FR2739292A1 - Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'acides nucleiques et ses utilisations - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne une composition pharmaceutique utile pour la transfection d'un acide nucléique caractérisée en ce quelle contient outre ledit acide nucléique et au moins un agent de transfection, au moins un composé associant des propriétés de fixation de l'ADN à une capacité de vectorisation nucléaire de cet ADN. Elle se rapporte en outre à l'utilisation de ladite composition pour le transfert in vitro, ex vivo et/ou in vivo d'acides nucléiques.

Description

La présente invention concerne le domaine de la thérapie génique et s'intéresse plus particulièrement au transfert in vitro, ex vivo et/ou in vivo du matériel génétique.
Elle propose notamment une nouvelle composition pharmaceutique utile pour transfecter efficacement des cellules. Elle se rapporte également aux utilisations de cette composition.
Des déficiences et/ou anomalies (mutation, expression aberrante, etc) chromosomiques sont à l'origine de nombreuses maladies, à caractère héréditaire ou non. Pendant longtemps, la médecine conventionnelle est demeurée impuissante à leur égard. Aujourd'hui, avec le développement de la thérapie génique, on espère pouvoir désormais corriger ou prévenir ce type d'aberration chromosomique. Cette nouvelle médication consiste à introduire une information génétique, dans la cellule ou l'organe affecté, en vu de corriger cette déficience ou anomalie ou encore, d'y exprimer une protéine d'intérêt thérapeutique.
L'obstacle majeur à la pénétration d'un acide nucléique dans une cellule ou un organe cible, repose sur la taille et la nature polyanionique de cet acide nucléique qui s'opposent à son passage à travers les membranes cellulaires.
Pour lever cette difficulté, diverses techniques sont aujourd'hui proposées dont plus particulièrement la transfection d'ADN nu à travers la membrane plasmique in vivo(WO90/11092) et la transfection d'ADN via un vecteur de transfection.
En ce qui concerne, la transfection d'ADN nu, son efficacité demeure encore très faible. Les acides nucléiques nus possèdent une demi vie plasmatique courte en raison de leur dégradation par les enzymes et de leur élimination par les voies unnaires.
Pour ce qui est de la seconde technique, elle propose principalement deux stratégies:
La première met en oeuvre les vecteurs de transfection naturels que sont les virus. n est ainsi proposé d'utiliser les adénovirus, les herpès virus, les rétrovirus et plus récemment les virus adéno associés. Ces vecteurs s'avèrent performants sur le plan de la transfection mais on ne peut malheureusement exclure totalement à leur égard certains risques de pathogénicité, réplication et/ou immunogénicité, inhérents à leur nature virale.
La seconde stratégie consiste avantageusement à utiliser des agents non viraux capables de promouvoir le transfert et l'expression d'ADN dans des cellules eucaryotes.
L'objet de la présente invention s'inscrit plus particulièrement dans cette seconde stratégie.
Les vecteurs chimiques ou biochimiques représentent une alternative avantageuse aux virus naturels en particulier pour cette absence de réponse immunologique et/ou recombinaison virale. Ils ne possèdent pas de pouvoir pathogène, le risque de multiplication de l'ADN au sein de ces vecteurs est nul et il ne leur est attaché aucune limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter.
Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, condenser 1'ADN à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires.
De part sa nature polyanionique, I'ADN nta naturellement aucune affinité pour la membrane plasmique des cellules de nature également polyanionique. Pour pallier à cet inconvénient, les vecteurs non viraux possèdent généralement tous des charges polycationiques.
Parmi les vecteurs synthétiques développés, les polymères cationiques de type polylysine et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants sont les plus avantageux. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Plus récemment, il a été développé le concept de la transfection ciblée, médiée par un récepteur. Cette technique met à profit le principe de condenser l'ADN, grâce au polymère cationique, tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane à l'aide d'un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Les criblages du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes ont ainsi été décrits.
Toutefois, les vecteurs synthétiques proposés aujourd'hui sont encore loin d'être aussi performants que les vecteurs viraux. Ceci peut notamment être la conséquence d'une condensation insuffisante de l'ADN à tranfecter et/ou des difficultés rencontrées par l'ADN transfecté pour sortir de l'endosome et pénétrer dans le noyau cellulaire. En effet, le transport d'ADN dans le noyau d'une cellule eucaryote au repos pose un problème évident puisque les dimensions des pores nucléaires ne permettent que la diffision de protéines de poids moléculaire inférieur à 60 OOODa. (I. Davis et al., Ann. Rev. Biochem. 1995; 64; 865-896). Un ADN plasmidique possédant un poids moléculaire supérieur à 106 ne peut donc naturellement pénétrer dans le noyau cellulaire par simple diffusion.
La présente invention a précisément pour objectif de proposer une solution avantageuse au problème précité.
