MXPA02002899A - Lipido cationico neutro para la administracion de acido nucleico y farmaco. - Google Patents

Abstract

Se describe un lipido que se representa mediante la formula (I), en donde cada una de R1 y R2 es una cadena de alquilo o alquenilo que tiene entre aproximadamente 8 hasta aproximadamente 24 atomos de carbono; n=1-20; L se selecciona a partir del grupo que consiste de (i) -X-(C=O)-Y-CH2-, (ii) -X-(C=O)-, y (iii) -X-CH2-, en donde X e Y se seleccionan independientemente a partir de oxigeno, NH y un enlace directo; y Z es una fraccion basica debil que tiene un pK de menos de aproximadamente 7.4 y mayor de aproximadamente 4.0.

Description

LIPIDO CAEIONICO NEUTRO PARA IA ADMINISTRACIÓN DE ACIDO NUCLEICO Y FÁRMACO Campo de la Invención La presente invención se relaciona con un lípido que tiene una fracción que es responsivo al pH de tal manera que el lípido es esencialmente neutro a un pH fisiológico, y tiene una carga predominantemente positiva a un pH menor que el pH fisiológico. La invención también se relaciona con una composición de liposomas que se prepara con el lípido.

Antecedentes de la Invención La transmisión de materiales biológicamente activos a las células, es un componente esencial de un rango amplio de terapias. Estas terapias incluyen suministrarle a una célula una proteína que tenga una actividad biológica necesaria, proporcionar una molécula de ácido nucleico (es decir, ADN, ARN, ADNc) a una célula (terapia de genes) , inmunizar a un sujeto contra una proteína extraña (vacunación) , inmunizar a un sujeto en contra de una proteína extraña mediante la introducción de un gen que codifica para la proteína (vacunación de genes), e inhibir la producción de una proteína en una célula por medio de proporcionarle a la célula una molécula de ácido nucleico que es antisentido, es decir, complementaria, al ARNm que codifica a la proteína o que interfiere de cualquier otra manera con el ARN m que codifica la proteína. Existen, sin embargo, diferentes obstáculos para administrar estos agentes a una célula, incluyendo el hecho de que la bicapa de fosfolípido que contiene la membrana externa de la mayoría de las células prohibe la entrada indiscriminada de materiales dentro de la célula. Los planteamientos que se describen para introducir los agentes activos dentro de las células incluyen, por ejemplo, la microinyección y la electroporación. Otros planteamientos incluyen vectores virales y la introducción mediada por productos químicos. Otro planteamiento para la administración de los agentes activos a las células, que se describen en la técnica, es la administración basada en liposomas. En particular, la administración de material genético a las células usando liposomas, se ha estudiado ampliamente. Generalmente, se entiende que las células captan las vesículas de liposomas por medio de la endocitosis e introducen la ruta de degradación lisosomal. De esta manera, se han hecho algunos esfuerzos hacia el diseño de liposomas que evitan la degradación. Un planteamiento ha sido incluir en el liposoma un lípido sensible al pH, tal como la palmitoilhomocisteína (Connor y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . (USA) 81:1715 (1984); Chu y Szoka, J. Liposome Res . , _ (1) : 361 (1994)). Estos lípidos sensibles al pH a un pH neutro se cargan de manera negativa y se incorporan de manera estable dentro de las bicapas de lípidos del liposoma. Sin embargo, en un pH acídico débil (pH menor de aproximadamente 6.8) el lípido se hace neutro en carga y cambia en estructura los suficiente para desestabilizar las bicapas del liposoma. El lípido, cuando se incorpora dentro de un liposoma que se ha tomado dentro de un endosoma, en donde se reporta que el pH es de entre aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.0, desestabiliza y provoca una liberación del contenido de liposoma . También se reporta ampliamente el uso de lípidos catiónicos, por ejemplo, derivados de glicolípidos con un amoníaco cargado de manera positiva o un cabeza de grupo que contiene iones de sulfonio, para la administración de biomoléculas cargadas negativamente, tales como oligonucleótidos y fragmentos de genes, como un componente bicapa de lípido del liposoma. El grupo de cabeza cargado de manera positiva del lípido interactúa con la superficie de la célula cargada de manera negativa, facilitando el contacto y la administración de la biomolécula a la célula. A pesar de estos esfuerzos, la administración de biomoléculas, tales como oligonucleótidos y otros materiales, como se describió anteriormente, a las células, todavía es una carencia en la técnica. La presente invención proporciona composiciones u métodos para mejorar la transferencia de un agente, tal como un ácido nucleico, a las células.

Compendio de la Invención La invención proporciona una composición de liposomas para la administración de un agente a una célula. La invención proporciona además un lípido para usarlo en una composición de liposomas para la administración de un agente a una célula. En un aspecto, la invención incluye una composición de liposomas que contiene un lípido que se representa por la fórmula: en donde cada una de R1 y R2 es una cadena de alquilo o de alquenilo que tiene entre aproximadamente 8 hasta aproximadamente 24 átomos de carbono; n=l-20; L se selecciona a partir del grupo que consiste de (i) -X- (C=0) -Y-CH2-, (ii) -X-(C=0)-, y (iii) -X-CH2-, en donde X e Y se seleccionan independientemente a partir de oxígeno, NH, y un enlace directo; y Z es una fracción básica débil que tiene un pK de menos de aproximadamente 7.4 y mayor de aproximadamente 4.0. En una modalidad específica, x es NH e Y es oxígeno.

En otras modalidades, L es un enlace de carbamato (NH-(C=0)-0-CH2) , un enlace de éster o un enlace de carbonato. En una modalidad preferida, Z es un imidazol. De preferencia, R1 y R2 son una cadena no ramificada de alquilo o alquenilo que tiene entre aproximadamente 8 hasta aproximadamente 24 átomos de carbono, y en una modalidad preferida, R1 y R2 son cada una grupos de estearilo (C?7H35) . En otra modalidad preferida, n es entre 1-10. Los liposomas, en una modalidad, incluyen entre aproximadamente 1 hasta aproximadamente 80 moles por ciento del lípido que tiene la fórmula que se mostró anteriormente. En otra modalidad, Z es una fracción que tiene un valor pK de entre aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.5 Los liposomas que tienen el lípido que se representa por la fórmula anterior, incluyen un compuesto terapéutico entrampado en los liposomas. En una modalidad, el agente terapéutico es un ácido nucleico, tal como ADN, ARN, o fragmentos de los mismos. Los liposomas también pueden incluir un ligando para fijar como blanco los liposomas en un sitio objetivo, tal como un ligando que tenga afinidad de fijación por las células de tumores endoteliales y el cual inicializan esas células, tales como E-selectina, Her-2 y FGF. En otra modalidad, los liposomas incluyen entre ^||^^^^| g^^^ ^ t ¿ m má aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 moles por ciento de una lípido que forma vesículas que se deriva con una cadena de polímeros hidrofílicos. La cadena de polímeros hidrofílicos en una modalidad preferida es el polietilenglicol (PEG) .

