KR101486989B1

KR101486989B1 - 공중합체 및 이를 포함하는 유전자 전달체

Info

Publication number: KR101486989B1
Application number: KR20130122715A
Authority: KR
Inventors: 김일; 프띠야마다띨 존슨 렌지스
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2013-10-15
Filing date: 2013-10-15
Publication date: 2015-02-03

Abstract

본 발명은 아크릴계 화합물 및 리신을 반복단위로 포함하는 공중합체, 상기 공중합체를 포함하는 유전자 전달체를 제공한다. 본 발명에 따른 공중합체는 유전자에 높은 결합능을 나타내고 세포 독성이 없어, 유전자 치료에 있어서 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

공중합체 및 이를 포함하는 유전자 전달체{Copolymer and gene transfer carrier comprising the same}

본 발명은 아크릴계 화합물 및 리신을 반복단위로 포함하는 공중합체, 및 상기 공중합체를 포함하는 유전자 전달체에 관한 것이다.

유전자 치료(gene therapy)는 치료 유전자를 체내의 원하는 장기로 전달하여 세포 내에서 새로운 단백질이 발현되도록 하여 질병을 치료하는 것으로, 질병의 증상을 치료하는 것이 아니고 질병의 원인을 제거하여 치료하는 방식이다. 유전자 치료는 일반적인 약물에 의한 치료에 비해 우수한 선택적 치료효과를 가고, 다른 치료법으로는 조절하기 힘든 질병의 치료율 및 치료 속도를 개선하여 오랜 기간 동안 적용할 수 있다.

다만, DNA 등 치료 핵산은 생체 내 효소에 의한 가수분해에 취약하고 세포 내로 유입되는 효율이 낮기 때문에, 효과적인 유전자 치료를 위해서는 치료 핵산을 원하는 표적세포로 안전하게 전달하여 높은 발현효율의 달성을 가능케 하는 유전자 전달체(gene carrier)를 개발하는 것이 필수적이다. 유전자 전달체는 독성이 낮거나 없어야 하며, 유전자를 선택적이고 효과적으로 원하는 세포에 전달할 수 있어야 한다.

이러한 유전자 전달체는 크게 바이러스성과 비바이러스성으로 나눌 수 있다. 최근까지 임상 실험에는 유전자 전달체로 형질도입 효율이 높은 바이러스성 벡터(viral vector)가 사용되었다. 그러나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus)와 같은 바이러스성 벡터는 제조과정이 복잡할 뿐만 아니라, 면역원성, 감염 가능성, 염증 유발, 비특이적 DNA의 삽입 등의 안전성 문제와 수용할 수 있는 핵산의 크기가 한정되어 있다는 문제로 인해 인체에 적용하기엔 한계가 많다. 이에 현재는 비바이러스성 벡터(non-viral vector)가 바이러스성 벡터의 대용으로 각광을 받고 있다.

비바이러스성 벡터는 최소한의 면역반응으로 반복 투여할 수 있고, 특정 세포로의 특이적 전달이 가능하며, 안전성 및 저장 안정성이 우수하고, 대량 생산이 용이하다는 장점을 가지고 있다. 이러한 비바이러스성 벡터의 예로는 양이온성 리포좀(liposome) 계열로서 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 알킬암모늄(alkylammonium), 양이온성 콜레스테롤 유도체(cationic cholesterol derivatives), 그라미시딘(gramicidin) 등이 있다. 그러나, 종래의 리포좀 계열 핵산 전달체는 혈액 안정성이 낮고, 가격 경쟁력이 낮은 단점이 있다.

최근 비바이러스성 벡터 중 양이온성 고분자가 음전하를 띠는 DNA 또는 RNA 등과 이온결합을 통한 복합체를 형성할 수 있기 때문에 많은 관심을 불러일으키고 있다. 이러한 양이온성 고분자에는 폴리-L-라이신(PLL), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스테르), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산], 폴리아미도아민 덴드리머, 폴리[N,N＇-(디메틸아미노)에틸]메타크릴레이트(PDMAEMA) 등이 포함되며, 이들은 DNA 등 치료 핵산을 압축하여 나노 입자를 형성함으로써 효소 분해로부터 DNA를 보호하고, 빠르게 세포 안으로 침투하여 엔도좀(endosome)에서 빠져나올 수 있도록 도와준다. 대부분의 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터에 비해 생분해성, 낮은 독성, 비면역원성, 사용상의 간편함 등의 장점을 가지나, 상대적으로 낮은 형질도입 효율, 제한적인 입자 크기 등의 문제점을 가지고 있다. 비바이러스성 벡터로서 가장 광범위하게 연구되고 있는 폴리에틸렌이민(PEI) 역시 생체 내 형질도입 효율이 현저히 떨어지며, 높은 세포독성 및 낮은 혈액 적합성으로 인한 핵산의 낮은 발현 효과 등의 문제점이 있다. 따라서, 기존의 비바이러스성 벡터의 장점은 그대로 유지하면서 형질도입 효율을 증강시킨 유전자 전달체의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 신규한 유전자 전달체를 개발하기 위해 노력한 결과, 아크릴계 화합물 및 리신을 반복단위로 포함하는 공중합체가 유전자와 우수한 결합능을 나타내어 공중합체/유전자 복합체를 형성하고, 상기 공중합체/유전자 복합체가 세포 독성이 없고, 유전자를 효율적으로 전달하는 특성이 있어, 유전자 전달체로서 우수한 효과를 가짐을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아크릴계 화합물 및 리신을 반복단위로 포함하는 공중합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 공중합체를 포함하는 유전자 전달체를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물을 반복단위로 포함하는 공중합체를 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R은 -(OCH₂CH₂)_aOH, -OCH₃, -NH₂, 및 -NHCH(CH₃)₂로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, a는 1 내지 10의 정수이며, n은 10 내지 1000의 정수이다.

[화학식 2]

상기 화학식 2에서, m은 10 내지 1000의 정수이다.