Plus précisément, la présente invention propose une composition pharmaceutique utile pour la transfection d'au moins un acide nucléique caractérisée en ce qu'elle contient outre ledit acide nucléique et au moins un agent de transfection, au moins un composé associant des propriétés de fixation de l'ADN à une capacité de vectorisation nucléaire de cet ADN.
Au sens de l'invention, un composé possédant des propriétés de fixation de l'ADN, couvre tout composé capable de se fixer au moins partiellement à l'ADN à vectoriser. En ce qui concerne plus particulièrement son aptitude à vectoriser cet
ADN, elle se traduit au sens de l'invention par une efficacité à diriger cet ADN efficacement à travers les différentes membranes cellulaires et/ou nucléaires pour le conduire jusqu'au sein du noyau de la cellule à traiter. Le composé selon l'invention peut également se présenter par exemple sous l'aspect d'une molécule chimère associant un domaine de fixation à l'ADN, à un domaine permettant l'import nucléaire.
Dans ce cas particulier, on peut sélectionner parmi des domaines de fixation à l'ADN, ceux issus de protéines régulatrices capables de se lier par exemple à des séquences spécifiques ou au contraire de protéines connues pour posséder une affinité non séquence dépendante pour l'ADN. En ce qui concerne plus particulièrement le domaine impliqué dans l'import nucléaire, il peut être par exemple figuré par une séquence dites nls (Nuclear localisation Sequence). De telles séquences pourront être apparentées ou dérivées au consensus bipartite déduit de la nucléoplasmine ou au consensus de l'antigène T de SV40.
Selon un mode de réalisation particulier, I'invention concerne une composition pharmaceutique utile pour la transfection d'au moins un acide nucléique caractérisée en ce qu'elle contient outre ledit acide nucléique et au moins un agent de transfection, au moins un composé appartenant à la famille des HMG ou l'un de ses dérivés.
Les protéines de type HMG, pour "High Mobility Group" sont des protéines riches en acides aminés chargés et possédant une masse moléculaire inférieure à 30000
Da. Solubles dans l'acide perchlorique 2-5%, elles sont classiquement extraites de la chromatine par 0,35 M NaCI.
Classiquement, on distingue 3 familles de protéines HMG: les protéines de type
HMG1/2 de masse moléculaire voisine de 25000, HMG14/17 de masse moléculaire voisine de 10-12000, et HMGI/Y de composition voisine des protéines de type HMG14/17 mais dont la répartition tissulaire et au cours de l'ontogénèse est différente.
On sait que la séquence primaire des protéines est conservée au cours de l'évolution au sein de chacune de ces trois familles.
En ce qui concerne plus particulièrement les protéines de la famille HMG1/2, elles se caractérisent par la présence d'une séquence de 80 acides aminés à prédominance basique (charge nette +20), dite "boîte HMG" , qui constitue un domaine de liaison à l'ADN. Dans cette famille on distingue les protéines capables de se lier à des séquences spécifiques de l'ADN double brin et les protéines dont la spécificité de liaison réside dans une stucture tridimensionnelle particulière de l'ADN.
Dans la première catégorie on trouve les protéines, UBF, SRY, TCFI, ABF2, qui stimulent la transcription de gènes spécifiques (Greiss E.A. et al. J. Mol. Evol. (1993) 37:204-210). La séquence de chacune de ces protéines contient une ou plusieurs "boîtes HMG" La deuxième catégorie est représentée par les protéines HMGI et
HMG2. Leur séquence primaire est caractérisée par la présence de deux "boîtes
HMG" et d'une séquence acide en C-terminal (Bustin M. B.B.A. (1990) 1049:231- 243). Ces protéines se lient de facon spécifique sur les séquences d'ADN palindromiques extrudées en structure cruciforme (appariement intrabrin au niveau du palindrome) ou sur les séquences d'ADN qui présentent une forte courbure.Ces deux types de structure ont en commun d'élargir le petit sillon de l'ADN qui devient alors capable d'accomoder la liaison des protéines de type HMG1/2. Le rôle physiologique des protéines HMG1 et HMG2 est à ce jour peu élucidé. Il a toutefois été montré que la protéine HMGI de veau est transportée de manière active dans le noyau des cellules de mammifères. (L. Kuehl et al; J. Biol. Chem. 1985; 260, 10361-10368).
De manière inattendue, la Demanderesse a mis en évidence qu'il était possible de mettre à profit ces facultés des protéines HMG, à savoir leurs aptitudes à fixer l'ADN et à être transportées de manière active dans le noyau, pour promouvoir efficacement la transfection dans le noyau de cellules à traiter de séquences nucléiques hétérologues, associées à au moins un agent transfectant.
Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne tout peptide, pseudopeptide (peptide incorporant des éléments non biochimiques) ou protéine différant du composé tel que défini précedemment, obtenu par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus par exemple de la protéine considérée. Plus précisément, par modification chimique, on entend toute modification du peptide ou protéine générée par réaction chimique ou par greffage chimique de molécule(s), biologique(s) ou non, sur un nombre quelconque de résidus de la protéine.Par modification génétique, on entend toute séquence peptidique dont l'ADN hybride avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et dont le produit possède les activités indiquées. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du polypeptide correspondant pour son ligand d'ADN, celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases, celui d'augmenter et/ou de modifier l'une de ses activités, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
Parmi les dérivés résultant d'une addition, on peut citer par exemple les séquences peptidiques chimères comportant une partie hétérologue supplémentaire liée à une extrémité. Le terme dérivé comprend également les séquences protéiques homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité du même type. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation de l'ADN correspondant. Les hybridations peuvent être réalisées à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions de stringence conventionnelles (Maniatis et al.), (Cf techniques générales de biologie moléculaire), ou, de préférence, dans des conditions de stringence élevées.
En outre, il est également envisageable dans le cadre de la présente invention de mettre à profit la forte affinité de certaines des protéines de la famille HMG, ou de leurs dérivées pour des structures secondaires présentes sur de l'ADN double brin. Il peut notament s'agir de structures à quatre brin pour lesquelles il a notamment été montré que l'HMGI de rat possède une très forte affinité (Bianchi et al. Sciences, 1989, 243, 1056-1059). De telles structures peuvent également être obtenues à partir de séquences naturelles telles que les ITRs du virus associé aux adénovirus ou bien être complètement synthétiques obtenues à partir de palyndromes artificiels.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le composé mis en oeuvre est choisi parmi les protéines de type HMG 1, 2, I, Y, 14 et 17 et leurs dérivés. Il est plus préférentiellement représenté par tout ou partie de la protéine HMG1 humaine ou l'un de ses dérivés ou homologues tels que définis précédemment.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les compositions de la présente invention comprennent en outre un élément de ciblage permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique. Cet élément de ciblage peut être un élément de ciblage extracellulaire, permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains types cellulaires ou certains tissus souhaités (cellules tumorales, cellules hépatiques, cellules hématopoiétiques, etc). Il peut également s'agir d'un élément de ciblage intracellulaire, permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains compartiments cellulaires privilégiés (mitochondries, noyau, etc).
Plus préférentiellement, I'élément de ciblage est lié, de manière covalente ou non covalente, au composé selon l'invention. L'élément de ciblage peut également être lié à l'acide nucléique. Selon un mode privilégié de l'invention, ledit composé est associé, via une partie hétérologue supplémentaire liée à une de ses extrémités, à un ligand de récepteur cellulaire présent à la surface du type cellulaire comme par exemple un sucre, la transférrine, I'insuline ou la protéine asialo-orosomucoïde. Il peut également s'agir d'un ligand de type intracellulaire comme une séquence signal de location nucléaire, nls, qui privilégie l'accumulation de l'ADN transfecté au sein du noyau.
Parmi les éléments de ciblage utilisables dans le cadre de l'invention, on peut citer les sucres, les peptides, les oligonucléotides ou les lipides. Préférentiellement, il s'agit de sucres et/ou peptides tels que des anticorps ou fragments d'anticorps, des ligands de récepteurs cellulaires ou des fragments de ceux-ci, des récepteurs ou fragments de récepteurs, etc. En particulier, il peut stagir de ligands de récepteurs de facteurs de croissance, de récepteurs de cytokines, de récepteurs de lectines cellulaires ou de récepteurs de protéines d'adhésion. On peut également citer le récepteur de la transferrine, des HDL et des LDL. L'élément de ciblage peut également être un sucre permettant de cibler des lectines tels que les récepteurs asialoglycoprotéiques, ou encore un fragment Fab d'anticorps permettant de cibler le récepteur du fragment Fc des immunoglobulines.
Avantageusement, le composé selon l'invention peut être en outre polyglycosylé, sulfoné et/ou phosphorylé et/ou greffé à des sucres complexes ou à un composé lipophile comme par exemple une chaîne polycarbonée ou un dérivé du cholestérol.
La composition selon l'invention peut bien entendu comprendre plusieurs composés selon l'invention, de nature différente. De même, il s'avère possible d'associer au composé selon l'invention, outre le composé de ciblage nucléaire précédemment décrit, un second composé caractérisé par sa capacité à compacter l'ADN. De tels composés sont notamment décrits dans la dde FR 95/01865.
Le composé selon l'invention est présent en quantité suffisante pour agir avec l'acide nucléique selon l'invention. C'est ainsi que le rapport composé/acide nucléique (exprimé en poids) peut être compris entre 0,01 et 5 et plus préférentiellement entre 0,25 et 0,5.
En ce qui concerne l'agent de transfection présent dans la composition selon l'invention, il est préférentiellement choisi parmi les polymères cationiques et les lipofectants.
