CA2231064A1 - Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'acides nucleiques et ses utilisations - Google Patents
Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'acides nucleiques et ses utilisations Download PDFInfo
- Publication number
- CA2231064A1 CA2231064A1 CA002231064A CA2231064A CA2231064A1 CA 2231064 A1 CA2231064 A1 CA 2231064A1 CA 002231064 A CA002231064 A CA 002231064A CA 2231064 A CA2231064 A CA 2231064A CA 2231064 A1 CA2231064 A1 CA 2231064A1
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- pharmaceutical composition
- composition according
- nucleic acid
- transfection
- compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Abandoned
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La présente invention concerne une composition pharmaceutique utile pour la transfection d'un acide nucléique caractérisée en ce qu'elle contient outre ledit acide nucléique et au moins un agent de transfection, au moins un composé associant des propriétés de fixation de l'ADN à une capacité de vectorisation nucléaire de cet ADN, ce dernier appartenant de préférence à la famille des protéines HMG ("High mobility group"). Elle se rapporte en outre à l'utilisation de ladite composition pour le transfert in vitro, ex vivo et/ou in vivo d'acides nucléiques.
Description
W O 97/120Sl PCTn~R96/01516 COMPOSIT~ON PHAT~MACF.UTIQUF Ul~ F POUR LA
TR~NSF F.CTION D'ACIDES NUCT FTQUES ET SES UT~T T~TIONS
La pré~..le invention con~rn~ le ~lo~ e de la thérapie génique et ~inLe~e plus partic~ au L~dl~rell in vitro, ex vivo et/ou in vivo du m~t~f~]
5 génétique. Elle propose n..L~ une nouvelle cu,.,~silion pl-A....A.ei-~;que utile pour L ~rwL~r ~ . ~.n~ des C~ Elle se ~al.~po~le e~l/?m~nt aux ~Iti1;.~ ;nn.
de cette conlposiLion.
Des ~iefi~ nr~ et/ou ~nnm~lif~ (mnt~tinn, ~A~ ion ~l~..,.nl~, etc) chrnmosnmirl~les sont à l'origine de nom~reuses m~ s, à caractère héréditaire ou10 non. Pendant longt~mrs~ la ...~lf-f~;..e co,lv~ ;nnnf~lle est dt~ eul~ce ;~r~ e à leur égard. Aujourd'hui, avec le dévelop~,.,t:"l de la thérapie gPni~le on espère pOuvol-déso..-.~i~ corriger ou pl~ven ce type d'~ til~n cl~ru.... ~ ue. Cette nouvelle m~ii-~ti~)n c~ c~ ~ à ull~ dui~e une ..,~ n génétique, dans la cellule ou l'organe affecté, en vu de corri~r cette ~IPfiri~n~e ou ~nnm~ ou encore, d'y ~i"~er une 15 protéine d'intérêt thf3...pei.l;que.
L'obst~cle majeur à la pé~L,~lion d'un acide ml~ q~le dans une cellule ou un organe cible, repose sur la taille et la nature polyanionique de cet acide nucléique qui s'o~>po~enl à son passage à travers les membranes c~ ires.
Pour lever cette ~liff~ lté~ diverses techniques sont aujourd'hui ~naposées 20 dont plus particuli~:-e-,*-,~ la L.~r~Lion d'ADN nu à travers la membrane plasmique in vivo(WO90/11092) et la transfection d'ADN via un vecteur de transfection.
En ce qui con~e~ ne, la transfection d'ADN nu, son ~ffica~ite~ demeure encûre très faible. Les acides m~ iq1l~c nus pt~ nt une derni vie pl~m~hque courte en raison de leur dégradation par les ~y--~s et de leur ~limin~hon par les voies 25 u~ai~es.
Pour ce qui est de la seconde technique, elle propose prinr1p~lem~?nt deux ~ stratégies:
La première met en oeuvre les vecteurs de transfection naturels que sont les virus. Il est ainsi propûsé d'utiliser les adénovirus, les herpès virus, les .~LIVviluS et plus 30 réCç~-----~nl les virus adéno associés. Ces vecteurs :j'av~-e~t ~ru-l--~-LS sur le plan de W O 97/12051 PCTA~R96/01516 la ~ r~l;~ n mais on ne peut mAlh~ ..~.nt~.ll exclure totAl~m~nt à leur égard certains risques de pathogénicité, r~p1ic~ti~n et/ou irnmlm~ onicit~, inhérents à leur nature virale.
La seconde strat~gie csn.~;~L~ avAnt~r- -~. . .~ à utiliser des agents n~ viraux5 ~'~p~hl~ de promouvoir le ~ L~ et l'~ion d'ADN dans des oellules euc~ y~Les.
L'o~et de la p~se ,l~ illvel~Lioll s'inscrit plus particulièlt:-~-e ~L dans cette secon~e stratégie.
Les v~;~eu.~ c~imiques ou hisrhimiqll~s ~t:p~ une alle~ndlive 10 avAnt~ ee aux virus naturels en particulier pour cette ~h~nc e de réponse immlm~lo~ e et/ou reco...l~ A;~n virale. Ils ne possèdent pas de pouvoir pAthogf~n~, le risque de mllltip~ tion de rADN au sein de ces vecteurs est nul et il ne leur est attaché aucune limite théorique en ce qui c--n~ f~rnç la taille de rADN à
transfecter.
Ces vecteurs ~y~lL~iques ont deux fonctions ~;.. ';p~l~, c~n~i~n~r l'ADN à
transfecter et promouvoir sa fixation oelllll~ire ainsi que ssn passage à travers la membrane plasmique et, le cas é~h~nt les deux m~mhr~nee nll~ ires.
De part sa nature poly~nioni~ç, rADN n'a natur~llçm~nt aucune affinité pour la membrane r1~mi~ e des oellules de nature ég~ m~nt polyanionique. Pour pallier à
20 cet inconvénient, les vecteurs non viraux p-).eeè-l~nt génér~lPm~nt tous des charges polycationiques.
Parmi les vecL~ y--lll~iques développés, les polymères cationiques de type polylysine et DEAE dextran ou encore les lipides c~ti~niql1çe ou lipofectants sont les plus avantageux ns p~)e.ee~l~nt la propriété de con-1~neçr l'ADN et de promouvoir son 25 association avec la membrane coelllll~ire. Plus récemm~nt il a été développé le concept de la transfection ciblée, médiée par un récepteur. Cette tech~ique met à profit le principe de con~ne~r l'ADN, grâce au polymère c~ti~)niflue~ tout en dirigeant lafixation du complexe à la membrane à l'aide d'un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type30 oe~ ire que l'on veut greffer. Les criblages du récepteur à la lLdl~r~llille, à l'insuline ou du récepteur des asialo~lycol?lo~ es des hépatocytes ont ainsi été décrits.
- =
W O 97/12051 PCTA~R96/01516 Touler~,is, les ve~;le~ Jes proposés aujou.~llli sont encore loin d'être aussi pelr~,....,-..lx que les vecteurs viraux. Ceci peut ~l~J~ nt être la conséquence d'une c~)nf~n~tiC~n ~ rr;.~e de l'ADN à tranfecter et/ou des riiffi~llt~s rencontrées par l'ADN ~ansfecté pour sor~r de l'~n~ Qme et pél~éL~ n~ le noyau 5 c~ ire. En effet, le transport d'ADN dans le noyau d'une cellule eucaryote au repos pose un problème évident puis~le les liimPn~;~ n~ des pores nllrl~ireS ne pçrmett~nt que la diffusion de protéines de poids molé~ ire illÇeliel,r à 60 OOODa. (I. Davis et al., Ann. Rev. Riorh~m 1995; 64; 865-896). Un ADN pl~miriique possédant un poidsmf~lé~ll~ire s l~ri~lr à 106 ne peut donc natur?~ mf~nt pénétrer dans le noyau 10 c~ ire par simple diffusion.
La présente illv~3l1ioll a préri~çm~nt pour objectif de proposer une solution av~nt~gn~ au problème précité.
Plus ~ér:~ . ~ .~nt la présente illv~lliun propose une composition pharm~ e~ti~e utile pour la h~r~;Lion d'au moins un acide nucléique caractérisée en 15 ce qu'eUe cnnhent outre ledit acide mlrl~iq~e et au moins un agent de L-~l~t~Lion, au moins un composé ~ nt des propriétés de fixation de l'ADN à une c~p~cité de ve~ m m-r.lé~ire de cet ADN.
Au sens de l'invention, un composé p~ éA~nt des propriétés de fixation de l'ADN, couvre tout composé capable de se fixer au moins parti~ m~nt à l'ADN à
20 vectoriser. En ce qui concerne plus particuli~lelllellL son aptitude à vectoriser cet ADN, elle se traduit au sens de l'invention par une efficacité à diriger cet ADNqr~m~nt à travers les difré ~ es membranes ~~ ires et/ou m1rlé~ires pour le conduire j~qu'au sein du noyau de la cellule à traiter. Le composé selon l'invention peut ég~l~mrnt se présenter par exemple sous l'aspect d'une m~lerl~l~ chimère 25 ~ nt un domaine de fixation à l'ADN, à un domaine permettant l'import mlrle~ire.
Dans ce cas particulier, on peut sélectinnner parmi des ~om~in~ de fixation à l'ADN, ceux issus de protéines régulatrices capables de se lier par exemple à des séquences spécifiques ou au contraire de protéines connues pour posséder une affinité non séquence dépendante pour l'ADN. En ce qui concerne plus particulièrement le 30 domaine impliqué dans l'import m~ ire, il peut être par exemple figuré par une WO 97/12051 PCTA~R96/01516 séquence dites nls (Nuclear k r~li~ti~ n Sequence). De telles séqll~nces pOuLlo-lL être a~p&~ Lées ou dérivées au c ~ bil)A-~iL~ déduit de la n~ 4O~ mine ou au cr-n~.qn~ de l'~nt f~ne T de SV40.
Selon un mode de ré~li~ti. n particulier, rinvention cn.-~ une composition 5 ~ . ..-P~el)tiqtle utile pour la L,~ .;Lion d'au moins un acide nucléique c~rarPri~e en ce qu'elle con~ outre ledit acide mt~ t~e et au moins un agent de transfection, au moins un cc.. ~ ~po~ al~parLel~ à la famille des HMG ou l'un de ses dérivés.
Les protéines de type HMG, pour "Hign Mobility Group" sont des protéines riches en acides aminés c~argés et p( .~ér1~nt une masse molé~-l~ire inférieure à 30000 10 Da. Solubles dans l'acide perchlorique 2-5~, elles sont classiqu~m~nt ~xLLailes de la dlL~...nl;nepar0,35 MNaCl.
Cla~iqu~....~.-~ on ~ hn~-e 3 f~mill~s de protéines HMG: les protéines de type HMGl/2 de masse molé~ re voisine de 25000, HMG14/17 de masse mr~lé~l-lAire voisine de 10-12000, et HMGI/Y de composition voisine des protéines de 15 type HMG14/17 mais dont la l~alLiLion tissulaire et au cours de l'ontogénèse est di~r~l~llL~. On sait que la séquence prilnA r~ des protéines est conservée au cours de l'évolution au sein de çhA~lm~ de ces trois f~mill~
En ce qui c-)ncefne plus particulièrement les protéines de la famille HMGl/2, elles se caractérisent par la présence d'une séquence de 80 acides aminés à
20 pré~o.~ AIl~ e basique (charge nette +20), dite "boîte HMG", qui c-)n~titl1e un rl~)m~in~ de liaison à rADN. Dans cette famille on distingue les protéines r~p~hl-~ de se lier à des séquences spécifiques de l'ADN double brin et les protéines dont la spe~ificité de liaison réside dans une stucture ~-lim~n~ionn~lle particulière de l'ADN.
Dans la ~lellli~r~ catégorie on trouve les protéines, UBF, SRY, TCFl, ABF2, qui 25 stiml-l~nt la transcription de gènes spécifiques (Greiss E.A. et al. J. Mol. Evol. (1993) 37:204-210). La séquence de ~hA-~lm.o de ces protéines contient une ou plusieurs"boites HMG". La deuxième catégorie est représentée par les protéines HMGl et HMG2. Leur séquence primaire est caractérisée par la présence de deux "boites W O 97~12051 PCTn~R96/01516 HMG" et d'une séquence acide en C-tf~rminAl (Bustin M. B.B.A. (1990~ 1049:231-243). Ces protéines se lient de facon s~ifi~e sur les séquences d'ADN
pali~ iq -~s e~c~udées en structure f~ lciÇfJ~ e (appariement in1rAhrin au niveau du pal.ncl~ll.e) ou sur les séquences d'ADN qui p ~sf~ .l une forte coul~u~e. Ces deux types de structure ont en co.. l-- d'élargir le petit sillon de l'ADN qui devient alors capable d~arcnm~ylf~ la liaison des ploléil-es de type HMGI/2. Le rôle phy~if~logiq~le des pr~éincs HMGl et HMG2 est à ce jour peu élucidé. Il a ~ rois été montré que la protéine HMGl de veau est ~ ée de n~ active dans le noyau des oellulesde ..~ r~es. (L. Kuehl e~ al; J. Biol. Chem. 1985; 260, 10361-10368).
10De Il~ iel~ inAttf~n~llle~ la DrmA-~le.~se a mis en évidence qu'il était possible de mettre à profit ces f~A~-Ttf~s des protéines HMG, à savoir leurs Artit-.~lf~s à fixer l'ADN et à être ~anspol~ées de Ill~licr~ active dans le noyau, pour promouvoir f~ffi~ Aoe.~ la transfection dans le noyau de cellules à traiter de séquences nucléiques hétérologues, A5.59rie~,5 à au moins un agent tran~fe~;~,~.
15Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne tout peptide, pseudopeptide (peptide incorpor_nt des Pl~mf~nt.s non biochimiques) ou protéine dirfé a-l~ du composé tel que défini prece~lPmmfr~nt obtenu par une ou p~ rs mn lificAtinns de nature génétique et/ou chimique. P_r mn~lifirAtion de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutAtic)n, s~hstittltion~ délétion, 20 A(1flitjnn et/ou molific~Aton d'un ou plusieurs résidus par exemple de la protéine cnn~i~erée. Plus pre-~isPm~n~ par morlifi~Ation chimique, on entend toute mc~ifirAtif)n du peptide ou protéine générée p_r réaction chimique ou par greffage rhimiqlle de molécule(s), biologique(s) ou non, sur un nombre qu~lcnnfl~le de résidus de la protéine. Par modification génétique, on entend toute séquence peptidique dont l'ADN
25 hybride avec ces séq~lellces ou des fnA~n~nt.s de celles-ci et dont le produit possède les activités in~ éf,~s De tels dérivés peuvent être générés dans des buts Lffé~ ~, tels que notAmm~nt celui d'~Al~ f l' ffinité du polypeptide correspondant pour son ligand d'ADN, oelui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'Allgmtont~r sa ~rPsi~Anre à des protéases, celui d'Angl~ Pl et/ou de modifier l'une de ses activités, 30 ou celui de lui conf~ ~r de nouvelles propriétés ph~rmzlcocinétiques et/ou biologiques.
Parmi les dérivés r~slllt~nt d'une a~ ;ml~ on peut citer par I .~...pl~ les s~ nr~?
pepti~ t-e,s ~ ~s comportant une partie hétérologue s~rple~.~e~ln;~ liée à une lliLé. Le terme dérivé ccl~ d e~ll?ment les ~q~ re~ protéiques hr~molo~l.?