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra un esquema sintético para la preparación de un lípido que tiene un enlace de carbamato y un grupo de imidazol Z; Las Figuras 2A-2D muestran elementos de reacción sintéticos para la preparación de los lípidos responsivos al pH; Las Figuras 3A-3D muestran varias estructuras de lípidos responsivos al pH: La Figura 4 es una gráfica que muestra el potencial zeta, en mV, como una función del pH medio para los liposomas que se prepararon con el lípido de la invención (triángulos abiertos), un lípido catiónico (diamantes cerrados) y un lípido neutro (cuadrados cerrados) ; La Figura 5 es una micrográfica del ensayo de electroforesis por gel de los liposomas que se prepararon con el lípido responsivo al pH de la invención que tiene ADN entrampada, en donde los liposomas se expusieron a la ADNasa I durante 30 minutos (Línea 1) ; los liposomas que se prepararon con el lípido responsivo al pH de la invención, que tiene ADN entrampado (Línea 2); el ADN expuesto a la ADNasa I durante 30 minutos (Línea 3); ADN (Línea 4); y el estándar de escalera de ADN de lkB (Línea 5) ; y Las Figuras 6A-6D son imágenes de micrográficas de células de tumor de pulmón humanas in vi tro después de la transfección con los liposomas que se prepararon con el lípido responsivo al pH de la invención y un anticuerpo objetivo. Los liposomas incluyen un plásmido entrampado que codifica para la proteína de fluorescencia verde, en donde la Figura 6A muestra las células que se transfectaron vistas bajo microscopía de fluorescencia y la Figura 6B muestra las células que se transfectaron, vistas bajo microscopía de luz. Las Figuras 6C-6D son micrográficas de las células después de la transfección con liposomas similares que no tienen el anticuerpo objetivo, en donde las células después de la incubación con los liposomas, se muestran bajo microscopía de fluorescencia en la Figura 6C y bajo microscopía de luz en la Figura 6D.

Descripción Detallada de la Invención I. Al describir la presente invención, se usará la siguiente terminología, de conformidad con las definiciones que se establecen más adelante. "Acido nucleico", como se usa en la presente, se refiere a una forma polimérica lineal de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o deoxinucleótidos, e incluye ADN y ARN tanto de doble cadena, como de una sola cadena. Un ácido nucleico puede incluir regiones tanto codificadoras como no codificadoras que se pueden obtener directamente a partir de una fuente natural (por ejemplo, un microorganismo) , o se pueden preparar con la ayuda de técnicas recombinantes o sintéticas. Una molécula de ácido nucleico pudiera ser equivalente a un fragmento de ácido nucleico o puede ser un fragmento de ácido nucleico en adición a uno o más nucleótidos, oligonucleótidos, o polinucleótidos. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico de la invención puede ser un vector o plásmido tal como un vector o plásmido de expresión o de clonación. Como se usa en la presente, un lípido "neutro" es uno que no está cargado, es decir, que no tiene carácter iónico. Un lípido "cargado" es uno que tiene una carga positiva o negativa, es decir, que tiene carácter iónico. Un "lípido formador de vesículas" se refiera un lípido anfifático que contiene fracciones de grupo de cabeza hidrófobas y polares, las cuales se pueden formar de manera espontánea en una vesícula de dos capas en agua, como se ejemplifica mediante un fosfolípido, o se incorpora de manera estable en bicapas de lípidos, con la fracción hidrófoba en contacto con la región hidrófoba interior de la membrana bicapa, y la fracción del grupo de cabeza polar orientada hacia la superficie polar exterior de la membrana. El lípido formador de vesículas de este tipo típicamente incluye una o más cadenas de hidrocarburos de acilo hidrófobas o un grupo esferoide, y puede contener un grupo reactivo de manera química, tal como una amina, ácido, éster, aldehido o alcohol, en el grupo de cabeza polar. Incluidos en esta clase están los fosfolípidos, tales como colina de fosfatidilo (PC), etanolamina de fosfatidilo (PE), ácido fosfatídico (PA) , inositol de fosfatidilo (Pl), y esfingomielina (SM) , en donde las dos cadenas de hidrocarburo tienen típicamente de entre aproximadamente 14 hasta aproximadamente 22 átomos de carbono de longitud, y tienen grados variables de insaturación. También se incluye dentro del alcance del término "lípido formador de vesículas" un glicolípido, tales como un cerebrosido y un gangliosido, y un esterol, tal como el colesterol. "Alquilo" se refiere a un radical monovalente completamente saturado que contiene carbono e hidrógeno, el cual puede ser una cadena ramificada o recta. Los ejemplos de los grupos de alquilo son metilo, etilo, n-butilo, t-butilo, n-heptilo, e isopropilo. El "alquilo inferior" se refiere a un radical de alquilo de uno a seis átomos de carbono, como se ejemplifica por el metilo, etilo, n-butilo, i-butilo, t-butilo, isoamilo, n-pentilo e isopentilo.

"Alquenilo" se refiere a un radical monovalente que contiene carbono e hidrógeno, el cual puede ser una cadena ramificada o recta, que contiene uno o más enlaces dobles. Abreviaturas: PEG: polietilenglicol; PEG : polietilenglicol terminado en metoxi; Col: colesterol; PC: colina de fosfatidilo; PHPC: colina de fosfatidílo parcialmente hidrogenado; PHEPC: colina de fosfatidilo de huevo parcialmente hidrogenado; HSPC: colina de fosfatidilo de soya hidrogenada; DSPE etanolamina de fosfatidilo de diestearoilo; APD: l-amino-2, 3-propanodiol; DTPA: ácido dietilentetraminpentaacético; Bn: bencilo.

