CN102154355A

CN102154355A - 一种重组免疫毒素ccl25-pe38基因及制备方法和应用

Info

Publication number: CN102154355A
Application number: CN2011100011252A
Authority: CN
Inventors: 张秋萍; 胡义; 张莉
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2011-01-06
Filing date: 2011-01-06
Publication date: 2011-08-17

Abstract

本发明公开了一种重组免疫毒素CCL25-PE38基因及制备方法和应用，其步骤是：A、钓取CCL25的cDNA,通过引物全基因合成CCL25的cDNA；B、钓取PE38的cDNA，运用PCR从pRB391质粒为模板，克隆PE38的cDNA；C、构建Igκ-CCL25-PE38，获得的PCR产物为模板，合成Igκ-CCL25-linker；D、构建pcDNA3.1-CCL25-PE38真核分泌表达载体，分别用核酸内切酶HindⅢ和EcoRⅠ消化PCR扩增产物Igκ-CCL25-PE38和pcDNA3.1载体，构成真核分泌性表达质粒；制备免疫毒素，pcDNA3.1-CCL25-PE38质粒转染293T细胞，采用无血清培养基OPTI-MEM进行培养，纯化，测定蛋白浓度，结果显示：重组免疫毒素CCL25-PE38，重组免疫毒素的质粒在制备治疗或预防急性T淋巴细胞白血病药物中的应用。制备简单，容易纯化。重组免疫毒素CCL25-PE38具有特异性杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长效果明显，毒副作用小，有很好的应用前景。

Description

一种重组免疫毒素CCL25-PE38基因及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种抗CCR9⁺白血病的重组免疫毒素CCL25-PE3基因，同时还涉及一种抗CCR9⁺白血病的重组免疫毒素CCL25-PE38的制备方法，还涉及重组免疫毒素CCL25-PE38基因的用途。

背景技术

研究发现CCR9在急性T淋巴细胞性白血病(T-ALL)患者的CD4⁺T淋巴细胞上异常高表达，CCR9的配体CCL25在淋巴结和皮肤中表达水平显著增高。在CCR9发生内置的情况下，白血病细胞的趋化和粘附作用减弱，说明CCR9与白血病细胞的迁移运动密切相关。CCR9的天然配体CCL25可以诱导T-ALLCD4⁺T细胞依赖Livin的方式抵抗TNF-α诱导的凋亡，说明CCL25/CCR9对T-ALL的存活有着十分重要的促进作用。

另有报道，在儿童ALL复发患者中，白血病细胞高表达CCR9和CD103，并且浸润到患者肠内的白血病细胞仍然高表达CCR9，同时高表达CCL25。说明CCL25/CCR9与儿童ALL病复发及白血病细胞转移至特定部位密切相关。成人淋巴细胞白血病(ALT)是一类具有高度侵袭性的CD4⁺成熟淋巴细胞恶性肿瘤，表达HTLV-1编码的转录因子Tax的白血病细胞可表达CCR9，体外培养ALT细胞1天后，可检测到CCR9在大多数白血病细胞上表达，使用免疫组织化学检测到侵入胃肠道的CD4⁺T细胞普遍表达CCR9，表明白血病细胞浸润到患者肠内与CCR9的表达密切相关。以上研究提示趋化因子及其受体在不同的白血病及其亚型表达谱不同，极有可能成为白血病靶向治疗的潜在位点。

免疫毒素的毒蛋白分为两类：一类是植物毒素如蓖麻毒素、美洲商陆抗病毒蛋白等，另一类是细菌毒素如绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin，PE)、白喉毒素等。PE38是PE的衍生物，其结合细胞表面受体的结构域被去除，保留了羧基端的ADP核糖基化酶功能结构域，通过导向分子进入细胞后最终在细胞质中与肽链合成中的延长因子EF-2结合，使EF-2糖基化失活，蛋白合成被阻断，从而导致细胞凋亡。

目前还没有使用毒素蛋白PE38靶向CCR9受体这一靶点的重组免疫毒素肿瘤治疗技术方案报道。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种重组免疫毒素CCL25-PE38基因。该基因具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。该序列SEQ ID NO.3是首次克隆，根据该序列可以设计引物，通过PCR的方法扩增获得该基因序列。

本发明的另一个目的是提供了一种抗CCR9⁺白血病的重组免疫毒素CCL25-PE38基因制备方法。该方法是构建真核分泌表达载体，转染真核细胞表达该重组免疫毒素，利用亲和层析方法纯化重组免疫毒素CCL25-PE38。该方法简便，表达的重组免疫毒素活性高。

本发明的再一个目的是提供了一种重组免疫毒素CCL25-PE38基因在制备治疗或预防急性T淋巴细胞白血病药物中的应用。该免疫毒素能特异性结合并杀伤CCR9⁺急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)MOLT4细胞，延缓MOLT4细胞异种移植肿瘤的生长，实现了有效治疗特定类型白血病的目的。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

术语“CCL25-PE38”包括完整的CCL25、PE38、His标签及CCL25与PE38之间的连接序列(Linker，(SG₄)₄)，如SEQ ID NO.3所示核酸序列，SEQ ID NO.4所示氨基酸序列。

