que el lípido se carga positivamente. Lo anterior se debe a que los liposomas presentan una fracción que responde al pH. Esto puede ocurrir, por ejemplo, en una región tumoral o en un lisozima. Así, un lípido que presenta una fracción imidazol, la cual presenta un pK de aproximadamente 6,0, tendrá carga predominantemente positiva a valores de pH inferiores a 6,0. Por lo tanto, en un endosoma donde el pH se encuentra comprendido entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,0, el lípido se protona, facilitando la aportación en el citoplasma celular del ADN atrapado (Xu y Szoka, Biochemistry, 35: 5616-5623 (1996)). En los Ejemplos siguientes se expone una descripción adicional de este principio.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención.
Materiales
Los materiales siguientes se obtuvieron a partir de la fuente indicada: fosfatidilcolina de soja parcialmente hidrogenada (Vernon Walden Inc., Green Village, NJ); colesterol (Solvay Pharmaceutical, Países Bajos); dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE) y dimetildioctadecilamonio (DDAB) (Avanti Polar Lipids, Inc, Birmingham, AL).
Métodos
Se realizó la dispersión de luz dinámica utilizando un Coulter N4-MD (Coulter, Miami, FL).
Potencial-zeta: El potencial-zeta se midió utilizando un ZETASIZER 2000 de Malver Instruments, Inc (Southborough MA). El instrumento se operó del modo siguiente: número de mediciones: 3; retraso entre mediciones: 5 segundos; temperatura: 25C; viscosidad: 0,89 cP; constante dieléctrica: 79; tipo celular: corriente capilar; límites zeta: -150 mV a 150 mV.
Ejemplo 1 Preparación de un lípido ejemplificativo A. Preparación de para-nitrofenil carbonato de diestearoil glicerol
Tal como se ilustra en la fig. 1, se secó 1,2-diesteaeoíl-sn-glicerol (500 mg, 0,8 mmol; compuesto I) azeotrópicamente con benceno (3 veces con evaporador rotatorio). Se añadió para-nitrofenil cloroformato (242 mg, 1,2 mmol, 1,5 eq; compuesto II), 4-dimetilaminopiridina (10 mg, 0,08 mmol, 0,1 eq), y trietilamina (334 \mul, 204 mmol, 3 eq) al 1,2-diestearoil glicerol en CHCl_{3} (5 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El TLC mostró que la reacción había finalizado. La mezcla se diluyó con CHCl_{3} (50 ml) y se extrajo con ácido cítrico al 10% (3 X 15 mL). La capa orgánica se secó (MgSO_{4}) y se evaporó para proporcionar un sólido. El sólido (naranja claro) se lavó con acetonitrilo (4 X 3 mL) para eliminar el exceso de p-nitrofenil cloroformato. El producto, para-nitrofenil carbonato de diestearoil glicerol (compuesto III) se secó al vacío sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 557 mg (88%). ^{1}H NMR (360 MHz, DMSO-D6,): \delta 0,88 (t, CH_{3}, 6H); 1,26 (s, CH_{2} 58H); 1,62 (m, CH_{2}CH_{2}CO, 4H); 2,4 (2xt, CH_{2}CO, 4H); 4,2 (dd, trans CH_{2}OCO, 1H); 4,35 (m, CH_{2}OCOO, 2H); 4,5 (dd, cis CH_{2}OCO, 1H); 5,38 (m, CH_{2}CHCH_{2}, 1H); 7,4 (d, C_{6}H_{5}, 2H); 8,3 (d, C_{6}H_{5}, 2H).
B. Preparación de carbamato de histamina y diestearoil glicerol
El para-nitrofenil carbonato de 1,2-diestearoil glicerol (350 mg, 0,44 mmol, compuesto III) se añadió a la histamina (46 mg, 0,40 mmol, 0,9 eq; compuesto IV) en CHCl_{3} (1 ml) con DMSO (200 \mul). Se añadió piridina (300 \mul; compuesto V) a la solución. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 horas. El TLC (CHCl_{3}: MeOH = 90:10) mostró que la reacción había finalizado. El disolvente se evaporó. El producto (compuesto VI) se disolvió en CHCl_{3}, se vertió en una columna de gel de sílice (Aldrich, tamiz 230-400, 60 \ring{A}) y se eluyó con los disolventes siguientes: CHCl_{3}:CH_{3}COCH_{3} = 90:10, 40 ml (elución de la mancha superior); CHCl_{3}:IPA = 80:20, 40 ml (elución del producto); CHCl_{3}:IPA = 70:30, 40 ml (elución de más producto). Se juntaron las fracciones que contenían el producto puro y se evaporaron. El producto se secó al vacío sobre P_{2}O_{5} y se obtuvo en forma de un sólido blanco (236 mg, rendimiento del 80%). ^{1}H NMR (360 MHz, CDCl_{3}/MeOH= 1:1 con TMS): \delta 0,88 (t, CH_{3}, 6H); 1,28 (s, CH_{2} 56H; 1,62 (m, CH_{2}CH_{2}CO, 4H); 2,34 (2xt, CH_{2}CO, 4H); 2,77 (t, CH_{2}CH_{2}NH, 2H); 3,18 (t, CH_{2}CH_{2}CO, 2H); 4,05-4,2 (dd cis y trans, CH_{2}CHCH_{2}, 4H); 5,13 (m, CH_{2}CHCH_{2}, 1H); 608 (s, Histamina, 1H); 7,53 (s, Histamina, 1H).
