CN101680039B - 酶的抗癌治疗 - Google Patents

酶的抗癌治疗 Download PDF

Info

Publication number
CN101680039B
CN101680039B CN200880021105.8A CN200880021105A CN101680039B CN 101680039 B CN101680039 B CN 101680039B CN 200880021105 A CN200880021105 A CN 200880021105A CN 101680039 B CN101680039 B CN 101680039B
Authority
CN
China
Prior art keywords
purposes
tumour
ada
adenosine
adenosine deaminase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200880021105.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101680039A (zh
Inventor
戴维·R·菲尔普拉
普贾·萨普拉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Unicris Inc.
Original Assignee
Sigma-Tau Rare Diseases S A
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sigma-Tau Rare Diseases S A filed Critical Sigma-Tau Rare Diseases S A
Publication of CN101680039A publication Critical patent/CN101680039A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101680039B publication Critical patent/CN101680039B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
    • C12Y305/04004—Adenosine deaminase (3.5.4.4)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本文提供治疗具有肿瘤的患者的方法，包括向需要的患者给药有效量的腺苷脱氨酶，优选聚环氧烷缀合的腺苷脱氨酶。

Description

酶的抗癌治疗
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年4月20日提交的美国临时专利申请序列号60/913,039的优先权，其内容在此引入作为参考。
技术领域
本发明提供治疗和抑制肿瘤(且尤其是恶性的实体瘤)的新方法，通过给药腺苷脱氨酶以减少腺苷和脱氧腺苷的组织水平。
背景技术
肿瘤是异常的良性或恶性的细胞或组织生长，其由不受控制的细胞增殖产生。恶性肿瘤是从其起源位点扩散的肿瘤，且也称为癌症。因此，肿瘤和癌症是具有不受控制的或不适当的细胞生长的共同特性的疾病家族。广泛地，恶性肿瘤为血液衍生的肿瘤如白血病，或实体瘤。血液衍生的恶性肿瘤通常在血液中循环，但实体恶性肿瘤从原发肿瘤扩散遍及全身。然后该分布的肿瘤细胞在转移的过程中具有发展为多种继发性瘤的潜力。为了实体瘤能经历这种转移扩散，实体瘤细胞必须从原发或初始肿瘤逃逸，进入血流或淋巴系统，并从那里侵入其它器官的组织，在该组织繁殖并形成新的肿瘤。转移是复杂的多步过程，其涉及肿瘤细胞粘附和活动性的变化，蛋白水解酶、化学引诱物和蛋白聚糖和其它因子的分泌。此外，血管发生，或新血管的形成也是转移过程中的关键步骤(Folkman，1995，NatureMedicine 1：27-31)。
也已显示免疫系统能抑制该恶性肿瘤细胞的转移，且已报道腺苷可抑制该免疫保护反应。例如，Loshkin等人，(2006，Cancer Res.66：7758-7765)报道了腺苷抑制杀伤T细胞的活化和细胞因子产生。腺苷不利地影响其它免疫功能，包括细胞组分和炎性功能(参见，例如，Spychala，2000，Pharmacology&Therapeutics 87：161-173和Sitkovesky等人，2005Nature ReviewsImmunology 5：713-721的综述)。Sitkovesky等人在2003年6月19日公开的WO 03/050241中也描述了增加对抗原的免疫应答和治疗肿瘤的方法，其通 过给药腺苷受体拮抗剂，可包括腺苷脱氨酶进行。
也已显示腺苷促进肿瘤细胞迁移和血管发生(Barcz等人，2000，Oncol.Rep.7(6)：1285-91；Adair，2005，Am J Physiol RegulIntegr Comp Physiol 289：R283-R296)且腺苷刺激结肠癌细胞的增殖(Muioomdar等人2003，Biochemical Pharmacology 661737-1747)。Asmar等人，1966，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.(摘要号73)也已报道在超过50％的小鼠腹水模型中某些肿瘤细胞的生长通过注射ADA被抑制。这些为淋巴细胞性白血病L1210和L4946，淋巴肉瘤6C3HED，乳腺癌TA3和欧利希氏癌(Ehrlich carcinoma)E2。在同一摘要中，报道了腺癌755对该作用有两倍抗性且肉瘤180对该作用完全抵抗。WO03050241A2描述了腺苷受体抑制剂对B16黑素瘤细胞的作用。尽管WO03050241A2提到ADA作为腺苷抑制剂，但没有具体说明以将ADA应用于治疗具体癌症，特别是卵巢癌和前列腺癌。
因此，看起来对于一些肿瘤，腺苷的存在对肿瘤增生和肿瘤血管发生提供了“通行(go)”信号，并对正常情况下杀死这些肿瘤的杀伤T细胞提供了“停止(stop)”信号。
与上述发现相反，Lind，等人(美国专利号6,579,857)报道了腺苷与腺苷脱氨酶抑制剂的组合，和/或与抗癌剂如助间型霉素的组合，可用于增强上皮来源的肿瘤细胞死亡的方法。因此，该文献暗示腺苷在癌症中的作用更加复杂和未定。
如上所述，用于降低内源性腺苷水平的试剂为腺苷脱氨酶。腺苷脱氨酶(″ADA″)，指定为EC 3.5.4.4，是重要的嘌呤再利用途径(purine salvagepathway)的酶。ADA将腺苷或脱氧腺苷在水的存在下转化为肌苷或脱氧肌苷和氨。已知具有在ADA基因中的有害突变的个体可发展为不同程度的免疫缺陷疾病，从轻度至重度，即重症联合免疫缺陷疾病(“SCID”)。已证实SCID是酶底物、腺苷和脱氧腺苷在未成熟的淋巴样细胞中的毒性累积的结果。疾病的发作可从幼童至成人，取决于遗传的突变。ADA的缺失是儿童中SCID的主要原因之一，且为基因治疗方法的主要靶点之一(R.Parkman等人，2000，″Gene therapy fordenosine deaminase deficiency″，Ann.Rev.Med.，51：33-47)。
之前，ADA已从牛来源商业分离并用于治疗多种疾病，包括SCID，其为缀合至聚乙二醇(″PEG″)聚合物的牛ADA的形式。用于医药用途的PEG化的ADA可从Enzon Pharmaceuticals，Inc.作为PEG化的ADA商购。PEG部分与ADA的缀合使得酶获得其完全治疗效果，这是通过增加循环寿命和使得ADA基本上非抗原性，以最小化免疫源反应的可能来实现的。也可制备以缀合形式使用的重组人或牛ADA酶，如以下所描述：共同拥有的美国专利申请序列号11/738,012，其名称为“Stabilized Proteins”，和共同拥有的美国申请序列号12/105,913，名称为“Stable Recombinant AdenosineDeaminase”，其于同一日提交且要求美国专利申请序列号60/913,009的优先权的权益，均以其整体在此引入作为参考。
因此，本领域存在治疗或抑制癌症生长、扩散和发展的新的和改善的方法的长期需求。
发明内容
因此，本发明提供治疗具有肿瘤的患者的方法，包括向需要的患者给药有效量的ADA。有效量是易于由本领域技术人员确定的减少患者腺苷或脱氧腺苷的组织水平的量，且其中肿瘤的生长或扩散通过患者的腺苷组织水平实质性降低(substantially reduced)所抑制。给药途径为例如皮下、静脉内、肌内、鞘内、腹腔内、吸入和经尿道的途径。
该肿瘤可为恶性的或非恶性的，且优选为实体瘤，例如，肿瘤如前列腺肿瘤，卵巢癌和/或结肠直肠癌。
该腺苷脱氨酶优选缀合至基本上非抗原性(substantially non-antigenic)聚合物，如聚环氧烷(polyalkylene oxide)(PAO)。该PAO优选的大小范围为约4,000至约45,000道尔顿。该PAO优选为聚乙二醇(″PEG″)。ADA与聚合物的摩尔比可为1∶1，或可为每个聚合物2个或更多个ADA分子，或更优选地，每个ADA分子约1至约20个聚合物分子(即11-18个PEG链)。
该聚合物-缀合的ADA优选的给药剂量范围为每kg约10U至约30U或更多，且维持足够的时间以保持对肿瘤的抑制，例如，约1至约20天，或更长。
给予的腺苷脱氨酶的量有效地实质性减少患者中腺苷或脱氧腺苷的组织水平，且其中肿瘤的生长或扩散被所述患者中实质性减少的腺苷组织水平所抑制。也就是说，例如，腺苷脱氨酶的剂量范围为每kg约10U至约30U。重复该剂量足够的时间以保持对肿瘤的抑制，例如，约1至约20天，或更长。该剂量通过任何方便的途径给药，如皮下、静脉内、肌内、鞘内、腹腔内、 吸入和经尿道。
该腺苷脱氨酶任选从牛来源纯化或为重组腺苷脱氨酶。该重组腺苷脱氨酶为，例如，包含SEQ ID NO：1的重组牛腺苷脱氨酶(Ser74-rbADA)，包含SEQ ID NO：3的重组人腺苷脱氨酶(Ser74-rhADA)和包含SEQ ID NO：5的重组牛腺苷脱氨酶和/或其变体或多态(polymorphism)。重组产生的牛腺苷脱氨酶，例如，SEQ ID NO：5，任选在Cys74封端(capped)，用于在水性介质中保持稳定。
出于本发明的目的，术语″残基″应理解是指化合物的部分，其涉及，例如，PEG、ADA、氨基酸，等，其在经历被另一化合物的取代反应后保留。
出于本发明的目的，术语″聚合物残基″例如，″PEG残基″每个应理解为聚合物或PEG的部分，其在与其它化合物、基团(moieties)等反应后保留。
出于本发明的目的，本文使用的术语“烷基”是指饱和脂肪烃，包括直链，支链和环状烷基。术语“烷基”还包括烷基-硫基-烷基，烷氧基烷基，环烷基烷基，杂环烷基和C1-6烷基羰基烷基。优选地，该烷基具有1至12个碳。更优选地，其为约1至7个碳的低级烷基，还更优选约1至4个碳。该烷基可为取代的或未取代的。当为取代的时，该取代的基团优选包括卤素、氧基、叠氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、烷基-硫基、烷基-硫基-烷基、烷氧基烷基、烷基氨基、三卤代甲基、羟基、巯基、羟基、氰基、烷基硅烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环烷基、杂芳基、烯基、炔基、C1-6烃基、芳基和氨基。
出于本发明的目的，本文使用的术语“取代”是指添加选自以下的一个基团或用选自以下的一个基团替换官能团或化合物中包含的一个或多个原子：卤素、氧基、叠氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、烷基-硫基、烷基-硫基-烷基、烷氧基烷基、烷基氨基、三卤代甲基、羟基、巯基、羟基、氰基、烷基硅烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环烷基、杂芳基、烯基、炔基、C1-6烷基羰基烷基、芳基和氨基。
出于本发明的目的，术语“烯基”是指含至少一个碳-碳双键的基团，包括直链、支链和环状基团。优选地，该烯基具有约2至12个碳。更优选地，其为约2至7个碳的低级烯基，还更优选约2至4个碳。该烯基可为取代的或未取代的。当为取代的时，该取代的基团优选包括卤素、氧基、叠氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、烷基-硫基、烷基-硫基-烷基、烷氧基烷基、烷 基氨基、三卤代甲基、羟基、巯基、羟基、氰基、烷基硅烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环烷基、杂芳基、烯基、炔基、C1-6烃基、芳基和氨基。
出于本发明的目的，术语“炔基”是指含至少一个碳-碳三键的基团，包括直链、支链和环状基团。优选地，该炔基具有约2至12个碳。更优选地，其为约2至7个碳的低级炔基，还更优选约2至4个碳。该炔基可为取代的或未取代的。当为取代的时，该取代的基团优选包括卤素、氧基、叠氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、烷基-硫基、烷基-硫基-烷基、烷氧基烷基、烷基氨基、三卤代甲基、羟基、巯基、羟基、氰基、烷基硅烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环烷基、杂芳基、烯基、炔基、C1-6烃基、芳基和氨基。″炔基″的实例包括炔丙基、丙炔和3-己炔。
出于本发明的目的，术语“芳基”是指包含至少一个芳环的芳香烃环体系。该芳环可任选与其它芳香烃环或非芳香烃环稠合或连接。芳基的实例包括，例如，苯基、萘基、1，2，3，4-四氢萘和联苯基。芳基的优选实例包括苯基和萘基。
出于本发明的目的，术语“环烷基”是指C3-8环烃。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
出于本发明的目的，术语“环烯基”是指包含至少一个碳-碳双键的C3-8环烃。环烯基的实例包括环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、1，3-环己二烯基、环庚烯基、环庚三烯基和环辛烯基。
出于本发明的目的，术语“环烷基烷基”是指被C3-8环烷基取代的烷基。环烷基烷基的实例包括环丙基甲基和环戊基乙基。
出于本发明的目的，术语“烷氧基”是指通过氧桥连接至母体分子部分的指定碳原子数的烷基。烷氧基的实例包括，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。
出于本发明的目的，“烷基芳基”是指被烷基取代的芳基。
出于本发明的目的，“芳烷基”是指被芳基取代的烷基。
出于本发明的目的，术语“烷氧基烷基”是指被烷氧基取代的烷基。
出于本发明的目的，术语“烷基-硫基-烷基”是指烷基-S-烷基硫醚，例如甲基硫基甲基或甲基硫基乙基。
出于本发明的目的，术语“氨基”是指现有技术已知的从氨衍生的含氮基团，其通过用有机基团代替一个或多个氢基而得到。例如，术语“酰基氨基” 和“烷基氨基”分别是指具有酰基和烷基取代基的特定的N-取代的有机基团。
出于本发明的目的，术语“烷基羰基”是指被烷基取代的羰基。
出于本发明的目的，术语“卤素’或“卤”是指氟、氯、溴和碘。
出于本发明的目的，术语“杂环烷基”是指包含至少一个选自氮、氧和硫的杂原子的非芳环体系。该杂环烷基环可任选与其它杂环烷基环和/或非芳香烃环稠合至或连接。优选杂环烷基具有3至7元。杂环烷基的实例包括，例如，哌嗪、吗啉、哌啶、四氢呋喃、吡咯烷和吡唑。优选杂环烷基包括哌啶基、哌嗪基、吗啉基和吡咯烷基。
