KR101743959B1 - 고분자 네트워크를 이용한 유전자 전달체 및 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 페닐보론산(phenyboronic acid), 당 및 저분자량 가지형 고분자가 결합되어 형성된 고분자 네트워크를 포함하는 유전자 전달체에 관한 것으로, 생체내에서 안정하게 유지되고 암세포 특이적으로 효율적인 유전자 전달이 가능하여 항암 치료를 위한 유전자 전달체로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

고분자 네트워크를 이용한 유전자 전달체 및 시스템{Gene delivery system using polymer network}
본 발명은 페닐보론산과 고분자 그리고 당에 의하여 형성된 고분자 네트워크를 포함하는 유전자 전달체를 통해 세포내로 유전자를 전달하는 기술이다.
유전자 치료는 다양한 질병 치료를 위하여 기대되고 있는 차세대 치료 기술이나, 효과적인 유전자 전달을 위한 적합한 운반체 등의 개발은 미흡한 실정이다.
최근에는 외부 또는 내부 자극을 이용한 운반체 연구가 활발하게 이루어지고 있으며 이러한 자극 감응성 운반체들은 세포내로 유입 및 새포내에서 엔도좀으로부터 유출되어 목적하는 위치에 유전자 치료를 위한 물질이나 약물을 효과적으로 전달할 수 있을 것으로 기대된다. 예를 들어, 세포내의 산성환경이나 환원조건 등을 통한 내부 자극에 의해 유전자 또는 약물을 포함한 전달체로부터 유전자 또는 약물을 목적하는 위치에 효과적으로 전달하는 기술이 있다.
한국 등록특허 제0466254호는 세포내의 산성조건에 의하여 유전자를 전달할 수 있는 친수성 고분자를 포함한 유전자 전달용 마이셀을 개시하고 있다.
유전자 또는 약물 등의 세포내 도입을 위한 다양한 기술이 개발되고 있으나, 핵산과 같은 유전자 전달 물질을 세포내에서 원하는 위치에 보다 효율적이고 정확하게 전달하기 위한 운반체 및 시스템 개발이 여전히 요구되고 있다.
한국등록특허 제0466254호
본 발명의 목적은 페닐보론산을 포함하는 고분자 네트워크가 형성된 유전자 전달체를 통하여 세포내에서 목적하는 위치에 유전자를 효과적으로 전달할 수 있는 유전자 전달체는 제공하는 것으로서, 특히 암세포에 특이적으로 유전자를 전달할 수 있는 유전자 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명은 페닐보론산(phenyboronic acid), 당 및 저분자량 가지형 고분자가 결합되어 형성된 고분자 네트워크를 포함하는 유전자 전달체를 제공한다.
본 발명은 페닐보론산(phenyboronic acid), 당 및 저분자량 가지형 고분자가 결합되어 형성된 고분자 네트워크를 포함하고 세포내의 산성조건 및 ATP 농도변화에 의하여 유전자를 전달하는 시스템을 제공한다.
본 발명의 유전자 전달체는 세포 내의 도입, 세포 내에서 세포질로의 유출 및 핵을 비롯한 다양한 세포내의 목적 위치에 유전자의 전달까지의 과정을 세포 내 자극 또는 환경변화에 의해 진행하여 유전자를 효과적으로 전달할 수 있다. 이러한 특징은 안전하고 효율적인 유전자 전달 및 다양한 질병치료를 위한 유전자 치료가 가능하며 나아가 유전자외에 세포내 도입이 필요한 약물 등 여러 물질의 운반에도 활용될 수 있다.
도 1은 PBA가 결합된 PEI(PBA-PEI) 및 갈락투론산이 결합된 PEI(Gal-PEI)의 제조방법을 보여준다.
도 2는 PBA가 결합된 PEI(PBA-PEI) 및 갈락투론산이 결합된 PEI(Gal-PEI)의 1H-NMR 결과이다.
도 3은 PBA가 결합된 PEI(PBA-PEI) 및 갈락투론산이 결합된 PEI(Gal-PEI)의 FT-IT 결과이다.
도 4는 PBA가 결합된 PEI(PBA-PEI) 및 갈락투론산이 결합된 PEI(Gal-PEI)의 플루오레사민 어세이 방법(a)) 및 결과(b))이다.