또한, 상기 공중합체를 포함하는 유전자 전달체를 제공한다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 화합물은 단량체, 올리고머 및 고분자를 모두 포함하는 것이다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 공중합체는 하기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물을 반복단위로 포함하는 것을 특징으로 한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, 상기 R은 -(OCH₂CH₂)_aOH, -OCH₃, -NH₂, 및 -NHCH(CH₃)₂로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, a는 1 내지 10의 정수일 수 있다. 상기 화학식 1에서 n은 10 내지 1000의 정수이며, 보다 바람직하게는 20 내지 200의 정수일 수 있다. 상기 공중합체에서 n의 값이 상기 범위를 만족하는 경우 물에 대한 용해도가 우수하여 혈액에 잘 용해되고, 분산도가 높아지며, 세포독성이 낮아 유전자 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 아크릴계 중합체이다. 상기 아크릴계 중합체는 아크릴레이트(acrylate) 또는 아크릴아마이드(acrylamide)로부터 중합될 수 있다. 상기 아크릴계 중합체는 가장 바람직하게는 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트로부터 중합된 화학식 3으로 표시되는 화합물 일 수 있다.

[화학식 3]

상기 화학식 3에서, n은 10 내지 1000의 정수이며, 보다 바람직하게는 20 내지 200의 정수일 수 있다.

[화학식 2]

상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 리신 중합체이다. 상기 리신 중합체는 L-리신(L-lysine, lys)으로부터 중합될 수 있다. 상기 화학식 2에서, m은 10 내지 1000의 정수이며, 보다 바람직하게 20 내지 200의 정수일 수 있다. 상기 공중합체에서 m의 값이 상기 범위를 만족하는 경우 유전자와의 결합력이 우수해 유전자 전달체로 사용되는 경우 우수한 유전자 전달 효과를 가질 수 있다.

상기 공중합체는 하기 화학식 10으로 표시되는 공중합체일 수 있다.

[화학식 10]

상기 화학식 10에서, 상기 R은 -(OCH₂CH₂)_aOH, -OCH₃, -NH₂, 및 -NHCH(CH₃)₂로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, a는 1 내지 10의 정수일 수 있다.

상기 X₁은 F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, X₂는 -CH₂-, -CH₂CH₂-, CH₂CH₂CH₂-,

,

및

로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, X₃는 -NH₂, -NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -NHCH₂CH₂CH₃, -N(CH₃)_2,-N(CH₂CH₃)₂및 -N(CH₂CH₂CH₃)₂로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. n₁ 및 n₂는 각각 독립적으로 10 내지 1000의 정수일 수 있고, 바람직하게는 X₁은 Br 이고, X₂는

이고, X₃는 -NH₂인 하기 화학식 11로 표시되는 화합물 일 수 있다.

[화학식 11]

상기 R은 -(OCH₂CH₂)_aOH, -OCH₃, -NH₂, 및 -NHCH(CH₃)₂로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, a는 1 내지 10의 정수일 수 있다. 상기 공중합체는 화학식 12 내지 화학식 16로 표시되는 화합물 중 어느 하나 일 수 있다.

[화학식 12]

[화학식 13]

상기 화학식 13에서, 상기 b는 2 내지 10의 정수일 수 있다.

[화학식 14]

[화학식 15]

[화학식 16]

상기 공중합체에 있어서, 바람직하게는, n₁은 5내지 500의 정수, n₂는 10 내지 300의 정수일 수 있고, 보다 바람직하게는 n₁은 10 내지 100의 정수, n₂는 20 내지 200의 정수일 수 있고, 가장 바람직하게는 n₁은 40, n₂는 40 내지 150의 정수 일 수 있다.

상기 n₁이 40, n₂가 40 내지 150의 정수인 공중합체를 유전자 전달체로 사용하는 경우 수용성이 높아 혈액 안정성이 우수하고 세포독성이 낮으며, 세포 내로 형질 도입 효율이 우수하여 유전자 치료에 있어서 효과적으로 사용할 수 있다.

본 발명에서의 공중합체(copolymer)는 2 종 이상의 단량체로 형성된 폴리머 또는 코폴리머를 의미하는 것으로, 교대 공중합체, 랜덤 공중합체, 교호 공중합체, 블록공중합체, 접목 공중합체, 등을 모두 포함한다. 상기 공중합체는 바람직하게는 블록 공중합체(block copolymer) 일 수 있고, 상기 블록 공중합체는 폴리머 분자의 일부분이 다수의 구성 단위로 되고, 그 부분에 인접하는 다른 부분과 화학구조상 혹은 입체상 배치가 상이한 블록이 2 종류 이상의 단량체로 형성된 것을 의미한다.

상기 공중합체의 제조는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 중합방법에 의하여 제조할 수 있고, 그 종류에 제한되지 않는다.

상기 중합방법의 일 예로 고분자 리빙 라디칼 중합 방법이 있고, 리빙 라디칼 중합반응은 원자이동 라디칼 중합반응 (atom transfer free radical polymerization, ATRP), 가역 첨가-분절 연쇄이동 중합(reversible addition fragmentation chain transfer polymerization, RAFT), 고리열림중합(ring opening polymerization, ROP), 양이온성 리빙중합, 음이온성 리빙중합, 사슬 왕복 고분자 반응(chain shuttling polymerization) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다.

상기 공중합체의 제조 시, 공중합은 유기용매 하에서 진행되는 것이 바람직하다. 상기 유기용매는 일 예로 아세톤, 에틸아세트산, 헥산, 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran; THF), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid). 메탄올, 에탄올, N,N-디메틸포름아미드(dimethylformamide; DMF) 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 공중합은 개시제에 의하여 개시할 수 있고, 상기 개시제는 공중합체 제조시 통상적으로 사용되는 개시제를 사용할 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서 프탈이미도 에틸 2-브로모-2-메틸 프로피오네이트 또는 대형단량체 개시제를 사용하였으나, 그 종류에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따른 공중합체는 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(2-hydroxyethyl methacrylate, HEMA) 및 리신(L-lysine)을 용매에 녹이고, 실온조건을 유지하면서 질소 하에서 교반하면서 반응시키는 방법으로 제조하였고, 상기 반응물을 디에틸에테르에서 침전 시킨 후 건조하여 공중합체를 얻었다.