出于本发明的目的，术语“杂芳基”是指包含至少一个选自氮、氧和硫的杂原子的芳环体系。该杂芳基环可与一个或多个杂芳基环、芳香或非芳香烃环或杂环烷基环稠合或连接。杂芳基的实例包括，例如、吡啶、呋喃、噻吩、5，6，7，8-四氢异喹啉和嘧啶。杂芳基的优选实例包括噻吩基、苯并噻吩基、吡啶基、喹啉基、吡嗪基、嘧啶基、咪唑基、苯并咪唑基、呋喃基、苯并呋喃基、噻唑基、苯并噻唑基、异噁唑基、噁二唑基、异噻唑基、苯并异噻唑基、三唑基、四唑基、吡咯基、吲哚基、吡唑基和苯并吡唑基。
出于本发明的目的，术语“杂原子”是指氮、氧和硫。
在一些实施方案中，取代的烷基包括羧基烷基、氨基烷基、二烷基氨基、羟基烷基和巯基烷基；取代的烯基包括羧基烯基、氨基烯基、二烯基氨基、羟基烯基和巯基烯基；取代的炔基包括羧基炔基、氨基炔基、二炔基氨基、羟基炔基和巯基炔基；取代的环烷基包括基团如4-氯环己基；芳基包括基团如萘基；取代的芳基包括基团如3-溴苯基；芳烷基包括基团如甲苯基；杂烷基包括基团如乙基噻吩；取代的杂烷基包括基团如3-甲氧基-噻吩；烷氧基包括基团如甲氧基；且苯氧基包括基团如3-硝基苯氧基。卤素应理解为包括氟、氯、碘和溴。
出于本发明的目的，“正整数”应理解为包括等于或大于1的整数，且本领域技术人员应理解在合理的范围内。
出于本发明的目的，术语“连接”应理解为包括共价(优选)或非共价连接一个基团至另一个基团上，即，由于化学反应的结果。
术语″有效量″和“足够量”出于本发明的目的应是指达到所需效果或治疗效果的量，该效果是本领域普通技术人员所理解的。
出于本发明的目的，术语“腺苷”应理解为包括核苷腺苷和脱氧腺苷。腺 苷还包括以AMP、ADP、ATP、dAMP、dADP或dATP形式存在的腺苷和脱氧腺苷。
出于本发明的目的，“腺苷介导的肿瘤”或“腺苷脱氨酶-响应性肿瘤”应以广义理解，包括任何受益于给药ADA或其活性部分(active fraction)等的肿瘤类型，且不考虑给药途径。
出于本发明的目的，“腺苷介导的肿瘤的治疗”或“腺苷脱氨酶-响应性肿瘤的治疗”或“腺苷介导的肿瘤生长的抑制”或“腺苷脱氨酶-响应性肿瘤生长的抑制”应理解为是指当与在没有ADA治疗的情况下观察到的相比，该症状或疾病被最小化或减轻。该治疗的症状可通过例如，肿瘤生长的抑制和/或癌细胞或组织中腺苷水平的降低而证实。
广义地说，应认为在获得所需临床响应(clinical response)时获得了成功的治疗。例如，成功的治疗可通过获得例如10％或更高(即20％30％，40％)肿瘤生长抑制而定义。或者与本文所述的在没有ADA治疗的情况下观察到的相比，成功的治疗可通过癌细胞或组织中获得至少20％或优选30％，更优选40％或更高(即，50％或80％)的腺苷水平的减少而定义，包括本领域技术人员考虑的其它临床指标。
而且，单数术语在说明书中的方便使用决不是为了限制。因此，例如，包含酶(anenzyme)的组合物涉及一个或多个分子的该酶。还应理解本发明不限于本文公开的具体构型、方法步骤和材料，这些构型、方法步骤和材料可稍加修改。
还应理解本文使用的术语仅是用于描述具体实施方案的目的，不是为了限制，因为本发明的范围将由所附权利要求和其等价物而限定。
发明详述
因此，本发明提供治疗肿瘤、包括癌症的新方法，该方法通过向需要的患者给药以一定量的ADA酶，且持续时间足以减少患者组织和/或体液中存在的腺苷的量。优选地，该ADA酶是聚合物缀合的。对于那些依赖于腺苷的存在而生长、转移扩散的肿瘤，和/或为了保护患者的免疫系统，内源性腺苷的充分减少将限制或防止癌症生长、转移扩散和/或使得患者的免疫系统的抗肿瘤活性正常运行。
也考虑本发明的对肿瘤的ADA治疗任选与一种或多种其它合适的现有 技术已知的抗癌治疗方法和药物组合或协同进行，其将在以下更详细讨论。本发明的组合治疗包括单独给药有效量的本文的化合物，或与第二化学治疗剂组合而同时或顺序给药。
用于该组合治疗的示例性的现有技术已知的抗癌剂包括，例如，TaxolTM，贝伐单抗长春新碱，长春碱，新霉素，考布他汀，鬼臼毒素，TNF-α，血管他丁，内皮他丁，血管抑制素(vasculostatin)，αv-β3拮抗剂，钙离子载体，钙运转(calcium-flux)诱导剂，它们的任何衍生物或前药。其它抗癌剂还包括化学治疗剂，放射治疗剂，细胞因子，抗血管形成剂，凋亡-诱导剂或抗癌免疫毒素或凝血配体(coaguligands)。一种该免疫毒素是例如(西妥昔单抗)。本文所述的″化学治疗剂″，是指用于治疗恶性肿瘤的经典化学治疗剂或药物。使用该术语，尽管事实上其它化合物技术上可描述为化学治疗剂，因为它们产生抗癌作用。然而，″化学治疗″已成为本领域明确的含义，且根据该标准含义使用。
因此，本发明的方法可与一种或多种已知有效治疗癌症的化学治疗剂组合使用，该化学治疗剂包括但不限于，5-氮胞苷，5-氟尿嘧啶，任选与以下药物组合：甲酰四氢叶酸(leucovorin)，5-氟脱氧尿苷，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，米托蒽醌，吖丙啶基苯醌(AZQ)，卡莫司汀(Bristol-Myers Squibb的BCNU或)，博来霉素，卡铂(CBDCA)，洛莫司汀(CCNU)，甲基-CCNU或MeCCNU，苯丁酸氮芥，氯脱氧腺苷，顺铂，环磷酰胺，阿糖胞苷，放线菌素D，柔红霉素，脱氧助间型霉素，多柔比星，doxycoformycin，DTIC(达卡巴嗪)，表柔比星，依托泊苷(VP-16)，氟达拉滨，六甲蜜胺，羟基脲，伊达比星，异环磷酰胺，异环磷酰胺和美司钠，左旋咪唑，N-乙酰基半胱氨酸(″NAC″)，1-苯基丙氨酸氮芥(1-phenylalaminemustard)，4′-(9-吖啶基氨基)甲磺酰胺-间-苯甲醚(4′-(9-acridinylamino)methanesulfon-m-anisidide)(″mAMSA″)，现有技术已知的多药耐药性的抑制剂(即，MDR抑制剂)，美法仑，甲氨蝶呤，任选与以下药物组合：甲酰四氢叶酸，光神霉素，丝裂霉素-c，多药耐药相关蛋白质的抑制剂(″MRP″抑制剂)，紫杉醇，丙卡巴肼，链脲佐菌素，N，N′N′-三亚乙基硫代磷酰胺(″塞替派″)，拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II抑制剂，紫杉醇，长春碱，vincristein，长春新碱，长春地辛，替尼泊苷和其它很多药物。
其它认为与本发明的方法组合使用的治疗癌症的方法包括用X-射线、γ 射线直接或以体层摄影靶向辐射，用植入式放射性球团或″种(seeds)″治疗癌症组织，中子束照射硼化合物预处理的组织，和/或其它类型本领域已知的粒子束治疗。
其它任选与本发明方法组合或协同给药的抗肿瘤或抗癌剂(抗肿瘤剂)包括描述于“GOODMAN AND GILMAN′S，THE PHARMACOLOGICALBASIS OF THERAPEUTICS”，TENTHEDITION，Eds.Hardman和Limbird的方法，以其整体在此引入作为参考.
为更好理解本发明，对以下术语进行了定义。
除非另有所述，本文涉及的″腺苷″还包括脱氧腺苷，和其本领域已知的存在于体内的变体和衍生物。
提到腺苷脱氨酶或ADA包括任何本领域已知形式的酶，包括纯化的天然酶，例如，纯化天然ADA，重组人或牛ADA和其变体、多态性(po1ymorphisms)和衍生物。从牛来源纯化的ADA酶具有根据SEQ ID NO：5的序列，且其Cys 74残基天然被半胱氨酸封端或保护，且从编码SEQ ID NO：5的ADA的基因预测的6个C-末端残基不存在。然而，预期本发明可使用天然牛ADA的替代变体进行，包括替代等位基因和多态性(polymorphism)，天然和重组产生的，有或没有预测的6个C-末端残基。牛ADA多态包括，例如，谷氨酰胺在198位代替赖氨酸；丙氨酸在245位代替苏氨酸；精氨酸在351位代替甘氨酸。
ADA酶的优选衍生物包括重组产生的ADA酶，其被突变以相对于非突变的重组ADA酶增强稳定性。这些包括，例如，从SEQ ID NO：5和/或具有一个或多个上述多态性的SEQ IDNO：5修饰的重组ADA酶，用合适的不可氧化(non-oxidizable)的氨基酸残基替换暴露于溶剂的可氧化的Cys残基。该不可氧化的残基包括任何本领域已知的天然氨基酸残基和/或任何其本领域已知的衍生物。例如，从首次从牛或人来源分离的基因表达的成熟重组ADA具有优选被不可氧化的氨基酸残基(例如，被Ser74)替换的不稳定的Cys74残基。该重组ADA酶由SEQ ID NO：1(牛ADA结构)和SEQ ID NO：3(人ADA结构)表示。SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4表示用于表达它们的有用DNA分子，其具有为大肠杆菌表达优化的密码子。关于该重组ADA突变蛋白的其它细节以及这些蛋白质的制备和纯化由共同拥有的美国专利申请序列号12/105,913
所提供，其要求美国专利申请号60/913,009的优先权，名称为“稳定的 重组腺苷脱氨酶”且在同一天(even date)提交，且以其整体在此引入作为参考。关于载体和纯化方法的具体细节可在其中找到，特别是实施例部分，最特别为实施例1-4。
或者ADA酶可按需要通过封端暴露于溶剂的可氧化的Cys残基而稳定化，其通过在足以封端反应性半胱氨酸的反应条件下用足量的封端剂处理ADA酶，而基本不灭活该ADA蛋白。该方法优选使用重组产生的ADA进行，可为突变蛋白或为野生型ADA酶。
例如，封端剂包括，但不限于，氧化的谷胱甘肽(优选)，碘乙酰胺，碘乙酸，胱氨酸，和本领域技术人员已知的其它二硫醇，及其混合物。本文所述方法的反应阶段中包含的封端剂的量和浓度将在一定程度上取决于具体使用的封端剂和技术人员的需求，但不需进行过多的实验。使用氧化的谷胱甘肽作为原型，当与重组蛋白质如rhADA反应时使用的浓度可为约25μM至约100mM。优选地，该氧化的谷胱甘肽以约5nM至约25mM的浓度与重组蛋白质反应。
封端剂和重组蛋白质反应过程中使用的反应条件进一步包括使用pH为约6.5至约8.4，优选约7.2至约7.8的水性溶液。此外，该水性溶液优选包括浓度为10至150mM的合适的缓冲液如磷酸钠，磷酸钾，Tris和Hepes及其混合物，(任选地，封端可超出该缓冲液范围而进行，低于10或高于150mM)。该反应条件进一步包括使反应在对于蛋白质降解不利的温度，即约4-37℃进行。任选地，封端可超出该温度范围进行，例如，在低于0-4℃或高于37℃的温度范围进行。该反应进行足够的时间以获得反应性半胱氨酸所需的稳定作用。仅仅是作为实例，该反应进行约5秒至约8小时(例如，过夜)。
其它关于封端的、稳定的重组ADA的细节由共同拥有的美国专利申请序列号11/738,012名称为“Stabilized Proteins”所提供，且特别是在实施例部分，其在此引入作为参考。
而且，单数术语在说明书中是为了方便决不是为了限制。因此，例如，包含酶(anenzyme)的组合物涉及该酶的一个或多个分子。还应理解本发明不限于本文公开的具体构型、方法步骤和材料，这些构型、方法步骤和材料可稍加修改。
A.聚合物-ADA缀合物
ADA的优选形式为聚合物缀合的酶形式。本发明的ADA-聚合缀合物(polymerconjugate)通常相应于式(I)：
(I)[R-NH]z-(ADA)
其中
(ADA)表示腺苷脱氨酶或任选地，其衍生物或片段；
NH-为ADA上的氨基酸的氨基、其衍生物或片段，用于连接至聚合物；
(z)为正整数，优选约1至约80，更优选约5至约80，还更优选约11至约18；且
R为以可释放或不可释放的形式连接至ADA的基本上非抗原性聚合物残基。
缀合物(R)的非抗原性聚合物残基部分可选自聚合物-基体系的非限制性实例，如：
和
其中：
R10-11和R22-23可相同或不同且为独立选择的非抗原性聚合物残基；
R3-9，R12-21和R24(参见下文)相同或不同且各自独立地选自氢，C1-6烷基，C3-12支链烷基，C3-8环烷基，C1-6取代的烷基，C3-8取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C1-6杂烷基，取代的C1-6杂烷基，C1-6烷氧基，苯氧基和C1-6杂烷氧基；
Ar为形成多取代的芳香烃或多取代的杂环基的部分；
Y1-11和Y13可相同或不同且独立地选自O，S和NR24；
A选自烷基，靶向部分，诊断剂和生物活性部分；
X为O，NQ，S，SO或SO2；其中Q为H，C1-8烷基，C1-8支链烷基，C1-8取代的烷基，芳基或芳烷基；
Z和Z’独立地选自主动运输至靶细胞的部分，疏水部分，双官能连接部分及其组合；
L1-6和L8可相同或不同且为独立选择的双官能连接基；
(a)，(c)，(d)，(f)，(g)，(i)，(j)，(j’)，(k)，(l)，(n)，(o)，(p)，(q)和(t)可相同或不同且优选地，在大多数方面独立地为0或正整数；
(b)，(e)，(r)，(r’)，(s)，(h)，(h’)和(m)可相同或不同且独立地为0或1；
mPEG为甲氧基PEG且
(u)为正整数以提供总分子量为约2,000至约100,000Da，优选约4,000至约45,000Da的聚合物。
在上述中，优选Y1-11和Y13为O；R3-8，R12-21和R24各自独立地为氢或C1-6烷基，且甲基和乙基是最优选的烷基，且R7-9优选为CH3。
在本发明另一方面，该缀合物的聚合物部分可为ADA提供多个连接点。该体系的非限制性实例包括：
和
其中所有变量与上述相同。
或者和/或优选地，多个PEG链连接至ADA。在这些方面，该ADA聚合缀合物可包括至少5个聚乙二醇链至高达80个链连接至酶上的Lys的ε氨基，但优选地，可包括约11-18PEG链连接至酶上的Lys的ε氨基。
尽管ADA每个酶分子通过赖氨酸连接缀合约11至约18个PEG分子，但可改变PEG与ADA的比例以修改组合的缀合物的物理和动力特性以适合任何具体临床情形。
可使用的制备ADA缀合物的活化的聚合物将自然与上述聚合物部分直接相应。主要特征为离去基团或活化基团的存在，有时在本文指定为B1，其促进聚合物体系连接至ADA上的胺基团(例如，赖氨酸的ε胺基团)。因此，化合物(i)-(xiii)包括离去基团或活化基团，如：
和
或其它合适的离去基团或活化基团如N-羟基苯并三唑基，卤素，N-羟基邻苯二甲酰亚胺基(hydroxyphthalimidyl)，咪唑基，O-酰基脲，五氟苯酚或2，4，6-三-氯苯酚或其它对于本领域技术人员明显的合适离去基团，这些基团发现于缀合反应后ADA连接的位置。
一些优选的活化的PEG包括公开于以下的那些：共同授让的美国专利号5,122,614，5,324,844，5,612,460和5,808,096(琥珀酰亚胺基碳酸酯-活化的聚乙二醇(SC-PEG)和相关活化的PEG′s)，和美国专利号5,349,001(环状亚胺硫酮活化的PEG′s)，其内容在此引入作为参考。本领域技术人员应理解，这些缀合反应通常在合适的缓冲液中使用几倍摩尔过量的活化的PEG而进行。一些优选的用直链PEG(如上述SC-PEG)制备的缀合物每个酶可包含平均约1至约80个PEG链。结果，因此，可使用几百倍摩尔过量，例如，200-1000倍。用于支链聚合物和连接至酶的聚合物的摩尔过量是较低的，且可使用下文所述的描述它们的专利和专利申请中描述的技术而确定。
出于本发明的目的，活化的基团应理解为能与ADA上(例如Lys上)的胺基团(亲核基团)反应的基团。
出于本发明的目的，上述也涉及活化的聚合物连接基。该聚合物残基优选基于聚环氧烷且更优基于选聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG是直链、支链或多臂的。
关于上述聚合物，可以看出Ar为形成多取代的芳香烃或多取代的杂环基的部分。关键特征为该Ar部分本质上是芳香的。通常，作为芳香性，pi电子必须在环状分子的平面上方和下方共享“电子云”。而且，pi电子的数量必须满足Huckle规则(4n+2)。本领域技术人员将认识到众多基团将满足基团芳香性的需求，因此其都适合在此使用。