도 5는 정상 상태 형광 소광 어세이(Steady-state fluorescence quenching)를 통한 당과 PBA 사이의 결합 정도를 보여준다.
도 6은 PBA가 결합된 PEI(PBA-PEI) 및 갈락투론산이 결합된 PEI(Gal-PEI)을 혼합하여 형성한 고분자 네트워크(crossPEI)를 보여낸다.
도 7은 겔 투과 크로마토그래피를 통한 고분자 네트워크의 분자량을 보여준다.
도 8은 페닐보론산, 당 및 가지형 저분자량 고분자로 형성된 고분자 네트워크의 안정성을 보여준다.
도 9는 PBA가 결합된 PEI(PBA-PEI), 갈락투론산이 결합된 PEI(Gal-PEI) 및 고분자 네트워크(crossPEI)의 MTT 분석을 통한 세포독성 결과를 보여준다.
도 10은 고분자량 PEI(25kDa), PBA가 결합된 PEI(PBA-PEI), 갈락투론산이 결합된 PEI(Gal-PEI) 및 고분자 네트워크(crossPEI) 각각이 DNA와 결합한 폴리플렉스의 산성 조건(pH 5) 및 ATP 농도에 따른 아가로스 겔 전기영동 결과를 보여준다.
도 11은 고분자 네트워크(crossPEI)가 DNA와 결합한 폴리플렉스에서 pH 및 ATP 농도 변화에 따른 수화부피측정(Hydrodynamic volume) 결과(a))와 고분자량 PEI(25kDa)가 DNA와 결합한 폴리플렉스에서 pH 및 ATP 농도 변화에 따른 수화부피측정(Hydrodynamic volume) 결과(b))를 보여준다.
도 12는 PBA가 결합된 PEI(PBA-PEI), 갈락투론산이 결합된 PEI(Gal-PEI) 및 고분자 네트워크(crossPEI)에 의한 유전자 전달 정도를 보여준다.
도 13은 바필로마이신(bafilomycin, Baf) A1 및 요오도아세트산(iodoacetic acid, IAA)를 처리하였을 때 유전자 전달 정도를 보여준다.
도 14는 PBA-PEG-CrossPEI/DNA 폴리플렉스에서 표면으로 노출되어 있는 PBA에 의한 종양 표적화를 나타낸다.
도 15는 생체내(in-vivo)에서 퍼길레이션된 고분자 네트워크(PEG-CrossPEI)및 퍼길레이션에 의해 페닐보론산이 접합된 고분자 네트워크(PBA- PEG-CrossPEI)에 의한 유전자 전달 정도를 보여준다.
도 16은 유세포 분석을 통해 퍼길레이션된 고분자 네트워크(PEG-CrossPEI), 퍼길레이션에 의해 페닐보론산이 접합된 고분자 네트워크(PBA- PEG-CrossPEI) 및 퍼길레이션에 의해 페닐보론산이 접합된 고분자 네트워크(PBA- PEG-CrossPEI)와 PBA를 함께 처리한 경우 각각의 폴리플렉스의 세포 내 유입 정도를 보여준다.
도 17은 공초점 주사 레이저 현미경 관찰을 통해 퍼길레이션된 고분자 네트워크(PEG-CrossPEI), 퍼길레이션에 의해 페닐보론산이 접합된 고분자 네트워크(PBA- PEG-CrossPEI) 및 퍼길레이션에 의해 페닐보론산이 접합된 고분자 네트워크(PBA- PEG-CrossPEI)와 PBA를 함께 처리한 경우 각각의 폴리플렉스의 세포 내 유입 정도를 나타낸다.
도 18은 생체내(in-vivo)에서 퍼길레이션된 고분자 네트워크(PEG-CrossPEI)및 퍼길레이션에 의해 페닐보론산이 접합된 고분자 네트워크(PBA- PEG-CrossPEI)에 의한 종양 표적화 정도를 보여준다.
도 19는 생체내(in-vivo)에서 퍼길레이션에 의해 페닐보론산이 접합된 고분자 네트워크(PBA- PEG-CrossPEI)에 의한 종양 증식 억제를 보여준다.