à la ~quellce cnn~ rée, issues d'autres sources ce1~ ires et n~ de oellules 6 d'origine htlm~in~, ou d'autres o~ ;s...~s, et ~s~ une activité du même type. De telles séquences h~mo1cl~1e~s peuven~ être oblP.~ par des ~ ?. ;~rt?S d~yhr~ tif)n de l'ADN cc,..es~ndiant. Les hykri~ t nn~ peuv~ être r~li~ à partir de banques d'acides nucléiques, en l~ti1i~nt comme sonde la seq~ nre native ou un f~grnl?nt de oelle-ci, dans des cnn-litinn~ de stringence c~ /ellLinnnfe1lf~ (Maniatis et al.), (Cf 10 techniques générales de biologie mol~..l~ire), ou, de p.~c~érel~ce, dans des c<)nf1itinn~
de slringence élevées.
En outre, il est ég~lrmPnt envi~ hle dans le cadre de la présente i lv~-~io de mettre à profit la forte affinité de certaines des protéines de la famille HMG, ou de leurs d~-ivées pour des structures secolldail~s ~ ~isel-~es sur de l'ADN double brin. n peut notament s'agir de structures à quatre brin pour lesquelles il a nol;.. ~.ll été
montré que l'HMG1 de rat possède une très forte affinité (~i~nrhi et al. ~iPnrPs, 1989, 243, 1056-1059). De telles structures ~uv~ é~lem~nt être obtenues à partirde séquences naturelles telles que le,s ITRs du virus associé aux adénovirus ou bie,n être completem~nt synthétiques obtenues à partir de palyndromes artifirie1~.
Selon un mode de ré,~ ti- n préféré de l'invention, le composé mis en oeuvre est choisi parmi le,s protéines de type HMG 1, 2, I, Y, 14 et 17 et leurs dérivés. Il est plus p~ ../;Pllem~Pnt le~l~sel.~é par tout ou partie de la protéine HMG1 hnm~imP ou l'un de ses dérivés ou homologues tels que définis précé~emm.~nt Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le~s compositions 26 de la présente invention colllpl~lmell~ en outre un éléme,nt de ciblage permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique. Cet élément de ciblage peut être un élfim~n~
de ciblage extr~rPllt-l~ire, permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains types cPll~ ires ou certains tissus souhaités (cellule,s tumorales, cellules hépatiques, cellules hématopoiétiques, etc). Il peut ég~lPm~nt s'agir d'un ~lfiment de W O 97/12051 PCTA~R96/01516 ciblage int~~ pel~ Lkul~ d'orienter le lla,~rè l de l'acide n~cl~ue vers certains colnp&L~nell~ c~llnl~ires privilégiés (~ o~ )nrlrie~s~ noyau, etc).
Plus ~rw~ m~nt l'~4m~nt de ciblage est lié, de Illani~le covalente ou non covalente, au composé selon l'inventioIL L'el~mPnt de ciblage peut é~ m~nt être 5 lie à l'acide ~ q-,e. Selon un mode privilégié de l'invention, ledit composé est ~ié, via une par~ie hétérologue supl le-..f ..l,.;~e liée à une de ses eAkél~ és~ à un ligand de r~ re présent à la surface du type c~ ire comme par ~Y~mple un sucre, la ll~rénllle~ rinsul;ne ou la protéine asialo-o ~so~ o~ . Il peut ég~l.o,ment s'agir d'un ligand de type intr~ ire comme une séquence signal de 10 loc~tion m~clé~ire~ nls, qui privilégie l'~ tion de l'ADN transfecté au sein du noyau.
Parmi les él~m-~nt.c de ciblage l~tili~hl~e dans le cadre de l'invention, on peut citer les sucres, les pepti~l~e~ les oliE -nt1cléoti~1.?,s ou les lipides. E~t:îé~ m.-nt il s'agit de sucres et/ou peptiA~s tels que des ~ ico~ps ou fr~ nte d'anticorps, des 15 ligands de récepleul~ lnl~ires ou des fr~grn~nt.e de ceux-ci, des récepleu~s ou fr~gm~nte de récepleuls~ etc. En particulier, il peut s'agir de ligands de réce~leul~ de f~ctell~ de cn~ e, de léceple~u~ de cyt~-kin~s, de léceple~ de lectines cellulaires ou de réce~èul~ de protéines d'a-lh~eif~n On peut ég~l~ment citer le récepteur de la li~relline, des HDL et des LDL. L'él~m~nt de ciblage peut eg~l~m~nt être un sucre 20 permettant de cibler des lectines tels que les réce~euls asialo~lyc~ éiques, ou encore un fragment Fab d'ainticorps permettant de cibler le récepteur du fragment Fc des immlm~lc)bulines.
Av~nt~el-~mçnt, le con~posé selon l'invention peut être en outre polyglycosylé, sulfoné et/ou phosphorylé et/ou greffé à des sucres complexes ou à un 25 composé lipophile comme par exemple une châîne polycarbonée ou un dérivé du cholestérol.
La composition selon l'invention peut bien ~nt~nlltl comprendre plusieurs composés selon l'invention, de nature dirréle,l~t:. De même, il s'avère possibled'associer au composé selon l'invention, outre le composé de ciblage mlrlé~ire W O 97/12051 PCTAFR96/01~16 pr~l~ l décrit, un second co,l.posé car~çri~é par sa c~l-A~;Ie à comr~cter l'ADN. De tels c~ ~s~,s sont no~ l décrits dans la (lf~m~n-le FR 95/01865.
Le co.~ selon l'..~v~lLicm est présent en qu&--LiLé s~rli~n~ pour agir avec l'acide nllrl~ e selon l'invention. C'est ainsi que le f~po-~ c-----l~.~./acide n~ iql-~xprimé en poids) peut être co...l,. ;.~ entre 0,01 et 5 et plus p~éré~ em~nt entre 0,25 et 0,5.
En ce qui c~ --f e. ..e l'agent de transfection présent dans la cu~ o~;iLion selon rinvention, il est p~ren~llLielIement choisi parmi les polyl-lè es c~h~niq~lçs et les f~L~-l~.
Selon la ~ invention, le polymère ~-~hc-nique est de ~lefi~ ce un composé de formule générale I, --Nl -(CH2)n--R (I) dans laquelle - R peut être un atome d'hydrogène ou un groupe de formule (CH2~n-N
- n est un nombre entier compris entre 2 et 10;
- p et q sont des nombres entiers, étant ~ que la somme p+q est telle que le poids molec~ ire moyen du polymère soit compris entre 100 et 107 Da.
Il est ~nt-~n~ que, dans la formule (I) la valeur de n peut varier enke les dir~ ~ motifs p. Ainsi, la formule (I) regroupe à la fois les homopolymères et les hétéropolymères .
Plus p~ llçm~nt, dans la formule (I~, n est compris entre 2 et 5. En particulier, les polymères de polyéthylène imine (PEI) et poly~b~.ylène imine (PPI) W O 97/12051 PCTnFR96/01516 pl~ des propri~t~s tout à fait av~ntag~~ . Les poly--~les p..ifé~és pour la mise en oeuvre de la plt'~ e invention sont ceuY dont le poids mc leclll~ire est co~
entre 103 et 5.106. A titre d'rYemp'~, on peut citer le polyéthylène imine de poids mol~l1~ire moyen 50 000 Da (PEI50K) ou le polyéthylène imine de poids mol~ll~iremoyen 800 000 Da (PEI800K).
Le PEI50K ou Le PEI800K sont accç~.~ihl~s c~ ~c;~lrm~nt Quant aux autres poly..,._~ ~~sel.L~s par la formule ~nr~le I, ils ~uv~"l être ~I~_par~s selon le procédé décrit dans la ~em~n~le de brevet FR 94 08735.
Pour obtenir un effet c~Lu~.ull, des co...posiLions de l'invention, les 10 proportions respectives du polymère et de l'acide nucléique sont de pr~re~nce....;n~s de sorte que le rapport molaire R = amines du polymère/ph~ hn~P~ de l'acide n11rl~le soit co~ is entre 0,5 et 50, plus ~l~çél~ mf!nt entre 5 et 30.
Des résultats tout particulit ~ avantageuY sont obtenus en lltili~nt de 5 à 15 équivalents d'amines de polymère par charge d'acide nucléique.
En ce qui conrrrne plus particuliel~-nen~ les Lpor~L~lL~, il s'agit de molec~lles ~...plliphil~s colll~ nant au moins une région hycL~hile cationique, par exemple polyamine, et une région lipophile. La région cationique, yl~re~nLiellement polyamine, chargée c~t ~ni~ ement est capable de s'associer de manière réversible avec l'acide nucléique, chargé négativement. Cette interaction compacte fortement l'acide nucléique. La région lipophile rend cette interaction ionique in~r~ihle au milieu aqueux externe, en recouvrant la particule nucléolipi~ e formée d'une pPni~ll? lipidique.
Av~nt~ .ent ces lipofectants peuve"~ ég~lrmrnt être choisis parmi des lipopolyamines dont la région polyamine répond à la formule générale II
~ H2N~ H)m-NH-)n-H II
dans laquelle m est un nombre entier supérieur ou égal à 2 et n est un nombre entier supérieur ou égal à 1, m pouvant varier entre les différents groupes de carbone ~ ~A 02i3io64 1998-03-24~ -- =v; r~
~ ln cornp~i~ en~re d~ux amin~ ~ref~ ticll~mcnt, rn ~st cornpris ~nrr~ 2 ~t inc~u~ rrl~rlt ~t ~1 est compris entre I et 'i inclusi~ement. ~nc~r,~ plu~
pr~férent;ellement, la ~gion pol-amine es. représentée par la ~p~rrnine, la th~rrnine ou un de leurs anak~gues ~vant conservé de~ propriétes ~Le ]iaison a 1'.4DlN. Quant ~ la 5 regic~n li~3phil~, elle est reL~resent~ par ~u moins rLrLe chaine hy<lroc3rborlée, saturé~
ou non, du cholest~rol, un lil~ide naturel ou un lipide synthétique capable de fcrrner dc~;
phases 13mell,~ires ou hexa~onales, liée dc maniere co~ aLent~ à la région hydrciph le.
La der~ande de bre~et EP 3~ 111 décrit d'au~res ]ipopcLyamines cle tc~rrnu!e g~;nerlle 111 ~u.sce~tibles ;i'~tre ntises en oeuvre dan~ le cadre d~ la ,orésente in~ention 1I N~f~l1m Ht~ ILl R
d~n~ uelle R représente nc,~mment un radi(:~l de rormule génér~le ~R1R2) N-CO-CH - I'iH-CO- .
A titre représen~ati~ ces lipop~l~,-a~nines on l?~ut pius }~arricu1ièrerncnt citer !a dioe~adécyl.lmidoglyc~l s,~elm~r.e ~DOGS~ e- !a :~-earboxyvp~rTrl-ilvmide dc la l ~i palrl~itc ~ Ipilosphatidyl~th~lr.ol~ ine (DPPES).
Le~ lipopol~2mine~s ~éerite~; d~n~ L;l ~iemand~ de br~,et F~ ~4 1~96 ~ u~en~
é~lement ~t~e uti1i~ées ~.~antageu:;ement a titre d'agcnt de tr~ns~e~tic)n ~k,n l'in~cntion. Elle.~i :;ont représer.~ees par la forrnule ,~énér~le 111 ci-de~i~us d~-ls laquell~ R
représente ,. R3 /X--~1 ~ ,~y--R6 IV
'~0 ~5 a~
- X et X' représentant, indeper~d~mrnent I'm c~ l'autre, un ~tome d'oxygène, LLn groupement rn.~hylène -(C1~2)9- ave~ q e~al ~ ~, 1, 2 ou i3, ou urL groupement ~mino -I~'EI- ou -~ '- a~ ~ R' repré~nt~nt un ~roupemenl alkyle en C I a C 1, ".~ - Y et ~' réprésentant ind~pend~mment l'un de l'~utre un gn~uperr.ent rn~lh~lene. un ~rour~meTIt carbon~le ou un ~r~upe!nent C=S, FEUILLE ~ E
' ' Y ~ CA 02231064 1998-03-24~
- R3, RS ~ r~pr~ ntant in~ieT~cndamrn~nt l'un ;le l'~utr~ Lll~ ~t~me d'h~droc ne ~u un r;~clic31 ~l~yle, ~ubs~itue oll n~)n, en C] à C~ ec p p~uvant ~ ri~r ~ntre 0 et ~, R6 repre~ent~nt un dcri~ du chol~st~rol C)'l un gro~lF~ment ;311~1e amino -.~R11~2 aYec Rl et R2 rcpresent~nt in~i~pendamm~nt l'un de l'~utr~ u,l radioal aliFh~lhq5 ~ature ou n~n, liné3i~ ou rlmifi~ en C12 a ~22.
A titre repré~sentatif de c~ pol~amir.e~ on peut tout par~iculi~rement citer le (Diocwdé~yl-carbatnoylméth< ~ acétale c:e 2-~i-bis-(3-amino-prop~larr.ino)-pent~
et ]e (~ioctad~cy~-czrbamcylmethox~)-2cétate de 1 ,3-bis-t3-:1minc~-prc~p~ l~lmino)-~~ropyle .
Les d~mandes dc bre~et EP 3~ 111 et FR ~ 59~ decri~,erLt é~,~lemer.t proc~éde utili~ab]e pOW' la pl~par~tion des liFop~lyarnirles corr~s~n~ nt~s.
~ )~ r;larLi~e ~aniculi~rrln~nt a-~nt~eu.e, c)n F~ut util ~r daJls '~ ca~lre de l'in~ent;on la dicct~:décylamidogl~-c~i spermine ~DO~Sj k 5-car~ox~s?crmylarnid~ de 1.1 ?:~lrrtitGylpho~ph~t!id~,lethanollmine (DPPE~;~ le ~Di~ade~ e;lr:~amo~ the~
15 acetate de _-5-bia-(3-:~mino-p~-t~pylamino)-pentvle <)u le ~Dioctacl~,l-carb2mo~ 1-rnet~to.~ c~t~Lte de 1 3-bis-(3-amino-propylarnin~>)-2 pro?yle.
PoUI ob~.enir Wl et-t~'t optimum clea comx~i iclna ~1~ l'in~enti~n 'ea proForei~ns respe~cti~es de la ~ Yam~ne et de l'acide nucl~ique sont dc prcferenc~
dét~mnin&s de sorte que le r~ppc)rt R ch~rges positilies -'e l'a~ent de ~r~tn.slection/
'>O char~ea negati~ej cte- l'acictè nucLeic~u~ soit cr~mpr;s ~ntr~ e~ l~) et prc~ferentielle7r.enl entre 0 S et -'.
I a r)re~ence d'un composé selon l'in~ention LtU ~in d'une compositicjn ~ra~ ;fec~ante est aYantage-i-~e 'a pllLsieurs ~iIre.~. L'n p ~rticulier i: s'cn ~uit un~ t xicilé
nettement ~tmoincir.e 4 ~i fend dc~e)rrn~ia pu~aible ptr e~rr.p]e la trLtns.fecti- n de 25 cellu!~s sensibles à l'ori~ine ~ I' a ent de transtection cornme ?ar e.~mple l~s celLulea hém~atctp<)ïéti;~u~a ~l~ ec les Li~ap~ rrtines.