在本发明一些优选方面，基于苄基消除或三甲基锁(lock)内酯化的聚合物体系的活化的聚合物连接基根据共同授让的美国专利号6,180,095，6,720,306，5,965,119，6,624,142和6,303,569制备，其内容在此引入作为参考。在本文中，优选以下活化的聚合物连接基：
在本发明另一方面，该ADA聚合缀合物使用某些N-二(羟乙基)甘氨酸 (bicine)聚合物残基制备，如描述于以下的残基：共同授让的美国专利号7,122,189和7,087,229和美国专利申请号10/557,522，11/502,108，和11/011,818。该专利申请每一个的公开在此引入作为参考。一些优选的活化的聚合物包括：
和
还应理解以上所示的离去基团或活化基团仅为合适基团之一，本文提及的其它基团也可使用，而没有过多的实验。
在其它方面，该活化的聚合物连接基使用支链的聚合物残基制备，如描述于共同授让的美国专利号5,681,567，5,756,593，5,643,575；5,919,455，6,113,906，6,153,655，6,395,266和6,638,499，6,251,382和6,824,766的那些，其各自的公开内容在此引入作为参考。这些活化的聚合物相应于聚合物体系
(iv)-(ix)，且以下是有代表性的：
其中B1为活化基团且所有变量如上定义。
在其它方面，活化的聚合物可使用受阻的酯-基(hindered ester-based)连接基。参见PCT/US07/78593，名称为“Polypropylene Oxides Having HinderedEster-BasedBiodegradable Linkers”，其内容被引入作为参考。例如，该化合物的非限制性实例包括：
和
其中(u)为约10至约2300的整数，以优选提供总分子量为约4,000至约45,000的聚合物。
在一个优选实施方案中，该活化的聚乙二醇提供与蛋白质的尿烷连接或酰胺-连接。
制备高纯度的具有末端羧酸的聚合物的方法描述于美国专利申请号11/328,662，其内容在此引入作为参考。该方法包括首先制备聚环氧烷的叔烷基酯，然后转化为其羧酸衍生物。该方法制备PAO羧酸的第一步骤包括形成中间体如聚环氧烷羧酸的叔丁基酯。该中间体通过将PAO与卤代乙酸叔丁酯在碱如叔丁醇钾的存在下反应而形成。一旦该叔丁基酯中间体形成，聚环氧烷的羧酸衍生物可易于以超过92％，优选超过97％，更优选超过99％且最优选超过99.5％的纯度形成。
在其它方面，可使用具有末端胺基团的聚合物以制备ADA缀合物。以高纯度制备含末端胺的聚合物的方法描述于美国专利申请号11/508,507和11/537,172，其每个的内容被引入作为参考。例如，具有叠氮化物的聚合物与膦-基还原剂如三苯基膦或碱金属硼氢化物还原剂如NaBH4反应。或者包含离去基团的聚合物与保护的胺盐如亚氨二甲酸甲基-叔丁基酯(methyl-tert-butyl imidodicarbonate)(KNMeBoc)的钾盐或亚氨二甲酸二叔丁酯(KNBoc2)的钾盐反应，然后脱保护被保护的胺基。由这些方法形成的含该末端胺的聚合物的纯度大于约95％且优选大于99％。
1.基本上非抗原性聚合物
如上所述，R10-11和R22-23各自优选为水溶性聚合物残基，其优选为基本上非抗原性的，如聚环氧烷(PAO’s)且更优选聚乙二醇如mPEG。出于解释而不是限制的目的，R10-11和R22-23的聚乙二醇(PEG)残基部分可选自：
J-O-(CH2CH2O)u-
J-O-(CH2CH2O)u-CH2C(O)-O-，
J-O-(CH2CH2O)u-CH2CH2NR25-，和
J-O-(CH2CH2O)u-CH2CH2SH-，
其中：
(u)为聚合度，即为约10至约2,300；
R25选自氢，C1-6烷基，C2-6烯基，C2-6炔基，C3-12支链烷基，C3-8环烷基，C1-6取代的烷基，C2-6取代的烯基，C2-6取代的炔基，C3-8取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C1-6杂烷基，取代的C1-6杂烷基，C1-6烷氧基，苯氧基和C1-6杂烷氧基，和
J为封端基团，即，聚合物的末端发现的基团，且在一些方面，可选自NH2(或CH2CH2NH2)，H，SH(或CH2CH2SH)，CO2H(或CH2CO2H)，C1-6烷基的任一种，优选甲基，或其它PEG末端活化基团，这些基团是本领域技术人员理解的。
在一个特别优选的实施方案中，R10-11和R22-23选自，CH3-O-(CH2CH2O)u-，CH3-O-(CH2CH2O)u-CH2C(O)-O-，CH3-O-(CH2CH2O)u-CH2CH2NH-和CH3-O-(CH2CH2O)u-CH2CH2SH-，其中(u)为正整数，优选加以选择使得聚 合物部分的平均总分子量为约2,000至约100,000Da。更优选地，R10-11和R22-23独立地具有约4,000Da至约4,5000Da的平均总分子量，且最优选重均分子量为约5,000Da以上。其它分子量也在考虑范围以满足技术人员的需要。
PEG通常由以下结构表示：
且R10-11和R22-23优选包括该式的残基。聚合物的聚合度表示聚合物链中重复单元的数目且其取决于聚合物的分子量。
或者本发明的聚乙二醇(PEG)残基部分可由以下结构表示：
-Y31-(CH2CH2O)u-CH2CH2Y31-，
-Y31-(CH2CH2O)u-CH2C(＝Y32)-Y31-，
-Y31-C(＝Y32)-(CH2)a11-Y33-(CH2CH2O)u-CH2CH2-Y33-(CH2)a11-C(＝Y32)-Y31-，
-Y31-(CR31R32)a12-Y33-(CH2)b11-O-(CH2CH2O)u-(CH2)b11-Y33-(CR31R32)a12-Y31-，
-Y31-(CH2CH2O)u-CH2CH2-，
-Y31-(CH2CH2O)u-CH2C(＝Y32)-，
-C(＝Y32)-(CH2)a11-Y33-(CH2CH2O)u-CH2CH2-Y33-(CH2)a11-C(＝Y32)-，和
-(CR31R32)a12-Y33-(CH2)b11-O-(CH2CH2O)u-(CH2)b11-Y33-(CR31R32)a12-，
其中：
Y31和Y33独立地为O，S，SO，SO2，NR33或键；
Y32为O，S或NR34；
R31-34独立地选自氢，C1-6烷基，C2-6烯基，C2-6炔基，C3-19支链烷基，C3-8环烷基，C1-6取代的烷基，C2-6取代的烯基，C2-6取代的炔基，C3-8取代的环烷基，芳基，取代的芳基，杂芳基，取代的杂芳基，C1-6杂烷基，取代的C1-6杂烷基，C1-6烷氧基，芳基氧基，C1-6杂烷氧基，杂芳基氧基，C2-6烷酰基，芳基羰基，C2-6烷氧基羰基，芳基氧基羰基，C2-6烷酰基氧基，芳基羰基氧基，C2-6取代的烷酰基，取代的芳基羰基，C2-6取代的烷酰基氧基，取代的芳基氧基羰基，C2-6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基；
(a11)，(a12)和(b11)独立地为0或正整数，优选0-6，且更优选0，1，或2；和
(u)为约10至约2300的整数。
作为实例，该PEG可以以下非限制性方式官能化：
-C(＝Y34)-(CH2)m11-(CH2CH2O)u-，
-C(＝Y34)-Y-(CH2)m11-(CH2CH2O)u-，
-C(＝Y34)-NR31-(CH2)m11-(CH2CH2O)u-，
-CR35R36-(CH2)m11-(CH2CH2O)u-
其中
R31，R35和R36独立地选自H，C1-6烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，杂烷基，取代的杂烷基和取代的C1-6烷基；
(m11)为0或为正整数，且优选1或2；
Y34为O或S；和
(u)表示聚合度。
在这些方面，封端基团(J)如甲基连接至PEG的末端。
例如，本发明的缀合物可通过以下方法制备，其包括将如以下描述的多臂PEG-OH和“星状(star)-PEG”产物转化为适当活化的聚合物：NOF Corp.Drug Delivery System目录，Ver.8，2006年4月，其公开在此引入作为参考，并使用描述于上述美国专利号5,122,614或5,808,096的活化技术。还参见Shearwater Corporation’s 2001目录″PolyethyleneGlycol and Derivatives forBiomedical Application″，在此引入作为参考。
该多臂聚合物包含4个或更多个聚合物臂且优选4或8个聚合物臂。出于解释而不是限制的目的，该多臂聚乙二醇(PEG)残基可为下式：
其中：
(x)为0和正整数，即约0至约28；和
(n)为聚合度。
在本发明一个具体实施方案中，该多臂PEG具有以下结构：
其中(n)为正整数。在本发明一个优选实施方案中，该聚合物的总分子量为约2,000Da至约100,000Da，且优选4,000Da至45,000Da。
具体地，和PEG可为下式：
或
其中：
(u’)为约10至约570的整数，以优选提供总分子量为约4,000至约45,000的聚合物；且残基的至多3个末端部分被甲基或其它低级烷基封端。
在一些优选的实施方案中，PEG的所有4个臂转化为合适的官能团，即SC，等，以促进连接至重组蛋白质。该转化之前的化合物包括：
和
本文包括的聚合物质优选在室温是水溶性的。该聚合物的非限制性实例包括聚环氧烷均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇，聚氧乙烯化的多元醇，其共聚物及其嵌段共聚物，条件是保持嵌段共聚物的水溶性。
在另一实施方案中，且作为PAO-基聚合物的代替物，R10-11和R22-23各自任选选自一种或多种有效的非抗原性物质如葡聚糖，聚乙烯醇，碳水化合物-基聚合物，羟基丙基甲基-丙烯酰胺(HPMA)，聚环氧烷，和/或其共聚物。也参见共同指定的美国专利号6,153,655，其内容在此引入作为参考。本领域技术人员应理解本文使用的活化与对PAO′s如PEG的活化类型相同。本领域普通技术人员将进一步认识到上述实例仅是解释性的，所有具有本文所述特性的聚合物质都被考虑，且其它聚环氧烷衍生物如聚丙二醇等也在考虑范围。
2.双官能连接基
在本发明许多方面，L1-6和L8为促进聚合物链(例如R10-11和/或R22-23)连接的连接基。提供的连接可为直接连接或通过本领域技术人员已知的其它偶联基团连接。在本发明该方面，L1-6和L8可相同或不同且可选自本领域技术 人员众所周知的多种基团，如双官能和杂双官能脂肪族和芳香-脂肪族基团，氨基酸，等。因此，L1-6和L8可相同或不同且包括基团如：
-NH(CH2CH2)2O-，
-NH(CH2CH2)(CH2CH2O)NH-，
-O(CH2CH2)NH-，
-O(CH2CH2)O-，
-NH(CH2CH2)NH-，
-NH(CH2CH2)(CH2CH2O)-，
-NH(CH2CH2O)-，
-NH(CH2CH2O)(CH2)NH-，
-NH(CH2CH2O)2-，
-O(CH2)3NH-，
-O(CH2)3O-，
-O(CH2CH2O)2NH-，
优选地，L1-6和L8选自：
-C(O)CH2OCH2C(O)-；
-C(O)CH2NHCH2C(O)-；
-C(O)CH2SCH2C(O)-；
-C(O)CH2CH2CH2C(O)-，和
-C(O)CH2CH2C(O)-。
或者合适的氨基酸残基可选自任何已知的天然存在的L-氨基酸，例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，等和/或其组合，仅列出一些。L1-6和L8也可包 括大小为例如，约2至约10个氨基酸残基的肽。
天然存在的氨基酸的衍生物和类似物，以及各种现有技术已知的非天然存在的氨基酸(D或L)，疏水的或非疏水的，也在本发明考虑的范围内。
3.Z部分及其功能
在本发明的一个方面，Z和Z’为L7-C(＝Y12)其中L7为选自限定L1-6的基团，且Y12选自与限定Y1的基团相同的基团的双官能连接基。在本发明该方面，该Z基团作为ADA和聚合物递送体系的剩余部分之间的连接基。在本发明其它方面，Z为主动运输至靶细胞的部分，疏水部分，及其组合。该Z’当存在时可作为双官能连接基，主动运输至靶细胞的部分，疏水部分，及其组合。
在本发明的该方面，制备该可释放的聚合物体系以使体内水解将聚合物从ADA裂解并释放酶进入细胞外液，同时仍连接至Z部分。例如，一些可能的Z-B组合为亮氨酸-ADA和Gly-Phe-Leu-Gly-ADA。
B.制备ADA缀合物
出于解释的目的，合适的缀合反应包括将ADA与本文所述的适当活化的聚合物体系反应。该反应优选使用本领域技术人员公知的用于蛋白质修饰的条件进行，包括使用PBS缓冲体系等，且pH范围为约6.5-8.5。预期在大多数情况下，过量的活化的聚合物将与ADA反应。
这种反应将经常导致含连接至ADA的一个或多个聚合物的缀合物的形成。应理解，经常需要分离不同级分并提供更均一的产物。在本发明大多数方面，收集该反应混合物，装载至合适的柱树脂上，且用增加量的缓冲液依序洗脱所需级分。通过合适的分析工具分析级分以测定进一步加工前缀合的蛋白质的纯度。不考虑所选的合成路线和活化的聚合物，该缀合物将符合本文定义的式(I)。从本文所述合成技术形成的一些优选缀合物包括：
其中B为ADA。
根据本发明制备的其它缀合物包括：
其中所有变量与上述相同，且B为ADA。
其它缀合物包括：
其中B为ADA。
特别优选的缀合物为：
其中mPEG的分子量为约4,000至约45,000。
当使用N-二(羟乙基)甘氨酸-基聚合物体系时，两个优选的缀合物为：
和
其中mPEG的分子量与上述相同。
更优选的缀合物包括
和
注意到ADA的PEG化将凭经验对每个蛋白质的总PEG连接、PEG聚合物大小和PEG连接基设计进行优化。用于评估PEG化优化的PEG化的ADA的关键特征包括体外测试(例如，酶活性和稳定性)和体内测试(例如，药代动力学和药效学)。
C.待治疗的肿瘤
本发明的方法适用于治疗所有类型的肿瘤(包括癌症)，该方法易于降低待治疗的人或动物的血液和/或组织中的腺苷或脱氧腺苷水平。广义地，这些包括血液肿瘤以及实体瘤。所包含的实体瘤为腺苷水平的降低能使患者免疫系统更有效抑制肿瘤的那些肿瘤，和/或因腺苷水平的降低抑制血液供应而受抑制的肿瘤，例如，在含氧量低的肿瘤中。
更优选地，对本发明的治疗方法敏感的肿瘤为实体瘤，其受益于伴随着腺苷组织水平减少的血管生成刺激减少的附加作用。
待治疗的肿瘤包括，仅仅是作为实例，那些源自以下的肿瘤：免疫系统、骨骼系统、肌肉和心脏、乳房、胃肠道、中枢和外周神经系统、肾系统、生殖系统、呼吸系统、皮肤、结缔组织系统，包括关节、脂肪组织、循环系统，包括血管壁等。
骨骼系统的肿瘤包括，例如，肉瘤和胚细胞瘤如骨肉瘤、软骨肉瘤、成 软骨细胞瘤，等。肌肉和心脏肿瘤包括骨骼和平滑肌肿瘤，例如，平滑肌瘤(平滑肌良性肿瘤)、平滑肌肉瘤、横纹肌瘤(骨骼肌良性肿瘤)、横纹肌肉瘤、心脏肉瘤，等。胃肠道肿瘤包括例如，口腔肿瘤、食管、胃、小肠、结肠和结肠直肠的肿瘤，以及胃肠分泌器官如唾液腺、肝、胰腺、胆道的肿瘤等。
中枢神经系统的肿瘤包括脑、视网膜和脊髓的肿瘤，且也可源自相关结缔组织、骨、血管或神经组织。也考虑治疗外周神经系统的肿瘤。此外，外周神经系统的肿瘤包括恶性的外周神经鞘瘤。
肾系统的肿瘤包括肾的肿瘤，例如，肾细胞癌，以及输尿管和膀胱的肿瘤。生殖系统的肿瘤包括子宫颈、子宫、卵巢、前列腺、睾丸和相关分泌腺的肿瘤。免疫系统的肿瘤包括基于血液的肿瘤和实体瘤，包括淋巴瘤，例如，霍奇金和非-霍奇金瘤。
呼吸系统的肿瘤包括鼻通道、支气管和肺的肿瘤。乳腺肿瘤包括，例如，小叶性和导管性癌。