Selon la présente invention, le polymère cationique est de préférence un composé de formule générale I,
Figure img00070001

dans laquelle nra--nP de ormu - R peut être un atome d'hydrogène ou un groupe de formule
Figure img00070002

- n est un nombre entier compris entre 2 et 10;
- p et q sont des nombres entiers, étant entendu que la somme p+q est telle que le poids moléculaire moyen du polymère soit compris entre 100 et 107 Da.
Il est entendu que, dans la formule (I) la valeur de n peut varier entre les différents motifs p. Ainsi, la formule (I) regroupe à la fois les homopolymères et les hétéropolymères.
Plus préférentiellement, dans la formule (I), n est compris entre 2 et 5. En particulier, les polymères de polyéthylène imine (PEI) et polypropylène imine (PPI) présentent des propriétés tout à fait avantageuses. Les polymères préférés pour la mise en oeuvre de la présente invention sont ceux dont le poids moléculaire est compns entre 103 et 5.106. A titre d'exemple, on peut citer le polyéthylène imine de poids moléculaire moyen 50 000 Da (PEI50K) ou le polyéthylène imine de poids moléculaire moyen 800 000 Da (PEI800K).
Le PEISOK ou Le PEI800K sont accessibles commercialement. Quant aux autres polymères représentés par la formule générale I, ils peuvent être préparés selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR 94 08735.
Pour obtenir un effet optimum des compositions de l'invention, les proportions respectives du polymère et de l'acide nucléique sont de préférence déterminées de sorte que le rapport molaire R = amines du polymère / phosphates de l'acide nucléique soit compris entre 0,5 et 50, plus préférentiellement entre 5 et 30.
Des résultats tout particulièrement avantageux sont obtenus en utilisant de 5 à 15 équivalents d'amines de polymère par charge d'acide nucléique.
En ce qui concerne plus particulièrement les lipofectants, il s'agit de molécules amphiphiles comprenant au moins une région hydrophile cationique, par exemple polyamine, et une région lipophile. La région cationique, préférentiellement polyamine, chargée cationiquement, est capable de s'associer de manière réversible avec l'acide nucléique, chargé négativement. Cette interaction compacte fortement l'acide nucléique. La région lipophile rend cette interaction ionique inaccessible au milieu aqueux externe, en recouvrant la particule nucléolipidique formée d'une pellicule lipidique.
Avantageusement, ces lipofectants peuvent également être choisis parmi des lipopolyamines dont la région polyamine répond à la formule générale II
H2N-(-(CH)m-NH-)n-H II dans laquelle m est un nombre entier supérieur ou égal à 1 et n est un nombre entier supérieur ou égal à 1, m pouvant varier entre les différents groupes de carbone compris entre deux amines. Préférentiellement, m est compris entre 2 et 6 inclusivement et n est compris entre I et 5 inclusivement. Encore plus préférentiellement, la région polyamine est représentée par la spermine, la thermine ou un de leurs analogues ayant conservé des propriétés de liaison à l'ADN.Quant à la région lipophile, elle est représentée par au moins une chaîne hydrocarbonée, saturée ou non, du cholestérol, un lipide naturel ou un lipide synthétique capable de former des phases lamellaires ou hexagonales, liée de manière covalente à la région hydrophile.
La demande de brevet EP 394 111 décrit d'autres lipopolyamines de formule générale III susceptibles d'être mises en oeuvre dans le cadre de la présente invention.
H2N-(-(FH)m-NH-)n-H
R III dans laquelle R représente notamment un radical de formule générale (R1 R2) N-CO
CH-NH-CO- .
A titre représentatif de ces lipopolyamines on peut plus particulièrement citer la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) et la 5-carboxyspermylamide de la palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES).
Les lipopolyamines décrites dans la demande de brevet FR 94 14596 peuvent également être utilisées avantageusement à titre d'agent de transfection selon l'invention. Elles sont représentées par la formule générale III ci-dessus dans laquelle R représente
Figure img00090001

avec - X et X' représentant, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'oxygène, un groupement méthylène (CH2)q avec q égal à 0, 1, 2 ou 3, ou un groupement amino -NH- ou -NR'- avec R' représentant un groupement alkyle en C1 à C4, - Y et Y' représentant indépendamment l'un de l'autre un groupement méthylène, un groupement carbonyle ou un groupement C=S, - R3, R4 et R5 représentant indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, substitué ou non, en C 1à Ce, avec p pouvant varier entre 0 et 5, - R6 représentant un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino -NR1R2 avec R1 et R2 représentant indépendamment l'un de l'autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en C12 à C22
A titre représentatif de ces lipopolyamines on peut tout particulièrement citer le (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)-acétate de 2-5-bîs-(3 -amino-propylamino)-pentyle et le (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)-acétate de 1,3 -bis-(3 -amino-propylamino)-2 propyle.
Les demandes de brevet EP 394 111 et FR 94 décrivent également un procédé utilisable pour la préparation des lipopolyamines correspondantes.