도 20은 생체내(in-vivo)에서 퍼길레이션을 통해 페닐보론산이 접합된 고분자 네트워크(PBA- PEG-CrossPEI)에 의한 항혈관신생 유전자 백터의 종양 특이적 전달 결과를 보여준다.
도 21은 퍼길레이션에 의해 페닐보론산이 접합된 고분자 네트워크를 포함하는 유전자 전달체의 구성 및 생체내에서의 유전자 전달 시스템을 나타낸다.
본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 해석되어야 하고, 도면은 과장되거나 발명의 요지를 흐릴 수 있는 부분은 생략될 수 있다.
본 발명은 페닐보론산(phenyboronic acid), 당 및 저분자량 가지형 고분자가 결합되어 형성된 고분자 네트워크를 포함하는 유전자 전달체를 제공한다. 페닐보론산은 당에 있는 시스-다이올과 선택적으로 결합할 수 있어 페닐보론산 및 당이 결합할 수 있는 고분자를 통해 조직화된 고분자 네트워크를 형성할 수 있다.
구체적으로, 페닐보론산이 결합된 저분자량 가지형 고분자와 당이 결합된 저분자량 고분자 각각을 준비한 후, 서로 혼합하여 페닐보론산 및 당을 통해 가지형 고분자가 가교결합되어 고분자 네트워크를 형성된다. 즉, 본 발명의 고분자 네트워크는 페닐보론산과 당이 각각 결합하여 하나의 구성 단위를 이루고, 이들 구성 단위 간에 다중결합을 유도되어 조직화된 고분자 네트워크를 구성하게 되는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 고분자 네트워크는 저분자량 가지형 고분자가 페닐보론산 및 당과 아미드 결합을 이루고, 저분자량 가지형 고분자에 결합된 페닐보론산 및 당이 결합을 이루어 형성될 수 있다.
본 발명에 따르면, 페닐보론산과 당은 페닐보론산과 당의 시스-다이올에 의해 선택적인 결합을 이루고, 산성이나 고농도의 다른 당이 존재하는 환경에서 결합된 페닐보론산과 당이 쉽게 해리되어 당의 농도변화에 의해 결합 및 해리가 조절될 수 있다. 세포내에는 산성 또는 고농도의 다른 당이 존재하는 환경이 형성될 수 있어 페닐보론산과 당의 결합 특징을 이용하여 세포내 자극을 통한 유전자 전달체를 제공할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 고분자 네트워크를 포함한 유전자 전달체는 세포내 자극 감응성 유전자 전달체로서 세포내 자극에 따라 유전자를 전달 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 페닐보론산은 N-아세틸뉴라민산(N-Acetylneuraminic)과 특이적으로 결합하는 성질이 있고, N-아세틸뉴라민산은 특히 암세포 표면에 과발현되기 때문에 페닐보론산을 이용하는 본 발명의 고분자 네트워크를 포함한 유전자 전달체는 암세포 특이적으로 인식하여 결합할 수 있다. 페닐보론산의 특이적 암세포 인식과 페닐보론산과 당의 선택적인 결합 및 해리에 의해 본 발명에 따른 유전자 전달체는 세포내 자극에 감응하여 유전자를 암세포에 전달할 수 있다. 이러한 특이적 유전자 전달은 유전자 치료를 통한 암 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 생체내(in vivo)에서 유전자 전달은 퍼길레이션(PEGylation)된 고분자 네트워크에 페닐보론산을 추가로 접합시킨 고분자 네트워크를 포함하는 유전자 전달체를 사용하는 경우 더 안정적으로 생체내에서 유지되고, 종양 표적화 특성이 더 우수할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포내에서 고농도의 당은 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP)에 해당할 수 있고, ATP 자극의 저해에 의해 유전자 전달 효율이 감소할 수 있다.
본 발명에서 고분자 네트워크를 이루기 위한 고분자는 양이온성 고분자가 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 양이온성 고분자로 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴아미드, 폴리메틸아크릴 아미드, 폴리 L-라이신 또는 키토산을 사용하여 고분자 네트워크를 형성할 수 있다.