_ ,, Dans les c~-...po~ de la p~sell~ inv~ io.~, l'acide mlr,lPi~lt~P peut être aussi bien un acide déso~ylibo~ clPilue qu'un acide rihnmlclP;lue. Il peut s'agir de s~uPnrP-~ d'origine naturelle ou artifiri~pllp~ et n. ~ d'ADN f~Pnomiq1l~, d'ADNc, d'ARNm, d'ARNt, d'ARNr, de séquences hybrides ou de séquences sy}-ll,.,liques ou5 semi-synthétiques. Ces acides nl~c1PJql1PS ~u~ l être d'origine l~ nim~le, vé~t~le ~ctériPnnP, virale, etc. ns peu~ être obtenus par toute technique connuede l'}-ol.,ll,e du métier, et n~ ....P..I par rrihlagP de banques, par synthèse rhimiql1e ou encore par des m~th~les mixtes in~ nt la m~ifir~tiQn rhimicltlp ou ~y...~l;qv~P-de séquences obtenues par ~rihl~ge de banques. ~s peuv~lll par ailleurs être illcor~L~s 10 dans des V~;leUL:j, tels que des vecteurs pl~mitliques.
Conl Prn~nt plus particuliè~ les acides désoxyribonllrl~ ues~ ils peuvenL
être simple ou double Wn. Ces acides d~so~cy,ibt nnrlPi~lues peuvel.L coder pour des gènes thérape~t qtnP.s, des séquences rég ll~trirP~ de la transcription ou de laréplic~t on, des séquences ~nti~Pn~, des régions de liaison à d'autres composants cp~ ires~ etc.
Au sens de rinvention, on entend par gène thérapeutique lloli-.. ent tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thé-d~uLique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la oellule cible (c'est-à-dire un produit qui est 20 norm~lement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucunepathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression ;n~rr~ dans la oellule ou l'e~p.e~ion d'une protéine inactive ou f~ ment active en raison d'une mo lific~tion~ ou encore de suL~Lilller ladite protéine. Le gène théldpeuLique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine 25 oell~ ire~ ayant une st~hilité accrue, une activité morlifiée etc. Le produit protéique peut ég~lem~Pnt être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité ~leficiente dans lacellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse imml Init~ire.
W O 97/12051 PCTA~R96/01516 Parrni les produits ll ~in~ l;ques au sens de la ~l~s~,le i~-ve:"liOn, on peut citer plus particulii;~~ nl les enzymes, les dérivés ~An~-in~A, les hormones, les ly~ s intf~rl~lkin-~..s, ~ e~re~ s, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de ~ Ç~ les ne,n;)1,n~ ttellr~ ou leurs precllr~ellrs ou ~,L~y,l~s de ~y~ ~se~ les 5 facteurs trophiques: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléic"Luplline, etc; les apoli~ot~ es: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR9305125), la dy jLlu~ e ou une mini-ly:~lLo~lLLle (FR 9111947), la protéine C~lR A~A~iPe à la IIIUCUVi~ les gènes ~pp~:~eu-~i de lul~leuLs p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FlR 93 04745), les gènes cod_nt pour des ra-;L~u,~ imrlir~
10 dans la Co5lgll1Atil-)n Facteurs VII, VIII, IX, les gènes illl~ vell~lL dans la réparation de l'ADN, les gènes s~ e~A (thy~nidine kinase, ~;yLosi~,e .1 ~Amin~Ae), etc Le gène l},c.a~..lique peut e~lf~m~nt être un gène ou une séquence AntiA~n~, dont l'~_~p,~ion dans la cellule cible permet de contrôler l'~,e~sion de gènes ou la LLan ion d'ARNm c~ llAires De telles séquences pe~Lv~L, par ~Y~mple être 15 trAn~ritf~s dans la cellule cible en ARN compl~ ~ d'ARNm c~ llAires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les Anti~ns cc, ~,p-c~ ent ég~lem~nt les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201).
Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut ég~l~m~nt co--,po-L~ un ou 20 p11lsiellr~s gènes codant pour un peptide ~ntigé.nique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une l~pollse immlmit~ire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet donc la ré~li.s~ti- n soit de vaccins soit de tr~it~m~.nt.s immlmc~thç.rapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notAmment contre des microorg~nism~s, des virus ou des cancers. Il peut s'agir not~mm~nt de peptides 25 ~nti~niques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hep~7tite B
(EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou eneore spécifique~s de tumeurs (EP 259 212).
I~lr.~;el1~m~.nt, I'acide nucléique comprend ég~1em~nt des séquences permettant l'expression du gène thérapeutique etjou du gène codant pour le peptide W O 97/12051 PCTA~R96/01516 ~ntigi~nique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des séquences qui sont naturell~m~nt ~s~ hles de l'expression du gène con~ ré lorsque ces séq1~ n~
sont s~epl;h~ de fon vh~)nn-~r dans la cellule infe~, Il peut e~ mPnt s'agir de séquences d'arigine dirr~ e (~-s~ hles de l'~ion d'autres pn)le~ s, ou même synthPfiTI~oc). Not~mm~?nt il peut s'agir de séquences prom~tri~ de gènes euc~y-,~s ou viraux. Par ~Yemrle, il peut s'agir de sequeJ-ces promotrices issues du ~nome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences prc~mot~ices issues du ~nom-~ d'un virus. A cet égard, on peut citer par PY~mrle les promoteurs des gènes ElA, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvt~ être moflifif~s par a(l-7iticn de séquellces d'activation, de ré~]l~ticn, etc.
Par ~ill~ms, l'acide m~ iq1~? peut é~ll~-m~nt coln~L~er, en particulier en amont du gène thel~pe~,lique, une séquence signal r~irigptqnt le produit IL~ euLique synth~ti~e dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquenoe signal naturelle du produit th~. 2.p.eul ;que, mais il peut é~lem~-nt s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d~une séquence signal arhficiell~
Plus p~îé~.-l;f llemf~nt les compositions de l'invention comp~llllell~ en outre,un ou plusieurs lipides neutres. De telles compositions sont particulièrement avantageuses, n~t~mm~nt lorsque le rapport R est faible. La ~l~m~n-l~resse a en effet montré que l'~fitlition d'un lipide neutre permet d'améliorer la fonnation des particules nuclé- liri~iques et, de mani~le su,p.~na,~e, de favoriser la pénétration de la particule dans la cellule en rl~lst~hili~nt sa membrane.
Plus ~c~ ,l;ell~m~nt les lipides neutres utilisés dans le cadre de la présente invention sont des lipides à 2 chaînes grasses.
De manière particulièrement av~nt~ e, on utilise des lipides naturels ou synthétiques, ~wiLLe.ioniques ou dépourvus de charge ionique dans les c~)n~liti(~n~
physiologique. Il pellve~lL être choisis plus particuliè,~,l~~lL parmi la dioleoylrhosph~-tidyléth~nf~l~min~ (DOPE), le oléoyl-palmitoylphos-phatidyléthanolamine (POPE), le di-stéaroyl, -palmitoyl, -miLy~uyl phosphatidyléthanolamine ainsi que leurs dérivé N-30 méthylés 1 à 3 fois; les pho~rh~ ylglycérols~ les diacylglycérols, les ~ly~o~yldiacyl-glycérols, les cé~ebl~sides (tels que no~ e~l les ~ oc~ebr~)sides)~ les sphingo-lipides (tels que ~ les srhin~nmyélines)ou encore les ~Qi~lo~ng~ Q (tels ~ que n.. l~.. ~.. ~r,.. ~ les asialoGMl et GM2).
Ces dirre~.L~, lipides peuvellL être obtenus soit par .,yll~lèse, soit par 5 extraction à partir d'organes ~el~ le: le celvea~l) ou d'oeufs, par des techniques cl~Q~Q;qve~Q, bien ~nm1eQ de l~omme du métier. En particulier, l'extraction des lipides naturels peut être réalisée au moyen de solvants organiques (voir e~lem~nt r Phnin~, Bio~h~", ;~,~, y) ~ éré~.~ lhm~nt les compositions de rinvention, mettant en oeuvre à titre 10 d'agent de transfection un lipofe~;kul~ col~ e~ ent de 0,1 à 20 équivalents de lipide neutre pour 1 équivalent de lipopolyamine, et, plus ~éçe~ nlf~nt~ de 1 à 5. Dans le cas où l'agent de LL~u~,re~;lion est un polymère c~tioni~lue~ les co,llposilions de l'illYellliOn co~llprel~nellL~ en plus du polymère cationique dans les la~)ol~, cités ci-avant, de 0,1 à 20 équivalents molaires de lipide neutre pour 1 équivalent molaire de 15 phoQ,ph~t~ de l'acide nucléique, et, plus préré~ llem~nt de 1 à 5.
Les compositions selon l'invention peuvè"l être formulées en vue d'2~ 1. dlions par voie topique, cutanée, orale, rectale, v~gin~le, p~enLeldle, jl~L~ le, u~ veilleuse, illLl~ ire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc... De préférence, les compositions phar~-elltiques de l'invention conti~nn~nt un 20 véhicule pharm~e..l;qlle.,~lll acceptable pour une formulation injectable, n~ ..,...ent pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une ~ . dlion par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notam~ent lyoI~hili~" qui, paraddition selon le cas d'eau st~rili~ée ou de sérum physiologique, permettent la 25 constihution de solutés injectables. Les doses d'acide nucléique llhli~?~ pour l'injection ainsi que le nombre d'~lmini.etrations peuve~ll être adaptées en fonction de dirrélellL~
paramètres, et notamment en fonction du mode d'~ dlion utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement ~ recherchée.
CA 0 2 i 3 i o 6 4 19 9 8 - 0 3 - 2 4 __ r . -,. 1~;
ELl~ peu~eJlt etre a~ln~t~usemcnt ut~ rts pour rrsr~;f~t~r Ir.~ ~r~ndevariétt de t~pe cellulaire comme par ~.;t rn,n,e ~'t~i cellulL~ nemalo,~t~iétiques les l~mphoe~tes, les hepatGcytes, les cellules enclothcliale~, L~i cellul~s L~e rnelano~nes ~e carcinc~rnes et dc ~iarcomes 1~ cellul~s rnu~.ul~ire~s lisses. Ie~ n~u.one.Y ~t lt- s 5 astr-oc~-tes.
La présente in~ention ~ournit ~in~ ne méth~xl~ particu]ierement a~nta~,eu~
pvur le uaitement de rnaladies uti]i.sant 1LS tra~1~t~eC.;<)n 1n V;tr~ ), eX V;-rO I)U irl vi~.v d'un acid2 nucleit,ue ~,t,at~ n~_er ladite rnal~d e en ~a~;oclatiorl 3~e~ un a~en~ t e transt~ectinn de ~pe E~ rr.ère cationique ou ]ipofectr~nt. et un corn~ ;e tel que de.~illi 10 ci-a~nt. Plu~ particuli~rem.ent. cette mérhode es~ a~tyl.cable au-;~ malacies re~u~taJI;
d'une déticience en un produit protéiqlle ou nucleique et l'~c de r.ucleique v.dnniri~lre code pour ledi~ produit yrotéique ou c~nt;ent la jeou~nce c~tresyor~dan~ audit prG~ui~
nucléique. L,e~ compo~ition~ s~elor: I'in~,eTltt~n .~ont p2rticuliere.rl1~rt intér~sanre~ pour leur ~)iodisE)on e et leur ni~e~u de T~an~fectivn.
-ésente inverltion c:~ncerne éc !llement ~ou~e utilisatic;rl d'un c~mpose selon l'in~enti~n couple à un li~,~Ln~l de recepIeur cellul .ir~, un ant;c~rps ou d~ri- e d'anticcrps~ pour cil~ler un acide nL~ciéique ~,ers ~es eeUuLe~s e~prirnanl l~s récepte~.~
<~u ~ti-gene~ co~resp(~ndams Dans cette perspecti~e, un lig~n~, an;ic~rps o~ dénvé
d'~nticcrps p~tentiel est cou~ audit ccrrtElc,~;c et i'orL a?precie le r~u~3ir de 70 trarstecti(an de eet~e mclecule chimèr~ c~mpa~ativement au com~>sé se~l.
L.a prc~cnte ir~nt;on ser~ plus compl~tem~nt dec..te à l'aic~e des e~;er,~ple~
qui sui~ent, 4ui doi~ent etr2 c.~nsideré~s comm~ illustraLit's ~t nc~n lirr.i~atifs.
~IC~'RE~
Fie,ure 1 ~e~ré~entation ~ intensités lumineuse~ de l efficacité d~ nsf~ctiens 25 r~a]isees selon l'invention dani dift~renLs t~pes cellulaires.
Fi~ur~ 2: ~.ppréci~t;~n ~le l'e~f;caci~é de iran~;f~ ti~7ns réalisées en Frc.sencr, et er.
;lb~;~nc~ ~e }I~IGl.
l~ElJlLL-~ ,r~ "~; ,r,'r MATERIEL FT METHQDES:
- La construction utilisée pour mettre en évidence l'activité des cv~ n~ de l'invention est un pl~mitleco~ o~l~ll le gène codant pour la luciÇ~.~ (Luc), pCMV-Luc.
Le pl~ni-l~ pCMV-luc comporte le promoteur du Cyt mé~lovirus (CMV), extrait du rl~mi.le vecteur pcDNA3 (Invit,rogen) par collp~ avec les ~y-l-es de restriction Mlu I et ~in~1m, situé en amont du gène codant pour la luciférase, inséré
aux sites MluI et Hindm dans le vecteur pGL basic Vector (Promega).
EXEMPLE l: PREPARATION DE LA PRO l~;INE HMGl DE RAT
1.1 Fxpression de la protéine HMG1 chez E. coli Cette protéine rec-)mhin~nte provenant d'un r~ ele a été préparée par s~ piession chez E. coli.
Le pl~mi~l~ T7-RNHMG1 codant pour la protéine HMG1 de rat (M. E. Ri~nrhi, Gene, 104 (1991) 271-275) est introduit dans la souche d'E. coli BL21(DE3). La 1~ souche est par la suite cultivée à 37~C en milieu LB+~mr illin~? (25 mg/L). Une préculture est obtenue à partir d'une colonie isolée. Elle permet d'ensemencer une culture de 500 ml. Lorsque l'absorbanoe à 600nm de la culture atteint la valeur de 0,7, la synthèse de HMG1 est induite par addition d'I~G à 0,5 mM ~mal. La souche productrice de HMG1 est encore cultivée 2h30 en présence d'IPTG. Les oellules sont ensuite récoltées par centrifugation (5000 x g, 20 minlltes), rincées par 200 ml d'eau ~ till~,e centrifugées de nouveau. Le culot de oellules est conservé à -80~C jusq'à
purification.
1.2: purification de la protéine HMG1 recombinante La purification de la protéine HMG1 peut être effectuée par chrom~tographie à partir
TR~NSF F.CTION D'ACIDES NUCT FTQUES ET SES UT~T T~TIONS
La pré~..le invention con~rn~ le ~lo~ e de la thérapie génique et ~inLe~e plus partic~ au L~dl~rell in vitro, ex vivo et/ou in vivo du m~t~f~]
5 génétique. Elle propose n..L~ une nouvelle cu,.,~silion pl-A....A.ei-~;que utile pour L ~rwL~r ~ . ~.n~ des C~ Elle se ~al.~po~le e~l/?m~nt aux ~Iti1;.~ ;nn.
de cette conlposiLion.
