KR20020063875A - 핵산 및 약물 전달용 중성-양이온성 지질 - Google Patents

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Abstract

하기 화학식 I로 표시된 지질이 기재된다:
(식 중, R1및 R2각각은 탄소수 약 8 내지 약 24의 알킬 또는 알케닐 사슬이고; n = 1-20 이고; L 은 (i) -X-(C=O)-Y-CH2-, (ii) -X-(C=O)- 및 (iii) -X-CH2- (식 중, X 및 Y 는 산소, NH, 및 직접 결합으로부터 독립적으로 선택된다)로 구성된 군으로부터 선택되고; Z 는 약 4.0 초과 내지 약 7.4 미만의 pK를 가지는 약 염기성 부분이다).

Description

핵산 및 약물 전달용 중성-양이온성 지질 {NEUTRAL-CATIONIC LIPID FOR NUCLEIC ACID AND DRUG DELIVERY}
세포에 생물학적 활성 물질의 전달은 다양한 치료의 필수적 성분이다. 그러한 치료법에는 필요한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 세포에 공급하고, 세포에 핵산 (즉, DNA, RNA, cDNA)분자를 제공하고(유전자 치료), 외래 단백질에 대해 대상을 면역화시키고 (예방접종), 단백질을 코딩하는 유전자를 도입함으로써 외래 단백질에 대해 대상을 면역화시키고 (유전자 예방접종), 단백질을 코딩하는 mRNA에 안티센스, 즉 상보적인 핵산 분자를 세포에 제공하거나, 또는 그와 달리 단백질을 코딩하는 mRNA를 방해함으로써 세포내의 단백질의 생산을 저해하는 것이 포함된다.
그러나, 대부분의 세포의 외막을 포함한 인지질 이중층이 세포내로 물질의 무분별한 출입을 금지하는 사실을 포함한, 세포에 그러한 물질의 전달에 대해 몇 가지의 장애가 있다. 세포내로 활성 물질을 도입하기 위한 것으로 기재된 접근법은, 예를 들면, 미세주입법 및 전기천공법을 포함한다. 다른 접근법은 바이러스 벡터 및 화학물질-매개 도입이 관여된다.
당 기술에 기재된, 세포에 활성 물질의 전달을 위한 다른 접근법은 리포좀-기재 전달이다. 특히, 리포좀을 이용한 유전 물질의 세포에 전달은 널리 연구되었다. 리포좀 소포는 엔도시토시스(endocytosis)를 통해 세포에 의해 흡수되어 리소좀 분해 경로에 들어간다고 일반적으로 이해된다. 그리하여, 분해를 피하는 리포좀을 고안하려는 일부 노력이 행해졌다. 하나의 접근법은 리포좀 내에 팔미토일호모시스테인과 같은, pH 감수성 지질을 포함하는 것이었다 (Connor 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:1715(1984); Chu 및 Szoka, J. Liposome Res., 4(1):361(1994)). 그러한 pH 감수성 지질은 중성 pH에서 음전하이고, 리포좀 지질 이중층내로 안정하게 혼입된다. 그러나, 약산성 pH(약 6.8 미만의 pH)에서, 지질은 중성 전하가 되고 구조가 충분히 변화되어 리포좀 이중층을 불안정하게 한다. pH가 약 5.0 내지 약 6.0으로 보고된, 엔도좀내로 들어간 리포좀에 혼입될 때, 지질은 불안정하게 되고, 리포좀 내용물의 방출을 야기한다.
올리고뉴클레오티드 및 유전자 절편과 같은, 음전하의 생분자의 전달을 위해, 리포좀 지질 이중층 성분으로서, 양이온성 지질, 예를 들면, 양전하의 암모늄 또는 술포늄 이온-함유 헤드기(headgroup)를 가진 당지질 유도체의 사용이 또한 널리 보고되어 있다. 지질의 양전하의 헤드기는 음전하의 세포 표면과 상호작용하여, 생분자의 세포와 접촉 및 세포내로의 전달을 촉진시킨다.
이러한 노력에도 불구하고, 상기에 기재된, 올리고뉴클레오티드 및 다른 물질과 같은, 생분자의 세포로의 전달은 여전히 당업계에서 부족하다. 본 발명은핵산과 같은 물질의 세포로의 전달을 개선시키는 조성물 및 방법을 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 물질의 세포로의 전달용 리포좀 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 물질의 세포로의 전달용 리포좀 조성물에 사용하기 위한 지질을 제공한다.
하나의 면에서, 본 발명은 하기 화학식으로 표시된 지질을 포함한 리포좀 조성물을 포함한다:
(식 중, R1및 R2각각은 탄소수 약 8 내지 약 24의 알킬 또는 알케닐 사슬이고; n = 1-20 이고; L 은 (i) -X-(C=O)-Y-CH2-, (ii) -X-(C=O)- 및 (iii) -X-CH2- (식 중, X 및 Y 는 산소, NH, 및 직접 결합으로부터 독립적으로 선택된다)로 구성된 군으로부터 선택되고; Z 는 약 4.0 초과 내지 약 7.4 미만의 pK를 가지는 약 염기성 부분이다).
하나의 특정 구현예에서, X는 NH 이고 Y는 산소이다. 다른 구현예에서, L은 카르바메이트 연결(NH-(C=O)-O-CH2), 에스테르 연결 또는 카르보네이트 연결이다. 바람직한 구현예에서, Z는 이미다졸이다. 바람직하게는, R1및 R2는 탄소수 약 8 내지 약 24의 비측쇄 알킬 또는 알케닐이고, 바람직한 구현예에서, R1및R2는 각각 스테아릴기(C17H35)이다. 또다른 바람직한 구현예에서, n은 1 내지 10이다.
하나의 구현예에서, 리포좀은 상기 제시된 식을 가진 약 1 내지 약 80 몰%의 지질을 포함한다.
또다른 구현예에서, Z는 약 5.0 내지 약 6.5의 pK 값을 가진 부분이다.
바람직한 구현예에서, 상기 화학식으로 표시된 지질을 가진 리포좀은 리포좀내에 포획된 치료 화합물을 포함한다. 하나의 구현예에서, 치료 물질은 DNA, RNA, 또는 이의 절편과 같은 핵산이다. 리포좀은 또한 리포좀을 표적자리로 표적화시키는 리간드, 예를 들면 내피 종양 세포에 대한 결합 친화력을 가지고, 그러한 세포에 의해 내부화되는 리간드, 예를 들면 E-셀렉틴, Her-2 및 FGF를 포함할 수 있다.
또다른 구현예에서, 리포좀은 친수성 중합체 사슬로써 유도화된 약 5 내지 약 20 몰%의 소포-형성 지질을 포함한다. 바람직한 구현예의 친수성 중합체 사슬은 폴리에틸렌글리콜(PEG)이다.