상기 건조 방법은 공중합체 제조 시 통상적으로 사용되는 건조방법에 의하여 건조할 수 있고, 일 예로 동결건조, 진공건조법에 의하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 공중합체는 생분해성 고분자인 아크릴레이트 또는 아크릴아마이드와 양이온성 고분자인 리신(lysine)으로부터 공중합 되는 것으로, 리신의 양이온성으로 인해 유전자와 결합하여 전달체로 작용할 수 있고, 상기 공중합체를 유전자 전달체로 사용하는 경우, 아크릴레이트 또는 아크릴아마이드의 산소원자 및 질소원자에 의하여 수용성이 증가하고, 폴리에스테르 부분 또는 폴리아마이드 부분에 의하여 생분해성이 증가하므로, 체내 세포독성이 낮고, DNA와 결합력이 강하여, DNA의 세포 내 형질도입 효율을 높일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 3의 화합물을 반복단위로 포함하는 공중합체를 포함하는 유전자 전달체를 제공한다.

상기 유전자 전달체는 상기 화학식1의 화합물 및 화학식 3의 화합물을 반복단위로 포함하는 공중합체와 유전자가 결합된 것 일 수 있다.

본 발명에 있어서 유전자 전달체는 벡터(vector)라고도 하며, 유전자치료 과정에서 환자의 질병세포에 유전자를 전달하여 주는 것을 의미한다. 유전자 치료를 위하여 세포 안에 결손된 유전자를 정상 유전자로 치환하거나, 새 유전자를 집어넣거나, 과잉 또는 과소 작용하는 유전자의 기능을 조절하는데 이용될 수 있는 것을 모두 의미한다. 상기 유전자 전달체는 비바이러스성 유전자 전달체를 의미한다.

상기 유전자 전달체에 결합될 수 있는 치료 유전자의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 본 발명의 목적에 따라 원하는 표적에 전달되어 원하는 치료 효과를 발휘할 수 있는 어떠한 형태의 유전자도 본 발명의 범위에 포함되며, 예를 들어 gDNA, cDNA, pDNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, shRNA, miRNA, DNA-RNA 혼성체 (hybrid), 리보자임 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

상기 유전자는 상기 공중합체와 결합하여 공중합체와 유전자 복합체를 형성할 수 있다. 본 발명의 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 상기 공중합체와 유전자 복합체는 공중합체/유전자 복합체 또는 폴리플렉스(polyplex)라고 표현한다. 상기 공중합체는 양이온성 고분자로서, 유전자와 결합이 잘 이루어 지므로, 혈액 환경의 변화 등에 있어서 결합이 깨어지지 않아 목적하는 부위에 유전자를 효과적으로 전달할 수 있다.

상기 유전자 전달체의 N/P 비율(공중합체의 질소/유전자의 인산염)은 바람직하게는 2 내지 100이며, 보다 바람직하게는 20 내지 60이다. N/P 비율이 20 내지 60인 경우에 공중합체와 유전자의 결합이 잘 일어나므로 유전자 전달체로 유용하게 사용할 수 있다.

상기 유전자 전달체는 평균 직경이 20 내지 300 nm, 바람직하게는 100 내지 250nm, 가장 바람직하게는 150 내지 220nm일 수 있다. 이러한 입자 크기일 때 유전자 전달체로서 효과적으로 작용할 수 있다.

특히 상기 유전자 전달체의 N/P 비율과 유전자 전달체의 평균 직경이 상기 범위를 동시에 만족하는 경우 공중합체와 유전자의 결합력이 향상되어, 우수한 유전자의 전달 효율 및 정확성을 갖는다.

상기 유전자 전달체의 제타 전위(zeta potential)는 15 내지 45mV, 바람직하게는 20 내지 40mV의 값을 갖는 경우에 유전자 전달체로서 효과적으로 작용할 수 있다.

본 발명의 유전자 전달체는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 적절한 방법으로 투여될 수 있다. 본 발명의 유전자 전달체는 통상의 방법에 따라 경구형 제형 또는 멸균 주사용액 등의 형태로 다양하게 제형화 할 수 있으며, 고체의 나노입자 및 미립구 분말로 제조할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 공중합체를 유전자 전달체로 이용하는 경우, 다가 양이온(polycation)인 폴리리신에 의하여 유전자가 결합된, 공중합체/DNA 복합체인 폴리플렉스(polyplex)를 형성하는 단계, 세포 안으로 폴리플렉스가 들어가서 세포질로 폴리플렉스가 방출되는 단계, 핵으로 유전자가 수송되는 단계를 통해 유전자 도입이 일어난다.

본 발명에 따른 공중합체는 화학식 1의 화합물 및 화학식 3의 화합물을 반복단위로 포함함으로써, 유전자에 높은 결합능을 나타내고 세포 독성이 없어, 유전자 전달을 위한 유전자 복합체로서 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 p(HEMA)₄₀-b-p(lys)_n로 표시되는 공중합체의 제조 과정을 나타낸 도이다.
도 2은 공중합체에서 p(HEMA)₄₀-b-p(lys)_n 공중합체와 pDNA의 결합력을 확인한 도이고, 상기 도 2에서 (a)는 n=40, (b)는 n=80, (c)는 n=120 그리고 (d)는 n=150인 경우를 나타낸다.
도 3는 p(HEMA)₄₀-b-p(lys)_n 공중합체/pDNA 복합체의 입자 크기 및 제타 전위(zeta potential)를 확인한 도이다. (a)는 N/P 비율이 20인 경우 평균 입경(nm)을 나타낸 그래프이고, (b)는 N/P 비율이 40인 경우 평균 입경(nm)을 나타낸 그래프이며, (c)는 N/P 비율이 20인 경우(검은색)와 N/P 비율이 40인 경우(붉은색)의 복합체의 제타 전위(mV)를 나타낸 그래프이다.
도 4은 p(HEMA)₄₀-b-p(lys)_n공중합체/유전자 복합체의 세포활성을 MTS 에세이를 통해 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 N/P 비율이 40인 p(HEMA)₄₀-b-p(lys)_n공중합체/pDNA의 유전자 주입(transfection) 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6는 p(HEMA)₄₀-b-p(lys)_n공중합체/pDNA 복합체에서 세포 내 유전자의 방출 여부를 확인한 도로, 붉은색을 띠는 경우가 세포기질에서 복합체를 흡수한 것을 의미하고, 상기 도 6에서 기준자(Scale bar)는 20μm를 나타낸다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험결과의 통계분석은 the Student＇s t-test로 나타내었고, p-value는 0.05 이하의 오차범위를 갖는다.

