SK70999A3 - Transfecting composition usable in gene therapy combining a recombinant virus incorporating an exogenous nucleic acid, a non-viral and non-plasmid transfecting agent - Google Patents

Description

Transfekčný prípravok vhodný na génovú terapiu, ktorý obsahuje rekombinantný vírus a transfekčné činidlo

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka oblasti génovej terapie a konkrétne sa týka prenosu genetického materiálu in vitro, ex vivo a/alebo in vivo. Vynález poskytuje predovšetkým nové prípravky použiteľné na účinnú transfekciu buniek.

Doterajší stav techniky

Chromozómové deficity a/alebo anomálie (mutácie, aberantné expresie, a pod.) sú zdrojom mnohých chorôb s dedičnou alebo nededičnou povahou. Medicína zostávala vzhľadom na ne dlhý čas bezmocná. S rozvojom génovej terapie je dnes možné dúfať, že v budúcnosti sa bude môcť tento typ chromozómovej aberácie opraviť alebo mu zabrániť. Tento nový spôsob liečenia spočíva v zavedení genetickej informácie do postihnutej bunky alebo orgánu s cieľom opraviť tento deficit alebo anomáliu, alebo alternatívne exprimovať tu požadovaný proteín.

Hlavná prekážka prieniku nukleovej kyseliny do bunky alebo cieľového orgánu spočíva vo veľkosti a polyaniónovej povahe tejto nukleovej kyseliny, čo bráni jej prechodu cez bunkovú membránu.

Aby sa táto prekážka odstránila, sú dnes navrhnuté rôzne techniky zahrňujúce konkrétne transfekciu samotnej nahej DNA cez plazmatickú membránu in vivo (W090/11092) a transfekciu DNA pomocou transfekčného vektora.

Čo sa týka konkrétne tejto druhej techniky, navrhnuté sú v zásade dve stratégie:

Prvá používa prirodzene transfekčné vektory, čo sú vírusy, a druhá spočíva v použití chemických alebo biochemických vektorov.

Čo sa týka vektorov vírusového pôvodu, používajú sa dnes široko na klonovanie, prenos a expresiu génov in vitro (na produkciu rekombinantných proteínov, uskutočňovanie skríningových testov, štúdium regulačných proteínov a pod.), ex vivo alebo in vivo (na vytváranie zvieracích modelov alebo v postupoch génového prenosu s liečebným významom). Z týchto vírusov sa môžu prípadne zmieniť konkrétne adenovírusy, adenoasociované vírusy (AAV), retrovírusy, herpesvírusy alebo dokonca vírus vakcínie.

Čeľaď vírusov Adenoviridae je široko rozšírená u cicavcov a vtákov a patrí do nej viac ako sto rôznych vírusových sérotypov, ktoré sú tvorené dvojvláknovou DNA bez obalu a vytvárajú kapsidu s ikozahedrickou symetriou (Horwitz, In: Fields BN, Knipe, DM, Howley PM, ed. Virology. Third edition ed. Philadephia: Raven Publishers, 1996: 2149-2171). Ich genóm obsahuje invertovanú terminálnu repetíciu (ITR) na každom konci, enkapsidačnú sekvenciu (Psi), rané a neskoré gény.·. Esenciálne skoré gény sa nachádzajú v úsekoch El, E2, E3 a E4. Z týchto génov sú tie, ktoré sa nachádzajú v úseku El, nevyhnutné na množenie vírusu. Esenciálne neskoré gény sa nachádzajú v úsekoch L1 až L5. Celý genóm adenovírusu Ad5 sa sekvenoval a je prístupný v databázach (pozri konkrétne Genebank M73260). Tiež sa sekvenovali rovnakým spôsobom časti alebo dokonca celé ďalšie adenovirusové genómy (Ad2, Ad7, Adl2 a pod.).

Okrem toho, že je neškodný, má adenovírus široký bunkový tropizmus. Na rozdiel od retrovírusu, ktorého životný cyklus je závislý na bunkovom delení, môže adenovírus výhodne infikovať aktívne sa deliace bunky, ale aj nedeliace sa bunky a jeho genóm sa udržuje v epizómovej forme. Navyše sa môže produkovať vo veľmi vysokom titri (10¹¹ pfu/ml). Tieto hlavné vlastnosti ho predurčujú ako vektor na klonovanie a expresiu heterologických génov. Skupina C adenovírusov, osobitne typy 2 a 5, a tiež psi adenovirus typu CAV-2, ktorého molekulová biológia je najlepšie známa, sú zdroje dnes bežne používaných vektorov. Z týchto dôvodov sa adenovírusové vektory využili na klonovanie a expresiu génov in vitro (Gluzman a kol., Cold Spring Harbor, New York 11724, p. 187), na vytvorenie transgénnych zvierat (WO95/22616), na prenos génov do buniek ex vivo (WO95/14875; W095/06120) a na prenos génov do buniek in vivo (pozri konkrétne WO93/19191, WO94/24297 a W094/08026).

Čo sa týka adeno-asociovaných vírusov (AAV) , sú to relatívne malé DNA vírusy, ktoré sa integrujú do genómu buniek, ktoré infikujú stálym a relatívne miestne-špecifickým spôsobom. Sú schopné infikovať široké spektrum buniek. Genóm AAV sa klonoval, sekvenoval a opísal. Obsahuje asi 4700 báz a na každom konci má úsek invertovanej terminálnej repeticie (ITR) s približnou veľkosťou 145 bp, ktorý slúži ako replikačný počiatok pre vírus. Zvyšok genómu je rozdelený do dvoch esenciálnych častí nesúcich enkapsidačné funkcie: ľavá časť genómu, ktorá obsahuje gén rep zúčastňujúci sa replikácie virpsu a expresie vírusových génov, a pravá časť genómu, ktorá obsahuje gén cap, kódujúci proteíny vírusovej kapsidy. Použitie vektorov odvodených od AAV na prenos génov in vitro a in vivo bol už opísaný (konkrétne pozri WO91/18088; WO93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941 a EP 488 528).

Ukázalo sa, že tieto vektory, predovšetkým adenovírusy, sú veľmi výhodné, čo sa týka úrovne transfekcie. Konvenčné sa infekcia buniek vírusovým transfekčným vektorom uskutočňuje v dvoch krokoch. V prvom stupni sa rozpoznávajú cieľové receptory na povrchu buniek, ktoré umožňujú prichytenie rekombinantného vírusu. Povaha týchto receptorov, rovnako ako ich distribúcia v závislosti na typu bunky, je málo dokumentovaná, ale v konkrétnom prípade adenovírusu sa zdá, že je to vlákno, proteín na vonkajšom povrchu adenovírusu, ktorý sa môže podieľať na tomto prichytení. Druhý krok spočíva v interakcii vírusového pentonového proteínu na koreni vlákna prostredníctvom peptidového motívu RGD s bunkovými integrínmi avb3 a/alebo avb5, ktoré umožňujú internalizáciu viriónu.

Účinnosť, s ktorou môže rekombinantný vírus infikovať bunku (účinnosť transdukcie), je veľmi variabilná a závisí na type buniek študovaných v tkanivovej kultúre alebo tkanivách, ktorých testovanie je dôležité pre in vivo liečenie. Vo všetkých prípadoch je to prvý krok prichytenia, ktorý určuje účinnosť internalizácie viriónu. Počet receptorov na povrchu bunky tak predstavuje limitujúci faktor infekčného procesu a je jasné, že každý prístup ako obísť tento krok prichytenia alebo jeho uľahčenia umožní túto prekážku odstrániť.

Prvým cieľom predkladaného vynálezu bolo konkrétne zvýšenie účinnosti transfekcie týchto vírusových vektorov optimalizáciou ich internalizácie na úrovni cieľovej bunky, ktorá sa má liečiť.

Druhý cieľ zameraný a dosiahnutý predkladaným vynálezom sa týka redukcie alebo dokonca supresie imunitnej odpovede, zvyčajne prejavovanej opracovanými bunkami, proti vírusovému vektoru. V skutočnosti, rovnako ako je to pre všetky známe vírusy, podávanie rekombinantných vírusov, ako sú rekombinantné adenovírusy, ktoré sú defektné v replikácii (Yang a kol., PNAS (1994) 4407), vyvoláva významnú imunitnú odpoveď. Jedna z hlavných úloh imunitného systému spočíva v skutočnosti v zničení prvkov, ktoré nie sú vlastné alebo sú vlastné, ale zmenené. Podávanie génového liečebného vektora vírusového pôvodu zavádza do organizmu motívy, ktoré mu nie sú vlastné. Rovnako bunky infikované takýmto vektorom, ktorého dôsledkom je expresia exogénneho génu, sa stanú vlastnými zmenenými prvkami. Imunitná odpoveď rozvinutá proti týmto infikovaným bunkám tak predstavuje hlavnú prekážku rozvoja týchto vírusových vektorov, pretože i) indukciou a deštrukciou infikovaných buniek obmedzuje čas expresie génu a teda liečebný účinok, ii) indukuje súčasnú a významnú zápalovú odpoveď a iii) znamená rýchlu elimináciu infikovaných buniek po opakovaných injekciách.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález umožňuje dosiahnuť výhodne tieto dva ciele spojením požadovaného rekombinantného vírusu s chemickou alebo biochemickou zlúčeninou, ktorá účinne napomáha jeho transdukcii a chráni ho pred reakciami imunitného systému vyvolanými po stretnutí s vírusom.

Ako sa už uviedlo, súčasne s vírusovými vektormi sa na úrovni génovej terapie vyvíjali tiež nevírusové transfekčné vektory. Presnejšie, sú to chemické alebo biochemické vektory. Tieto syntetické vektory majú dve hlavné funkcie, kondenzovať DNA, ktorá sa má transfekovať a podporovať jej bunkové prichytenie, ako aj jej prechod cez plazmatickú membránu, a ak je to nutné, cez dve jadrové membrány.