待治疗的特别常见类型的恶性肿瘤包括，仅仅是作为实例：前列腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、皮肤黑素瘤、淋巴瘤、非-霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、成神经细胞瘤、Wilms′肿瘤、横纹肌肉瘤(产生自肌肉)、成视网膜细胞瘤、骨肉瘤和Ewing′s肉瘤，仅列出一些。
D.剂量选择
技术人员将理解，在临床环境，的剂量根据肿瘤的临床响应和个体患者(无论动物或人)的副作用特性而不同。在以下提供的实施例研究中，最高剂量为耐受的最大可行剂量。以250U/mL商业提供。对于用0.2ml注射的约25g小鼠相当于2000U/kg。下文提供的实施例研究中使用的最低剂量近似于临床的人剂量。治疗人SCID患者中推荐的给药方案为第一剂量10U/kg，第二剂量15U/kg，和第三剂量20U/kg。5U/kg/周的进一步增加是允许的，直到最大单次剂量为30U/kg。以下示例的方案中的剂量(100U/kg)为约12U/kg临床儿童剂量的小鼠等效剂量。
基于酶的量的剂量将为，例如，约0.10U/kg至约30U/kg，或更高，优选约0.5U/kg至约20U/kg，且更优选约0.5U/kg至约12U/kg(即每kg患者体重)如约0.5U/kg至约5U/kg。总周剂量可高达40U/kg，或更多， 只要接受者耐受。5U/kg/周的进一步增加是允许的，直到最大单次剂量为30U/kg，或更多，只要接受者耐受。通常，以15U/kg周注射后，血浆中ADA活性的平均整体水平为20至25μmol/hr/mL。
当然，技术人员将理解聚合物-缀合的ADA的剂量还可根据具体聚合物大小、连接基化学物(linker chemistry)以及价态而调节。例如，相对于每个聚合物包含两个或四个ADA酶的聚合缀合物，其给药方案将根据任何具体的ADA聚合缀合物的每ml溶液中ADA的单位而调节。
在通过注射提供ADA或ADA PEG-缀合物时，最佳剂量范围可通过监测血浆中的腺苷水平调节。通常需要向接受者提供以下剂量，其将保持血浆ADA活性(整体水平(troughlevels))为约10至100μmol/hr/mL，优选约15至约35μmol/hr/mL(在37C测试)；且证实红细胞腺苷的下降，即，在预注射样品中测量，在浓缩的红细胞(packed erythrocyte)中dATP至≤约0.001-0.057μmol/mL，优选约0.005-约0.015μmol/mL，或≤约1％的总红细胞腺苷(即，ATP+dATP含量)具有正常腺苷水平。dATP的正常值低于约0.001μmol/mL。ADA剂量信息的详情描述于(Enzon，Inc.)中的处方插页，其内容在此引入。
实施例
以下实施例用来提供对本发明的进一步理解，但不以任何方式限制本发明的有效范围。
实施例1
在DU145人前列腺肿瘤异种移植模型中的抗肿瘤功效
A)测试体系
物种： 小鼠，小家鼠
品系： 无胸腺裸鼠
供应商： Harlan-Sprague Dawley
性别： 雌性
平均初始重量： 27.2g
研究的数量： 40
顺应期： 到来后7天
鉴别： 笼号和耳穿孔
B)方法
实验设计：
DU 145人前列腺癌细胞获自美国典型培养物保藏中心(American TypeCultureCollection)(ATTC)，Manassas，VA。通过向右腋侧皮下注射2.0x 106DU 145细胞/小鼠，在裸小鼠中建立肿瘤。每周两次监测肿瘤生长且对可触及的肿瘤测量一次。当肿瘤达到平均体积为78mm3时，将小鼠分为各个实验组(8/组)。小鼠用以2000，500，或100IU/kg治疗，每周两次保持5周。作为阳性对照，小鼠以与相同的频率以5mg/kg剂量接受(贝伐单抗(Bevacizumab)，抗-VEGF单克隆抗体)。实验组按下表1所示建立。给药的第一天指定为第1天。各小鼠的肿瘤体积通过用卡尺测量两个尺寸，并用下式计算而确定：肿瘤体积＝(长x宽2)/2)。在研究开始时测量和在整个8周期间每周测两次小鼠重量和肿瘤尺寸。
表1
剂量选择：
或通过腹腔内(″i.p.f″)途径每周给药两次，保持5周(总共：10剂量)。
批号：NV0604，浓度：229IU/ml
批号：M66781，浓度：25mg/ml
剂量计算基于在第1天测得的体重。
临床检测：
小鼠在到来时可视检测。之后，初始肿瘤可触后将小鼠按个体每周检测两次，检测临床体征、一般行为变化，并监测体重。记录任意死亡和临床体征。食物和水消耗未监测。将带有显示开放坏死性损伤(open necrotic lesions)的肿瘤的小鼠处死。体重损失大于20％的小鼠也被人性化地处死。
统计分析：
使用单因素方差分析比较不同治疗间的肿瘤体积％变化的差异。使用Holm-Sidak方法进行全配对多重比较。
C)结果
使用的术语的定义：
(a)％初始肿瘤体积：(在任何指定天的肿瘤体积/第1天的肿瘤体积)x100
(b)％肿瘤体积变化：[(在任何指定天的肿瘤体积-第1天的肿瘤体积)/第1天的肿瘤体积]x100
(c)％肿瘤生长抑制(TGI)：[(对照组的平均肿瘤体积-治疗组的平均肿瘤体积)/对照组的平均肿瘤体积]x100
(d)肿瘤的消退定义为相比第1天肿瘤体积减小
(e)治愈定义为人肉眼观察到的肿瘤的完全消失。
研究开始时的平均肿瘤尺寸为78mm3。研究开始时的平均体重为27.20g。所有组中的小鼠体重增加，且到研究结束时各组中小鼠重量相比治疗前的重量增加20至25％。该研究在第57天终止，此时大多数动物具有溃疡性肿瘤或肿瘤体积超过1500mm3。
下表2和3总结了在研究第49天观察到的最终结果(对照动物100％存活的最后一天)，并提供了治疗的动物和治疗的动物的组间存活比较。对照组中的肿瘤在整个研究中稳定生长。在第49天，平均肿瘤体积尺寸为783.1(±556.2)mm3。肿瘤生长的百分比变化为833.3％(±622.7)。用在所有三个剂量水平的治疗有效抑制肿瘤生长。应注意对于所有治疗组，肿瘤以缓慢速率生长直到给药最后一天(第33天)，之后肿瘤具有较 快的生长速率(数据未显示)。与该观察一致的是在所有三个剂量水平下肿瘤体积的％变化明显不同于对照组，直到第36天(P＜0.05)(数据未显示)。
这表明对肿瘤生长具有细胞抑制作用。尽管在第36天后直到研究结束时，肿瘤体积的％变化与对照相比没有显著性差异，但用治疗导致可检测的肿瘤生长抑制。特别是，用2000IU/kg治疗的肿瘤的平均肿瘤体积在第49天为343.0(±249.8)mm3。肿瘤体积的平均变化为424.2％(±360.6)。2000IU/kg的显示56％肿瘤生长抑制。
用500IU/kg治疗的肿瘤的平均肿瘤体积在第49天为696.3(±290.4)mm3。肿瘤体积的平均变化为797.6％(±492.7)，且从初始肿瘤的变化为897.6％(±492.7)。肿瘤生长抑制为11.1％。第40天前该组中的肿瘤具有与其它-治疗组类似的肿瘤生长速率，之后它们以更快的速率生长。该差异的原因未知。
用100IU/kg治疗的肿瘤的平均肿瘤体积在第49天为414.8(±219.0)mm3。肿瘤体积的平均变化为489.9％(±307.0)，且从初始肿瘤的平均百分变化为589.9％(±307.0)。肿瘤生长抑制或TGI为47.0％。
的治疗效果在最低剂量100IU/kg达到最大效果。应注意100IU/kg剂量近似于的临床人剂量(用于治疗SCID儿童的剂量)。显示最有效地减少肿瘤尺寸，且肿瘤生长抑制或TGI为92.5％。
总之，用以所有三个剂量水平治疗能在体内有效抑制DU145肿瘤生长。
表2：最终总结(第49天)
组号 化合物 最终平均肿瘤体积 最终肿瘤体积中值 肿瘤体积％变化 ％初始肿瘤体积 ％初始肿瘤体积 #消退 #治愈 ％存活
1 盐水 783.1 (556.2) 680.0 833.3 (622.7) 933.3 (622.7) 0 0 62.5
2 Adagen (2000 IU/kg) 343.0 (249.8) 283.8 424.2 (360.6) 524.2 (360.6) 56.2 0 0 75.0
3 Adagen (500IU/kg) 696.3 (290.4) 766.2 797.6 (492.7) 897.6 (492.7) 11.1 0 0 75.0
4 Adagen (100IU/kg) 414.8 (219.0) 349.8 489.9 (307.0) 589.9 (307.0) 47.0 0 0 75.0
5 Avastin (5mg/kg) 58.5 (36.1) 49.3 -15.7 (59.6) 84.3 (59.6) 92.5 7/8 0 87.5
#消退，#治愈和％存活数据从第56天。
肿瘤体积平均值、中值、肿瘤体积％变化、％初始肿瘤体积和％肿瘤生长抑制数据从第49天。
表3：组存活比较(#活的动物)
实施例2
在SK-OV-3人卵巢肿瘤异种移植模型中的抗肿瘤功效
A)测试体系
物种： 小鼠，小家鼠
品系： 无胸腺裸鼠
供应商： Harlan-Sprague Dawley
性别： 雌性
平均初始重量： 22.18g
研究的数量： 54
顺应期： 到来后7天
B)方法
实验设计：
通过向右腋侧皮下注射3x106细胞/小鼠在裸小鼠中建立SK-OV-3人卵巢腺癌肿瘤。每周两次监测肿瘤生长且对可触及的肿瘤测量一次。各小鼠的肿瘤体积通过用卡尺测量两个尺寸，并用下式计算而确定：肿瘤体积＝(长x宽2)/2)。当肿瘤达到平均体积为90mm3时，将小鼠分为各个实验组(9/组)。实验组按下表1所示建立。给药的第一天指定为第1天。小鼠重量和肿瘤尺寸在研究开始时测量且每周测两次直到研究终止。约7周(52天)后终止研究，此时大多数动物具有大的或溃疡性肿瘤块。
表4
给药方案：
或天然ADA(Native ADA)每周两次静脉内给药，保持5周(总共：10剂量)。
试验样品：
批号：NV0604，浓度：229IU/ml
批号：M66781，浓度：25mg/ml
天然ADA：批号：06-0315-111
剂量计算：
基于第1天测得的体重。
临床检测：
小鼠在到来时可视检测。之后，初始肿瘤可触后将小鼠按个体每周检测两次，检测临床体征、一般行为变化，并监测体重。记录任意死亡和临床体征。食物和水消耗未监测。将带有显示开放坏死性损伤(open necrotic lesions)的肿瘤的小鼠处死。体重损失大于20％的小鼠也被人性化地处死。
统计分析：
使用单因素方差分析比较不同治疗间的肿瘤体积％变化的差异。使用Tukey-Kramer方法进行全配对多重比较。
C)结果
使用的术语的定义：
(a)％初始肿瘤体积：(在任何指定天的肿瘤体积/第1天的肿瘤体积)x100
(b)％肿瘤体积变化：[(在任何指定天的肿瘤体积-第1天的肿瘤体积)/第1天的肿瘤体积]x100
(c)％肿瘤生长抑制(TGI)：[(对照组的平均肿瘤体积-治疗组的平均肿瘤体积)/对照组的平均肿瘤体积]x100
(d)肿瘤的消退定义为相比第1天肿瘤体积减小
(e)治愈定义为人肉眼观察到的肿瘤的完全消失。
研究开始时的平均肿瘤尺寸为90mm3。研究开始时的平均体重为22.2g。所有组中的平均体重在整个研究中没有明显变化。该研究在第52天终止。由于肿瘤生长超过1500mm3处死四只小鼠。
下表5给出了在第32天的结果的最终总结(对照动物66％存活的最后一天)。对照组中的肿瘤在整个研究中稳定生长。在第32天，平均肿瘤体积尺寸为754.9(±700.7)mm3。肿瘤生长的百分比变化为693.2％(±673.6)。
表5：最终总结(第32天)
用2000IU/kg治疗的肿瘤的平均肿瘤体积在第32天为437.7(±122.2)mm3。肿瘤体积的平均变化为402.1％(±177.7)。2000IU/kg的显示42％肿瘤生长抑制。
用500IU/kg治疗的肿瘤的平均肿瘤体积在第32天为471.1(+60.0)mm3。肿瘤体积的平均变化为421.3％(±102.2)，且从初始肿瘤的变化为521.3％(±102.2)。肿瘤生长抑制为37.6％。
用100IU/kg治疗的肿瘤的平均肿瘤体积在第32天为497.7(±152.6)mm3。肿瘤体积的平均变化为450.7％(±172.7)，且从初始肿瘤的平均百分比变化为550.7％(±172.7)。肿瘤生长抑制为34.1％。
用2000IU/kg天然ADA治疗的肿瘤的平均肿瘤体积在第32天为356.6(213.0)mm3。肿瘤体积的平均变化为340.1％(±210.0)，且从初始肿瘤的平均 百分比变化为440.1％(239.1)。肿瘤生长抑制为52.8％。
用任一剂量水平的Adagen的治疗与对照组相当。然而，各剂量水平的Adagen产生上述的TGI。
的治疗效果以最低剂量100IU/kg达到最大效果。应注意100IU/kg剂量近似于的临床人剂量(用于治疗SCID儿童的剂量)。在该研究中作为阳性对照的显示最有效地减少肿瘤尺寸，且TGI为72％。
总之，用以100，500或2000IU/kg治疗导致肿瘤生长抑制范围为34-42％。
用于本发明方法的其它重组ADA酶如下描述。
实施例3
表达重组人ADA的大肠杆菌表达菌株的构建，在成熟蛋白的74位具有Cys至Ser的变化
分析报道的人腺苷脱氨酶的363氨基酸序列(GenBank NP 000013，在此引入作为参考)的半胱氨酸密码子的存在。成熟(N-末端的Met被切割)多肽中的5个位置编码半胱氨酸(C74，C152，C153，C168，C261)。在表达人ADA的设计的和修饰的基因中，这5个半胱氨酸密码子中仅1个(半胱氨酸74，TGC)改变为丝氨酸密码子(TCC)(其为翻译的蛋白质中的75位)。使用重叠寡核苷酸片段的标准化学合成，将限定的多肽序列(参见SEQ ID NO：3)提供给Blue Heron Corporation(Bothell，Washington，U.S.A.)用于全基因合成新基因，该新基因具有对为大肠杆菌中表达而优化的密码子。简言之，按照用于大肠杆菌K12的标准细菌密码子优化该序列用于细菌表达，使用描述于以下的密码子数据：Grantham R.等人；1981，″Codon catalogue usage in genomestrategy modulated for gene expressivity，″Nucleic Acid Res.9：r43-r47，和Lathe，R.1985，″Synthetic oligonucleotide probesdeduced from amino acid sequencedata，Theoretical and practicalconsiderations.″J.Mol Biol；183：1-12。
然后分析相应的RNA序列的发夹结构的形成或环形成(loop formation)并进行最小自由能计算。侧翼限制位点NdeI和BamHI包含在基因的末端。在用限制酶NdeI和BamHI消化该合成DNA后，将1.1千碱基基因通过T4DNA连接酶连接至质粒载体pET-28a(NovagenCorporation)，该质粒载体 pET-28a也已用这两种酶消化。通过电穿孔使用BTX ElectroCell Manipulator600根据制造商的说明将重组质粒引入大肠杆菌菌株BLR(DE3)或HMS174(DE3)。将转化混合物铺板于含卡那霉素(15μg/ml)的LB琼脂平板上，以允许选择含质粒pET-28a/ADAcysSer的菌落(命名为ADAc75s/pET28a：BLR(DE3)或ADAc75s/pET28a：HMS 174(DE3))。该ADA变体基因核苷酸序列通过ABI Prism 310Genetic Analyzer使用BigDyeTerminators通过DNA序列分析证实。该编码Ser74-rhADA可读框的DNA序列根据SEQ IDNO：4。
分离的菌落进一步通过铺板纯化并分析在LB培养基中IPTG可诱导的基因表达，其通过标准方法如描述于Novagen pET System Manual NinthEdition的方法进行，在此引入作为参考。