De manière particulièrement avantageuse, on peut utiliser dans le cadre de l'invention la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) la 5-carboxyspermylamide de la palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES), le (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy) acétate de 2-5-bis-(3-amino-propylamino)-pentyle ou le (Dioctadécylcarbamoylméthoxy)-acétate de 1,3 -bis-(3 -amino-propylamino)-2 propyle.
Pour obtenir un effet optimum des compositions de l'invention, les proportions respectives de la polyamine et de l'acide nucléique sont de préférence déterminées de sorte que le rapport R charges positives de l'agent de transfection/ charges négatives de l'acide nucléique soit compris entre 0,1 et 10 et plus préférentiellement entre 0,5 et 2.
La présence d'un composé selon l'invention au sein d'une composition transfectante est avantageuse à plusieurs titres. En particulier, il s'en suit une toxicité nettement amoindrie qui rend désormais possible par exemple la transfection de cellules sensibles à l'origine à l'agent de transfection comme par exemple les cellules hématopoïétiques avec les lipopolyamines.
Dans les compositions de la présente invention, I'acide nucléique peut être aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARNm, d'ARNt, d'ARNr, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Ils peuvent par ailleurs être incorporés dans des vecteurs, tels que des vecteurs plasmidiques.
Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent être simple ou double brin. Ces acides désoxyribonucléiques peuvent coder pour des gènes thérapeutiques, des séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, des séquences antisens, des régions de liaison à d'autres composants cellulaires, etc.
Au sens de l'invention, on entend par gène thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible.Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5,
HARP/pléiotrophine, etc; les apolipoprotéines ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gênes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, Ralla,
DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation Facteurs VII, VIII, IX, les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), etc.
Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les antisens comprennent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201).
Comme indiqué plus haut, I'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre,
I'invention permet donc la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des microorganismes, des virus ou des cancers. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Préférentiellement, I'acide nucléique comprend également des séquences permettant l'expression du gène thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gênes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus.A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes ElA, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc.
Par ailleurs, I'acide nucléique peut également comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
Plus préférentiellement, les compositions de l'invention comprennent en outre, un ou plusieurs lipides neutres. De telles compositions sont particulièrement avantageuses, notamment lorsque le rapport R est faible. La demanderesse a en effet montré que l'addition d'un lipide neutre permet d'améliorer la formation des particules nucléolipidiques et, de manière surprenante, de favoriser la pénétration de la particule dans la cellule en déstabilisant sa membrane.
Plus préférentiellement, les lipides neutres utilisés dans le cadre de la présente invention sont des lipides à 2 chaînes grasses.
De manière particulièrement avantageuse, on utilise des lipides naturels ou synthétiques, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologique. Il peuvent être choisis plus particulièrement parmi la dioleoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), le oléoyl-palmitoylphos-phatidyléthanolamine (POPE), le di-stéaroyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamine ainsi que leurs dérivé Nméthylés 1 à 3 fois; les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines)ou encore les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGM1 et GM2).
Ces différents lipides peuvent être obtenus soit par synthèse, soit par extraction à partir d'organes (exemple le cerveau) ou d'oeufs, par des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. En particulier, I'extraction des lipides naturels peut être réalisée au moyen de solvants organiques (voir également Lehninger,
Biochemistry).
Préférentiellement, les compositions de l'invention, mettant en oeuvre à titre d'agent de transfection un lipofectant, comprennent de 0,1 à 20 équivalents de lipide neutre pour I équivalent de lipopolyamine, et, plus préférentiellement, de 1 à 5. Dans le cas où l'agent de transfection est un polymère cationique, les compositions de l'invention comprennent, en plus du polymère cationique dans les rapports cités ci avant, de 0,1 à 20 équivalents molaires de lipide neutre pour I équivalent molaire de phosphate de l'acide nucléique, et, plus préférentiellement, de I à 5.
Les compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc... De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée.
Elles peuvent être avantageusement utilisées pour transfecter une grande variété de type cellulaire comme par exemple les cellules hematopoïétiques, les lymphocytes, les hépatocytes, les cellules endothéliales, les cellules de mélanomes, de carcinomes et de sarcomes, les cellules musculaires lisses, les neurones et les astrocytes.
La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement avantageuse pour le traitement de maladies utilisant la transfection in vitro, ex vivo ou in vivo d'un acide nucléique apte à corriger ladite maladie en association avec un agent de transfection de type polymère cationique ou lipofectant, et un composé tel que défini ci-avant. Plus particulièrement, cette méthode est applicable aux maladies résultant d'une déficience en un produit protéique ou nucléique et l'acide nucléique administré code pour ledit produit protéique ou contient la séquence correspondant audit produit nucléique. Les compositions selon l'invention sont particulièrement intéressantes pour leur biodisponibilité et leur niveau de transfection.