Des ~iefi~ nr~ et/ou ~nnm~lif~ (mnt~tinn, ~A~ ion ~l~..,.nl~, etc) chrnmosnmirl~les sont à l'origine de nom~reuses m~ s, à caractère héréditaire ou10 non. Pendant longt~mrs~ la ...~lf-f~;..e co,lv~ ;nnnf~lle est dt~ eul~ce ;~r~ e à leur égard. Aujourd'hui, avec le dévelop~,.,t:"l de la thérapie gPni~le on espère pOuvol-déso..-.~i~ corriger ou pl~ven ce type d'~ til~n cl~ru.... ~ ue. Cette nouvelle m~ii-~ti~)n c~ c~ ~ à ull~ dui~e une ..,~ n génétique, dans la cellule ou l'organe affecté, en vu de corri~r cette ~IPfiri~n~e ou ~nnm~ ou encore, d'y ~i"~er une 15 protéine d'intérêt thf3...pei.l;que.
L'obst~cle majeur à la pé~L,~lion d'un acide ml~ q~le dans une cellule ou un organe cible, repose sur la taille et la nature polyanionique de cet acide nucléique qui s'o~>po~enl à son passage à travers les membranes c~ ires.
Pour lever cette ~liff~ lté~ diverses techniques sont aujourd'hui ~naposées 20 dont plus particuli~:-e-,*-,~ la L.~r~Lion d'ADN nu à travers la membrane plasmique in vivo(WO90/11092) et la transfection d'ADN via un vecteur de transfection.
En ce qui con~e~ ne, la transfection d'ADN nu, son ~ffica~ite~ demeure encûre très faible. Les acides m~ iq1l~c nus pt~ nt une derni vie pl~m~hque courte en raison de leur dégradation par les ~y--~s et de leur ~limin~hon par les voies 25 u~ai~es.
Pour ce qui est de la seconde technique, elle propose prinr1p~lem~?nt deux ~ stratégies:
La première met en oeuvre les vecteurs de transfection naturels que sont les virus. Il est ainsi propûsé d'utiliser les adénovirus, les herpès virus, les .~LIVviluS et plus 30 réCç~-----~nl les virus adéno associés. Ces vecteurs :j'av~-e~t ~ru-l--~-LS sur le plan de W O 97/12051 PCTA~R96/01516 la ~ r~l;~ n mais on ne peut mAlh~ ..~.nt~.ll exclure totAl~m~nt à leur égard certains risques de pathogénicité, r~p1ic~ti~n et/ou irnmlm~ onicit~, inhérents à leur nature virale.
La seconde strat~gie csn.~;~L~ avAnt~r- -~. . .~ à utiliser des agents n~ viraux5 ~'~p~hl~ de promouvoir le ~ L~ et l'~ion d'ADN dans des oellules euc~ y~Les.
L'o~et de la p~se ,l~ illvel~Lioll s'inscrit plus particulièlt:-~-e ~L dans cette secon~e stratégie.
Les v~;~eu.~ c~imiques ou hisrhimiqll~s ~t:p~ une alle~ndlive 10 avAnt~ ee aux virus naturels en particulier pour cette ~h~nc e de réponse immlm~lo~ e et/ou reco...l~ A;~n virale. Ils ne possèdent pas de pouvoir pAthogf~n~, le risque de mllltip~ tion de rADN au sein de ces vecteurs est nul et il ne leur est attaché aucune limite théorique en ce qui c--n~ f~rnç la taille de rADN à
transfecter.
Ces vecteurs ~y~lL~iques ont deux fonctions ~;.. ';p~l~, c~n~i~n~r l'ADN à
transfecter et promouvoir sa fixation oelllll~ire ainsi que ssn passage à travers la membrane plasmique et, le cas é~h~nt les deux m~mhr~nee nll~ ires.
De part sa nature poly~nioni~ç, rADN n'a natur~llçm~nt aucune affinité pour la membrane r1~mi~ e des oellules de nature ég~ m~nt polyanionique. Pour pallier à
20 cet inconvénient, les vecteurs non viraux p-).eeè-l~nt génér~lPm~nt tous des charges polycationiques.
Parmi les vecL~ y--lll~iques développés, les polymères cationiques de type polylysine et DEAE dextran ou encore les lipides c~ti~niql1çe ou lipofectants sont les plus avantageux ns p~)e.ee~l~nt la propriété de con-1~neçr l'ADN et de promouvoir son 25 association avec la membrane coelllll~ire. Plus récemm~nt il a été développé le concept de la transfection ciblée, médiée par un récepteur. Cette tech~ique met à profit le principe de con~ne~r l'ADN, grâce au polymère c~ti~)niflue~ tout en dirigeant lafixation du complexe à la membrane à l'aide d'un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type30 oe~ ire que l'on veut greffer. Les criblages du récepteur à la lLdl~r~llille, à l'insuline ou du récepteur des asialo~lycol?lo~ es des hépatocytes ont ainsi été décrits.
- =
W O 97/12051 PCTA~R96/01516 Touler~,is, les ve~;le~ Jes proposés aujou.~llli sont encore loin d'être aussi pelr~,....,-..lx que les vecteurs viraux. Ceci peut ~l~J~ nt être la conséquence d'une c~)nf~n~tiC~n ~ rr;.~e de l'ADN à tranfecter et/ou des riiffi~llt~s rencontrées par l'ADN ~ansfecté pour sor~r de l'~n~ Qme et pél~éL~ n~ le noyau 5 c~ ire. En effet, le transport d'ADN dans le noyau d'une cellule eucaryote au repos pose un problème évident puis~le les liimPn~;~ n~ des pores nllrl~ireS ne pçrmett~nt que la diffusion de protéines de poids molé~ ire illÇeliel,r à 60 OOODa. (I. Davis et al., Ann. Rev. Riorh~m 1995; 64; 865-896). Un ADN pl~miriique possédant un poidsmf~lé~ll~ire s l~ri~lr à 106 ne peut donc natur?~ mf~nt pénétrer dans le noyau 10 c~ ire par simple diffusion.
La présente illv~3l1ioll a préri~çm~nt pour objectif de proposer une solution av~nt~gn~ au problème précité.
Plus ~ér:~ . ~ .~nt la présente illv~lliun propose une composition pharm~ e~ti~e utile pour la h~r~;Lion d'au moins un acide nucléique caractérisée en 15 ce qu'eUe cnnhent outre ledit acide mlrl~iq~e et au moins un agent de L-~l~t~Lion, au moins un composé ~ nt des propriétés de fixation de l'ADN à une c~p~cité de ve~ m m-r.lé~ire de cet ADN.
Au sens de l'invention, un composé p~ éA~nt des propriétés de fixation de l'ADN, couvre tout composé capable de se fixer au moins parti~ m~nt à l'ADN à
20 vectoriser. En ce qui concerne plus particuli~lelllellL son aptitude à vectoriser cet ADN, elle se traduit au sens de l'invention par une efficacité à diriger cet ADNqr~m~nt à travers les difré ~ es membranes ~~ ires et/ou m1rlé~ires pour le conduire j~qu'au sein du noyau de la cellule à traiter. Le composé selon l'invention peut ég~l~mrnt se présenter par exemple sous l'aspect d'une m~lerl~l~ chimère 25 ~ nt un domaine de fixation à l'ADN, à un domaine permettant l'import mlrle~ire.
Dans ce cas particulier, on peut sélectinnner parmi des ~om~in~ de fixation à l'ADN, ceux issus de protéines régulatrices capables de se lier par exemple à des séquences spécifiques ou au contraire de protéines connues pour posséder une affinité non séquence dépendante pour l'ADN. En ce qui concerne plus particulièrement le 30 domaine impliqué dans l'import m~ ire, il peut être par exemple figuré par une WO 97/12051 PCTA~R96/01516 séquence dites nls (Nuclear k r~li~ti~ n Sequence). De telles séqll~nces pOuLlo-lL être a~p&~ Lées ou dérivées au c ~ bil)A-~iL~ déduit de la n~ 4O~ mine ou au cr-n~.qn~ de l'~nt f~ne T de SV40.
Selon un mode de ré~li~ti. n particulier, rinvention cn.-~ une composition 5 ~ . ..-P~el)tiqtle utile pour la L,~ .;Lion d'au moins un acide nucléique c~rarPri~e en ce qu'elle con~ outre ledit acide mt~ t~e et au moins un agent de transfection, au moins un cc.. ~ ~po~ al~parLel~ à la famille des HMG ou l'un de ses dérivés.
Les protéines de type HMG, pour "Hign Mobility Group" sont des protéines riches en acides aminés c~argés et p( .~ér1~nt une masse molé~-l~ire inférieure à 30000 10 Da. Solubles dans l'acide perchlorique 2-5~, elles sont classiqu~m~nt ~xLLailes de la dlL~...nl;nepar0,35 MNaCl.
Cla~iqu~....~.-~ on ~ hn~-e 3 f~mill~s de protéines HMG: les protéines de type HMGl/2 de masse molé~ re voisine de 25000, HMG14/17 de masse mr~lé~l-lAire voisine de 10-12000, et HMGI/Y de composition voisine des protéines de 15 type HMG14/17 mais dont la l~alLiLion tissulaire et au cours de l'ontogénèse est di~r~l~llL~. On sait que la séquence prilnA r~ des protéines est conservée au cours de l'évolution au sein de çhA~lm~ de ces trois f~mill~
En ce qui c-)ncefne plus particulièrement les protéines de la famille HMGl/2, elles se caractérisent par la présence d'une séquence de 80 acides aminés à
20 pré~o.~ AIl~ e basique (charge nette +20), dite "boîte HMG", qui c-)n~titl1e un rl~)m~in~ de liaison à rADN. Dans cette famille on distingue les protéines r~p~hl-~ de se lier à des séquences spécifiques de l'ADN double brin et les protéines dont la spe~ificité de liaison réside dans une stucture ~-lim~n~ionn~lle particulière de l'ADN.
Dans la ~lellli~r~ catégorie on trouve les protéines, UBF, SRY, TCFl, ABF2, qui 25 stiml-l~nt la transcription de gènes spécifiques (Greiss E.A. et al. J. Mol. Evol. (1993) 37:204-210). La séquence de ~hA-~lm.o de ces protéines contient une ou plusieurs"boites HMG". La deuxième catégorie est représentée par les protéines HMGl et HMG2. Leur séquence primaire est caractérisée par la présence de deux "boites W O 97~12051 PCTn~R96/01516 HMG" et d'une séquence acide en C-tf~rminAl (Bustin M. B.B.A. (1990~ 1049:231-243). Ces protéines se lient de facon s~ifi~e sur les séquences d'ADN
pali~ iq -~s e~c~udées en structure f~ lciÇfJ~ e (appariement in1rAhrin au niveau du pal.ncl~ll.e) ou sur les séquences d'ADN qui p ~sf~ .l une forte coul~u~e. Ces deux types de structure ont en co.. l-- d'élargir le petit sillon de l'ADN qui devient alors capable d~arcnm~ylf~ la liaison des ploléil-es de type HMGI/2. Le rôle phy~if~logiq~le des pr~éincs HMGl et HMG2 est à ce jour peu élucidé. Il a ~ rois été montré que la protéine HMGl de veau est ~ ée de n~ active dans le noyau des oellulesde ..~ r~es. (L. Kuehl e~ al; J. Biol. Chem. 1985; 260, 10361-10368).
10De Il~ iel~ inAttf~n~llle~ la DrmA-~le.~se a mis en évidence qu'il était possible de mettre à profit ces f~A~-Ttf~s des protéines HMG, à savoir leurs Artit-.~lf~s à fixer l'ADN et à être ~anspol~ées de Ill~licr~ active dans le noyau, pour promouvoir f~ffi~ Aoe.~ la transfection dans le noyau de cellules à traiter de séquences nucléiques hétérologues, A5.59rie~,5 à au moins un agent tran~fe~;~,~.
15Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne tout peptide, pseudopeptide (peptide incorpor_nt des Pl~mf~nt.s non biochimiques) ou protéine dirfé a-l~ du composé tel que défini prece~lPmmfr~nt obtenu par une ou p~ rs mn lificAtinns de nature génétique et/ou chimique. P_r mn~lifirAtion de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutAtic)n, s~hstittltion~ délétion, 20 A(1flitjnn et/ou molific~Aton d'un ou plusieurs résidus par exemple de la protéine cnn~i~erée. Plus pre-~isPm~n~ par morlifi~Ation chimique, on entend toute mc~ifirAtif)n du peptide ou protéine générée p_r réaction chimique ou par greffage rhimiqlle de molécule(s), biologique(s) ou non, sur un nombre qu~lcnnfl~le de résidus de la protéine. Par modification génétique, on entend toute séquence peptidique dont l'ADN
25 hybride avec ces séq~lellces ou des fnA~n~nt.s de celles-ci et dont le produit possède les activités in~ éf,~s De tels dérivés peuvent être générés dans des buts Lffé~ ~, tels que notAmm~nt celui d'~Al~ f l' ffinité du polypeptide correspondant pour son ligand d'ADN, oelui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'Allgmtont~r sa ~rPsi~Anre à des protéases, celui d'Angl~ Pl et/ou de modifier l'une de ses activités, 30 ou celui de lui conf~ ~r de nouvelles propriétés ph~rmzlcocinétiques et/ou biologiques.
Parmi les dérivés r~slllt~nt d'une a~ ;ml~ on peut citer par I .~...pl~ les s~ nr~?
pepti~ t-e,s ~ ~s comportant une partie hétérologue s~rple~.~e~ln;~ liée à une lliLé. Le terme dérivé ccl~ d e~ll?ment les ~q~ re~ protéiques hr~molo~l.?
à la ~quellce cnn~ rée, issues d'autres sources ce1~ ires et n~ de oellules 6 d'origine htlm~in~, ou d'autres o~ ;s...~s, et ~s~ une activité du même type. De telles séquences h~mo1cl~1e~s peuven~ être oblP.~ par des ~ ?. ;~rt?S d~yhr~ tif)n de l'ADN cc,..es~ndiant. Les hykri~ t nn~ peuv~ être r~li~ à partir de banques d'acides nucléiques, en l~ti1i~nt comme sonde la seq~ nre native ou un f~grnl?nt de oelle-ci, dans des cnn-litinn~ de stringence c~ /ellLinnnfe1lf~ (Maniatis et al.), (Cf 10 techniques générales de biologie mol~..l~ire), ou, de p.~c~érel~ce, dans des c<)nf1itinn~
de slringence élevées.
En outre, il est ég~lrmPnt envi~ hle dans le cadre de la présente i lv~-~io de mettre à profit la forte affinité de certaines des protéines de la famille HMG, ou de leurs d~-ivées pour des structures secolldail~s ~ ~isel-~es sur de l'ADN double brin. n peut notament s'agir de structures à quatre brin pour lesquelles il a nol;.. ~.ll été
montré que l'HMG1 de rat possède une très forte affinité (~i~nrhi et al. ~iPnrPs, 1989, 243, 1056-1059). De telles structures ~uv~ é~lem~nt être obtenues à partirde séquences naturelles telles que le,s ITRs du virus associé aux adénovirus ou bie,n être completem~nt synthétiques obtenues à partir de palyndromes artifirie1~.