检测了几个诱导参数，包括时间、温度和诱导剂浓度。优选条件是在25℃用50μMIPTG诱导12小时，其使得以总细胞蛋白质的约20％在宿主细菌的细胞质内高水平产生ADA。表达的ADA蛋白在SDS PAGE分析中证实，显示正确分子量为约40kDa(数据未显示)。
实施例4
表达重组牛ADA的大肠杆菌表达菌株的构建，在成熟蛋白的74位具有Cys至Ser的变化
源自牛肠制备物的纯化的成熟ADA蛋白为从cDNA序列预测缺失N-末端蛋氨酸且还缺失最后6个C-末端残基的356氨基酸蛋白质(GenBankNP 776312，在此引入作为参考)。分析牛ADA氨基酸序列的半胱氨酸密码子的存在。成熟多肽中的5个位置编码半胱氨酸(C74，C152，C153，C168，C261)。在设计的和修饰的牛ADA合成基因中，这5个半胱氨酸位置中仅1个(半胱氨酸74)改变为丝氨酸残基。这通过插入丝氨酸密码子(TCC)代替在成熟多肽的74位(或翻译产物的75位)的正常半胱氨酸密码子而进行。该基因还是为在大肠杆菌中表达而优化的密码子。
简言之，将限定的多肽序列(参见SEQ ID NO：1)提供给BioCatalytics Inc.用于全基因合成新基因，该新基因具有为在大肠杆菌中表达而优化的密码子，使用包括化学合成重叠寡核苷酸片段的方法。该BioCatalytics方法由美国专利号6,366,860更详细的描述，其内容以其整体在此引入作为参考。
在几种表达体系中研究牛ADA表达。例如，侧翼限制位点NdeI和BamHI包含在基因的末端。在用限制酶NdeI和BamHI消化该合成DNA后，该1.1千碱基基因通过T4DNA连接酶连接入质粒载体pET-9d(NovagenCorporation)，该质粒载体pET-9d也已用这两种酶消化。通过电穿孔使用BTXElectro Cell Manipulator 600根据制造商的说明将重组质粒引入大肠杆菌菌株BLR(DE3)或HMS174(DE3)。将转化混合物铺板于含卡那霉素(15μg/ml)的LB琼脂平板上，以允许选择含质粒pET-9d/bADA的菌落(命名为bADA/pET9d：BLR(DE3)或bADA/pET9d：HMS 174(DE3))。该ADA变体基因核苷酸序列通过ABI Prism 310 Genetic Analyzer使用Big Dye Terminators通过DNA序列分析证实。该DNA的可读框由SEQ ID NO：2所示。
分离的菌落通过铺板进一步纯化并用于分析在LB培养基中IPTG可诱导的基因表达，其通过标准方法如描述于Novagen pET System Manual NinthEdition的方法进行。检测了几个诱导参数，包括时间、温度和诱导剂浓度。优选条件是在37℃用0.3％乳糖诱导12小时，其使得以总细胞蛋白质的约20％在宿主细菌的细胞质内高水平产生ADA。ADA产物在SDS PAGE分析中证实，显示正确分子量为约40kDa。
实施例5
重组人突变蛋白ADA蛋白的纯化
rhADA的纯化以Enzon开发的3色谱规程进行。进行大肠杆菌的细菌发酵，所述大肠杆菌由宿主细胞HMS174(DE3)中质粒pET28a(Novagen)上的合成基因表达rhADA蛋白。将利福平(200μg/ml)和卡那霉素(30μg/ml)包括在补充有酵母提取物(30g/l)的基本甘油培养基中，且当添加诱导剂IPTG至5mM最终浓度时细胞在28℃生长至OD600为11。40小时后(OD600～110)，通过离心收获细胞并在-20℃冷冻。简言之，将解冻的细胞浆(50g)重悬浮于1800ml的10mM Tris，1mM DTT，pH 8.0的缓冲液中，并用TempestVirtis(SentryTM，Microprocessor，Boston，MA)以1200RPM匀浆10秒。将该悬浮液通过不锈钢筛网(开孔微米数(Opening micrometer)250μ，No.60，W.STyler)以去除大颗粒。将均匀的细胞悬浮液在15,000psi微流化3个循环(设备用冰浴冷却)(Micro Fluidizer，Microfluidics Corp.，Model#110Y，Boston，MA)。在微流化结束时，将200ml上述相同的缓冲液用于冲洗该设备，且将 该溶液与上述悬浮液合并。源自细胞裂解物的可溶蛋白质通过以16,000rpm在4℃离心40分钟而提取(RC 5C plus，转子SLA-1000)。小心收集上清液以避免不希望的混合。将pH调节至8.0，且添加1mM MgCl2和20mg/mL DNase并在室温培养2小时。然后将pH用1NHCl调节至6.5。如上进行第二次离心，收集上清液，且调节至2mM EDTA，然后在Nalgene(90mm过滤装置)上过滤。过滤的上清液的体积为500ml，通过BCA方法测定的总蛋白质浓度为8.5mg/ml。
将细胞提取物(100ml)调节至pH 7.2、4.5mS/cm，并以20mM Bis-Tris，20mM NaCl，pH 6.5加载至DEAE ff上，并用20mM Bis-Tris，500mM NaCl，pH 6.5洗脱。峰级分用酶测试和SDS-PAGE鉴定且调节至20mMNaHPO4中的1.5M硫酸铵，pH 6.5中，并装载在HiTrap Phenyl ff柱上。蛋白质用负载缓冲液和20mM NaHPO4，pH 6.5梯度洗脱。将峰级分(55ml；0.4mg/ml)相对20mM NaHPO4，1mM EDTA，1mM DTT，pH 6.5渗滤，并装载在HiTrap SP-Sepharose ff上并用20mM NaHPO4，500mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT，pH 6.5洗脱。收集的级分包含纯化的ADA蛋白(77ml；0.1mg/ml)。
实施例6
纯化重组牛ADA蛋白
实施例4的克隆所表达的rbADA的纯化以Enzon开发的3色谱规程进行。简言之，将储存于-80℃的200g解冻的细胞浆(分别获自Blue Hereon或Biocatalytics)重悬于1800ml的20mM Bis-Tris，1mM EDTA，pH 7.4缓冲液，且用Tempest Virtis(SentryTM，Microprocessor，Boston，MA)以1200RPM匀浆5分钟。将该悬浮液通过不锈钢筛网(开孔微米数250μ，No.60，W.S Tyler)以去除大颗粒。将均匀的细胞悬浮液在15,000psi微流化3个循环(设备用冰浴冷却)(Micro Fluidizer，Microfluidics Corp.，型号#110Y，Boston，MA)。在微流化结束时，将200ml与上述相同的缓冲液用于冲洗该设备，且将该溶液与上述悬浮液合并。源自细胞裂解物的可溶蛋白质通过在7100rpm(12000×g)在4℃离心60分钟而提取(Avanti J-201，Beckman Coulter；Rotor#JLA8.1000)。小心收集上清液以避免不希望的混合。
为去除该细胞提取物中的核苷酸，将聚乙烯亚胺(PEI)添加至上述上清液中(最终0.15％，wt/v)并通过搅拌充分混合10分钟。然后将该细胞提取物 在4℃静置过夜。该过夜样品中的沉淀物通过以7100rpm(12000xg)在4℃离心60分钟而去除(Avanti J-201，Beckman Coulter；Rotor# JLA8.1000)。类似的，小心收集上清液以避免任何不希望的混合。为帮助ADA结合至第一柱，将10％PEG4600缓慢添加至该细胞提取物中且将该细胞提取物的pH用1N NaOH和1N HC1缓慢调节至6.5。在装载至下一柱前，将该上清液以7100rpm(12000x g)在4℃再离心60分钟(AvantiJ-201，Beckman Coulter；Rotor#JLA8.1000)。
将细胞提取物加载至以20mM Bis-Tris，1mM EDTA，pH 6.5的缓冲液预平衡的Capto Q柱上(Cat# 17-5316-01，GE Healthcare，Piscataway，NJ.柱床体积350ml预装在XK-50柱中)。在以平衡缓冲液中的80mM NaCl将ADA从柱洗脱前，首先进行60mM和70mM NaCl的洗脱以去除杂质。通过ADA活性、SDS-PAGE分析、蛋白质印迹和RP-HPLC分析洗脱状况。
经过Capto Q柱后，使用两个疏水作用色谱纯化，一个接一个，以进一步提高蛋白质的纯度。第一个HIC为辛基琼脂糖4FF(Cat#17-0946-02，GEHealthcare，Piscataway，NJ)。将源自Capto Q柱的ADA级分的汇集物(pool)用硫酸铵粉末直接调节至1.5M(NH4)2SO4并将pH调节至6.5。将过滤的样品(Nalgene Nunc，CAT#540887，MEMB 0.2PES，Rochester，NY)加载至第一HIC柱上，该柱用1.5M(NH4)2SO4，20mM磷酸钾，1mM EDTA，pH 6.5预平衡(柱床体积150ml，于XK-50中，GE Healthcare，Piscataway，NJ)。该ADA蛋白用硫酸铵梯度洗脱且该洗脱的纯度状况通过SDS-PAGE和RP-HPLC测定。汇集第一HIC柱的级分中的ADA蛋白且调节至1M(NH4)2SO4并直接加载至第二HIC柱(柱床体积150ml，XK-50，HIC Phenyl HP，Cat#17-1082-01，Piscataway，NJ)，该柱用1M(NH4)2SO4，20mM KH2PO4-K2HPO4，1mM EDTA，pH 6.5预平衡。ADA用20mM KH2PO4-K2HPO4，1mM EDTA，pH 6.5中的1M至300mM硫酸铵梯度洗脱。这些级分的ADA纯度通过SDS-PAGE和RP-HPLC分析。纯化的rbADA或rhADA进一步在LabScaleTMTFF系统(Membrane BioMax 5，Bedford，MA)中相对储存缓冲液(例如，100mM磷酸钠，1mM EDTA，pH6.5)脱盐和浓缩。
实施例7
通过尿烷连接的PEG化的Ser74-rbADA的制备
在轻微搅拌下将SC-PEG(N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯-活化的聚乙二醇，0.084mmol)添加至Ser74-rbADA(0.00027mmol)在3mL磷酸钠缓冲液(0.1M，pH 7.8)中的溶液中。该溶液在30℃搅拌30分钟。使用GPC柱(ZorbaxGF-450)监测PEG缀合。在反应结束时(通过天然酶的缺失证实)，该混合物用12mL配制缓冲液(0.05M磷酸钠，0.85％氯化钠，pH 7.3)稀释并用Centriprep浓缩器(Amicon)渗滤以去除未反应的PEG。渗滤按需要在4℃继续直到通过混合等量的滤液和0.1％PMA(0.1M HCl中的聚甲基丙烯酸)不再检测到更多的游离PEG。
实施例8
通过尿烷连接的PEG化的Ser74-rhADA的制备
使用与实施例7相同的条件将SC-PEG(0.084mmol)与Ser74-rhADA(0.00027mmol)反应。
实施例9
通过酰胺连接的PEG化的Ser74-rbADA的制备
在轻微搅拌下将SS-PEG(N-羟基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯-活化的聚乙二醇，0.084mmol)添加至Ser74-rbADA(0.00027mmol)在3mL磷酸钠缓冲液(0.1M，pH 7.8)中的溶液中。该溶液在30℃搅拌30分钟。使用GPC柱(Zorbax GF-450)监测PEG缀合。在反应结束时(通过天然酶的缺失证实)，该混合物用12mL配制缓冲液(0.05M磷酸钠，0.85％氯化钠，pH 7.3)稀释并用Centriprep浓缩器(Amicon)渗滤以去除未反应的PEG。渗滤按需要在4℃继续直到通过混合等量的滤液和0.1％PMA(0.1M HCl中的聚甲基丙烯酸)不再检测到更多的游离PEG。
实施例10
通过酰胺连接的PEG化的突变蛋白rhADA的制备
使用与实施例9所述相同的条件将SS-PEG(0.084mmol)与突变蛋白rhADA(0.00027mmol)反应。
<110>安佐制药股份有限公司(ENZON PHARMACEUTICALS，INC.)
<120>酶的抗癌治疗
<130>213.1261-PCT
<140>未给出(Not yet assigned)
<141>同一日(On even date herewith)
<150>PCT/US08/60733
<151>2008-04-18
<150>US 60/913,039
<151>2007-04-20
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>356
<212>PRT
<213>牛(Bovine)
<220>
<221>misc_feature
<222>(74)..(74)
<223>Cys至Ser突变蛋白
<400>1
Ala Gln Thr Pro Ala Phe Asn Lys Pro Lys Val Glu Leu His Val His
1 5 10 15
Leu Asp Gly Ala Ile Lys Pro Glu Thr Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Lys
20 25 30
Arg Gly Ile Ala Leu Pro Ala Asp Thr Pro Glu Glu Leu Gln Asn Ile
35 40 45
Ile Gly Met Asp Lys Pro Leu Ser Leu Pro Glu Phe Leu Ala Lys Phe
50 55 60
Asp Tyr Tyr Met Pro Ala Ile Ala Gly Ser Arg Glu Ala Val Lys Arg
65 70 75 80
Ile Ala Tyr Glu Phe Val Glu Met Lys Ala Lys Asp Gly Val Val Tyr
85 90 95
Val Glu Val Arg Tyr Ser Pro His Leu Leu Ala Asn Ser Lys Val Glu
100 105 110
Pro Ile Pro Trp Asn Gln Ala Glu Gly Asp Leu Thr Pro Asp Glu Val
115 120 125
Val Ser Leu Val Asn Gln Gly Leu Gln Glu Gly Glu Arg Asp Phe Gly
130 135 140
Val Lys Val Arg Ser Ile Leu Cys Cys Met Arg His Gln Pro Ser Trp
145 150 155 160
Ser Ser Glu Val Val Glu Leu Cys Lys Lys Tyr Arg Glu Gln Thr Val
165 170 175
Val Ala Ile Asp Leu Ala Gly Asp Glu Thr Ile Glu Gly Ser Ser Leu
180 185 190
Phe Pro Gly His Val Lys Ala Tyr Ala Glu Ala Val Lys Ser Gly Val
195 200 205
His Arg Thr Val His Ala Gly Glu Val Gly Ser Ala Asn Val Val Lys
210 215 220
Glu Ala Val Asp Thr Leu Lys Thr Glu Arg Leu Gly His Gly Tyr His
225 230 235 240
Thr Leu Glu Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Gln Glu Asn Met