실시예 1. 재료, 기기, 및 측정 방법.

1-1 재료의 준비

모든 시약 및 용매는 상업적인 공급회사로부터 구매하였고, 특별히 명시된 바 없는 경우에는 일반적으로 인정되는 것을 사용하였다. N-(2-히드록시에틸)프탈이미드(99%), 2-브로모 이소뷰티릴 브로마이드(98%), 트리에틸아민(TEA, 99.5%), 2-히드록시에틸 메타크릴레이트(2-hydroxyethyl methacrylate; HEMA, 98%), 브롬화 구리(copper (I) bromide, 99.99%), 2,2＇-비피리딜(bipyridyl; bpy >99%), 히드라진 일수화물(hydrazine monohydrate, 98%), N ^ε(카보벤즈옥시)-L-리신(carbobenzoxy-L-lysine, 99.0%), 브롬화 수소(아세트 산에서 33 wt%) 및 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, 99%)은 Sigma-Aldrich Co.(USA)에서 구입하였다. 트리포스겐(Triphosgene, >98%)은 TCI(Japan)에서 구입하였다. N,N-디메틸폼아미드(dimethylformamide; DMF)는 나트륨을 통해 증류하였다. 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran; THF)은 수소화칼슘(calcium hydride)을 통해 건조시키고 감압하여 증류하였다. 증류수(deionized water; DI)는 모든 반응, 용액의 준비에서 사용되었으며, 공중합체의 분리는 18 MΩ(Milli-Q Reagent Water System, Millipore Corp., Billerica, MA, USA)의 저항을 갖도록 정제되었다. Z-lys-NCA(N ^ε(carbobenzoxy)-L-lysine N-carboxyanhydride)는 Poche et al.(Fuchs-Farthing method)에 기술된 방법에 의하여 제조되었다. NIH 3T3 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast cells)는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. DMEM(Dulbecco＇s Modified Eagle＇s Medium)은 Sigma-Aldrich Co에서 구입하였다. 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS)은 Dainippon Sumitomo Parma Co., Ltd.(Osaka, Japan)에서 구입하였다. gWiz-luc(Aldevron, USA) 플라스미드는 대장균(Escherichia coli) DH5α 수용성 세포(competent cells)에 열 충격(heat shock) 방법을 통해 형질전환(transformation)하고, 상기 gWiz-luc를 100mg/mL의 카나마이신(kanamycin)(Biosesang Inc., Korea)이 포함된 LB(Luria-Bertani) 배지(Becton Dickinson, USA)에서 배양한 대장균에 삽입하였다. 플라스미드 DNA(pDNA)는 미니 DNA-스핀 키트(Intron Biotechnology Co., Korea)를 이용하여 추출 및 정제하였다. DNA-결합 염료인 Bobo 3 아이오드(Iodide)는 Life Technologies(USA)에서 구입하였고, MTS 시약은 Promega(USA)에서 얻었다. BCA(bicinchoninic acid) 에세이 키트 및 DAPI를 수반한 골드 안티페이드(Gold antifade) 시약은 각각 Intron Biotechnology Co.(Korea)와 Invitrogen(USA)에서 구입하여 사용하였다.

1-2. 기기 및 측정방법

¹H NMR(400 MHz) 및 ¹³C NMR(100 MHz) 스펙트럼은 Varian INOVA 400 NMR 분광기(spectrometer)를 통해 기록하였다. 컬럼 크로마토그래피는 300-400 메시(mesh)의 실리카겔을 사용하여 Combi-Flash Companion purification system (Teledyne ISCO, Lincoln, NE, USA)에서 수행하였다. UV-vis 비탁분석(turbidimetry) 실험은 온도 조절기가 갖춰진 Shimadzu UV-1650 PC에서 LCST를 확인하기 위해 수행하였다. FT-IR(Fourier transform-infrared) 스펙트라는 KBr 디스크 위에 Shimadzu IR Prestige 21 분광기를 통해 측정하였다. 분자량 및 고분자의 Ð는 Waters 1515 HPLC 용매 펌프, Water 2414 굴절률 검출기(refractive index detector), 세 개의 Waters Styragel High Resolution 컬럼(HR4, HR2, HR1, 효과적인 분자량의 범위는 각각 5000-500,000, 500-20,000, 및 100-5000 g mol^-1)이 갖춰진 Waters GPC(gel permeation chromatography)에서 용리제(eluent)로 0.1N LiBr(유속 1.0mL/min)이 포함된 HPLC-grade THF를 사용하여 40℃ 조건에서 측정되었다. PSs(polystyrenes)의 단분산(monodisperse)은 검량선(calibration curve)을 만들기 위해 이용되었다. 폴리플렉스(polyplex)의 크기와 표면 전하는 Zetasizer Nanoseries 기기(Malvern Instruments Ltd., UK)를 이용하여 측정하였다. 세포 내의 이미지는 공초점 레이저 현미경(confocal laser scanning microscope; CLSM, Carl Zeiss, Oberlochem, Germany)을 이용하여 찍었으며, 흡광도는 Bio-Rad 플레이트 리더기(Bio-Rad, Hertfordshire, UK)로 기록하였다.