본 발명은 지질이 생리적 pH에서 본질적으로 중성이고, 생리적 pH 미만의 pH에서 우세하게 양성 전하를 가지도록, pH에 반응하는 부분을 가진 지질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 지질로써 제조된 리포좀 조성물에 관한 것이다.
도 1은 카르바메이트 연결 및 이미다졸 Z기를 가진 지질의 제조용 합성 계획을 보여준다;
도 2A-2D는 pH 반응성 지질의 제조용 합성 반응식을 보여준다;
도 3A-3D는 pH 반응성 지질의 다양한 구조를 보여준다;
도 4는 본 발명의 지질 (빈 삼각형), 양이온성 지질 (채워진 다이아몬드) 및 중성 지질 (채워진 사각형)로써 제조된 리포좀에 대해 매질 pH의 함수로서, mV의 제타 전위(zeta potential)를 보여주는 그래프이다;
도 5는 포획된 DNA를 가진 본 발명의 pH 반응성 지질로써 제조된 리포좀의 겔 전기영동 분석의 마이크로그래프로서, 30분 동안 DNAse I에 노출된 리포좀 (레인 1); 포획된 DNA를 가진 본 발명의 pH 반응성 지질로써 제조된 리포좀 (레인 2); 30분 동안 DNAse I 에 노출된 DNA (레인 3); DNA (레인 4); 및 1kB DNA 래더 표준물질 (레인 5); 및
도 6A-6D는 본 발명의 pH 반응성 지질 및 표적 항체로써 제조된 리포좀으로써 트랜스펙션 후 시험관 내 인간 폐 종양세포의 마이크로그래프의 이미지이다. 리포좀은 녹색 형광단백질을 코딩하는 포획된 플라스미드를 포함하는데, 도 6A는 형광 현미경으로 보여진 트랜스펙션된 세포를 보여주고, 도 6B는 광학 현미경으로 보여진 트랜스펙션된 세포를 보여준다. 도 6C-6D는 표적 항체를 가지지 않는 유사한 리포좀으로써 트랜스펙션 후의 세포의 마이크로그래프로서, 리포좀과의 인큐베이션 후의 세포는 도 6C에서는 형광 현미경 및 도 6D에서는 광학 현미경으로써 보여진다.
I. 본 발명을 기재할 때, 하기 용어가 하기에 설명된 정의에 따라서 사용될 것이다.
본원에 사용된 "핵산"은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 선형 중합체 형태를 말하며, 이중- 및 단일-가닥 DNA 및 RNA 양자를 포함한다. 핵산은 천연 공급원(예를 들면, 미생물)로부터 직접 수득하거나 재조합 또는 합성 기술의 도움으로 제조될 수 있는 코딩 및 비코딩 부위 양자를 포함할 수 있다. 핵산 분자는 핵산 절편과 동등하거나 하나 이상의 다른 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 또는 폴리뉴클레오티드외에도 핵산 절편일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 핵산 분자는 발현 또는 클로닝 벡터 또는 플라스미드와 같은 벡터 또는 플라스미드일 수 있다.
본원에 사용된, "중성" 지질은 비전하, 즉 이온 특성이 없는 것이다.
"전하의" 지질은 양성 또는 음성 전하, 즉 이온 특성이 있는 것이다.
"소포-형성 지질"은 소수성 및 극성 헤드기 부분을 가진 양친매성 지질을 말하며, 이는 인지질에 예시된 것처럼, 소수성 부분이 이중층막의 내부 소수성 부위와 접촉하고, 극성 헤드기 부분이 막의 외부 극성 표면으로 향한 채, 물에서 자발적으로 이중층 소포내로 형성할 수 있거나, 지질 이중층내로 안정하게 혼입될 수 있다. 상기 유형의 소포-형성 지질은 전형적으로 하나 또는 두 개의 소수성 아실 탄화수소 사슬 또는 스테로이드기를 포함하고, 화학적으로 반응성인 기, 예를 들면, 아민, 산, 에스테르, 알데히드 또는 알콜을 극성 헤드기에 함유할 수 있다. 이 부류에 포함되는 것은 인지질, 예를 들면, 포스파티딜 콜린(PC), 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티드산(PA), 포스파티딜 이노시톨(PI), 및 스핑고미엘린(SM)이며, 여기에서 두 개의 탄화수소 사슬이 전형적으로 탄소수 약 14 내지 약 22의 길이이고, 다양한 불포화도를 가진다. 또한 용어 "소포-형성 지질"의 범주내에포함된 것은 당지질, 예를 들면, 세레브로시드 및 강글리오시드, 및 스테롤, 예를 들면, 콜레스테롤이다.
"알킬"은 측쇄 또는 직쇄일 수 있는, 탄소 및 수소를 함유한 충분히 포화된 1가 라디칼을 말한다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, n-부틸, t-부틸, n-헵틸, 및 이소프로필이다. "저급 알킬"은 탄소수 1 내지 6의 알킬 라디칼, 예를 들면, 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸, t-부틸, 이소아밀, n-펜틸, 및 이소펜틸을 말한다.
"알케닐"은 하나 이상의 이중결합을 포함한, 측쇄 또는 직쇄일 수 있는, 탄소 및 수소를 함유한 1가 라디칼을 말한다.
약어: PEG: 폴리에틸렌 글리콜; mPEG: 메톡시-말단 폴리에틸렌 글리콜; Chol: 콜레스테롤; PC: 포스파티딜 콜린; PHPC: 부분적으로 수소화된 포스파티딜 콜린; PHEPC: 부분적으로 수소화된 난(卵) 포스파티딜 콜린; HSPC: 수소화된 대두 포스파티딜 콜린; DSPE: 디스테아로일 포스파티딜 에탄올아민; APD: 1-아미노-2,3-프로판디올; DTPA: 디에틸렌테트라아민 펜타아세트산; Bn: 벤질.
II. 양이온성-중성 지질
하나의 면에서, 본 발명은 하기 제시된 구조식으로 표시된 지질을 포함한다:
(식 중, R1및 R2각각은 탄소수 약 8 내지 약 24의 알킬 또는 알케닐 사슬이고; n = 1-20 이고, 바람직한 구현예에서는 1-10 이고; L 은 (i) -X-(C=O)-Y-CH2-,(ii) -X-(C=O)- 및 (iii) -X-CH2- (식 중, X 및 Y 는 산소, NH, 및 직접 결합으로부터 독립적으로 선택된다)로 구성된 군으로부터 선택되고; Z 는 약 4.0 초과 내지 약 7.4 미만의 pK를 가지는 약 염기성 부분이다).
