TWI486169B - 酵素性抗癌療法 - Google Patents

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Description

酵素性抗癌療法 相關申請案之相互引用
本發明主張美國臨時專利申請案序號60/913,009，申請日2007年4月20日，其內文係以引用方式納入本文中。
本發明提供治療及抑制腫瘤(且特別是惡性固體腫瘤)之方法，其係藉由投藥腺苷脫胺酶以減低腺苷與去氧腺苷的組織水平。
發明背景
腫瘤為由於失控之細胞增生，而引發的細胞或組織異常良性或惡性生長。惡性腫瘤為一種從其原始部位擴散者，且該項技藝已知亦稱之為癌症。因此，腫瘤與癌症係一族共有失控或不適當細胞生長之共通特性的疾病。廣義而言，惡性腫瘤為血管衍生之腫瘤(例如白血病)或固體腫瘤。血管衍生之惡性腫瘤一般會在血液中循環，但固體腫瘤係從原發腫瘤擴散遍及全身。然後分布的腫瘤細胞具有(在轉移的過程中)發展成多發性續發腫瘤之潛能。為使固體腫瘤能進行此類轉移性擴散，固體腫瘤細胞必須脫離原發或原始腫瘤，進入血流或淋巴系統內，並從其侵入其他器官之組織中，於該處彼等進行增殖並形成新的腫瘤。轉移為一種複雜的多步驟程序，涉及腫瘤細胞黏附及運動性之改變，蛋白分解性酵素、趨化物質與蛋白聚糖之分泌，及其他因素。此外，血管生成(或形成新的血管) 亦為轉移過程中的重要步驟(福克曼，1995,自然醫學(Nature Medicine) 1：27－31)。
免疫系統亦已顯示抑制此類惡性腫瘤細胞之轉移，且已曾報導腺苷(依次)可抑制此類免疫保護性反應。例如，羅許金等人(2006,癌症研究(Cancer Res.) 66：7758－7765)報導，腺苷抑制殺手T細胞中之活性與細胞因子製造。腺苷負面地衝擊其他免疫功能，包括細胞元件與發炎功能(參見，例如，由史派查拉,2000,藥理學與治療學(Pharmacology & Therapeutics) 87：161－173，及由席柯維斯基等人,2005自然回顧免疫學(Nature Reviews Immunology) 5：713－721所撰之回顧)。席柯維斯基等人(於WO 03/050241，公開於2003年六月19日)亦描述，藉由投藥腺苷受體拮抗劑(其可包括腺苷脫胺酶)，用於增加對抗原之免疫反應及用於治療腫瘤之方法。
亦已顯示，腺苷促進腫瘤細胞遷移及血管生成(巴克茲等人，2000,Oncol.Rep. 7(6)：1285－91；亞代爾,2005,Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 289：R283－R296)，且腺苷刺激結腸癌細胞增生(繆裘達爾等人，2003,生化藥理學(Biochemical Pharmacology) 66 1737－1747)。亦已由艾斯瑪等人，1966,Proc.Am.Assoc.CancerRes. (摘要No.73)報導，於小鼠腹水模式中藉由注射ADA可抑制某些腫瘤細胞之生長達超過50%。此等為淋巴白血病L1210與L4946、淋巴肉瘤6C3HED、乳腺癌TA3及埃利希癌E2。於同一篇摘要中，據報導腺癌755對該功效之抗性為兩倍， 而肉瘤180則完全具有抗性。WO03050241A2描述腺苷受體抑制劑對於B16黑素瘤細胞之功效。雖然WO03050241A2提及ADA做為腺苷抑制劑，但其中未特別描述應用ADA治療特定癌症，且尤其是卵巢癌與前列腺癌。
因此，似乎對於一些腫瘤而言，腺苷之存在提供對於腫瘤增生及腫瘤血管生成的“進行”訊號，及對於會正常殺死此等腫瘤之殺手T細胞的“停止”訊號。
相反於前文所論述之發現，林德等人(美國專利案號6,579,857)已報導，腺苷(與酵素腺苷脫胺酶抑制劑組合，及/或與抗癌劑例如可福霉素(coformycin)組合)有用於加強上皮細胞來源之增生性細胞的細胞死亡之方法。因而，此參考文獻暗示腺苷在癌症方面所扮演之角色更加複雜且未決定的。
如前所述，用於減低內源性腺苷水平之試劑為酵素腺苷脫胺酶。腺苷脫胺酶("ADA")，經指定為EC 3.5.4.4，係一種嘌呤補救途徑之重要酵素。ADA在有水存在下，將腺苷或去氧腺苷轉化成肌苷或去氧肌苷與氨。已知具有ADA基因有害突變之個體，可能發展出各種不同程度的免疫缺陷病症，從中度到重度(亦即，嚴重複合免疫缺失疾病(SCID))。SCID已經確定係導因於該酵素受質(腺苷及去氧腺苷)之毒性累積於未成熟淋巴細胞中所致。該病症之開始範圍可能從孩童早期至成人，視其所繼承之突變而定。ADA之缺陷為SCID的主要成因之一(在孩童)，且為基因療法途徑的主要標的之一(R.帕克曼等人，2000， “對於腺苷脫胺酶缺陷之基因療法”，Ann.Rev.Med .,51：33-47)。
先前，ADA已市售分離自牛來源，並以經共軛至聚乙二醇("PEG")聚合物之牛ADA的形式，用於治療許多病症(包括SCID)。用於醫療用途之聚乙幣二醇化ADA係市售可得自恩重製藥股份有限公司(Enzon Pharmaceuticals,Inc.)，商品名為ADAGEN® ，聚乙幣二醇化ADA。將PEG部份與ADA共軛可藉由增加循環壽命而令使該酵素達到其完全的治療功效，並使ADA實質上不具抗原性，以使進行致免反應之可能性減至最低。亦可能製造供以共軛形式使用之重組人類或牛ADA酵素，如由共同擁有之美國專利申請案序號11/738,012，發明名稱為“經穩定之蛋白質”，及共同擁有之美國專利申請案序號12/105,913，發明名稱為“穩定的重組腺苷脫胺酶”，申請日與本發明相同，現已被授予美國專利第8,071,741號，且主張美國專利申請案序號60/913,009之優先權，且彼等皆以其完整性以引用方式納入本文中，所描述者。
因此，該項技藝中有長期需要新穎且改良的治療或抑制癌症生長、擴散及發展之方法。
 發明概要
於是，本發明提供治療具有腫瘤之患者的方法，其包含將有效量ADA投藥予有其需要之患者。有效量為由習於該項技藝者容易地決定以減低患者體內腺苷或去氧腺苷之組織水平的量，且其中腫瘤之生長或擴散係藉由患者體 內腺苷之組織水平實質上減低而受到抑制。投藥之途徑為例如皮下、靜脈內、肌肉內、鞘內、腹膜內、吸入及經尿道的途徑。
腫瘤可為惡性或非惡性，且較佳地為固體腫瘤，例如為諸如前列腺腫瘤、卵巢癌及/或結直腸癌等腫瘤。
腺苷脫胺酶較佳地係經共軛至實質上非抗原性之聚合物，例如聚伸烷基氧化物(PAO)。PAO之大小範圍較佳地係介於約4,000至約45,000道耳頓。PAO較佳為聚乙二醇("PEG")。ADA對聚合物之莫耳比可為1：1，或可為二或多個ADA分子每聚合物，或更佳地，提供約1至約20聚合物分子(亦即11-18 PEG股)每ADA分子。
經聚合物-共軛之ADA較佳地係以範圍約10U至約30U每公斤或以上之劑量，進行投藥達一段足以維持腫瘤抑制之時間，例如約1至約20天或更長。
所投藥之腺苷脫胺酶量係有效以實質上減低患者體內腺苷或去氧腺苷之組織水平，且其中腫瘤之生長或擴散係藉由該患者體內腺苷之組織水平實質上減低而受到抑制。此為(例如)腺苷脫胺酶範圍約10U至約30U每公斤之劑量。重複施予該劑量達一段足以維持腫瘤抑制之時間，例如約1至約20天或更長。劑量係藉由任何方便途徑，例如皮下、靜脈內、肌肉內、鞘內、腹膜內、吸入及經尿道進行投藥。
腺苷脫胺酶係視需要地經純化自牛來源，或為重組腺苷脫胺酶。重組腺苷脫胺酶係(例如)包含SEQ ID NO：1 之重組牛腺苷脫胺酶(Ser74－rbADA)、包含SEQ ID NO：3之重組人類腺苷脫胺酶(Ser74－rhADA)及包含SEQ ID NO：5之重組牛腺苷脫胺酶與/或其變異或多樣性。為求於含水介質中具穩定性，視需要地將經重組方式製得之牛腺苷脫胺酶(例如，SEQ ID NO：5)於Cys74處加帽。
對於本發明之目的，術語“殘基”應了解係意指其所引述之化合物，例如PEG、ADA、胺基酸等在其已與另一化合物進行取代反應後所殘留的部份。
對於本發明之目的，術語“聚合物殘基”例如“PEG殘基”應各別了解係意指，該聚合物或PEG之在其已與其他化合物、部份等進行反應後所殘留的部份。
對於本發明之目的，術語“烷基”如用於本文意指飽和脂族烴，包括直鏈、支鏈及環狀烷基。術語“烷基”亦包括烷基－硫－烷基、烷氧基烷基、環烷基烷基、雜環烷基及C1－6 烷羰基烷基基團。較佳地，烷基基團具有約1至12個碳。更佳地，其為具有約1至7個碳，又更佳地約1至4個碳之低碳數烷基。烷基可為經取代或未經取代。當為經取代時，取代基團較佳地包括鹵基、氧基、疊氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、烷基－硫基、烷基－硫－烷基、烷氧基烷基、烷基胺基、三鹵甲基、羥基、巰基、羥基、氰基、烷基矽烷基、環烷基、環烷基烷基、雜環烷基、雜芳基、烯基、炔基、C1－6 氫羰基、芳基及胺基。
對於本發明之目的，術語“經取代”如用於本文意指，將官能基或化合物中所含有之一或多個原子添加或置換以 選自鹵基、氧基、疊氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、烷基－硫基、烷基－硫－烷基、烷氧基烷基、烷基胺基、三鹵甲基、羥基、巰基、羥基、氰基、烷基矽烷基、環烷基、環烷基烷基、雜環烷基、雜芳基、烯基、炔基、C1－6 羰基、芳基及胺基之組群的部份其中之一。
對於本發明之目的，術語“烯基”意指含有至少一個碳－碳雙鍵之基團，包括直鏈、支鏈及環狀基團。較佳地，烯基基團具有約2至12個碳。更佳地，其為約2至7個碳，又更佳地約2至4個碳之低碳數烯基。烯基可為經取代或未經取代。當為經取代時，取代基團較佳地包括鹵基、氧基、疊氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、烷基－硫基、烷基－硫－烷基、烷氧基烷基、烷基胺基、三鹵甲基、羥基、巰基、羥基、氰基、烷基矽烷基、環烷基、環烷基烷基、雜環烷基、雜芳基、烯基、炔基、C1－6 烷羰基烷基、芳基及胺基基團。