실시예 2. 프탈이미도 에틸 2-브로모-2-메틸 프로피오네이트(phthalimido ethyl 2-bromo-2-methyl propionate)의 제조

프탈이미도 에틸 2-브로모-2-메틸 프로피오네이트는 헤테로기능성(heterofunctional) 개시제(initiators)로서 N-(2-히드록시에틸)프탈이미드(N-(2-hydroxyethyl)phthalimide)와 α-브로모-이소뷰티릴 브로마이드(α-bromo isobutyryl bromide)를 TEA(triethylamine)이 존재하는 THF에서 한 단계의 반응을 통해 제조하였다.

구체적으로는, N-(2-히드록시에틸)프탈이미드(4.80g, 25mmol, 1.0 당량)와 TEA(3.5mL, 25mmol, 1.0 당량)를 THF(150mL)에 녹인 후, N₂ 주입구와 고무 격막(rubber septum)이 있는 두 개의 목이 있는 플라스크(250mL)에 넣고, 얼음 조(ice bath)에 넣어 냉각시켰다. 상기 혼합물에 α-브로모-이소뷰티릴 브로마이드(3.090 mL, 25 mmol, 1.0 당량)를 한 방울씩 떨어뜨려 첨가하였다. 상온에서 밤새도록 교반하여 반응을 진행시킨 후, 생성된 흰색의 트리에틸암모니움 브로마이드 침전물은 여과하여 제거하고, THF는 회전농축기(rotavapor)에서 증발시켜 제거하였다. 잔여물은 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 헥산/에틸 아세테이트 v/v: 4/1)를 통해 정제하여 황백색의 고체(66%)를 수득하였다. 생성물의 NMR 데이터는 다음과 같다.

¹H NMR (400 MHZ, CDCl3): δ= 1.80 (s, 6H C(CH₃)₂), 3.95 (t, 2H O(CH₂)), 4.40 (t, 2H N(CH₂)), 7.70 (m, 2H, H ar), 7.90 (m, 2H, H ar).

¹³C NMR (100 MHZ, CDCl₃): δ= 30.2, 37.1, 42.3, 55.5, 63.0, 127.5, 130.2, 132.6, 165.4, 175.5.

실시예 3. 원자이동 라디칼 중합반응P(atom transfer radical polymerization)에 의한 프탈이미도 말단-캡(End-capped) p(HEMA)의 제조

p(HEMA)₄₀-b-p(lys)_n를 제조하기 위해 도 1에 나타낸 바와 같이 실시하였다. 단량체/개시제 비율이 40인 프탈이미도 말단-캡 p(HEMA)은 원자이동라디칼 중합반응(atom transfer radical polymerisation, ATRP)에 의하여 제조하였다. ATRP 개시제로서 프탈이미도 에틸 2-브로모-2-메틸 프로피오네이트(0.3401g, 1mmol)를 사용하였고, HEMA(2-hydroxyethyl methacrylate)와 무수 메탄올이 1:2 w/w이 되도록 하여 HEMA를 무수 메탄올에 녹이고 가스를 제거하였다. 가스를 제거한 용액에 2,2＇-비피리딘(2,2＇-bipyridine) 리간드(0.234 g, 1.5 mmol) 및 CuBr 촉매(0.072 g, 0.5 mmol)를 첨가하여 촉매 복합체를 만든 후 20℃에서 교반하여 폴리머화(polymerisation)를 7분동안 진행하였다. 생성물을 중성 알루미나 컬럼을 통과시켜 촉매를 제거하였고, 차가운 THF에서 침전을 통해 순수한 생성물을 얻은 후 진공 건조하였다.

실제 수평균 분자량(number-average molecular weight; Mn)은 프탈이미드와 메탄(methane) 수소의 ¹H NMR 스펙트럼 피크의 적분값을 통해 계산하였으며, 수득된 p(HEMA)-PI는 증류수의 투석을 통해 잔여의 단량체 및 비활성화 개시제를 배타적 제거하여 정제하였다. 생성물의 NMR 데이터는 다음과 같다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ= 1.29 (m, C(CH₃)₂), 2.07 (s, CH₃), 2.41 (br, CH₂), 3.81 (br, OCH₂), 4.27 (br, OCO(CH₂)), 4.5 (s, OH), 7.70 (m, 2H, H ar), 8.13 (m, 2H, H ar) ppm.

¹³C NMR (100 MHZ, CDCl₃): δ= 21.6, 24.2, 46.5, 47.7, 62.6, 69.2, 127.4, 132, 132.3, 165.9, 174.5 ppm.

실시예 4. p(HEMA) 말단에 존재하는 프탈이미드의 히드라진분해 (hydrazinolysis)를 통한 일차 아민의 제조

p(HEMA) 말단에 존재하는 프탈이미드의 히드라진분해를 통해서 p(HEMA)₄₀-NH₂를 생성하였으며, p(HEMA)₄₀-NH₂는 p(HEMA)₄₀-b-p(lys)_n 블록 공중합체의 제조를 위한 NCA(N-carboxyanhydride)의 고리열림중합(ring-opening polymerization, ROP)의 대형단량체개시제(macroinitiator)로 사용되었다. p(HEMA)-PI(2.60g, 0.5mmol) 및 5배 과량의 히드라진 일수화물(monohydrate)을 DMF/에탄올(20mL)에 녹인 후 질소 하에서 12시간동안 실온에서 교반하였다. 용액 안에 프탈릴히드라자이드(phthalylhydrazide)가 형성되어 노르스름해지면 1000Da의 분획분자량(molecular-weight cut off, MWCO)이 있는 투석백(dialysis bag)에 넣고 증류수로 48시간 동안 투석하였다. 증류수는 처음 5시간동안은 매 시간마다 갈아주었고, 마지막에는 수용액을 동결 건조하여 생성물(46%)을 얻었다. 생성물의 NMR 데이터는 다음과 같다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ= 1.29 (m, C(CH₃)₂), 2.07 (s, CH₃), 2.41 (br, CH₂), 2.93 N(CH₂), 3.81 (br, OCH₂), 4.27 (br, OCO(CH₂)), 4.5 (s, OH) ppm.