약 염기성 부분 Z는 약 7.4의 생리적 pH에서 예를 들면, 우세하게 50% 이상의 양으로 중성 전하이나, 선택되거나 지정된 pH에서 생리적 pH 보다 낮은 값을 가지며, 양성 전하인 경향이 있다. 예를 들면, 하나의 구현예에서, Z는 약 6.0의 pK를 가지는 이미다졸 부분이다. 생리적 pH 7.4에서, 상기 부분은 우세하게 중성이나, 6.0 미만의 pH 값에서는, 부분은 우세하게 양성 전하가 된다. 하기에 논의된 바와 같이, 이미다졸 부분을 가진 지질을 제조하고 리포좀의 제조에 사용하였다.
다른 적당한 Z 부분은, 예를 들면, 방향족 아민, 아닐린, 아미노슈가, 및 하기에 기재된 전형적인 지질 구조를 포함한다.
또다른 구현예에서, Z는 약 4.5 내지 약 7.0, 더욱 바람직하게는 약 4.8 내지 약 6.5, 가장 바람직하게는 약 5.0 내지 약 6.0 사이의 pK 값을 가지는 부분이다.
본 발명의 지질은 지질의 Z 부분과 꼬리 부분을 연결하는 중성 연결 L을 포함한다. 연결 L은 다양할 수 있으나, 하나의 구현예에서는 카르바메이트, 에스테르, 아미드, 카르보네이트, 우레아, 아민 및 에테르로부터 선택된다. 바람직하게 제조된 지질에서, 카르바메이트 연결을 사용하는데, 여기서 L은 -X-(C=O)-Y-CH2- 이고, X는 NH 이고, Y는 산소이다.
지질의 꼬리 부분에서, R1및 R2는 동일하거나 상이하다. R1및 R2는 탄소수 약 8 내지 약 24의 비측쇄 알킬 또는 알케닐일 수 있다. 바람직하게는, R1및 R2기는 R1= R2= C17H35(기가 스테아릴기가 된다), 및 R1= R2= C17H33(기가 올레오일기가 된다)인 탄소수 약 12 내지 약 22의 길이이다.
본 발명의 지질은 표준 합성 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하기 제시된 구조를 가진 지질을 제조하였다 (식 중, Z는 이미다졸이고, N=2 이고, L은 카르바메이트이고, R1= R2= C17H35이다). 상기 지질의 제조를 위한 반응식을 도 1에 보여준다. 합성의 상세한 것은 실시예 1에 또한 제공한다. 간단하게, 1,2-디스테아로일 글리세롤 (화합물 III)의 파라-니트로페닐 카르보네이트를 1,2-디스테아로일-sn-글리세롤(화합물 I) 및 파라-니트로페닐 클로로포르메이트(화합물 II)로부터 제조하고, 히스타민(화합물 IV)과 반응시켜, 카르바메이트 연결을 통해 디스테아로일 꼬리에 연결된 이미다졸 부분을 가진 지질(화합물 VI)을 수득하였다. 1-아미노-2,3-프로판디올 대신에 글리세롤을 사용한, 유사한 합성을 또한 이용하여, 카르보네이트-연결된 생성물 (L = -O-(C=O)-O-CH2- 또는 -O-(C=O)-CH2-)을 제조할 수 있다.
본원에 지침 및 실시예가 제시되었으므로, 다른 연결을 가진 지질의 다른 합성은 당업자에 의해 쉽게 이루어질 수 있다. 다른 연결은 예를 들면, 에테르(L=O-CH2-) 및 에스테르 연결 (L=-0-(C=O)-), 뿐만 아니라 아미드, 우레아 및 아민 연결(즉, L =-NH-(C=O)-NH-, -NH-(C=O)-CH2-, -NH-(C=O)-NH-CH2-, 또는 -NH-CH2-)을 포함한다. L이 직접 결합인 케토 연결을 또한 제조할 수 있다. 도 2A-2B는 에테르-연결된 지질 (도 2A) 및 에스테르-연결된 지질 (도 2B)의 제조를 각각 설명한다. 도 2A에서, 히스타민의 말단 아민은 글리시딜 클로라이드와 반응하여, 생성된 에폭시드를 가수분해시키고, 생성된 디올을 아실화시킨다.
도 2B에서, 에스테르-연결된 지질(L=-O-(C=O)- 또는 -O-(C=O)-CH2-)을 예를 들면, 히스타민과 글리세르산 아세토니드(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-카르복실산) 또는 4개의 탄소 유사체인 2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-아세트산의 활성화된 유도체를 반응시킴으로써 제조한다. 디올을 이어서 탈보호하고 아실화시킨다.
도 2C 및 2D 는 본 발명에 따른 pH 반응성 지질의 제조용 추가적인 반응식을 보여준다.
도 3A-3D 는 pH 반응성 지질의 다양한 구조를 보여주는데, 도 3A-3B는 "Z' 부분으로서 방향족 아민을 가진 지질을 보여준다. 도 3C-3D는 지질에 부착된 아미노슈가를 가진 지질을 보여준다.
III. 리포좀 조성물
A. 리포좀 성분
상기에 기재된 지질을 포함한 리포좀을 다양한 기술, 예를 들면 [Szoka 등, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467(1980)]에 기재된 것들, 및 하기에 충분히 기재되는, 제조된 리포좀의 특정 실시예에 의해서 제조할 수 있다. 전형적으로, 리포좀은 간단한 지질-필름 수화 기술에 의해 형성될 수 있는 다중라멜라 소포 (MLV)이다. 이 절차에서, 하기에 기재된 유형의 리포좀-형성 지질의 혼합물을 적당한 유기용매에 용해시키고, 이어서 용기내에서 증발시켜 얇은 필름을 형성한다. 지질 필름을 이어서 수성 매질로 덮고, 수화시켜, 전형적으로 약 0.1 내지 약 10 마이크론의 크기의 MLV를 형성한다.
본 발명에서 제조된 리포좀은, 예를 들면, 약 1 내지 약 80 몰%의 지질 및 하기에 제시된 구조를 가지는 리포좀을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 리포좀은 약 5 내지 약 50 몰%의 지질을 포함한다. 리포좀 지질 성분의 나머지는 추가로, 예를 들면, 다양한 소포-형성 지질, 즉, 인지질로 예시되는, 물 중의 이중층 소포내로 자발적으로 형성되는 지질을 포함할 수 있다. 상기 유형의 소포-형성 지질은 바람직하게는 두 개의 탄화수소 사슬, 전형적으로 아실 사슬, 및 극성 또는 비극성의 헤드기를 가진 것이다. 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨, 및 스핑고미엘린 (여기에서, 두 개의 탄화수소 사슬이 전형적으로 탄소수 약 12 내지 약 22의 길이이고, 다양한 불포화도를 가진다)과 같은 인지질을 포함한, 다양한 합성 소포-형성 지질 및 천연적으로 발생하는 소포-형성 지질이 있다.