對於本發明之目的，術語“炔基”意指含有至少一個碳－碳參鍵之基團，包括直鏈、支鏈及環狀基團。較佳地，炔基基團具有約2至12個碳。更佳地，其為約2至7個碳，又更佳地約2至4個碳之低碳數炔基。炔基可為經取代或未經取代。當為經取代時，取代基團較佳地包括鹵基、氧基、疊氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、烷基－硫基、烷基－硫－烷基、烷氧基烷基、烷基胺基、三鹵甲基、羥基、巰基、羥基、氰基、烷基矽烷基、環烷基、環烷基烷基、雜環烷基、雜芳基、烯基、炔基、C1－6 氫羰基、芳基及胺 基基團。“炔基”之實例包括炔丙基、丙炔與3－己炔。
對於本發明之目的，術語“芳基”意指含有至少一個芳香環之芳族烴環系。芳香環可視需要地經稠合或者接附至其他芳族烴環或非－芳族烴環。芳基基團之實例包括(例如)苯基、萘基、1,2,3,4－四氫萘及聯苯基。芳基基團之較佳實例包括苯基與萘基。
對於本發明之目的，術語“環烷基”意指C3－8 環狀烴。環烷基之實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基及環辛基。
對於本發明之目的，術語“環烯基”意指含有至少一個碳－碳雙鍵之C3－8 環狀烴。環烯基之實例包括環戊烯基、環戊二烯基、環己烯基、1,3－環己二烯基、環庚烯基、環庚三烯基及環辛烯基。
對於本發明之目的，術語“環烷基烷基”意指經C3－8 環烷基取代之烷基。環烷基烷基之實例包括環丙基甲基與環戊基乙基。
對於本發明之目的，術語“烷氧基”意指具有所指定碳數之烷基基團經由氧橋連接附至母體分子部份。烷氧基基團之實例包括(例如)甲氧基、乙氧基、丙氧基及異丙氧基。
對於本發明之目的，“烷基芳基”意指經烷基取代之芳基。
對於本發明之目的，“芳烷基”意指經芳基取代之烷基。
對於本發明之目的，術語“烷氧基烷基”意指經烷氧基取代之烷基。
對於本發明之目的，術語“烷基－硫－烷基”意指烷基－S－烷基硫醚，例如甲基硫甲基或甲基硫乙基。
對於本發明之目的，術語“胺基”意指含有基團之氮，如同於該項技藝中已知係藉由將一或多個氫自由基置換以有機游離基而衍生自氨。例如，術語“醯基胺基”及“烷基胺基”意指，分別具有醯基與烷基取代基團之特定N－經取代有機游離基。
對於本發明之目的，術語“烷基羰基”意指經烷基取代之羰基基團。
對於本發明之目的，術語“鹵素”或“鹵基”意指氟、氯、溴及碘。
對於本發明之目的，術語“雜環烷基”意指含有至少一個選自氮、氧與硫之雜原子的非芳香族環系。雜環烷基環可視需要地經稠合或者接附至其他雜環烷基環及/或非－芳族烴環。較佳之雜環烷基具有3至7成員。雜環烷基基團之實例包括(例如)六氫吡、嗎福啉、六氫吡啶、四氫呋喃、吡咯啶及吡唑。較佳之雜環烷基基團包括六氫吡啶基、六氫吡基、嗎福啉基及吡咯啶基。
對於本發明之目的，術語“雜芳基”意指含有至少一個選自氮、氧與硫之雜原子的芳香族環系。雜芳基環可經稠合或者接附至一或多個雜芳基環、芳族或非－芳族烴環或雜環烷基環。雜芳基基團之實例包括(例如)吡啶、呋喃、 噻吩、5,6,7,8－四氫異喹啉及嘧啶。雜環烷基基團之較佳實例包括噻吩基、苯并噻吩基、吡啶基、喹啉基、吡基、嘧啶基、咪唑基、苯并咪唑基、呋喃基、苯并呋喃基、噻唑基、苯并噻唑基、異唑基、二唑基、異噻唑基、苯并異噻唑基、三唑基、四唑基、吡咯基、吲哚基、吡唑基及苯并吡唑基。
對於本發明之目的，術語“雜原子”意指氮、氧與硫。
於有些具體態樣，經取代之烷基包括羧基烷基、胺基烷基、二烷基胺基、羥基烷基與巰基烷基；經取代之烯基包括羧基烯基、胺基烯基、二烯基胺基、羥基烯基與巰基烯基；經取代之炔基包括羧基炔基、胺基炔基、二炔基胺基、羥基炔基與巰基炔基；經取代之環烷基包括諸如4－氯環己基之部份；芳基包括諸如萘基之部份；經取代之芳基包括諸如3－溴苯基之部份；芳烷基包括諸如甲苯基之部份；雜烷基包括諸如乙基噻吩之部份；經取代之雜烷基包括諸如3－甲氧基－噻吩之部份；烷氧基包括諸如甲氧基之部份；且苯氧基包括諸如3－硝基苯氧基之部份。鹵基應了解係包括氟基、氯基、碘基與溴基。
對於本發明之目的，“正整數”應了解係包括等於或大於1之整數，且將為習於該項技藝人士所理解之範圍。
對於本發明之目的，術語“已連接”應了解係包括將一基團共價(較佳地)或非共價性接附至另一基團，亦即如同化學反應之結果。
術語“有效量”及“足夠量”對於本發明之目的，應 意指達到所希望功效或治療功效，例如習於該項技藝人士所瞭解之功效的量。
對於本發明之目的，術語“腺苷”應了解係包括核苷腺苷及去氧腺苷。腺苷亦包括以AMP、ADP、ATP、dAMP、dADP或dATP形式存在之腺苷及去氧腺苷。
對於本發明之目的，“腺苷－介導之腫瘤”或“腺苷脫胺酶－反應性腫瘤”應了解以廣義而言係包括任何因投藥ADA，或其活性部份等(不論投藥途徑為何)而獲助益之腫瘤類型。
對於本發明之目的，“治療腺苷－介導之腫瘤”或“治療腺苷脫胺酶－反應性腫瘤”或“抑制腺苷－介導之腫瘤生長”或“抑制腺苷脫胺酶－反應性腫瘤生長”，應了解係意指當相較於無ADA治療時所觀察到者，已使症狀或病況最小化或減弱。經治療之病況可藉由(例如)腫瘤生長抑制及/或於癌細胞或組織中腺苷水平之減少而確認。
廣義而言，當獲得所希望之臨床反應時，應視為已發生成功的治療。例如，成功的治療可藉由獲得(例如)10%或更高(亦即20%、30%、40%)腫瘤生長抑制而定義。或者，成功的治療可定義為當相較於無ADA治療時所觀察到者，於癌細胞或組織中獲得至少20%或較佳地30%，更佳地40%或更高(亦即50%或80%)腺苷水平減少，包括其他由習於該項技藝人士所預期之臨床標記。
而且，為方便起見在敘述時使用單數型術語，並非意於做如此限制。因此，例如，引述包含一種酵素之組成物 係指該酵素之一或多數分子。亦須了解本發明非受限於本文所揭示之特別結構、方法步驟及材料，因為此類結構、方法步驟及材料可能有些變動。
亦須了解，本文所使用之術語學係僅為描述特別具體態樣之目的而使用而非意於受限制，因為本發明之範圍將由所附之申請專利範圍及其同等物來限制。
 發明詳述
於是，本發明提供新穎治療腫瘤(包括癌症)之方法，其係藉由將ADA酵素以足以減低該患者組織及/或體液內腺苷存在之量的量及一段時間，投藥予有其需要之患者。較佳地，ADA酵素係經聚合物共軛。對於該等依賴腺苷存在以供生長、轉移性擴散及/或保護不受患者之免疫系統攻擊的腫瘤而言，足量減低內源性腺苷將限制或防止癌症生長、轉移性擴散及/或使能由患者之免疫系統執行正常的抗腫瘤活性。
亦預期，本發明腫瘤之ADA治療係視需要地，與一或多種其他適當之該項技藝已知抗癌治療方法與藥劑組合或調合來進行，如下文中更詳細論述。本發明之組合治療包括將有效量之本文所述化合物單獨，或與第二種化學治療劑組合(同時或依序)進行投藥。
用於此類組合治療之例舉性技藝已知之抗癌劑包括(例如)紫杉醇TM 、貝瓦西單抗(bevacizumab)(艾瓦司汀(Avastin))、長春新鹼、長春鹼、新霉素、坎雷他司他汀 (combretastatin)、鬼臼毒素、TNF－阿伐、血管生成抑制素、內分泌抑制素、血管抑制素、阿伐v －貝他3 拮抗劑、鈣離子載體、鈣－流通誘導劑、其任何衍生物或前藥。
額外之抗癌劑亦包括化學治療劑、放射治療劑、細胞因子、抗－血管生成劑、細胞凋亡誘導劑或抗癌免疫毒素或凝集配體(coaguligands)。一種此類免疫毒素為例如厄比吐克(Erbitux)(瑟吐西單抗(cetuximab))。“化學治療劑”如用於本文意指用於治療惡性腫瘤之傳統化學治療劑或藥物。此術語係為方便而使用，儘管事實上其他化合物以其發揮抗癌功效，而可於技術上描述做為化學治療劑。然而，“化學治療劑”於該項技藝中已具有清楚的定義，且係根據此標準定義來使用。
因此，本發明之方法可與一或多種已知有效於治療癌症之化學治療劑，包括(但不限定於)5－氮胞苷、6－氟尿嘧啶(視需要地與甲醯四氫葉酸組合)、6－巰基嘌呤、6－硫鳥嘌呤、米托蒽醌、吖丙啶基苯醌(AZQ)、卡莫司汀(Carmustine)(BCNU或BiCNU購自必治妥－麥耳斯史奎布)、博萊霉素、卡鉑(CBDCA)、羅莫司汀(CCNU)、甲基－CCNU或MeCCNU、氯氨布西(chlorambucil)、氯去氧腺苷、順鉑、環磷醯胺、阿糖胞苷、更生霉素(dactinomycin)、紅比霉素(daunorubicin)、去氧助間型霉素(deoxycoformycin)、羥基紅比霉素(doxorubicin)、多西助間型霉素(doxycoformycin)、DTIC(達卡巴)、表柔比星(epirubicin)、伊托泊苷(VP－16)、氟達拉濱(fludarabine)、 六甲蜜胺、羥基尿素、伊達比星(idarubicin)、異環磷醯胺、異環磷醯胺與美司鈉、左旋咪唑、N－乙醯基半胱胺酸("NAC")、1－苯丙胺酸氮芥、4'－(9－吖啶胺基)甲磺醯－m－茴香胺("mAMSA")、技藝已知之多重藥物抗性抑制劑(亦即MDR抑制劑)、米爾法藍(melphalan)、甲胺蝶呤(視需要地與甲醯四氫葉酸組合)、光輝霉素(mithramycin)、絲裂霉素－c、多重藥物抗性相關蛋白質之抑制劑("MRP"抑制劑)、紫杉醇、丙卡巴、鏈唑霉素(streptozotocin)、N,N'N'－三乙烯硫磷醯胺("thioTEPA")、拓撲異構酶I與/或拓撲異構酶II之抑制劑、紫杉酚、長春鹼、新長春鹼、長春新鹼、長春地新、替尼泊苷(VM－26)及其他不勝枚舉者組合使用。
其他預期用於與本發明方法組合之癌症治療方法，包括以X－射線、加瑪射線直接或伴隨X射線斷層掃描標定進行照射，以植入放射活性團粒或“種子”治療癌性組織，中子照射經硼化合物引發之組織，及/或其他類型技藝已知之粒子束療法。
另外視需要與本發明之方法組合或調合之抗腫瘤或抗癌劑(抗增生劑)包括該等由“古德曼與吉爾曼氏，治療學之藥理學基礎”，第十版，哈得曼與林柏德編著(以其完整性以引用方式納入本文中)所描述者。
為更佳認知本發明，遂將下列術語加以定義。
於本文中引述“腺苷”亦包含去氧腺苷，及其於活體內存在之技藝已知的變異與衍生物，除非另行指定。