La présente invention concerne également toute utilisation d'un composé selon l'invention couplé à un ligand de récepteur cellulaire, un anticorps ou dérivé d'anticorps, cibler un acide nucléique vers des cellules exprimant les récepteurs ou anti-gènes correspondants. Dans cette perspective, un ligand, anticorps ou dérivé d'anticorps potentiel est couplé audit composé et l'on apprécie le pouvoir de transfection de cette molécule chimère comparativement au composé seul.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
FIGURES:
Figure 1: Représentation en intensités lumineuses de l'efficacité de transfections réalisées selon l'invention dans diiférents types cellulaires.
Figure 2: Appréciation de l'efficacité de transfections réalisées en présence et en absence de HMG1.
MATERIEL ET METHODES
La construction utilisée pour mettre en évidence l'activité des compositions de l'invention est un plasmide comportant le gène codant pour la luciférase (Luc), pCMV-Luc.
Le plasmide pCMV-luc comporte le promoteur du Cytomégalovirus (CMV), extrait du plasmide vecteur pcDNA3 (Invitrogen) par coupure avec les enzymes de restriction Mlu I et Hindîli, situé en amont du gène codant pour la luciférase, inséré aux sites MluI et HindIII dans le vecteur pGL basic Vector (Promega).
EXEMPLE 1: PREPARATION DE LA PROTEINE HMG1 DE RAT 1. I Expression de la protéine HMG1 chez E. coli
Cette protéine recombinante provenant d'un mammifère a été préparée par surexpression chez E. coli.
Le plasmide T7-RNHMGI codant pour la protéine HMG1 de rat (M. E. Bianchi,
Gene, 104 (1991) 271-275) est introduit dans la souche d'E. coli BL21(DE3). La souche est par la suite cultivée à 37"C en milieu LB+Ampicilline (25 mg/L). Une préculture est obtenue à partir d'une colonie isolée. Elle permet d'ensemencer une culture de 500 ml. Lorsque l'absorbance à 600nm de la culture atteint la valeur de 0,7, la synthèse de HMG1 est induite par addition d'IPTG à 0,5 mM final. La souche productrice de HMG1 est encore cultivée 2h30 en présence d'IPTG. Les cellules sont ensuite récoltées par centrifugation (5000 x g, 20 minutes), rincées par 200 ml d'eau distillée centrifugées de nouveau. Le culot de cellules est conservé à -800C jusq'à purification.
1.2: purification de la protéine HMG1 recombinante
La purification de la protéine HMG1 peut être effectuée par chromatographie à partir d'une culture de la souche de E. coli décrite dans l'exemple 1.1, par exemple en utilisant le protocole suivant:
Sauf indication contraire, I'ensemble de la purification décrite ci-dessous est effectuée à 40C. Les cellules obtenues à partir de 500 ml de culture sont resuspendues dans 15 ml de tampon 50 mM Tris/HCI pH 7,7 contenant 500 IlM EDTA, 5 mM DTT, 200 M Pefabloc SC [4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride hydrochloride], et 10% (poids/volume) glycérol.Après cassage des cellules par sonication durant 15 min, les débris cellulaires sont séparés par centrifugation (50 000 x g; I h). L'extrait acellulaire est ensuite chromatographié à travers une colonne de Sephadex G-25 (Pharmacia) équilibrée et éluée avec du tampon A [20 mM Hepes pH 7,9 contenant 400 mM chlorure de sodium, 200 mM EDTA, I mM DTT, 200 I1M Pefabloc SC, 0,2%
Nonidet P40, et 10% glycérol]. La fraction contenant les protéines est récoltée et chromatographiée à travers une colonne de gel DEAE Sephadex A-25 (Pharmacia) équilibrée dans le tampon A. La fraction protéique non retenue sur cette colonne est mélangée progressivement avec du sulfate d'ammonium solide jusqu'à une concentration finale de 2,8 M. Après 2 h, cette suspension est centrifugée (30 000 x g; 15 min). Le surnageant est chromatographié à 20"C à travers une colonne Phényl
Superose HR 5/5 (Pharmacia) équilibrée dans du tampon 20 mM Hepes pH 7,9 contenant 200 mM EDTA, 500 p1M DTT, et 2,8 M sulfate d'ammonium. Les protéines sont éluées de la colonne avec un gradient linéaire décroissant de sulfate d'ammonium (2,8 M à 0 M) dans le même tampon. Les fractions contenant la protéine HMG1 sont regroupées et dialysées extensivement contre du tampon 50 mM Tris/HCI pH 7,7 contenant 1 mM EDTA et 500 ,uM DTT.Cet échantillon est ensuite injecté sur une colonne MonoQ HR 5/5 (Pharmacia) qui est ensuite éluée avec un gradient linéaire de
O à 0,5 M de chlorure de sodium dans du tampon 50 mM Tris/HCl pH 7,7-500 ,uM
DTT. La protéine HMGI, qui forme un pic d'absorbance symétrique à 280 nm, est collectée dans ce tampon. La protéine HMG1 est ensuite reprise dans du tampon 10mM Mes pH6,2-140 mM NaC1-500 pM DTT après concentration par centrifugation dans Centrikon 10. La protéine HMGI est stockée à -80 C jusqu'à utilisation. Cette préparation présente une seule bande protéique migrant à un poids moléculaire apparent de 3 1 000 lorsqu'elle est analysée par électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS) et révélation au Coomassie.Le rendement global de la purification est de 850 ;ig de protéine HMG1 pure pour 500 ml de culture de départ.