Selon un mode de ré,~ ti- n préféré de l'invention, le composé mis en oeuvre est choisi parmi le,s protéines de type HMG 1, 2, I, Y, 14 et 17 et leurs dérivés. Il est plus p~ ../;Pllem~Pnt le~l~sel.~é par tout ou partie de la protéine HMG1 hnm~imP ou l'un de ses dérivés ou homologues tels que définis précé~emm.~nt Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le~s compositions 26 de la présente invention colllpl~lmell~ en outre un éléme,nt de ciblage permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique. Cet élément de ciblage peut être un élfim~n~
de ciblage extr~rPllt-l~ire, permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains types cPll~ ires ou certains tissus souhaités (cellule,s tumorales, cellules hépatiques, cellules hématopoiétiques, etc). Il peut ég~lPm~nt s'agir d'un ~lfiment de W O 97/12051 PCTA~R96/01516 ciblage int~~ pel~ Lkul~ d'orienter le lla,~rè l de l'acide n~cl~ue vers certains colnp&L~nell~ c~llnl~ires privilégiés (~ o~ )nrlrie~s~ noyau, etc).
Plus ~rw~ m~nt l'~4m~nt de ciblage est lié, de Illani~le covalente ou non covalente, au composé selon l'inventioIL L'el~mPnt de ciblage peut é~ m~nt être 5 lie à l'acide ~ q-,e. Selon un mode privilégié de l'invention, ledit composé est ~ié, via une par~ie hétérologue supl le-..f ..l,.;~e liée à une de ses eAkél~ és~ à un ligand de r~ re présent à la surface du type c~ ire comme par ~Y~mple un sucre, la ll~rénllle~ rinsul;ne ou la protéine asialo-o ~so~ o~ . Il peut ég~l.o,ment s'agir d'un ligand de type intr~ ire comme une séquence signal de 10 loc~tion m~clé~ire~ nls, qui privilégie l'~ tion de l'ADN transfecté au sein du noyau.
Parmi les él~m-~nt.c de ciblage l~tili~hl~e dans le cadre de l'invention, on peut citer les sucres, les pepti~l~e~ les oliE -nt1cléoti~1.?,s ou les lipides. E~t:îé~ m.-nt il s'agit de sucres et/ou peptiA~s tels que des ~ ico~ps ou fr~ nte d'anticorps, des 15 ligands de récepleul~ lnl~ires ou des fr~grn~nt.e de ceux-ci, des récepleu~s ou fr~gm~nte de récepleuls~ etc. En particulier, il peut s'agir de ligands de réce~leul~ de f~ctell~ de cn~ e, de léceple~u~ de cyt~-kin~s, de léceple~ de lectines cellulaires ou de réce~èul~ de protéines d'a-lh~eif~n On peut ég~l~ment citer le récepteur de la li~relline, des HDL et des LDL. L'él~m~nt de ciblage peut eg~l~m~nt être un sucre 20 permettant de cibler des lectines tels que les réce~euls asialo~lyc~ éiques, ou encore un fragment Fab d'ainticorps permettant de cibler le récepteur du fragment Fc des immlm~lc)bulines.
Av~nt~el-~mçnt, le con~posé selon l'invention peut être en outre polyglycosylé, sulfoné et/ou phosphorylé et/ou greffé à des sucres complexes ou à un 25 composé lipophile comme par exemple une châîne polycarbonée ou un dérivé du cholestérol.
La composition selon l'invention peut bien ~nt~nlltl comprendre plusieurs composés selon l'invention, de nature dirréle,l~t:. De même, il s'avère possibled'associer au composé selon l'invention, outre le composé de ciblage mlrlé~ire W O 97/12051 PCTAFR96/01~16 pr~l~ l décrit, un second co,l.posé car~çri~é par sa c~l-A~;Ie à comr~cter l'ADN. De tels c~ ~s~,s sont no~ l décrits dans la (lf~m~n-le FR 95/01865.
Le co.~ selon l'..~v~lLicm est présent en qu&--LiLé s~rli~n~ pour agir avec l'acide nllrl~ e selon l'invention. C'est ainsi que le f~po-~ c-----l~.~./acide n~ iql-~xprimé en poids) peut être co...l,. ;.~ entre 0,01 et 5 et plus p~éré~ em~nt entre 0,25 et 0,5.
En ce qui c~ --f e. ..e l'agent de transfection présent dans la cu~ o~;iLion selon rinvention, il est p~ren~llLielIement choisi parmi les polyl-lè es c~h~niq~lçs et les f~L~-l~.
Selon la ~ invention, le polymère ~-~hc-nique est de ~lefi~ ce un composé de formule générale I, --Nl -(CH2)n--R (I) dans laquelle - R peut être un atome d'hydrogène ou un groupe de formule (CH2~n-N
- n est un nombre entier compris entre 2 et 10;
- p et q sont des nombres entiers, étant ~ que la somme p+q est telle que le poids molec~ ire moyen du polymère soit compris entre 100 et 107 Da.
Il est ~nt-~n~ que, dans la formule (I) la valeur de n peut varier enke les dir~ ~ motifs p. Ainsi, la formule (I) regroupe à la fois les homopolymères et les hétéropolymères .
Plus p~ llçm~nt, dans la formule (I~, n est compris entre 2 et 5. En particulier, les polymères de polyéthylène imine (PEI) et poly~b~.ylène imine (PPI) W O 97/12051 PCTnFR96/01516 pl~ des propri~t~s tout à fait av~ntag~~ . Les poly--~les p..ifé~és pour la mise en oeuvre de la plt'~ e invention sont ceuY dont le poids mc leclll~ire est co~
entre 103 et 5.106. A titre d'rYemp'~, on peut citer le polyéthylène imine de poids mol~l1~ire moyen 50 000 Da (PEI50K) ou le polyéthylène imine de poids mol~ll~iremoyen 800 000 Da (PEI800K).
Le PEI50K ou Le PEI800K sont accç~.~ihl~s c~ ~c;~lrm~nt Quant aux autres poly..,._~ ~~sel.L~s par la formule ~nr~le I, ils ~uv~"l être ~I~_par~s selon le procédé décrit dans la ~em~n~le de brevet FR 94 08735.
Pour obtenir un effet c~Lu~.ull, des co...posiLions de l'invention, les 10 proportions respectives du polymère et de l'acide nucléique sont de pr~re~nce....;n~s de sorte que le rapport molaire R = amines du polymère/ph~ hn~P~ de l'acide n11rl~le soit co~ is entre 0,5 et 50, plus ~l~çél~ mf!nt entre 5 et 30.
Des résultats tout particulit ~ avantageuY sont obtenus en lltili~nt de 5 à 15 équivalents d'amines de polymère par charge d'acide nucléique.
En ce qui conrrrne plus particuliel~-nen~ les Lpor~L~lL~, il s'agit de molec~lles ~...plliphil~s colll~ nant au moins une région hycL~hile cationique, par exemple polyamine, et une région lipophile. La région cationique, yl~re~nLiellement polyamine, chargée c~t ~ni~ ement est capable de s'associer de manière réversible avec l'acide nucléique, chargé négativement. Cette interaction compacte fortement l'acide nucléique. La région lipophile rend cette interaction ionique in~r~ihle au milieu aqueux externe, en recouvrant la particule nucléolipi~ e formée d'une pPni~ll? lipidique.
Av~nt~ .ent ces lipofectants peuve"~ ég~lrmrnt être choisis parmi des lipopolyamines dont la région polyamine répond à la formule générale II
~ H2N~ H)m-NH-)n-H II
dans laquelle m est un nombre entier supérieur ou égal à 2 et n est un nombre entier supérieur ou égal à 1, m pouvant varier entre les différents groupes de carbone ~ ~A 02i3io64 1998-03-24~ -- =v; r~
~ ln cornp~i~ en~re d~ux amin~ ~ref~ ticll~mcnt, rn ~st cornpris ~nrr~ 2 ~t inc~u~ rrl~rlt ~t ~1 est compris entre I et 'i inclusi~ement. ~nc~r,~ plu~
pr~férent;ellement, la ~gion pol-amine es. représentée par la ~p~rrnine, la th~rrnine ou un de leurs anak~gues ~vant conservé de~ propriétes ~Le ]iaison a 1'.4DlN. Quant ~ la 5 regic~n li~3phil~, elle est reL~resent~ par ~u moins rLrLe chaine hy<lroc3rborlée, saturé~
ou non, du cholest~rol, un lil~ide naturel ou un lipide synthétique capable de fcrrner dc~;
phases 13mell,~ires ou hexa~onales, liée dc maniere co~ aLent~ à la région hydrciph le.
La der~ande de bre~et EP 3~ 111 décrit d'au~res ]ipopcLyamines cle tc~rrnu!e g~;nerlle 111 ~u.sce~tibles ;i'~tre ntises en oeuvre dan~ le cadre d~ la ,orésente in~ention 1I N~f~l1m Ht~ ILl R
d~n~ uelle R représente nc,~mment un radi(:~l de rormule génér~le ~R1R2) N-CO-CH - I'iH-CO- .
A titre représen~ati~ ces lipop~l~,-a~nines on l?~ut pius }~arricu1ièrerncnt citer !a dioe~adécyl.lmidoglyc~l s,~elm~r.e ~DOGS~ e- !a :~-earboxyvp~rTrl-ilvmide dc la l ~i palrl~itc ~ Ipilosphatidyl~th~lr.ol~ ine (DPPES).
Le~ lipopol~2mine~s ~éerite~; d~n~ L;l ~iemand~ de br~,et F~ ~4 1~96 ~ u~en~
é~lement ~t~e uti1i~ées ~.~antageu:;ement a titre d'agcnt de tr~ns~e~tic)n ~k,n l'in~cntion. Elle.~i :;ont représer.~ees par la forrnule ,~énér~le 111 ci-de~i~us d~-ls laquell~ R
représente ,. R3 /X--~1 ~ ,~y--R6 IV
'~0 ~5 a~
- X et X' représentant, indeper~d~mrnent I'm c~ l'autre, un ~tome d'oxygène, LLn groupement rn.~hylène -(C1~2)9- ave~ q e~al ~ ~, 1, 2 ou i3, ou urL groupement ~mino -I~'EI- ou -~ '- a~ ~ R' repré~nt~nt un ~roupemenl alkyle en C I a C 1, ".~ - Y et ~' réprésentant ind~pend~mment l'un de l'~utre un gn~uperr.ent rn~lh~lene. un ~rour~meTIt carbon~le ou un ~r~upe!nent C=S, FEUILLE ~ E
' ' Y ~ CA 02231064 1998-03-24~
- R3, RS ~ r~pr~ ntant in~ieT~cndamrn~nt l'un ;le l'~utr~ Lll~ ~t~me d'h~droc ne ~u un r;~clic31 ~l~yle, ~ubs~itue oll n~)n, en C] à C~ ec p p~uvant ~ ri~r ~ntre 0 et ~, R6 repre~ent~nt un dcri~ du chol~st~rol C)'l un gro~lF~ment ;311~1e amino -.~R11~2 aYec Rl et R2 rcpresent~nt in~i~pendamm~nt l'un de l'~utr~ u,l radioal aliFh~lhq5 ~ature ou n~n, liné3i~ ou rlmifi~ en C12 a ~22.
A titre repré~sentatif de c~ pol~amir.e~ on peut tout par~iculi~rement citer le (Diocwdé~yl-carbatnoylméth< ~ acétale c:e 2-~i-bis-(3-amino-prop~larr.ino)-pent~
et ]e (~ioctad~cy~-czrbamcylmethox~)-2cétate de 1 ,3-bis-t3-:1minc~-prc~p~ l~lmino)-~~ropyle .
Les d~mandes dc bre~et EP 3~ 111 et FR ~ 59~ decri~,erLt é~,~lemer.t proc~éde utili~ab]e pOW' la pl~par~tion des liFop~lyarnirles corr~s~n~ nt~s.
~ )~ r;larLi~e ~aniculi~rrln~nt a-~nt~eu.e, c)n F~ut util ~r daJls '~ ca~lre de l'in~ent;on la dicct~:décylamidogl~-c~i spermine ~DO~Sj k 5-car~ox~s?crmylarnid~ de 1.1 ?:~lrrtitGylpho~ph~t!id~,lethanollmine (DPPE~;~ le ~Di~ade~ e;lr:~amo~ the~
15 acetate de _-5-bia-(3-:~mino-p~-t~pylamino)-pentvle <)u le ~Dioctacl~,l-carb2mo~ 1-rnet~to.~ c~t~Lte de 1 3-bis-(3-amino-propylarnin~>)-2 pro?yle.
PoUI ob~.enir Wl et-t~'t optimum clea comx~i iclna ~1~ l'in~enti~n 'ea proForei~ns respe~cti~es de la ~ Yam~ne et de l'acide nucl~ique sont dc prcferenc~
dét~mnin&s de sorte que le r~ppc)rt R ch~rges positilies -'e l'a~ent de ~r~tn.slection/
'>O char~ea negati~ej cte- l'acictè nucLeic~u~ soit cr~mpr;s ~ntr~ e~ l~) et prc~ferentielle7r.enl entre 0 S et -'.
I a r)re~ence d'un composé selon l'in~ention LtU ~in d'une compositicjn ~ra~ ;fec~ante est aYantage-i-~e 'a pllLsieurs ~iIre.~. L'n p ~rticulier i: s'cn ~uit un~ t xicilé
nettement ~tmoincir.e 4 ~i fend dc~e)rrn~ia pu~aible ptr e~rr.p]e la trLtns.fecti- n de 25 cellu!~s sensibles à l'ori~ine ~ I' a ent de transtection cornme ?ar e.~mple l~s celLulea hém~atctp<)ïéti;~u~a ~l~ ec les Li~ap~ rrtines.
_ ,, Dans les c~-...po~ de la p~sell~ inv~ io.~, l'acide mlr,lPi~lt~P peut être aussi bien un acide déso~ylibo~ clPilue qu'un acide rihnmlclP;lue. Il peut s'agir de s~uPnrP-~ d'origine naturelle ou artifiri~pllp~ et n. ~ d'ADN f~Pnomiq1l~, d'ADNc, d'ARNm, d'ARNt, d'ARNr, de séquences hybrides ou de séquences sy}-ll,.,liques ou5 semi-synthétiques. Ces acides nl~c1PJql1PS ~u~ l être d'origine l~ nim~le, vé~t~le ~ctériPnnP, virale, etc. ns peu~ être obtenus par toute technique connuede l'}-ol.,ll,e du métier, et n~ ....P..I par rrihlagP de banques, par synthèse rhimiql1e ou encore par des m~th~les mixtes in~ nt la m~ifir~tiQn rhimicltlp ou ~y...~l;qv~P-de séquences obtenues par ~rihl~ge de banques. ~s peuv~lll par ailleurs être illcor~L~s 10 dans des V~;leUL:j, tels que des vecteurs pl~mitliques.
Conl Prn~nt plus particuliè~ les acides désoxyribonllrl~ ues~ ils peuvenL
être simple ou double Wn. Ces acides d~so~cy,ibt nnrlPi~lues peuvel.L coder pour des gènes thérape~t qtnP.s, des séquences rég ll~trirP~ de la transcription ou de laréplic~t on, des séquences ~nti~Pn~, des régions de liaison à d'autres composants cp~ ires~ etc.
Au sens de rinvention, on entend par gène thérapeutique lloli-.. ent tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thé-d~uLique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la oellule cible (c'est-à-dire un produit qui est 20 norm~lement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucunepathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression ;n~rr~ dans la oellule ou l'e~p.e~ion d'une protéine inactive ou f~ ment active en raison d'une mo lific~tion~ ou encore de suL~Lilller ladite protéine. Le gène théldpeuLique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine 25 oell~ ire~ ayant une st~hilité accrue, une activité morlifiée etc. Le produit protéique peut ég~lem~Pnt être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité ~leficiente dans lacellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse imml Init~ire.