引述腺苷脫胺酶或ADA包括該酵素之任何技藝已知的形式，包括經純化天然酵素(例如經純化天然ADA)、重組人類或牛ADA及其變異、多樣性與衍生物。自牛來源純化得之ADA酵素具有根據SEQ ID NO：5之序列，其中Cys 74天然地受半胱胺酸加帽或保護，且不存在從編碼具SEQ ID NO：5之ADA的基因所預測之六個C－端殘基。然而，預期本發明可以在天然牛ADA進行之替代變異，包括替代等位基因與多樣性(天然及經重組方式製得者，具有及不具有所預測之六個C－端殘基)而實施。牛ADA多樣性包括(例如)位於位置198之谷胺醯胺取代賴胺酸；位於位置245之丙胺酸取代蘇胺酸；位於位置351之精胺酸取代甘胺酸。
ADA酵素之較佳衍生物包括，已經突變而以相較於未經突變之重組ADA酵素具增進穩定性之經重組方式製得的ADA酵素。此等包括(例如)從SEQ ID NO：5及/或具有一或多種前述多樣性之SEQ ID NO：5修改得之重組ADA酵素，已將經溶劑暴露出之可氧化性Cys殘基置換以穩定的非可氧化性胺基酸殘基。此類非可氧化性殘基包括任何技藝已知之天然胺基酸殘基與/或其任何技藝已知的衍生物。例如，從首先單離自牛或人類來源之基因表現得之成熟ADA，具有不安定的Cys74 殘基，其較佳地經置換以非可氧化性胺基酸殘基，例如置換以Ser74 。此類重組ADA酵素係以SEQ ID NO：1(牛ADA結構)及SEQ ID NO：3(人類ADA結構)說明。SEQ ID NO：2與SEQ ID NO：4 說明可用於表現彼等之DNA分子，其已經密碼子最適化用於大腸桿菌表現。關於此類重組ADA突變蛋白之其他詳情，及此等蛋白質之製造與純化，係由共同擁有之U.S.專利申請案序號12/105,913，申請日與本案日期相同(其主張美國臨時專利申請案序號60/913,009之優先權)，發明名稱“穩定的重組腺苷脫胺酶”，現已被授予美國專利第8,071,741號，且以其完整性以引用方式納入本文中。其中(特別是於實施例段落，且尤其是在實施例1-4中)載述關於載體及純化方法之細節。
或者，(若需要)可將ADA酵素藉由將經溶劑暴露出之可氧化性Cys殘基加帽而穩定化，其係藉由將ADA酵素以足量之加帽劑，於足以將反應性半胱胺酸加帽(實質上不使該ADA酵素去活化)之條件下進行處理。此製程較佳地利用於經重組方式製得的ADA(為突變蛋白或野生型ADA酵素)。
例如，加帽劑包括(不限定於)經氧化之谷胱甘肽(為較佳)、碘乙醯胺、碘乙酸、胱胺酸及習於該項技藝人士已知之其他硫醇類，及其混合物。加帽劑於本文所述方法之反應期間所包括的量與濃度，多少將視所使用之特別加帽劑及技術人士的需要而定，但不必進行過度實驗。使用經氧化之谷胱甘肽做為原型，當與重組蛋白質例如rhADA反應時所使用之濃度範圍可介於約25μM至約100mM。較佳地，經氧化之谷胱甘肽係於約5nM至約25mM之濃度下與重組蛋白質反應。
於加帽劑與重組蛋白質之反應期間所使用之反應條 件，進一步包括使用具有pH值為約6.5至約8.4，較佳地從約7.2至約7.8之水溶液。此外，該水溶液較佳地包括適宜之緩衝劑例如磷酸鈉、磷酸鉀、Tris與Hepes及其混合物，濃度範圍介於10至150 mM(視需要地，加帽可於超出此緩衝劑範圍，低於10或高於150 mM下進行)。反應條件進一步包括令反應於不會造成蛋白質分解之溫度，亦即從約4－37℃下進行。視需要地，加帽可於超出此溫度範圍，例如低於0－4℃或高於37℃下進行。該反應進行一段足以達到具反應性半胱胺酸之所希望穩定化的時間。僅做為例舉，該反應進行一段範圍介於約5秒至約8小時(例如，過夜)之時間。
關於經加帽、穩定化之重組ADA的其他詳情，係由共同擁有之美國專利申請案序號11/738,012，發明名稱為“經穩定之蛋白質”(且特別是於實施例段落中)提供，其以引用方式納入本文中。
而且，為方便起見使用單數型術語，並非意於做如此限制。因此，例如，引述包含一種酵素之組成物係指該酵素之一或多數分子。亦須了解本發明非受限於本文所揭示之特別結構、方法步驟及材料，因為此類結構、方法步驟及材料可能有些變動。
A.聚合物－ADA共軛體
ADA之較佳形式係呈一種聚合物共軛的酵素形式。ADA－聚合物共軛體通常相當於式(I)：(I)[R－NH]z －(ADA)
其中(ADA)代表腺苷脫胺酶酵素或(視需要地)其衍生物或片段；NH－為存在ADA、其衍生物或片段上供接附至該聚合物之胺基酸的胺基基團；(z)為正整數，較佳為約1至約80，更佳地約5至約80，又更佳地約11至約18；且R係一種以可釋出或非可釋出形式接附至該ADA之實質上非抗原性聚合物殘基。
共軛體之非抗原性聚合物殘基部份(R)可選自以聚合物為底之系統的非限制性列表，例如：
其中：R10－11 及R22－23 可為相同或不同，且獨立地為所選擇之非抗原性聚合物殘基；R3－9 、R12－21 及R24 (參見下述)可為相同或不同，且各別獨立地係選自氫、C1－6 烷基、C3－12 支鏈烷基、C3－8 環烷基、C1－6 經取代烷基、C3－8 經取代環烷基、芳基、經取代芳基、芳烷基、C1－6 雜烷基、經取代C1－6 雜烷基、C1－6 烷氧基、苯氧基及C1－6 雜烷氧基；Ar為形成經多取代之芳族烴或經多取代之雜環基團的部份；Y1－11 及Y13 可為相同或不同，且獨立地係選自O、S及NR24 ；A係選自於烷基、靶定部份、診斷劑及生物學上具活 性之部份；X為O、NQ、S、SO或SO2 ；其中Q為H、C1－8 烷基、C1－8 支鏈烷基、C1－8 經取代烷基、芳基或芳烷基；Z及Z’獨立地係選自於活性地運送入標靶細胞中之部份、厭水性部份、雙官能性連接部份及其組合；L1－6 與L8 可為相同或不同，且獨立地係選自雙官能性連接基團；(a)、(c)、(d)、(f)、(g)、(i)、(j)、(j’)、(k)、(l)、(n)、(o)、(p)、(q)及(t)可為相同或不同，且獨立地為0或正整數(於大多數方面為較佳)；(b)、(e)、(r)、(r’)、(s)、(h)、(h’)及(m)可為相同或不同，且獨立地為0或1；mPEG為甲氧基PEG且(u)為整數以提供具有總分子量為約2,000 Da至約100,000 Da，較佳地約4,000 Da至約45,000 Da之聚合物。
於上述中，較佳地Y1－11 及Y13 可為O；R3－8 、R12－21 及R24 各別獨立地為氫或C1－6 烷基，以甲基與乙基為最佳地烷基，且R7 －9 較佳地為CH3 。
於本發明之其他方面，共軛物之聚合物部份可為其能給予多數個供ADA接附點者。此類系統之非限制性列表包括： 及 其中所有可變數皆與前述所列者相同。
或者且/或較佳地，可將多數PEG股接附至ADA。於此等方面，ADA聚合物共軛體可包括至少5條聚乙二醇股，至多80股接附至該酵素上Lys之伊普西隆胺基基團，但較佳地，可包括約11－18條PEG股接附至該酵素上Lys之伊普西隆胺基基團。
雖然ADA係經由賴胺酸連接而共軛至約11至約18 PEG分子每酵素分子，可改變PEG對ADA之比例，以修改所組合共軛物之物理及動力學特性，使適應任何特別的臨床狀況。
可用於製造ADA共軛體之經活化聚合物，將於天然下直接相當於前文所述之聚合物部份。主要的差異在於存在有脫離基或活化性基團(有時於本文中命名為B1 )，其有助於聚合物系統接附至存在ADA上之胺基基團(例如，賴胺酸之伊普西隆胺基基團)。因此，化合物(i)－(xiii)包括脫離基或活化性基團例如： 或其他適宜之脫離基或活化性基團，例如N－羥基苯并三唑基、鹵素、N－羥基鄰苯二甲醯亞胺基、咪唑基、O－醯基脲、五氟酚或2,4,6－三氯酚，或其他對習於該項技藝者為顯而易知之適宜脫離基，於共軛反應後存在於ADA所接附之位置。
有些較佳之經活化PEG包括該等經描述於共通讓與之美國專利案號5,122,614、5,324,844、5,612,460及5,808,096(經琥珀醯亞胺基碳酸酯活化之聚乙二醇(SC－PEG)及相關的經活化PEG)、及美國專利案號5,349,001(環狀亞胺硫酮活化之PEG)，其內容係以引用方式納入本文中。如習於該項技藝人士所瞭解者，此類共軛反應係代表性地於適宜之緩衝液中，使用數倍莫耳過量的經活化PEG來完成。有些以類似前述SC－PEG之線形PEG製得之較佳共軛體，可含有(平均)約1至約80 PEG股每酵素。結果，因此，可利用數百倍(例如200－1000x)之莫耳過量。對於分歧之聚合物及接附至酵素之聚合物，所使用的莫耳過量將較低，且可使用描述於本文下述所提及者之專利案與專利申 請案中的技術測定得。
對於本發明之目的，經活化之基團據了解為該等能夠與存在ADA，例如於Lys上之胺基團(親核劑)。
對於本發明之目的，前述亦稱作經活化之聚合物連接物。聚合物殘基較佳為以聚伸烷基氧化物為主，且更佳地係以聚乙二醇為主，其中PEG為線形、分歧或多臂的。
關於前述之聚合物，可見Ar為形成經多取代之芳族烴或經多取代之雜環基團的部份。A主要特徵在於Ar部份於天然為芳香性。一般，欲為芳香性，在位於環狀分子平面之上方與下方的“雲團”內必須共有pi電子。而且，pi電子數目必須滿足休克爾規則(4n＋2)。習於該項技藝人士應瞭解無數種部份將滿足該部份之芳香性需要，而因此適用於本文。
於本發明之有些較佳方面，以苄基消除或三甲基閉鎖內酯化作用為基礎之聚合物系統之經活化聚合物連接物，係根據共通讓與之美國專利案號6,180,095、6,720,306、5,965,119、6,624,142及6,303,569(其內文係以引用方式納入本文中)製備得。於此方面，係製備下列經活化聚合物連接物：
於本發明之另一方面，係使用某些特定N－二甘胺酸(bicine)聚合物殘基，例如該等經描述於共通讓與之美國專利案號7,122,189與7,087,229，及美國專利申請案號10/557,522、11/502,108與11/011,818者，製得ADA聚合物共軛體。各此等專利申請案之揭示係以引用方式納入本 文中。一些較佳的經活化聚合物包括：
亦應了解，前文所示之脫離或活化性基團僅為適宜基團之一，且亦可使其他用於本文中所提及者，而無需進行過度實驗。