一种抗CCR9⁺白血病的重组免疫毒素CCL25-PE38基因制备方法，其步骤是：

A、钓取CCL25(GenBank：BC144463.1)的cDNA，通过合成多对可互扩的引物(A和B、C和D、E和F、G和H、I和J)，先合成较短的基因片段(AB、CD、EF、GH、IJ)，AB和CD、CD和EF、EF合GH、GH和IJ之间存在着互相重叠的区域。采用SOE-PCR，如分子免疫学实验指南(黎燕等编著，2008，北京，化学工业出版社)所述的方法，构建CCL25的cDNA(图1)。

B、钓取PE38(GenBank：HC051663.1)的cDNA，运用PCR从pRB391质粒(Hu CC，et al.Construction of eukaryotic expression vector of recombinant immunotoxin human VEGF165-PE38 and its expression.Cancer Research and Clinic.2009，21(4)：222-225.)为模板，使用上游引物K，和下游引物L进行PCR，克隆PE38的cDNA(图2)。

C、构建Igк-CCL25-PE38(SEQ ID NO.3)。以CCL25(步骤A获得的PCR产物)为模板，合成Igк-CCL25-linker，以PE38(步骤B获得的PCR产物)为模板，合成Linker-PE38。然后采用SOE-PCR，合成Igк-CCL25-PE38全基因片段(图3)，如分子免疫学实验指南(黎燕等编著，2008，北京，化学工业出版社)所述的方法。

D、构建pcDNA3.1-CCL25-PE38真核分泌表达载体。分别用核酸内切酶Hind III和EcoR I(New England Biolabs公司，美国)消化PCR扩增产物Igк-CCL25-PE38和pcDNA3.1载体(Invitrogen公司，美国)，然后连接构成CCL25-PE38的真核分泌性表达质粒。

E、制备免疫毒素CCL25-PE38。pcDNA3.1-CCL25-PE38质粒转染293T细胞(America Tyte Cultrue Collection，美国)，采用无血清培养基OPTI-MEM(Invitrogen公司，美国)进行培养，72小时后收获细胞培养上清；使用HisTrapFF(Roche公司，美国)进行纯化，使用BCA法(Zhongshu Liang，Kan Yang and Benmei Chen.Cholesterol in U937 foam cells assayed in liquid chromatographic-mass spectrometry.Chin J Mod Med.2004，14(20)：51-56.)进行测定蛋白浓度，结果显示重组免疫毒素CCL25-PE38浓度为2nmol/ml。Western blot鉴定所表达的重组免疫毒素(图5)，如分子免疫学实验指南(黎燕等编著，2008，北京，化学工业出版社)所述的方法。结果显示本发明的重组免疫毒素CCL25-PE38，能被抗PE38的抗体特异性识别，并与预期目的分子量(54.7kDa)条带一致。

本发明的技术方案是：提供一种制备重组免疫毒素的质粒，此质粒具有CCL25cDNA碱基序列(来自GenBank，SEQ ID NO.1)和绿脓杆菌外毒素的活性片段PE38cDNA碱基序列(来自GenBank，SEQ ID NO.2)连接而成。一种分离的蛋白的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO.3所示核苷酸序列。提供一种高度特异性的重组免疫毒素，此种免疫毒素由上述质粒表达、纯化而成，以CCL25为导向分子、以绿脓杆菌外毒素的活性片段PE38为毒素分子，具有特异性结合并杀伤MOLT4细胞(人急性T淋巴细胞白血病细胞，自然高表达CCR9)的特性。CCL25是一种CC型趋化因子，主要表达在胸腺和小肠。其特异性受体CCR9也主要表达在胸腺和小肠的T淋巴细胞上。在T-ALL中，CD4⁺白血病细胞高表达CCR9。CCR9的高表达与CD4⁺白血病细胞的转移和耐药密切相关。因此CCR9为白血病的个体化治疗提供了一个潜在的靶点。本发明选用CCL25为导向分子、以绿脓杆菌外毒素的活性片段PE38为毒素分子，制备CCL25-PE38重组免疫毒素，特异性结合并杀伤CCR9⁺T-ALL MOLT4细胞，实现了有效治疗特定类型白血病的目的。

SEQ ID NO.1为CC型趋化因子CCL25的cDNA序列，该基因序列编码的蛋白主要在T细胞的发生发展中起作用，趋化T淋巴细胞，巨噬细胞和树突状细胞，其特异性受体为CCR9。

一种分离的多肽，其序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。SEQ ID NO.2为绿脓杆菌外毒素的衍生物PE38(分子量为38kD)的编码序列，去除了绿脓杆菌外毒素与细胞受体结合的序列，其编码的蛋白分子可以通过导向分子进入细胞内后最终在细胞质中与肽链合成中的延长因子EF-2结合，使EF-2糖基化失活，蛋白合成被阻断，从而导致细胞凋亡。

一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.3所示核苷酸序列。SEQ ID NO.3为基因重组构建的一种新型重组免疫毒素Igк-CCL25-PE38序列；SEQ ID NO.4为SEQ ID NO.3所示序列编码的重组免疫毒素CCL25-PE38的蛋白质序列，根据在线翻译工具http://expasy.org/tools/dna.html获得。一种分离的多肽，其序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。该重组免疫毒素CCL25-PE38通过结合CCR9的特异性和PE38介导的细胞毒作用，从而对CD4⁺急性T淋巴细胞白血病细胞起到特异的杀伤作用。