EXEMPLE 2: TRANSFERT D'ACIDE NUCLEIOUE IN VITRO DANS DES
CELLULES DE MAMMIFERE
Cet exemple montre comment une protéine, de type HMGI, se liant à l'ADN et étant importée dans le noyau de manière active, peut être utilisée pour stimuler la transfection d'ADN plasmidique.
La construction utilisée pour mettre en évidence l'activité des compositions de l'invention est le plasmide comportant le gène codant pour la luciférase (Luc) décrit précédemment.
Le protocole est établi pour des plaques de 24 puits ( 16mm) à recolter 2 jours après transfection (cellules à confluence). Tous les paramètres peuvent être modifiés proportionnellement.
Le jour J les cellules Nl1H 3T3 (ATCC: CRL1658), 3LL (Isakov N.et al., JNCI 71(1983) 139-145) H460 (Maxwell et al., Oncogene 8 (1993), 3421-3429) sont ensemencées à 105 cellules par puits.
Le jour J+2 les cellules sont rincées avec du PBS (pour eliminer les traces de serum) et reprises dans 250 ml de RPMI (3LL et H460) ou DMEM (NIH3T3), supplémenté ou non par 10% Serum Fetal de Veau (SFV)
Composition mise en oeuvre pour la transfection:Par équivalent puits, dans un tube on ajoute: - H20 qsp 20 ml
- NaCI qsp 140 mM final
- 0,5 mg d'ADN plasmidique
- 125 ngHMGl puis on vortexe modérément et on incube à température ambiante 15 minutes avant d'ajouter 1,5 nmole de lipofectant DOGS.On vortexe à nouveau modérément et incube à température ambiante 15 minutes
Les cellules sont transfectées par ajout de 20 ml du mélange ADN/HMGl/lipofectant au milieu de culture, incubées pendant 2 à 4 heures à 37"C. Ce milieu est ensuite remplacé par du milieu complet.
Le jour J+4 les cellules sont rincées à température ambiante par 250 ml de PBS, lysées dans 100 ml de tampon ad hoc (Reporter (Promega)+TCK et Aprotinin). 10 ml de lysat et 50 ml de substrat (Promega) sont utilisés pour mesurer l'activité de la luciférase synthétisée.
Les résultats présentés en figures 1 et 2 sont la moyenne de quatre expériences, répétées indépendament 2 fois. Pour ce faire on apprécie les Unitées Lumineuses (UL) obtenues par expression du gène Luc dans les cellules transfectées.
La figure I rassemble les valeurs obtenues pour les trois types cellulaires précedemment cités, en présence de quantité variable de protéine HMGI.
La figure 2 rassemble de manière synoptique les facteurs de stimulation de la transfection obtenus par ajout de différentes quantités de protéines HMG1.
L'augmentation de l'efficacité de transfection par la protéine HMGI est variable selon les types cellulaires.
On observe ainsi qu'elle est maximale lorsque le milieu contenant la composition nécessaire à la transfection est supplémenté par 10% SFV. Ceci est intéressant car la présence de SFV représente les conditions rencontrées in vivo. D'autre part il est notable que la présence de SFV diminue l'efficacité de transfection, particulièrement en l'absence de protéine HMGI. On peut penser que la présence de SFV dans le milieu de culture diminue la quantité d'ADN susceptible d'être internalisé par les cellules. Dans ce cadre on peut conclure que HMGI est particulièrement avantageuse pour la transfection dans des conditions où la quantité d'ADN est limitante.
Le rapport HMGI/ADN (en masse) optimal pour la transfection est 0,25 à 0,5. De telles conditions ne sont pas décrites comme étant capable de compacter l'ADN (Bottger M. et ai., B.B.A. 950 (1988), 221-228); Stros M. et al., N.A.R. 22 (1994), 1044-1051). En effet le plasmide n'est pas saturé par HMGI (Kohlstaedt L.A. et al.,
Biochemistry 33 (1994), 12702-12707). L'effet de la protéine HMGI est donc expliqué par sa capacité à lier l'ADN et à être transportée vers le noyau de la cellule.

Claims (25)

REVENDICATIONS
1. Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'au moins un acide nucléique caractérisée en ce qu'elle contient outre ledit acide nucléique et au moins un agent de transfection au moins un composé associant des propriétés de fixation de l'ADN à une capacité de vectorisation nucléaire de cet ADN
2. Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'au moins un acide nucléique caractérisée en ce qu'elle contient outre ledit acide nucléique et au moins un agent de transfection au moins un composé appartenant à la famille des HMG ou l'un de ses dérivés.
3. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que le composé est choisi parmi les protéines de type HMG 1, 2, I, Y, 14 et 17 et leurs dérivés.
4. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications précédentes carctérisée en ce que le composé est représenté par tout ou partie de la protéine
HMGI humaine, l'un de ses dérivés ou homologues.
5. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que ledit composé est en outre polyglycosylé, sulfoné, phosphorylé et/ou greffé à des sucres complexes ou à un agent lipophile.
6. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que ledit composé est en outre associé à un ligand de récepteur cellulaire ou nucléaire.
7. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'agent de transfection est un polymère cationique ou un lipofectant.
8. Composition pharmaceutique selon la revendication 7 caractérisée en ce que le polymère cationique est de préférence un composé de formule générale (I)
Figure img00210001
dans laquelle
- R peut être un atome d'hydrogène ou un groupe de formule
Figure img00210002
- p et q sont des nombres entiers, avec la somme p+q étant telle que le poids moléculaire moyen du polymère soit compris entre 100 et 107
- n est un nombre entier compris entre 2 et 10;
9. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 7 ou 8 caractérisée en ce que le polymère cationique est choisi parmi le polyéthylène imine (PEI) et le polypropylène imine (PPI).
10. Composition pharmaceutique selon la revendication 9 caractérisée en ce que le polymère est choisi parmi le polyéthylène imine de poids moléculaire moyen 50 000 (PEI50K) et le polyéthylène imine de poids moléculaire moyen 800 000 (PEI800K).
11. Composition pharmaceutique selon la revendication 7 caractérisée en ce que le lipofectant comprend au moins une région hydrophile polyamine de formule générale II H2N-(-(CH),-NH-),-H II dans laquelle m est un nombre entier supérieur ou égal à 2 et n est un nombre entier supérieur ou égal à 1, m pouvant varier entre les différents groupes de carbone compris entre 2 amines associée de manière covalente à une région lipophile de type chaîne hydrocarbonée, saturée ou non, du cholestérol, ou un lipide naturel ou synthétique capable de former des phases lamellaires ou héxagonales.
12. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 1 caractérisée en ce que la région polyamine est représentée par la spermine, la thermine ou un de leurs analogues ayant conservé ses propriétés de liaison à l'acide nucléique.
13. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 1 caractérisée en ce que la région lipophile y est représentée par la formule générale IV
Figure img00220001
dans laquelle - X et X' représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'oxygène, un groupement méthylène (CH2)q- avec q égal à 0, 1, 2 ou 3, ou un groupement amino -NH- ou -NR'- avec R' représentant un groupement alkyle en C1 à C4, - Y et Y' représentent indépendamment l'un de l'autre un groupement méthylène, un groupement carbonyle ou un groupement C=S, - R3, R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical allyle, substitué ou non, en C1 à C4, avec p pouvant varier entre 0 et 5, - R6 représente un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino -NR1R2 avec
R1 et R2 représentant indépendamment l'un de l'autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en C12 à C22
14. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 11 à 12 ou 13 caractérisée en ce qu'il s'agit de préférence d'une lipopolyamine choisie parmi la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS), la 5-carboxyspermylamide de la palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES), le (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)acétate de 2-5-bis-(3-amino-propylamino)-pentyle ou le (Dioctadécylcarbamoylméthoxy)-acétate de 1,3 -bis-(3 -amino-propylamino)-2 propyle.
15. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, 11 à 12 et 14 caractérisée en ce que l'agent de transfection est la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS).
16. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide désoxyribonucléique.
17. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide ribonucléique.
18. Composition pharmaceutique selon la revendication 16 ou 17 caractérisée en ce que l'acide nucléique est modifié chimiquement.
19. Composition pharmaceutique selon la revendication 16, 17ou 18 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un antisens.
20. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 16 à 19 caractérisée en ce que l'acide nucléique comporte un gêne thérapeutique.
21. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications précédentes comprenant en outre un ou plusieurs lipides neutres.
22. Composition pharmaceutique selon la revendication 21 caractérisée en ce que le ou les lipides neutres sont choisis parmi les lipides synthétiques ou naturels, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologiques.
23. Composition pharmaceutique selon la revendication 21 ou 22 caractérisée en ce que le ou les lipides neutres sont choisis parrni la dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), I'oléoyl-palmitoylphos phatidyléthanolamine (POPE), le di-stéaroyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamine ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à 3 fois; les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) et les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGM1 et
GM2).
24. Utilisation d'une composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 23 pour le transfert in vitro, ex vivo et/ou in vivo d'acides nucléiques.
25. Utilisation d'un composé tel que défini en revendication 1 ou 2, couplé à un ligand de récepteur cellulaire, un anticorps ou dérivé d'anticorps, cibler un acide nucléique vers des cellules exprimant les récepteurs ou anti-gènes correspondants.
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