於另一方面，經活化之聚合物連接物係使用諸如該等描述於共通讓與之美國專利案號5,681,567、5,756,593、5,643,575、5,919,455、6,113,906、6,566,506、6,153,655、6,395,266與6,638,499、6,251,382及6,824,766者(各其揭示係以引用方式納入本文中)的分歧聚合物殘基製備得。此類經活化之聚合物相當於以下列做為代表之聚合物系統(iv)－(ix)： 其中B1 為活化性基團，且所有可變數皆如先前所定義。
於又另一方面，經活化之聚合物可使用以受阻酯類為主之連接物。參見PCT/US07/78593發明名稱“具有以受阻酯為主之生物可分解性連接物的聚伸烷基氧化物”，其內文以引用方式納入本文中。例如，此類化合物之非限制性列示包括：
其中(u)為範圍介於約10至約2300之整數，以較佳地提供具有總分子量為約4,000 Da至約45,000之聚合物。
於一項較佳具體態樣，經活化之聚乙二醇為其提供與蛋白質之尿烷連接或醯胺連接者。
製備高純度具有終端羧酸之聚合物的方法，係描述於美國專利申請案號11/328,662，其內文以引用方式納入本文中。該方法包括首先製備聚伸烷基氧化物之三級烷基酯，隨後轉化成其羧酸衍生物。該方法中製備PAO羧酸之第一步驟，包括形成中間物例如聚伸烷基氧化物羧酸之第三－丁基酯。此中間物係藉由將PAO與鹵基乙酸第三－丁酯，於諸如第三－丁醇化鉀之鹼類存在下進行反應而形成。一旦已經形成第三－丁基酯中間物，可容易地純度超過92%，較佳地超過97%，更佳地超過99%且最佳地超過99.5%純度之聚伸烷基氧化物羧酸衍生物。
於又另外的方面，可利用具有終端胺基團之聚合物來製造ADA共軛體。製備高純度含有終端胺之聚合物的方法，係描述於美國專利申請案號11/508,507與11/537,172，其各別之內文以引用方式納入本文中。例如，具有疊氮化物之聚合物係與膦為主之還原劑例如三苯基膦，或鹼金屬硼氫化物還原劑例如NaBH4 反應。或者，包括脫離基之聚合物係與受保護胺鹽，例如亞醯胺基二碳酸甲基－第三－丁酯之鉀鹽(KNMeBoc)或亞醯胺基二碳酸二－第三－丁酯之鉀鹽(KNBoc2 )反應，隨後將受保護胺基團去保護。藉由此等方法所形成之含有終端胺之聚合物的純度，係大於約95% 且較佳地大於99%。
1.實質上非抗原性之聚合物
如前所述，R10－11 及R22－23 較佳地各自為其較佳係實質上非抗原性之水溶性聚合物殘基，例如聚伸烷基氧化物(PAO's)，且更佳地為聚乙二醇例如mPEG。對於例舉說明及非限制之目的，R10－11 及R22－23 之聚乙二醇(PEG)殘基部份可選自於：J－O－(CH2 CH2 O)u －J－O－(CH2 CH2 O)u －CH2 C(O)－O－、J－O－(CH2 CH2 O)u －CH2 CH2 NR25 －、及J－O－(CH2 CH2 O)u －CH2 CH2 SH－，其中：(u)為聚合程度，亦即從約10至約2,300；R25 係選自氫、C1－6 烷基、C2－6 烯基、C2－6 炔基、C3－12 支鏈烷基、C3－8 環烷基、C1－6 經取代烷基、C2－6 經取代烯基、C2－6 經取代炔基、C3－8 經取代環烷基、芳基、經取代芳基、芳烷基、C1－6 雜烷基、經取代C1－6 雜烷基、C1－6 烷氧基、苯氧基及C1－6 雜烷氧基，且J為加帽基團，亦即位於聚合物末端之基團，於有些方面’可選自NH2 (CH2 CH2 NH2 ),H,SH(CH2 CH2 SH),CO2 H(CH2 CO2 H)、C1－6 烷基(較佳為甲基)，或其他PEG末端活化性基團，例如習於該項技藝人士所了解之基團。
於一項特別較佳之具體態樣，R10－11 及R22－23 係選自於： CH3 －O－(CH2 CH2 O)u－ 、CH3 －O－(CH2 CH2 O)u －CH2 C(O)－O－、CH3 －O－(CH2 CH2 O)u －CH2 CH2 NH－及CH3 －O－(CH2 CH2 O)u －CH2 CH2 SH－，其中(u)為正整數，較佳地所選以使聚合物部份之總分子量為約2,000 Da至約100,000 Da。更佳地，R10－11 及R22－23 獨立地具有平均總分子量為約4,000 Da至約4,5000 Da，以從約5,000 Da之重量平均分子量為較佳。亦預期其他分子量，以順應技術人士的需要。
PEG一般係由下列結構式表示： 且R10－11 及R22－23 較佳地包含具此分子式之殘基。對於該聚合物之聚合程度，代表聚合物鏈中重複單位的數目，且係取決於聚合物之分子量。
或者，本發明之聚乙二醇(PEG)殘基部份可由下列結構式代表：－Y31 －(CH2 CH2 O)u －CH2 CH2 Y31 －、－Y31 －(CH2 CH2 O)u －CH2 C(＝Y32 )－Y31 －、－Y31 －C(＝Y32 )－(CH2 )a11 －Y33 －(CH2 CH2 O)u －CH2 CH2 －Y33 －(CH2 )a11 －C(＝Y32 )－Y31 －、－Y31 －(CR31 R32 )a12 －Y33 －(CH2 )b11 －O－(CH2 CH2 O)u －(CH2 )b11 －Y33 －(CR31 R32 )a12 －Y31 －、－Y31 －(CH2 CH2 O)u －CH2 CH2 －、－Y31 －(CH2 CH2 O)u －CH2 C(＝Y32 )－、－C(＝Y32 )－(CH2 )a11 －Y33 －(CH2 CH2 O)u －CH2 CH2 －Y33 －( H2 )a11 －C(＝Y32 )－及－(CR31 R32 )a12 －Y33 －(CH2 )b11 －O－(CH2 CH2 O)u －(CH2 )b11 －Y33 －(CR31 R32 )a12 －，其中：Y31 及Y33 獨立地為O、S、SO、SO2 、NR13 或鍵結； Y32 為O、S或NR34 ；R31－34 係獨立地選自氫、C1－6 烷基、C2－6 烯基、C2－6 炔基、C3－19 支鏈烷基、C3－8 環烷基、C1－6 經取代烷基、C2－6 經取代烯基、C2－6 經取代炔基、C3－8 經取代環烷基、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、C1－6 雜烷基、經取代之C1－6 雜烷基、C1－6 烷氧基、芳氧基、C1－6 雜烷氧基、雜芳氧基、C2－6 烷醯基、芳基羰基、C2－6 烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2－6 烷醯氧基、芳基羰氧基、C2－6 經取代烷醯基、經取代之芳基羰基、C2－6 經取代烷醯氧基、經取代之芳氧基羰基、C2－6 經取代烷醯氧基及經取代之芳基羰基氧基；(a11)、(a12)及(b11)獨立地為零或正整數，較佳地0－6，且更佳地為0、1或2；且(u)為介於約10至約2300之正整數。
舉例而言，可將PEG以下列非限制性方式官能化：－C(＝Y34 )－(CH2 )m11 －(CH2 CH2 O)u －、－C(＝Y34 )－Y－(CH2 )m11 －(CH2 CH2 O)u －、－C(＝Y34 )－NR31 －(CH2 )m11 －(CH2 CH2 O)u －、－CR35 R36 －(CH2 )m11 －(CH2 CH2 O)u －
其中R31 、R35 及R36 係獨立地選自H、C1－6 烷基、芳基、經取代芳基、芳烷基、雜烷基、經取代雜烷基及經取代之C1－6 烷基；(m11)為零或為正整數，且較佳地為1或2；Y34 為O或S；且 (u)代表聚合之程度。
於此等方面，係將加帽基團(J)例如甲基接附至PEG之末端。
例如，本發明之共軛物可藉由其包括使用經描述於前述所提及之美國專利案號5,122,614或5,808,096的活化技術，將多臂PEG－OH或"star－PEG"產物，例如該等經描述於NOF CorP.藥物遞送系統目錄，Ver.8，2006年四月(其揭示係以引用方式納入本文中)者，轉化成經適宜活化之聚合物的方法而製得。亦參見謝瓦特公司之2001目錄“供生物醫學應用之聚乙二醇與衍生物”，以引用方式納入本文中。
多臂聚合物含有四或多個聚合物臂，且較佳地四或八個聚合物臂。為說明之目的且非用以限制，多臂聚乙二醇(PEG)殘基可具下列分子式：
其中：(x)為零與正整數，亦即為約0至約28；且(n)代表聚合之程度。
於本發明之一項特別具體態樣，多臂PEG具有結構：
其中(n)為正整數。於本發明之一項較佳具體態樣，聚合物具有總分子量為約2,000 Da至約100,000 Da，且較佳地4,000 Da至45,000 Da。
特別地，PEG可具有分子式：
其中：(u')為約10至約570之整數，以提供具有總分子量為約2,000 Da至約100,000 Da，且較佳地4,000 Da至45,000 Da之聚合物；且該殘基之多達3個終端部份係經甲基或其他低碳數烷基加帽。
於有些較佳具體態樣，全部4個PEG臂接轉化成適宜的官能基團(亦即SC等)，以助於接附至重組蛋白質。此類優先轉化之化合物包括：
本文中所包括之聚合物質，較佳地於室溫下為水溶性。此類聚合物之非限制性列示包括聚伸烷基氧化物同元聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多醇類，其共聚物及其嵌段共聚物，條件為能維持該等嵌段共聚物之水溶性。
於另一項具體態樣，且作為PAO為主之聚合物的另外選擇，R10－11 及R22－23 各自視需要係選自於一或多種實際上非抗原性之物質，例如環糊精、聚乙烯醇、碳水化合物為主之聚合物、羥丙基甲－丙烯醯胺類(HPMA)、聚伸烷基氧化物、及/或其共聚物。亦參見共通讓與之美國專利案號6,153,655(其內容係以引用方式納入本文中)。習於該項 技藝人士應瞭解，係使用與本文中所述用於PAO's例如PEG者相同類型的活化作用。習於該項技藝人士將進一步瞭解，前述之列示僅為例舉說明，且預期所有具有本文所描述性質之聚合物質，且亦預期其他聚伸烷基氧化物衍生物，例如聚乙二醇等類。
2.雙官能性連接物基團