W O 97/12051 PCTA~R96/01516 Parrni les produits ll ~in~ l;ques au sens de la ~l~s~,le i~-ve:"liOn, on peut citer plus particulii;~~ nl les enzymes, les dérivés ~An~-in~A, les hormones, les ly~ s intf~rl~lkin-~..s, ~ e~re~ s, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de ~ Ç~ les ne,n;)1,n~ ttellr~ ou leurs precllr~ellrs ou ~,L~y,l~s de ~y~ ~se~ les 5 facteurs trophiques: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléic"Luplline, etc; les apoli~ot~ es: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR9305125), la dy jLlu~ e ou une mini-ly:~lLo~lLLle (FR 9111947), la protéine C~lR A~A~iPe à la IIIUCUVi~ les gènes ~pp~:~eu-~i de lul~leuLs p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FlR 93 04745), les gènes cod_nt pour des ra-;L~u,~ imrlir~
10 dans la Co5lgll1Atil-)n Facteurs VII, VIII, IX, les gènes illl~ vell~lL dans la réparation de l'ADN, les gènes s~ e~A (thy~nidine kinase, ~;yLosi~,e .1 ~Amin~Ae), etc Le gène l},c.a~..lique peut e~lf~m~nt être un gène ou une séquence AntiA~n~, dont l'~_~p,~ion dans la cellule cible permet de contrôler l'~,e~sion de gènes ou la LLan ion d'ARNm c~ llAires De telles séquences pe~Lv~L, par ~Y~mple être 15 trAn~ritf~s dans la cellule cible en ARN compl~ ~ d'ARNm c~ llAires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les Anti~ns cc, ~,p-c~ ent ég~lem~nt les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201).
Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut ég~l~m~nt co--,po-L~ un ou 20 p11lsiellr~s gènes codant pour un peptide ~ntigé.nique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une l~pollse immlmit~ire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet donc la ré~li.s~ti- n soit de vaccins soit de tr~it~m~.nt.s immlmc~thç.rapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notAmment contre des microorg~nism~s, des virus ou des cancers. Il peut s'agir not~mm~nt de peptides 25 ~nti~niques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hep~7tite B
(EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou eneore spécifique~s de tumeurs (EP 259 212).
I~lr.~;el1~m~.nt, I'acide nucléique comprend ég~1em~nt des séquences permettant l'expression du gène thérapeutique etjou du gène codant pour le peptide W O 97/12051 PCTA~R96/01516 ~ntigi~nique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des séquences qui sont naturell~m~nt ~s~ hles de l'expression du gène con~ ré lorsque ces séq1~ n~
sont s~epl;h~ de fon vh~)nn-~r dans la cellule infe~, Il peut e~ mPnt s'agir de séquences d'arigine dirr~ e (~-s~ hles de l'~ion d'autres pn)le~ s, ou même synthPfiTI~oc). Not~mm~?nt il peut s'agir de séquences prom~tri~ de gènes euc~y-,~s ou viraux. Par ~Yemrle, il peut s'agir de sequeJ-ces promotrices issues du ~nome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences prc~mot~ices issues du ~nom-~ d'un virus. A cet égard, on peut citer par PY~mrle les promoteurs des gènes ElA, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvt~ être moflifif~s par a(l-7iticn de séquellces d'activation, de ré~]l~ticn, etc.
Par ~ill~ms, l'acide m~ iq1~? peut é~ll~-m~nt coln~L~er, en particulier en amont du gène thel~pe~,lique, une séquence signal r~irigptqnt le produit IL~ euLique synth~ti~e dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquenoe signal naturelle du produit th~. 2.p.eul ;que, mais il peut é~lem~-nt s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d~une séquence signal arhficiell~
Plus p~îé~.-l;f llemf~nt les compositions de l'invention comp~llllell~ en outre,un ou plusieurs lipides neutres. De telles compositions sont particulièrement avantageuses, n~t~mm~nt lorsque le rapport R est faible. La ~l~m~n-l~resse a en effet montré que l'~fitlition d'un lipide neutre permet d'améliorer la fonnation des particules nuclé- liri~iques et, de mani~le su,p.~na,~e, de favoriser la pénétration de la particule dans la cellule en rl~lst~hili~nt sa membrane.
Plus ~c~ ,l;ell~m~nt les lipides neutres utilisés dans le cadre de la présente invention sont des lipides à 2 chaînes grasses.
De manière particulièrement av~nt~ e, on utilise des lipides naturels ou synthétiques, ~wiLLe.ioniques ou dépourvus de charge ionique dans les c~)n~liti(~n~
physiologique. Il pellve~lL être choisis plus particuliè,~,l~~lL parmi la dioleoylrhosph~-tidyléth~nf~l~min~ (DOPE), le oléoyl-palmitoylphos-phatidyléthanolamine (POPE), le di-stéaroyl, -palmitoyl, -miLy~uyl phosphatidyléthanolamine ainsi que leurs dérivé N-30 méthylés 1 à 3 fois; les pho~rh~ ylglycérols~ les diacylglycérols, les ~ly~o~yldiacyl-glycérols, les cé~ebl~sides (tels que no~ e~l les ~ oc~ebr~)sides)~ les sphingo-lipides (tels que ~ les srhin~nmyélines)ou encore les ~Qi~lo~ng~ Q (tels ~ que n.. l~.. ~.. ~r,.. ~ les asialoGMl et GM2).
Ces dirre~.L~, lipides peuvellL être obtenus soit par .,yll~lèse, soit par 5 extraction à partir d'organes ~el~ le: le celvea~l) ou d'oeufs, par des techniques cl~Q~Q;qve~Q, bien ~nm1eQ de l~omme du métier. En particulier, l'extraction des lipides naturels peut être réalisée au moyen de solvants organiques (voir e~lem~nt r Phnin~, Bio~h~", ;~,~, y) ~ éré~.~ lhm~nt les compositions de rinvention, mettant en oeuvre à titre 10 d'agent de transfection un lipofe~;kul~ col~ e~ ent de 0,1 à 20 équivalents de lipide neutre pour 1 équivalent de lipopolyamine, et, plus ~éçe~ nlf~nt~ de 1 à 5. Dans le cas où l'agent de LL~u~,re~;lion est un polymère c~tioni~lue~ les co,llposilions de l'illYellliOn co~llprel~nellL~ en plus du polymère cationique dans les la~)ol~, cités ci-avant, de 0,1 à 20 équivalents molaires de lipide neutre pour 1 équivalent molaire de 15 phoQ,ph~t~ de l'acide nucléique, et, plus préré~ llem~nt de 1 à 5.
Les compositions selon l'invention peuvè"l être formulées en vue d'2~ 1. dlions par voie topique, cutanée, orale, rectale, v~gin~le, p~enLeldle, jl~L~ le, u~ veilleuse, illLl~ ire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc... De préférence, les compositions phar~-elltiques de l'invention conti~nn~nt un 20 véhicule pharm~e..l;qlle.,~lll acceptable pour une formulation injectable, n~ ..,...ent pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une ~ . dlion par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notam~ent lyoI~hili~" qui, paraddition selon le cas d'eau st~rili~ée ou de sérum physiologique, permettent la 25 constihution de solutés injectables. Les doses d'acide nucléique llhli~?~ pour l'injection ainsi que le nombre d'~lmini.etrations peuve~ll être adaptées en fonction de dirrélellL~
paramètres, et notamment en fonction du mode d'~ dlion utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement ~ recherchée.
CA 0 2 i 3 i o 6 4 19 9 8 - 0 3 - 2 4 __ r . -,. 1~;
ELl~ peu~eJlt etre a~ln~t~usemcnt ut~ rts pour rrsr~;f~t~r Ir.~ ~r~ndevariétt de t~pe cellulaire comme par ~.;t rn,n,e ~'t~i cellulL~ nemalo,~t~iétiques les l~mphoe~tes, les hepatGcytes, les cellules enclothcliale~, L~i cellul~s L~e rnelano~nes ~e carcinc~rnes et dc ~iarcomes 1~ cellul~s rnu~.ul~ire~s lisses. Ie~ n~u.one.Y ~t lt- s 5 astr-oc~-tes.
La présente in~ention ~ournit ~in~ ne méth~xl~ particu]ierement a~nta~,eu~
pvur le uaitement de rnaladies uti]i.sant 1LS tra~1~t~eC.;<)n 1n V;tr~ ), eX V;-rO I)U irl vi~.v d'un acid2 nucleit,ue ~,t,at~ n~_er ladite rnal~d e en ~a~;oclatiorl 3~e~ un a~en~ t e transt~ectinn de ~pe E~ rr.ère cationique ou ]ipofectr~nt. et un corn~ ;e tel que de.~illi 10 ci-a~nt. Plu~ particuli~rem.ent. cette mérhode es~ a~tyl.cable au-;~ malacies re~u~taJI;
d'une déticience en un produit protéiqlle ou nucleique et l'~c de r.ucleique v.dnniri~lre code pour ledi~ produit yrotéique ou c~nt;ent la jeou~nce c~tresyor~dan~ audit prG~ui~
nucléique. L,e~ compo~ition~ s~elor: I'in~,eTltt~n .~ont p2rticuliere.rl1~rt intér~sanre~ pour leur ~)iodisE)on e et leur ni~e~u de T~an~fectivn.
-ésente inverltion c:~ncerne éc !llement ~ou~e utilisatic;rl d'un c~mpose selon l'in~enti~n couple à un li~,~Ln~l de recepIeur cellul .ir~, un ant;c~rps ou d~ri- e d'anticcrps~ pour cil~ler un acide nL~ciéique ~,ers ~es eeUuLe~s e~prirnanl l~s récepte~.~
<~u ~ti-gene~ co~resp(~ndams Dans cette perspecti~e, un lig~n~, an;ic~rps o~ dénvé
d'~nticcrps p~tentiel est cou~ audit ccrrtElc,~;c et i'orL a?precie le r~u~3ir de 70 trarstecti(an de eet~e mclecule chimèr~ c~mpa~ativement au com~>sé se~l.
L.a prc~cnte ir~nt;on ser~ plus compl~tem~nt dec..te à l'aic~e des e~;er,~ple~
qui sui~ent, 4ui doi~ent etr2 c.~nsideré~s comm~ illustraLit's ~t nc~n lirr.i~atifs.
~IC~'RE~
Fie,ure 1 ~e~ré~entation ~ intensités lumineuse~ de l efficacité d~ nsf~ctiens 25 r~a]isees selon l'invention dani dift~renLs t~pes cellulaires.
Fi~ur~ 2: ~.ppréci~t;~n ~le l'e~f;caci~é de iran~;f~ ti~7ns réalisées en Frc.sencr, et er.
;lb~;~nc~ ~e }I~IGl.
l~ElJlLL-~ ,r~ "~; ,r,'r MATERIEL FT METHQDES:
- La construction utilisée pour mettre en évidence l'activité des cv~ n~ de l'invention est un pl~mitleco~ o~l~ll le gène codant pour la luciÇ~.~ (Luc), pCMV-Luc.
Le pl~ni-l~ pCMV-luc comporte le promoteur du Cyt mé~lovirus (CMV), extrait du rl~mi.le vecteur pcDNA3 (Invit,rogen) par collp~ avec les ~y-l-es de restriction Mlu I et ~in~1m, situé en amont du gène codant pour la luciférase, inséré
aux sites MluI et Hindm dans le vecteur pGL basic Vector (Promega).
EXEMPLE l: PREPARATION DE LA PRO l~;INE HMGl DE RAT
1.1 Fxpression de la protéine HMG1 chez E. coli Cette protéine rec-)mhin~nte provenant d'un r~ ele a été préparée par s~ piession chez E. coli.
Le pl~mi~l~ T7-RNHMG1 codant pour la protéine HMG1 de rat (M. E. Ri~nrhi, Gene, 104 (1991) 271-275) est introduit dans la souche d'E. coli BL21(DE3). La 1~ souche est par la suite cultivée à 37~C en milieu LB+~mr illin~? (25 mg/L). Une préculture est obtenue à partir d'une colonie isolée. Elle permet d'ensemencer une culture de 500 ml. Lorsque l'absorbanoe à 600nm de la culture atteint la valeur de 0,7, la synthèse de HMG1 est induite par addition d'I~G à 0,5 mM ~mal. La souche productrice de HMG1 est encore cultivée 2h30 en présence d'IPTG. Les oellules sont ensuite récoltées par centrifugation (5000 x g, 20 minlltes), rincées par 200 ml d'eau ~ till~,e centrifugées de nouveau. Le culot de oellules est conservé à -80~C jusq'à
purification.
1.2: purification de la protéine HMG1 recombinante La purification de la protéine HMG1 peut être effectuée par chrom~tographie à partir
2~; d'une culture de la souche de E. coli décrite dans l'exemple 1.1, par exemple en utili~nt le protocole suivant:
Sauf in~ t1r~n col.h~ hl~ de la pl1rifir~ti~n décrite ci-dessous est effectuée à 4~C. Les cellules ol~ es à partir de 500 ml de culture sont ~-S~ p~ t1es dans 15tml de tampon 50 mM Tris/HCl pH 7,7 cont~n~nt 500 ~ EDTA, 5 rnM DTT, 200t~M Pefabloc SC [4(2-~min-çthyl)-b~n7~n~-1fonyl fl-~ le lly-ll~hlori-le]~ et5 10 ~o (poids/volume) glycérol. Après cassage des cellules par soni~t~c-n durant 15tmin, les débris u~ ires sont séparés par centrifugation (50 000 x g; 1 h) L'ex~ait ~c~11l11~ire est ensuite clk.. ~ hié à travers tme coknn~ de ~'~eph~ x G-25 (Pharmacia) e~ 1ilihrée et éluée avec du tampon A [20 mM Hepes pH 7,9 co.,~
400 mM chlorure de ~li~ , 200 mM EDTA, 1 mM DTI', 200 ~lM Pefabloc SC, 0,2 ~o Nonidet P40, et 10 ~ glycérol]. La fraction contf~n~nt les protéines est récoltée et chromatographiée à travers une c~ nne de gel DEAE Sephadex A-25 (Pharmacia) équilibrée dans le tampon A. La fraction protéique non retenue sur cette colonne est m~l~n~ pro~e~iv~ ent avec du sulfate d~mm~ni11m solide jusqu'à une c-)n-~.ontration finale de 2,8 M. Après 2 h, cette s~ ion est centrifugée (30 000 x g;
15 15 min). Le surn~nt est dh J.na~ographié à 20~C à travers une colonne Phényl-Superose HR 5/5 (Pharmacia) équilibrée dan~ du tampon 20 mM Hepes pH 7,9 c-nten~nt 200 mM EDTA, 500 ~I DTr, et 2,8 M sulfate ~l';..-~.l-.~ni~ Les protéines sont éluées de la colonne avec un gradient linéaire décroissant de sulfate d';~
(2,8 M à 0 M) dans le même tampon. Les fractions contenant la protéine HMGl sont20 regroupées et dialysées extensivement contre du tampon 50 mM Tris/HCI pH 7,7 c~nt~n~nt 1 mM EDTA et 500 ,uM DTT. Cet e~h~ntillon est ensuite injecté sur une colonne MonoQ HR 5/5 (Ph~ ci~) qui est ensuite éluée avec un gradient linéaire de O à 0,5 M de chlorure de sodium dans du tampon 50 mM Tris/HCI pH 7,7-500 ,uM
DTT. La protéine HMG1, qui forme un pic d'abso~ballce symétrique à 280 nm, est 25 collectée dans ce tampon. La protéine HMGl est ensuite reprise dans du tamponlOmM Mes pH6,2-140 mM NaCl-500,uM DTT après c-~nc~ntration par centrifugation dans Centrikon 10. La protéine HMG1 est stockée à -80~C jusqu'à llfili~tinn. Cette pl~pa-a~ion présente une seule bande protéique migrant à un poids molé~-l~ire appare~lL de 31 000 lorsqu'elle est analysée par électrophorèse en c- n~itionC
30 dén~ les (SDS) et révélation au Coomassie. Le r~ntl~m~nt global de la purification est de 850 ~g de protéine HMG1 pure pour 500 ml de culture de départ.
