EP1100946A1 - Vecteurs derives de baculorivus et utilisation pour le transfert d'acides nucleiques dans les cellules nerveuses des vertebres - Google Patents

Vecteurs derives de baculorivus et utilisation pour le transfert d'acides nucleiques dans les cellules nerveuses des vertebres

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EP1100946A1
EP1100946A1 EP99932958A EP99932958A EP1100946A1 EP 1100946 A1 EP1100946 A1 EP 1100946A1 EP 99932958 A EP99932958 A EP 99932958A EP 99932958 A EP99932958 A EP 99932958A EP 1100946 A1 EP1100946 A1 EP 1100946A1
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EP
European Patent Office
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cells
baculovims
recombinant
nucleic acid
product
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99932958A
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German (de)
English (en)
Inventor
Chamsy Sarkis
Jacques Mallet
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Aventis Pharma SA
Original Assignee
Aventis Pharma SA
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Filing date
Publication date
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Application filed by Aventis Pharma SA filed Critical Aventis Pharma SA
Publication of EP1100946A1 publication Critical patent/EP1100946A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the invention relates to new recombinant viruses and their use for the transfer of genes into cells of the nervous system of vertebrates. It also relates to pharmaceutical compositions comprising said recombinant viruses. More particularly the present invention relates to new vectors derived from baculoviruses and their use for the treatment of diseases of the nervous system of vertebrates.
  • Baculoviruses are enveloped viruses with circular double-stranded DNA specific to invertebrates. Their prototype, AcNPY (autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus), has a genome of 133 kb. This vector is very widely used as a vector for the expression of eukaryotic genes in insect cells, from two strong promoters [polyhedrin (Ph) and P10], (King and Possee, The baculovirus expression system. London: Chapman & Hall, 1992 .).
  • Baculovirus stocks can be prepared by infection of insect cells (Sf9 or Sf21) with the recombinant baculovirus. Protein is produced by infection of insect cells with baculovirus: the cell medium is harvested and the protein synthesized in vitro in insect cells is extracted.
  • Recombinant baculoviruses are obtained by homologous recombination in insect cells (generally Sf9 or Sf21) between the shuttle plasmid containing the transgene under the control of an active promoter in vertebrate cells and the baculovirus genome linearized at the site of recombination, or by other techniques well known to those skilled in the art (transposons, yeast recombination, etc.).
  • Baculoviruses are episomal viruses (in the insect), and can integrate up to 100 kb of recombinant DNA.
  • the Applicant has now shown that it is possible to construct recombinant baculoviruses comprising a heterologous nucleic acid sequence preferentially coding for a product of therapeutic interest for the treatment of diseases of the nervous system, to administer these recombinant baculoviruses in vivo, and that this administration allows stable and localized expression of the transgene in vivo, and in particular in the nervous system.
  • the results presented in the examples demonstrate that the baculoviruses of the invention can infect and direct the expression of transgene in the cells of the nervous system of vertebrates and preferably of humans.
  • the Examples of the present application surprisingly relate the expression of a transgene of interest in at least 60% of cells of a differentiated primary human telencephalon culture and / or an expression in at least 30% of telencephalic progenitor cells. as well as 30% of astrocytes from a primary culture of an adult human cortex.
  • the present invention thus provides viral vectors usable directly in gene therapy, particularly suitable and effective for directing the expression of transgenes of therapeutic interest in vivo in the nervous system or for an ex vivo application for the transfer of genes in cultures of cells of the nervous system or other (Sertoli cells, muscle cells ...) intended to be grafted.
  • the present invention thus offers a new approach which is particularly advantageous for the treatment and / or prevention of neurodegenerative diseases or the treatment of metabolic diseases requiring specific treatment of the nervous system due to the poor accessibility of therapeutic agents which do not cross the blood-brain barrier. -encephalic.
  • a first subject of the invention resides in recombinant baculoviruses comprising a heterologous nucleic acid sequence coding for a product of therapeutic interest for the treatment of diseases of the nervous system.
  • heterologous nucleic acid sequence may include one or more therapeutic genes.
  • the therapeutic genes which can thus be transferred are any gene whose transcription and possibly translation into the target cell generate products having a therapeutic effect.
  • the protein product thus coded can be a protein or a peptide.
  • This protein product can be homologous with respect to the target cell (that is to say a product which is normally expressed in the target cell when the latter presents no pathology).
  • the expression of a protein makes it possible, for example, to compensate for an insufficient expression in the cell or the expression of an inactive or weakly active protein due to a modification, or else to overexpress. said protein.
  • the therapeutic gene can also code for a mutant of a cellular protein, having increased stability, modified activity, etc.
  • the protein product can also be heterologous towards the target cell.
  • an expressed protein can for example supplement or provide a deficient activity in the cell allowing it to fight against a pathology, or else inhibit the expression of a protein in cells, by the use of negative mutants for example .
  • lymphokines interleukins, interferons, TNF, etc.
  • growth factors include growth factors, neurotransmitter synthesis enzymes, trophic factors, in particular neurptrophic for the treatment of neurodegenerative diseases, traumas having damaged the nervous system, or retinal degenerations.
  • members of the neurotrophin family such as NGF, BDNF, NT3, NT4 / 5, NT6 and their derivatives
  • members of the CNTF family such as CNTF, axokine, LIF and their derivatives, l 'IL6, cardiotrophin, GDNF and its derivatives
  • members of the IGF family such as IGF-1, IFGF-2
  • members of the FGF family such as FGF 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 their derivatives, and TGF- ⁇ .
  • tumor suppressor genes p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc. (FR 93 04745), suicide genes: thymidine kinase, cytosine deaminase, etc.,
  • nucleic acid sequences coding for products of therapeutic interest within the meaning of the present invention also cover the genes coding for the proteins involved in the metabolism of amino acids, lipids and other constituents of the cell.
  • carbohydrates such as, for example, fructose-1-phosphate aldolase, fructose-1,6-diphosphata
  • genes associated with diseases of the amino acid metabolism such as, for example, phenylalanine hydroxylase, dihydrobiopterin synthetase, tyrosine aminotransferase, tyrosinase, histidinase, fumarylacetoacetase, glutathione synthetase, ⁇ -glutamylcysteine synthetase, ornithinosphate synthetase, ornithinosphate ⁇ omithine carbamoyltransferase, argininosuccinate synthetase, argininosuccinate lyase, arginase, L-lysine dehydrogenase, L-lysine ketoglutarate reductase, valine transaminase, leucine isoleucine transaminase, 2- chain ketoacidase decarboxylase, hydrogen ester, isovalase acylase, hydrogen
  • lysosomal deficiencies such as for example ⁇ - lysosomal l-iduronidase, lysosomal iduronate sulfatase, heparan lysosomal N-sulfatase, N-acetayl- ⁇ -D-lysosomal glucosaminidase, acetyl-CoA: ⁇ -glucosamine N-acetyl lysosomal, N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine 6-lysosomal sulfatase, galactosamine 6-lysosomal sulfatase, lysosomal ⁇ -galactosidase, lysosomal arylsulfatase B, lysosomal ⁇ -glucuronidase, N-acetylglucosaminylphosphotransferase, lysosomal ⁇ -
  • Mention may also be made, without limitation, of the genes associated with diseases of the steroid and lipid metabolism, the genes associated with diseases of the metabolism of purines and pyrimidines, as well as the genes associated with diseases of the metabolism of the porphyrin and Theme.