본 발명에서 고분자 네트워크를 이루기 위한 고분자는 가지형 고분자(branched polymer)로 저분자량이 바람직하다. 저분자량 가지형 고분자의 분자량은 600 Da 내지 3,000 Da, 1,200 Da 내지 2,000 Da, 바람직하게는 1,500 Da 내지 2,000 Da이나 이에 제한되는 것은 아니다. 저분자량의 가지형 양이온성 고분자는 유전자 전달체가 세포내에서 세포독성을 거의 나타나지 않게 하고, 유전자 전달 효율을 수배에서 수십배 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 저분자량 가지형 고분자는 페닐보론산 및 당과 각각 아미드 결합(amide bond)을 이루어 접합될 수 있다. 저분자량 가지형 고분자가 페닐보론산 및 당과 각각 아미드 결합을 통해 접합하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않으며 고분자나 당의 종류에 따라 결합의 종류는 달라질 수 있다.
본 발명에서 당은 포도당, 과당, 갈락토스, 라이보스 및 만노오즈로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 페닐보론산과 당의 선택적 결합이 해리될 수 있는 산성 조건은 pH 6 이하이며, 바람직하게는 pH 4.5 내지 5.5이나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 세포내 고농도 당의 자극이 ATP인 경우, ATP의 농도가 3mM 이상, 5 mM 이상, 바람직하게는 3 내지 5 mM, 보다 바람직하게는 4.5 내지 5.5mM 일 때 페닐보론산과 당의 선택적 결합이 해리될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 고분자 네트워크를 포함하는 유전자 전달체는 산성 환경 및 ATP 농도 변화에 의한 자극에 의해 유전자 전달 효율이 변할 수 있다. 산성 환경이 형성되고 ATP 농도가 높아 지는 경우 서로 다른 두 자극에 의해 유전자 전달 효율이 현저히 상승될 수 있으나, 산성 환경 또는 ATP 농도 변화 중 어느 하나의 변화에 의해서도 유전자를 효율적으로 전달할 수 있다.
본 발명의 유전자 전달체에서는 고분자 네트워크와 유전자들이 양이온성 고분자와 정전기적으로 상호작용하여 안정화되고, 페닐보론산이 세포 표면의 N-아세틸뉴라민산과 특이적으로 결합하여 세포내로 엔도사이토시스(endocytosis) 등의 기작을 통해 유입될 수 있다.
세포내로 유입된 유전자 전달체는 세포내의 산성 또는 고농도의 당 환경에 의한 자극 감응에하여 유전자를 전달할 수 있다. 예를 들어, 엔도사이토시스에 의해 세포내로 전달된 유전자 전달체는 엔도좀 내부의 산성 환경에 의해 고분자네트워크에 결합되어 있던 페닐보론산 및 당의 해리가 일어나게 된다. 이후, 엔도좀의 파괴에 따라 해리가 일어나던 고분자네트워크는 세포질로 이동하고 세포질의 고농도 ATP에 의해 해리가 더욱 촉진되어 유전자를 전달하게 된다. 이때, 페닐보론산은 암세포 표면에 발현된 N-아세틸뉴라민산과 결합할 수 있어, 특히 암세포에 특이적으로 유전자를 전달할 수 있다.
본 발명의 유전자 전달체를 제조하는 방법은, 페닐보론산이 결합된 저분자량 가지형 고분자 및 당이 결합된 저분자량 가지형 고분자를 준비하는 단계, 페닐보론산이 결합된 저분자량 가지형 고분자 및 당이 결합된 저분자량 가지형 고분자를 염기성 조건에서 혼합하여 고분자 네트워크를 형성하는 단계 및 저분자량의 화합물 제거하여 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, 생체내에서 사용하기에 적합한 유전자 전달체를 제조하는 방법은 고분자 네트워크를 형성한 후 퍼길레이션하는 단계 및 페닐보론산을 추가로 접합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하에서 본 발명을 실시하기 위해 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 예시에 해당하며 발명의 내용이 실시예에 의하여 한정되어 해석되는 것은 아니다.