Ejemplo 2 Preparación placebo de liposoma
El lípido (compuesto VI) preparado tal como se describe en el Ejemplo 1 y fosfatidil colina de soja parcialmente hidrogenada (PHSPC) en una relación molar de 40/60 se disolvieron en cloroformo y/o metanol en un matraz redondo. Los disolventes se eliminaron mediante evaporación rotatoria, y la película lipídica seca producida se hidrató con desionizada para producir vesículas multilamelares grandes.
Las formulaciones comparativas de liposomas se prepararon utilizando 100 moles por ciento de PHSPC y con una relación molar 40/60 de DDAB-colesterol mediante una metodología similar.
El tamaño de los liposomas de cada formulación se determinó mediante dispersión dinámica de luz.
Ejemplo 3 Preparación de liposomas que contienen ácido nucleico A. Preparación de liposomas con ADN atrapado
Se prepararon los complejos a temperatura ambiente del modo siguiente. En primer lugar, se condensaron 400 \mug de DNA plasmídico del reportero luciferasa en una solución de glucosa al 5% mediante la adición de 100 \mug de histona con agitación lenta continua durante 10 minutos.
Una solución de PHSPC y el lípido que responde al pH preparado en el Ejemplo 1 (compuesto VI) en una relación molar de 40/60 a una cantidad de lípido total de 12.000 nm en 5% de glucosa se ajustó a pH = 4. La solución de ADN condensado se añadió lentamente a la solución acídica de liposomas con agitación continua durante 10 minutos. La concentración final de ADN era de 0,25 mg/ml y la concentración de lípido total era de 7,5 mM. La proporción de ADN respecto a los lípidos totales era de 1 \mug de ADN por 30 nmoles de lípidos.
B. Ensayo de la DNasa I
El ADN solo o el ADN atrapado en los liposomas se trataron con DNasa I en presencia de MgSO_{4} 10 mM a 37ºC durante 30 minutos. Después del tratamiento, la mezcla de liposoma/DNasa se extrajo con fenol/CHCl_{3} y CHCl_{3} para separar los lípidos y proteínas del ADN.
Alícuotas del ADN tratado con DNasa y de la fracción de ADN obtenida a partir de los liposmas con ADN tratados con DNasa se cargaron en un gel de agarosa al 1% que contenía bromuro de etidio y se sometieron a electroforesis para examinar la integridad del ADN. Como controles, se cargaron en el gel el ADN y los liposomas no tratados con DNasa, junto con un marcador de ADN de 1Kb. Los resultados se muestran en la fig. 5.

Claims (20)

1. Lípido que presenta la fórmula:
3
en la que cada uno de R^{1} y R^{2} es independientemente una cadena de alquilo o alquenilo que presenta entre 8 y 24 átomos de carbono;
n=0-20;
L se selecciona de entre el grupo que consiste en (i) -X-(C=O)-Y-, (ii) -X-(C=O)-, e (iii) -X-, donde X e Y se seleccionan independientemente de entre oxígeno, NH y una unión directa; y
Z es una fracción que presenta un pK inferior a 7,4 y superior a 4,0 y se trata de una fracción imidazol, una amina aromática o un aminoazúcar.
2. Lípido según la reivindicación 1, en el que L es un enlace carbamato, un enlace éster, o un enlace carbonato.
3. Lípido según la reivindicación 2, en el que X es NH e Y es oxígeno.
4. Lípido según la reivindicación 3, en el que L es NH-(C=O)-O-.
5. Lípido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que Z es una fracción que presenta un valor de pK comprendido entre 5,0 y 6,5.
6. Lípido según la reivindicación 5, en el que Z es un imidazol.
7. Lípido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada uno de R^{1} y R^{2} es una cadena alquilo o alquenilo no ramificada que presenta entre 8 y 24 átomos de carbono.