Aj keď tieto chemické vektory nie sú tak účinné ako vírusové vektory, sú na druhej strane výhodnejšie z imunitného hľadiska. Neprejavujú sa patogénne, riziko namnoženia DNA v týchto vektoroch je nulové a nemajú v podstate žiadny teoretický limit, čo sa týka veľkosti DNA, ktorá sa má transfekovať.

/

Z týchto vyvinutých syntetických, vektorov sú najvýhodnejšie katiónové polyméry typu polylyzínu a DEAE-dextránu alebo dokonca lipofektanty. Sú schopné kondenzovať DNA a podporovať jej spojenie s bunkovou membránou. Úplne nedávno sa vyvinul spôsob cielenej transfekcie sprostredkovanej receptorom. Táto technika spočíva na princípe kondenzácie DNA vplyvom katiónového polyméru, zatiaľ čo sa súčasne riadi prichytenie komplexu na membránu prostredníctvom chemickej väzby medzi katiónovým polymérom a ligandom membránového receptora, prítomného na povrchu bunkového typu, ktorý je žiaduce naviazať. Opísalo sa tak cielenie receptora pre transferín, pre inzulín alebo receptora asialoglykoproteínov hepatocytu.

Hlavný cieľ predkladaného vynálezu leží presnejšie v spojení aspoň jedného z týchto chemických alebo biochemických vektorov s rekombinantným vírusom obsahujúcim v svojom genóme aspoň jednu exogénnu nukleotidovú sekvenciu so zreteľom na účinnejšiu podporu bunkovej transdukcie tohto rekombinantného vírusu.

Autor neočakávane dokázal, že bolo možné využiť simultánne príslušné vlastnosti týchto dvoch typov transfekčných vektorov na účinnú indukciu expresie terapeutických génov.

Predkladaný vynález výhodne vychádza súčasne z vlastností nosičov chemických vektorov typu lipozóm alebo lipofektant, ktoré sú schopné fúzie s celým radom bunkových typov a účinnosťou internalizácie rekombinantných vírusov, ako je konkrétne adenovírus. Nasleduje synergia medzi viriónom, ktorý je transdukčným činidlom génu požadovaného liečebného účinku a lipofektantom ako pomocným činidlom transfekcie. Tento synergizmus sa výhodne prejavuje v dvoch úrovniach.

Spočiatku sa prejavuje veľmi významným zvýšením v lokálnej koncentrácii rekombinantného vírusu. Táto podpora je taká, že u bunkového typu, ako sú bunky hladkého svalstva ciev, kde je veľmi málo exprimovaný vláknitý receptor, . je účinnosť transfekcie u rekombinantného adenovírusu spojeného s lipozómom 50 až lOOx vyššia ako u samotného rekombinantného adenovírusu. Toto pozorovanie sa navyše potvrdilo u odlišných adenovírusov. Dokázalo sa, že je možné v prítomnosti chemického alebo biochemického vektora použiť znížené množstvo rekombinantných vírusov s rovnakou, ak nie vyššou účinnosťou.

Nakoniec sa neočakávane dokázalo, že asociácia chemického vektora sa účinne oslabil systémom s rekombinantným adenovírusom umožňuje, aby fenomén neutralizácie, zvyčajne indukovaný vírusmi. Ak sa pri stretnutí s rekombinantnými adenovírus v izolovanej forme neutralizačné obsahujúcim anti-Ad zníženie účinnosti transdukcie.

skontaktuje protilátky,

Táto transdukcie imunitným s ľudským sérom pozoruje sa silné je nečakane významne zvýšená lipofektantu. Podľa v prítomnosti chemického vektora typu dávky použitého lipofektantu je účinnosť transdukcie buď obnovená alebo zvýšená 10 až 20x v porovnaní s transdukciou adenovirusu pri priaznivých podmienkach.

Predkladaný vynález tak má ako prvý predmet prípravok použiteľný v génovej terapii, charakteristický tým, že je spojený s jedným alebo viacerými rekombinantnými neenkaspidovanými vírusmi obsahujúcimi v svojom genóme aspoň jednu exogénnu nukleovú kyselinu a aspoň jedno transfekčné činidlo iného ako vírusového alebo plazmidového pôvodu.

Čo sa týka nevírusového transfekčného činidla, vyberá sa prednostne z katiónových polymérov a lipofektantov.

Konkrétnejšie, čo sa týka lipofektantov, je pochopiteľné, že toto označenie pokrýva v zmysle predkladaného vynálezu každú zlúčeninu lipidového charakteru a už predloženú ako aktívne činidlo vzhľadom na bunkovú transfekciu nukleovými kyselinami. Všeobecne sú to amfifilné molekuly obsahujúce aspoň jeden lipofilný úsek spojený alebo nespojený s hydrofilným úsekom. Ako predstavitelia prvej rodiny sa môžu uviesť konkrétne lipidy schopné tvoriť lipozómy, ako sú POPC, fosfatidylserín, fosfatidylcholín, cholesterol, lipofektamín, maleimidofenylbutyrylfosfatidyletanolamín, laktozylceramid v prítomnosti alebo neprítomnosti polyetylénglykolu na tvorbu falošných lipozómov alebo tvorbu imunolipozómov či cielených lipozómov s protilátkami alebo ligandmi alebo bez nich.

V konkrétnom spôsobe podľa vynálezu má použité lipidové činidlo katiónový úsek. Tento katiónový úsek, výhodne polyamín nabitý ako katión, pravdepodobne reverzibilne asociuje s rekombinantným vírusom.

Ako ilustračné prípady tohto typu katiónových lipidov skonštruovaných na nasledovnom štruktúrnom modeli: lipofilná skupina asociovaná s aminoskupinou prostredníctvom spacer vetvy, je možné uviesť konkrétne DOTMA, a tiež tie lipidy, ktoré obsahujú ako lipofilnú skupinu dve mastné kyseliny alebo derivát cholesterolu a navyše majú, ak je to nevyhnutné, kvartérnu amóniovú skupinu ako aminoskupinu. Ako reprezentatívne príklady tejto kategórie katiónových lipidov sa môžu uviesť konkrétne

DOTAP, DOBT alebo ChOTB. Iné zlúčeniny, ako DOSC a ChOSC, sú charakterizované prítomnosťou cholínovej skupiny na mieste kvartétnej amóniovej skupiny.

Lipofektanty vhodné pre vynález sa môžu výhodne vybrať tiež z lipopolyamínov, ktorých polyamínový úsek zodpovedá všeobecnému vzorcu

H₂N-(-(CH)_m-NH-)_n-H

I kde m je celé číslo rovné alebo väčšie ako 2 a n je celé číslo rovné alebo väčšie ako 1, pričom m sa môže pohybovať medzi odlišnými uhlíkovými skupinami nachádzajúcimi medzi dvoma amínmi, tento polyamínový úsek je kovalentne spojený s lipofilným úsekom uhlovodíkového reťazca, ktorý je saturovaný alebo nesaturovaný, cholesterolu, alebo prirodzeného či syntetického lipidu schopného tvoriť lamelárne alebo hexagonálne fázy. Tento polyamínový úsek je najvýhodnejšie predstavovaný spermínom, thermínom alebo jedným -z ich analógov, ktorý má zachované väzbové vlastnosti k nukleovej kyseline.

Patentová prihláška EP 394 111 opisuje lipopolyaminy tejto rodiny, ktoré sa môžu použiť v zmysle predkladaného vynálezu. Ako príklad týchto lipopolyamínov sa môžu konkrétne uviesť dioktadecylamidoglycyl-spermín (DOGS) a palmitoylfosfatidyletanolamin-5-karboxyspermylamid (DPPES).

Lipolyaminy opísané v patentovej prihláške WO96/17823 sa môžu tiež výhodne použiť podlá vynálezu. Sú predstavované všeobecným vzorcom

H₂N-(-(CH)_m-NH-)_n-H v ktorom R predstavuje

kde X a X' predstavujú, nezávisle jeden na druhom, atóm kyslíka, metylénovú skupinu -(CH2)_q- s q rovným 0, 1, 2 alebo 3, alebo aminoskupinu, -NH- alebo -NR'-, kde R' predstavuje alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 atómy uhlíka (Ci až C4 alkylovú skupinu),

Y a Y' nezávisle jeden na druhom predstavujú metylénovú skupinu, karbonylovú skupinu alebo skupinu C=S,

R³, R⁴ a R⁵ nezávisle jeden na druhom predstavujú atóm vodíka alebo substituovanú alebo nesubstituovanú Ci až C4 alkylovú skupinu, pričom p sa môže pohybovať od 0 po 5,

R⁶ predstavuje derivát cholesterolu alebo alkylamínovú skupinu -NR¹R², kde R¹ a R², nezávisle jeden na druhom predstavujú· saturovanú alebo nesaturovanú, lineárnu alebo nelineárnu alebo rozvetvenú alifatickú skupinu obsahujúcu 12 až 22 atómov uhlíka (C12 až C22 alifatickú skupinu) .

Ako reprezentatívne príklady týchto lipopolyamínov možno uviesť najmä 2-5-bis-(3-amino-propylamino) pentyl (dioktadecylkarbamoylmetoxy)acetát a 2-[1,3-bis(3-aminopropylamino)]propyl (dioktadecylkarbamoylmetoxy) acetát.