综上所述，如图1显示的琼脂糖凝胶电泳结果，本发明提供的PCR产物与CCL25预期的核酸片段(SEQ ID NO.1)大小一致。如图2显示的琼脂糖凝胶电泳结果，本发明提供的PCR产物与PE38预期的核酸片段(SEQ ID NO.2)大小一致。如图3显示的琼脂糖凝胶电泳结果，本发明提供的PCR产物与Igк-CCL25-PE38预期的核酸片段(SEQ ID NO.3)大小一致。如图5显示的免疫印迹结果，本发明提供的CCL25-PE38(SEQ ID NO.4)氨基酸序列能被抗PE38的抗体特异性识别，并出现在预期分子量(54.7kDa)条带上。如图6所示流式细胞仪分析结果显示，本发明提供的CCL25-PE38能特异性地识别MOLT4细胞表面表达的CCR9分子。如图7显示的共聚焦显微镜、流式细胞仪分析结果，本发明提供的CCL25-PE38能内化进入MOLT4细胞内并伴随细胞表面CCR9分子表达降低。如图8显示的细胞毒性实验结果，本发明提供的CCL25-PE38能特异性地靶向杀伤MOLT4细胞。如图9、10显示CCL25-PE38能有效缓解MOLT4细胞异种移植肿瘤的生长。

一种构建的重组免疫毒素在制备治疗或预防急性T淋巴细胞白血病药物中的应用，通过细胞活力测定、抑制肿瘤生长实验检测免疫毒素靶向杀伤急性T淋巴细胞白血病MOLT4细胞的活性。其应用过程是：首先根据趋化因子CCL25的cDNA序列全基因合成此序列(SEQ ID NO.1)；然后根据PE38的cDNA序列设计引物，运用PCR技术从pRB391质粒克隆PE38cDNA序列(SEQ IDNO.2)；接下来根据上述两步获得的序列，运用重叠PCR技术将其进行融合，构建成编码重组免疫毒素CCL25-PE38的Igк-CCL25-PE38cDNA序列(SEQ IDNO.3)；最后通过蛋白质数据库ExPASy在线翻译工具(http://expasy.org/tools/dna.html)，根据SEQ ID NO.3得到重组免疫毒素CCL25-PE38的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)。

构建的Igк-CCL25-PE38基因，可在真核细胞的得到表达，并可分泌至细胞培养上清中。能够特异性结合表达CCR9的急性T淋巴白血病细胞并通过PE38的细胞毒作用对其起到特异的杀伤作用。

根据本发明的优选实施方案，最好使用可在适当的培养条件下高效表达外源基因的293T细胞作为制备本免疫毒素的宿主细胞。

因此，为了制备本发明的抗人CCR9⁺T-ALL的免疫毒素CCL25-PE38，首先构建分泌表达载体pcDNA3.1-CCL25-PE38。然后将其转染至293T细胞中，使之瞬时高表达并分泌至细胞培养液中，从而可更有效地进行分离。另外，由于293T细胞是表达SV40大T抗原的永生性细胞，可大大提高外源蛋白的表达。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明创造性的将趋化因子CCL25和PE38融合表达，构建一种新型的重组免疫毒素，并利用真核分泌表达载体表达此重组免疫毒素CCL25-PE38，具有制备简单，容易纯化的特点。利用CCL25结合CCR9的特异性和PE38细胞毒作用对肿瘤细胞起到特异的杀伤作用。0.5nmol/ml重组免疫毒素CCL25-PE38在作用于MOLT4细胞48小时后，可导致种植在RMPI1640(Hyclone公司，美国)细胞培养液中一半的细胞死亡。在连续给予12次重组免疫毒素CCL25-PE38(每只小鼠每天给予0.5nmol)治疗SCID小鼠MOLT4细胞异种移植肿瘤，MOLT4细胞异种移植肿瘤的生长减缓，肿瘤重量明显小于PBS处理组。所以，重组免疫毒素CCL25-PE38具有特异性杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长效果明显，毒副作用小，有很好的应用前景，为急性T淋巴细胞白血病的治疗提供一种新的选择。

附图说明

图1为一种琼脂糖凝胶电泳结果示意图

本发明提供的PCR产物与CCL25预期的核酸片段大小一致。

图2为一种琼脂糖凝胶电泳结果示意图

本发明提供的PCR产物与PE38预期的核酸片段大小一致。

图3为一种琼脂糖凝胶电泳结果示意图

本发明提供的PCR产物与Igк-CCL25-PE38预期的核酸片段大小一致。

图4为一种琼脂糖凝胶电泳结果示意图

本发明提供的pcDNA3.1-Igк-CCL25-PE38质粒Hind III和EcoR I酶切产物pcDNA3.1和Igк-CCL25-PE38与预期的片段大小一致。