  • the heterologous nucleic acid sequence may be an antisense gene or sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs.
  • Such sequences can for example be transcribed, in the target cell, into RNA complementary to cellular mRNA and thus block their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140 308, into autocatalytic RNA such as ribozymes as well as in RNA modifying the splicing in trans.
  • the heterologous nucleic acid sequence also includes a promoter region for functional transcription in the infected cell. It may be a promoter region naturally responsible for the expression of the gene considered when it is capable of functioning in the infected cell. They can also be regions of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic). In particular, they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes. For example, they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect.
  • it is an active promoter in cells or nervous tissues, in particular a eukaryotic promoter. In this regard, it may for example be a ubiquitous promoter, that is to say functional in the majority of cell types.
  • the promoter can be autologous, that is to say coming from the same species as the cell in which the expression is sought or xenogenic (coming from another species).
  • eukaryotic ubiquitous promoters may be cited as strong promoters such as the promoter of the phosphoglycerate kinase 1 (PGK) gene or of other promoters directing the expression of genes of compulsory cell metabolism (these genes are said to be "domestic” or “household” and specify proteins necessary for functions common to all cells). They are, for example, genes involved in the Krebs cycle, in cellular respiration or in replication or transcription or ' translation (EFl- ⁇ ).
  • PGK phosphoglycerate kinase 1
  • EFl- ⁇ genes involved in the Krebs cycle, in cellular respiration or in replication or transcription or ' translation
  • this type of promoter mention may be made of the promoter of the ⁇ l-antitrypsin, ⁇ -actin, vimentin, aldolase A or Efl ⁇ (elong
  • the promoter used in the context of the invention may also be a eukaryotic promoter specific for nerve cells.
  • a eukaryotic promoter specific for nerve cells By way of example, mention may be made of the promoter of the NSE (Neuron Specifies Enolase), NF (Neurofilament), TH (Tyrosine Hydroxylase), DAT (Dopamine Transporter), ChAT (Choline Acetyl Transferase), DBH (Dopamine ⁇ -Hydroxylase) genes.
  • TPH Teryptophan Hydroxylase
  • GAD Glutamic Acid Dehydrogenase
  • GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein
  • viral promoters such as for example CMV (Cytomegalovims), RSV (Rous Sarcoma Vi s), TK (Thymidine Kinase), SV40 (Simian Vims) and LTR (Long Terminal Repeat) promoters of RSV.
  • CMV Cytomegalovims
  • RSV Rat Sarcoma Vi s
  • TK Thymidine Kinase
  • SV40 Sonic Vims
  • LTR Long Terminal Repeat
  • chimeric promoters such as CAG (CMV enhancer and promoter of chicken ⁇ -actin), NRSE-PGK or inducible promoters such as promoters inducible by tetracycline (Tet-On and Tet- Off), ecdysone inducible promoters, or other inducible promoters (RU486, 17 ⁇ -Oestradiol ”). and in particular stress inducible promoters, such as heat stress (hsp70)
  • CAG CMV enhancer and promoter of chicken ⁇ -actin
  • NRSE-PGK or inducible promoters such as promoters inducible by tetracycline (Tet-On and Tet- Off), ecdysone inducible promoters, or other inducible promoters (RU486, 17 ⁇ -Oestradiol ”).
  • stress inducible promoters such as heat stress (hsp70)
  • promoter regions can be modified by adding activation or regulatory sequences, or allowing tissue-specific or majority expression.
  • heterologous nucleic acid sequence may also comprise a signal sequence directing the therapeutic product synthesized in the secretory pathways of the target cell or in a specific compartment of the cell.
  • This signal sequence may be the natural signal sequence of the therapeutic product, but it may also be any other functional signal sequence, or an artificial signal sequence.
  • Vims can be used both in an ex vivo or in vivo approach.
  • an ex vivo approach can be envisaged by grafting genetically modified cells with a recombinant baculovims.
  • These cells can be of various origins: nerve (human or non-human), Sertoli cells, chromaffin cells
  • the combination of certain drugs can be considered with a view in particular to improving the maintenance of the transplant or the expression of the transgene (immunosuppressants, anti-complement ). It is also possible to envisage the implantation of genetically modified cells by a recombinant baculovims after packaging in an inert system.
  • the baculovims according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art. In particular, they can be prepared by homologous recombination between a shuttle plasmid and the genome of Autographa californica in Sf9 cells and amplified in these same cells according to the method described by Gmenwald S. and Heitz J., 1993 (Baculovims expression vector System, procedure & method manual. Pharmingen Eds, San Diego, CA). Then the baculovims which have multiplied are recovered and purified according to conventional molecular biology techniques as illustrated in the examples.
  • the baculovims of the invention extend to any derivative of a baculovims as described and produced previously.
  • derivative is meant any baculovim having its genome modified either by insertion of sequences or by deletion of viral genes in said genome.
  • baculovim derivatives are obtained by deletion of all or part of one or more viral genes.
  • a particular derivative is represented by the deletion of all the viral genes of baculovims (gutless vims) allowing the insertion of a large expression cassette.
  • envelopes that is to say to express an envelope protein other than those of baculovims on the surface thereof, thus making it possible to modify the host spectrum of the vims. It is thus possible to use envelopes which make it possible to widen the host spectrum to a very wide variety of cell types or one can on the contrary consider restricting the host spectrum to a specific type of nerve cells.
  • envelope proteins which can be used, there may be mentioned in particular: the VSV glycoprotein, the amphotropic envelope protein of MLV.
  • envelope proteins which make it possible to specifically improve the entry of the vims into the neural cells (CNS and / or PNS) such as the rhabdovims glycoprotein and in particular of the rabies vims, the envelope glycoprotein. togavims (alphavims including Semliki Forest and Sindbis vims, and mbivims) and in particular mbeole (mbivims), the glycoprotein of Herpes vims (HSV), or any other neurotropic vims.
  • Preferred variants of recombinant baculovims according to the invention are baculovims pseudotyped by the rabies vims glycoprotein (Rabies Vims) or the VSV glycoprotein (Vesicular Stomatitis Vims). These recombinant vectors can be used for the transfer of nucleic acids into nervous tissue cells in vitro, ex vivo or in vivo.
  • the in vivo application can be made in particular by stereotaxic injection of the recombinant baculovims in the central nervous system (brain, marrow) and in particular in the parenchyma or else in the spaces containing the cerebrospinal fluid (intraventricular or intrathecal for example).
  • CVF complement inhibitors
  • sCRl Hetman et al., Gene therapy, 1998, vol.5, pp531-536
  • FUT175 complement inhibitors
  • baculovims in particular at the level of the muscle, in order to reach the nervous system by retrograde transport of the baculovims and / or of the therapeutic product.
  • the injection will advantageously be preceded by inhibition of the complement system in vivo.
  • the present invention also relates to any use of a baculovim as described above for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment and / or prevention of diseases of the nervous system. More particularly, it relates to any use of these baculovims for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment and / or prevention of Parkinson's disease, Alzheimer's disease, • amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Huntington's disease, epilepsy of multiple sclerosis or other diseases affecting myelinization, as well as diseases affecting metabolism such as lysosomal diseases and in particular MPS VII disease or Sly syndrome.
  • Parkinson's disease Alzheimer's disease
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • Huntington's disease epilepsy of multiple sclerosis or other diseases affecting myelinization
  • diseases affecting metabolism such as lysosomal diseases and in particular MPS VII disease or Sly syndrome.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising one or more recombinant baculovims as described above.