V poslednom čase sa vyvinuli nové lipopolyamíny, ktoré sa opísali v patentovej prihláške FR95/13490 a môžu byť tiež vhodné v zmysle predkladaného vynálezu. Sú to zlúčeniny, ktoré majú nasledovný všeobecný vzorec:

kde R¹, R² a R³ predstavujú, nezávisle jeden na druhom, atóm vodíka alebo skupinu -(CH2)_q-NRR', s tým, že q môže mať hodnoty 1, 2, 3, 4, 5 a 6, nezávisle pre rôzne R¹, R² a R³,

R a R' nezávisle jeden na druhom predstavujú atóm vodíka alebo skupinu -(CH2)_q-NH2, pričom q môže mať hodnoty 1, 2, 3, 4, 5 a 6, nezávisle pre rôzne skupiny R a R' .

m, n a p predstavujú, nezávisle jeden na druhom, celé číslo, ktoré sa môže pohybovať medzi 0 až 6, ak n je väčšie ako 1, m môže mať odlišné hodnoty a R³ odlišné významy vo všeobecnom vzorci, a

R⁴ predstavuje skupinu so všeobecným vzorcom

kde R6 a R7 nezávisle jeden na druhom predstavujú atóm vodíka alebo saturovanú či nesaturovanú Cio až C₂2 alifatickú skupinu obsahujúcu 10 až 22 atómov uhlíka (Cio až C22) , pričom aspoň jedna z dvoch skupín nie je vodík, u je celé číslo medzi 0 až 10, a ak u je celé číslo väčšie -ako 1, R⁵, X, Y a r môžu mať rôzne významy v odlišných motívoch [X-(CHR⁵) _r-Y],

X predstavuje atóm kyslíka alebo síry alebo volitelne monoalkylovanú aminoskupinu,

Y predstavuje karbonylovú skupinu alebo metylénovú skupinu,

R⁵ predstavuje atóm vodíka alebo bočný reťazec prirodzenej aminokyseliny, ak je to nutné, substituovanej, a r je celé číslo pohybujúce sa medzi 1 až 10, a ak je r rovné 1, R⁵ predstavuje substituovaný alebo nesubstituovaný bočný reťazec prirodzenej aminokyseliny, a ak je r väčšie ako 1, R⁵ predstavuje atóm vodíka.

Ako reprezentatívny príklad týchto lipopolyamínov sa môžu konkrétne ako vhodné uviesť nasledovné:

{H₂N(CH₂)₃}N(CH₂)₄N{ (CH₂)₃NH₂} (CH₂)₃NHCH₂COGlyN[ (CH₂)i7-CH₃]₂ (RP120525)

H₂N (CH₂) ₃NH (CH₂) ₄NH (CH₂) ₃NHCH₂COGlyN [ (CH₂) _χ8] 2 (RP120535)

H₂N (CH₂) ₃NH (CH₂) ₄NH (CH₂) ₃NHCH₂COArgN [ (CH₂) ₁₈] ₂ (RP120531)

V ďalšom konkrétnom uskutočnení vynálezu je nevírusový vektor predstavovaný aspoň jedným katiónovým polymérom a, výhodnejšie zlúčeninou so všeobecným vzorcom

N --- (CH₂)_n

I

R v ktorom R môže byť atóm vodíka alebo skupina podlá vzorca (CH₂) _n — N kde n pričom je molekulová je celé zrejmé, hmotnosť číslo medzi 2 zlúčeniny

WO96/02655 sú že súčet p polyméru je uvedené konkrétne v až 10, p a q je taký, 100 až sú celé čísla, + q medzi že

10⁷ priemerná

Takéto

D.

patentovej prihláške

Konkrétne úplne výhodné vlastnosti majú polyméry polyetylénimín (PEI) a polypropylénimín (PPI) . Polyméry výhodné na uskutočnenie predkladaného vynálezu sú tie, ktorých molekulová hmotnosť je medzi 10³ a 5 x 10⁶. Ako príklad sa môže uviesť polyetylénimín s priemernou molekulovou hmotnosťou 50000

D (PEI50K) alebo polyetylénimín s priemernou molekulovou hmotnosťou 800000 D (PEI800K). PEI50K a PEI800K sú dostupné komerčne. Čo sa týka ďalších polymérov predstavovaných všeobecným vzorcom uvedeným vyššie, môžu sa pripraviť podlá postupu opísaného v patentovej prihláške FR 94 08735.

Mimoriadne výhodne sa môže použiť v zmysle vynálezu lipofektamín, dioktadecylamidoglycylspermin (DOGS), palmitoylfosfatidyletanolamín-5-karboxyspermylamid (DPPES), 2-5-bis(3-aminopropylamino)pentyl(dioktadecylkarbamoylmetoxy)acetát,

2-1,3-bis(3-aminopropylamino)]propyl(dioktadecylkarbamoylmetoxy) acetát, {H₂N(CH₂)₃}N(CH₂)₄N{ (CH₂)₃NH₂} (CH₂)₃NHCH₂COGlyN[ (CH₂)₁₇-CH₃]₂, H₂N (CH₂) ₃NH (CH₂) ₄NH (CH₂) ₃NHCH₂COGlyN [ (CH₂) i₈] 2,

H₂N (CH₂) ₃NH (CH₂) ₄NH (CH₂) ₃NHCH₂COArgN [ (CH₂) ₁₈] ₂ a/alebo

H₂N (CH₂) ₃NH (CH₂) ₄NH (CH₂) ₃NHCH₂COGlyN [ (CH₂) i₇-CH₃] ₂

Rekombinantné vírusy použité podľa predkladaného vynálezu sú defektné, t.j. neschopné replikovať sa autonómnym spôsobom v cieľovej bunke. Všeobecne, genóm defektným vírusov použitých podľa vynálezu má tak minimálne odstránené sekvencie nevyhnutné pre replikáciu uvedeného vírusu v infikovanej bunke. Tieto úseky sa môžu buď eliminovať (úplne alebo čiastočne) alebo znefunkčniť alebo substituovať inými sekvenciami, konkrétne vloženou nukleovou kyselinou, Defektný vírus výhodne obsahuje sekvencie svojho genómu, ktoré sú nevyhnutné pre enkapsidáciu (zabalenie) vírusových častíc.

Rekombinantný vírus použitý v zmysle predkladaného vynálezu pochádza z enkapsidovaného vírusu. Ako neobmedzujúce príklady takéhoto typu vírusu je mimoriadne vhodné uviesť adenovírusy a adeno-asociované vírusy (AAV). Podľa výhodného uskutočnenia vírus je adenovírus.

Existujú rôzne sérotypy adenovírusu, ktorých štruktúra a vlastnosti sa trochu líšia. Z týchto sérotypov sa v zmysle predkladaného vynálezu preferuje použitie ľudského adenovírusu typ 2 alebo 5 (Ad2 alebo Ad5) alebo adenovírusy zvieracieho pôvodu (pozri prihláška WO94/26914). Z adenovírusov zvieracieho pôvodu, ktoré sa môžu uviesť v rámci predkladaného vynálezu, sa môžu uviesť adenovírusy pôvodu psieho, hovädzieho, myšacieho (napríklad: Mavl, Beard a kol., Virology, 75, 81, 1990), ovčieho, prasacieho, vtáčieho alebo prípadne opičieho (napríklad: SAV). Výhodne adenovírus zvieracieho pôvodu je psí adenovírus, výhodnejšie adenovírus CAV2 (napríklad kmeň Manhattan alebo A26/61 (ATCC VR-800). Výhodne sú v rámci vynálezu použité adenovírusy ľudské alebo psie, alebo zmiešaného pôvodu.

Výhodne je znefunkčnená aspoň jedna oblasť E1 v genóme adenovírusu. Uvažovaný vírusový gén sa môže znefunkčniť akoukoľvek technikou známou odborníkovi, konkrétne úplnou supresiou, substitúciou, čiastočnou deléciou alebo pridaním jednej alebo viacerých báz k uvažovaným génom. Môžu sa modifikovať tiež ďalšie oblasti, konkrétne oblasť E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697).

Podľa výhodného spôsobu použitia obsahuje adenovírus deléciu v úsekoch E1 a E4. Podľa ďalšieho výhodného uskutočnenia obsahuje deléciu v úseku E1 na úrovni, v ktorej sú vložené úsek E4 a kódujúce sekvencie. Vo víruse podľa vynálezu delécia v úseku E1 výhodne zaberá úsek nukleotidov 455 až 3329 zo sekvencie adenovírusu Ad5. Podlá ďalšieho výhodného uskutočnenia je sekvencia exogénnej nukleovej kyseliny vložená na úrovni delécie úseku El.

Defektné rekombinantné adenovírusy podľa vynálezu sa môžu pripraviť akoukoľvek technikou odborníkovi známou (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917) . Môžu sa pripraviť konkrétne homologickou rekombináciou medzi adenovírusom a plazmidom nesúcim okrem iného exogénnu nukleovú kyselinu. Homologická rekombinácia nastáva po spoločnej transfekcii (kotransfekcii) uvedenými adenovirusmi a plazmidom príslušnej bunkovej línie. Použitá bunková línia musí byť výhodne (i) transformovateľná uvedenými prvkami a (ii) musí obsahovať sekvencie schopné komplementovať časti genómu defektného adenovírusu, výhodne v integrovanej forme, aby sa zabránilo riziku rekombinácie. Ako príklad línie sa môže uviesť línia ľudských embryonálnych obličiek 293 (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), ktorá obsahuje konkrétne integrovanú do svojho genómu ľavú časť genómu adenovírusu Ad5 (12%) alebo línia schopná komplementovať funkcie El a E4, ako sa konkrétne opísalo v prihláškach č. WO94/26914 a WO95/02697'. Adenovírusy, ktoré sa namnožili, sa získajú .a purifikujú zvyčajnými technikami molekulovej biológie, ako je uvedené v príkladoch.

Adenovírusy použité podľa vynálezu sa môžu podobne získať pôvodným postupom opísaným v patentovej prihláške WO96/25506, ktorá používa ako kyvadlový plazmid prokaryotický plazmid obsahujúci genóm rekombinantného adenovírusu ohraničený jedným alebo viacerými reštrikčnými miestami, ktoré nie sú v uvedenom genóme prítomné.