图5为一种免疫印迹结果示意图

本发明提供的CCL25-PE38能被抗PE38的抗体特异性识别，并出现在预期分子量(54.7kDa)条带上。

图6为一种流式细胞仪分析结果示意图。

A：对照，L929细胞仅加R-PE标记的羊抗兔IgG处理；

B：CCL25-PE38处理L929细胞30分钟后再加入R-PE标记的羊抗兔IgG；

C：对照，MOLT4细胞仅加R-PE标记的羊抗兔IgG处理；

D：CCL25-PE38处理MOLT4细胞30分钟后再加入R-PE标记的羊抗兔IgG；

结果显示本发明提供的CCL25-PE38能特异性地识别CCR9阳性的MOLT4细胞。

图7为一种共聚焦显微镜、流式细胞仪分析结果示意图

A：共聚焦显微镜检测MOLT4细胞表面的CCL25-PE38；

B：共聚焦显微镜检测MOLT4细胞内的CCL25-PE38；

C：流式细胞术检测MOLT4细胞表面的CCR9；

D：流式细胞术检测MOLT4细胞表面的CCR9；

结果显示本发明提供的CCL25-PE38能内化进入MOLT4细胞内并伴随细胞表面CCR9分子表达降低。

图8为一种细胞毒性实验结果示意图

A：本发明提供的CCL25-PE38能特异性地靶向杀伤MOLT4细胞；B：本发明提供的CCL25-PE38不影响CCR9阴性细胞L929的增殖。

图9为一种肿瘤生长曲线示意图

结果显示CCL25-PE38能有效缓解MOLT4细胞异种移植肿瘤的生长。

图10为一种肿瘤体重比较示意图

结果显示CCL25-PE38处理组与PBS处理组相比较具有统计学意义，CCL25-PE38能有效缓解MOLT4细胞异种移植肿瘤的生长。

具体实施方式

实施例1：构建制备重组免疫毒素CCL25-PE38的分泌型真核表达质粒

CCL25cDNA碱基序列如SEQ ID NO.1所示，PE38cDNA碱基序列如SEQID NO.2所示，载体选用pcDNA3.1(Invitrogen公司，美国)。一种抗CCR9⁺白血病的重组免疫毒素CCL25-PE38基因制备方法，具体步骤如下：

1.人CCL25基因的克隆：

构建用于本发明的CCL25基因，使用PrimeSTAR HS DNA polymerase试剂盒(Takara公司，中国)说明书推荐的方法，将各片段和成cDNA。

第1轮PCR：分泌取1μl引物A和引物B；引物C和引物D；引物E和引物F；引物G和引物H；引物I和引物J互作为模板进行扩增AB片段，CD片段，EF片段，GH片段，IJ片段。反应条件：94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；28个循环。

第2轮PCR：以AB片段，CD片段为模板，以A和D为引物对扩增ABCD片段；以EF片段，GH片段为模板，以引物E和H为引物对扩增EFGH片段。反应条件：94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；先行9个PCR循环后，分别加入引物A/D和E/H，继续进行28个循环。

第3轮PCR：以ABCD片段，EFGH片段为模板，以A和H为引物对扩增ABCDEFGH片段。反应条件：94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；先行9个PCR循环后，分别加入引物A和H，继续进行28个循环。

第4轮PCR：以ABCDEFGH片段，IJ片段为模板；以A和J为引物对扩增ABCDEFGHIJ片段及CCL25。反应条件：94℃，30s；60℃，30s；72℃，40s；先行9个PCR循环后，分别加入引物A和J，继续进行28个循环。扩增产物行1.2％(1.2g琼脂糖溶于100ml TAE缓冲液)琼脂糖凝胶电泳分析，如图1所示。

引物A：

CAAGGTGTCTTTGAGGACTGCTGCCTGGCCTACCACTACCCCATTGGGTGGGCTGTGC

引物B：

CTCACCTCCTGGATCCGGTAAGTCCAGGCGCGCCGGAGCACAGCCCACCCAATGGGGT

引物C：

CTTACCGGATCCAGGAGGTGAGCGGGAGCTGCAATCTGCCTGCTGCGATATTCTACC

引物D：

GGGGTTCCCACACACCTTCCTGTGTCTCTTGGGGAGGTAGAATATCGCAGCAGGCAGA

引物E：

CACAGGAAGGTGTGTGGGAACCCCAAAAGCAGGGAGGTGCAGAGAGCCATGAAGCTCCT

引物F：

GGTGGAGCTTTGCAAAAACCTTATTTCGAGCATCCAGGAGCTTCATGGCTCTCTGCA

引物G：

TAAGGTTTTTGCAAAGCTCCACCACAACACGCAGACCTTCCAAGCAGGCCCTCATGCTG

引物H：

CGATGATAACTTGGAGTTTCCAGAACTCAACTTCTTTACAGCATGAGGGCCTGCTTGG

引物I：

GGAAACTCCAAGTTATCATCGTCCAAGTTTAGCAATCCCATCAGCAGCAGTAAGAGGAA

引物J：

CTATTACAGTCCTGAATTAGCTGATATCAGGAGGGAGACATTCCTCTTACTGCTGCTGA。获得一种编码CCL25的cDNA的序列，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(GenBank：BCl44463.1)。

2.PE38基因的克隆：

按照PrimeSTAR HS DNA polymerase试剂盒(Takara公司，中国)说明书推荐的方法，克隆PE38的cDNA。以pRB391(Hu CC，et al.Construction of eukaryotic expression vector of recombinant immunotoxin human VEGF165-PE38and its expression.Cancer Research and Clinic.2009，21(4)：222-225.)为模板，使用上游引物K，和下游引物L进行PCR扩增。反应条件：94℃变性4min；98℃，10s；68℃，90s；30个循环。扩增产物行1.2％(1.2g琼脂糖溶于100ml TAE缓冲液)琼脂糖凝胶电泳分析，如图2所示。

引物K：

TCCGGAGGTCCCGAGGGC

引物L：

GTGCTTCAGGTCCTCGCGCGGCGGTTTGCCGGGCTGGCTGGCG。获得一种编码编码PE38的cDNA的序列，其序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列(GenBank：HC051663.1)。