W O 97/12051 PCTA~R96/01516 EXEMPLE 2: TRANSFERT D'ACIDE NUCLEIQUE IN VITRO DANS DES
CELLULES DE MAMMIlFERE
Cet exemple montre cc-.. rn~ une protéine, de type HMG1, se liant à l'ADN et étant ée dans le noyau de manière active, peut être utilisée pour shmt~l~r la 5 lla~re~lion d'ADN p1~ que.
La construction utilisée pour mettre en évidence l'activité des compositions de rinvention est le p~ ie comportant le gène codant pour la luciférase (Luc) décrit préc~1el....~
Le protocole est établi pour des plaques de 24 puits (0 16mm) à recolter 2 jours après transfection (c~ s à cr~flll~n~e). Tous les paramètres ~llv~ être m~ifi~c ~)lupO~ l;onnf~llf?mf~.nt.
Le jour J les oellules NIH 3T3 (ATCC: CRL1658), 3LL (Isakov N.et al., JNCI
71(1983) 139-145) H460 ~Maxwell et al., Oncogene 8 (1993), 3421-3429) sont ~.n~çm~nl~.ée.~ à 105 cellules par puits.
Le jour J+2 les cellules sont rincées avec du PBS (pour elimine.r les traces de serum) et reprises dans 250 ml de RPMI (3LL et H460) ou DMEM (NIH3T3), supplémenté ou non par 10 ~o Serum Fetal de Veau (SFV) Composition mise en oeuvre pour la transfection:Par équivalent puits, dans un tube on ajoute:
- H2O qsp 20 ml - NaCl qsp 140 mM final - 0,5 mg d'ADN pl~mi~ique - 125 ng HMG1 puis on vortexe modérément et on incube à ~ a~ule ~mbi~ntl? 15 mimlt~ avant 25 d'ajouter 1,5 nmole de lipofectant DOGS. On vortexe à nouveau modérément et incube à lel,-~la~,l,e ambiante 15 minllteS
Les cellules sont transfectées par ajout de 20 ml du mélange ADN/HMG1/lipofectant au milieu de culture, inc~ s pendant 2 à 4 heures à 37~C. Ce milieu est ensuite remplacé par du milieu complet.
Le jour J+4 les oellules sont rinc~es à ~~ e ~mhisnte par 250 ml de PBS, lysées dans 100 ml de tampon ad hoc (Reporter (Promega)+TCK et A~)Linill). 10 rnl de lysat et 50 ml de su~ Ll~L (Promega) sont utilisés pour Ines.l-~ l'activité de la l--cir~ ~y.,~
5 Les ré.s--h~ts p~senL~s en figures 1 et 2 sont la moyenne de quatre ~A~fiences, répétées ;.~lp~n~l~ m~nt 2 fois. Pour ce faire on apprécie les Unitées r ...~ ..~ (UL~
obtPn1les par ~A~l~s~ion du gène Luc dans les cellules transfectées.
La figure 1 r~emhle les valeurs obtPn~ s pour les trois types c~ ires préceA~.. ~.. I cités, en ~ sell~e de qu~lLi~e variable de protéine HMGl.
10 La figure 2 ~ hlP~ de ll,a~iè.~ synoptique les r~.;~s de stimulation de la transfection obtenus par ajout de dirre ._llles qt~ de protéines HMGl.
L'~ n de l'Pffl~ i~ de ll~rt:~;Lion par la protéine HMG1 est variable selon les types cellulaires.
On observe ainsi qu'elle est Ind~llale lorsque le rnilieu co..~ ..l la composition 15 nPcç~ à la transfection est supplPmPntP par 10~o SFV. Ceci est ~ e~ car la présence de SFV représente les c~n~liti-)n~ rencontrées in vivo. D'autre part il est notable que la présence de SF V ~limin11P l'Pffic~ite de transfection, particuliè~ el-~ en l'~bsPnc~e de protéine HMGl. On peut penser que la présence de SFV dans le milieu de culture ~ e la ~ LiL~ d'ADN susceptible d'être in~Prn~ e par les c~ IPS. Dans 20 ce cadre on peut conclure que HMG1 est particulièrement avantageuse pour la transfection dans des c~n~iti~n~ OU la quantité d'ADN est li...;l~..le, Le rapport HMGl/ADN (en masse) optimal pour la transfection est 0,25 à 0,5. De telles conditions ne sont pas décrites comme étant capable de compa~er l'ADN
(Bottger M. et al., B.B.A. 950 (1988), 221-228); Stros M. et al., N.A.R. 22 (1994), 1044-1051). En effet le pl~mi~P n'est pas saturé par HMGl (~hl~taP-lt L.A. et al., Bio(~hPmi~ry 33 (1994), 12702-12707). L'effet de la protéine HMG1 est donc expliqué par sa c~pacité à lier l'ADN et à être transportée vers le noyau de la cellule.
Sauf in~ t1r~n col.h~ hl~ de la pl1rifir~ti~n décrite ci-dessous est effectuée à 4~C. Les cellules ol~ es à partir de 500 ml de culture sont ~-S~ p~ t1es dans 15tml de tampon 50 mM Tris/HCl pH 7,7 cont~n~nt 500 ~ EDTA, 5 rnM DTT, 200t~M Pefabloc SC [4(2-~min-çthyl)-b~n7~n~-1fonyl fl-~ le lly-ll~hlori-le]~ et5 10 ~o (poids/volume) glycérol. Après cassage des cellules par soni~t~c-n durant 15tmin, les débris u~ ires sont séparés par centrifugation (50 000 x g; 1 h) L'ex~ait ~c~11l11~ire est ensuite clk.. ~ hié à travers tme coknn~ de ~'~eph~ x G-25 (Pharmacia) e~ 1ilihrée et éluée avec du tampon A [20 mM Hepes pH 7,9 co.,~
400 mM chlorure de ~li~ , 200 mM EDTA, 1 mM DTI', 200 ~lM Pefabloc SC, 0,2 ~o Nonidet P40, et 10 ~ glycérol]. La fraction contf~n~nt les protéines est récoltée et chromatographiée à travers une c~ nne de gel DEAE Sephadex A-25 (Pharmacia) équilibrée dans le tampon A. La fraction protéique non retenue sur cette colonne est m~l~n~ pro~e~iv~ ent avec du sulfate d~mm~ni11m solide jusqu'à une c-)n-~.ontration finale de 2,8 M. Après 2 h, cette s~ ion est centrifugée (30 000 x g;
15 15 min). Le surn~nt est dh J.na~ographié à 20~C à travers une colonne Phényl-Superose HR 5/5 (Pharmacia) équilibrée dan~ du tampon 20 mM Hepes pH 7,9 c-nten~nt 200 mM EDTA, 500 ~I DTr, et 2,8 M sulfate ~l';..-~.l-.~ni~ Les protéines sont éluées de la colonne avec un gradient linéaire décroissant de sulfate d';~
(2,8 M à 0 M) dans le même tampon. Les fractions contenant la protéine HMGl sont20 regroupées et dialysées extensivement contre du tampon 50 mM Tris/HCI pH 7,7 c~nt~n~nt 1 mM EDTA et 500 ,uM DTT. Cet e~h~ntillon est ensuite injecté sur une colonne MonoQ HR 5/5 (Ph~ ci~) qui est ensuite éluée avec un gradient linéaire de O à 0,5 M de chlorure de sodium dans du tampon 50 mM Tris/HCI pH 7,7-500 ,uM
DTT. La protéine HMG1, qui forme un pic d'abso~ballce symétrique à 280 nm, est 25 collectée dans ce tampon. La protéine HMGl est ensuite reprise dans du tamponlOmM Mes pH6,2-140 mM NaCl-500,uM DTT après c-~nc~ntration par centrifugation dans Centrikon 10. La protéine HMG1 est stockée à -80~C jusqu'à llfili~tinn. Cette pl~pa-a~ion présente une seule bande protéique migrant à un poids molé~-l~ire appare~lL de 31 000 lorsqu'elle est analysée par électrophorèse en c- n~itionC
30 dén~ les (SDS) et révélation au Coomassie. Le r~ntl~m~nt global de la purification est de 850 ~g de protéine HMG1 pure pour 500 ml de culture de départ.
W O 97/12051 PCTA~R96/01516 EXEMPLE 2: TRANSFERT D'ACIDE NUCLEIQUE IN VITRO DANS DES
CELLULES DE MAMMIlFERE
Cet exemple montre cc-.. rn~ une protéine, de type HMG1, se liant à l'ADN et étant ée dans le noyau de manière active, peut être utilisée pour shmt~l~r la 5 lla~re~lion d'ADN p1~ que.
La construction utilisée pour mettre en évidence l'activité des compositions de rinvention est le p~ ie comportant le gène codant pour la luciférase (Luc) décrit préc~1el....~
Le protocole est établi pour des plaques de 24 puits (0 16mm) à recolter 2 jours après transfection (c~ s à cr~flll~n~e). Tous les paramètres ~llv~ être m~ifi~c ~)lupO~ l;onnf~llf?mf~.nt.
Le jour J les oellules NIH 3T3 (ATCC: CRL1658), 3LL (Isakov N.et al., JNCI
71(1983) 139-145) H460 ~Maxwell et al., Oncogene 8 (1993), 3421-3429) sont ~.n~çm~nl~.ée.~ à 105 cellules par puits.
Le jour J+2 les cellules sont rincées avec du PBS (pour elimine.r les traces de serum) et reprises dans 250 ml de RPMI (3LL et H460) ou DMEM (NIH3T3), supplémenté ou non par 10 ~o Serum Fetal de Veau (SFV) Composition mise en oeuvre pour la transfection:Par équivalent puits, dans un tube on ajoute:
- H2O qsp 20 ml - NaCl qsp 140 mM final - 0,5 mg d'ADN pl~mi~ique - 125 ng HMG1 puis on vortexe modérément et on incube à ~ a~ule ~mbi~ntl? 15 mimlt~ avant 25 d'ajouter 1,5 nmole de lipofectant DOGS. On vortexe à nouveau modérément et incube à lel,-~la~,l,e ambiante 15 minllteS
Les cellules sont transfectées par ajout de 20 ml du mélange ADN/HMG1/lipofectant au milieu de culture, inc~ s pendant 2 à 4 heures à 37~C. Ce milieu est ensuite remplacé par du milieu complet.
Le jour J+4 les oellules sont rinc~es à ~~ e ~mhisnte par 250 ml de PBS, lysées dans 100 ml de tampon ad hoc (Reporter (Promega)+TCK et A~)Linill). 10 rnl de lysat et 50 ml de su~ Ll~L (Promega) sont utilisés pour Ines.l-~ l'activité de la l--cir~ ~y.,~
5 Les ré.s--h~ts p~senL~s en figures 1 et 2 sont la moyenne de quatre ~A~fiences, répétées ;.~lp~n~l~ m~nt 2 fois. Pour ce faire on apprécie les Unitées r ...~ ..~ (UL~
obtPn1les par ~A~l~s~ion du gène Luc dans les cellules transfectées.
La figure 1 r~emhle les valeurs obtPn~ s pour les trois types c~ ires préceA~.. ~.. I cités, en ~ sell~e de qu~lLi~e variable de protéine HMGl.
10 La figure 2 ~ hlP~ de ll,a~iè.~ synoptique les r~.;~s de stimulation de la transfection obtenus par ajout de dirre ._llles qt~ de protéines HMGl.
L'~ n de l'Pffl~ i~ de ll~rt:~;Lion par la protéine HMG1 est variable selon les types cellulaires.
On observe ainsi qu'elle est Ind~llale lorsque le rnilieu co..~ ..l la composition 15 nPcç~ à la transfection est supplPmPntP par 10~o SFV. Ceci est ~ e~ car la présence de SFV représente les c~n~liti-)n~ rencontrées in vivo. D'autre part il est notable que la présence de SF V ~limin11P l'Pffic~ite de transfection, particuliè~ el-~ en l'~bsPnc~e de protéine HMGl. On peut penser que la présence de SFV dans le milieu de culture ~ e la ~ LiL~ d'ADN susceptible d'être in~Prn~ e par les c~ IPS. Dans 20 ce cadre on peut conclure que HMG1 est particulièrement avantageuse pour la transfection dans des c~n~iti~n~ OU la quantité d'ADN est li...;l~..le, Le rapport HMGl/ADN (en masse) optimal pour la transfection est 0,25 à 0,5. De telles conditions ne sont pas décrites comme étant capable de compa~er l'ADN
(Bottger M. et al., B.B.A. 950 (1988), 221-228); Stros M. et al., N.A.R. 22 (1994), 1044-1051). En effet le pl~mi~P n'est pas saturé par HMGl (~hl~taP-lt L.A. et al., Bio(~hPmi~ry 33 (1994), 12702-12707). L'effet de la protéine HMG1 est donc expliqué par sa c~pacité à lier l'ADN et à être transportée vers le noyau de la cellule.
Claims (24)
1. Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'au moins un acide nucléique caractérisée en ce qu'elle contient outre ledit acide nucléique au moins un composé associant des propriétés de fixation de l'ADN à une capacité de vecrorisation nucléaire de cet ADN et au moins un agent de transfection choisi parmi les polymères cationiques et lipofectants.
2. Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'au moins un acide nucléique caractérisée en ce qu'elle contient outre ledit acide nucléique, au moins un composé appartenant à la famille des HMG ou l'un de ses dérivés et au moins un agent de transfection choisi parmi les polymères cationiques et lipofectants.
3. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que le composé est choisi parmi les protéines de type HMG 1, 2, I, Y, 14 et 17 et leurs dérivés.
4. Composition pharmaceutique selon des revendications précédentes caractérisée en ce que le composé est représenté par tout ou partie de la protéine HMG1 humaine, l'un de ses dérivés ou homologues.
5. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisée en ce que ledit composé est en outre polyglycosylé, sulfoné, phosphorylé
et/ou greffé à des sucrés complexes ou à un agent lipophile.
et/ou greffé à des sucrés complexes ou à un agent lipophile.
6. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que ledit composé est en outre associé à un ligand de récepteur cellulaire ou nucléaire.
7. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que l'agent de transfection est au moins un polymère cationique de formule générale (I):
(I) dans laquelle - R peut être un atome d'hydrogène ou un groupe de formule - n'est un nombre entier compris entre 2 et 10;
- p et q sont des nombres entiers, avec la somme p+q étant telle que le poids moléculaire moyen du polymère soit compris entre 100 et 107.