II . Lípido Neutro Catiónico En un aspecto, la invención incluye lípidos que se representan mediante la estructura que se muestra a continuación: en donde cada una de R1 y R2 es una cadena de alquilo o de alquenilo que tiene entre aproximadamente 8 hasta aproximadamente 24 átomos de carbono; n=l-20, y en una modalidad preferida es de entre 1-10; L se selecciona a partir del grupo que consiste de (i) -X- (C=0) -Y-CH2-, (ii) - ¿ ?l m^ M * m*m~á *M*^ X-(C=0)-, y (iii) -X-CH2-, en donde X e Y se seleccionan independientemente a partir de oxígeno, NH, y un enlace directo; y Z es una fracción básica débil que tiene un pK de menos de aproximadamente 7.4 y mayor de aproximadamente 4.0. La fracción básica débil Z da como resultado un lípido que a un pH fisiológico de aproximadamente 7.4 está predominantemente, por ejemplo, en una cantidad de cuando menos 50 por ciento, neutro en carga pero a un pH seleccionado o especificado, tiene un valor menor que el pH fisiológico y tiende a un valor positivo. Por ejemplo, en una modalidad, Z es una fracción de imidazol, la cual tiene un pK de aproximadamente 6.0. A un pH fisiológico de 7.4, esta fracción es predominantemente neutra, pero a valores de pH de menos de 6.0, la fracción se hace predominantemente de carga positiva. Como se describirá más adelante, se preparó un lípido que tenga una fracción de imidazol y se usó en la preparación de los liposomas. Una fracción Z adecuada incluye, por ejemplo, aminas aromáticas, anilina, aminoazúcares, y las estructuras de lípidos ejemplares que se describen más adelante. En otra modalidad, Z es una fracción que tiene un valor pK de entre aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 7.0, de más preferencia de entre aproximadamente 4.8 hasta aproximadamente 6.5 y de más preferencia de entre aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.0. lililí liiiiirÜÉJiliiiÜliiMi ^H^l Los lípidos de la invención incluyen un enlace neutro, L, que une la fracción Z y la porción de cola del lípido. El enlace L puede variar, pero en una modalidad, se selecciona a partir de un carbamato, un éster, un carbonato, una urea, una amina, y un éter. En un lípido preparado preferido, se emplea un enlace de carbamato, en donde L es -X- (C=0)-Y-CH2-, X es NH e Y es oxígeno. En la porción de cola del lípido, R1 y R2 son iguales 0 diferentes. R1 y R2 pueden ser una cadena de alquilo o alquenilo sin ramificaciones que tiene de entre aproximadamente 8 hasta aproximadamente 22 átomos de carbono de longitud, con R1 = R2 = C?H33 (de manera que el grupo es un grupo oleoilo) . El lípido de la invención se puede preparar usando métodos sintéticos estándares. Se preparó un lípido que tiene la estructura que se mostró anteriormente, en donde A es un imidazol, N=2 es un carbamato, y R1 = R2 = C?7H33. En la Figura 1 se muestra un esquema de reacción para la preparación de este lípido. Los detalles completos de la síntesis también se proporcionan en el Ejemplo 1. Brevemente, se preparó carbonato de para-nitrofenilo del glicerol de 1,2-diestearoilo (Compuesto III), a partir de 1, 2-diesteaoil-sn-glicerol (Compuesto I) y cloroformato de para-nitrofenilo (Compuesto II) y se hizo reaccionar con histamina (Compuesto IV), para producir un lípido (Compuesto VI) que tiene una fracción de imidazol enlazada a una cola de diestearoilo por medio de un enlace de carbamato. También se puede usar una síntesis similar, usando glicerol en lugar de l-amino-2,3~ propanodiol, para producir un producto enlazado con carbonato (L = -0-(C=0)-0-CH2 - u -0-(C=0)CH2-) . Dada la guía y los ejemplos en la presente, se pueden conseguir fácilmente otras síntesis de un lípido que tenga otros enlaces por parte de aquellos expertos en la técnica. Otros enlaces incluyen, por ejemplo, éter (L = 0-CH2-) y enlaces de éster (L = -0-(C=0)-), así como enlaces de amida, urea y amina (es decir, en donde L = -NH- (C=0) -NH-, -NH- (C=0)-CH2-, -NH-(C=0)-NH-CH2-, ó -NH-CH2-) . También se puede preparar un enlace queto, en donde L es un enlace directo.

Las Figuras 2A-2B ilustra la preparación de un lípido enlazado con éter (Figura 2A) y un lípido enlazado con éster (Figura 2B) , respectivamente. En la Figura 2A, la amina terminal de la histamina se hace reaccionar con cloruro de glicidilo, hidrolizando el epóxido resultante y acilatando el diol resultante. En la Figura 2B, se preparó un lípído enlazado con éster (L = -0-(C=0)- u -O- (C=0) -CH2-) , por ejemplo, por medio de hacer reaccionar la histamina con un derivado activo de acetonido de ácido glicérico (ácido 2, 2-dimetil-l, 3-dioxolano-4-carboxílico) o el homólogo de cuatro carbonos, el ácido 2, 2-dimetil-l, 3-dioxolano-4-acético. El diol se desprotege subsecuentemente y se acilata. Las Figuras 2C y 2D muestran esquemas de reacción adicionales para la preparación de lípidos responsivos al pH, de conformidad con la presente invención. Las Figuras 3A-3D muestran diferentes estructuras de lípidos responsivos al pH, en donde las Figuras 3A-3B muestran lípidos que tienen una amina aromática como la fracción "Z". Las Figuras 3C-3D muestran lípidos que tienen un aminoazúcar unido a un lípido.

III . Composición de Liposomas A. Componentes del Liposoma Los liposomas que contienen el lípido que se describió anteriormente se pueden preparar mediante una variedad de técnicas, tales como aquellas que se describen en Szoka y colaboradores, Ann . Rev. Biophys . Bioeng. , 9 : 461 (1980), y los ejemplos específicos de liposomas que se preparados que se describen de manera completa más adelante.