리포좀은 추가로 디아실글리세롤, 리소-인지질, 지방산, 당지질, 세레브로시드 및 콜레스테롤과 같은 스테롤과 같은 리포좀 지질 이중층내로 안정하게 혼입된 지질을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 리포좀은 친수성 중합체 사슬의 표면 코팅을 포함한다. 본원에 사용된, "표면-코팅"은 리포좀의 표면상에서 친수성 중합체의 코팅을 말한다. 친수성 중합체가 리포좀 조성물내에 친수성 중합체 사슬로써 유도화된 하나 이상의 소포-형성 지질을 포함함으로써 리포좀내에 포함된다. 그러한 코팅을 가진 리포좀이 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 미국 특허 제 5,013,556호에 기재되어 있다. 친수성 중합체 사슬의 표면 코팅은 그러한 코팅이 부족한 리포좀과 비교할 때 리포좀의 생체내 혈액 순환 수명을 증가시키는데 효과적이다.
친수성 중합체를 이용한 유도화에 적당한 소포-형성 지질은, 예를 들면, 상기에 열거된 임의의 지질, 특히 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(DSPE)과 같은 인지질을 포함한다.
소포-형성 지질을 이용한 유도화에 적당한 친수성 중합체는, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐메틸에테르, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리히드록시프로필옥사졸린, 폴리히드록시프로필메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리히드록시프로필메타크릴레이트, 폴리히드록시에틸아크릴레이트, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아스파르트아미드 및 친수성 펩티드 서열을 포함한다. 중합체는 단독중합체 또는 블록 또는 무작위 공중합체로서 이용될 수 있다.
바람직한 친수성 중합체 사슬은 바람직하게는 약 500 내지 약 10,000 달톤, 더욱 바람직하게는 약 1,000 내지 약 5,000 달톤의 분자량을 가진 폴리에틸렌글리코(PEG)이다. PEG의 메톡시 또는 에톡시-캡핑된 유사체가 또한 바람직한 친수성 중합체이다. 이러한 중합체는 다양한 중합체 크기, 예를 들면, 약 120 내지 약 20,000 달톤으로 시판된다.
친수성 중합체로써 유도화된 소포-형성 지질의 제조가 예를 들면, 미국 특허 제 5,395,619호 및 Zalipsky STEALTH LIPOSOMES, (D. Lasic 및 F. Martin, 저, CRC Press, 9장 (1995))에 기재되어 있다.
그러한 코팅을 가진 리포좀은 바람직하게는 약 1 내지 약 20 몰%의 잔존하는 리포좀 형성 성분으로써 유도화된 지질, 예를 들면, 소포-형성 지질을 포함한다. 유도화된 지질의 제조 및 중합체-코팅된 리포좀의 형성의 전형적인 방법이 공동 소유의 미국 특허 제 5,013,556, 5,631,018 및 5,395,619에 기재되어 있다. 친수성 중합체가 지질에 안정하게 결합되거나, 코팅된 리포좀이 혈류내에서 순환할 때 또는 자극에 반응할 때 중합체 사슬의 코팅이 벗겨지도록 하는 불안정한 연결을 통해 결합될 수 있다.
리포좀은 또한 포획된 물질을 포함할 수 있는데, 여기에서 용어 "포획된"은 리포좀의 수성 코아(core) 및 수성 공간내에 물질의 피낭형성뿐만 아니라, 리포좀의 지질 이중층내에 물질의 포획을 포함한다.
본 발명의 조성물에 유용한 물질은 상당히 다양하고, 예를 들면, 치료용 적용뿐만 아니라 진단용 적용을 위한 물질을 포함한다. 선택된 치료용 또는 진단용 물질은 하기를 포함한, 표준 방법에 의해 리포좀내로 혼입될 수 있다: (i) 지질 필름을 물질의 수용액으로써 수화시킴에 의한 수용성 화합물의 수동 포획; (ii) 물질을 포함한 지질 필름을 수화시킴에 의한 친지성 화합물의 수동 포획; (iii) 내부/외부 리포좀 pH 구배에 대해 이온화가능한 약물의 적재. 다른 적당한 방법은 역증발상 리포좀 제제를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 리포좀은 절편, 즉 절단(truncation), 돌연변이, 및 이의 유사체를 포함한, 다양한 DNA 및 RNA 기재 핵산으로부터 선택된 핵산을 포함한다. 다양한 상태의 치료를 위한 다양한 유전자가 당업계에서 기재되었고, 관심 있는 특정 유전자에 대한 코딩 서열 및/또는 ORF가 GenBank 또는 EMBL과 같은 DNA 데이타은행으로부터 쉽게 회수될 수 있다. 예를 들면, 낭성섬유증, 아데노신 탈아미노효소 결핍증 및 에이즈와 같은, 바이러스, 악성 및 염증 질병 및 상태의 치료용 폴리뉴클레오티드가 기재되어 있다. APC, DPC4, NF-1, NF-2, MTS1, RB, p53, WT1, BRCA1, BRCA2, 및 VHL과 같은 종양 억제성 유전자의 투여에 의한 암의 치료가 고려된다.
특정 상태의 치료용 특정 핵산의 예는 예를 들면 하기를 포함한다: HLA-B7, 종양, 결장직장암, 흑색종; IL-2, 암, 특히 유방암, 폐암 및 종양; IL-4, 암; TNF, 암; IGF-1 안티센스, 뇌종양; IFN, 신경모세포종; GM-CSF, 신세포암; MDR-1, 암, 특히 진전된 암, 유방 및 난소암; 및 HSV 티미딘 키나아제, 뇌종양, 머리 및 목 종양, 중피종, 난소암.
본 발명의 핵산은 이들 표적, 전형적으로 전령 RNA(mRNA) 또는 mRNA 전구체에 상보적인 서열로 구성된 "안티센스 핵산" 일 수 있다. mRNA는 전형적으로 기능성, 또는 센스 방향으로 유전 정보를 함유하고, 안티센스 폴리뉴클레오티드의결합은 의도한 mRNA를 불활성화시키고, 단백질로의 번역을 막을 수 있다. 그러한 안티센스 핵산은 단백질이 특정 RNA로부터 번역된다는 것을 보여주는 생화학적 실험에 기초하여 결정된다. RNA의 서열이 공지되면, 상보적인 왓슨-크릭크 염기쌍을 통해 RNA에 결합하는 안티센스 핵산이 고안될 수 있다. 그러한 안티센스 핵산은 전형적으로 약 10 내지 약 40 염기쌍, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 약 25 염기쌍, 가장 바람직하게는 약 15 내지 약 20 염기쌍을 함유한다.