  • compositions of the invention can be formulated for administration by various routes and in particular by the intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, intra-cerebral, intra-ventricular, intra-medullary route, etc.
  • the pharmaceutical compositions of the invention contain a pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for a direct injection into the nervous system of the patient.
  • a pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation in particular for a direct injection into the nervous system of the patient.
  • They may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as the case may be of sterilized water or physiological semm, allow the constitution of injectable solutes.
  • Direct injection into the patient's nervous system is advantageous because it allows the therapeutic effect to be concentrated in the affected tissues.
  • the direct injection into the central nervous system of the patient is advantageously carried out by means of a stereotaxic injection device. The use of such a device makes it possible to target with great precision the injection site.
  • the invention also relates to a method of treatment of diseases of the nervous system, such as for example neurodegenerative or metabolic diseases, comprising the administration to a patient of a recombinant baculovims as defined above. More particularly, the invention relates to a method of treatment of neurodegenerative and / or lysosomal diseases comprising the stereotaxic administration of a recombinant baculovims as defined above.
  • the doses of vims used for the injection can be adapted according to different parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or even the duration of the treatment sought.
  • the recombinant baculovims according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 ⁇ and 1014 pfu / ml, and preferably 10 ⁇ to 10 ⁇ pfu ml.
  • the term pfu (“plaque forming unit”) corresponds to the infectious power of a vims solution, and is determined by infection of an insect cell culture, and measures, generally after 5 days, the number of plaques of infected cells or in titration by limiting dilution.
  • Another subject of the invention relates to any mammalian cell infected with one or more recombinant baculovims as described above. More particularly, the invention relates to any population of human nerve cells infected with these baculovims. It can in particular be glial cells (astrocytic, microglial, oligodendrocyte, Schwann cell), ependymal, neural, etc.
  • glial cells astrocytic, microglial, oligodendrocyte, Schwann cell
  • ependymal neural, etc.
  • the cells according to the invention can come from primary cultures. These can be removed by any technique known to those skilled in the art, then cultured under conditions allowing their proliferation.
  • they may be astrocytic cells, preferably adult humans.
  • they may be embryonic cells preferably human, nerve or neuronal progenitor cells such as progenitors from the human telencephalon or mesencephalon which may possibly differentiate in vitro before the transplant, from embryonic astrocytes; these cells can be easily obtained from biopsies. It can also be xenografts from pheochromocytomas, or embryonic cells or astrocytes or other cell types such as Sertoli cells.
  • the cells can also be ES cells (Embryonnic Stem cells) preferably human, differentiated in a nerve path for example. These cells can be used directly for infection by baculovims, or stored, for example by freezing, for the establishment of autologous banks, for later use.
  • ES cells Embryonnic Stem cells
  • the cells according to the invention can also be secondary cultures, obtained for example from pre-established banks.
  • the cells in culture are then infected with recombinant baculovims, to give them the capacity to produce a substance of therapeutic interest.
  • the infection is carried out in vitro according to techniques known to those skilled in the art. In particular, according to the type of cells used and the number of copies of vims per cell desired, a person skilled in the art can adapt the multiplicity of infection and possibly the number of infection cycles carried out. It is well it is understood that these steps must be carried out under conditions of appropriate sterility when the cells are intended for administration in vivo.
  • the doses of recombinant baculovims used for the infection of cells can be adapted by a person skilled in the art according to the aim sought.
  • the conditions described above for administration in vivo can be applied to infection in vitro.
  • Another subject of the invention relates to an implant comprising human cells infected with one or more recombinant baculovims as described above, and an extracellular matrix.
  • the implants according to the invention comprise 10 ⁇ to 10 ⁇ cells. More preferably, they include 10 "to 10 ⁇ .
  • the extracellular matrix comprises a gelling compound and optionally a support allowing the anchoring of the cells.
  • gelling agents are used for the inclusion of cells in a matrix having the constitution of a gel, and to promote the anchoring of the cells on the support, if necessary.
  • Different cell adhesion agents can therefore be used as gelling agents, such as, in particular, coUagen, gelatin, glycosaminoglycans, fibronectin, lectins, etc.
  • coUagen is used. It can be coUagen of human, bovine or murine origin. More preferably, type I coUagen is used.
  • compositions according to the invention advantageously comprise a support allowing the anchoring of the cells.
  • anchoring designates any form of biological and / or chemical and / or physical interaction resulting in the adhesion and / or fixing of the cells on the support.
  • the cells can either cover the support used, or penetrate inside this support, or both. It is preferred to use within the framework of the invention a solid support, not toxic and / or bio-compatible.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • the implants according to the invention can be implanted at different sites in the body.
  • the implantation can be carried out in a muscle, a tumor, the central nervous system, or even under a mucous membrane.
  • the implants according to the invention are particularly advantageous in that they make it possible to control the release of the therapeutic product in the organism: This is first of all determined by the multiplicity of infection and by the number of cells implanted . Then, the release can be controlled either by the withdrawal of the implant, which definitively stops the treatment, or by the use of regulable expression systems, making it possible to induce or repress the expression of the therapeutic genes.
  • the present invention thus provides a very effective means for the treatment or prevention of diseases of the nervous system. It is particularly suitable for the treatment of Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's, and ALS diseases, or even lysosomal diseases.
  • the baculovims according to the invention also have significant advantages, linked in particular to their low immunogenicity, due to the absence of expression of the baculovims proteins in mammalian cells.
  • the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, extracted with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol and then incubated in the presence of the DNA ligase from phage T4 (Biolabs) according to the supplier's recommendations.
  • the filling of the protruding 5 ′ ends can be carried out by the Klenow fragment of DNA Polymerase I of E. coli (Biolabs) according to the supplier's specifications. Destruction of the prominent 3 ′ ends is carried out in the presence of DNA polymerase from phage T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations. The destemction of the protruding 5 ′ ends is carried out by a gentle treatment with nuclease S 1.
  • Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 1_3 (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham.
  • PCR Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. and Faloona F.A., Meth. Enzym. 55 (1987) 335-350] can be performed using a "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) according to the manufacturer's specifications.
  • Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5477] using the kit distributed by Amersham. LEGEND OF FIGURES
  • Figure 1 Percentage of GFP cells positive and conserved in the undifferentiated state by adding bFGF to the medium, as a function of the amount of baculovirus Bac-CMV-GFP (1 ⁇ l corresponding to an MOI of 5).
  • Figure 2 Percentage of GFP cells positive and cultured in the presence of 10% of semen (differentiated state), depending on the amount of Baculovims Bac-CMV-GFP (l ⁇ l corresponding to an MOI of 5).
  • Figure 3 Comparison and demonstration of the action of butyrate in several cell lines: CHP-212, Hela, Cos 7. Infection and expression is very significant, especially in CHP-212 cells. The addition of butyrate allows expression of GFP in almost 100% of these cells.
  • Figure 4 Demonstration of the action of butyrate on the infection of progenitor cells cultured in the presence of 10% SFV 48 hours after infection:
  • Figure 5 Results of the in vitro expression of GFP after infection with Bac-CMV-GFP of a culture of human embryonic telencephalic cells: - 5 A: culture of human embryonic telencephalic cells with 10% FCS. The vast majority of these cells are astrocytes.
  • - 5B culture of human embryonic telencephalic cells with 10% FCS and butyrate. All cells express GFP.