245 250 255
His Phe Glu Val Cys Pro Trp Ser Ser Tyr Leu Thr Gly Ala Trp Lys
260 265 270
Pro Asp Thr Glu His Pro Val Val Arg Phe Lys Asn Asp Gln Val Asn
275 280 285
Tyr Ser Leu Asn Thr Asp Asp Pro Leu Ile Phe Lys Ser Thr Leu Asp
290 295 300
Thr Asp Tyr Gln Met Thr Lys Asn Glu Met Gly Phe Thr Glu Glu Glu
305 310 315 320
Phe Lys Arg Leu Asn Ile Asn Ala Ala Lys Ser Ser Phe Leu Pro Glu
325 330 335
Asp Glu Lys Lys Glu Leu Leu Asp Leu Leu Tyr Lys Ala Tyr Gly Met
340 345 350
Pro Ser Pro Ala
355
<210>2
<211>1074
<212>DNA
<213>牛
<400>2
atggctcaga ccccggcttt caacaaaccg aaggtagaac tgcacgtaca cctggatggt 60
gctatcaaac cggagactat cctgtactat ggtcgtaagc gtggcatcgc tctgccggct 120
gacactccgg aagaactgca gaacatcatc ggcatggaca aaccgctgtc tctgccggaa 180
ttcctggcta aattcgacta ctacatgccg gctatcgctg gttctcgtga agcagtcaaa 240
cgtatcgctt acgaattcgt agaaatgaaa gctaaagatg gtgtagtata cgttgaagtt 300
cgttactctc cgcacctgct ggcaaactct aaagttgaac cgatcccgtg gaaccaggca 360
gaaggcgatc tgactccgga tgaagtagtt tctctggtta accagggtct gcaggagggt 420
gaacgcgatt tcggcgtaaa agttcgttct atcctgtgct gcatgcgcca ccagccgtct 480
tggtcttctg aagttgttga actgtgcaag aaataccgtg agcagaccgt agttgctatc 540
gatctggcag gtgatgaaac catcgaaggt tcttctctgt ttccgggtca cgtaaaggct 600
tatgctgaag ctgttaaatc tggcgtacac cgtactgtac acgcaggtga agttggttct 660
gctaacgttg ttaaagaagc tgttgacacc ctgaaaactg aacgcctggg tcacggctac 720
cacaccctgg aagacaccac cctgtacaac cgtctgcgtc aggaaaacat gcacttcgaa 780
gtttgtccgt ggtcctctta cctgactggt gcttggaaac cggacaccga acacccggtt 840
gttcgtttca aaaacgacca ggtaaactac tctctgaaca ctgacgatcc gctgatcttc 900
aaatctaccc tggacaccga ctaccagatg accaaaaacg aaatgggttt cactgaagaa 960
gaattcaaac gtctgaacat caacgctgct aagtcctctt ttctgccgga agatgagaaa 1020
aaagaactgc tggacctgct gtacaaggca tacggtatgc cgtctccggc ttaa 1074
<210>3
<211>362
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<222>(74)..(74)
<223>Cys至Ser突变蛋白
<400>3
Ala Gln Thr Pro Ala Phe Asp Lys Pro Lys Val Glu Leu His Val His
1 5 10 15
Leu Asp Gly Ser Ile Lys Pro Glu Thr Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Arg
20 25 30
Arg Gly Ile Ala Leu Pro Ala Asn Thr Ala Glu Gly Leu Leu Asn Val
35 40 45
Ile Gly Met Asp Lys Pro Leu Thr Leu Pro Asp Phe Leu Ala Lys Phe
50 55 60
Asp Tyr Tyr Met Pro Ala Ile Ala Gly Ser Arg Glu Ala Ile Lys Arg
65 70 75 80
Ile Ala Tyr Glu Phe Val Glu Met Lys Ala Lys Glu Gly Val Val Tyr
85 90 95
Val Glu Val Arg Tyr Ser Pro His Leu Leu Ala Asn Ser Lys Val Glu
100 105 110
Pro Ile Pro Trp Asn Gln Ala Glu Gly Asp Leu Thr Pro Asp Glu Val
115 120 125
Val Ala Leu Val Gly Gln Gly Leu Gln Glu Gly Glu Arg Asp Phe Gly
130 135 140
Val Lys Ala Arg Ser Ile Leu Cys Cys Met Arg His Gln Pro Asn Trp
145 150 155 160
Ser Pro Lys Val Val Glu Leu Cys Lys Lys Tyr Gln Gln Gln Thr Val
165 170 175
Val Ala Ile Asp Leu Ala Gly Asp Glu Thr Ile Pro Gly Ser Ser Leu
180 185 190
Leu Pro Gly His Val Gln Ala Tyr Gln Glu Ala Val Lys Ser Gly Ile
195 200 205
His Arg Thr Val His Ala Gly Glu Val Gly Ser Ala Glu Val Val Lys
210 215 220
Glu Ala Val Asp Ile Leu Lys Thr Glu Arg Leu Gly His Gly Tyr His
225 230 235 240
Thr Leu Glu Asp Gln Ala Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Gln Glu Asn Met
245 250 255
His Phe Glu Ile Cys Pro Trp Ser Ser Tyr Leu Thr Gly Ala Trp Lys
260 265 270
Pro Asp Thr Glu His Ala Val Ile Arg Leu Lys Asn Asp Gln Ala Asn
275 280 285
Tyr Ser Leu Asn Thr Asp Asp Pro Leu Ile Phe Lys Ser Thr Leu Asp
290 295 300
Thr Asp Tyr Gln Met Thr Lys Arg Asp Met Gly Phe Thr Glu Glu Glu
305 310 315 320
Phe Lys Arg Leu Asn Ile Asn Ala Ala Lys Ser Ser Phe Leu Pro Glu
325 330 335
Asp Glu Lys Arg Glu Leu Leu Asp Leu Leu Tyr Lys Ala Tyr Gly Met
340 345 350
Pro Pro Ser Ala Ser Ala Gly Gln Asn Leu
355 360
<210>4
<211>1089
<212>DNA
<213>人
<400>4
atggctcaga cacccgcatt tgataaaccg aaagtggaac tgcatgtcca cctggatggt 60
agcatcaaac cggaaactat cttatattac ggtcggcgtc gtggtattgc gttgccggca 120
aacacggctg aaggtttgct gaacgtgatc ggcatggaca aaccgctgac cttgccggat 180
tttttggcga aatttgatta ttatatgccg gcgattgctg gttcccgcga ggcaatcaaa 240
cgcatcgcgt atgagtttgt tgaaatgaaa gcgaaagaag gcgttgtgta tgttgaggtc 300
cgttacagtc cgcatctgct ggctaacagc aaggtagaac ctatcccctg gaaccaagct 360
gaaggcgatc tgacgccgga tgaagtggtt gctctggtgg gtcagggttt acaggagggg 420
gagcgcgatt ttggcgttaa agctcgctct attttatgtt gcatgcgcca tcagcccaat 480
tggtccccga aagtggttga actttgtaaa aagtaccaac aacagaccgt tgtcgcgatt 540
gatttggcag gcgatgaaac aattccaggc agctccctgt tgccagggca cgtgcaagcg 600
taccaagaag cagtgaaaag cggcatccac cggactgtcc acgccggcga ggtcggtagc 660
gccgaggttg tgaaagaagc cgtggacatc ctgaaaaccg agcggctggg ccatgggtac 720
cacacactgg aggatcaggc attatataac cgcttacgcc aggaaaatat gcatttcgaa 780
atttgtccgt ggagtagtta cttaactggc gcgtggaaac cggataccga acatgcggtt 840
atccgcttaa agaatgatca agcaaattac agtctgaata cagatgatcc cctgattttc 900
aagtctaccc tggacacaga ttatcagatg acgaagcggg atatgggatt tacggaagaa 960
gaatttaagc gtctcaatat caatgcggcg aaatcttcat ttctgccgga agatgagaaa 1020
cgtgagttgc tggatcttct gtacaaggcc tacggtatgc cgccgagcgc atcggccggg 1080
cagaacctg 1089
<210>5
<211>356
<212>PRT
<213>牛
<400>5
Ala Gln Thr Pro Ala Phe Asn Lys Pro Lys Val Glu Leu His Val His
1 5 10 15
Leu Asp Gly Ala Ile Lys Pro Glu Thr Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Lys
20 25 30
Arg Gly Ile Ala Leu Pro Ala Asp Thr Pro Glu Glu Leu Gln Asn Ile
35 40 45
Ile Gly Met Asp Lys Pro Leu Ser Leu Pro Glu Phe Leu Ala Lys Phe
50 55 60
Asp Tyr Tyr Met Pro Ala Ile Ala Gly Cys Arg Glu Ala Val Lys Arg
65 70 75 80
Ile Ala Tyr Glu Phe Val Glu Met Lys Ala Lys Asp Gly Val Val Tyr
85 90 95
Val Glu Val Arg Tyr Ser Pro His Leu Leu Ala Asn Ser Lys Val Glu
100 105 110
Pro Ile Pro Trp Asn Gln Ala Glu Gly Asp Leu Thr Pro Asp Glu Val
115 120 125
Val Ser Leu Val Asn Gln Gly Leu Gln Glu Gly Glu Arg Asp Phe Gly
130 135 140
Val Lys Val Arg Ser Ile Leu Cys Cys Met Arg His Gln Pro Ser Trp
145 150 155 160
Ser Ser Glu Val Val Glu Leu Cys Lys Lys Tyr Arg Glu Gln Thr Val
165 170 175
Val Ala Ile Asp Leu Ala Gly Asp Glu Thr Ile Glu Gly Ser Ser Leu
180 185 190
Phe Pro Gly His Val Lys Ala Tyr Ala Glu Ala Val Lys Ser Gly Val
195 200 205
His Arg Thr Val His Ala Gly Glu Val Gly Ser Ala Asn Val Val Lys
210 215 220
Glu Ala Val Asp Thr Leu Lys Thr Glu Arg Leu Gly His Gly Tyr His
225 230 235 240
Thr Leu Glu Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Gln Glu Asn Met
245 250 255
His Phe Glu Val Cys Pro Trp Ser Ser Tyr Leu Thr Gly Ala Trp Lys
260 265 270
Pro Asp Thr Glu His Pro Val Val Arg Phe Lys Asn Asp Gln Val Asn
275 280 285
Tyr Ser Leu Asn Thr Asp Asp Pro Leu Ile Phe Lys Ser Thr Leu Asp
290 295 300
Thr Asp Tyr Gln Met Thr Lys Asn Glu Met Gly Phe Thr Glu Glu Glu
305 310 315 320
Phe Lys Arg Leu Asn Ile Asn Ala Ala Lys Ser Ser Phe Leu Pro Glu
325 330 335
Asp Glu Lys Lys Glu Leu Leu Asp Leu Leu Tyr Lys Ala Tyr Gly Met
340 345 350
Pro Ser Pro Ala
355