Ako ilustračný a neobmedzujúci príklad prípravkov podľa vynálezu je konkrétne vhodné navrhnúť, že asociácia lipofektamínu v dostatočnom množstve s rekombinantným adenovírusom obsahujúcim v svojom genóme aspoň jednu exogénnu nukleovú kyselinu zlepší jej bunkovú transdukciu.

V prípravkoch podía predkladaného vynálezu sa ako nukleová kyselina môže zaviesť na úrovni genómu rekombinantného vírusu deoxyribonukleová kyselina, ako aj ribonukleová kyselina. Môžu to byť sekvencie prirodzeného alebo umelého pôvodu, konkrétne genómová DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, hybridné sekvencie alebo syntetické či semisyntetické sekvencie modifikovaných alebo nemodifikovaných oligonukleotidov. Tieto nukleové kyseliny môžu byť pôvodu ľudského, zvieracieho, rastlinného, bakteriálneho, vírusového a pod. Môžu sa získať akoukoľvek technikou odborníkovi známou, konkrétne skríningom, chemickou syntézou alebo alternatívne zmiešanými metódami, vrátane chemickej alebo enzýmovej modifikácie sekvencií získaných skríningom knižníc.

Čo sa konkrétnejšie týka deoxyribonukleových kyselín, môžu byť jedno alebo dvojvláknové, rovnako ako krátke oligonukleotidy alebo dlhšie sekvencie. Tieto deoxyribonukleové kyseliny môžu niesť terapeutické gény, regulačné sekvencie pre transkripciu alebo replikáciu, modifikované alebo nemodifikované antisense sekvencie, väzbové úseky pre iné bunkové zložky, a pod.

V zmysle vynálezu sa pojmom terapeutický gén v podstate myslí každý gén kódujúci proteínový produkt, ktorý má terapeutický účinok. Proteínový produkt kódovaný týmto spôsobom môže byť proteín, peptid a pod. Tento proteínový produkt môže byť homologický vzhladom na cieľovú bunku (t.j. produkt, ktorý sa normálne exprimuje v cieľovej bunke, ktorá neprejavuje žiadnu patológiu) . V tomto prípade expresia proteínu dovoľuje prekonať napríklad nedostatočnú expresiu v bunke alebo expresiu proteínu, ktorý je inaktívny alebo slabo aktívny kvôli modifikácii, alebo alternatívne sa uvedený proteín exprimuje nadmerne. Terapeutický gén môže tiež kódovať mutantný bunkový proteín, ktorý má zvýšenú stabilitu, modifikovanú aktivitu, a pod. Proteínový produkt môže byť rovnako tiež heterologický vzhľadom na cieľovú bunku. V tomto prípade môže exprimovaný proteín vytvárať alebo prispievať k aktivite, ktorá je v bunke nedostatočná a tak umožní bojovať s patológiou alebo stimulovať imunitnú odpoveď.

Z terapeutických produktov v zmysle predkladaného vynálezu je vhodné konkrétne uviesť enzýmy, krvné deriváty, hormóny, lymfokiny, interleukíny, interferóny, TNF, a pod. (FR9203120), rastové faktory, neurotransmitery alebo ich prekurzory či enzýmu syntézy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofín, atď., dystrofin alebo minidystrofin (FR 9111947), proteín CFTR spojený s mukoviscidózou, gény spojené so zastavením bunkového delenia, konkrétne gén gax, nádorové supresorové gény: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev a pod. (FR 93 04745), gény kódujúce faktory zapojené do koagulácie: faktory VII, VIII, IX, gény zasahujúce do opravy DNA, samovražedné gény (tymidínkináza, cytozíndeamináza), hemoglobín alebo ďalší gén proteínových prenášačov, gény zodpovedajúce proteinom zapojených do metabolizmu lipidov apolipoproteínovov A-I, A-II, A-IV, B, CI, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J a apo(a), metabolické enzýmy, ako je napríklad lipoproteínová lipáza, pečeňová lipáza, lecitíncholesterolacyltransferáza, 7-alfa-cholesterolhydroxyláza, fosfatidová kyslá fosfatáza, alebo alternatívne proteíny prenášajúce lipidy, ako je proteín viažuci HDL alebo alternatívne receptor vybratý napríklad z receptorov LDL, zvyškových receptorov chylomikrónov, pod.

scavenger receptorov,

Terapeutická nukleová kyselina môže byť tiež gén alebo antisense sekvencia (sekvencia s orientáciou proti zmyslu normálnej transkripcie), ktorej expresia v cieľovej bunke umožňuje expresiu génu alebo potlačenie transkripcie bunkovej mRNA. Takéto sekvencie sa môžu napríklad v cieľovej bunke transkribovať do RNA komplementárnej k bunkovej mRNA a tým blokovať jej transláciu do proteínu, podľa spôsobu opísaného v patente EP 140 308. Terapeutické gény tiež obsahujú sekvencie kódujúce ribozýmy, ktoré sú schopné selektívne zničiť cieľové RNA (EP 321 201).

Ako sa už uviedlo vyššie, nukleová kyselina môže tiež obsahovať jeden alebo viac génov kódujúcich antigénne peptidy schopné vyvolať imunitnú odpoveď u človeka alebo zvierat. V tomto konkrétnom spôsobe použitia vynález teda umožňuje produkciu buď vakcín alebo imunoterapeutických liečiv podávaných ľuďom alebo zvieratám, predovšetkým proti mikroorganizmom, vírusom alebo rakovine. Môžu to byť konkrétne špecifické antigénne peptidy vírusu Epstein-Barrovej, vírusu HIV, vírusu hepatitídy B (EP 185 573), vírusu pseudorabies, vírusu vytvárajúceho syncycia alebo iných vírusov, alebo alternatívne peptidy špecifické pre nádory (EP 259 212) .

Nukleová kyselina výhodne tiež obsahuje sekvencie umožňujúce expresiu terapeutického génu a/alebo génu kódujúceho antigénny peptid v požadovanej bunke alebo orgáne. Môžu to byť sekvencie, ktoré sú prirodzene zodpovedné za expresiu požadovaného génu, ak sú tieto sekvencie schopné fungovať v infikovanej bunke. Môžu to byť tiež sekvencie odlišného pôvodu (zodpovedné za expresiu iných proteínov, alebo dokonca syntetické) . Konkrétne to môžu byť promótorové sekvencie eukaryotických alebo vírusových génov. Napríklad to môžu byť promótorové sekvencie pochádzajúce z genómu vírusu. Z tohto hladiska je vhodné uviesť napríklad promótory génov E1A, MLP, CMV, RSV, a pod. Okrem toho tieto expresné sekvencie sa môžu t modifikovať pridaním aktivačných alebo regulačných sekvencií, a pod. Môžu to byť tiež promótorové, indukovatelné alebo reprimovatelné sekvencie.

Nukleová kyselina môže tiež navyše obsahovať, konkrétne v protismere od terapeutického génu, signálnu sekvenciu pre nasmerovanie syntetizovaného terapeutického produktu do sekrečných dráh cielovej bunky. Táto signálna sekvencia môže byť prirodzená signálna sekvencia terapeutického produktu, ale môže to byť tiež akákoľvek iná funkčná signálna sekvencia alebo umelá signálna sekvencia. Nukleová kyselina môže tiež obsahovať signálnu sekvenciu smerujúcu syntetizovaný terapeutický produkt smerom ku konkrétnemu kompartmentu bunky.

V ďalšom spôsobe podľa vynálezu môžu prípravky podľa vynálezu navyše obsahovať adjuvans dioleoylfosfatidyletanolamín (DOPE), oleoylpalmitoylfosfatidyletanolamín (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl alebo -myristoylfosfatidyletanolamínový typ, ako aj ich deriváty, ktoré sú 1 až 3 krát N-metylované; fosfatidylglyceroly, diacylglyceroly, glykozyldiacylglyceroly, cerebrozidy (konkrétne galaktocerebrozidy), sfingolipidy (konkrétne sfingomyeliny), alebo alternatívne asialogangliozidy (konkrétne asialoGMl a GM2) .

Autor úplne nedávno dokázal, že sa tiež mimoriadne výhodné použila ako adjuvans v transfekčných prípravkoch zlúčenina zasahujúca priamo alebo nepriamo na úrovni kondenzácie nukleových kyselín. Táto zlúčenina je tvorená úplne alebo čiastočne peptidovými motívmi (KTPKKAKKP) a/alebo (ATPAKKAA), pričom počet motívov sa môže pohybovať medzi 2 až 10. Takéto činidlo môže tiež pochádzať celé alebo čiastočne z histónov, nukleolínu, protamínu a/alebo jedného z ich derivátov (WO96/25508).

Takéto adjuvans môže byť užitočné na zlepšenie intracelulárneho pohybu rekombinantného vírusu v prípravkoch podľa vynálezu.

V prípravku podľa vynálezu sa môžu tiež použiť jeden alebo viac cieliacich prvkov, ktoré umožňujú to, že vírusové a nevírusové vektory sú namierené proti’ receptorom alebo ligandom na povrchu buniek. Ako príklad môže prípravok predkladaného vynálezu obsahovať jednu alebo viac protilátok namierených proti molekulám na bunkovom povrchu alebo alternatívne jeden alebo viac ligandov membránových receptorov, ako je inzulín, transferín, kyselina listová alebo akýkoľvek iný rastový faktor, cytokíny alebo vitamíny. V prípravku sa môžu výhodne použiť modifikované alebo nemodifikované lektíny, aby sa zamerali na konkrétne polysacharidy na povrchu bunky alebo susediaci extracelulárny matrix. Môžu sa tak využiť proteíny s motívom RGD, cyklické alebo acyklické peptidy obsahujúce pár motívov RGD a tiež polylyzínové peptidy. Tieto zacieľovacie činidlá sa môžu konjugovať buď s rekombinantným vírusom a/alebo s nevírusovým transfekčným vektorom.