Típicamente, los liposomas son vesículas de múltiples láminas (MLVs) , los cuales se pueden formar mediante técnicas sencillas de hidratación de lípido-película . En este procedimiento, se disuelve una mezcla de lípidos formadores de liposomas, del tipo que se detalla más adelante, en un solvente orgánico adecuado el cual se evapora entonces en un recipiente, para formar una pel{icula delgada. La película de lípido se cubre subsecuentemente por un medio acuoso, hidratando para formar MLVs, típicamente con tamaños entre aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 10 micrones. Los liposomas que se prepararon en la presente invención incluyen, por ejemplo, liposomas que tienen entre aproximadamente 1 hasta aproximadamente 80 moles por ciento del lípido y la estructura que se dio anteriormente. En las modalidades preferidas, los liposomas incluyen entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50 moles por ciento del lípido. El resto de los componentes del lípido del liposoma puede incluir además, por ejemplo, una variedad de lípidos formadores de vesículas, es decir, lípidos que se forman de manera espontánea en vesículas de dos capas en agua, como se ejemplificó mediante los fosfolípidos. Los lípidos formadores de vesículas de este tipo son de preferencia los que tienen dos cadenas de hidrocarburo, típicamente cadenas de acilo, y un grupo de cabeza, ya sea polar o no polar. Existe una variedad de lípidos formadores de vesículas sintéticos y lípidos formadores de vesículas que ocurren de manera natural, incluyendo los fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilgli-cerol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, fosfatidilino-sitol, y esfingomielina, en donde las dos cadenas de hidrocarburo tienen típicamente entre aproximadamente 12 hasta aproximadamente 22 átomos de carbono de longitud, y m^ ilill lllilllll-i-ÉIIÉiÉlilHBiÉlllil ^ tienen grados variables de insaturación. Los liposomas pueden incluir además un lípido que se incorpora de manera estable dentro de la bicapa de lípido del liposoma, tales como diacilgliceroles, liso-fosfolípidos, ácidos grasos, glicolípidos, cerebrósidos y esteróles, tal como colesterol. En una modalidad, los liposomas de la invención incluyen un cubierta superficial de una cadena de polímero hidrofílico. "Cubierta Superficial", como se usa en la presente, se refiere a la cubierta de un polímero hidrofílico sobre la superficie de los liposomas. El polímero hidrofílico se incluye en el liposoma por medio de incluirlo en una composición de liposomas uno o más lípidos formadores de vesículas que se derivatizan con una cadena de polímero hidrofílico. Los liposomas que tienen esta cubierta son conocidos en la técnica, y se han descrito, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,013,556. La cubierta superficial de las cadenas de polímero hidrofílico es efectiva para incrementar el tiempo de vida de la circulación sanguínea in vivo de los liposomas, cuando se compara con los liposomas que carecen de esta cubierta. Los lípidos formadores de vesículas adecuados para la derivatización con un polímero hidrofílico incluyen, por ejemplo, cualesquiera de los lípidos que se enlistaron anteriormente, y, en particular fosfolípidos, tales como la fosfatidiletanolamina de diestearoilo (DSPE) . Los polímeros hidrofílicos adecuados para la derivatización con un lípido formador de vesículas incluyen, por ejemplo, polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, poli-metiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxa-zolina, polihidroxipropilmetacrilamina, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, polihidroxipropilmetacrilato, poli-hidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietilenglicol, poliaspartamida y secuencias de péptidos hidrofílicos. Los polímeros se pueden emplear como homopolímeros o como copolímeros en bloque o aleatorios. Una cadena de polímeros hidrofílicos preferida es el polietilenglicol (PEG) , que tiene de preferencia un peso molecular de entre aproximadamente 500 hasta aproximadamente 10,000 daltones, de más preferencia de entre aproximadamente 1,000 hasta aproximadamente 5,000 daltones. Los análogos cubiertos con metoxi o etoxi de PEG, también son polímeros hidrofílicos preferidos. Estos polímeros están disponibles comercialmente en una variedad de tamaños de polímero, por ejemplo, de entre aproximadamente 120 hasta aproximadamente 20,000 daltones. La preparación de los lípidos formadores de vesículas que se derivatizan con los polímeros hidrofílicos se ha descrito en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,395,619, y en Zalipsky STEALTH LIPOSOMES, (D. Lasic y F. Martín, Eds., CRC Press, capítulo 9 (1995) ) . Los liposomas que tienen esta cubierta contienen de preferencia de entre aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 moles por ciento del lípido derivatizado con los componentes formadores de liposoma restantes, por ejemplo, los lípidos formadores de vesículas. En las Patentes de los Estados Unidos de copropiedad Números 5,013,556, 5,631,018 y 5,395,619, se han descrito los métodos ejemplares para preparar los lípidos derivatizados y para formar los liposomas cubiertos con polímeros. El polímero hidrofílico se puede acoplar de manera estable con el lípido, o acoplarse a través de un enlace inestable que permite que los liposomas cubiertos esparzan la cubierta de las cadenas de polímeros a medida que circulan en la corriente sanguínea o en respuesta a un estímulo. Los liposomas también pueden incluir un agente entrampado, en donde el término "entrampado" incluye la encapsulación de un agente en el núcleo acuoso y espacios acuosos de liposomas, así como el entrampamiento de un agente en las dos capas de lípidos del liposoma. Los agentes útiles en la composición de la invención son ampliamente variados, e incluyen, por ejemplo, agentes para aplicaciones terapéuticas así como aplicaciones de diagnóstico. El agente terapéutico o de diagnóstico Itjjüiji^ seleccionado se puede incorporar dentro de los liposomas mediante métodos estándares, que incluyen: (i) entrampamiento pasivo de un compuesto soluble en agua por medio de hidratar una película de lípido con una solución acuosa del agente; (ii) entrampamiento pasivo de un compuesto lipofílico por medio de hidratar una película de lípido que contenga el agente; y (iii) cargar un fármaco ionizable contra un gradiente de pH de liposoma interno/externo. Otros métodos adecuados incluyen la preparación de liposoma de fase de evaporación inversa. En una modalidad preferida, los liposomas incluyen un ácido nucleico, que se selecciona a partir de ácidos nucleicos basados en ADN y ARN, que incluyen fragmentos, es decir, truncamientos, mutaciones, y análogos de los mismos. En la técnica se ha descrito una variedad de genes para el tratamiento de diferentes condiciones, y las secuencias de codificación y/u ORFs para los genes específicos de interés, se pueden recuperar fácilmente a partir de bancos de datos de ADN, tal como el GenBank o el EMBL. Por ejemplo, se han descrito los polinucleótidos para el tratamiento de enfermedades y condiciones virales, malignas e inflamatorias, tales como fibrosis cística, deficiencia de deaminasa de adenosina, y SIDA. Se contempla el tratamiento de cánceres mediante la administración de genes supresores de tumores, tales como APC, DPC4, NF-1, NF-2, MTSl, RB, p53, WTl, BRCAl, BRCA2, y VHL. Los ejemplos de los ácidos nucleicos específicos para el tratamiento de una condición específica incluyen, por ejemplo: HLA-B7, tumores, carcinoma colorrectal, melanoma; IL-2, cánceres, especialmente el cáncer de pecho, cáncer de pulmón, y tumores; IL-4, cáncer; TNF, cáncer; IGF-1 antisentido, tumores de cerebro; IFN, neuroblastoma; GM-CSF; carcinoma de célula renal; MDR-1, cáncer, especialmente cáncer avanzado, cánceres de pecho y de ovarios; y quinasa de timidina HSV, tumores de cerebro, tumores de cabeza y cuello, mesotelioma, cáncer de ovarios. Loa ácidos nucleicos de la invención pueden ser "ácidos nucleicos antisentido" que se componen de secuencias complementarias a su objetivo, típicamente un ARN mensajero (ARNm) o un ARNm precursor. El ARNm típicamente contiene información genética en la orientación funcional o de sentido, y la fijación del polinucleótido antisentido puede desactivar el ARNm pretendido y evitar la traducción a la proteína. Estos ácidos nucleicos antisentido se determinan basándose en experimentos bioquímicos que muestran que las proteínas se traducen a partir de ARNs específicos. Una vez que se conoce la secuencia del ARN, se puede diseñar un ácido nucleico antisentido que se fijará al ARN a través de los pares de base Watson-Crick suplementarios. Estos ácidos nucleicos antisentido típicamente contienen entre .-^^Mii-t_HfetÉ4s_Ii^Mjl.-k«lÉ,„tti,......... fe.. ....t^^..?. >.í f M¡ií ?&.t ? i iá í aproximadamente 10 hasta aproximadamente 40 pares de base, de más preferencia, entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 25 pares de base, y de mayor preferencia entre aproximadamente 15 hasta aproximadamente 20 pares de base. El ácido nucleico antisentido se puede modificar para una resistencia mejorada a la hidrólisis de la nucleasa. Estos análogos incluyen, por ejemplo, fosforotioato, metilfosfonato, fosfodiéster, y oligonucleótidos p-etoxi (vea, por ejemplo, la WO 97/07784) . El agente entrampado puede ser también una riboenzima o ARN catalítico. El ácido nucleico también se puede insertar dentro de un plásmido o vector, de preferencia uno que sea una molécula circulada o de doble cadena cerrada que tenga tamaños de preferencia en el rango de 5-40 Kbp (parbase por kilo) . Estos plásmidos o vectores se construyen de conformidad con métodos bien conocidos e incluyen un ácido nucleico o gen terapéutico, es decir, el gen o ácido nucleico que se va a expresar en la terapia de genes, bajo el control de un promotor adecuado y mejorador, y otros elementos necesarios para la duplicación dentro de la célula anfitriona y/o la integración dentro del genoma de la célula anfitriona. Los métodos para preparar los plásmidos y vectores útiles para la terapia de genes son ampliamente conocidos y nombrados en la técnica.