안티센스 핵산은 핵산가수분해효소의 가수분해에 대한 개선된 저항성을 위해 변형될 수 있다. 그러한 유사체는, 예를 들면, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포디에스테르, 및 p-에톡시 올리고뉴클레오티드를 포함한다 (예를 들면, WO 97/07784를 참조). 포획된 물질은 또한 리보자임 또는 촉매성 RNA일 수 있다.
핵산은 또한 플라스미드 또는 벡터, 바람직하게는 크기가 바람직하게는 5-40 Kbp (킬로 염기쌍) 범위인 원형의 또는 폐쇄 이중가닥 분자내로 삽입될 수 있다. 그러한 플라스미드 또는 벡터는 주지의 방법에 따라 구축되고, 치료용 핵산 또는 유전자, 즉, 적당한 프로모터 및 인핸서(enhancer)의 조절하에, 유전자 치료에서 발현되는 유전자 또는 핵산, 및 숙주세포내의 복제 및/또는 숙주세포 게놈내로의 삽입에 필요한 다른 원소를 포함한다. 유전자 치료에 유용한 플라스미드 및 벡터의 제조 방법은 널리 공지되고, 당업계에서 참고된다.
DNA 플라스미드와 같은 핵산이 리포좀 지질 필름의 수화 동안 수동 포획에 의해 리포좀내에 포획될 수 있다. 핵산을 포획하는 다른 절차는, 예를 들면,단일분자 형태로 핵산을 응축시키는 것을 포함하는데, 여기서 핵산을 작은 입자로 응축시키기에 효과적인 조건하에, 프로타민 술페이트, 스퍼민, 스퍼미딘, 히스톤, 라이신 또는 이의 혼합물과 같은 물질을 포함한 수성 매질, 또는 다른 적당한 폴리양이온성 응축제에 핵산을 현탁시킨다. 응축된 핵산 분자의 용액을 사용하여 건조된 지질 필름을 재수화시켜, 포획된 형태의 응축된 핵산을 가진 리포좀을 형성한다.
또다른 구현예에서, 리포좀을 표면기, 예를 들면, 항체 또는 항체 절편, 세포 표면 수용체와 상호작용하기 위한 작은 효과기(effector) 분자, 항원, 및 특정 세포 군집에 원하는 표적 결합 성질을 이루기 위한 다른 유사한 화합물을 포함하도록 제조할 수 있다. 그러한 리간드는 리포좀 지질내에 표적 분자로써 유도화된 지질, 또는 미리형성된 리포좀내에 표적 분자로써 유도화될 수 있는 극성 헤드 화학기를 가진 지질을 포함함으로써 리포좀내에 도입할 수 있다.
지질은 이의 인접 말단에서 소포-형성 지질에 부착된, 친수성 중합체 사슬의 자유 말부 말단에 리간드를 공유적으로 부착시킴으로써 표적 리간드로써 유도화될 수 있다. 선택된 친수성 중합체를 선택된 지질에 부착시키고, 선택된 리간드와의 반응에 대해 중합체의 자유, 미부착 말단을 활성화시키는 다양한 기술이 존재한다. 특히, 친수성 중합체 PEG가 널리 연구되었다 (Allen, T.M. 등, Biochemicia et Biophysica Acta 1237:99-108 (1995); Zalipsky, S., Bioconjugate Chem., 4(4):296-299 (1993); Zalipsky, S., 등, FEBS Lett. 353:71-74 (1994); Zalipsky, S. 등, Bioconjugate Chemistry, 705-708 (1995); Zalipsky, S.,STEALTH LIPOSOMES (D. Lasic 및 F. Martin, 저) 9장, CRC Press, Boca Raton, FL (1995)).
표적 리간드는 당업자에 주지되어 있고, 바람직한 구현예에서, 표적 리간드는 내피 종양세포에 결합 친화력을 가진 것이고, 바람직하게는 세포에 의해 내부화된다. 그러한 리간드는 종종 성장인자 수용체의 세포외 도메인에 결합한다. 전형적인 수용체는 HER2/neu 암유전자의 c-erbB-2 단백질 산물, 표피성장인자(EGF) 수용체, 염기성 섬유아세포 성장인자(염기성 FGF) 수용체 및 혈관내피성장인자 수용체, E-, L- 및 P-셀렉틴 수용체, 엽산 수용체, CD4 수용체, CD19 수용체, αβ인테그린 수용체 및 케모카인 수용체를 포함한다.
본 발명에 따라, 제조된 리포좀은 선택된 크기 범위, 전형적으로 약 0.01 내지 약 0.5 마이크론, 더욱 바람직하게는 약 0.03 내지 약 0.40 마이크론으로 실질적으로 균일한 크기를 가질 수 있다. REV 및 MLV에 대한 하나의 효과적인 크기측정 방법은 약 0.03 내지 약 0.20 마이크론, 전형적으로 약 0.05, 0.08, 0.10 또는 0.20 마이크론의 범위의 선택된 균일한 공극 크기의 일련의 폴리카르보네이트 막을 통해 리포좀의 수성 현탁액을 압출하는 것이 관여된다. 막의 공극 크기는 특히 제제가 동일한 막을 통해 2회 이상 압출되는 경우에, 상기 막을 통해 압출에 의해 생성된 리포좀의 가장 큰 크기에 대략 해당한다. 균일화 방법은 또한 100nm 이하의 크기로 리포좀의 크기를 줄이는데 유용하다 (Martin, F.J., SPECIALIZED DRUG DELIVERY SYSTEMS-MANUFACTURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY, (P. Tyle, 저) Marcel Dekker, New York, pp. 267-316 (1990)).
B. 전형적인 조성물의 제조 및 특성규명
카르바메이트 연결을 통해 디스테아로일 꼬리에 연결된 이미다졸 부분을 가진, 실시예 1에서 기재된 리포좀을 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. 리포좀은 60 몰%의 부분적으로 수소화된 대두 포스파티딜콜린(PHSPC) 및 40 몰%의 이미다졸-카르바메이트-디스테아로일 지질로 구성된다. 조성물내의 리포좀은 초음파 처리 후 80 나노미터(nm)의 평균 입경을 가졌다.
상기 리포좀의 제타 전위는 pH의 함수로서 측정되었고, 결과는 도 4 (빈 삼각형)에 보여진다. 비교를 위해, 본 발명의 지질을 포함하지 않는 두 개의 리포좀 조성물을 제조하였다. 하나의 조성물은 양이온성 지질을 포함한 반면에, 다른 조성물은 단일 중성 지질인 PHSPC로 구성되었다. 양이온성 리포좀 조성물은 55 몰%의 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB) 및 45 몰%의 콜레스테롤로 구성되었다.