Dávky vírusu použité na podávanie funkcie rôznych parametrov, konkrétne použitého podávania, vzťahujúceho sa alternatívne na dĺžku potrebnej liečby, podľa vynálezu sú všeobecne formulované dávok medzi 10⁴ až 10¹⁴ pfu/ml. Termín pfu

sa môžu nastaviť ako
ako	funkcie	spôsobu
na	patológiu	alebo
Rekombinantné	vírusy
a	podávané vo forme

(plaque-forming unit jednotka tvoriaca plak) zodpovedá infekčnej sile suspenzie viriónov a určuje sa infekciou príslušnej bunkovej kultúry a meraním, všeobecne po 48 hodinách, počtu plakov infikovaných buniek. Spôsoby určenia titra pfu vírusového roztoku sú v literatúre dobre dokumentované.

Čo sa týka množstva asociovaného nevírusového transfekčného vektora, samozrejme sa mení podľa jeho povahy, povahy vírusového vektora s ktorým je asociovaný, a tiež podľa bunkového typu, na ktorý je zameraný. Všeobecne povedané, používa sa in vitro množstvo pohybujúce sa medzi 50 ng až 1 pg. Pri aplikáciách ex vivo sa množstvo asociovaného nevírusového transfekčného vektora mení podľa množstva a typu bunkového tkaniva, ktoré je potrebné transfekovať. Toto množstvo sa môže pohybovať medzi 60 ng/ml až 500 μς/ιηΐ.

Prípravky podľa vynálezu sa môžu formulovať s ohľadom na podávanie spôsobom topickým, kutánnym, perorálnym, rektálnym, vaginálnym, parenterálnym, intranazálnym, intravenóznym, intramuskulárnym, subkutánnym, intraokulárnym, transdermálnym a pod. Farmaceutické prípravky podľa vynálezu výhodne obsahujú farmaceutický prijateľný nosič na injikovateľný prípravok, konkrétne na priamu injekciu na úrovni požadovaného orgánu alebo na podávanie topickou cestou (na kožu a/alebo mukózne membrány). Konkrétne to môžu byť sterilné izotonické roztoky, alebo suché, konkrétne lyofilizované prípravky, ktoré umožnia vytvorenie roztoku pre injekcie pridaním sterilnej vody alebo fyziologického séra podľa daného prípadu. Dávky nukleovej kyseliny použitej na injekcie, a tiež počet podávania sa môže nastaviť ako funkcia rôznych parametrov, konkrétne ako funkcie spôsobov použitého podávania, súvisiaceho s patológiou, génu, ktorý sa má exprimovať alebo alternatívne k dĺžke požadovanej liečby. Konkrétnejšie čo sa týka spôsobu podávania, môže to byť buď priama injekcia do tkaniva alebo obehu, alebo opracovanie buniek v kultúre nasledované ich reimplantáciou in vivo, injekciou alebo štepom. Predkladaný vynález sa tiež týka buniek opracovaných prípravkom podlá vynálezu na použitie ex vivo.

Predkladaný vynález bude úplnejšie opísaný formou príkladov a obrázkov, ktoré nasledujú a ktoré je potrebné považovať za ilustrativne a neobmedzujúce.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1: účinok lipofektamínu na účinnosť transdukcie AdPGal na úrovni buniek VSMC.

Obrázok 2: porovnanie účinnosti transdukcie Ad-luc v prítomnosti a neprítomnosti lipofektamínu.

Obrázok 3: detekcia kryštálovou fialovou buniek CMV transdukovaných s Ad-TK a opracovaných s GCV, v prítomnosti a neprítomnosti 0,125 gg lipofektamínu.

Obrázok 4: vyhodnotenie účinku lipofektamínu na neutralizáciu Ad-luc v médiu FCS alebo AHS pre dávky pohybujúce sa od 0 do 0,5 gg lipofektamínu (obrázok 4A) a od 1 do 10 pg lipofektamínu (obrázok 4B) .

Obrázok 5: inhibícia proliferácie buniek hladkého svalstva nadmernou expresiou proteínu Gax prostredníctvom samostatného adenovírusu (I) alebo s použitím CLAAT (II).

Obrázok 6: transfekcia ex vivo adenovírusu na izolovanej artérii v kombinácii so stúpajúcimi dávkami lipofektamínu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Materiál a metódy

Ďalej v texte sú opísané rôzne metódy použité v príkladoch ukazujúcich synergiu medzi rekombinantnými adenovírusmi a katiónovými lipozómami v transdukcii buniek hladkého svalstva ciev v primárnej kultúre.

A. Primárna kultúra buniek hladkého svalstva ciev (VSMC)

VSMC sa získajú enzýmovým štiepením králičej aorty podlá upravenej metódy autorov Chamley a kol. (Celí Tissue Res. 197, 177, 503-522) a potom sa nasadia do primárnej kultúry. Králičia aorta sa na tento účel vytiahla a potom 45 minút inkubovala v prítomnosti kolagenázy (kolagenáza II, Cooper Biomedical) pri 37 °C. Druhé štiepenie v prítomnosti kolagenázy a elastázy (Biosys) sa uskutočňuje dve hodiny pri 37 °C. Tieto dve štiepenia umožňujú to, aby sa získala bunková suspenzia tvorená v podstate s VSMC. VSMC sa v kultúre udržujú v médiu DMEM (Gibco) obsahujúcom 20% fetálne teľacie sérum’. (FCS, Gibco) a pre všetky nasledujúce pokusy sa použili pred desiatou pasážou. Pri každej pasáži sa uskutočňovala fenotypizácia VSNC imunofluorescenciou s pomocou protilátok namierených proti špecifickému alfa-aktínu buniek hladkého svalstva (Sigma).

B. Rekombinantné adenovírusy (Ad)

Na rôzne príklady transdukcie VSMC sa použili odlišné rekombinantné adenovírusy. Všetky použité rekombinantné Ad sú prvej generácie a defektné v replikácii s deléciou úseku El.

Ad-Luc nesie expresnú kazetu obsahujúcu luciferázový gén pod kontrolou promótora CMV. Táto expresná kazeta pochádza z komerčného plazmidu pUT650 (Caylam Toulouse, Francúzsko) a obsahuje luciferázový gén fúzovaný s génom rezistencie zeo pod kontrolou promótora CMV. Expresná kazeta sa vložila v úseku EI adenovírusu In340 (Feldman a kol., Improved efficiency of arterial gene transfer by use of poloxaner 407 as a vehicle for adenonoviral vectors, Gene Ther., 1997. 4: 189-99; Róbert, J.J. a kol., Gene Neurochemistry, 1997, Vol. 68, pp 2152-2160; Hearing a kol. 1983, Celí 33, pp 695-703).

Ad-pGal nesie kazetu kódujúcu gén β-galaktozidázy Escherichia coli fúzovaný svojou N-terminálnou časťou k jadrovej lokalizačnej sekvencii (NLS), identickej so sekvenciou antigénu T vírusu SV40, pod kontrolou promótora . LTR-RSV (StratfordPerricaudet a kol., Widespread long-term gene transfer to mouse skeletal muscles and heart, J. Clin. Invest., 1992, 90: 626630) .

Ad-tk kóduje gén tymidínkinázy vírusu Herpes simplex pod kontrolou LTR-RSV (Maron a kol., Gene therapy of rat C6 glioma using adenovirus-mediated transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene: long-term follow up by magnetic resonance imaging. Gene Ther., 1996, 3: 315-22).

C. Transdukcia VSMC samotným rekombinantným Ad alebo v komplexe s katiónovými lipozómami

VSMC sú inokulované na 24-jamkovéj kultivačnej miske (Falcon) s hustotou 50000 buniek na jamku v 1 ml DMEM obsahujúcom 10% FCS (DMEM-FCS) . Po 20 až 24 hodinách je DMEM-FCS buniek VSMC nahradené s 300 μΐ DMEM bez séra. Bunky sa potom infikujú rekombinantnými vírusmi, samotnými alebo v komplexe s lipozómami, s multiplicitou infekcie (MOI) meniacou sa podlá pokusov. Tento adenovírusový preparát sa pridal po inkubácii 30 minút pri teplote okolia k suspenzii 100 μΐ vody alebo fosfátového pufru (PBS), ktoré obsahovali buď samotný Ad s požadovanou MOI alebo Ad s rôznym množstvom katiónových lipozómov (Lipofectamine, Gibco) . 100 μΐ Ad alebo komplexu Ad-lipofektamín sa pridalo priamo k VSMC v 300 μΐ DMEM. Na pokusy určené na štúdium účinku neutralizačného ľudského séra (AHS) v porovnaní s FCS na účinnosť transdukcie sa po 1 hodine pri 37 °C transdukčná zmes nahradí s DMEM 0,5% FCS. 24 hodín po infekcii sa indukuje bunková proliferácia pridaním média bohatého na sérum (DMEM 10% FCS). Bunková viabilita (životaschopnosť) sa určuje 72 hodín po infekcii pomocou testov s Alamarovou modrou (Biosource).

V prípade VSMC transdukovaných s Ad-tk sa bunky skontaktujú s 25 μΜ ganciklovirusom (GCV) po 48 hodinách kultivácie. Tie isté bunky neinfikované alebo bunky transdukované s Ad-pGal slúžia ako kontroly neopracované alebo opracované s GCV.

D. Prenos adenovírusu kódujúceho luciferázový gén v izolovaných artériách

Abdominálne artérie králikov druhu New Zealand White sa odoberú po eutanázii predávkovaním pentobarbitalom sodným. Abrázia artérií sa uskutočňuje pomocou Fogartyovho katétra 3F nafúknutého s 0,15 ml vzduchu. Artérie sú narezané na fragmenty dlhé 5 mm, ktoré sú potom pozdĺžne otvorené. Každý fragment je umiestnený v jamke 12-jamkové j doštičky v 1 ml média bez séra.