실시예 1. 고분자 네트워크의 제조
1-1. 페닐보론산 또는 갈락투론산이 접합된 폴리에틸렌이민 합성
양이온성 고분자인 가지형 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine, PEI), 당을 접합하기 위한 갈락투론산(Galacturonic acid, GA) 및 페닐보론산을 접합하기 위한 PBA(3-fluoro-4-carboxyphenylboronic acid)를 준비하였다. PEI(100mg, 1.8kDa)을 탈이온수에 녹이고 pH를 7.4로 조절하였다. 갈락투론산 및 PBA를 각각 5당량씩 탈이온수에 녹인후, 30 당량 EDC(1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)propyl) carbodiimide hydrochloride) 및 NHS를 저어주면서 용해시켰다. 30분 후, PEI 용액을 각각 갈락투론산 용액 및 PBA 용액에 적가(dropwise)하고 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응 후 셀룰로오스 막 투석 주머니(MWCO=1,000Da)를 사용하여 각각의 용액에서 반응하지 않은 물질을 이틀간 물로 투석하여 제거하여 PBA가 결합된 PEI(PBA-PEI) 및 갈락투론산이 결합된 PEI(Gal-PEI)을 수득하였다(도 1). 1H-NMR 및 FT-IR(Fourier Transform Infrared) 스펙트라는 PEI가 성공적으로 당 및 PBA와 결합되었음을 나타낸다(도 2 및 3). PBA가 결합된 PEI(PBA-PEI) 및 갈락투론산이 결합된 PEI(Gal-PEI)는 플루오레사민 어세이(fluorescamine assay)를 통한 일차 아민양으로부터 역적정하여 확인하였다(도 4). 당과 PBA 사이의 결합은 정상 상태 형광 소광 어세이(Steady-state fluorescence quenching)로 확인하였다(도 5).
1-2. 페닐보론산 , 당 및 가지형 폴리에틸렌이민의 결합에 의한 고분자 네트워크의 제조
Gal-PEI 용액(10mg/mL)을 PBA-PEI 용액(10mg/ml)에 혼합시키고 하룻밤 교반하여 반응시켰다. 반응 용액은 트리스-아세테이트 버퍼하에(pH 8.2, 0.3M NaCl 첨가) 막 원심분리(MWCO = 3000 Da, 4000 rpm)를 20분간 5회 실시하여 정제하여 고분자 네트워크(crossPEI)를 형성하였다(도 6). 고분자 네트워크 분자량은 젤 투과 크로마토그래피 GPC(Gel permeation chromatography)를 통해 분자량을 확인하였고, 1.8kDa 폴리에틸렌이민과 2.5kDa 폴리에틸렌이민 사이에서 검출되어 저분자량의 고분자 네트워크 형성을 확인하였다(도 7). 폴리에틸렌아민이 가교된 양은 아세트산구리(copper acetate, CuOAc) 아민 정량 어세이로 확인하였다. Gal-PEI 및 PBA-PEI 간의 결합에 의해 형성된 고분자 네트워크는 갈락토오즈의 다이올 잔기 및 PBA의 다중 결합에 의해, PBA 또는 갈락토오즈가 없거나 PEI에 의한 가교가 형성되지 않은 경우 보다 30배 이상의 Ka 값을 나타낼 정도로 안정하였다(도 8).
1-3. 세포독성 확인
세포독성 확인을 위해 MCF-7(인간 유방 선암 세포주) 및 PC-3(인간 전립선암 세포주)를 RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute, Hyclone) 배지에서 배양하여 준비하고, HeLa(인간 자궁경부암 세포주)는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Hyclone) 배지에서 배양하여 준비하였다. 각각의 세포에 DNA(0.2㎍/well)이 포함된 고분자 네트워크(crossPEI)를 처리하고 세포 독성 확인을 위해 MTT 어세이를 수행하였다. MTT 어세이 수행 결과, 고분자 네트워크 자체의 세포 독성이 나타나지 않았고, 고분자 네트워크는 DNA를 방출하면서 낮은 독성을 가지는 가지형 저분자 PEI(1.8kDa), Gal-PEI 및 PBA-PEI로 분해되기 때문 세포 독성은 거의 나타나지 않았다(도 9).