3.CCL25-PE38全基因的克隆：

第1步：扩增CCL25C端部分序列与PE38N端部分序列的连接序列。使用上游引物M和下游引物N互为模板进行扩增，反应条件：98℃，10s；68℃，20s；30个循环。

第2步：扩增CCL25-Linker(SEQ ID NO.3)。以CCL25，第1步获得的序列为模板，以A和O为引物对扩增CCL25-Linker，反应条件：94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；先行9个PCR循环后，分别加入引物A和O，继续进行28个循环。

第3步：扩增Linker-PE38(SEQ ID NO.3)。以第1步获得的序列、PE38为模板，以M和P为引物对扩增Linke-PE38，反应条件：94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；先行9个PCR循环后，分别加入引物M和P，继续进行28个循环。

第4步：扩增CCL25-PE38(SEQ IDNO.3)。以CCL25-Linker，Linker-PE38为模板，使用上游引物A，和下游引物P进行PCR扩增。反应条件：94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；先行9个PCR循环后，分别加入引物A和下游引物P，反应条件：94℃，4min；98℃10s；68℃，90s；30个循环后72℃延伸5min。

第5步：各取1μl引物Q和R互为模板进行扩增含分泌信号序列Igк(GenBank：DQ295255.1)的Igк-CCL25N端部分序列(SEQ ID NO.3)。反应条件：98℃，10s；68℃，20s；30个循环。

第6步：扩增Igк-CCL25-PE38(SEQ ID NO.3，长度为1620bp)。以Igк-CCL25N端部分序列，CCL25-PE38为模板，使用上游引物Q，和下游引物P进行PCR扩增。反应条件：94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；先行9个PCR循环后，分别加入引物Q和下游引物P，反应条件：94℃，4min；98℃，10s；68℃，100s；30个循环后72℃延伸5min。

第7步：构建用于本发明的Igк-CCL25-PE38全序列(含酶切位点)，一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。以Igк-CCL25-PE38为模板(由上述第6步所得)，以含有酶切位点HindIII的上游引物T和含有酶切位点EcoR I下游引物S进行PCR扩增(94℃，4min；98℃10s；68℃，100s；30个循环后72℃延伸5min)。扩增产物行1.2％(1.2g琼脂糖溶于100ml TAE缓冲液)琼脂糖凝胶电泳分析，如图3所示。

引物M：

CTTCAGGTCCTCGCGCGGCGGTTTGCCGGGCTGGCTGGCGTAGTCCGGCAGGGCGCTGA

引物N：

CGGGACCTCCGGAAGCGGCCGCTGAGCCACCGCCCGACCCACCACCGCCACCGGAGCCT

引物O：

CGGGACCTCCGGAAGCGGCCGCTGAGCCACCGCCCGACCCACCACCGCCACCGGAGCCT

引物P：

GTGCTTCAGGTCCTCGCGCGGCGGTTTGCCGGGCTGGCTGGCG引物Q：

GGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTG

引物R：

GTCCTCAAAGACACCTTGATGATGATGATGATGGTGCGCGTCACCAGTGGAACCTGGAA

引物S：

CGCAAGCTTCTATTAGTGGTGGTGGTGGTG GTGCTTCAGGTCCTCGCG

引物T：

GCGAAGCTTACCATGGAGACAGACACACTCCT。获得一种编码编码Igк-CCL25-PE38的序列，一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

4.pcDNA3.1-CCL25-PE38载体的构建：

分别用核酸内切酶Hind III和EcoR I消化PCR扩增产物Igк-CCL25-PE38(由上述第7步所得)和pcDNA3.1载体(Invitrogen公司，美国)，37℃，4小时。回收酶切后含目的基因的片段后，使用T4连接酶(New England Biolabs公司，美国)连接过夜，构成CCL25-PE38的真核分泌性表达质粒，用此连接产物转化DH5α(Novagen公司，美国)感受态大肠杆菌细胞。并对筛选的阳性克隆进行Hind III和EcoR I酶切鉴定(图4)以及DNA测序(金斯瑞公司，南京)。一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，结果显示，所获得的核酸序列与GenBank中注册的CCL25 cDNA和PE38 cDNA序列完全一致。用上述方法鉴定证实后，将所获得的真核分泌性表达载体定名为pcDNA3.1-CCL25-PE38，含有编码重组免疫毒素CCL25-PE38基因。一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO.1为步骤1获得的编码CCL25的cDNA；

SEQ ID NO.2为步骤2获得的编码PE38的cDNA；

SEQ ID NO.3为步骤3获得的编码Igк-CCL25-PE38的cDNA；

SEQ ID NO.4为根据SEQ ID NO.3翻译(在线翻译工具，

http://expasy.org/tools/dna.html)的重组免疫毒素的蛋白质序列。

实施例2：制备重组免疫毒素CCL25-PE38(如序列SEQ ID NO.4所示蛋白质序列)

按照Michael等人所述的方法(

M，Tur MK，Sasse S，Krüssmann A，Barth S，Engert A.Secretion of functional anti-CD30-angiogenin immunotoxins into the supernatant of transfected 293T-cells.Protein Expr Purif.2003；28(2)：211-9.)制备抗T-ALL的重组免疫毒素CCL25-PE38。