¹³C NMR (100 MHZ, CDCl₃): δ= 21.6, 24.2, 33.9, 41.9, 46.5, 47.7, 62.6, 69.2, 71.4, 174.5 ppm.

고분자의 수평균 분자량(Mn)은 p(HEMA) 메틸렌 수소(3.81ppm) 및 프탈이미드의 수소(7.5-7.7ppm)의 강도율(intensity ratios)에 의하여 측정되었다. 또한, 반응이 진행되어 일차 아민-말단 p(HEMA)는 3000 cm^-1 근처에서 강한 밴드가 생겼고, 아마이드 카보닐의 흡수띠(1776 cm^-1및 1725 cm^-1)가 사라지며, 7.5-7.7 ppm의 신호(프탈이미드 그룹)가 사라지고, 4.5 ppm(일차 아민)이 생기는 것을 통해 p(HEMA)₄₀-NH₂가 제조되었음을 알 수 있었다.

실시예 5. p(HEMA) ₄₀ - b -p(lys) _n (n = 40, 80, 120, 150) 블록 공중합체의 제조

Z-lys-NCA의 고리열림중합에서 p(HEMA)-NH₂를 대형단량체개시제로 사용하였다. p(HEMA)-NH₂(0.45g, 0.15mmol) 및 지정된 양의 Z-lys-NCA를 두 개의 분리된 플라스크(Schlenk 사)에 담은 DMF에 녹인 후, 질소 하에서 트랜스퍼 니들(transfer needle)을 이용하여 반응시켰다. 반응 혼합물은 5일동안 질소 하에서 실온조건으로 교반하였으며, 그 후 높은 진공상태에서 농축시켰다. 농축된 DMF 용액은 디에틸에테르(diethylether)에서 침전시키고 진공에서 건조시켜서 p(HEMA)₄₀-b-p(Z-lys)_n(n = 40, 80, 120, 150)을 얻었다. 벤질그룹의 탈보호기를 위해, 트리플루오로아세트산 (100mg, 3mL)에 있는 p(HEMA)₄₀-b-p(Z-lys)_n 용액을 플라스크에 가득 채웠다. 그 후, 아세트산에서 33wt%인 HBr 용액을 4배의 몰랄농도 과량으로 첨가하여 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물은 디에틸에테르 안에서 침전되었고, 생성물을 세척한 후 진공건조하여 p(HEMA)₄₀-b-p(lys)_n (n = 40, 80, 120, 150)를 얻었다. 생성물의 NMR 데이터는 다음과 같다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ= 1.29-1.79 (b, nH,CH₂), 2.07 (s, CH₃), 2.41 (br, CH₂), 2.65 ( N(CH₂)), 3.56 (s, CH(CO)), 3.81 (br, O(CH₂)), 4.27 (br, OCO(CH₂)), 4.5 (s, OH), 8.10 (br, NH) ppm.

¹³C NMR (100 MHZ, CDCl₃): δ= 21.3, 24.2, 33.7, 34.5, 42.3, 46.5, 47.7, 62.6, 69.2, 174.5 ppm.

¹H NMR 결과에서, p(HEMA)의 메틸렌 수소(CH₂, δ=3.8)와 리신의 메틸렌 수소(CH₂, δ=1.2-1.8)는 화학적 이동값이 상이하기 때문에, 그 적분값을 통해 분자량을 측정하였다.

p(HEMA)₄₀-b-p(lys) _n 의 제조를 위해 대형단량체 개시제로 사용된 p(HEMA)₄₀-NH₂에 의한 Z-lys-NCA의 고리열림중합의 결과는 하기 표 1에 나타내었다. (조건 : p(HEMA)₄₀-NH₂ = 0.53 g (0.10 mmol), DMF = 10 mL, 온도 = 27℃, 시간 = 72 시간).

이론적인 구성(p(HEMA)₄₀-b-p(lys) _n )		n=40	n=80	n=120	n=150
lys-NCA (mmol)		4	8	12	15
수득(%)		70	64	68	64
Mn ^a (g/mol)	이론적^b	12200	19100	26000	31200
	NMR	11800	17600	25000	29500
	GPC^c	24330	34800	43980	52340
NMR 구성		p(HEMA)₄₀-b-p(lys)₃₈	p(HEMA)₄₀-b-p(lys)₇₁	p(HEMA)₄₀-b-p(lys)₁₁₄	p(HEMA)₄₀-b-p(lys)₁₄₀
PDI ^c		1.16	1.22	1.28	1.34

상기 표 1에서 Mn ^a 는 벤질그룹의 탈보호기 후의 수평균분자량이고, 이론적^b는 이론적인 수평균 분자량(MW) = {([Z-lys-NCA]₀/[p(HEMA)₄₀-NH₂]₀) x (벤질그룹 탈보호화 후의 반복 유닛의 분자량) + (개시제의 분자량)}이며, GPC^c 는 다분산지수(Polydispersity index, 40℃에서 GPC, DMF를 용리제로 사용하여 다분산지수를 측정)이다.

실시예 6. 공중합체/pDNA 복합체의 준비 및 생물물리학적 특성

p(HEMA)₄₀-b-p(lys)_n/pDNA 복합체의 형성에서, 공중합체(5mg/mL)의 스톡 용액 및 pDNA(0.978ng/μL)는 극히 순수한 물에서 준비하였다. 공중합체와 플라스미드는 요구되는 N/P 비율(공중합체 질소/플라스미드 DNA(pDNA)의 인산염)에 의해 적절한 농도로 희석하여 최종 부피를 20μL로 만들었다. 0.22μL 나일론 필터에 걸러진 공중합체와 DNA 용액을 10초간 볼텍싱하여 섞고, 45분동안 실온에서 배양하였다. pDNA를 포함하는 Tris 완충용액(50mM, pH 7.4, 동등한 부피)에 공중합체 용액을 서서히 첨가하여 폴리플렉스를 형성하였고, N/P의 비율은 5에서 40까지 다양하며, 상기 복합체는 사용하기 30분 전에 만들었다. 260nm에서의 흡수는 pDNA의 농도를 결정하기 위하여 사용하였다. p(HEMA)₄₀-b-p(lys) _n /pDNA에 대한 양성 대조군(Positive control)으로 동일한 방법으로 Branched PEI (bPEI)/pDNA 복합체를 준비하여 사용하였다.