  • Figure 6 Results of GFP expression in vivo one week after stereotaxic injection in the Balb C mouse of baculovims bac-CMV-GFP:
  • the labeled cells appear to be blood vessel epithelial cells as well as a few nerve cells (astrocytes) surrounding the blood vessel.
  • the labeled cells are astrocytes.
  • the labeled cells are ependymal cells.
  • Figure 7 Results in the striatum of GFP expression in vivo 48 hours after stereotaxic injection in the rat, of baculovims bac-CMV-GFP. The injection was carried out under the same conditions as described in Example 4 (9 ⁇ l of vims diluted to 1:10). The labeling of the expression of GFP was carried out using an anti-GFP antibody (Cldntech).
  • the recombinant baculovims RSV-LacZ was obtained by homologous recombination between a shuttle plasmid and the genome of Autographa california in Sf9 cells and amplified in these same cells according to the method described by Gmenwald S. and Heitz J., 1993 (Baculovims expression vector system, procedure & method manual. Pharmingen Eds, San Diego, CA).
  • the shuttle plasmid was produced by inserting into plasmid pVL1392 (Pharmingen, San Diego, CA) a cassette for expression of the nuclear beta-galactosidase gene under the control of the RSV LTR, and of the polyadenylation signal of SV40 in downstream of the LacZ gene.
  • This expression cassette was inserted into the multiple cloning site in reverse orientation relative to the polyhedrin promoter contained in the plasmid pVL1392.
  • the vims is then produced by amplification in 'Sf9 cells. It is concentrated by ultracentrifugation of 180 ml of supernatant (initially titrated at 3 ⁇ 10 7 pfu / ml) at 25,000 rpm at 4 ° C for 90 minutes in a rotor SW 28, then taken up in 2 ml of PBS, ultracentrifuged at 25,000 rpm at 4 ° C for 90 minutes in a rotor SW 41 in a sucrose gradient (10% to 60%, in PBS). The white band corresponding to the purified viral particles is removed and resuspended in PBS and ultracentrifuged at 25,000 rpm at 4 ° C for 90 minutes. The pellet is resuspended in 1.5 ml of cold PBS. This stock of concentrated and purified vims is stored at 4 ° C or -80 ° C.
  • the recombinant baculovims CAG-LacZ was obtained using the shuttle plasmid pAcYM1 (Matsuura et al, J. of Gen. Virol. 68 (1987) 1233-1250).
  • An expression cassette containing the CAG promoter controlling the expression of the LacZ gene was inserted into the shuttle plasmid.
  • the CAG promoter is a composite promoter consisting of a CMV IE enhancer, the chicken beta-actin promoter and the rabbit bet-globin polyadenylation signal.
  • the recombinant baculovims was obtained by homologous recombination in Sf9 cells, then amplified in these cells (according to the protocol of Matsuura et al., J. of Gen. Virol. 68 (1987) 1233-1250).
  • the vims used was obtained by amplification of an aliquot of the recombinant baculovims in Sf9 cells.
  • the viral solution is titrated to lxl 0 9 pfu / ml.
  • the vims is then concentrated by a factor of 100 and purified under the same conditions as those described for the baculovims RSV-LacZ.
  • the purpose of this example is to describe the construction of a recombinant baculovims, carrying a very active expression cassette, cloned from the vector pCI vector (Promega) and including the gene of the Green Fluorescent Protein (EGFP), cloned from of the plasmid EGFP (Clontech), under the control of a CMV promoter and a chimeric intron (comprising the 5 'splicing site of the ⁇ -globin intron and the 3' splicing site of an IgG intron by example) placed upstream of the transgene and an SV 40 polyA.
  • EGFP Green Fluorescent Protein
  • a Bac-CMV shuttle plasmid containing an expression cassette comprising the CMV early promoter, the late polyadenylation signal of SV40 and a multiple cloning site was constructed in order to be able to clone any cDNA. expression of the latter in mammalian cells.
  • the cassette was cloned into a vector pVL1392 (Invitrogene), in reverse orientation of the polyhedrine promoter in order to prevent any transcription interference with the baculovims polyhedrine promoter.
  • the GFP reporter gene was cloned into the shuttle plasmid (Bac-CMV) to produce the Bac-CMV-GFP plasmid.
  • This shuttle plasmid was then transfected into Sf9 insect cells for the production of recombinant baculovims, by homologous recombination with the linearized genome of Autographa california (AcNPV).
  • AcNPV Autographa california
  • the viral stock (Bac. CMV-GFP) was successively concentrated and purified according to the methods described above. The aliquots were stored at -80 ° C.
  • the cells are grown in 4-well dishes. Infection takes place at 37 ° C. in culture medium without semen for approximately 2 h. It was done with increasing concentrations of recombinant vims. After 24 h the cells are fixed
  • Observation of the cultures at 24 and 48 hours after infection shows that the recombinant baculovims is capable of infecting cells of a primary culture of human astrocytes (human telencephalon cultivated in bFGF) and of expressing the LacZ gene ( observed by X-Gal reaction).
  • the cells are cultured in a medium containing bFGF (medium enabling them to be maintained in a state of undifferentiated or very poorly differentiated progenitor cells).
  • the infection was made in the complete culture medium for 2 h. Uninfected controls do not show blue cells.
  • Observation of cultures four days after infection shows that the recombinant baculovims is capable of infecting nerve progenitor cells human (human telencephalon cultivated in bFGF) and to express the LacZ gene (observed by X-Gal reaction).
  • the vector Bac-CMV-GFP was used to transduce primary rodent or human nerve cells.
  • baculovim containing an expression cassette comprising a promoter (CMV) and a heterologous gene (GFP) is capable of infecting non-neuronal cells but also and surprisingly, neuronal cells (line CHP212) as well as nerve cells from primary cultures (embryonic or adult) and direct expression of the heterologous gene in said cells at a very significant rate.
  • CMV promoter
  • GFP heterologous gene
  • RSV-LacZ concentrated.
  • the injection was made by slow injection of 1 ⁇ l of vims (0.25 ⁇ l / min) into three injection sites with 3 sub-sites for each of the sites.
  • the brains are cut at the striatum with a cryostat (cutting thickness: 20 ⁇ m).
  • the sections are studied in immunohistochemistry to detect the presence of ⁇ -galactosidase from E. coli.
  • the slides are washed in PBS, incubated in methanol + 0.3% H 2 O 2 for 1 hour, washed in PBS, then preincubated for 2 h with PBS + 10% FCS + 0.1% Triton. Then they are incubated overnight with anti- ⁇ -Gal antibody (Cappel: 1: 5000th), washed with PBS, then incubated with the secondary antibody (Vectastain Goat Anti-Rabbit Kit). The revelation is made in DAB + Nickel. Thus, a large number of marked cells were observed in the two brains (on approximately 100 sections, making a thickness of approximately 2 mm around the injection site).
  • Fluorescent ⁇ -Gal + GFAP double labeling was done using a monoclonal anti- ⁇ -Gal antibody (Promega) and an anti-polyclonal GFAP antibody. Very few cells are doubly labeled.
  • the immunohistochemistry study with the anti- ⁇ Gal antibody demonstrates that the recombinant baculovims allows infection and expression of the transgene in a large number of nerve cells. It also shows that the recombinant baculovims is not inactivated by the complement in the CNS.
  • the purpose of this example is to demonstrate the capacity of the Bac CMV-GFP vector to infect nerve cells in vivo.