제타 전위값은 리포좀의 외부 표면상의 겉보기 전하의 측정을 제공한다. 더욱 구체적으로, 제타 전위는 고체와 접촉하는 지질 경계층 및 지질체내의 이동성 확산층, 예를 들면, 미끄럼면(slipping plane) 사이의 간극을 가로질러 발생하는 전위의 측정이다. 제타 전위값은 시판되는 장치를 사용하여, 하기 방법 섹션에 설명된 바와 같이 측정된다.
도 4에서, 이미다졸-카르바메이트-디스테아로일 지질(빈 삼각형)로써 제조된 리포좀은 제타 전위 및 주위 매질의 pH 사이의 강한 관계를 보여주었다. 관찰된 바와 같이, 약 5.0 미만의 pH 값에서, 제타 전위는 약 65 밀리볼트(mV)로 비교적 일정했다. 매질의 pH가 증가할 때, 제타 전위는 급격히 감소했다. 대조적으로, 양이온성 리포좀 (예를 들면, DDAB-콜레스테롤의 리포좀, 채워진 다이아몬드), 및 중성 리포좀 제형물(채워진 사각형)은 현탁액 매질의 pH가 증가할 때 제타 전위의 변화가 적었다.
현탁액 매질의 pH처럼 이미다졸-카르바메이트-디스테아로일 지질을 함유한 리포좀의 제타 전위의 급격한 변화는 이미다졸 부분의 pK 성질때문에 증가하였다. 이미다졸의 pK는 약 pH 6.0 이다. 6.0 미만의 pH에서, 이미다졸 부분은 우세하게 예를 들면, 50% 초과의 양성 전하이고, 이미다졸-카르바메이트-디스테아로일 지질을 함유한 리포좀의 제타 전위는 양성인 경향이 있다. 6.0 초과의 pH에서, 이미다졸은 중성 전하, 예를 들면, 50% 초과의 중성전하로 되고, 이미다졸-카르바메이트-디스테아로일 지질을 함유한 리포좀의 양성 제타 전위는 감소하거나, 중성인 경향이 있다.
또다른 구현예에서, 이미다졸-카르바메이트-디스테아로일 지질 (실시예 1에서 기재된 바와 같이 제조함)을 포함하고, 포획된 DNA를 포함한 리포좀을 제조하였다. 실시예 3A에 기재된 바와 같이, 응축된 플라스미드 DNA를 60/40 몰비의 PHSPC 및 이미다졸-카르바메이트-디스테아로일 지질을 포함한 리포좀과 접촉시켰다. 리포좀 용액의 pH는 응축된 DNA와 접촉하기 전에 약 4.0으로 조정되었다. 약 4.0의 pH에서, 지질상의 이미다졸 헤드기는 음성 전하의 DNA가 지질에 정전기적으로 결합되도록 양성 전하이다. 계속적인 교반으로, 지질 이중층내에 DNA를 포획하는 DNA 주위에 리포좀이 형성된다. 따라서, 본 발명은 pH 반응성 지질을 가진 리포좀을 제조하고, pH 반응성 지질이 양성 전하가 되는 조건하에 물질을 리포좀과 접촉시킴으로써 음성 전하의 물질을 효과적으로 포획하는 방법을 제공한다.
포획된 DNA를 가진 리포좀을 단지 DNA를 함유한 시료와 비교하였다. 이러한 두 가지 시료를 30분 동안 DNase I으로써 처리하였다 (실시예 3B 참조). 처리 기간 후에, 각 시료의 분취량을 에티디움 브로마이드를 함유한 아가로스 겔상에 적재하고 전기영동하였다. 동일한 리포좀 및 DNase I으로써 처리되지 않은 DNA의 시료를 또한 아가로스 겔상에 적재하였다.
도 5는 이러한 시료의 겔 전기영동 분석의 마이크로그래프이다. 레인 1은 DNase-처리된 리포좀; 레인 2는 리포좀 (DNase I으로써 처리되지 않음); 레인 3은 DNase I으로써 처리된 DNA; 레인 4는 DNA; 레인 5는 1kB DNA 래더 표준물질이다.
도 5는 DNA 단독으로 DNase I에 의해 절단된, 레인 1 과 레인 3을 비교함으로써 리포좀내에 포획된 DNA가 DNase I에 의한 절단으로부터 보호된다는 것을 보여준다.
또다른 연구에서, pH 반응성 지질 및 표적 항체를 포함한 리포좀을 제조하였다. 이러한 리포좀은 인간 폐 종양세포의 시험관내 트랜스펙션에 사용되었다.
구체적으로, 녹색 형광 단백질 유전자를 포함한 DNA 리포터 플라스미드 벡터 pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto CA)를 실시예 3A의 절차에 따라 리포좀내에 포획하였다. 리포좀내의 DNA에 대한 총지질의 비율은 약 14 나노몰 지질/1마이크로그램(㎍) DNA 이었다. DNA를 리포좀내에 포획한 후에, 폴리에틸렌글리콜-DSPE (PEG-DSPE)에 접합된 1F11 Fab'의 미셀(micelle)로써 리포좀을 인큐베이션함으로써항 인테그린 항체 1F11 Fab'를 지질 이중층내로 삽입하였다. 1F11 Fab'-PEG-DSPE 접합물을 예를 들면, [Zalipsky, STEALTH LIPOSOMES, (D. Lasic 및 F. Martin, 저, CRC Press, 9장 (1995)]에 기재된 바와 같이, PEG-DSPE의 N-말단 말레이미드에 항체를 부착시킴으로써 종래의 기술을 사용하여 제조하였다. 항체를 포함한 미셀 및 리포좀을 상온에서 밤새 인큐베이션하였다.
인테그린 수용체를 가진 인간 폐 종양 세포주 2E9을 시험관내에서 리포좀과 인큐베이션하였다. 1F11-PEG-DSPE 접합물을 포함한 리포좀 및 항체가 결여된 (항체가 결여된 PDG-DSPE를 포함한) 대조군 리포좀을 5㎍ DNA/70 나노몰 지질/ml의 농도에서 37℃에서 4시간 동안 세포와 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후에, 매질을 변화시켜 리포좀을 제거하였다.