Los ácidos nucleicos, tal como un plásmido de ADN, se pueden entrampar en un liposoma mediante el entrampamiento pasivo durante la hidratación de la película de lípido del liposoma. Otros procedimientos para entrampar ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, la condensación del ácido nucleico en una forma de una sola molécula, en donde el ácido nucleico se suspende en un medio acuoso que contiene agentes tales como sulfato de protamina, espermina, espermidina, histona, usina, o mezclas de las mismas, u otro agente de condensación policatiónico adecuado, bajo condiciones que son efectivas para condensar el ácido nucleico en partículas pequeñas. La solución de las moléculas de ácido nucleico condensado se usa para rehidratar una película de lípido seca para formar liposomas con el ácido nucleico en forma entrampada. En otra modalidad, los liposomas se pueden preparar para que contengan grupos superficiales, tales como anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, moléculas efectoras pequeñas para interactuar con los receptores superficiales de la célula, antígenos, y otros compuestos similares para conseguir las propiedades de fijación al objetivo deseadas para las poblaciones de células específicas. Estos ligandos se pueden introducir en los liposomas por medio de incluir en los lípidos liposomales un lípido que se derivatiza con la molécula de objetivo, o un lípido que tiene un grupo químico ,"?íKfff? :. de cabeza polar que se puede derivatizar con la molécula objetivo en los liposomas formados previamente. Los lípidos se pueden derivatizar con un ligando objetivo por medio de unir de manera covalente el ligando al extremo distal libre de una cadena de polímeros hidrofílica, la cual se une en su extremo proximal a un lípido formador de vesículas. Existe una variedad amplia de técnicas para unir un polímero hidrofílico seleccionado a un lípido seleccionado y activar el extremo libre, no unido del polímero para la reacción con un ligando seleccionado. En particular, el polímero hidrofílico PEG se ha estudiado ampliamente (Alien, T.M., y colaboradores, Biochemical et Biophysica Acta 1237:99-108 (1995); Zalipsky, S., Bioconj uga te Chem . 4(4):296-299 (1993); Zalipsky, S., y colaboradores, FEBS Lett . 353:71-74 (1994); Zalipsky, S., y colaboradores, Bioconj uga te Chemistry, 705-708 (1995); Zalipsky, S., en STEALTH LIPOSOMES (D. Lasic y F. Martin, editores) capítulo 9, CRC Press, Boca Ratón, FL (1995)). Los ligandos objetivos son bien conocidos para aquellos de experiencia en la técnica, y en una modalidad preferida, el ligando objetivo es uno que tiene afinidad de fijación con las células de tumor endotelial, y de preferencia se incorpora mediante las células. Estos ligandos frecuentemente se fijan a un dominio extracelular de un receptor de factor de crecimiento. - „ . fc i I i «JBtffcfJ.'SJ Los receptores ejemplares incluyen el producto de proteína c-erbB-2 del oncogen HER2/neu, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) , el receptor de crecimiento de fibroblasto básico (FGF básico) el receptor del factor de crecimiento endotelial del receptor y vascular, receptores de E-, L- y P-selectina, receptor de folato, receptor de CD4, receptor de CD 19, receptor de integrina aß, y receptores de quemocina. De conformidad con la invención, los liposomas preparados se pueden formar a la medida para que tengan tamaños sustancialmente homogéneos en un rango de tamaños seleccionado, típicamente entre aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 0.5 micrones, de más preferencia entre aproximadamente 0.03 hasta aproximadamente 0.40 micrones. UN método para hacer al tamaño efectivo para los REVs y los MLVs incluye extruir una suspensión acuosa de los liposomas a través de una serie de membranas de policarbonato que tienen un tamaño de poro uniforme seleccionado en el rango de aproximadamente 0.03 hasta aproximadamente 0.20 micrones, típicamente aproximadamente 0.05, 0.08, 0.10 ó 0.20 micrones. El tamaño de poro de la membrana corresponde aproximadamente a los tamaños m{as grandes de los liposomas que se produjeron mediante extrusión a través de esa membrana, particularmente en donde la preparación se extruye dos o más veces a través de la misma membrana. Los métodos de homogeneización también son útiles para reducir de tamaño los liposomas de 100 nm o menos (Martin, F.J., en SPECIALIZED DRUG DELIVERY SYSTEMS- MANUFACTURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY, (P. Tyle, ed.) Marcel Dekker, Nueva York, págs. 267-316 (1990)).