  • the Bac-CMV-GFP vector at 10 6 pfu was injected into the striatum of adult Sprague Dawley rats and adult Nude or Balb-C mice.
  • the stereotaxic injection coordinates are as follows:
  • mice adult females Nude or Balb-C, 20-25g: injection of 2 ⁇ l at a rate of 0.1 ⁇ l per minute.

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Abstract

L'invention concerne de nouveaux virus recombinants et leur utilisation pour le transfert de gènes dans les cellules du système nerveux des vertébrés. Elle concerne également les compositions pharmaceutiques comprenant lesdits virus recombinants. Plus particulièrement la présente invention concerne de nouveaux vecteurs dérivés des baculovirus et leur utilisation pour le traitement des maladies du système nerveux des vertébrés.

Description

VECTEURS DERIVES DE BACULORIVUS ET UTILISATION POUR LE TRANSFERT D ' ACIDES NUCLEIQUES DANS LES CELLULES NERVEUSES DES VERTEBRES
L'invention concerne de nouveaux virus recombinants et leur utilisation pour le transfert de gènes dans les cellules du système nerveux des vertébrés. Elle concerne également les compositions pharmaceutiques comprenant lesdits virus recombinants. Plus particulièrement la présente invention concerne de nouveaux vecteurs dérivés des baculovirus et leur utilisation pour le traitement des maladies du système nerveux des vertébrés.
Les baculovirus sont des virus enveloppés à ADN bicaténaire circulaire spécifiques d'invertébrés. Leur prototype, AcNPY (autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus), a un génome de 133 kb. Ce vecteur est très largement utilisé comme vecteur d'expression de gènes eucaryotes en cellules d'insectes, à partir de deux promoteurs forts [polyédrine (Ph) et P10], (King et Possee, The baculovirus expression system. London: Chapman&Hall, 1992.).
Des stocks de baculovirus peuvent être préparés par infection de cellules d'insectes (Sf9 ou Sf21) par le baculovirus recombinant. La production de protéine se fait par infection des cellules d'insecte avec le baculovirus: le milieu cellulaire est récolté et la protéine synthétisée in vitro dans les cellules d'insecte est extraite.
Les baculovirus recombinants sont obtenus par recombinaison homologue dans des cellules d'insectes (généralement Sf9 ou Sf21 ) entre le plasmide navette contenant le transgène sous contrôle d'un promoteur actif dans les cellules de vertébrés et le génome du baculovirus linéarisé au niveau du site de recombinaison, ou par d'autres techniques bien connues de l'homme du métier (transposons, recombinaison en levure...). Les baculovirus sont des virus épisomaux (chez l'insecte), et permettent d'y intégrer jusqu'à 100 kb d'ADN recombinant. Ainsi ils présentent de nombreux avantages liés à leur facilité de production (multiplication en cellules d'insectes, conditions de culture industrialisables, obtention de titres élevés), à leur capacité de clonage importante, et au fait qu'il présentent un faible risque de dissémination car ils sont ni réplicatifs chez les mammifères ni disséminatifs chez les insectes. Ces vecteurs n'ont cependant pas été utilisés dans le domaine de la thérapie génique, car d'une part et jusqu'à très récemment il était admis que ces virus n'infectaient pas les cellules de mammifères, et d'autre part la transfection de Baculovirus in vivo chez les mammifères n'a encore jamais été mise en évidence.
Hoffmann et al. (PNAS USA 92 (1995) 10099-10103) ont montré qu'un baculovirus recombinant contenant un gène rapporteur sous contrôle du promoteur précoce de CMV est capable d'infecter et d'exprimer le transgène dans des hépatocytes avec une très bonne efficacité : humains (culture primaire, lignée Huh7 et HepG2) et murins (culture primaire de lapin). Cependant ces auteurs n'ont pas observé d'expression significative du transgène dans toute une série de lignées provenant d'origines diverses, y compris du système nerveux (neuroblastome de souris Neuro-2a, astrocytome humain SW1088 et pheochromocytome de rat PC 12).
Boyce F.M. et Bûcher N.L.R. PNAS USA 93 2348-2352 (1996) ont obtenu une expression significative du gène LacZ placé sous contrôle d'un promoteur RSV dans la lignée HepG2 ainsi que dans les lignées 293 (rein humain), A549 (poumon humain) et PC 12 (pheochromocytome de rat). Ils n'ont pa obtenu d'expression significative dans toutes les autres lignées testées,
Sandig V. et al. (Human Gène therapy 7 1937-1945 (1996)) ont utilisé un baculovirus recombinant RSV-LacZ pour l'infection d'hepatocytes humains et murins.
Ils ont montré que le virus est sensible au complément et ne peut donc pas infecter in vivo le foie. Ils ont obtenu cependant une infection d'un morceau de foie humain perfusé ex vivo par le baculovirus, après élimination du sérum.
Plus récemment, Shoji et al. (J. Gen. Virol. 1997) ont utilisé un baculovirus recombinant contenant un gène rapporteur sous contrôle du promoteur CAG
(enhancer précoce du CMV et promoteur de la β-actine de poulet), et ont obtenu une expression significative dans différentes lignées cellulaires (HepG2, Huh7, CPK, Cos7, Hela, FS-L3 KATO-ffl). Une faible expression a été détectée dans les lignées RGM-1, PC 12, IMR-32 et MT-2.
Barsoum et al (Human Gène Therapy, 8 201 1-2018 (1997)) ont montré qu'il était possible de modifier l'enveloppe virale d'un baculovirus contenant une cassette d'expression de la β-galactosidase sous contrôle du LTR de RSV. Ceci permet d'améliorer le potentiel de transduction de ces vecteurs, en améliorant l'infection des cellules infectables par le baculovirus dont l'enveloppe n'est pas modifiée. Ceci permet également d'infecter des cellules qui n'étaient pas infectables par le baculovirus dont l'enveloppe n'était pas modifiée. Cependant, les auteurs n'ont pas testé l'infection de cellules nerveuses. De plus, ils n'ont pas réussi à transduire les cellules Neuro2a (ou N2a) qui sont issues d'un neuroblastome de souris.
Ainsi jusqu'à présent aucun vecteur baculovirus n'a été utilisé pour le transfert de gènes in vitro ou in vivo dans les cellules du tissus nerveux. En effet, seule la lignée PC 12, pouvant présenter dans des conditions particulières un phénotype "pseudo-neuronal" (phechromocytome de rat : système nerveux périphérique), s'est révélée pouvoir être infectée par le baculovirus, cependant le niveau d'expression restait très faiblement supérieur à celui du contrôle. Enfin, aucune utilisation du baculovirus pour le transfert de gène in vivo chez les mammifères n'a été décrite jusqu'à présent.