트랜스펙션후 24시간에 녹색 형광를 조사하고, 결과를 도 6A-6D에 보여준다. 도 6A-6B는 1F11-접합된 리포좀으로써 트랜스펙션된 세포의 마이크로그래프이다. 도 6A는 형광 현미경으로 보여진 세포를 보여주고, 도 6B는 광학 현미경으로 보여진 세포를 보여준다. 도 6A는 형광 세포에 해당하는 밝은 부위에 의해 증명된 바와 같이, 세포가 트랜스펙션되었다는 것을 보여준다. 도 6C-6D는 표적 항체가 결여된 대조군 제형물로써 트랜스펙션된 세포의 이미지이다. 세포를 형광 현미경으로 볼 경우, 형광의 부족에 의해 증명된 바와 같이, 어떠한 트랜스펙션도 발생하지 않았다 (도 6C).
본 발명의 지질은 약 7.4의 pH에서 지질이 본질적으로 중성이 되도록 pH에 반응성인 부분을 포함한다. 그리하여, 포유동물, 예를 들면, 인간과 같은 대상에 투여할 경우, 리포좀은 비전하이고, 이는 전하를 가진 리포좀으로써 성취한 것보다 보다 더 장기간의 혈액 순환 시간을 허용한다. 엔도시토시스되거나 pH가 낮은 특정 생체내 부위에 도달하는 리포좀은 지질이 양성 전하가 될 때 전하를 가진다. 이것은 pH 반응성 부분을 가진 리포좀에 기인한다. 이것은, 예를 들면, 종양 부위 또는 리소좀내에서 일어날 수 있다. 그리하여, 약 6.0의 pK를 가지는 이미다졸 부분을 가진 지질은 6.0 미만의 pH 값에서 우세하게 양성 전하가 될 것이다. 그러므로, pH가 약 5.0 내지 약 6.0인 엔도좀에서, 지질은 양성화되고, 세포의 세포질내로 포획된 DNA의 흡수 및 방출을 용이하게 한다 (Xu 및 Szoka, Biochemistry, 35:5616-5623 (1996)). 이 원리의 추가의 설명은 하기 실시예에서 설명된다.
하기 실시예는 본 발명의 설명이다.
재료: 하기 재료를 표시된 공급원으로부터 수득하였다: 부분적으로 수소화된 대두 포스파티딜콜린 (Vernon Walden Inc., Green Village, NJ); 콜레스테롤 (Solvay Pharmaceuticals, 네덜란드); 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 (DOPE) 및 디메틸디옥타데실암모늄 (DDAB) (Avanti Polar Lipids, Inc., Birmingham, AL).
방법: 동적 광 산란을 Coulter N4-MD (Coulter, Miami FL)을 사용하여 수행하였다.
제타 전위: 제타 전위를 Malver Instruments, Inc. (Southborough MA)사의 ZETASIZER 2000을 사용하여 측정하였다. 기구를 하기와 같이 작동하였다: 측정수: 3; 측정사이의 지연: 5초; 온도: 25℃; 점도: 0.89 cP; 유전상수: 79; 셀 유형: 모세관 흐름; 제타 한계: -150 mV 내지 150 mV.
실시예 1
전형적인 지질의 제조
A.디스테아로일 글리세롤의 파라-니트로페닐 카르보네이트의 제조
도 1에 설명된 바와 같이, 1,2-디스테아에오일-sn-글리세롤 (500 mg, 0.8 mmol; 화합물 I)을 벤젠과 함께 끓여 건조시켰다 (회전 증발기로써 3회), 파라-니트로페닐 클로로포르메이트 (242mg, 1.2mmol, 1.5 당량; 화합물 II), 4-디메틸아미노피리딘 (10 mg, 0.08 mmol, 0.1 당량), 및 트리에틸아민 (334㎕, 204 mmol, 3 당량)을 CHCl3(5 ml) 중의 1,2-디스테아로일 글리세롤에 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완결되었다는 것을 보여주었다. 혼합물을 CHCl3(50 ml)로써 희석하고, 10% 구연산 (3 X 15 mL)로써 추출하였다. 유기층을 건조시키고 (MgSO4), 증발시켜 고체를 수득하였다. 고체 (밝은 오렌지)를 아세토니트릴 (4 X 3 mL)로써 세척하여 과량의 p-니트로페닐 클로로포르메이트를 제거하였다. 생성물인 디스테아로일 글리세롤의 파라-니트로페닐 카르보네이트 (화합물 III)를 P2O5로써 진공하에 건조시켰다. 수득율: 557mg(88%).
B.히스타민 및 디스테아로일 글리세롤의 카르바메이트의 제조
1,2-디스테아로일 글리세롤의 파라-니트로페닐 카르보네이트 (350mg, 0.44mmol, 화합물 III)를 DMSO (200㎕)와 함께 CHCl3(1ml) 중의 히스타민 (46 mg, 0.40 mmol, 0.9 당량; 화합물 IV)에 첨가하였다. 피리딘 (300㎕; 화합물 V)를 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 약 20시간 동안 밤새 상온에서 교반하였다. TLC (CHCl3:MeOH= 90:10)는 반응이 완결되었다는 것을 보여주었다. 용매를 증발시켰다. 생성물 (화합물 VI)을 CHCl3중에 용해시키고, 실리카 겔 (Aldrich, 230-400 메쉬, 60 Å) 칼럼 상에 쏟고, 하기 용매, CHCl3:CH3COCH3= 90:10, 40 ml (상단 스폿이 용출됨); CHCl3:IPA= 80:20, 40 ml (생성물이 용출됨); CHCl3:IPA= 70:30, 40 ml (더욱 많은 생성물이 용출됨)로써 용출하였다. 순수한 생성물을 함유한 분획을 결합하고, 증발시켰다. 생성물을 P2O5로써 진공하에 건조시키고, 백색 고체로서 수득하였다 (236 mg, 80% 수득율).
실시예 2
플라시보(placebo) 리포좀 제조
40/60의 몰비로 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 지질(화합물 VI) 및 부분적으로 수소화된 대두 포스파티딜콜린(PHSPC)을 둥근바닥 플라스크에서 클로로포름 및/또는 메탄올 중에 용해시켰다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 생성된 건조 지질 필름을 탈이온수로써 수화시켜 큰 다중라멜라 소포를 제조하였다.
비교 리포좀 제형물을 유사한 방법론에 의해 100 몰%의 PHSPC 및 40/60 몰비의 DDAB-콜레스테롤로써 제조하였다.
각 제형물의 리포좀 크기는 동적 광 분산에 의해 결정하였다.
실시예 3
핵산을 함유한 리포좀의 제조
A.포획된 DNA를 가진 리포좀의 제조
복합체를 하기와 같이 상온에서 제조하였다. 먼저, 400㎍ 루시퍼라제 리포터 플라스미드 DNA를 10분 동안 천천히, 계속적인 교반으로써 100㎍ 히스톤을 첨가함으로써 5% 글루코오스 용액에 응축시켰다.