Infekcia prebieha ten istý deň ako odber. Objem zmesi adenovírusov (AVi.oCMVLuc alebo AVi.oCMVPGal, 10⁸ pfu) a lipofektamínu sa upravia na 80 μΐ na jamku s PBS. Roztok sa potom inkubuje 30 minút pri teplote okolia a potom sa umiestni na fragmenty artérie nachádzajúcej sa v 1 ml média bez séra v jednej jamke 12-jamkovéj doštičky. Fragmenty sa potom inkubujú 1 hodinu pri 37 °C a potom sa prenesú na novú 12-jamkovú doštičku a inkubujú v 2 ml média DMEM 20% FCS. Vyhodnotenie prenosu sa robí meraním luciferázovej aktivity (AVi.oCMVLuc) alebo histochemickým vyšetrením (AVi.₀CMV3Gal) 3 dni po infekcii.

Testovalo sa niekoľko dávok lipofektamínu pre konštantné MOI

AVi.oCMVLuc.

E. Analýza účinnosti transdukcie VSMC rekombinantným Ad asociovaným alebo neasociovaným s lipozómami.

Stanovenie luciferázovej aktivity

VSMC transdukované s Ad-Luc sa zozbierali do 200 μΐ lytického pufru pre luciferázový test (Prom'ega) . Po 15 minútovej lýze sa použilo 10 μΐ z každej vzorky na určenie luciferázovej aktivity pomocou súpravy Luciferase assay kit (Promega) a luminometra (Berthold). Luciferázová aktivita je vyjadrená v RLU (Relative Light Units - relatívne svetelné jednotky).

Meranie luciferázovej aktivity na izolovaných artériách vyžaduje, aby sa fragmenty artérie rozdrvili v 500 μΐ lytického pufra obsahujúceho anti-proteázy a potom 20 minút inkubovali za miešania pri teplote okolia. Odrátanie sa uskutočňuje na 10 μΐ extraktu za prítomnosti 50 μΐ substrátu po 10 s.

Stanovenie β-galaktozidázovej aktivity v bunkách β-galaktozidázová aktivity v VSMC transdukovaných Αϋ-βΘβΙ sa určuje chemiluminiscenciou pomocou súpravy Galacto-Light plus kit (od firmy Tropix, Inc.). Bunky sa premyjú v PBS a potom sa prenesú do 250 μΐ lytického roztoku obsahujúceho 100 μΜ fosforečnan draselný pH 7,8 a 0,2 % Triton X-100. Lyzáty sa centrifugujú 2 minúty v 10 000 g a potom sa 5 μΐ každej vzorky zmieša s 50 μΐ reakčného pufru Galactom-Plus™ a inkubuje sa 1 hodinu pri teplote okolia. Na meranie luminiscencie sa zmesi umiestnia do luminometra (akcelerátor emisie svetla) a meria sa luminiscencia, ktorá sa vyjadri v RLU.

Histochemická detekcia β-galaktozidázovej aktivity v bunkách

VSMC, na kultivačnom podklade alebo oddelené opracovaním s trypsínom, sa premyjú s PBS a fixujú v PBS obsahujúcom 4% formaldehyd. Fixačný roztok sa odstráni na konci 10 minút a potom sa bunky zafarbia 1 až 4 hodiny pri 37 °C v PBS obsahujúcom 4 mM ferrikyanid draselný, 4 mM ferrokyanid draselný, 200 mM chlorid horečnatý a 0,4 mg/ml substrátu X-Gal. Percento modrých buniek sa ráta z preparátu VSMC v suspenzii, zatiaľ čo VSMC na kultivačnom podklade sa fotografujú.

Histochemická detekcia β-galaktozidázovej aktivity v tkanivových rezoch

3 dni po infekcii sa fragmenty	tkaniva (artérie)	fixovali 3
hodiny v 4% PBS-formole. Potom	sa opláchli a	opracovali
nasledovným spôsobom:
PBS	3 x 20 minút
PBS-MgCl2	30 minút
PBS-MgCl2	30 minút pri 4	°C
Permeabilizačný roztok	30 minút pri 4	°C

(2 mM PBS-MgCl₂, 0,01% deoxycholát sodný a 0,02% NP40)

Farbiaci roztok 4 až 22 hodín pri 37 °C (permeabilizačný roztok plus 35 mM K₄Fe (CN) 6· 3H₂0 a 35 mM K₃Fe(CN)₆

Potom sa opláchli v PBS a umiestnili do kyviet a dehydratovali nasledovným spôsobom:

60% etanol hodina

80% etanol	1 hodina
100% etanol	1 hodina
100% etanol	1 hodina
100% etanol	1 hodina
xylén	1 hodina
xylén	1 hodina
xylén	1 hodina
xylén	2 hodiny
parafín	2 hodiny
parafín	3 hodiny

Potom sa zaliali do parafínu a narezali na mikrotome.

Hodnotenie viability buniek podlá zafarbenia kryštálovou fialovou

Na hodnotenie účinnosti transdukcie Ad-tk boli VSMC opracované s GCV ako je už opísané. Živé bunky, vybraté po tomto opracovaní, sa opláchli s PBS a potom sa fixovali v PBS obsahujúcom 4% formaldehyd. Na konci 15. minúty sa fixačný roztok odstránil a bunky sa farbili 20 minút v 0,1% roztoku kryštálovej fialovej vo vode. Po zafarbení sa bunky trikrát opláchli vodou a potom fotografovali.

Príklad 1

Tento príklad ukazuje transdukcie VSMC, keď je Ad-PGal asociovaný s katiónovým lipozómom ako je lipofektamín.

VSMC sú transdukované podlá protokolu opísaného v časti Materiál a metódy, pričom sa použil Ad-pGal v množstve zodpovedajúcom MOI 10 v prítomnosti rastúcich dávok lipofektaminu v rozsahu od 0 po 0,5 pg. Histochemická detekcia β-galaktozidázovej aktivity jasne ukázala, že od dávky 0,125 gg lipofektaminu zvyšuje veľmi výrazne účinnosť transdukcie VSMC s vektorom Ad-PGal.

Aby sa kvantifikovala účinnosť transdukcie, stanovilo sa percento buniek pozitívnych na β-galaktozidázovú aktivitu po histochemickom farbení buniek v suspenzii podľa protokolu uvedeného v časti Materiál a metódy. Výsledky sú uvedené na obr.

1.

Pokiaľ sa použije samotný Ad^Gal s MOI 10, je pozitívna iba 1 až 2% VSMC, ale hneď po pridaní lipofektaminu od dávky 0,125 gg počet pozitívnych presahuje 40%. Táto účinnosť transdukcie je v perfektnej korelácii s β-galaktozidázovou aktivitou meranou chemiluminiscenčnou metódou (obrázok 1) . Pozorovalo sa slabé zníženie tejto aktivity, keď sa zvýšila koncentrácia lipofektaminu. Toto zníženie je pravdepodobne spôsobené slabou toxicitou, ako ukazuje rátanie buniek (bodkovaná čiara na obrázku 1). Táto toxicita, prejavujúca sa iba pri najvyššej dávke lipofektaminu 0,5 μς však neovplyvňuje viac ako 25% buniek.

Uvedené výsledky jasne ukazujú zlepšenie transdukcie vďaka tomu, že Ad-^Gal sa kombinoval s katiónovým lipofektantom.

Príklad 2

V tomto príklade sa stanovila dávka lipofektaminu tak, že sa transdukovali VSMC vektorom Ad-^Gal s MOI rastúcou až na hodnotu 10. Na transdukciu VSMC sa použil Ad-Luc s rôznymi hodnotami MOI a luciferázová aktivita sa stanovila spôsobom opísaným v časti Materiál a metódy. Luciferázová aktivita rástla takmer lineárne ako funkcia MOI Ad-Luc použitého na transdukciu VSMC (obrázok 2, prázdne krúžky) . Je zaujímavé, že pri ktorejkoľvek z použitých MOI, prídavok 0,125 gg lipofektamínu k Ad-Luc (obrázok 2, plné kosoštvorce) spôsobuje 100-násobné zvýšenie zaznamenávanej luciferázovej aktivity. To ukazuje, že až do hodnoty MOI 100 Ad-Luc, malé množstvo lipofektamínu, t.j. 0,125 gg je postačujúci na to, aby sa významne zlepšila transdukcia VSMC.

Príklad 3

Adenovirus použitý v tomto príklade je adenovírus Ad-tk tu použitý na cytotoxické vlastnosti génu týmidínkinázy z vírusu herpes simplex v prítomnosti ganciklovírusu (GCV). VSMC sa transdukovali Ad-TK s MOI 1, 10 a 1000 a potom opracovali s GCV ako sa opísalo v časti Materiál a metódy. Ako kontrola sa použil Ad-pGal s MOI 100.

Ad-TK a Ad-pGal sa použili jednak samotné alebo v komplexe s 0,125 gg lipofektamínu. Obrázok 3 ukazuje farbenie VSMC s kryštálovou fialovou po transdukcii a opracovaní s GCV.

GCV podľa očakávania nejavil žiadnu toxicitu vzhľadom na bunky transdukované s Ad-QGal buď v prítomnosti lipofektamínu alebo bez neho. Transdukcia VSMC Ad-TK nasledovaná opracovaním s GCV vykazovala toxicitu (viabilita 30 až 50%) iba pri najvyššom MOI, t. j. MOI 100. Je zaujímavé, že ak bol Ad-TK v komplexe s 0,125 gg lipofektamínu, účinnosť po opracovaní s GCV pri MOI 1 bola porovnateľná s účinnosťou pri použití samotného Ad-TK s MOI 100. Pri hodnotách MOI 10 alebo 100 je Ad-TK asociovaný s lipofektamínom silno toxický v prítomnosti GCV. Tento príklad prináša dôkaz o význame a prípravku podľa vynálezu. Ukazuje súčasne, že je možné významne znížiť množstvo podávaného rekombinantného vírusu Ad-TK, a pritom dosiahnuť rovnaké alebo vyššie terapeutické účinnosti v porovnaní s účinnosťou, ktorá sa dosiahne s použitím samotného Ad-TK.