B. Preparación y Caracterización de las Composiciones Ejemplares Los liposomas, que se describen en el Ejemplo 1, que tienen una fracción de imidazol enlazada a una cola de diestearoilo por medio de un enlace de carbamato, se prepararon como se describe en el Ejemplo 2. Los liposomas estaban compuestos de 60 moles por ciento de fosfatidilcolma (PHSPC) de frijol de soya parcialmente hidrogenado, y 40 moles por ciento de lípido de imidazol-carbamato- diestearoilo. Los liposomas en la composición tuvieron un tamaño de partícula promedio de 80 nanómetros (nm) después de la sonificación. El potencial zeta de estos liposomas se midió como una función del pH y los resultados se muestran en la Figura 4 (triángulos abiertos) . Para comparación, se prepararon dos composiciones de liposomas que no contenían el lípido de la invención. Una composición incluía un lípido catiónico, mientras que la otra composición consistía de un solo lípido neutro, el PHSPC. La composición de liposomas catiónicos se componía de 55 moles por ciento de dimetildioctadecilamonio (DDAB) y 45 moles por ciento de colesterol. Los valores del potencial zeta proporcionan una medida de la carga aparente en la superficie externa de los liposomas. De manera más específica, el potencial zeta es una medida del potencial que surge a través de la interfase entre una capa de límite líquida en contacto con un sólido y la capa difusa móvil en el cuerpo del líquido, por ejemplo, el plano de deslizamiento. Los valores del potencial zeta se midieron como se establece en la sección de métodos más adelante, usando un aparto disponible comercialmente. En la Figura 4, un liposoma que se preparó con el lípido de imidazol-carbamato-diestearoilo (triángulos abiertos) mostró una relación fuerte entre el potencial zeta y el pH del medio circundante. Como se observó, a los valores de pH de menos de aproximadamente 5.0, el potencial zeta fue relativamente constante a aproximadamente 65 milivoltios (mV) . A medida que se incrementó el pH del medio, el potencial zeta disminuyó rápidamente. En contraste, los liposomas catiónicos (por ejemplo, liposomas de DDAB-colesterol, diamantes sólidos) , y la formulación de liposoma neutra (cuadrados sólidos) tuvo menos cambio en el potencial zeta a medida que se incrementó el pH de la suspensión. El rápido cambio en el potencial zeta de los liposomas que contenían los lípidos de imidazol-carbamato-diestearoilo como el pH del medio de suspensión, se ^ ^^jül incrementó debido a la propiedad de pK de la fracción de imidazol. El pK del imidazol es de aproximadamente un pH de 6.0. A un pH de menos de 6.0, la fracción de imidazol es predominante, por ejemplo, mayor del 50 por ciento, de carga positiva, y el potencial zeta de los liposomas que contienen el lípido de imidazol-carbamato-diestearoilo tiende a positivo. A un pH más elevado de 6.0, el imidazol se vuelve de carga neutra, por ejemplo, mayor del 50 por ciento neutro, y el potencial zeta positivo de los liposomas que contienen el lípido de imidazol-carbamato-diestearoilo disminuye, o tiende a neutro. En otro experimento, se prepararon los liposomas que incluían el lípido de imidazol-carbamato-diestearoilo (preparado como se describe en el Ejemplo 1), y contenía ADN entrampado. Como se describe en el Ejemplo 3A, el ADN del plásmido condensado se puso en contacto con los liposomas que contenían una proporción molar de 60/40 de PHSPC y el lípido de imidazol-carbamato-diestearoilo. Se ajustó el pH de la solución de liposomas a aproximadamente 4.0 antes de ponerse en contacto con el ADN condensado. A un pH de aproximadamente 4.0, el grupo de cabeza del imidazol en el lípido, se carga positivamente de manera que el ADN cargado de manera negativa llega a estar electrostáticamente unido al lípido. Con agitación continúa, los liposomas se forman alrededor del ADN que entrampa el ADN dentro de las dos capas del lípido. De conformidad con lo anterior, la invención proporciona un método para entrampar de manera eficiente un agente cargado de manera negativa por medio de preparar los liposomas con un lípido responsivo al pH y poniendo en contacto el agente con los liposomas bajo condiciones en donde el lípido responsivo al pH tiende hacia la carga positiva. Los liposomas que tienen ADN entrampado se compararon con una muestra que contenía solamente ADN. Estas dos muestras se trataron con DNasa I durante 30 minutos (ver Ejemplo 3B) . Después del período de tratamiento, se cargó un alícuota de cada muestra sobre un gel de agarosa que contenía bromuro de etidio y se sometió a electroforesis. Las muestras de los mismos liposomas y el ADN que no se trató con la DNasa I también se cargaron sobre el gel de agarosa. La Figura 5 es una micrográfica del ensayo de electroforesis de gel de estas muestras. La Línea 1 es de los liposomas tratados con DNasa I; la Línea 2 es la de liposomas (que no se trataron con la DNasa I) ; la Línea 3 es el ADN que se trató con la DNasa I; la Línea 4 es el ADN; y la Línea 5 es un estándar de escalera de ADN de 1 kB. La Figura 5 muestra que el ADN entrampado en los liposomas estuvo protegido de la digestión por parte de la DNasa I, (por medio de comparar la Línea 1 con la Línea 3, en donde la DNasa I digirió el ADN solo) . En otro estudio, se prepararon los liposomas que incluían un lípido responsivo al pH y un anticuerpo objetivo. Estos liposomas se usaron para la transfección in vi tro de células de tumos de pulmón humanas. De manera específica, un vector del plásmido reportero de ADN pEGFP-Cl (Clontech, Palo Alto CA) que contenía el gen de proteína de fluorescencia verde se entrampó en los liposomas, se insertó un anticuerpo anti-integrina 1F11 Fab' dentro de las dos capas del lípido por medio de incubar los liposomas con micelas de 1F11-Fab'-conjugado con el polietilenglicol-DSPE (PEG-DSPE) . El conjugado de 1F11-Fab' -PEG-DSPE se preparó usando tecnología convencional por medio de unir el anticuerpo en la maleimida de la terminal N del PEG-DSPE, como se describe, por ejemplo, en Zalipsky, STEALTH LIPOSOMES, (D. Lasic y F. Martin, eds, . CRC Press, capítulo 9 (1995)). Se incubaron las micelas que contienen el anticuerpo y los liposomas durante toda la noche a la temperatura ambiente. La línea 2E9 de las células de tumor de pulmón humanas, que tenían un receptor de integrina, se incubaron con los liposomas in vi tro. Los liposomas que contenían el conjugado de 1F11-PEG-DSPE y los liposomas de control que carecían de anticuerpo (que contenían PDG-DSPE con anticuerpo ausente) se incubaron con las células a una concentración de 5 µg ADN/70 nmoles lípido por mililitro durante 4 horas a 37 °C. Después del período de incubación, se cambió elmedio para remover los liposomas. La fluorescencia verde se examinó 24 horas después de la transfección, y los resultados se muestran en las Figuras 6A-6D. Las Figuras 6A-6D son micrográficas para las células que se transfectaron con los liposomas conjugados con 1F11. La Figura 6A muestra las células vistas bajo microscopía de fluorescencia y la Figura 6B muestra las células vistas bajo microscopía de luz. La Figura 6A muestra que las células se transfectaron, como se evidencia por las regiones de luz, las cuales corresponden con las células fluorescentes. Las Figuras 6C-6D son imágenes de las células que se transfectaron con la formulación de control que carecían del anticuerpo objetivo. No ocurrió ninguna transfección, como lo evidencia la carencia de fluorescencia cuando se vieron las células mediante microscopía de fluorescencia (Figura 6C) . El lípido de la invención incluye una reacción que es responsiva al pH de manera que a un pH de aproximadamente 7.4 el lípido es esencialmente neutro. De esta manera los liposomas, cuando se administran a un sujeto, tal como un mamífero, por ejemplo, un ser humano, están sin cargar, lo cual permite un tiempo de circulación sanguínea más prolongado que el que se consigue con liposomas cargados. Los liposomas que están endocitados o que alcanzan una región in vivo específica en el donde el pH es menor, llegan a estar cargados a medida que el lípido se carga positivamente. Esto üÉMto??üüÉiMilá ^j i . se debe a los liposomas que tienen una fracción responsiva al pH. Esto puede ocurrir, por ejemplo, en una región de tumor o en un lisosoma. De esta manera, un liposoma que tenga una fracción de imidazol, la cual tiene un pK de aproximadamente 6.0, se hará predominantemente positivo a valores de pH menores de 6.0. Por lo tanto, en un endosoma en donde el pH es de entre aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.0, los protenatos del lípido facilitan la captación y la liberación del ADN entrampado dentro del citoplasma de la célula (Xu y Szoka, Biochemistry, 35:5616-5623 (1996)). En los Ejemplos más adelante se establece una ilustración adicional de este principio.