(I) dans laquelle - R peut être un atome d'hydrogène ou un groupe de formule - n'est un nombre entier compris entre 2 et 10;
- p et q sont des nombres entiers, avec la somme p+q étant telle que le poids moléculaire moyen du polymère soit compris entre 100 et 107.
8. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'agent de transfection est un polymère cationique choisi parmi le polyéthylène imine (PEI) et le polypropylène imine (PPI).
9. Composition pharmaceutique selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'il s'agit du polyéthylène imine de poids moléculaire moyen 50 000 (PE150K) ou du polyéthylène imine de poids moléculaire moyen 800 000 (PET800K).
10. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que l'agent de transfection est au moins un lipofectant comprenant au moins une région hydrophile polyamine de formule générale II
II
dans laquelle m est un nombre entier supérieur ou égal à 2 et n est un nombre entier supérieur ou égal à 1, m pouvant varier entre les différents groupes de carbone compris entre 2 amines associée de manière covalente à une région lipophile de type chaîne hydrocarbonée, saturée ou non, du cholestérol, ou un lipide naturel ou synthétique capable de former des phases lamellaires ou héxagonales.
II
dans laquelle m est un nombre entier supérieur ou égal à 2 et n est un nombre entier supérieur ou égal à 1, m pouvant varier entre les différents groupes de carbone compris entre 2 amines associée de manière covalente à une région lipophile de type chaîne hydrocarbonée, saturée ou non, du cholestérol, ou un lipide naturel ou synthétique capable de former des phases lamellaires ou héxagonales.
11. Composition pharmaceutique selon la revendication 10 caractérisée en ce que la région polyamine est représentée de préférence par la spermine, la thermine ou un de leurs analogues ayant conservé ses propriétés de liaison à l'acide nucléique.
12. Composition pharmaceutique selon la revendication 10 ou 11 caractérisée en ce que la région lipophile y est représentée par la formule générale IV
dans laquelle - X et X' représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'oxygène, un groupement méthylène - (CH2)q- avec q égal à 0, 1, 2, 3, ou un groupement amino -NH- ou -NR' avec R' représentant un groupement alkyle en C1 à C4, - Y et Y' représentent indépendamment l'un de l'autre un groupement méthylène, un groupement carbonyle ou un groupement C=S, - R3, R4, et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, substitué ou non, en C1 à C4, avec p pouvant varier entre 0 et 5, - R6 représente un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino -NR1R2 avec R1 et R2 représentant indépendamment l'un de l'autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en C12 à C22.
dans laquelle - X et X' représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'oxygène, un groupement méthylène - (CH2)q- avec q égal à 0, 1, 2, 3, ou un groupement amino -NH- ou -NR' avec R' représentant un groupement alkyle en C1 à C4, - Y et Y' représentent indépendamment l'un de l'autre un groupement méthylène, un groupement carbonyle ou un groupement C=S, - R3, R4, et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, substitué ou non, en C1 à C4, avec p pouvant varier entre 0 et 5, - R6 représente un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino -NR1R2 avec R1 et R2 représentant indépendamment l'un de l'autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en C12 à C22.
13. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 6 et 10 à
12 caractérisée en ce que l'agent de transfection est de préférance une lipopolyamine choisi parmi la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS), la 5-carboxyspermylamidede la palmitoyphosphatidylethanolamine (DPPES), le (Dioctadécyl-carbomoyl-méthoxy)-acétate de 2-5-bis-(3-amino-propylamino)-pentyle ou le (Dioctadécyl-carbamoyl-méthoxy)-acétate de 1,3-bis-(3-amino-propylamino)-2 propyle.
12 caractérisée en ce que l'agent de transfection est de préférance une lipopolyamine choisi parmi la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS), la 5-carboxyspermylamidede la palmitoyphosphatidylethanolamine (DPPES), le (Dioctadécyl-carbomoyl-méthoxy)-acétate de 2-5-bis-(3-amino-propylamino)-pentyle ou le (Dioctadécyl-carbamoyl-méthoxy)-acétate de 1,3-bis-(3-amino-propylamino)-2 propyle.
14. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à
6 et 10 à 13 caractérisée en ce que l'agent de transfection est la dioctadécylamidoglycyi spermine(DOGS).
6 et 10 à 13 caractérisée en ce que l'agent de transfection est la dioctadécylamidoglycyi spermine(DOGS).
15. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide désoxyribonucléique.
16. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide ribonucléique.
17. Composition pharmaceutique selon la revendication 15 ou 16 caractérisée en ce que l'acide nucléique est modifié chimiquement.
18. Composition pharmaceutique selon la revendication 15, 16 ou 17 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un antisens.
19. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 15 à 18 caractérisée en ce que l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique.
20. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications précédentes comprenant en outre un ou plusieurs lipides neutres.
21. Composition pharmaceutique selon la revendication 20 caractérisée en ce que le ou les lipides neutres sont choisis parmi les lipides synthétiques ou naturels, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologiques.
22. Composition pharmaceutique selon la revendication 20 ou 21 caractérisée en ce que le ou les lipides neutres sont choisis parmi la dioléoylphosphatidyl-éthanolamine (DOPE), l'oléoyl-palimitoylphes-phatidyl-éthanolamine (POPE), le di-stéaroyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamine ainsi que leurs dérivé
N-méthylés 1 à 3 trois; les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) et les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGM1 et GM2).
N-méthylés 1 à 3 trois; les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) et les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGM1 et GM2).
23. Utilisation d'une composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 22 pour le transfert in vitro, ex vivo et/ou in vivo d'acidesnucléiques.
24. Utilisation d'un composé tel que défini en revendication 1 ou 2, couplé à unligand de récepteur cellulaire. un anticorps ou dérivé d'anticorps, pour cibler un acide nucléique vers des cellules exprimant les récepteurs ou anti-gènes correspondants.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9511411A FR2739292B1 (fr) | 1995-09-28 | 1995-09-28 | Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'acides nucleiques et ses utilisations |
| FR9511411 | 1995-09-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2231064A1 true CA2231064A1 (fr) | 1997-04-03 |
Family
ID=9483020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA002231064A Abandoned CA2231064A1 (fr) | 1995-09-28 | 1996-09-27 | Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'acides nucleiques et ses utilisations |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6153597A (fr) |
| EP (1) | EP0854930A1 (fr) |
| JP (1) | JPH11512704A (fr) |
| KR (1) | KR19990063814A (fr) |
| AU (1) | AU720697B2 (fr) |
| BR (1) | BR9610719A (fr) |
| CA (1) | CA2231064A1 (fr) |
| CZ (1) | CZ94798A3 (fr) |
| FR (1) | FR2739292B1 (fr) |
| HU (1) | HUP9900317A3 (fr) |
| IL (1) | IL123849A0 (fr) |
| NO (1) | NO981322L (fr) |
| SK (1) | SK40098A3 (fr) |
| WO (1) | WO1997012051A1 (fr) |
| ZA (1) | ZA968109B (fr) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2750704B1 (fr) | 1996-07-04 | 1998-09-25 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de production d'adn therapeutique |
| US6383811B2 (en) * | 1997-12-30 | 2002-05-07 | Mirus Corporation | Polyampholytes for delivering polyions to a cell |
| IT1299583B1 (it) * | 1998-05-19 | 2000-03-16 | Vander Way Limited | Uso di proteine hmg-i per la preparazione di medicamenti ad attivita' citotossica |
| DE19925143A1 (de) * | 1999-06-02 | 2000-12-07 | Aventis Pharma Gmbh | Neue liposomale Vektorkomplexe und deren Verwendung für die Gentherapie |
| DE19929104A1 (de) * | 1999-06-24 | 2000-12-28 | Aventis Pharma Gmbh | Neue Vektorkomplexe und deren Verwendung für die Gentherapie |
| FR2814370B1 (fr) * | 2000-09-22 | 2004-08-20 | Centre Nat Rech Scient | Utilisation d'un complexe acide nucleique/pei pour le ciblage de cellules souches du cerveau |
| IL156132A0 (en) * | 2000-11-27 | 2003-12-23 | Yissum Res Dev Co | Transfection of human embryonic stem cells |
| ATE388691T1 (de) * | 2001-07-10 | 2008-03-15 | Univ North Carolina State | Träger zur freisetzung von nanopartikeln |
| FR2829136B1 (fr) | 2001-08-29 | 2006-11-17 | Aventis Pharma Sa | Derives lipidiques d'aminoglycosides |
| ITMI20011986A1 (it) * | 2001-09-25 | 2003-03-25 | San Raffaele Centro Fond | Metodo e composizione per l'attivazione di cellule presentanti l'antigene |
| US7060498B1 (en) | 2001-11-28 | 2006-06-13 | Genta Salus Llc | Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers |
| US20100035974A1 (en) * | 2006-10-04 | 2010-02-11 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs | Compositions comprising a sirna and lipidic 4,5-disubstituted 2-deoxystreptamine ring aminoglycoside derivatives and uses thereof |
| EP3034539A1 (fr) * | 2014-12-19 | 2016-06-22 | Ethris GmbH | Compositions pour l'introduction d'acides nucléiques dans des cellules |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2645866B1 (fr) * | 1989-04-17 | 1991-07-05 | Centre Nat Rech Scient | Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi |
| FR2646161B1 (fr) * | 1989-04-17 | 1991-07-05 | Centre Nat Rech Scient | Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi |
| US5286634A (en) * | 1989-09-28 | 1994-02-15 | Stadler Joan K | Synergistic method for host cell transformation |
| US5334761A (en) * | 1992-08-28 | 1994-08-02 | Life Technologies, Inc. | Cationic lipids |
| US5631237A (en) * | 1992-12-22 | 1997-05-20 | Dzau; Victor J. | Method for producing in vivo delivery of therapeutic agents via liposomes |
| SG54115A1 (en) * | 1993-04-27 | 1998-11-16 | Gerber Scient Products Inc | Thermal printing apparatus with improved power supply |
| FR2722506B1 (fr) * | 1994-07-13 | 1996-08-14 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations |
-
1995
- 1995-09-28 FR FR9511411A patent/FR2739292B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-09-26 ZA ZA968109A patent/ZA968109B/xx unknown
- 1996-09-27 CZ CZ98947A patent/CZ94798A3/cs unknown
- 1996-09-27 CA CA002231064A patent/CA2231064A1/fr not_active Abandoned
- 1996-09-27 US US09/043,856 patent/US6153597A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-09-27 SK SK400-98A patent/SK40098A3/sk unknown
- 1996-09-27 EP EP96932668A patent/EP0854930A1/fr not_active Withdrawn
- 1996-09-27 JP JP9513192A patent/JPH11512704A/ja not_active Ceased
- 1996-09-27 BR BR9610719A patent/BR9610719A/pt unknown
- 1996-09-27 HU HU9900317A patent/HUP9900317A3/hu unknown
- 1996-09-27 WO PCT/FR1996/001516 patent/WO1997012051A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1996-09-27 KR KR1019980702282A patent/KR19990063814A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-09-27 AU AU71361/96A patent/AU720697B2/en not_active Ceased
- 1996-09-28 IL IL12384996A patent/IL123849A0/xx unknown
-
1998
- 1998-03-24 NO NO981322A patent/NO981322L/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA968109B (en) | 1997-04-21 |
| FR2739292A1 (fr) | 1997-04-04 |
| EP0854930A1 (fr) | 1998-07-29 |
| FR2739292B1 (fr) | 1997-10-31 |
| CZ94798A3 (cs) | 1998-07-15 |
| US6153597A (en) | 2000-11-28 |
| IL123849A0 (en) | 1998-10-30 |
| WO1997012051A1 (fr) | 1997-04-03 |
| NO981322D0 (no) | 1998-03-24 |
| JPH11512704A (ja) | 1999-11-02 |
| HUP9900317A3 (en) | 2001-10-29 |
| SK40098A3 (en) | 1998-09-09 |
| BR9610719A (pt) | 1999-07-13 |
| MX9801920A (es) | 1998-08-30 |
| HUP9900317A2 (hu) | 1999-05-28 |
| AU720697B2 (en) | 2000-06-08 |
| NO981322L (no) | 1998-03-24 |
| KR19990063814A (ko) | 1999-07-26 |
| AU7136196A (en) | 1997-04-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0809705B1 (fr) | Compositions contenant des acides nucleiques, preparation et utilisation | |
| CA2231064A1 (fr) | Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'acides nucleiques et ses utilisations | |
| CA2290664C (fr) | Composes, leur preparation et leur utilisation pour le transfert d'acides nucleiques dans les cellules | |
| CA2194797C (fr) | Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations | |
| EP2555777B1 (fr) | Entités chimiques isolées inédites et procédés d'administration d'oligonucléotides | |
| CA2208184A1 (fr) | Lipopolyamines comme agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques | |
| US6982092B2 (en) | Method of complexing a nucleic acid with a lipid-conjugated polyamide | |
| EP1135168A1 (fr) | Vecteurs peptidiques de substances a travers la barriere hemato-encephalique | |
| FR2766826A1 (fr) | Vecteurs derives d'anticorps pour le transfert de substances dans les cellules | |
| CA2297487A1 (fr) | Polymeres cationiques, complexes associant lesdits polymeres cationiques et des substances therapeutiquement actives comprenant au moins une charge negative, notamment des acides nucleiques, et leur utilisation en therapie genique | |
| EP0234151B1 (fr) | Glycoprotéines modifiées par oxydation et formation de base de Schiff, inhibant les ribosomes, procédé d'obtention et immunotoxines comprenant une telle glycoprotéine | |
| CA2318512C (fr) | Composes transfectants sensibles aux conditions reductrices, compositions pharmaceutiques les contenant, et leurs applications | |
| Ganbold et al. | Efficient in vivo siRNA delivery by stabilized d-peptide-based lipid nanoparticles | |
| US20210214726A1 (en) | Peptide Docking Vehicle for Targeted Nucleic Acid Delivery | |
| KR102467932B1 (ko) | 간을 표적으로 하는 특정 리간드와 갑상선 호르몬 수용체 작용제를 포함하는 약물 | |
| EP0229564B1 (fr) | Glycoprotéines modifiées par oxydation puis réduction, inhibant les ribosomes, procédé d'obtention et immunotoxines comprenant une telle glycoprotéine | |
| EP0938580A1 (fr) | Structure membranaire artificielle polymerique, procede pour sa preparation, procede de preparation de ce polymere, particule et film comprenant cette structure | |
| WO2002053583A2 (fr) | Peptides amphipathiques et leur utilisation pour transferer des substances d'interet dans les cellules | |
| CA2272637A1 (fr) | Composition transfectante utile en therapie genique associant a un virus recombinant incorporant un acide nucleique exogene, un agent de transfection non viral et non plasmidique | |
| CA2324931A1 (fr) | Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs applications | |
| FR2834465A1 (fr) | Compositions pour la vectorisation d'oligonucleotides a travers la barriere hematoencephalique et leur utilisation pour le traitement des maladies du systeme nerveux central | |
| Van den Bossche | Polyethylene glycol conjugates and vinyl ether constructs for programmed gene and drug delivery | |
| FR2575160A1 (fr) | Composes ionophores carboxyliques monovalents | |
| FR2564839A1 (fr) | Conjugues associant par liaison covalente un ionophore carboxylique monovalent et une macromolecule et leur utilisation comme agents potentialisateurs des immunotoxines | |
| FR2567521A1 (fr) | Nouveaux ionophores actives |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZDE | Discontinued |