실시예 7. 공중합체/pDNA 복합체의 pDNA 결합능력 확인

p(HEMA)₄₀-b-p(lys) _n 의 pDNA 결합능력을 아가로오스 겔 전기영동을 통해 측정하였다. 다양한 p(HEMA)₄₀-b-p(lys) _n /pDNA 복합체를 5 내지 40의 N/P 비율에 따라 준비를 하고, 15분의 배양 후 복합체를 0.5x TBE 완충용액, 1% 아가로오스 겔을 사용하여 80V에서 전기영동 하였다. 그리고 UV 조사기를 통한 pDNA와 DNA 복합체의 상대적인 위치를 비교하였다. 핵산의 염색 시료는 DNA에 결합할 경우 녹색 형광을 띄는 RedSafe 핵산 착색용액을 사용하였다. p(HEMA)₄₀-b-p(lys)_n/pDNA 복합체의 N/P 비율에 따른 겔 지연(gel retardation) 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, p(HEMA)₄₀-b-p(lys)₄₀인 경우(a), p(HEMA)₄₀-b-p(lys)₈₀인 경우(b), p(HEMA)₄₀-b-p(lys)₁₂₀인 경우(c), 또는 p(HEMA)₄₀-b-p(lys)₁₅₀인 경우(d)의 공중합체/pDNA 복합체 모두 N/P 비율이 15에서 40인 경우에는 밴드가 거의 이동하지 않은 것을 확인하였다. 즉, N/P 비율이 15에서 40인 복합체는 공중합체와 pDNA가 잘 결합된 것을 확인하였다.

실시예 8. 공중합체/pDNA 복합체의 입자 크기 및 제타-전위

준비된 폴리플렉스의 크기와 제타 전위(ζ)의 측정은 He-Ne 레이저(633nm)가 장치된 Zetasizer Nanoseries 기기(Malvern Instruments Ltd., UK)를 사용하여 25℃에서 수행되었다. 측정을 위해 각각의 폴리플렉스 용액은 저용량 유리 큐벳(low-volume glass cuvette, ZEN2112, volume: 12μL)에 담았다. 폴리플렉스의 확산 계수(diffusion coefficient)와 다분산성 지수(polydispersity indices)는 누적률 방법(cumulant method)에 의해 결정되었고, 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter)은 Stokes-Einstein equation를 사용하여 계산되었다. 폴리플렉스의 제타-전위는 접이식 모세관 세포(folded capillary cell)를 이용한 동일한 기구를 사용하여 측정되었으며, 제타-전위값은 스몰루쵸우스키 방정식(Smoluchowski equation)에 의해 계산하였다(ζ = 4πηυ/ε 여기서 ζ는 제타-전위, η는 용매의 점성(viscosity), υ는 전기영동이동도(electrophoretic mobility), 그리고 ε는 용매의 유전상수(dielectric constant)). 이의 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, p(HEMA)₄₀-b-p(lys)_n의 입자 크기는 p(lys)의 길이보다는 N/P 비율에 의해 결정됨을 확인하였다. N/P 비율이 20일 때, 폴리플렉스는 150~167nm의 지름을 갖는 반면(a), N/P 비율이 40일 때, p(HEMA)₄₀-b-p(lys)₄₀을 사용한 폴리플렉스는 183nm, p(HEMA)₄₀-b-p(lys)₁₅₀을 사용한 폴리플렉스는 약 200nm의 지름을 갖는 것을 확인하였다(b). 또한 N/P에 따른 제타 전위는, N/P 비율이 20일 때는 25 내지 31mV이며, N/P 비율이 40일 때에는 30 내지 34mV 값을 갖는 것을 확인하였다(c)

실험예 1. 세포 활성(Cell viability)

폴리플렉스의 세포독성은 MTS 에세이를 통해 측정하였다. NIH 3T3 세포주를 5 x 10³ 세포/웰 플레이트 밀도로 10% FBS가 첨가된 DMEM에서 12시간동안 37℃ 조건으로 배양하였다. 배지를 제거하고 세포를 PBS에 세척한 후에 N/P(공중합체 질소/pDNA 인산염) 비율에 따라서, N/P비율 20, 40, 60의 p(HEMA)₄₀-b-p(lys) _n /pDNA 복합체 각각과 음성대조군으로 bPEI/pDNA 복합체를 준비하고, 각각의 복합체를 용액에 6시간동안 37℃ 조건으로 반응시켰다. MTS 시약을 각 웰에 첨가하고, 세포 활성을 550 BioRad 플레이트-리더를 사용하여 490nm의 흡광도를 측정하였다. 각 웰의 세포활성은 양성 대조군(처리하지 않은 세포의 세포 활성)의 값에 대한 백분율 값으로 계산하였다. 각 결과는 5개의 표본의 평균 및 표준편차를 통해 얻었다. 이의 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, N/P 비율 값이 20인 경우는 세포 생존율이 60%이상이고, 40인 경우는 모든 p(HEMA)₄₀-b-p(lys) _n /pDNA가 80% 이상 값을 나타내었다. 따라서, 양이온성 공중합체/pDNA 복합체의 세포활성은 전반적으로 우수한 것을 확인하였고, 다양한 범위의 N/P비율의 p(HEMA)₄₀-b-p(lys) _n /pDNA 모두 음성대조군으로 사용된 bPEI 복합체 보다 현저히 우수한 세포활성을 나타냄을 확인 하였다.