Ejemplos Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención.

Materiales : Los siguientes materiales se obtuvieron a partir de la fuente indicada: fosfatidilcolina de frijol de soya parcialmente hidrogenada (Vernon Walden Inc., Green Village, NJ) ; colesterol (Solvay Pharmaceuticals, Países Bajos) ; etanolamina de dioleoilfosfatidilo (DOPE) y dimetildioctadecilamonio (DDAB) (Avanti Polar Lipids, Inc., Birmingham, AL).

Métodos: Se realizó diseminación de luz dinámica usando un iÉÉÜÉiÜpli ni i II r-^^— ^ Coulter N4-MD (Coulter, Miami, FL) Potencial Zeta: El potencial Zeta se midió usando un ZETASIZER 2000 de Malver Instruments Inc. (Southborough MA) . El instrumento se operó como sigue: número de mediciones: 3; retardo entre mediciones: 5 segundos; temperatura: 25C; viscosidad: 0.89 cP; constante dieléctrica: 79; tipo de célula: flujo capilar; límites zeta: -150 mV a 150 mV.

EJEMPLO 1 Preparación del Lipido Ejemplar A. Preparación de carbonato de para-nitrofenilo de diestearoilglicerol Como se ilustra en la Figura 1, se secó 1,2-diestearoil-sn-glicerol (500 miligramos, 0.8 mmoles; Compuesto I) de manera azeotrópica con benceno (3 veces con evaporador giratorio) . Se agregaron el cloroformato de para-nitrofenilo (242 miligramos, 1.2 mmoles, 1.5eq; Compuesto II), la 4-dimetilaminopiridina (10 miligramos, 0.08 mmoles, O.leq), y la trietilamina (334 µl, 204 mmoles, 3eq) a 1,2-diestearoilglicerol en CHC13 (5 mililitros) . Se agitó la mezcla de reacción a la temperatura ambiente durante 2 horas. El TLC mostró que la reacción estaba completa. Se diluyó la mezcla con CHC13 (50 mililitros) y se extrajo con ácido cítrico al 10 por ciento (3 X 15 mililitros) . La capa orgánica se secó (MgS04) y se evaporó para dar un sólido. Se lavó el sólido (anaranjado suave) con acetonitrilo (4 X 3 mililitros) para remover el exceso de cloroformato de p-nitrofenilo. El producto, carbonato de para-nitrofenilo del diestearoilglicerol (Compuesto III), se secó al vacío sobre P205. Rendimiento: 557 miligramos (88 por ciento) . 1H NMR (360 MHz, DMSO-D6) : d 0.88 (t, CH3, 6H) ; 1.26 (s, CH2, 58H) ; 1.62 (m, CH2CH2CO, 4H) ; 2.4 (2xt, CH2CO, 4H) ; 4.2 (dd, trans CH2OCO, 1H) ; 4.35 (m, CH2OCOO, 2H) ; 4.5 (dd, cis CH2OCO, 1H) ; 5.38 (m, CH2CHCH2 1H) ; 7.4 (d, C6H5, 2H) ; 8.3 (d, C6H5, 2H) .

B. Preparación de carbamato de Histamina y diestearo-ilglicerol Se agregó carbonato de para-nitrofenilo de 1,2-diestearoilglicerol (350 miligramos, 0.44 mmoles, Compuesto III) a Histamina (46 miligramos, 0.40 mmoles, 0.9eq; Compuesto IV) en CHC13 (1 mililitro) con DMSO (200 µl) . Se agregó piridina (300 µl; Compuesto V) a la solución. Se agitó la mezcla de reacción a la temperatura ambiente durante toda la noche durante aproximadamente 20 horas. El TLC (CHCl3:MeOH= 90:10) mostró que la reacción estaba completa. Se evaporó el solvente. Se disolvió el producto (Compuesto VI) en CHC13, se vació sobre columna de gel de sílice (Aldrich, malla de 230-400, 60 Á) , y se levigó con los siguientes solventes, CHC13: CH3COCH3= 90:10, 40 mililitros (levigado en punto superior); CHC13:IPA= 80:20, 40 mililitros (producto levigado); dftCl3:IPA= 70:30, 40 mililitros (más producto levigado) . Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron, y se evaporaron. El producto se secó bajo vacío sobre P205 y se obtuvo como un sólido blanco (236 miligramos, 80 por ciento producción) . 1H NMR (360 MHz, CDCl3/Me0H= 1:1 con TMS) : d 0.88 (t, CH3, 6H) ; 1.28 (s, CH2, 56H) ; 1.62 (m, CH2CH2CO, 4H) ; 2.34 (2xt, CH2C0, 4H) ; 2.77 (t, CH2CH2NH, 2H) ; 3.18 (t, CH2CH2CO, 2H) ; 4.05-4.2 (dd, cis y trans CH2CHCtf2, 4H) ; 5.13 (m, CH2CHCH2, 1H) ; 608 (s, Histamina, 1H) ; 7.53 (s, Histamina, 1H) .

EJEMPLO 2 Preparación de Liposoma Placebo Se disolvieron el lípido (Compuesto VI) que se preparó como se describe en el Ejemplo 1 y la fosfatidilcolina de frijol de soya parcialmente hidrogenada (PHSPC) en una proporción molar de 40/60, en cloroformo y/o metanol en un matraz de fondo redondo. Se removieron los solventes mediante evaporación giratoria, y la película de lípido seca que se produjo se hidrató con desionizado para producir vesículas grandes de múltiples láminas. Se prepararon formulaciones de liposomas comparativas usando 100 moles por ciento de PHSPC y con una proporción molar de 40/60 de DDAB-colesterol mediante una metodología similar.

El tamaño del liposoma de cada formulación se determinó mediante diseminación de luz dinámica.

EJEMPLO 3 Preparación de Liposomas que Contienen Acido Nucleico A. Preparación de Liposomas con ADN Entrampado Se prepararon complejos a la temperatura ambiente como sigue. Primero, se condensaron 400 µg de ADN del plásmido reportero de luciferaza en solución de glucosa al 5 por ciento por medio de añadir 100 µg de histona con agitación lenta, continúa durante 10 minutos. Se ajustó a un pH de 4 una solución de PHSPC y el lípido responsivo al pH que se preparó en el Ejemplo 1 (Compuesto IV) en una proporción molar de 40/60 con una cantidad total de lípido de 12,000 nm en glucosa al 5 por ciento. La solución de ADN condensada se agregó a la solución de liposomas acídica lentamente con agitación continua durante 10 minutos. La concentración final de ADN fue de 0.25 miligramos/mililitro y la concentración total de lípido fue de 7.5 mM. La proporción de ADN con los lípidos totales fue de 1 µg de ADN para 30 nmoles de lípidos.