於本發明之許多方面，L1－6 及L8 為有助於聚合物股(例如R10－11 及/或R22－23 )接附之連接基團。所提供之連接可為直接，或透過習於該項技藝人士已知之其他偶合基團。於本發明之此方面，L1－6 與L8 可為相同或不同，且可選自該項技藝人士所熟知之各種不同基團，例如雙官能性及異雙官能性脂族與芳香性脂族基團、胺基酸等。因此，L1－6 與L8 可為相同或不同，且包括諸如下列之基團：－NH(CH2 CH2 )2 O－、－NH(CH2 CH2 )(CH2 CH2 O)NH－、－O(CH2 CH2 )NH－、－O(CH2 CH2 )O－、－NH(CH2 CH2 )NH－、－NH(CH2 CH2 )(CH2 CH2 O)－、－NH(CH2 CH2 O)－、－NH(CH2 CH2 O)(CH2 )NH－、－NH(CH2 CH2 O)2 －、－O(CH2 )3 NH－、－O(CH2 )3 O－、－O(CH2 CH2 O)2 NH－、
較佳地，L1－6 及L8 係選自於：－C(O)CH2 OCH2 C(O)－；－C(O)CH2 NHCH2 C(O)－；－C(O)CH2 SCH2 C(O)－；－C(O)CH2 CH2 CH2 C(O)－、及－C(O)CH2 CH2 C(O)－。
或者，適宜之胺基酸殘基可選自任何已知之天然L－胺基酸，例如丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸等及/或其組合物，僅例舉一些。L1－6 及L8 亦包括其大小範圍介於(例如)約2至約10個胺基酸殘基之肽類。
天然胺基酸之衍生物與類似物，以及各種技藝已知之非天然胺基酸(D或L)，厭水性或非厭水性，亦預期包含於本發明之範圍內。
3. Z部份及其他功能
於本發明之一方面，Z及Z’為L7 －C(＝Y12 )，其中L7 係一種選自於其定義L1－6 之基團的雙官能性連接物，且Y12 係選自於與定義Y1 者相同之基團。於本發明之此方面，Z基團係做為ADA與聚合物遞送系統之其餘部份之間的連 接。於本發明之其他方面，Z為具活性地被運送入標靶細胞中之部份，為厭水性部份及其組合。Z’(若存在時)可做為雙官能性連接物，為具活性地被運送入標靶細胞中之部份，為厭水性部份及其組合。
於本發明之此方面，係製備可釋出聚合物系統，以使活體內水解作用能將聚合物從ADA裂解，並將酵素釋放至胞外液體中，而仍連接於Z部份。例如，有些可能的Z－B組合為亮胺酸－ADA及Gly－Phe－Leu－Gly－ADA。
B. ADA共軛物之製備
為說明之目的，適宜之共軛反應包括將ADA與本文所述經適宜活化的聚合物系統反應。該反應較佳地係使用習於該項技藝人士所熟知用於蛋白質修飾之條件來完成，包括使用具有pH值範圍約6.5－8.5之PBS緩衝系統。預期於大多數實例中，將使過量的經活化聚合物與ADA進行反應。
此類反應往往導致形成含有一或多數經接附至ADA之聚合物的共軛體。如所了解者，通常可希望單離出各種不同級份，並提供多種同源性產物。於本發明之大多數方面，係收集反應混合物，加樣於適宜的管柱樹脂上，並依序以漸增水平之緩衝液溶析出所希望的流份。將流份藉由適當分析工具進行分析，以測定經共軛蛋白質之純度，之後再做進一步加工處理。不論所選擇之合成途徑及經活化蛋白質為何，共軛體將順應如本文中所定義之式(I)。有些由本文所述之合成技術產生的較佳共軛體包括：
其中B為ADA。
又根據本發明製得之其他共軛體包括： 其中所有可變數皆與前述所列者相同，且B為ADA。
其他共軛體包括： 其中B為ADA。
尤其較佳之共軛體為： 其中mPEG之分子量為約4,000至約45,000。
當使用N－二甘胺酸為底之聚合物系統時，兩種較佳之 共軛體為： 其中mPEG之分子量與前述相同。
更佳之共軛體包括
應注意，ADA之聚乙幣二醇化作用將以實驗針對美蛋白質之總PEG接附量、PEG聚合物大小及PEG連接物設計加以最適化。經聚乙幣二醇化之ADA用於評估聚乙幣二醇化作用的關鍵特徵包括，活體外分析(例如酵素活性及穩定性)，與活體內分析(例如藥物動力學及藥物效力學)。
C.欲受治療之腫瘤
本發明可應用於治療所有類型，易於能減低在欲受治療之人類或動物的血液及/或組織中腺苷或去氧腺苷水平的腫瘤(包括癌症)。簡言之，此等包括血液之腫瘤以及固體腫瘤。於固體腫瘤中，包括該等當所減低之腺苷水平可使患者免疫系統能更有效地壓制該腫瘤時而受到壓制者， 及/或當所減低之腺苷水平抑制血液供給時而受到壓制的腫瘤(例如在已缺氧之腫瘤)。
更佳地，能藉由本發明方法治療之腫瘤為固體腫瘤，其從減少血管生成刺激之額外功效獲得助益，其伴隨減低腺苷的組織水平。
欲受治療之腫瘤包括(僅以舉例而言)該等起源於免疫系統、骨骼系統、肌肉與心臟、乳房、胃腸道、中樞與周邊神經系統、腎系統、生殖系統、呼吸系統、皮膚、結締組織系統(包括關節)、脂肪組織、循環系統(包括血管壁)等者。
骨骼系統之腫瘤包括(例如)肉瘤與胚細胞瘤，例如骨肉瘤、軟骨肉瘤、成軟骨細胞瘤等。肌肉與心臟腫瘤包括骨骼肌與平滑肌之腫瘤，例如平滑肌瘤(平滑肌之良性腫瘤)、平滑肌肉瘤、橫紋肌瘤(骨骼肌之良性腫瘤)、橫紋肌肉瘤、心肌肉瘤等。胃腸道之腫瘤包括(例如)口、食道、胃、小腸、結腸之腫瘤與結直腸腫瘤、以及胃腸分泌器官，例如唾腺、肝、胰臟膽道等之腫瘤。
中樞神經系統之腫瘤包括腦、視網膜與脊髓之腫瘤，且亦可能起源於相關之結締組織、骨頭、血管或神經組織。亦預期可治療周邊神經系統之腫瘤。此外，周邊神經系統之腫瘤包括惡性周邊神經鞘腫瘤。
腎系統之腫瘤包括該等為腎臟之腫瘤，例如腎細胞瘤，以及尿道與膀胱之腫瘤。生殖系統之腫瘤包括子宮頸、子宮、卵巢、前列腺、睪丸與相關分泌腺體之腫瘤。免疫系 統之腫瘤包括以血液為底及固體腫瘤，包括淋巴瘤例如霍奇金與非霍奇金淋巴瘤。
呼吸系統之腫瘤包括鼻通道、支氣管與肺部之腫瘤。乳房之腫瘤包括(例如)小葉與導管之癌症。
欲受治療之特別常見的惡性腫瘤類型包括(僅以舉例而言)：前列腺癌、肺癌、乳癌、結直腸癌、膀胱癌、胰臟癌、子宮內膜癌、卵巢癌、皮膚黑素瘤、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰臟癌、成神經細胞瘤、維爾姆斯瘤、橫紋肌肉瘤(發起自肌肉)、成視網膜細胞瘤、骨肉瘤及尤因氏瘤，僅例舉一些。
D.劑量選擇
技術人員應了解，於臨床設定時，艾達金(Adagen)之劑量係視腫瘤之臨床反應，及個別患者(為動物或人類)之副作用圖譜而個別化。於本文下述所提供之實例研究中，最高劑量為所忍受之最大可能劑量。艾達金於市面上係以250U/mL提供。此對於注射以0.2 ml艾達金之大約25g小鼠，是換算成2000U/kg。用於本文下述所提供之實例研究中的最低劑量幾近於臨床人類劑量。在治療人類SCID患者之建議劑量療程中，係以10 U/kg為第一劑量，15 U/kg為第二劑量，而20 U/kg為第三劑量。允許進一步增加5 U/kg/週，直到最大單一劑量為30 U/kg。於下述例舉性提案中之劑量(100 U/kg)係大約12 U/kg臨床孩童劑量之小鼠同等劑量。
以酵素量為基準之劑量將於(例如)約0.10 U/kg至 約30 U/kg(或更高)，較佳地約0.5 U/kg至約20 U/kg，且更佳地於約0.5 U/kg至約12U/kg(亦即每公斤患者體重)，例如約0.5U/kg至約5U/kg之間有所變化。總每週劑量可多達40 U/kg(或更高)，如接受者所能忍受。可允許再增加5 U/kg/週，達最大單一劑量為30 U/kg(或更高)，如接受者所能忍受。一般而言，在每週以15U/kg注射ADAGEN後，血漿中ADA活性之平均最低體內水平(trough level)係介於20至25 μmol/hr/mL。
當然，技術人員應了解，亦可針對特別聚合物大小、連接物化學及價數調整經聚合物共軛之ADA的劑量。例如，對於包含二或多數ADA酵素每聚合物之聚合物共軛體的劑量療程，將根據每ml ADA之任何特別聚合物共軛體溶液中的ADA單位而進行調整。
在藉由注射提供ADA或ADA PEG－共軛體時，最適劑量範圍較佳係經由監測血漿腺苷水平來調整。一般可希望提供患者其可使血漿ADA活性(最低體內水平)維持在約10至100 μmol/hr/mL，較佳地約15至35 μmol/hr/mL(於37℃下分析得)之範圍內的劑量；且證明當於預先注射樣本中進行測量時，裝填紅細胞中之紅細胞腺苷(亦即dATP)衰減至0.001－0.057 μmol/mL，較佳地約0.005－約0.015 μmol/mL，或者至總體紅細胞腺苷(亦即ATP＋dATP含量)之約1%，具有正常腺苷水平。dATP之正常值係低於約0.001 μmol/mL。
ADA劑量資料之詳情為技藝已知，經描述於ADAGEN(恩重股份有限公司)之處方插頁，其內文以引用方式納入本文中。
實施例
下列實施例係為進一步認知本發明而提供，但不意味以任何方式侷限本發明之有效範圍。
實施例1
艾達金 (ADAGEN )於DU145人類前列腺腫瘤異種移植模式中之抗腫瘤功效 A)測試系統
B)方法實驗設計： DU145人類前列腺癌細胞係得自美國模式培養物收集中心(ATCC)，蒙拿薩斯，VA。藉由將2.0 x 106 DU 145細胞/小鼠皮下注射入右腋窩側面，而於裸鼠中建立腫瘤。每週兩次監測腫瘤生長，並於可觸診後開始進行測量。當腫瘤到達平均體積為78 mm3 後，將小鼠分成實驗組(8隻 /組)。將小鼠以劑量為2000、500或100 IU/kg之艾達金進行處理每週兩次。做為陽性對照組，小鼠接受5mg/kg劑量之艾瓦司汀(貝瓦西單抗，一種抗－VEGF單株抗體)，施用頻數與艾達金相同。實驗組之設立如下表1所示。將施予劑量之第一天指定為第1天(Day 1)。各小鼠之腫瘤體積係藉由以測徑器測量二維而測定得，並使用下式：腫瘤體積＝(長度×寬度2 )/2進行計算。於研究開始及每週兩次經過8－週時間，測量小鼠重量與腫瘤大小。
劑量選擇： 將艾達金或艾瓦司汀藉由腹膜內("i.p.")途徑投藥每週兩次達五週(總共：10劑量)。
艾達金：批號：NV0604，濃度：229 IU/ml 艾瓦司汀：批號：M66781，濃度：25 mg/ml
劑量計算係以於第1天測得之體重為基準。