실험예 2. 복합체 주입(Transfection) 에세이

p(HEMA)₄₀-b-p(lys) ₁₅₀ /pDNA 폴리플렉스의 NIH 3T3 세포의 감염 정도를 측정하기 위해 bPEI(25kDa, N/P 비율 = 10) 복합체를 대조군으로 사용하여 복합체 주입 에세이를 수행하였다. NIH 3T3 세포는 24-웰 플레이트에 5 x 10⁴ 세포/웰 밀도로 놓고, 10% FBS를 포함하는 400μL DMEM에서 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 및 습한 대기조건으로, 상기 세포를 70%의 세포 밀집(confluence)에 도달할 때까지 배양하였다. 그리고 20 또는 40 N/P 비율을 갖는 p(HEMA)₄₀-b-p(lys) _n /pDNA 복합체를 배양 플레이트(12-웰)에 넣고 48시간동안 37℃ 조건에서 배양한 후, PBS로 2회 세척하고 리포터(reporter) 용해 완충액으로 수확하였다. 유전자 리포터로는 루시퍼라아제(luciferase)를 사용하였으며, 반응 후 세포의 단백질의 밀리그램(mg) 당 RLU(relative light units)를 구하여 전체 세포의 단백질의 표준화(normalization)를 BCA 에세이 키트를 이용하여 수행하였다. 결과는 4개의 표본의 평균 및 표준편차를 통해 얻었다. 복합체 주입 효율은 N/P 비율이 20일 때 보다 40인 경우가 높았으며, N/P 비율이 40일 때의 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, p(HEMA)₄₀-b-p(lys) _n (N/P 비율 = 40)의 lys 비중이 증가할수록 세포 내 흡수 및 주입 효율이 증가함을 확인하였다.

실험예 3. 폴리플렉스의 세포 내 수송(trafficking)

시험관 내에서 p(HEMA)₄₀-b-p(lys)₁₅₀/pDNA에서 세포 내의 pDNA의 방출을 알아보기 위해서, DNA 염기쌍에 염료의 비를 최소 5:1로 하여 pDNA를 DNA 삽입 염료 BOBO-3으로 표지하였다. 표지된 DNA와 N/P 비율이 40인 p(HEMA)₄₀-b-poly(L-lysine)₁₅₀를 섞은 후, Lab-Tek® 챔버 슬라이드(Chamber Slide)에서 1 x 10⁵ 세포/웰 밀도의 NIH 3T3 세포에 상기 폴리플렉스를 첨가하였다. DMEM을 플레이트에 넣어 총 부피를 1mL가 되도록 한 후 빛이 없는 곳에서 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 PBS로 3회 세척하고, PBS를 제거한 후 핵(nuclei)을 DAPI와 골드 안티페이드(Gold antifade) 시약으로 37℃에서 30분간 염색하였다. 그 후 세포를 다시 PBS로 3회 세척 후 200μL DMEM에서 24시간동안 배양하였다. 그 후에 CLSM(confocal laser scanning microscopy)으로 복합체를 관찰하였다. 이의 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 공중합체/pDNA 복합체를 흡수한 세포는 세포기질(cytosol)에서 붉은 색을 띄게 되기 때문에 폴리플렉스를 처리하지 않은 경우(a-c)와 다르게, 처리를 한 경우(d-f)에서는 핵 안에 pDNA가 존재함을 확인하였다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물을 반복단위로 포함하는 공중합체:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
R은 -(OCH₂CH₂)_aOH, -OCH₃, -NH₂, 및 -NHCH(CH₃)₂로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, a는 1 내지 10의 정수이며, n은 10 내지 1000의 정수이다:
[화학식 2]

상기 화학식 2에서, m은 10 내지 1000의 정수이다.
제 1 항에 있어서,
상기 화학식 1은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물인 공중합체:
[화학식 3]

상기 화학식 3에서, n은 10 내지 1000의 정수이다.
제 1 항에 있어서,
상기 공중합체는 하기 화학식 10으로 표시되는 것인 공중합체:
[화학식 10]

상기 화학식 10에서,
R은 -(OCH₂CH₂)_aOH, -OCH₃, -NH₂, 및 -NHCH(CH₃)₂로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, a는 1 내지 10의 정수이며,
X₁은 F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,
X₂는 -CH₂-, -CH₂CH₂-, CH₂CH₂CH₂-,
, ,
,
및
로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며,
X₃는 -NH₂, -NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -NHCH₂CH₂CH₃, -N(CH₃)_2,-N(CH₂CH₃)₂및 -N(CH₂CH₂CH₃)₂로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,
n₁ 및 n₂는 각각 독립적으로 10 내지 1000의 정수이다.
제 3 항에 있어서,
상기 공중합체는 하기 화학식 11로 표시되는 것인 공중합체:
[화학식 11]

상기 화학식 11에서, n₁ 및 n₂는 각각 독립적으로 10 내지 1000의 정수이다.
제 3 항에 있어서,
상기 공중합체는 하기 화학식 12로 표시되는 것인 공중합체:
[화학식 12]

상기 화학식 12에서, n₁ 및 n₂는 각각 독립적으로 10 내지 1000의 정수이다.
제 3 항에 있어서,
상기 화학식 10의 n₁은 5내지 500의 정수이고, n₂는 10 내지 300의 정수인 공중합체.
제 6 항에 있어서, 상기 공중합체는 블록공중합체인 공중합체.
제 1 항에 따른 공중합체를 포함하는 유전자 전달체.
제 8 항에 있어서,
상기 유전자는 gDNA, cDNA, pDNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인, 유전자 전달체.
제 8 항에 있어서,
상기 유전자 전달체는 공중합체의 질소 / 유전자의 인산염(N/P 비율)이 2 내지 100인, 유전자 전달체.
제 8 항에 있어서,
상기 유전자 전달체는 평균 직경이 50 내지 300nm인, 유전자 전달체.
제 8 항에 있어서,
상기 유전자 전달체는 평균 제타 전위가 15 내지 45mV인, 유전자 전달체.