La demanderesse a maintenant montré qu'il est possible de construire des baculovirus recombinants comprenant une séquence d'acides nucléiques hétérologue codant préférentiellement pour un produit d'intérêt thérapeutique pour le traitement des maladies du système nerveux , d'administrer ces baculovirus recombinants in vivo, et que cette administration permet une expression stable et localisée du transgène in vivo, et en particulier dans le système nerveux. En effet, les résultats présentés dans les exemples démontrent que les baculovirus de l'invention peuvent infecter et diriger l'expression de transgène dans les cellules du système nerveux de vertébrés et préférentiellement de l'humain. A titre illustratif de l'invention, les exemples de la présentent demande, rapportent de manière surprenante l'expression d'un transgène d'intérêt dans au moins 60 % de cellules d'une culture primaire de télencéphale humain différenciées et/ou une expression dans au moins 30 % de cellules télencéphaliques progénitrices ainsi que 30% d'astrocytes d'une culture primaire d'un cortex humain adulte. La présente invention fournit ainsi des vecteurs viraux utilisables directement en thérapie génique, particulièrement adaptés et efficaces pour diriger l'expression de transgènes d'intérêt thérapeutique in vivo dans le système nerveux ou pour une application ex vivo pour le transfert de gènes dans des cultures de cellules du système nerveux ou autre (cellules de Sertoli, cellules musculaires...) destinées à être greffées. La présente invention offre ainsi une nouvelle approche particulièrement avantageuse pour le traitement et/où la prévention des maladies neurodégénératives ou le traitement de maladies métaboliques nécessitant un traitement spécifique du système nerveux en raison de la faible accessibilité des agents thérapeutiques qui ne franchissent pas la barrière hémato-encéphalique.
Un premier objet de l'invention réside dans des baculovirus recombinants comprenant une séquence d'acides nucléiques hétérologue codant pour un produit d'intérêt thérapeutique pour le traitement des maladies du système nerveux.
En particulier, la séquence d'acides nucléiques hétérologue peut comporter un ou plusieurs gènes thérapeutiques.
Les gènes thérapeutiques qui peuvent ainsi être transférés sont tout gène dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des produits ayant un effet thérapeutique.
Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine ou un peptide. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule lui permettant de lutter contre une pathologie, ou encore inhiber l'expression d'une protéine dans les cellules, par l'utilisation de mutants négatifs par exemple.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les enzymes de synthèse de neurotransmetteurs, les facteurs trophiques, en particulier neurptrophiques pour le traitement des maladies neurodégénératives, des traumatismes ayant endommagé le système nerveux, ou des dégénérescences rétiniennes. Par exemple les membres de la famille des neurotrophines tels que le NGF, BDNF, NT3, NT4/5, NT6 et leurs dérivés, les membres de la familles du CNTF tels que le CNTF, l'axokine, le LIF et leurs dérivés, l'IL6 , la cardiotrophine , le GDNF et ses dérivés, les membres de la famille des IGF, tels que l'IGF-1, l'IFGF-2 , les membres de la famille de FGF, tels que le FGF 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 leurs dérivés, et le TGF-β.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut également citer les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745) , les gènes suicides : thymidine kinase, cytosine désaminase, etc.,
Les séquences d'acides nucléiques codant pour des produits d'intérêt thérapeutique au sens de la présente invention recouvrent également les gènes codant pour les protéines impliquées dans le métabolisme des acides aminés, des lipides et des autres constituants de la cellule.
On peut ainsi citer de manière non limitative les gènes associés aux maladies du métabolisme des carbohydrates comme par exemple fructose- 1 -phosphate aldolase, fructose- 1,6-diphosphatase, glucose-6-phosphatase, α-l,4-glucosidase lysosomale, amylo-l,6-glucosidase, amylo-(l,4 : 1 ,6)-transglucosidase, phosphorylase musculaire, phosphofructokinase musculaire, phosphorylase-b-kinase, galactose- 1 -phosphate uridyl transférase, toutes les enzymes du complexe pyruvate déshydrogénase, pyruvate carboxylase, 2-oxoglutarate glyoxylase carboxylase, D-glycérate déhydrogénase.
On peut également citer :
- les gènes associés avec des maladies du métabolisme des amino-acides comme par exemple phénylalanine hydroxylase, dihydrobioptérine synthétase, tyrosine aminotransférase, tyrosinase, histidinase, fumarylacéto-acétase, glutathion synthétase, γ-glutamylcystéine synthétase, ornithine-δ-aminotransférase, carbamoylphosphate synthétase, omithine carbamoyltransférase, argininosuccinate synthétase, argininosuccinate lyase, arginase, L-lysine déhydrogénase, L-lysine kétoglutarate réductase, valine transaminase, leucine isoleucine transaminase, décarboxylase des 2- céto-acides à chaîne ramifiée, isovaléryl-CoA déhydrogénase, acyl-CoA déhydrogénase, 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA lyase, acétoacétyl-CoA 3- kétothiolase, propionyl-CoA carboxylase, méthylmalonyl-CoA mutase, ATP xobalamine adénosyl transférase, dihydrofolate réductase, méthylène tétrahydrofolate réductase, cystathionine β-synthétase, le complexe sarcosine déshydrogénase, les protéines appartenant au système de clivage de la glycine, β- alanine transaminase, carnosinase sérique, homocamosinase cérébrale.
- Les gènes associés avec des maladies du métabolisme des graisses et des acides gras, comme par exemple lipoprotéine lipase, apolipoprotéine C-II, apolipoprotéine E, d'autres apolipoprotéines, lécithine cholestérolacyltransférase, récepteur des LDL, stérol hydroxylase du foie, « acide phytanique » α-hydroxylase.
- Les gènes associés avec des déficiences lysosomales, comme par exemple α- L-iduronidase lysosomale, iduronate sulfatase lysosomale, héparan N-sulfatase lysosomale, N-acétayl-α-D-glucosaminidase lysosomale, acétyl-CoA : α-glucosamine N-acétyltransférase lysosomale, N-acétyl-α-D-glucosamine 6-sulfatase lysosomale, galactosamine 6-sulfate sulfatase lysosomale, β-galactosidase lysosomale, arylsulfatase B lysosomale, β-glucuronidase lysosomale, N-acétylglucosaminyl- phosphotransférase, α-D-mannosidase lysosomale, α-neuraminidase lysosomale, aspartylglycosaminidase lysosomale, α-L-fucosidase lysosomale, lipase acide lysosomale, céramidase acide lysosomale, sphingomyelinase lysosomale, glucocérébrosidase lysosomale et galactocérébrosidase lysosomale, galactosylcéramidase lysosomale, arylsulfatase A lysosomale, α-galactosidase A, β- galactosidase acide lysosomale, chaîne α de l'hexosaminidase A lysosomale.
On peut également citer, de façon non restrictive, les gènes associés avec des maladies du métabolisme des stéroïdes et des lipides, les gènes associés avec des maladies du métabolisme des purines et des pyrimidines, ainsi que les gènes associés à des maladies du métabolisme de la porphyrine et de Thème.
La séquence d'acides nucléiques hétérologue peut être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308, en ARN autocatalytiques tels que les ribozymes ainsi qu'en ARN modifiant l'épissage en trans.
Généralement, la séquence d'acides nucléiques hétérologue comprend également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule infectée. Il peut s'agir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. Avantageusement, il s'agit d'un promoteur actif dans les cellules ou tissus nerveux, notamment d'un promoteur eucaryote. A cet égard, il peut s'agir par exemple d'un promoteur ubiquitaire, c'est-à-dire fonctionnel dans la majorité des types cellulaires. Encore plus préférentiellement, il s'agit donc d'un promoteur ubiquitaire eucaryote. Le promoteur peut être autologue, c'est-à-dire provenant de la même espèce que la cellule dans laquelle l'expression est recherchée ou xénogénique (provenant d'une autre espèce). On peut citer à titre d'exemples avantageux des promoteurs ubiquitaires eucaryotes des promoteurs forts tels que le promoteur du gène de la phosphoglycerate kinase 1 (PGK) ou d'autres promoteurs dirigeant l'expression des gènes du métabolisme cellulaire obligatoire (ces gènes sont dits "domestiques" ou "de ménage" et spécifient des protéines nécessaires à des fonctions communes à toutes les cellules). II s'agit par exemple de gènes intervenant dans le cycle de Krebs, dans la respiration cellulaire ou encore dans la réplication ou la transcription ou la' traduction (EFl-α). On peut citer comme exemples particuliers de ce type de promoteurs, le promoteur des gènes αl-antitrypsine, β-actine, vimentine, aldolase A ou Eflα (facteur d'élongation).