B. Ensayo de DNasa I Se trataron el ADN solo y el ADN entrampado en los liposomas con DNasa I en la presencia de 10 mM de MgS04 a tt ^? ?M iMm 37 °C durante 30 minutos. Después del tratamiento, se extrejo la mezcla de liposomas/DNasa con fenol/CHCl3 y CHC13 para separar los lípidos y las proteínas del ADN. Los alícuotas del ADN tratado con DNasa y de la fracción de ADN a partir de los liposomas tratados con DNasa que tenían ADN entrampado, se cargaron sobre un gel de agarosa al 1 por ciento que contenía bromuro de etidio y se sometieron a electroforesis para examinar la integridad del ADN. Como controles, el ADN y los liposomas no tratados con DNasa se cargaron sobre el gel, junto con un estándar de ADN de lkB. En la Figura 5 se muestran los resultados. La descripción completa de las patentes, los documentos de patentes, publicaciones, etcétera, que se citan en la presente, se incorporan como referencia en su totalidad como si se hubieran incorporado de manera individual. Diferentes modificaciones y alteraciones a esta invención serán claras para aquellos expertos en la técnica, sin alejarse del alcance de esta invención. Se deberá entender que no se presenta esta invención para ser indebidamente limitada por las modalidades y ejemplos ilustrativos que se establecen en la presente, y que estos ejemplos y modalidades se presentan a modo de ejemplo solamente con el alcance de la invención a la que solamente pueden limitar las reivindicaciones que se establecen en la presente como sigue. ittl-iili-i-l-MiÉ-^^

Claims (33)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de liposomas que comprende: un lípido que tiene la fórmula: en donde cada una de R1 y R2 es una cadena de alquilo o de alquenilo que tiene entre aproximadamente 8 hasta aproximadamente 24 átomos de carbono; n = 1-20; L se selecciona a partir del grupo que consiste de (i) -X- (C=?)-Y-CH2-, (ii) -X-(C=0)-, y (iii) -X-CH2-, en donde X e Y se seleccionan independientemente a partir de oxígeno, NH, y un enlace directo; Z es una fracción básica débil que tiene un pK de menos de aproximadamente 7.4 y mayor de aproximadamente 4.0.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde X es NH e Y es oxígeno.

3. La composición de la reivindicación 1, en donde L es un enlace de carbamato, u enlace de éster o un enlace de carbonato.

4. La composición de la reivindicación 1, en donde L es NH- (C=0) -0-CH2.

5. La composición de la reivindicación 1, en donde Z es un imidazol.

6. La composición de la reivindicación 1, que comprende entre aproximadamente 1 hasta aproximadamente 80 moles por ciento del lípido.

7. La composición de la reivindicación 1, en donde Z es una fracción que tiene un valor pK de entre aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.5.

8. La composición de la reivindicación 1, en donde cada una de R1 y R2 es una cadena de alquilo o de alquenilo no ramificada que tiene entre aproximadamente 8 hasta aproximadamente 24 átomos de carbono.

9. La composición de la reivindicación 8, en donde cada una de R1 y R2 es C?7H35.

10. La composición de la reivindicación 1, en donde n es de entre 1-10.

11. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además un compuesto terapéutico entrampado en los liposomas.

12. La composición de la reivindicación 11, en donde el agente terapéutico es un ácido nucleico.

13. La composición de la reivindicación 12, en donde el ácido nucleico se selecciona a partir del grupo que consiste de ADN. ARN, y sus componentes.

14. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además un ligando para poner como objetivos los liposomas en un sitio objetivo.

15. La composición de la reivindicación 14, en donde el ligando tienen una afinidad de fijación con las células de tumor endoteliales y lo introducen las células .

16. La composición de la reivindicación 15, en donde el ligando se selecciona a partir del grupo que consiste de E-selectina, Her-2, y FGF.

17. La composición de la reivindicación 1, en donde los liposomas comprenden además entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 moles por ciento de un lípido formador de vesículas que se derivatiza con un cadena de polímeros hidrofílicos.

18. La composición de la reivindicación 17, en donde la cadena de polímeros hidrofílicos es polietilenglicol (PEG) .

19. Un lípido que tiene la fórmula: en donde cada una de R1 y R2 es una cadena de alquilo o de alquenilo que tiene entre aproximadamente 8 hasta aproximadamente 24 átomos de carbono; n = 1-20; L se selecciona a partir del grupo que consiste de (i) -X- (C=0)-Y-CH2-, (ii) -X-(C=0)-, y (iii) -X-CH2-, en donde X e Y se seleccionan independientemente a partir de oxígeno, NH, y un enlace directo; y Z es una fracción básica débil que tiene un pK de menos de aproximadamente 7.4 y mayor de aproximadamente 4.0.

20. El lípido de la reivindicación 19, en donde X es NH e Y es oxígeno.

21. El lípido de la reivindicación 19, en donde L es un enlace de carbamato, u enlace de éster o un enlace de carbonato.

22. El lípido de la reivindicación 19, en donde L es NH-(C=O)-0-CH2.

23. El lípido de la reivindicación 22, en donde Z es un imidazol.

24. El lípido de la reivindicación 22, en donde Z es una fracción que tiene un valor pK de entre aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.5.

25. El lípido de la reivindicación 19, en donde cada una de R1 y R2 es una cadena de alquilo o de alquenilo no ramificada que tiene entre aproximadamente 8 hasta aproximadamente 24 átomos de carbono.

26. El lípido de la reivindicación 23, en donde cada una de R1 y R2 es C?7H35.

27. El lípido de la reivindicación 19, en donde n es de entre 1-10.

28. Un liposoma que comprende el lípido de conformidad con la reivindicación 19.

29. Un liposoma que comprende el lípido de conformidad con la reivindicación 26.

30. Un método para administrar un agente terapéutico a un sujeto, que comprende: preparar liposomas que comprenden un lípido que tiene la fórmula: en donde cada una de R1 y R2 es una cadena de alquilo o de alquenilo que tiene entre aproximadamente 8 hasta aproximadamente 24 átomos de carbono; n = 1-20; L se selecciona a partir del grupo que consiste de (i) -X-(C=0)-Y-CH2-, (ii) -X-(C=0)-, y (iii) -X-CH2-, en donde X e Y se seleccionan independientemente a partir de oxígeno, NH, y un enlace directo; Z es una fracción básica débil que tiene un pK de menos de aproximadamente 7.4 y mayor de aproximadamente 4.0; y Administrar los liposomas al sujeto.

31. El método de la reivindicación 30, en donde 1 ^tí mÉí m M ** íi '*' la preparación comprende entrampar un ácido nucleico en los liposomas .

32. El método de la reivindicación 31, en donde el ácido nucleico es ADN, ARN, o sus complementos.

33. El método de la reivindicación 30, en donde la preparación comprende además entrampar una proteína o un fragmento de proteína en los liposomas. —