1.转染293T细胞：取3μg pcDNA3.1-CCL25-PE38质粒与12μl转染试剂Entranster^TM-D(Engreen公司，中国)混合后转染293T细胞(America Tyte Cultrue Collection，美国)，置于37℃，CO₂浓度为5％的细胞培养箱中，4小时后换成无血清培养基OPTI-MEM(Invitrogen公司，美国)，72小时后收获细胞培养上清。

2.纯化和定量：上清液用磷酸盐缓冲液(PBS)进行透析，浓缩液使用Ni²⁺亲和层析柱HisTrap FF(Roche公司，美国)进行纯化，纯化后的蛋白于-80℃保存。蛋白浓度使用BCA试剂盒(碧云天公司，中国)进行测定，分析结果显示，CCL25-PE38，上述步骤1获得的一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，浓度为2nmol/ml。

3.Westernblot鉴定显示：本发明的抗人急性T淋巴细胞白血病的重组免疫毒素CCL25-PE38，能被抗PE38的抗体特异性识别(图5)。

实施例3：重组免疫毒素CCL25-PE38结合和内化特性实验

收集MOLT4细胞和L929细胞(America Tyte Cultrue Collection，美国)，PBS洗涤。取CCL25-PE38(0.5nmol/ml，PBS稀释)，加至细胞悬液中，于4℃孵育1小时，PBS洗涤两遍后。加入抗PE38的兔抗P2318(Sigma公司，美国)，对照组加入PBS，4℃孵育30分钟。PBS洗涤两遍后加入R-PE标记的羊抗兔IgG(ProteinTech公司，美国，4℃孵育30分钟。PBS洗涤两次后上流式细胞仪(Beckman公司，美国)进行检测。结果如图6所示。

收集MOLT4细胞(America Tyte Cultrue Collection，美国)，PBS洗涤。取CCL25-PE38(0.5nmol/ml，PBS稀释)，加至细胞悬液中，于4℃或37℃孵育1小时，PBS洗涤两遍后。一部分细胞加入抗PE38的兔多抗P2318，4℃孵育30分钟；PBS洗涤两遍后加入R-PE标记的羊抗兔IgG(ProteinTech公司，美国)，4℃孵育30分钟，PBS洗涤两次后进行共聚焦显微镜(Leica公司，德国)分析，结果如图7A，B所示。一部分细胞加入抗CCR9的鼠单抗，4℃孵育30分钟；PBS洗涤两遍后加入R-PE标记的驴抗鼠IgG(ProteinTech公司，美国)，4℃孵育30分钟，PBS洗涤两次后上流式细胞仪进行检测，结果如图7C，D所示。

由图6和图7所示的结果可以看出，使用本发明的CCL25-PE38能特异性结合表达CCR9的MOLT4细胞。CCL25-PE38结合MOLT4细胞后可内化进入细胞并伴随MOLT4细胞表面CCR9减少。

实施例4：重组免疫毒素CCL25-PE38靶向杀伤MOLT4细胞实验

收集MOLT4细胞，PBS洗涤。分别取CCL25-PE38(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，2.0nmol/ml，PBS稀释)，加至细胞悬液中，混合物加至96孔板的各小孔中。以PBS处理为阴性对照。37℃、CO₂浓度为5％的细胞培养箱中培养48小时后，加入10μl WST-1(Roche公司，美国)继续培养4小时。测定450nm下的OD值(表1，图8A)。

同时为检测CCL25-PE38对MOLT4细胞的特异性杀伤依赖于CCR9，设立抗CCR9Ab(R&D公司，美国)处理组。收集MOLT4细胞，PBS洗涤。先用抗CCR9Ab处理1小时，然后加入CCL25-PE38。其他处理同上(表1，图8A)。

表1.重组免疫毒素CCL25-PE38对MOLT4细胞的杀伤作用(OD450nm)

为检测CCL25-PE38对不表达CCR9细胞增殖能力的影响，收集L929细胞，PBS洗涤。取CCL25-PE38(0.5nmol/ml，PBS稀释)，加至细胞悬液中，混合物加至96孔板的各小孔中。以PBS处理为阴性对照。37℃、CO₂浓度为5％的细胞培养箱中培养48小时后，加入10μl WST-1继续培养4小时。测定450nm下的OD值(表2，图8B)。

表2.重组免疫毒素CCL25-PE38对L929细胞增殖的影响(OD450nm)

由表1、表2和图8A、8B所示的结果可以看出，采用本发明的CCL25-PE38能特异性杀伤MOLT4细胞，其杀伤作用能被抗CCR9的抗体阻断。因此，可采用这种方法靶向杀伤高表达CCR9的T-ALL细胞。

实施例5：重组免疫毒素CCL25-PE38缓解MOLT4细胞异种移植肿瘤生长实验

MOLT4细胞异种移植肿瘤模型建立：

SCID小鼠由武汉大学动物实验中心提供，6-8周龄，雌性，许可证编号：SCXK(鄂)2008-2004。小鼠饲养在无菌隔离器中。一周后，无菌条件下将MOLT4细胞接种至SCID小鼠背部皮下(1×10⁷/只)，接种后约7-9天可触及到约300mm³大小的肿瘤块，将未长出肿瘤的小鼠弃掉不用，余下动物分成2组，每组5只。