5% 글루코오스에 12,000nm의 총 지질 양으로 40/60 몰비의 PHSPC 및 실시예 1에서 제조된 pH 반응성 지질(화합물 VI)의 용액을 pH=4로 조정하였다. 응축된 DNA 용액을 10분 동안 천천히 연속적으로 교반하면서 산성 리포좀 용액에 첨가하였다. DNA의 최종 농도는 0.25 mg/ml 이었고, 총 지질 농도는 7.5 mM 이었다. DNA 총 지질의 비는 30nmole 지질에 대해 1㎍ DNA 이었다.
B.DNase I 분석
DNA 단독 및 리포좀내에 포획된 DNA를 37℃에서 30분 동안 10mM MgSO4의 존재하에 DNase I으로써 처리하였다. 처리 후, 리포좀/DNase 혼합물을 페놀/CHCl3및 CHCl3로써 추출하여 DNA로부터 지질 및 단백질을 분리하였다.
포획된 DNA를 가진, DNase-처리된 리포좀으로부터 DNase 처리된 DNA 및 DNA 분획의 분취량을 에티디움 브로마이드를 함유한 1% 아가로스 겔 상에 적재하고, 전기영동하여 DNA의 완전성을 조사하였다. 대조군으로서, DNase를 처리하지 않은 DNA 및 리포좀을 1Kb DNA 표준물질과 더불어 겔 상에 적재하였다. 결과를 도 5에 보여준다.
본원에 인용된 특허, 특허 문서, 공보 등의 완전한 개시 내용이 각각 개별적으로 포함된 것처럼, 전적으로 참고로 포함된다. 본 발명에 대한 다양한 변형 및 변경이 본 발명의 범주를 벗어나지 않고 당업자에 명백할 것이다. 본 발명이 본원에 설명된 예증 구현예 및 실시예에 부당하게 제한될 의도가 아니며, 그러한 실시예 및 구현예는 하기와 같이 본원에 설명된 청구범위에 의해서만 제한될 의도인 본 발명의 범주로, 단지 실시예를 통해 제시된다는 것을 이해하여야 한다.

Claims (33)

  1. 하기 화학식을 가진 지질을 함유하는 리포좀 조성물:
    (식 중, R1및 R2각각은 탄소수 약 8 내지 약 24의 알킬 또는 알케닐 사슬이고; n = 1-20 이고; L 은 (i) -X-(C=O)-Y-CH2-, (ii) -X-(C=O)-, 및 (iii) -X-CH2- (식 중, X 및 Y 는 산소, NH, 및 직접 결합으로부터 독립적으로 선택된다)로 구성된 군으로부터 선택되고; Z 는 약 4.0 초과 내지 약 7.4 미만의 pK를 가지는 약 염기성 부분이다).
  2. 제 1 항에 있어서, X가 NH이고, Y가 산소인 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, L이 카르바메이트 연결, 에스테르 연결 또는 카르보네이트 연결인 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, L이 NH-(C=O)-O-CH2인 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, Z가 이미다졸인 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 약 1 내지 약 80 몰%의 지질을 함유하는 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, Z가 약 5.0 내지 약 6.5의 pK 값을 가지는 부분인 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, R1및 R2각각이 탄소수 약 8 내지 약 24의 비측쇄 알킬 또는 알케닐인 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, R1및 R2각각이 C17H35인 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, n이 1 내지 10 인 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서, 리포좀내에 포획된 치료용 화합물을 추가로 함유하는 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 치료제가 핵산인 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 핵산이 DNA, RNA, 및 이들의 보체로 구성된 군으로부터선택되는 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서, 표적 자리에 리포좀을 표적화시키는 리간드를 추가로 함유하는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 리간드가 내피 종양세포에 대한 결합 친화력을 가지며, 상기 세포에 의해 내부화(internalization)되는 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 리간드가 E-셀렉틴, Her-2 및 FGF로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  17. 제 1 항에 있어서, 리포좀이 친수성 중합체 사슬로써 유도화된 약 5 내지 약 20 몰%의 소포-형성 지질을 추가로 함유하는 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 친수성 중합체 사슬이 폴리에틸렌글리콜(PEG)인 조성물.
  19. 하기 화학식을 가진 지질:
    (식 중, R1및 R2각각은 탄소수 약 8 내지 약 24의 알킬 또는 알케닐 사슬이고; n = 1-20 이고; L 은 (i) -X-(C=O)-Y-CH2-, (ii) -X-(C=O)- 및 (iii) -X-CH2- (식 중, X 및 Y 는 산소, NH, 및 직접 결합으로부터 독립적으로 선택된다)로 구성된 군으로부터 선택되고; Z 는 약 4.0 초과 내지 약 7.4 미만의 pK를 가지는 약 염기성 부분이다).
  20. 제 19 항에 있어서, X가 NH이고, Y가 산소인 지질.
  21. 제 19 항에 있어서, L이 카르바메이트 연결, 에스테르 연결 또는 카르보네이트 연결인 지질.
  22. 제 19 항에 있어서, L이 NH-(C=O)-O-CH2인 지질.
  23. 제 22 항에 있어서, Z가 이미다졸인 지질.
  24. 제 19 항에 있어서, Z가 약 5.0 내지 약 6.5의 pK 값을 가지는 부분인 지질.
  25. 제 19 항에 있어서, R1및 R2각각이 탄소수 약 8 내지 약 24의 비측쇄 알킬또는 알케닐인 지질.
  26. 제 23 항에 있어서, R1및 R2각각이 C17H35인 지질.
  27. 제 19 항에 있어서, n이 1 내지 10 인 지질.
  28. 제 19 항에 따른 지질을 함유하는 리포좀.
  29. 제 26 항에 따른 지질을 함유하는 리포좀.
  30. 하기 화학식
    (식 중, R1및 R2각각은 탄소수 약 8 내지 약 24의 알킬 또는 알케닐 사슬이고; n = 1-20 이고; L 은 (i) -X-(C=O)-Y-CH2-, (ii) -X-(C=O)- 및 (iii) -X-CH2- (식 중, X 및 Y 는 산소, NH, 및 직접 결합으로부터 독립적으로 선택된다)로 구성된 군으로부터 선택되고; Z 는 약 4.0 초과 내지 약 7.4 미만의 pK를 가지는 약 염기성 부분이다)
    을 가진 지질을 함유하는 리포좀을 제조하고, 상기 리포좀을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 대상에 치료제를 전달하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 제조 과정이 리포좀내에 핵산을 포획하는 것을 포함하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 핵산이 DNA, RNA, 또는 이들의 보체인 방법.
  33. 제 30 항에 있어서, 제조 과정이 리포좀내에 단백질 또는 단백질 절편을 포획하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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