Príklad 4

Okrem účinnosti transdukcie, ktorá sa však môže zlepšiť, ako ukázal predchádzajúci príklad, ďalšia hlavná prekážka optimálnej účinnosti rekombinantného adenovírusu je jeho neutralizácia imunitným systémom. Skutočne po bunkovej lýze po prvom prenose do zvieraťa alebo po prvom kontakte človeka s adenovírusom môže imunitný systém velmi účinne vírus v krvnom obehu neutralizovať a tak znížiť možnosť opakovanej injekcie.

Tento príklad reprodukuje in vitro neutralizáciu rekombinantného adenovírusu súborom ľudských sér a výhodne ukazuje, že asociácia rekombinantného adenovírusu s lipozómami umožňuje zrušiť neutralizáciu, takže transdukcia môže byť, v závislosti na dávke lipozómu, vyššia ako sa dosiahne s použitím samotného vírusu.

Obrázky 4A a 4B ukazujú bunky VSMC transdukované s Ad-Luc pri MOI 100 v prítomnosti teľacieho fetálneho séra (FCS) alebo dospelého ľudského séra (AHS) v kultivačnom médiu DMEM.

Aj keď 10% FCS nemení výrazne účinnosť transdukcie Ad-Luc vzhladom na samotný Ad-Luc v DMEM, luciferázová aktivita je' výrazne znížená v prítomnosti 10% AHS. Zvýšené dávky lipofektamínu pridávané k Ad-Luc ovplyvňujú luciferázovú aktivitu, takže je zhodná alebo dokonca pri najvyšších dávkach lipofektamínu významne vyššia ako v prípade použitia samotného vírusu (obrázok 4B).

Tento príklad teda ukázal, že prípravok podľa vynálezu na jednej strane umožňuje úplne potlačiť neutralizáciu rekombinantného adenovírusu protilátkami a na druhej strane umožňuje zvýšiť účinnosť transdukcie v prítomnosti neutralizačného séra.

Príklad 5

Tento príklad ukazuje zvýšenie transdukcie terapeutického génu (gax) do buniek hladkého svalstva králika na príklade adenovírusu AVi,oCMVrGAX a kat iónového lipidu ako je lipofektamin (CLAAT).

Bunky hladkého svalstva králika v DMEM s 10% FCS sa nasadili na mikrodoštičku MW48 v množstve zodpovedajúcom 5 xlO⁴ buniek na jamku. Infekcia sa uskutočnila o 24 hodín neskoršie v médiu DMEM bez séra. Rôzne riedenia adenovírusu sa zmiešali s 60 ng lipofektamínu a doplnili s PBS do celkového objemu 25 μΐ. Tento roztok sa inkuboval pri teplote miestnosti 30 minút. Kultivačné médium sa potom v každej jamke nahradilo so 175 μΐ média bez séra a k bunkám sa pridala zmes adenovírusu a lipofektamínu. Vlastná infekcia prebiehala 1 hodinu pri 37 “C. Médium obsahujúce vírus sa potom nahradilo s DMEM s 0,5% FCS. 24 hodín po infekcii sa indukovala bunková proliferácia pridaním média bohatého na sérum (DMEM s 10% FCS). Viabilita buniek sa vyhodnocovala pomocou testu s Alamarovou modrou (Biosource).

Tento príklad ukázal, že lipofektamin sám o sebe a dávka nevyhnutná pre CLAAT nemajú žiadny vplyv na viabilitu buniek. Avšak hodnota MOI nevyhnutná na získanie 50% inhibície rastu SMC je lOx menšia ak sa použije zmes AVi₍oCMVrGAX a lipofektamínu v porovnaní so samotným AVi,oCMVrGAX. Obrázok 5 ukazuje porovnanie inhibície proliferácie buniek hladkého svalstva nadmernou expresiou proteinu GAX prostredníctvom samotného adenovírusu (I) alebo s použitím CLAAT (II) . Bunky sa infikovali s MOI od 0 do 10⁵ PV/bunku, buď s AVi₍₀CMV (a) alebo samotný, AV_lr0CMVrGAX (b) . S použitím CLAAT bola hodnota MOI od 0 do 3x 10⁴ PV/bunku tých istých vírusov (Il-a, Il-b). Po infekcii sa bunky inkubovali 24 hodín v DMEM s 0,5% FCS. Médium sa potom vymenilo za médium bohaté na sérum. Viabilita buniek sa hodnotila 72 hodín po infekcii.

Tento príklad ukázal zvýšenie transdukcie terapeutického génu do buniek hladkého svalstva králika na príklade kombinácie adenovírusu AVi,₀CMVrGAX a lipofektamínu. Príklad dokázal, že je možné použiť nižšiu dávku vírusu v prípade kombinácie katiónového lipidu a adenovírusu.

Príklad 6

Tento príklad ukazuje prenos génov do izolovaných fragmentov artérie pomocou kombinácie adenovírusu kódujúceho luciferázu alebo β-galaktozidázu a lipofektamínu (CLAAT).

Fragmenty artérie sa získali a infikovali spôsobom, ktorý sa opísal v časti Materiál a metódy (D).

Na prípravu bunkových extraktov a meranie luciferázovej aktivity sa fragmenty artérie rozdrvili v 500 μΐ lytického pufra obsahujúceho antiproteázy a potom sa inkubovali 20 minút za miešania pri teplote miestnosti. Potom sa usadili 5 minút pri 10000 rpm. Vyhodnocovanie prebiehalo s 10 μΐ extraktu v prítomnosti 50 μΐ substrátu 10 sekúnd pomocou súpravy Luciferase assay kit (Promega) a luminometra (Berthold).

Na základe výsledkov uvedených na obrázku 6 je možné uzavrieť, že na jednej strane luciferázová aktivita je jasne zvýšená, a na druhej strane, že je závislá na použitej dávke lipofektamínu, pokiaľ sa prenos adenovírusu do izolovaných artérií uskutočňuje pomocou CLAAT.

Detekcia β-galaktozidázovej aktivity sa uskutočňovala spôsobom opísaným v časti Materiál a metódy (E) . Získané histochemické výsledky ukazujú, že bunky, ktoré exprimujú β-galaktozidázu po prenose pomocou CLAAT, sú umiestnené v adventicii (vonkajšom obale steny) a sú to bunky typu fibroblastov. Okrem toho sa počet transdukovaných buniek zdá vyšší ako v prípade, keď sa prenáša samotný adenovírus s rovnakou MOI.

Tento príklad ukazuje, že je možný prenos génu do izolovanej artérie pomocou CLAAT. Okrem toho tento spôsob ex vivo umožňuje na jednej strane zlepšiť prenos génov, a na druhej strane získať bunky z adventícia. Dá sa teda predpokladať využitie tohto spôsobu na opracovanie cievnych štepov požadovanými génmi, ako je napr. faktor FGF, nesenými adenovírusovými vektormi.

Claims (31)

1. Prípravok na transfekciu vhodný na génovú terapiu vyznačujúci sa tým, že spája jeden alebo niekoľko bezobalových rekombinantných vírusov, ktoré obsahujú v svojom genóme aspoň jednu exogénnu nukleovú kyselinu s aspoň jedným transfekčným činidlom iným ako vírus alebo plazmid.

2.

Prípravok podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že nevírusové transfekčné činidlo je vybraté z katiónových polymérov alebo lipofektantov.

3. Prípravok podľa nároku 1 alebo 2vyznačujúci sa tým, že nevírusové transfekčné činidlo je lipofektant.

4. Prípravok podľa nároku 3 vyznačujúci sa tým, že ide o lipid schopný tvoriť lipozómy, falošné lipozómy, imunolipozómy alebo cielené lipozómy.

5. Prípravok podľa nároku 3 vyznačujúci sa tým, že lipofektant obsahuje aspoň jeden polyamínový úsek podľa všeobecného vzorca:

H₂N-(-(CH)_m-NH-)_n-H

I kde m je celé číslo rovné alebo väčšie 2 a n je celé číslo rovné alebo väčšie ako 1, pričom m sa môže meniť pre rôzne uhlíkové skupiny, medzi dvoma amínmi kovalentne spojený s lipofilným úsekom uhľovodíkového reťazca, ktorý je saturovaný alebo nesaturovaný, cholesterolu, alebo prírodného či syntetického lipidu schopného tvoriť lamelárne alebo hexagonálne fázy.

6. Prípravok podlá nároku 5 vyznačujúci sa tým, že polyamínový úsek predstavuje spermín, thermín alebo niektorý z ich analógov, ktoré majú zachované väzbové vlastnosti k nukleovej kyseline.

7. Prípravok podlá nároku ’3 vyznačujúci sa tým, že lipofektant má všeobecný vzorec

H₂N-(-(CH)_m-NH-)_n-H I R v ktorom R predstavuje lipofilný úsek so všeobecným vzorcom

Y-----R⁶ kde X a X' predstavujú, nezávisle jeden na druhom, atóm kyslíka, metylénovú skupinu -(CH₂)_q- s q rovným 0, 1, 2 alebo 3, alebo aminoskupinu, -NH- alebo -NR'-, kde R' predstavuje alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 atómy uhlíka.