Le promoteur utilisé dans le cadre de l'invention peut encore être un promoteur eucaryote spécifique des cellules nerveuses. On peut citer à titre d'exemple le promoteur des gènes NSE (Neuron Spécifie Enolase), NF (Neurofilament), TH (Tyrosine Hydroxylase), DAT (Dopamine Transporter), ChAT (Choline Acetyl Transférase), DBH (Dopamine β -Hydroxylase), TPH (Tryptophane Hydroxylase), GAD (Glutamic Acid Déshydrogénase), GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) et, plus généralement, tous les promoteurs des enzymes de synthèse ou des transporteurs des neuromédiateurs ou tout autre promoteur de gènes dont l'expression est spécifique d'un type ou sous-type neuronal ou glial donné.
On peut également envisager l'utilisation de promoteurs viraux, tels que par exemple les promoteurs CMV (Cytomégalovims), RSV (Rous Sarcoma Vi s), TK (Thymidine Kinase), SV40 (Simian Vims) et LTR (Long Terminal Repeat) de RSV, de MLV (Murine Leukaemia Vims) ou de HIV (Human Immunodeficiency Vims). Il est également envisageable d'utiliser des promoteurs chimériques tels que CAG (enhancer de CMV et promoteur de la β-actine de poulet), NRSE-PGK ou des promoteurs inductibles tels que les promoteurs inductibles par la tétracycline (Tet-On et Tet-Off), les promoteurs inductibles à l'ecdysone, ou encore d'autres promoteurs inductibles (RU486, 17β-Oestradiol...) et notamment des promoteurs inductibles par le stress, tel que le stress thermique (hsp70)
En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire.
Par ailleurs, la séquence d'acides nucléiques hétérologue peut également comporter, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible ou dans un compartiment spécifique de la cellule. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
Le vims peut être utilisé aussi bien dans une approche ex vivo ou in vivo. Dans le cadre d'une thérapie génique applicable à l'homme, on peut envisager une approche ex vivo par greffe de cellules modifiées génétiquement par un baculovims recombinant. Ces cellules peuvent être d'origines diverses: nerveuses (humaines ou non humaines), cellules de Sertoli, cellules chromaffines L'association de certains médicaments peut être envisagée en vue notamment de d'améliorer le maintien de la greffe ou l'expression du transgène (immunosuppresseurs, anti-complément...). On peut aussi envisager l'implantation de cellules génétiquement modifiées par un baculovims recombinant après encapsidation dans un système inerte.
Les baculovims selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier. En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un plasmide navette et le génome de Autographa californica dans les cellules Sf9 et amplifié dans ces mêmes cellules selon la méthode décrite par Gmenwald S. et Heitz J., 1993 (Baculovims expression vector System, procédure & method manual. Pharmingen Eds, San Diego, CA). Ensuite les baculovims qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire comme illustré dans les exemples.
Les baculovims de l'invention s'étendent à tout dérivé d'un baculovims tel que décrit et produit précédemment. Par dérivé, il faut entendre tout baculovims ayant son génome modifié soit par insertion de séquences soit par délétion de gènes viraux dans ledit génome. En particulier, les dérivés des baculovims sont obtenus par délétion de tout ou partie d'un ou plusieurs gènes viraux. A titre d'exemple, on peut citer la délétion du gène de la polyhedrine, du gène P10 ainsi que de tout gène non indispensable pour la réplication du baculovims en cellules d'insecte notamment. Un dérivé particulier est réprésenté par la délétion de tous les gènes viraux du baculovims (vims gutless) permettant l'insertion d'une cassette d'expression de grande taille.
Il est également possible de modifier l'enveloppe des baculovims, c'est-à-dire de faire exprimer une protéine d'enveloppe autre que celles des baculovims à la surface de ceux-ci, permettant ainsi de modifier le spectre d'hôte du vims. On peut ainsi utiliser des enveloppes qui permettent d'élargir le spectre d'hôtes à une très large variété de types cellulaires ou l'on peut au contraire envisager de restreindre le spectre d'hôtes à un type spécifique de cellules nerveuses. Parmi les protéines d'enveloppe utilisables on peut citer notamment : la glycoprotéine de VSV, la protéine d'enveloppe amphotrope de MLV. On peut également utiliser des protéines d'enveloppes qui permettent d'améliorer spécifiquement l'entrée du vims dans les cellules neurales (CNS et/ou PNS) telles que la glycoprotéine de rhabdovims et notamment du vims de la rage, la glycoprotéine d'enveloppe de togavims (alphavims dont Semliki Forest et Sindbis vims, et mbivims) et notamment de la mbéole (mbivims), la glycoprotéine des Herpès vims (HSV), ou tout autre vims neurotrope. Des variantes préférés de baculovims recombinants selon l'invention sont des baculovims pseudotypés par la glycoprotéine du vims de la rage (Rabies Vims) ou la glycoprotéine de VSV (Vesicular Stomatitis Vims). Ces vecteurs recombinants peuvent être utilisés pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules des tissus nerveux in vitro, ex vivo ou in vivo.
L'application in vivo pourra être faite notamment par injection stéréotaxique du baculovims recombinant dans le système nerveux central (cerveau, moelle) et notamment dans le parenchyme ou bien dans les espaces contenant le liquide céphalorachidien (intraventriculaire ou intrathécal par exemple). A cet égard, il est possible d'utiliser l'association d'inhibiteurs du complément (CVF, sCRl(Hoffman et al., Gène therapy, 1998, vol.5, pp531-536), FUT175...) pour améliorer l'efficacité de la transfection. Il est également envisageable de réaliser l'administration du baculovims, notamment au niveau du muscle, afin d'atteindre le système nerveux par transport rétrograde du baculovims et/ou du produit thérapeutique. Dans ce dernier cas, l'injection sera avantageusement précédée par une inhibition du système du complément in vivo.
Comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également toute utilisation d'un baculovims tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies du système nerveux. Plus particulièrement, elle concerne toute utilisation de ces baculovims pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention de la maladie de Parkinson, de la maladie d'Alzheimer, • de la sclérose latérale amyotrophique (ALS), de la maladie d'Huntington, de l'épilepsie de la sclérose en plaque ou d'autres maladies affectant la myelinisation, ainsi que les maladies affectant le métabolisme telles que les maladies lysosomiales et notamment la maladie MPS VII ou syndrome de Sly.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs baculovims recombinants tels que décrits précédemment.
Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par différentes voies et notamment par voie intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, intra-cérébrale, intra-ventriculaire, intra-médullaire, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe dans le système nerveux du patient. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sémm physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans le système nerveux du patient est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. L'injection directe dans le système nerveux central du patient est avantageusement réalisée au moyen d'un appareil d'injection stéréotaxique. L'emploi d'un tel appareil permet en effet de cibler avec une grande précision le site d'injection.