重组免疫毒素CCL25-PE38处理及效果观察：

于第9天开始分别尾静脉注射CCL25-PE38(0.5nm/只/天)，PBS；连续注射14天。每隔一天测量瘤体的长和宽，并计算瘤体大小(表3，图9)。至实验第29天，将SCID荷瘤小鼠处死，剥离肿瘤体并称重(表4，图10)。

表3.重组免疫毒素CCL25-PE38对MOLT4细胞异种移植肿瘤生长的影响(mm³)

表4.重组免疫毒素CCL25-PE38对MOLT4细胞异种移植肿瘤瘤体重量的影响(g)

Control CCL25-PE38

1 4.19 3.45

2 4.63 2.6

3 3.7 1.94

4 3.05 1.51

5 2.36 1.03

由表3、表4和图9、图10所示的结果可以看出，采用本发明的CCL25-PE38在作用12天以后能观察到瘤体的体积缩小。因此，采用静脉注射重组免疫毒素CCL25-PE38能有效抑制MOLT4细胞异种移植肿瘤的生长，在临床上具有潜在的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 一种重组免疫毒素CCL25-PE38基因及制备方法和应用

<130> 一种重组免疫毒素CCL25-PE38基因及制备方法和应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

caaggtgtct ttgaggactg ctgcctggcc taccactacc ccattgggtg ggctgtgctc 60

cggcgcgcct ggacttaccg gatccaggag gtgagcggga gctgcaatct gcctgctgcg 120

atattctacc tccccaagag acacaggaag gtgtgtggga accccaaaag cagggaggtg 180

cagagagcca tgaagctcct ggatgctcga aataaggttt ttgcaaagct ccaccacaac 240

acgcagacct tccaagcagg ccctcatgct gtaaagaagt tgagttctgg aaactccaag 300

ttatcatcgt ccaagtttag caatcccatc agcagcagta agaggaatgt ctccctcctg 360

atatcagcta attcaggact g 381

<210> 2

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tccggaggtc ccgagggcgg cagcctggcc gcgctgaccg cgcaccaggc ttgccacctg 60

ccgctggaga ctttcacccg tcatcgccag ccgcgcggct gggaacaact ggagcagtgc 120

ggctatccgg tgcagcggct ggtcgccctc tacctggcgg cgcggctgtc gtggaaccag 180

gtcgaccagg tgatccgcaa cgccctggcc agccccggca gcggcggcga cctgggcgaa 240

gcgatccgcg agcagccgga gcaggcccgt ctggccctga ccctggccgc cgccgagagc 300

gagcgcttcg tccggcaggg caccggcaac gacgaggccg gcgcggccaa cggcccggcg 360

gacagcggcg acgccctgct ggagcgcaac tatcccactg gcgcggagtt cctcggcgac 420

ggcggcgacg tcagcttcag cacccgcggc acgcagaact ggacggtgga gcggctgctc 480

caggcgcacc gccaactgga ggagcgcggc tatgtgttcg tcggctacca cggcaccttc 540

ctcgaagcgg cgcaaagcat cgtcttcggc ggggtgcgcg cgcgcagcca ggacctcgac 600

gcgatctggc gcggtttcta tatcgccggc gatccggcgc tggcctacgg ctacgcccag 660

gaccaggaac ccgacgcacg cggccggatc cgcaacggtg ccctgctgcg ggtctatgtg 720

ccgcgctcga gcctgccggg cttctaccgc accagcctga ccctggccgc gccggaggcg 780

gcgggcgagg tcgaacggct gatcggccat ccgctgccgc tgcgcctgga cgccatcacc 840

ggccccgagg aggaaggcgg gcgcctggag accattctcg gctggccgct ggccgagcgc 900

accgtggtga ttccctcggc gatccccacc gacccgcgca acgtcggcgg cgacctcgac 960

ccgtccagca tccccgacaa ggaacaggcg atcagcgccc tgccggacta cgccagccag 1020

cccggcaaac cgccgcgcga ggacctgaag 1050

<210> 3

<211> 1620

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gcgaagctta ccatggagac agacacactc ctgctatggg tactgctgct ctgggttcca 60