Y a Y' nezávisle jeden na druhom predstavujú metylénovú skupinu, karbonylovú skupinu alebo skupinu C=S,

R³, R⁴ a R⁵ nezávisle jeden na druhom predstavujú atóm vodíka alebo substituovanú alebo nesubstituovanú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 atómy uhlíka, pričom p sa môže pohybovať od 0 po 5,

R⁶ predstavuje derivát cholesterolu alebo alkylaminovú skupinu -NR¹R², kde R¹ a R², nezávisle jedna na druhej, predstavujú saturovanú alebo nesaturovanú, lineárnu alebo nelineárnu alebo rozvetvenú alifatickú skupinu obsahujúcu 12 až

22 atómov uhlíka.

8. Prípravok podľa nároku 3 vyznačujúci sa tým, že lipofektant má všeobecný vzorec mať hodnoty kde R¹, R² a R³ predstavujú, nezávisle jeden na druhom, atóm vodíka alebo skupinu - (CH2) _q-NRR', s tým, že q môže 1, 2, 3, 4, 5 a 6, nezávisle pre rôzne R¹, R² a R³,

R a R' nezávisle jeden na druhom predstavujú alebo skupinu -(CH2)_q-NH_2/ pričom q môže mať hodnoty 5 a 6, nezávisle pre rôzne skupiny R a R' .

atóm vodíka

1, 2, 3, 4, m, n a p predstavujú, nezávisle jeden na číslo, ktoré sa môže pohybovať medzi 0 až 6, ak n 1, m môže mať odlišné hodnoty a R³ odlišné významy vzorci, a druhom, celé t

je väčšie ako vo všeobecnom

R⁴ predstavuje skupinu so všeobecným vzorcom to

X kde R6 a R7 nezávisle jeden na druhom predstavujú atóm vodíka alebo saturovanú či nesaturovanú alifatickú skupinu obsahujúcu 10 až 22 atómov uhlíka, pričom aspoň jedna z dvoch skupín nie je vodík,

X predstavuje atóm kyslíka alebo síry alebo voliteľne monoalkylovú aminoskupinu,

Y predstavuje karbonylovú skupinu alebo metylénovú skupinu,

R⁵ predstavuje atóm vodíka alebo bočný reťazec prirodzenej aminokyseliny, ak je to nutné tak substituovaný, a r je celé číslo pohybujúce sa medzi 1 až 10, a ak je r rovné 1, R⁵ predstavuje substituovaný alebo nesubstituovaný bočný reťazec prirodzenej aminokyseliny, a ak je r väčšie ako 1, R⁵ predstavuje atóm vodíka.

9. Prípravok podľa nároku 1 alebo 2 v y tým, že nevírusové transfekčné činidlo vybratý z polyalkylénimínov.

je ačujúci sa katiónový polymér

10. Prípravok podľa nároku 9 že ide o polyetylénimin (PEI) vyznač alebo polypropylénimín

11. Prípravok podľa nároku 1 tým, že i obsahujúcej molekulovou ú c i sa alebo 2 vyznaču nevírusové transfekčné činidlo je vybraté lipofektamín, polyetylénimin hmotnosťou 50 000 (PEI50K),

800 palmitoyl-fosfatidyl2-5-bis(3-aminopropyl2-l,3-bis(3acetát, molekulovou hmotnosťou zo skupiny priemernou s s

polyetylénimin 000 (PEI800K), priemernou dioktadecylamidoglycylspermín (DOGS), etanolamin-5-karboxyspermylamid (DPPES), amino) pentyl (dioktadecylkarbamoyl-metoxy) acetát, -aminopropyloamino) Jpropyl (dioktadecylkarbamoyl-metoxy) {H₂N (CH₂) 312N (CH₂) ₄N {CH₂) ₃NH₂} (CH₂) ₃NHCH₂COGlyN [ (CH₂) ₁₇-CH₃ ] ₂, H₂N (CH₂) ₃NH (CH₂) ₄NH (CH₂) ₃NHCH₂COGlyN [ (CH₂) i₈] 2, H₂N (CH₂) ₃NH (CH₂) ₄NH (CH₂) ₃NHCH₂COArgN [ (CH₂) i₈] 2 a H₂N (CH₂) ₃NH (CH₂) ₄NH (CH₂) ₃NHCH₂COGlyN [ (CH₂) i₇CH₃] ₂

12. Prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich vyznačujúci sa tým, že nukleová nárokov kyselina nachádzajúca sa v rekombinantnom víruse je deoxyribonukleová kyselina.

13. Prípravok podlá ktoréhokolvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 11 vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina nachádzajúca sa v rekombinantnom víruse je ribonukleová kyselina.

14. Prípravok podľa nároku 12 alebo 13 vyznačujúci sa t ý m, že nukleová kyselina je chemicky modifikovaná.

15. Prípravok podľa nároku 12, 13 alebo 14 vyznačujú- ci sa tým, že nukleová kyselina je antisense nukleová kyselina.

16. Prípravok podľa ktoréhokolvek z predchádzajúcich nárokov vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina obsahuje terapeutický gén.

17. Prípravok podľa nároku 16 vyznač že terapeutický gén kóduje produkt deriváty, TNF, prekurzory NGF, IGF, , dystrofín gén kóduje obsahujúcej enzýmy, krvné interleukíny, interferóny, neurotransmitery alebo trofické faktory: BDNF, NT5, HARP/pleiotrofín a proteín CFTR.

ich

CNTF, ďalšie, sa tým, zo skupiny lymfokíny: faktory, syntézy, GMF, aFGF, bFGF, NT3, alebo minidystrofín a u j ú c i vybratý hormóny, rastové či enzýmy aFGF, :

18. Prípravok podľa nároku 16 vyznačujúci sa tým, že terapeutický gén je vybratý z génov spojených so zastavením bunkového delenia, konkrétne zo skupiny obsahujúcej gén gax, nádorové supresorové gény: p53,

Rb, Rapla, DCC, k-rev, gény kódujúce faktory zúčastňujúce sa koagulácie: faktory VII, VIII, IX, gény zasahujúce do opravy DNA, samovražedné gény (tymidínkináza, cytozíndeamináza), hemoglobín alebo ďalšie gény proteínových prenášačov, gény odpovedajúce na proteíny zapojené do metabolizmu lipidov apolipoproteínového typu vybraté z apolipoproteínov A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J a apo(a), metabolické enzýmy, ako je napríklad lipoproteínová lipáza, pečeňová lipáza, lecitíncholesterolacyltransferáza, 7-alfa-cholesterolhydroxyláza, fosfatidová kyslá fosfatáza alebo alternatívne proteíny prenášajúce lipidy, ako je proteín prenášajúci estery cholesterolu a proteín prenášajúci fosfolipidy, proteín viažuci HDL alebo alternatívne receptor vybratý napríklad z receptorov LDL, receptorov zvyškov chylomikrónov, alebo scavenger receptorov.

19. Prípravok podlá ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov vyznačujúci sa tým, že bezobalový rekombinantný vírus neobsahuje minimálne také úseky svojho genómu, ktoré sú nevyhnutné na jeho replikáciu v infikovanej bunke.

20. Prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov vyznačujúci sa tým, že bezobalový rekombinantný vírus je odvodený z adenovírusu alebo AAV.

21. Prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov vyznačujúci sa tým, že bezobalový rekombinantný vírus je odvodený prednostne z adenovírusu zvieracieho alebo ľudského pôvodu.

22. Prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov vyznačujúci sa tým, že bezobalový rekombinantný vírus je odvodený z adenovírusu typ Ad5 alebo Ad2.

23. Prípravok podía ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4 a 12 až 22 vyznačujúci sa tým, že spája rekombinantný adenovírus, ktorý obsahuje v svojom genóme jednu exogénnu nukleovú kyselinu a lipofektamín v množstve dostatočnom na zlepšenie bunkovej transdukcie.

24. Prípravok podľa ktoréhokoľvek vyznačujúci sa ’t dioleoylfosfatidyletanolamín fosfatidyletanolamín (POPE), alebo že ý m, (DOPE) adjuvans myristoylfosfatidyletanolamínového

3 krát N-metylované; glykozyldiacylglyceroly, (najmä deriváty 1 až diacylglyceroly, galaktocerebrozidy), sfingolipidy alternatívne asialogangliozidy.

predchádzajúcich nárokov navyše obsahuje adjuvans alebo oleylpalmitoyldi-stearoyl, -palmitoyl typu, ako aj ich fosfatidylglyceroly, cerebrozidy (najmä sfingomyelíny) alebo

25. Prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov vyznačujúci sa tým, že navyše obsahuje zlúčeninu ovplyvňujúcu, priamo alebo nepriamo, úroveň kondenzácie nukleových kyselín.

26. Prípravok podľa nároku 25 vyznačujúci sa tým, že zlúčenina je tvorená, úplne alebo čiastočne, peptidovými motívmi (KTPKKAKKP) a/alebo (ATPAKKAA), pričom počet týchto motívov sa môže pohybovať od 2 do 10.

27. Prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov vyznačujúci sa tým, že je okrem už uvedených vektorov, navyše spojený so zacieľovacím prvkom.

28. Prípravok podľa nároku 27 vyznačujúci sa tým, že zacieľovací prvok je vybratý zo skupiny obsahujúcej protilátky namierené proti molekulám bunkového povrchu, ligandy alebo membránové receptory ako je inzulín, transferin, kyselina listová alebo iný rastový faktor, cytokíny alebo vitamíny, modifikované alebo nemodifikované lektíny, proteín s motívom RGD, cyklické alebo acyklické peptidy obsahujúce pár motívov RGD, a tiež polylyzínové peptidy.

29. Použitie prípravku podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 28 na prenos nukleových kyselín do buniek.

30. Rekombinantná bunka, ktorá sa získa tým, že sa skontaktovala s prípravkom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 28.

31. Spôsob prenosu nukleových kyselín do vnútra bunky vyznačujúci sa tým, bunka sa skontaktuje s prípravkom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 28.

RLU/jamka