실시예 2. 자극에 의한 고분자 네트워크에 결합된 DNA의 방출효율 확인
다양한 N/P 비의 겔 리타데이션(gel retardation) 어세이를 통해 PBA가 결합된 PEI(PBA-PEI), 갈락투론산이 결합된 PEI(Gal-PEI) 및 고분자 네트워크(CrossPEI) 각각이 DNA 결합되는 것을 확인하였다. CrossPEI는 높은 전하 밀도를 가져 Gal-PEI 또는 PBA-PEI 보다 더 강하게 DNA와 결합하였고, 낮은 pH 와 높은 ATP 농도의 자극에서 Gal-PEI 또는 PBA-PEI 로 분해되면서 DNA 방출이 촉진되었다. 이러한 현상은 DNA와 가교된 PEI의 폴리플렉스를 산성 pH 또는 5Mm ATP에서 인큐베이션한 후, 1% 아가로스 겔 전기영동으로 통해 확인할 수 있었다(도 10 및 도 11). Gal-PEI, PBA-PEI 또는 25k PEI와 DNA가 결합된 경우 산성 또는 세포내 ATP 농도 자극에서 DNA 방출이 거의 일어나지 않았으며, 고분자 네트워크로부터 효과적인 DNA 방출은 산성 pH 또는 세포내 ATP 농도로 확인되었다.
실시예 3. 고분자 네트워크에 의한 유전자전달 확인
고분자 네크워크에 의한 유전형질주입(gene transfection)을 평가하기 위해 MCF-7, HeLa 및 PC-3 세포에서 루시페라아제 리포터 유전자 어세이(luciferase gene reporter assay)를 수행하였다. 각각의 세포를 24-웰 배양 플레이트에 3x104 세포/웰 밀도로 분주하고, 동일 조건에서 하루 배양하였다. 2.5kDa PEI, 1.8kDa PEI, Gal-PEI, PBA-PEI 및 고분자 네트워크(CrossPEI) 각각에 다양한 N/P 비율로 DNA(1㎍/well)를 첨가하여 DNA가 포함된 서로 다른 폴리플렉스(polyplex)를 준비하였으며, 폴리플렉스의 최종 부피는 20㎕로 하였다. 각각의 세포를 폴리플렉스 가 포함된 200㎕ 무혈청 배지에서 2시간 배양한 후, 배지를 9% 혈청 포함 배지 500㎕로 교체하여 22시간 더 배양하였다. 이 후 세포를 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline) 버퍼로 세척하고 라이시스 버퍼(lysis buffer)로 용해시켰다. 루시페라아제 리포터 유전자의 발현을 마이크로플레이트 분광형광계(VICTOR 3 V Multilabel Counter, PerkinElmer, Wellesley, MA)로 측정하였다. 형질주입 효율은 낮은 전하 밀도 때문에 1.8k PEI 및 Gal-PEI에서 낮게 나타났고, PBA-PEI는 1.8k PEI 보다 높게 나타났다. PBA-PEI 및 Gal-PEI와 비교하였을 때 고분자 네트워크는 모든 세포주에서 높은 유전형질주입 효과가 나타났다(도 12). 이러한 효과는 PBA-PEI 및 Gal-PEI가 가교되어 형성된 고분자 네트워크가 높은 전하 밀도를 가져 DNA를 포함한 조밀한 폴리플렉스를 형성할 수 있고, 산성 pH와 세포내 ATP 농도에 따른 자극에 의해 고분자 네트워크가 분해되면서 DNA를 효율적으로 방출하기 때문인 것으로 확인되었다. 추가적으로, 폴리플렉스의 유전자 전달 메커니즘을 구체적으로 확인하기 위해 MCF-7 세포를 바필로마이신(bafilomycin) A1으로 전처리하여 폴리플렉스의 엔도사이토시스 동안 엔도좀의 산성화를 억제하였고, 세포내에서 ATP 생성을 억제하기 위해 ATP 블록커로 요오도아세트산(iodoacetic acid)을 전처리하여 형질 주입 결과를 확인하였다(도 13). 그 결과, 유전자 전달 메커니즘은 산성 환경 및 세포내 ATP 농도 변화에 의한 것임을 확인하였다.