Claims (18)

1.腺苷脱氨酶与聚乙二醇的缀合物在制备用于治疗具有前列腺或卵巢的肿瘤或癌症的患者的药物中的用途，其中所述腺苷脱氨酶为从牛来源纯化的腺苷脱氨酶；或为根据SEQID NO:5或SEQ ID NO:1的重组牛腺苷脱氨酶；或为根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的重组牛腺苷脱氨酶，且具有选自以下的氨基酸取代：Gln代替Lys198；Ala代替Thr245；Arg代替Gly351,及其组合；
且其中所述聚乙二醇的大小范围为4,000至45,000道尔顿。
2.权利要求1的用途,其中所述肿瘤是恶性的。
3.权利要求1的用途,其中给药的缀合的腺苷脱氨酶的量有效地实质性减少腺苷或脱氧腺苷在所述患者中的组织水平,且其中肿瘤的生长或扩散被所述患者中减少的腺苷组织水平所抑制。
4.权利要求1的用途,其中所述肿瘤是实体瘤。
5.权利要求1的用途，其中所述肿瘤为前列腺肿瘤。
6.权利要求1的用途，其中所述肿瘤为卵巢癌。
7.权利要求1的用途，其中所述缀合物的给药剂量范围为每kg10U至30U。
8.权利要求1的用途,其中给药所述缀合物足够的时间以抑制肿瘤。
9.权利要求1的用途,其中所述缀合物的给药时间为1至20天。
10.权利要求1的用途,其中相对于每个聚乙二醇所述缀合物包含2个或更多个腺苷脱氨酶分子。
11.权利要求1的用途,其中所述缀合物包含附接至腺苷脱氨酶的一个或多个Lys残基的ε氨基的11个至18个聚乙二醇链。
12.权利要求11的用途,其中所述腺苷脱氨酶通过尿烷连接缀合至聚乙二醇。
13.权利要求1的用途,其中所述缀合物通过选自以下的途径给药：皮下、静脉内、肌内、鞘内、腹腔内、吸入和经尿道。
14.腺苷脱氨酶与聚乙二醇的缀合物在制备用于抑制哺乳动物前列腺或卵巢的肿瘤或癌症生长的药物中的用途，其中所述腺苷脱氨酶为从牛来源纯化的腺苷脱氨酶；或为根据SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:1的重组牛腺苷脱氨酶；或为根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的重组牛腺苷脱氨酶，且具有选自以下的氨基酸取代：Gln代替Lys198；Ala代替Thr245；Arg代替Gly351,及其组合；
且其中所述聚乙二醇的大小范围为4,000至45,000道尔顿。
15.权利要求1的用途，其中聚乙二醇与腺苷脱氨酶的Lys残基的ε氨基共价连接。
16.权利要求15的用途，其中一个或多个聚乙二醇链与腺苷脱氨酶的一个或多个Lys残基的ε氨基共价连接。
17.权利要求15的用途，其中11至18个聚乙二醇链与腺苷脱氨酶的一个或多个Lys残基的ε氨基共价连接。
18.权利要求17的用途，其中每个聚乙二醇链为约5,000道尔顿。
CN200880021105.8A 2007-04-20 2008-04-18 酶的抗癌治疗 Active CN101680039B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US91303907P 2007-04-20 2007-04-20
US60/913,039 2007-04-20
PCT/US2008/060733 WO2008131163A1 (en) 2007-04-20 2008-04-18 Enzymatic anticancer therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101680039A CN101680039A (zh) 2010-03-24
CN101680039B true CN101680039B (zh) 2016-08-24