ggttccactg gtgacgcgca ccatcatcat catcatcaag gtgtctttga ggactgctgc 120

ctggcctacc actaccccat tgggtgggct gtgctccggc gcgcctggac ttaccggatc 180

caggaggtga gcgggagctg caatctgcct gctgcgatat tctacctccc caagagacac 240

aggaaggtgt gtgggaaccc caaaagcagg gaggtgcaga gagccatgaa gctcctggat 300

gctcgaaata aggtttttgc aaagctccac cacaacacgc agaccttcca agcaggccct 360

catgctgtaa agaagttgag ttctggaaac tccaagttat catcgtccaa gtttagcaat 420

cccatcagca gcagtaagag gaatgtctcc ctcctgatat cagctaattc aggactgggc 480

ggcgggggtt ctggtggtgg aggctccggt ggcggtggct caggcggtgg tgggtcgtcc 540

ggaggtcccg agggcggcag cctggccgcg ctgaccgcgc accaggcttg ccacctgccg 600

ctggagactt tcacccgtca tcgccagccg cgcggctggg aacaactgga gcagtgcggc 660

tatccggtgc agcggctggt cgccctctac ctggcggcgc ggctgtcgtg gaaccaggtc 720

gaccaggtga tccgcaacgc cctggccagc cccggcagcg gcggcgacct gggcgaagcg 780

atccgcgagc agccggagca ggcccgtctg gccctgaccc tggccgccgc cgagagcgag 840

cgcttcgtcc ggcagggcac cggcaacgac gaggccggcg cggccaacgg cccggcggac 900

agcggcgacg ccctgctgga gcgcaactat cccactggcg cggagttcct cggcgacggc 960

ggcgacgtca gcttcagcac ccgcggcacg cagaactgga cggtggagcg gctgctccag 1020

gcgcaccgcc aactggagga gcgcggctat gtgttcgtcg gctaccacgg caccttcctc 1080

gaagcggcgc aaagcatcgt cttcggcggg gtgcgcgcgc gcagccagga cctcgacgcg 1140

atctggcgcg gtttctatat cgccggcgat ccggcgctgg cctacggcta cgcccaggac 1200

caggaacccg acgcacgcgg ccggatccgc aacggtgccc tgctgcgggt ctatgtgccg 1260

cgctcgagcc tgccgggctt ctaccgcacc agcctgaccc tggccgcgcc ggaggcggcg 1320

ggcgaggtcg aacggctgat cggccatccg ctgccgctgc gcctggacgc catcaccggc 1380

cccgaggagg aaggcgggcg cctggagacc attctcggct ggccgctggc cgagcgcacc 1440

gtggtgattc cctcggcgat ccccaccgac ccgcgcaacg tcggcggcga cctcgacccg 1500

tccagcatcc ccgacaagga acaggcgatc agcgccctgc cggactacgc cagccagccc 1560

ggcaaaccgc cgcgcgagga cctgaagcac caccaccacc accactaata ggaattcgcg 1620

<210> 4

<211> 509

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

His His His His His His Gln Gly Val Phe Glu Asp Cys Cys Leu Ala

1 5 10 15

Tyr His Tyr Pro Ile Gly Trp Ala Val Leu Arg Arg Ala Trp Thr Tyr

20 25 30

Arg Ile Gln Glu Val Ser Gly Ser Cys Asn Leu Pro Ala Ala Ile Phe

35 40 45

Tyr Leu Pro Lys Arg His Arg Lys Val Cys Gly Asn Pro Lys Ser Arg

50 55 60

Glu Val Gln Arg Ala Met Lys Leu Leu Asp Ala Arg Asn Lys Val Phe

65 70 75 80

Ala Lys Leu His His Asn Thr Gln Thr Phe Gln Ala Gly Pro His Ala

85 90 95

Val Lys Lys Leu Ser Ser Gly Asn Ser Lys Leu Ser Ser Ser Lys Phe

100 105 110

Ser Asn Pro Ile Ser Ser Ser Lys Arg Asn Val Ser Leu Leu Ile Ser

115 120 125

Ala Asn Ser Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Pro Glu Gly Gly

145 150 155 160

Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu

165 170 175

Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln

180 185 190

Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg

195 200 205

Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser

210 215 220

Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu

225 230 235 240

Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe

245 250 255

Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Gly Pro

260 265 270

Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala

275 280 285

Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr

290 295 300

Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu

305 310 315 320

Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala

325 330 335

Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu

340 345 350

Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala

355 360 365

Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg

370 375 380

Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly

385 390 395 400

Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu

405 410 415

Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile

420 425 430

Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp

435 440 445

Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp

450 455 460

Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys

465 470 475 480

Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys

485 490 495

Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys His His His His His His

500 505

Claims

1.一种分离的重组免疫毒素的质粒，其特征在于：重组免疫毒素序列为SEQ ID NO.3所示核苷酸序列。

2.一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列。

3.权利要求1所述的一种抗急性T淋巴细胞白血病的重组免疫毒素CCL25-PE38基因制备方法，其步骤是：

钓取CCL25的cDNA, 通过合成互扩的引物：A和B、C和D、E和F、G和H、I和J，先合成较短的基因片段：AB、CD、EF、GH、IJ，AB和CD、CD和EF、EF合GH、GH和IJ之间存在着互相重叠的区域，构建CCL25的cDNA；

钓取 PE38的cDNA，运用PCR从pRB391质粒为模板，使用上游引物K，和下游引物L进行PCR，克隆PE38的cDNA；

构建Igκ-CCL25-PE38，以CCL25 步骤（1）获得的PCR产物)为模板，合成Igκ-CCL25-linker，以PE38步骤（2）获得的PCR产物为模板，合成Linker-PE38，采用SOE-PCR，合成Igκ-CCL25-PE38全基因片段；

构建pcDNA3.1-CCL25-PE38真核分泌表达载体，分别用核酸内切酶Hind Ⅲ和 EcoR Ⅰ消化PCR扩增产物Igκ-CCL25-PE38和pcDNA3.1载体，然后连接构成CCL25-PE38的真核分泌性表达质粒；

（5）制备免疫毒素CCL25-PE38：pcDNA3.1-CCL25-PE38质粒转染293T细胞，采用无血清培养基OPTI-MEM 进行培养，72小时后收获细胞培养上清；使用HisTrap FF进行纯化，使用BCA法进行测定蛋白浓度，结果显示重组免疫毒素CCL25-PE38浓度为2 nmol/ml；Western blot鉴定所表达的重组免疫毒素，结果显示重组免疫毒素CCL25-PE38，能被抗PE38的抗体特异性识别，并与预期目的分子量54.7 kDa条带一致。

4.权利要求1或2所述的一种分离的重组免疫毒素的质粒在制备治疗或预防急性T淋巴细胞白血病药物中的应用。