실시예 4. 고분자 네트워크를 포함한 유전자 전달체를 이용한 유전자 전달 확인
암세포 특이적 유전자 확인을 위해 고분자 네트워크에 추가적으로 폴리에틸렌글리콜을 접합한 후, 이 말단에 페닐보론산을 접합된 고분자 네트워크를 포함한 유전자 전달체를 제조하였다. 구체적으로, 퍼길레이션(PEGylation)을 위해 6-암 PEG-SS(6-arm polyethylene glycol succimidyl succinate)를 고분자 네트워크와 혼합시켰고, 혼합할 때 숙시미딜 숙시네이트 대 PEI의 아민 비가 1:5가 되도록 혼합시켜 PEG가 접합된 고분자 네트워크(PEG-CrossPEI)를 얻었다. PEG가 접합된 고분자 네트워크에 PBA를 접합하기 위해 3당량 3-아미노페닐보론산(3-aminophenylboronic acid)를 첨가하였다. 이 후, 막 원심분리(MWCO=10 kDa, 4000 rpm)를 20분간 5회 실시하여 정제된 최종 산물로 고분자 네트워크를 포함한 유전자 전달체(PBA-PEG-CrossPEI)를 얻었다.
PBA-PEG-CrossPEI와 DNA가 결합된 폴리플렉스인 PBA-PEG-CrossPEI/DNA를 준비하였다. PBA-PEG-CrossPEI/DNA 폴리플렉스는 혈액의 글루코스 레벨인 5mM 글루코스 농도에서 안정적으로 유지되었고, PBA-PEG-CrossPEI/DNA 폴리플렉스에서 PBA는 폴리플렉스의 표면으로 노출되어 표적화 모이어티(moiety)로 기능하였다(도 14). 루시페라아제 리포터 유전자 어세이를 통해 in vitro에서는 PBA-PEG-CrossPEI/DNA 폴리플렉스가 PEI 25k보다 효율적인 형질주입이 되는 것을 확인하였고, 고분자 네트워크(crossPEI)만을 사용하는 경우보다는 낮은 효율로 형질주입이 되는 것을 확인하였다. 그러나, in vivo 에서는 퍼길레이션(PEGylation)된 경우 고분자 네트워크만을 사용한보다 혈액에서 오래 유지되고 더 좋은 표적화 기능을 나타내었을 뿐만 아니라, PBA-PEG-CrossPEI가 PEG-CrossPEI 보다 3배 더 높은 형질주입 효율을 나타내었다(도 15). 폴리플렉스의 세포 섭취 확인을 위해 FNR-648 라벨링된 PBA-PEG-CrossPEI/DNA와 PEG-CrossPEI/DNA를 준비하고, 무혈청 RPMI에서 MCF-7 세포에 처리하여 배양하였다. 이 후, 세포 내로 유입된 양을 FACS Calibur(Becton Dickinson 및 BD Cell Quest software(Becton Dickinson))을 이용한 유세포 분석(flow cytometery analysis)을 통해 확인하였다(도 16). PBA-PEG-CrossPEI를 사용한 경우 PEG-CrossPEI에 비해 효율적으로 세포 내로 유입되는 것을 확인하였고, 이는 PBA가 세포막과 강한 결합을 형성하기 때문이었다. 또한, PBA만을 전처리 한 경우 세포 내로 유입되는 효율이 감소된 것을 통해, PBA-PEG-CrossPEI에서 PBA 모이어티가 세포 내 유입을 조절하는 것을 확인하였다. 마지막으로, 공초점 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy)을 통해 PBA를 포함한 폴리머의 세포 내 유입 정도를 확인하였다. 우선, MCF-7 세포를 12-웰 배양 플레이트에 3x104 세포/웰 밀도로 분주하고 하루 배양하였다. 다음으로 웰당 1㎍ DNA를 포함한 PBA-PEG-CrossPEI 및 PEG-CrossPEI 폴리플렉스를 처리하고 무혈청 RPMI에서 2시간 배양하였다. 차가운 DPBS를 첨가하여 세포 흡수 시킨 후 세포 세척 및 4% 파라포름알데하이드로 하루동안 고정시켰다. 고정 후, DAPI를 포함한 봉입제(mounting medium)를 처리하여 커버슬라이드 위의 세포를 봉입하고, 공초점 주사 레이저 현미경으로 관찰하였다(도 17). PBA-PEG-CrossPEI에 의한 형질 주입의 경우 PEG-CrossPEI 및 PBA를 전처리하고 PBA-PEG-CrossPEI를 처리한 경우보다 더 강하고 고른 형광 신호가 관찰되었다.