Family

ID=39875909

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880021105.8A Active CN101680039B (zh) 2007-04-20 2008-04-18 酶的抗癌治疗

Country Status (19)

Country Link
US (1) US8741283B2 (zh)
EP (1) EP2147122B1 (zh)
JP (1) JP5595904B2 (zh)
KR (1) KR101540296B1 (zh)
CN (1) CN101680039B (zh)
BR (1) BRPI0810384B8 (zh)
CA (1) CA2684749C (zh)
CY (1) CY1117000T1 (zh)
DK (1) DK2147122T3 (zh)
ES (1) ES2507508T3 (zh)
HR (1) HRP20140947T1 (zh)
IL (1) IL201593A (zh)
MX (1) MX2009011320A (zh)
NZ (1) NZ580980A (zh)
PL (1) PL2147122T3 (zh)
PT (1) PT2147122E (zh)
SI (1) SI2147122T1 (zh)
TW (1) TWI486169B (zh)
WO (1) WO2008131163A1 (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2287303B1 (en) 2004-11-12 2014-07-02 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
MX2009011319A (es) 2007-04-20 2009-12-11 Enzon Pharmaceuticals Inc Adenosina desaminasa recombinante estable.
CN103476931A (zh) * 2011-02-03 2013-12-25 米尔纳医疗股份有限公司 Mir-34的合成模拟物
KR102122463B1 (ko) 2014-10-14 2020-06-15 할로자임, 아이엔씨 아데노신 디아미네이즈-2(ada2)의 조성물, 이의 변이체 및 이를 사용하는 방법
US10874724B2 (en) * 2015-05-22 2020-12-29 University Of Houston System Enzymatic immunomodulation of solid tumors and uses thereof
WO2017156483A1 (en) * 2016-03-11 2017-09-14 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods and compositions for treating tumors
WO2018191619A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Senti Biosciences, Inc. Combinatorial cancer immunotherapy
CN113164518A (zh) 2018-10-17 2021-07-23 森迪生物科学公司 组合癌症免疫疗法
US11419898B2 (en) 2018-10-17 2022-08-23 Senti Biosciences, Inc. Combinatorial cancer immunotherapy
WO2023086931A2 (en) * 2021-11-12 2023-05-19 Georgia Tech Research Corporation Adenosine deaminase 1 compositions and methods for using same

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002077233A2 (en) * 2000-11-08 2002-10-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 38650, 28472, 5495, 65507, 81588 and 14354 METHODS AND COMPOSITIONS OF HUMAN PROTEINS AND USES THEREOF

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5346823A (en) * 1984-05-29 1994-09-13 Genencor, Inc. Subtilisin modifications to enhance oxidative stability
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5349001A (en) * 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5605976A (en) * 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5756593A (en) * 1995-05-15 1998-05-26 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkyene oxide carboxylic acids
JP4465109B2 (ja) * 1997-12-17 2010-05-19 エンゾン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド アミノ及びヒドロキシル含有生物活性剤のポリマープロドラッグ
US6180095B1 (en) * 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5965119A (en) * 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
US6624142B2 (en) * 1997-12-30 2003-09-23 Enzon, Inc. Trimethyl lock based tetrapartate prodrugs
US6153655A (en) * 1998-04-17 2000-11-28 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
US6251382B1 (en) * 1998-04-17 2001-06-26 Enzon, Inc. Biodegradable high molecular weight polymeric linkers and their conjugates
US6824766B2 (en) * 1998-04-17 2004-11-30 Enzon, Inc. Biodegradable high molecular weight polymeric linkers and their conjugates
US6333396B1 (en) * 1998-10-20 2001-12-25 Enzon, Inc. Method for targeted delivery of nucleic acids
US20020088017A1 (en) * 1999-04-28 2002-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Adenosine deaminase deficient transgenic mice and methods for the use thereof
US6579857B1 (en) * 1999-06-11 2003-06-17 Evanston Northwestern Healthcare Research Institute Combination cancer therapy comprising adenosine and deaminase enzyme inhibitors
AU7868400A (en) 1999-10-08 2001-04-23 Alza Corporation Neutral-cationic lipid for nucleic acid and drug delivery
AU2002365360A1 (en) * 2001-11-28 2003-06-10 Biopolymed Inc. Biologically active non-antigenic copolymer and conjugates thereof and methods for producing the same
ES2528384T3 (es) * 2001-12-12 2015-02-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Healt Métodos de utilización de inhibidores del receptor de adenosina para potenciar la respuesta inmunitaria y la inflamación
US7413738B2 (en) * 2002-08-13 2008-08-19 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable polymeric conjugates based on biodegradable linkers
US7087229B2 (en) * 2003-05-30 2006-08-08 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
US7122189B2 (en) * 2002-08-13 2006-10-17 Enzon, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
US20040175804A1 (en) * 2003-03-04 2004-09-09 Skonezny Paul M. Process for preparing dideoxyinosine using adenosine deaminase enzyme
US7301003B2 (en) * 2005-08-26 2007-11-27 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Method of preparing polymers having terminal amine groups
US7601798B2 (en) * 2005-10-04 2009-10-13 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Methods of preparing polymers having terminal amine groups using protected amine salts
US7989554B2 (en) * 2006-01-10 2011-08-02 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Reacting polyalkylene oxide with base, tertiary alkyl haloacetate, then acid to prepare polyalkylene oxide carboxylic acid
WO2007149686A2 (en) 2006-06-21 2007-12-27 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Stabilized proteins
AU2007296189A1 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polyalkylene oxides having hindered ester-based biodegradable linkers
US20080159964A1 (en) * 2006-12-29 2008-07-03 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Use of adenosine deaminase for treating pulmonary disease
MX2009011319A (es) 2007-04-20 2009-12-11 Enzon Pharmaceuticals Inc Adenosina desaminasa recombinante estable.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002077233A2 (en) * 2000-11-08 2002-10-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 38650, 28472, 5495, 65507, 81588 and 14354 METHODS AND COMPOSITIONS OF HUMAN PROTEINS AND USES THEREOF

Also Published As

Publication number Publication date
ES2507508T3 (es) 2014-10-15
CA2684749A1 (en) 2008-10-30
CY1117000T1 (el) 2017-04-05
IL201593A0 (en) 2010-05-31
RU2009142817A (ru) 2011-05-27
NZ580980A (en) 2012-04-27
BRPI0810384B8 (pt) 2021-05-25
WO2008131163A8 (en) 2010-01-28
CN101680039A (zh) 2010-03-24
US8741283B2 (en) 2014-06-03
EP2147122B1 (en) 2014-07-16
EP2147122A4 (en) 2010-11-17
JP5595904B2 (ja) 2014-09-24
DK2147122T3 (da) 2014-10-13
JP2010524968A (ja) 2010-07-22
KR101540296B1 (ko) 2015-07-31
TW200902051A (en) 2009-01-16
BRPI0810384A2 (pt) 2014-11-04
HRP20140947T1 (hr) 2015-02-13
PL2147122T3 (pl) 2015-05-29
SI2147122T1 (sl) 2015-01-30
US20090047270A1 (en) 2009-02-19
CA2684749C (en) 2016-06-21
MX2009011320A (es) 2009-12-15
WO2008131163A1 (en) 2008-10-30
TWI486169B (zh) 2015-06-01
EP2147122A1 (en) 2010-01-27
IL201593A (en) 2017-07-31
AU2008242791A1 (en) 2008-10-30
KR20090130108A (ko) 2009-12-17
PT2147122E (pt) 2014-10-15
BRPI0810384B1 (pt) 2021-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101680039B (zh) 酶的抗癌治疗
US11780882B2 (en) Peptide compounds and peptide conjugates for the treatment of cancer through receptor-mediated chemotherapy
CN109715805A (zh) 核酸-多肽组合物及其用途
CN103517718A (zh) Il-2部分与聚合物的缀合物
CN106687121A (zh) 改善的聚乙烯亚胺聚乙二醇载体
US11191843B2 (en) Multi-arm targeting anti-cancer conjugate
EP3459546A1 (en) Multi-arm polymeric targeting anti-cancer conjugate
Groer et al. Intratumoral cancer chemotherapy with a carrier-based immunogenic cell-death eliciting platinum (IV) Agent
JP2023537066A (ja) トランス－シクロオクテン生体直交型薬剤並びに癌及び免疫療法における使用
US20220281911A1 (en) Oligonucleotide conjugate compositions and methods of use
CN110156889A (zh) 高亲和力HBs T细胞受体
CN106466484B (zh) 一种具有细胞内吞介导功能的多靶向配体-药物偶联体
CN104119444B (zh) 抗肿瘤融合蛋白及其制备方法和用途
RU2481855C2 (ru) Ферментативная противоопухолевая терапия
AU2008242791B2 (en) Enzymatic anticancer therapy
CN105131101B (zh) 一种人类核糖体蛋白rps6亚基抗癌肽段及其应用
CN102154355A (zh) 一种重组免疫毒素ccl25-pe38基因及制备方法和应用
CN108727582A (zh) 靶向抗癌偶联物
CN108727584A (zh) 抗癌偶联物
CN108472330A (zh) 作为近距离放射治疗剂的放射性标记的去整合素

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1142634

Country of ref document: HK

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: DIFIANTE PHARMACEUTICAL CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: ENZON PHARMACEUTICALS INC.

Effective date: 20110330

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: NEW JERSEY, THE USA TO: FUNCHAL, PORTUGAL

TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20110330

Address after: Portugal Funchal

Applicant after: Deffee Antwerp pharmaceutical Limited by Share Ltd

Address before: new jersey

Applicant before: Enzon Pharmaceuticals Inc.

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: RARE DISEASES SIGMA-TAU PHARMACEUTICALS, INC.

Free format text: FORMER OWNER: DIFIANTE PHARMACEUTICAL CO., LTD.

Effective date: 20120704

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20120704

Address after: Portugal Funchal

Applicant after: Defiante Farmaceutica, S.A.

Address before: Portugal Funchal

Applicant before: Deffee Antwerp pharmaceutical Limited by Share Ltd

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: SIGMA-TAU PHARMA LIMITED

Free format text: FORMER OWNER: RARE DISEASES SIGMA-TAU PHARMACEUTICALS, INC.

Effective date: 20150526

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20150526

Address after: London, England

Applicant after: Sigama tau Pharmaceutical Co., Ltd.

Address before: Portugal Funchal

Applicant before: Defiante Farmaceutica, S.A.

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: SIGMA-TAU RARE DISEASES S. A.

Free format text: FORMER OWNER: SIGMA-TAU PHARMA LIMITED

Effective date: 20150721

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20150721

Address after: London, England

Applicant after: SIGMA-TAU RARE DISEASES S.A.

Address before: London, England

Applicant before: Sigama tau Pharmaceutical Co., Ltd.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: London, England

Patentee after: Leedey Antwerp biological science Limited by Share Ltd

Address before: London, England

Patentee before: SIGMA-TAU RARE DISEASES S.A.

CP01 Change in the name or title of a patent holder
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1142634

Country of ref document: HK

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210607

Address after: Great Britain

Patentee after: Unicris Inc.

Address before: London, England

Patentee before: Leedey Antwerp biological science Limited by Share Ltd.