臨床實驗： 於到達時將小鼠以目測進行檢驗。之後，於最初腫瘤 觸診後個別地於每週兩次，進行檢查其臨床徵兆、一般行為改變，並監測其體重。記錄任何死亡與臨床徵兆。並未監測食物與水消耗量。將顯現開口壞死性損傷之帶有腫瘤的小鼠犧牲。亦以人力將體重喪失超過20%之小鼠犧牲。
統計分析： 使用單向分散分析比較各不同處理間在腫瘤體積%改變上的差異。所有成對多數比較皆係使用荷姆－席達克(Holm－Sidak)方法進行。
C)結果所使用術語之定義： (a)%之最初腫瘤體積：(於任何所給定天數之腫瘤體積/於第1天之腫瘤體積)×100 (b)%於腫瘤體積之改變：[(於任何所給定天數之腫瘤體積－於第1天之腫瘤體積)/於第1天之腫瘤體積]×100 (c)%腫瘤生長抑制(TGI)：[(對照組之平均腫瘤體積－處理組之平均腫瘤體積)/對照組之平均腫瘤體積]×100(d)腫瘤之消退係定義為相較於第1天之負腫瘤體積(e)已治癒係定義為從人類裸眼進行觀察時完全無腫瘤存在。
於研究開始時之平均腫瘤大小為78 mm3 。於研究開始時之平均體重為27.20 g。所有組別中之小鼠體重皆增加，且於研究結束前各不同組別小鼠之體重較其處理前體重增加20至25%。該項研究於第57天結束，當時大部分動物具有生潰瘍的腫瘤，或具有腫瘤體積超過1500 mm3 。
下表2與3總括在研究之第49天(對照組動物100%存活的最後一天)之最後結果，並提供經艾達金處理動物與艾瓦司汀處理動物間之組別存活比較。對照組織腫瘤在整個研究期間穩定地生長。於第49天，平均腫瘤大小為783.1(±556.2)mm3 。於腫瘤生長之變化百分率為833.3%(±622.7)mm3 。以所有三種劑量水平之艾達金進行的治療，在抑制腫瘤生長方面有效。應注意對於所有治療組，直到施予劑量之最後一天(第33天)以前，腫瘤係以緩慢速率生長，其後腫瘤具有較快的生長速率(數據未示)。符合此項觀察為事實上於所有三種劑量水平之艾達金下，直到第36天以前腫瘤體積之%變化與對照組之改變顯著不同(P<0.05)(數據未示)。
此暗示，艾達金對於腫瘤生長具有細胞靜止功效。雖然於第36天後直到研究結束前，腫瘤體積之%變化與對照組的在統計學上並無差異，但以艾達金治療導致可偵測的腫瘤生長抑制。尤其，經2000IU/kg艾達金處理之腫瘤，於第49天具有平均腫瘤體積為343.0(±249.8)mm3 。腫瘤體積之平均變化為424.2%(±360.6)。劑量為2000IU/kg之艾達金顯示56%腫瘤生長抑制。
經500IU/kg艾達金處理之腫瘤，於第49天具有平均腫瘤體積為696.3(±290.4)mm3 。腫瘤體積之平均變化為797.6%(±492.7)，且從最初腫瘤之改變為897.6%(±492.7)。腫瘤生長抑制為11.1%。直到第40天以前，此組之腫瘤具有與其他艾達金－處理組相似的腫瘤生長速率，之後彼等 以更加快速之速率生長。關於此項差異之理由為未知。
經100IU/kg艾達金處理之腫瘤，於第49天具有平均腫瘤體積為414.8(±219.0)mm3 。腫瘤體積之平均變化為489.9%(±370.0)，且從最初腫瘤之平均百分率改變為589.9%(±307.0)。腫瘤生長抑制或TGI為47.0%。
艾達金之治療功效在為100IU/kg之最低劑量下達到最大功效。應注意100 IU/kg劑量幾近於艾達金之臨床人類劑量(用於治療SCID孩童之劑量)。艾瓦司汀顯示以腫瘤生長抑制或TGI為92.5%，最有效減少腫瘤大小。
結論，以所有三種劑量水平之艾達金進行的治療，在活體內抑制DU145腫瘤之生長方面有效。
#消退、#已治癒及%存活數據係得自第56天。 腫瘤體積平均值、中間值、腫瘤體積之%變化、%最初腫瘤體積及%存活數據係得自第49天。
實施例2
艾達金 (ADAGEN )於SK－OV－3人類卵巢腫瘤異種移植模 式中之抗腫瘤功效 A)測試系統
B)方法實驗設計： 藉由將3 x 106 細胞/小鼠皮下注射入右腋窩側面，而於裸鼠中建立SK－OV－3人類卵巢腺癌腫瘤。每週兩次監測腫瘤生長，並於可觸診後開始進行測量。各小鼠之腫瘤體積係藉由以測徑器測量二維而測定得，並使用下式：腫瘤體積＝(長度×寬度2 )/2進行計算。當腫瘤到達平均體積為90 mm3 後，將小鼠分成實驗組(9隻/組)。實驗組之設立如下表所示。將施予劑量之第一天指定為第1天。於研究開始及每週兩次測量小鼠重量與腫瘤大小直到研究終了。該項研究係於大約7週(52天)後終結，當時大多數動物具有大或生潰瘍之腫瘤團。
劑量施予療程： 艾達金、艾瓦司汀或天然ADA係藉由靜脈內投藥每週兩次達五週(總共：10劑量)。
測試商品： 艾達金：批號：NV0604，濃度：229 IU/ml 艾瓦司汀：批號：M66781，濃度：25 mg/ml 天然ADA：批號：06－0315－111
劑量計算： 以於第1天測得之體重為基準。
臨床實驗： 於到達時將小鼠以目測進行檢驗。之後，於最初腫瘤觸診後個別地於每週兩次，進行檢查其臨床徵兆、一般行為改變，並監測其體重。記錄任何死亡與臨床徵兆。並未監測食物與水消耗量。將顯現開口壞死性損傷之帶有腫瘤的小鼠犧牲。亦以人力將體重喪失超過20%之小鼠犧牲。
統計分析： 使用單向分散分析比較各不同處理間在腫瘤體積%改變上的差異。所有成對多數比較皆係使用荷姆－席達克方法進行。
C)結果所使用術語之定義： (a)%之最初腫瘤體積：(於任何所給定天數之腫瘤體積/於第1天之腫瘤體積)×100 (b)%於腫瘤體積之改變：[(於任何所給定天數之腫瘤體積－於第1天之腫瘤體積)/於第1天之腫瘤體積]×100 (c)%腫瘤生長抑制(TGI)：[(對照組之平均腫瘤體積－處理組之平均腫瘤體積)/對照組之平均腫瘤體積]×100(d)腫瘤之消退係定義為相較於第1天之負腫瘤體積(e)已治癒係定義為從人類裸眼進行觀察時完全無腫瘤存在。
於研究開始時之平均腫瘤大小為90 mm3 。於研究開始時之平均體重為22.2 g。所有組別之平均體重在整個研究期間並無顯著變化。該項研究係於第52天終結。其中四隻小鼠由於腫瘤生長超過而被犧牲1500 mm3 。
下表5給予在第32天(對照組動物660%存活的最後一天)之結果的最後概要。對照組之腫瘤在整個研究期間穩定地生長。於第32天，平均腫瘤大小為754.9(±700.7)mm3 。於腫瘤生長之變化百分率為693.2%(±673.6)mm3 。
經2000IU/kg艾達金處理之腫瘤，於第32天具有平均腫瘤體積為437.7(±122.2)mm3 。腫瘤體積之平均變化為402.1%(±177.7)。劑量為2000IU/kg之艾達金顯示42%腫瘤生長抑制。
經500IU/kg艾達金處理之腫瘤，於第32天具有平均腫瘤體積為471.1(±60.0)mm3 。腫瘤體積之平均變化為421.3%(±102.2)，且從最初腫瘤之改變為521.3%(±102.2)。腫瘤生長抑制為37.6%。
經100IU/kg艾達金處理之腫瘤，於第32天具有平均腫瘤體積為497.7(±152.6)mm3 。腫瘤體積之平均變化為450.7%(±172.7)，且從最初腫瘤之平均百分率改變為550.7%(±172.7)。腫瘤生長抑制為34.1%。
經2000IU/kg天然ADA處理之腫瘤，於第32天具有平均腫瘤體積為356.6(213.0)mm3 。腫瘤體積之平均變化為340.1%(±210.0)，且從最初腫瘤之百分率改變為440.1%(239.1)。腫瘤生長抑制為52.8%。
以任一劑量水平之艾達金進行的處理與得自對照組之結果相當。然而，以各別劑量水平之艾達金產生如上所示 的TGI。
艾達金之治療功效在為100IU/kg之最低劑量下達到最大功效。應注意100 IU/kg劑量幾近於艾達金之臨床人類劑量(用於治療SCID孩童之劑量)。艾瓦司汀(於此項研究中做為陽性對照組)顯示以TGI為72%最有效減少腫瘤大小。
結論，以100、500或2000 IU/kg劑量之艾達金進行的治療，可導致範圍介於34－42%之腫瘤生長抑制作用。
以下描述用於本發明方法之另供選擇的重組ADA酵素。
實施例3
表現具有位於成熟蛋白質位置74之Cys改變成Ser之重組人類ADA的大腸桿菌表現株之構築 針對人類腺苷脫胺酶之已經報導363胺基酸序列(GenBank NP_000013，以引用方式納入本文中)分析半胱胺酸密碼子之存在。於成熟(N－末端Met被裂解)多肽中之五個位置編碼半胱胺酸(C74、C152、C153、C168、C261)。於所設計及經修改之表現人類ADA的基因中，僅將此等五個半胱胺酸密碼子其中一個(半胱胺酸74,TGC)改變成絲胺酸密碼子(TCC)(此係經轉譯蛋白質之位置75)。將所確定之多肽序列(參見SEQ ID NO：3)提供予Blue Heron公司(波賽爾，華盛頓州，U.S.A.)，以使用重疊寡核苷酸節段之標準化學合成，進行整體基因合成出具有經最適化用於大腸桿菌中表現密碼子的新穎基 因。簡言之，係藉由遵照用於大腸桿菌K12 之標準細菌密碼子利用，使用由格蘭薩母R.等人；1981；"用於為基因表現性而調整之基因組策略的密碼子目錄",Nucleic Acid Res. 9 ：r43－r47，及拉瑟，R.1985；"從胺基酸序列數據、理論及實施考量所推演得之合成寡核苷酸探針"J.Mol Biol ；183 ：1－12所敘述之密碼子數據，將該序列最適化用於細菌表現。
然後將對應之RNA序列分析是否形成髮夾結構或環形成，並進行最小自由能計算。於該基因之兩終端包括兩側翼限制位點(NdeI 與BamHI )。待將合成DNA以限制酵素NdeI 與BamHI 消化後，將1.1千鹼基基因經由T4 DNA連接酶，連接至已經以此二種酵素消化之質體載體pET－28a(諾瓦金公司)中。藉由使用BTX電細胞操作機600(BTXElectro Cell Manipulator 600)，根據製造商說明進行之電穿孔作用，將重組質體導入大腸桿菌株BLR(DE3)或HMS174(DE3)中。將轉形混合物平布於含有肯那霉素(15 μg/ml)之LB瓊脂平板上，以使能篩選出含有質體pET－28a/ADAcysSer之純株(命名為ADAc75s/pET28a：BLR(DE3)或ADAc75s/pET28a：HMS174(DE3))。藉由以ABI Prism 310基因分析儀(Genetic Analyzer)，使用巨染料終結子(Big Dye Terminators)進行之DNA序列分析，確認ADA變異型基因核苷酸序列。編碼Ser74 －rhADA開放讀框之DNA序列係與SEQ ID NO：4一致。