실시예 5. In vivo 에서 종양 표적화 확인
In vivo에서 종양 표적화 확인을 위해 MCF-7 세포를 이식하여 종양이 형성된 마우스(MCF-xenografed mice)를 이용하였다. 임의적으로 선택된 마우스 3마리당 1그룹으로 하여 3그룹을 준비한 후, 생리식염수, PBA-PEG-CrossPEI/DNA 폴리플렉스 및 PEG-CrossPEI/DNA 폴리플렉스를 정맥 주사하였다. 6 시간 후, 마우스를 안락사 시키고 각 기관의 형광을 IVIS Spectrum(caliper lifesciences, Hopkinston, MA)으로 확인 및 분석하였다(도 18). 분석결과 PBA-PEG-CrossPEI/DNA 폴리플렉스가 PEG-CrossPEI/DNA 폴리플렉스보다 두 배 이상 종양에서 축적되는 것을 통해 PBA 개질화된 폴리플렉스는 효과적으로 종양을 표적화 할 수 있음을 확인하였다. In vitro에서와 달리 in vivo 에서는 글루코스와 같이 PBA 모이어티에 결합할 수 있는 다른 물질이 있음에도 불구하고, 종양 부분의 산성 조건에 의해 PBA 모이어티에 결합할 수 있는 다른 물질의 결합 친화성이 떨어져 PBA-PEG-CrossPEI/DNA 폴리플렉스가 종양 세포에 선택적으로 결합 및 세포내재화 될 수 있었다.
실시예 6. In vivo 항암 치료 효과 확인
In vivo에서 항암 치료 효과 확인을 위해 CT-26 세포를 이식하여 종양이 형성된 마우스와 신생혈관 억제를 위해 VEGF 수용체의 수용성 부분을 코딩하는 sFit-1 pDNA를 이용하였다. 임의적으로 선택된 마우스 5마리당 1그룹으로 하여 5그룹을 준비한 후, 생리식염수, sFit-1 pDNA, PBA-PEG-CrossPEI/sFit-1 pDNA 폴리플렉스, PBA-PEG-CrossPEI/LUC pDNA 및 PEG-CrossPEI/sFit-1 pDNA 폴리플렉스를 마우스당 40㎍ DNA가 주입되도록 7일 마다 정맥 주사하였다. 종양 크기 변화는 2일 마다 전자 캘리퍼로 측정하였다(도 19). PBA-PEG-CrossPEI/sFit-1 pDNA 폴리플렉스 및 PEG-CrossPEI/sFit-1 pDNA를 주사한 쥐에서는 7일째부터 종양 증식이 느리게 진행되었으나, 다른 쥐에서는 빠른 종양 증식이 확인되었다. 그리고, 면역 화학 염색을 통한 종양 조직 분석을 위해 각 그룹의 마우스로부터 종양 조직을 채취하여 파라핀 고정하고 CD31 항체를 처리한 후 2차 항체로 FITC-라벨된 Anti-goat 항체를 처리하여 공초점 주사 전자 현미경으로 확인하였다(도 20). PBA-PEG-CrossPEI/sFit-1 pDNA 폴리플렉스를 주사한 마우스 그룹에서 CD31 염색 강도는 약하게 나타났으나 다른 마우스 그룹에서는 강한게 나타났다. 이러한 결과를 통해 항혈관신생 유전자 벡터가 종양 특이적으로 표적화되어 전달되었고, 암 치료를 위한 전달체로 응용될 수 있음을 확인하였다.

Claims (9)

  1. 페닐보론산이 아미드 결합으로 결합된 폴리에틸렌이민 및 당이 아미드 결합으로 결합된 폴리에틸렌이민을 포함하고,
    상기 페닐보론산이 상기 당의 다이올과 선택적으로 결합하여 형성된 보론산 에스터(boronate ester) 결합을 통해 고분자 네트워크를 형성하며,
    세포 내의 산성 조건 및 ATP 농도변화에 의한 유전자 전달을 특징으로 하는 유전자 전달체.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 페닐보론산은 암세포 표면에 과발현된 N-아세틸뉴라민산(N-Acetylneuraminic)과 결합하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 당은 포도당, 과당, 갈락토스 및 만노오즈로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 유전자 전달체.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌이민은 1.2kDa 내지 2.0kDa인 유전자 전달체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 산성조건은 pH가 4.5 내지 5.5 인 유전자 전달체.
  9. 제1항에 있어서,
    ATP 농도 변화는 3mM 이상인 유전자 전달체.
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