8. Lípido según la reivindicación 7, en el que cada uno de R^{1} y R^{2} es C_{17}H_{35}.
9. Lípido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que n se encuentra comprendido entre 1 y 10.
10. Lípido según la reivindicación 1, que presenta la fórmula:
4
11. Composición liposomal que comprende un lípido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
12. Composición según la reivindicación 11, que comprende entre 1 y 80 moles por ciento del lípido.
13. Composición según las reivindicaciones 11 ó 12, que además comprende un compuesto terapéutico atrapado en los liposomas.
14. Composición según la reivindicación 13, en la que el agente terapéutico es un ácido nucleico y/o una proteína o un fragmento de proteína.
15. Composición según la reivindicación 14, en la que el ácido nucleico se selecciona de entre el grupo que consiste en ADN, ARN y sus complementos.
\newpage
16. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, que además comprende un ligando para dirigir los liposomas hacia el sitio diana.
17. Composición según la reivindicación 16, en la que el ligando es tal que presenta afinidad de unión a células tumorales endoteliales y está internalizado por las células.
18. Composición según la reivindicación 17, en la que el ligando se selecciona de entre el grupo que consiste en E-selectina, Her-2, y FGF.
19. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, en la que los liposomas comprenden además entre 5 y 20 de moles por ciento de un lípido formador de vesículas derivatizado con una cadena polimérica hidrofílica.
20. Composición según la reivindicación 19, en la que dicha cadena polimérica hidrofílica es polietilenglicol.
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7238368B2 (en) 1999-04-23 2007-07-03 Alza Corporation Releasable linkage and compositions containing same
AU769425B2 (en) 1999-04-23 2004-01-29 Alza Corporation Conjugate having a cleavable linkage for use in a liposome
US7303760B2 (en) 1999-04-23 2007-12-04 Alza Corporation Method for treating multi-drug resistant tumors
US20040197390A1 (en) * 2001-05-29 2004-10-07 Shi-Kun Huang Neutral-cationic lipid for systemic delivery of factor VIII gene
WO2001026625A2 (en) 1999-10-08 2001-04-19 Alza Corp Neutral-cationic lipid for nucleic acid and drug delivery
DE10207177A1 (de) * 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Fakultativ kationische Lipide
CN102940891B (zh) * 2004-05-05 2016-02-24 赛伦斯治疗有限公司 脂质、脂质复合物及其应用
EP1935434A1 (en) * 2006-12-19 2008-06-25 Novosom AG Construction and use of transfection enhancer elements
MX2009011320A (es) 2007-04-20 2009-12-15 Enzon Pharmaceuticals Inc Terapia anticancer enzimatica.
CN101475503B (zh) * 2008-12-15 2012-02-15 山东大学 一种新型阳离子类脂及其制备方法和应用
EP2532649B1 (en) * 2011-06-07 2015-04-08 Incella GmbH Amino lipids, their synthesis and uses thereof
IL280771B2 (en) 2011-06-08 2024-03-01 Shire Human Genetic Therapies Preparations of lipid nanoparticles and methods for administration of mRNA
WO2013151326A1 (en) * 2012-04-04 2013-10-10 Samyang Biopharmaceuticals Corporation Method of preparing composition for delivering an anionic drug
CN105585598B (zh) * 2014-10-20 2019-02-19 湖南师范大学 甘露糖衍生物阳离子脂质体纳米颗粒的制备方法
BR112018007611A2 (pt) * 2015-10-14 2018-10-23 Bio Path Holding Inc ácidos nucleicos p-etóxi para formulação lipossômica
CN107200841B (zh) * 2016-03-17 2019-02-01 华东师范大学 一种培化二酰甘油的合成方法
CN110709065B (zh) * 2017-04-19 2023-02-10 Apa先进技术有限公司 融合脂质体、组合物、试剂盒及其治疗癌症的用途

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US5965434A (en) * 1994-12-29 1999-10-12 Wolff; Jon A. Amphipathic PH sensitive compounds and delivery systems for delivering biologically active compounds
DE19521412A1 (de) * 1995-06-14 1996-12-19 Boehringer Mannheim Gmbh Neue kationische und polykationische Amphiphile, diese enthaltende Reagenzien und deren Verwendung
US5855911A (en) 1995-08-29 1999-01-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides
TW520297B (en) * 1996-10-11 2003-02-11 Sequus Pharm Inc Fusogenic liposome composition and method
US6056973A (en) * 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
WO2000030444A1 (en) 1998-11-25 2000-06-02 Vanderbilt University Cationic liposomes for gene transfer
WO2001026625A2 (en) 1999-10-08 2001-04-19 Alza Corp Neutral-cationic lipid for nucleic acid and drug delivery

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