將單離之純株藉由平布法(plating)進一步純化，並於 LB培養基中藉由標準方法，例如該等描述於諾瓦金pET系統手冊第九版(以引用方式納入本文中)之標準方法，分析IPTG可誘導的基因表現。
檢測數種誘導參數包括時間、溫度及誘導劑濃度。較佳之條件係與50 μM IPTG於25℃下培育12小時，其使能以總體細胞蛋白質之約20%，高度製造ADA於宿主細菌之細胞質內。將所表現之ADA蛋白質於SDS PAGE分析上確認，呈現正確的分子量為約40 kDa(數據未示)。
實施例4
表現具有位於成熟蛋白質位置74之Cys改變成Ser之重組牛ADA的大腸桿菌表現株之構築 衍生自牛腸製劑之經純化成熟ADA蛋白質，為356胺基酸之從cDNA序列預測缺少N－端甲硫胺酸，且亦缺少最後六個C－端殘基的蛋白質(GenBank NP_776312，以引用方式納入本文中)。針對牛ADA胺基酸序列分析半胱胺酸密碼子之存在。於成熟多肽中之五個位置編碼半胱胺酸(C74、C152、C153、C168、C261)。於所設計及經修改之牛ADA合成基因中，僅將此等五個半胱胺酸位置其中一個(半胱胺酸74)改變成絲胺酸殘基。此係藉由將絲胺酸密碼子(TCC)插入，置換位於成熟多肽位置74(或轉譯產物之位置75)之正常半胱胺酸密碼子。亦將該基因最適化於大腸桿菌中表現。
簡言之，將所確定之多肽序列(參見SEQ ID NO：1)提供予BioCatalytics股份有限公司，以使用彼等之包括重 疊寡核苷酸節段之標準化學合成的方法，進行整體基因合成出具有經最適化用於大腸桿菌中表現之新穎基因。BioCatalytics方法更詳細描述於美國專利案號6,366,860，其內文以其完整性以引用方式納入本文中。
於數種表現系統中研究牛ADA表現。例如，將側翼限制位點(NdeI 與BamHI )包括於該基因之終端。待將合成DNA以限制酵素NdeI 與BamHI 消化後，將1.1千鹼基基因經由T4 DNA連接酶，連接至已經以此二種酵素消化之質體載體pET－9d(諾瓦金公司)中。藉由使用BTX電細胞操作機600，根據製造商說明進行之電穿孔作用，將重組質體導入大腸桿菌株BLR(DE3)或HMS174(DE3)中。將轉形混合物平布於含有肯那霉素(15 μg/ml)之LB瓊脂平板上，以使能篩選出含有質體pET－9d/bADA之純株(命名為bADA/pET9d：BLR(DE3)或bADA/pET9d：HMS174(DE3))。藉由以ABI Prism 310基因分析儀，使用巨染料終結子進行之DNA序列分析，確認ADA變異型基因核苷酸序列。編碼突變蛋白ADA之DNA分子係由SEQ ID NO：2表示。
將單離之純株藉由平布法進一步純化，並於LB培養基中藉由標準方法，例如該等描述於諾瓦金pET系統手冊第九版之標準方法，分析IPTG可誘導的基因表現。檢測數種誘導參數包括時間、溫度及誘導劑濃度。較佳之條件係與0.3%乳糖於37℃下培育12 hrs，其使能以總體細胞蛋白質之約20%，高度製造ADA於宿主細菌之細胞質內。 將所表現之ADA蛋白質於SDS PAGE分析上確認，呈現正確的分子量為約40 kDa。
實施例5
重組人類突變蛋白ADA蛋白質之純化 於由恩重(Enzon)所研發之3層析術程序，完成rhADA之純化。對於從存在宿主細胞HMS174(DE3)中之質體pET28a(諾瓦金)上的合成基因，表現rhADA蛋白質之大腸桿菌進行細菌發酵。於補充以酵母抽出物(30 g/l)之基本甘油培養基中包括利福平(200 μg/ml)與肯那霉素(30 μg/ml)，並將細胞於28℃下生長至OD600 為11，此時將誘導劑IPTG加入達5 mM終濃度。經40小時後(OD600 ~110)，藉由離心收取細胞並冷凍於－20℃下。簡要地，將經解凍之細胞團塊(50 g)再懸浮於1800 ml含10 mM Tris、1mM DTT，pH 8.0之緩衝液中，並於1200 RPM下以Tempest Virtis(SentryTM ，微量處理器，波士頓，MA)進行均質化10秒。將此懸浮液通過不鏽鋼篩網(開口微米(Opening micrometer)250μ，No.60，W.S泰勒)以去除大顆粒。將均勻的細胞懸浮液於15,000 psi(元件經冰浴)下進行微流體化3次循環(微流體化機，微流體公司，型號110Y，波士頓，MA)。於微流體化結束時，使用200 ml如前述相同之緩衝液沖洗該元件，並將此溶液與前述之懸浮液組合。藉由於16,000 rpm下，於4℃下離心40分鐘(Sorvall RC 5C正，轉子SLA－1000)，而自細胞溶解產物萃取得可溶性蛋白質。小心地收集上清液以避免產生不希望的混 合。將pH值調整至8.0，並將1 mM MgCl2 與20 mg/mL DNase加入，並於室溫下培育2小時。之後以1N HCl將pH值調整至6.5。如前述進行第二次離心，收集上清液並調整至2 mM EDTA，隨後於Nalgene(90 mm過濾器單元)上進行過濾。經過濾得之上清液體積為500 ml，以BAC方法測得之總蛋白質濃度為8.5 mg/ml。
將細胞萃取物(100 ml)調整至pH 7.2，4.5 mS/cm，並加樣至處於20 mM Bis－Tris，20 mM NaCl，pH 6.5之HiTrap DEAE ff上，並以20 mM Bis－Tris,500 mM NaCl(pH 6.5)溶析。藉由酵素分析與SDS－PAGE鑑定出高峰流份，並調整至1.5 M硫酸銨存在20 mM NaHPO4 (pH 6.5)中，並加樣至HiTrap苯基ff管柱上。將蛋白質以加樣緩衝液與20 mM NaHPO4 (pH 6.5)之梯度溶析出。將高峰流份(55 ml；0.4 mg/ml)對20 mM NaHPO4 ,1 mM EDTA,1 mM DTT,pH 6.5進行膜滲濾，並加樣至HiTrap SP－瓊脂糖(Sepharose)ff並以20 mM NaHPO4 ,500 mM NaCl,1 mM EDTA,1 mM DTT,pH 6.5溶析。所收集得之流份含有經純化ADA蛋白質(77ml；0.1 mg/ml)。
實施例6
重組牛ADA蛋白質之純化 於由恩重所研發之3層析術程序，完成由實施例4之純株表現之rbADA的純化。簡要地，將200 g儲放於－80℃下之經解凍細胞團塊(分別得自Blue Hereon或Biocatalytics)再懸浮於1800 ml含20 mM Bis－Tris,1mM EDTA,pH 7.4之緩衝液中，並於1200 RPM下以Tempest Virtis(SentryTM ，微量處理器，波士頓，MA)進行均質化5分鐘。將此懸浮液通過不鏽鋼篩網(開口微米250μ，No.60，W.S泰勒)以去除大顆粒。將均勻的細胞懸浮液於15,000 psi(元件係經冰浴)下進行微流體化3次循環(微流體化機，微流體公司，型號110Y，波士頓，MA)。於微流體化結束時，使用200 ml如前述相同之緩衝液沖洗該元件，並將此溶液與前述之懸浮液組合。藉由於7100 rpm(12000×g)下於4℃離心60分鐘(Avanti J－201，貝克曼考特；轉子# JLA8.1000)，而從細胞溶解產物萃取得可溶性蛋白質。小心地收集上清液以避免產生不希望的混合。
為去除存在此細胞萃取物中之核苷酸，遂將聚乙烯亞胺(PEI)加至前述上清液(終濃度0.15%,wt/v)，並藉由攪拌10分鐘使之充分混合。然後令此細胞萃取物於4℃下靜置過夜。將從此過夜樣本產生之沈澱物，藉由於7100 rpm(12000×g)下於4℃離心60分鐘(Avanti J－201，貝克曼考特；轉子# JLA8.1000)而去除。同樣，小心地收集上清液以避免產生不希望的混合。為協助ADA結合至第一管柱，遂將10% PEG4600緩慢地加至此細胞萃取物中，並以1 N NaOH與1N HCl將此細胞萃取物之pH值調整至6.5。將此上清液再次於7100 rpm(12000×g)下於4℃離心60分鐘(Avanti J－201，貝克曼考特；轉子# JLA8.1000)，之後加樣至下一管柱。
將細胞萃取物加樣至經含20 mM Bis－Tris,1 mM EDTA, pH 6.5之緩衝液預先平衡之Capto Q管柱(Cat# 17－5316－01，GE健康照護，皮斯卡他威，NJ。柱床體積350 ml預先裝填於XK－50管柱)。在將ADA於存在平衡緩衝液中之80 mM NaCl下從管柱溶析出之前，首先於60 mM及70 mM NaCl下進行溶析以去除雜質。藉由ADA活性、SDS－PAGE分析、西方轉漬及RP－HPLC以分析溶析圖譜。
經Capto Q管柱後，依序地使用2次厭水性相互作用層析術純化，以進一步精練該蛋白質的純度。第一次HIC為辛基瓊脂糖4FF(Cat# 17－0946－02，GE健康照護，皮斯卡他威，NJ)。將得自Capto Q管柱之ADA流份匯集直接以硫酸銨粉末調整至1.5 M(NH4 )2 SO4 ，並將pH值調整至6.5。將已過濾樣本(奈爾金努克，CAT #540887，MEMB 0.2 PES，羅契斯特，NY)加樣至已預先經1.5 M(NH4 )2 SO4 ,20 mM磷酸鉀，1 mM EDTA,pH 6.5平衡之第一HIC管柱(柱床體積150 ml，於XK－50，GE健康照護，皮斯卡他威，NJ)。將ADA蛋白質以硫酸銨梯度進行溶析，並藉由SDS－PAGE及RP－HPLC測定此溶析作用之純度圖譜。將存在第一HIC管柱之流份中的ADA蛋白質匯集，並調整至1 M(NH4 )2 SO4 及直接加樣至已預先經1 M(NH4 )2 SO4 ,20 mM KH2 PO4 －K2 HPO4 ,1 mM EDTA,pH 6.5平衡之第二HIC管柱(柱床體積150 ml，於XK－50，HIC苯基HP，Cat# 17－1082－01，皮斯卡他威，NJ)。將ADA蛋白質以1 M至300 mM存在20 mM KH2 PO4 －K2 HPO4 ,1 mM EDTA,pH 6.5中之硫酸銨梯度進行溶析。藉由SDS－PAGE及RP－HPLC 分析此等流份之ADA純度。將純化得之rbADA或rhADA進一步對儲存緩衝液(例如，100 mM磷酸鈉，1 mM EDTA,pH 6.5)脫鹽，並於LabScaleTM TFF系統(膜BioMax 5，貝弗得，MA)中進行濃縮。
實施例7
經由尿烷連接製備經聚乙幣二醇化之Ser 74 －rbADA 將SC－PEG(經N－羥基琥珀西亞胺基碳酸酯－活化之聚乙二醇，0.084 mmol)伴隨溫和攪拌，加至Ser74 －rbADA(0.00027 mmol)溶於3 mL磷酸鈉緩衝液(0.1 M,pH 7.8)之溶液中。將溶液於30℃下攪拌30分鐘。使用GPC管柱(Zorbax GF－450)監測PEG共軛作用。於反應結束時(經由已無天然酵素存在而證明)，將混合物以12 mL調配緩衝液(0.05 M磷酸鈉，0.85%氯化鈉，pH 7.3)稀釋，並以Centriprep濃縮器(亞米康Amicon)進行滲濾，將未反應的PEG去除。若需要於4℃下持續進行滲濾，直到藉由將等量濾液與0.1% PMA(聚甲基丙烯酸溶於0.1 M HCl)混合而不再偵測到游離態PEG為止。
實施例8
經由尿烷連接製備經聚乙幣二醇化之Ser74－rhADA 使用如實施例7中所述之相同條件，將SC－PEG(0.084 mmol)與Ser74 －rhADA(0.00027 mmol)進行反應。
實施例9
經由醯胺連接製備聚乙幣二醇化之Ser 74 －rbADA 將SS－PEG(經N－羥基琥珀西亞胺基琥珀酸酯－活化之 聚乙二醇，0.084 mmol)伴隨溫和攪拌，加至Ser74 －rbADA(0.00027 mmol)溶於3 mL磷酸鈉緩衝液(0.1 M,pH 7.8)之溶液中。將溶液於30℃下攪拌30分鐘。使用GPC管柱(Zorbax GF－450)監測PEG共軛作用。於反應結束時(經由已無天然酵素存在而證明)，將混合物以12 mL調配緩衝液(0.05 M磷酸鈉，0.85%氯化鈉，PH 7.3)稀釋，並以Centriprep濃縮器(亞米康)進行滲濾，將未反應的PEG去除。若需要於4℃下持續進行滲濾，直到藉由將等量濾液與0.1% PMA(聚甲基丙烯酸溶於0.1 M HCl)混合而不再偵測到游離態PEG為止。
實施例10
經由醯胺連接製備聚乙幣二醇化之Ser 74 －rhADA 使用如實施例9中所述之相同條件，將SS－PEG(0.084 mmol)與Ser74 －rhADA(0.00027 mmol)進行反應。
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Claims (22)

  1. 一種腺苷脫胺酶之用途，其係用於製造用於治療具有前列腺腫瘤或卵巢癌之患者的醫藥品，其中該腺苷脫胺酶係共軛至實質上非抗原性之聚合物，其中該實質上非抗原性之聚合物之大小範圍係介於約4,000至約45,000道耳頓，其中該實質上非抗原性之聚合物為聚乙二醇，且其中該腺苷脫胺酶為從牛來源純化得之腺苷脫胺酶或為重組牛腺苷脫胺酶且其中該重組牛腺苷脫胺酶係選自由包含SEQ ID NO：1之重組牛腺苷脫胺酶、包含SEQ ID NO：5之重組牛腺苷脫胺酶、及包含SEQ ID NO：1或5且具有選自由Gln取代Lys198 、Ala取代Thr245 、Arg取代Gly351 、及其組合所組成之組群的胺基酸取代之重組牛腺苷脫胺酶所組成的組群。
  2. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該醫藥品係經投藥以產生有效於實質上減低該患者體內腺苷或去氧腺苷的組織水平的腺苷脫胺酶之量，且其中該腫瘤之生長或擴散係藉由該患者體內腺苷之組織水平減低而受到抑制。
  3. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該醫藥品係經投藥以產生範圍介於約10U至約30U每公斤之腺苷脫胺酶之劑量。
  4. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該醫藥品係經投藥達一段足以維持腫瘤抑制之時間。
  5. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該醫藥品係經投藥達一段範圍介於1至約20天之時間。
  6. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該共軛物包含二或多個腺苷脫胺酶分子每實質上非抗原性之聚合物。
  7. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該腺苷脫胺酶包含約11至約18條聚乙二醇股接附至該腺苷脫胺酶之一或多個Lys殘基之伊普西隆胺基基團。
  8. 根據申請專利範圍第7項之用途，其中該腺苷脫胺酶係經由尿烷連接共軛至該聚乙二醇。
  9. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該醫藥品係藉由選自由皮下、靜脈內、肌肉內、鞘內、腹膜內、吸入及經尿道所組成之組群的途徑進行投藥。
  10. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該包含SEQ ID NO：5之重組牛腺苷脫胺酶包含經加帽之Cys74以防止於水性介質中氧化。
  11. 一種腺苷脫胺酶之用途，其用於製造用於在具有前列腺腫瘤或卵巢癌的哺乳動物中抑制腫瘤生長之醫藥品，其中該腺苷脫胺酶係共軛至實質上非抗原性之聚合物，其中該實質上非抗原性之聚合物之大小範圍係介於約4,000至約45,000道耳頓，其中該實質上非抗原性之聚合物為聚乙二醇，且其中該腺苷脫胺酶為從牛來源純化得之腺苷脫胺酶或為重組牛腺苷脫胺酶且其中該重組牛腺苷脫胺酶係選自由包含SEQ ID NO：1之重組牛腺苷脫胺酶、包含SEQ ID NO：5之重組牛腺苷脫胺酶、及包含SEQ ID NO：1或5且具有選自由Gln取代Lys198 、Ala取代Thr245 、Arg取代Gly351 、及其組合所組成 之組群的胺基酸取代之重組牛腺苷脫胺酶所組成的組群。
  12. 一種用於治療具有前列腺腫瘤或卵巢癌之患者的醫藥組成物，其包含有效量之腺苷脫胺酶，其中該腺苷脫胺酶係共軛至實質上非抗原性之聚合物，其中該實質上非抗原性之聚合物之大小範圍係介於約4,000至約45,000道耳頓，其中該實質上非抗原性之聚合物為聚乙二醇，且其中該腺苷脫胺酶為從牛來源純化得之腺苷脫胺酶或為重組牛腺苷脫胺酶且其中該重組牛腺苷脫胺酶係選自由包含SEQ ID NO：1之重組牛腺苷脫胺酶、包含SEQ ID NO：5之重組牛腺苷脫胺酶、及包含SEQ ID NO：1或5且具有選自由Gln取代Lys198 、Ala取代Thr245 、Arg取代Gly351 、及其組合所組成之組群的胺基酸取代之重組牛腺苷脫胺酶所組成的組群。
  13. 根據申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物係經投藥以產生有效於實質上減低該患者體內腺苷或去氧腺苷的組織水平的腺苷脫胺酶之量，且其中該腫瘤之生長或擴散係藉由該患者體內腺苷之組織水平減低而受到抑制。
  14. 根據申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物係經投藥以產生範圍介於約10U至約30U每公斤之腺苷脫胺酶之劑量。
  15. 根據申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物係經投藥達一段足以維持腫瘤抑制之時間。
  16. 根據申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其中該醫 藥組成物係經投藥達一段範圍介於1至約20天之時間。
  17. 根據申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其中該共軛物包含二或多個腺苷脫胺酶分子每實質上非抗原性之聚合物。
  18. 根據申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其中該腺苷脫胺酶包含約11至約18條聚乙二醇股接附至該腺苷脫胺酶之一或多個Lys殘基之伊普西隆胺基基團。
  19. 根據申請專利範圍第18項之醫藥組成物，其中該腺苷脫胺酶係經由尿烷連接共軛至該聚乙二醇。
  20. 根據申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物係藉由選自由皮下、靜脈內、肌肉內、鞘內、腹膜內、吸入及經尿道所組成之組群的途徑進行投藥。
  21. 根據申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其中該包含SEQ ID NO：5之重組牛腺苷脫胺酶包含經加帽之Cys74以防止於水性介質中氧化。
  22. 一種用於在具有前列腺腫瘤或卵巢癌的哺乳動物中抑制腫瘤生長之醫藥組成物，其包含有效量之腺苷脫胺酶，其中該腺苷脫胺酶係共軛至實質上非抗原性之聚合物，其中該實質上非抗原性之聚合物之大小範圍係介於約4,000至約45,000道耳頓，其中該實質上非抗原性之聚合物為聚乙二醇，且其中該腺苷脫胺酶為從牛來源純化得之腺苷脫胺酶或為重組牛腺苷脫胺酶且其中該重組牛腺苷脫胺酶係選自由包含SEQ ID NO：1之重組牛腺苷脫胺酶、包含SEQ ID NO：5之重組牛腺苷脫胺 酶、及包含SEQ ID NO：1或5且具有選自由Gln取代Lys198 、Ala取代Thr245 、Arg取代Gly351 、及其組合所組成之組群的胺基酸取代之重組牛腺苷脫胺酶所組成的組群。
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