A cet égard, l'invention concerne également une méthode de traitement des maladies du système nerveux, telles que par exemple les maladies neurodégénératives ou métaboliques, comprenant l'administration à un patient d'un baculovims recombinant tel que défini ci-avant. Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode de traitement des maladies neurodégénératives et/ou lysosomiales comprenant l'administration stéréotaxique d'un baculovims recombinant tel que défini ci-avant.
Les doses de vims utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les baculovims recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 10^ et 1014 pfu/ml, et de préférence 10^ à 10^ pfu ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de vims, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire d'insecte, et mesure, généralement après 5 jours, du nombre de plages de cellules infectées ou bien en titration par dilution limite. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Un autre objet de l'invention concerne toute cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs baculovims recombinants tels que décrits ci-dessus. Plus particulièrement, l'invention concerne toute population de cellules nerveuses humaines infectée par ces baculovims. Il peut s'agir en particulier de cellules gliales (astrocytaire, microgliale, oligodendrocyte, cellule de Schwann), épendymales, neurales, etc.
Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures primaires. Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'agissant plus particulièrement de greffes autologues, il peut s'agir de cellules astrocytaires de préférence humaines adultes .S'agissant des greffes hétérologues, il peut s'agir de cellules embryonnaires de préférence humaines, de cellules progénitrices nerveuses ou neuronales telles que les progéniteurs issus de télencéphale ou de mésencéphale humain pouvant éventuellement différenciés in vitro avant la greffe, des astrocytes embryonnaires ; ces cellules peuvant être aisément obtenues à partir de biopsies. Il peut s'agir également de xénogreffes issues de phéochromocytomes, ou de cellules embryonnaires ou d'astrocytes ou encore d'autres types cellulaires tels que les cellules de Sertoli. Les cellules peuvent également être des cellules ES (Embryonnic Stem cells) de préférence humaines, différenciées dans une voie nerveuses par exemple. Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'infection par les baculovims, ou conservées, par exemple par congélation, pour l'établissement de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuvent également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de banques préétablies.
Les cellules en culture sont ensuite infectées par des baculovims recombinants, pour leur conférer la capacité de produire une substance d'intérêt thérapeutique. L'infection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de vims par cellule désiré, l'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infection et éventuellement le nombre de cycles d'infection réalisé. Il est bien entendu que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilité appropriées lorsque les cellules sont destinées à une administration in vivo. Les doses de baculovims recombinant utilisées pour l'infection des cellules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci- avant pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à l'infection in vitro.
Un autre objet de l'invention concerne un implant comprenant des cellules humaines infectées par un ou plusieurs baculovims recombinants telles que décrites ci-dessus, et une matrice extracellulaire. Préférentiellement, les implants selon l'invention comprennent 10^ à 10^ cellules. Plus préférentiellement, ils en comprennent 10" à 10^.
Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant et éventuellement un support permettant l'ancrage des cellules.
Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que notamment le coUagène, la gélatine, les glycosaminoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention du coUagène. Il peut s'agir de coUagène d'origine humaine, bovine ou murine. Plus préférenciellement, on utilise du coUagène de type I.
Comme indiqué ci-avant, les compositions selon l'invention comprennent avantageusement un support permettant l'ancrage des cellules. Le terme ancrage désigne toute forme d'interaction biologique et/ou chimique et/ou physique entraînant l'adhésion et/ou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux. On préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non toxique et/ou bio-compatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou un support d'origine biologique.
Les implants selon l'invention peuvent être implantés en différents sites de l'organisme. En particulier, l'implantation peut être effectuée dans un muscle, une tumeur, le système nerveux central, ou encore sous une muqueuse. Les implants selon l'invention sont particulièrement avantageux en ce sens qu'ils permettent de contrôler la libération du produit thérapeutique dans l'organisme : Celle-ci est tout d'abord déterminée par la multiplicité d'infection et par le nombre de cellules implantées. Ensuite, la libération peut être contrôlée soit par le retrait de l'implant, ce qui arrête définitivement le traitement, soit par l'utilisation de systèmes d'expression régulable, permettant d'induire ou de réprimer l'expression des gènes thérapeutiques.
La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des maladies du système nerveux. Elle est tout particulièrement adaptée au traitement des maladies d'Alzheimer, de Parkinson, de Huntington, et de l'ALS, ou encore les maladies lysosomiales. Les baculovims selon l'invention présentent en outre des avantages importants, liés notamment à leur faible immunogénicité, en raison de l'absence d'expression des protéines du baculovims dans les cellules de mammifères.
La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
MATERIELS ET METHODES
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlomre de césium, l'electrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destraction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destmction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S 1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 1_3 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de
PCR [Polymérase-catalyzed Chain Réaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 55 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463- 5467] en utilisant le kit distribué par Amersham. LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Pourcentage de cellules GFP positives et conservées à l'état indifférentié par ajout de bFGF dans le milieu, en fonction de la quantité de baculovirus Bac- CMV-GFP (lμl correspondant à une MOI de 5).
Figure 2 : Pourcentage de cellules GFP positives et cultivées en présence de 10 % de sémm (état différentié), en fonction de la quantité de baculovims Bac-CMV-GFP (lμl correspondant à une MOI de 5).
Figure 3 : Comparaison et mise en évidence de l'action du butyrate dans plusieurs lignées cellulaires : CHP-212, Hela, Cos 7. L'infection et l'expression est très significative notamment dans les cellules CHP-212. L'ajout de butyrate permet une expression de GFP dans pratiquement 100% de ces cellules.
Figure 4 : Mise en évidence de l'action du butyrate sur l'infection de cellules progénitrices cultivées en présence de 10 % de SFV 48 heures après l'infection :
4A : action du butyrate exprimée en pourcentage de cellules GFP positives. 48 heures après l'infection, plus de 60 % des cellules expriment la GFP.
- 4B : action du butyrate exprimée en intensité de fluorescence. 48 heures après l'infection, l'intensité de fluorescence est très supérieure, dans les cellules soumises à l'action du butyrate (intensité d'environ 425 avec butyrate versus une intensité égale à 100 sans butyrate).
Figure 5 : Résultats de l'expression in vitro de GFP après infection par Bac-CMV- GFP d'une culture de cellules télencéphalique embryonnaires humaines : - 5 A : culture de cellules télencéphalique embryonnaires humaines avec 10 % de SVF. La très grande majorité de ces cellules sont des astrocytes.
- 5B : culture de cellules télencéphalique embryonnaires humaines avec 10 % de SVF et butyrate. Toutes les cellules expriment la GFP.
Figure 6 : Résultats de l'expression de la GFP in vivo une semaine après injection stéréotaxique chez la souris Balb C du baculovims bac-CMV-GFP :
- 6A : expression de la GFP dans le striatum. Morphologiquement, les cellules marquées semblent être des cellules épithéliales de vaisseau sanguin ainsi que quelques cellules nerveuses (astrocytes) entourant le vaisseau sanguin.
- 6B : expression de la GFP dans le striatum. Les cellules marquées sont des astrocytes.
- 6C : expression de la GFP dans le ventricule latéral. Les cellules marquées sont des cellules épendymaires.
Figure 7 : Résultats dans le striatum de l'expression de la GFP in vivo 48 heures après injection stéréotaxique chez le rat, du baculovims bac-CMV-GFP . L'injection a été réalisée dans les mêmes conditions que décrites dans l'exemple4 ( 9 μl de vims dilué à 1 :10). Le marquage de l'expression de la GFP a été réalisé au moyen d'un anticorps anti-GFP (Cldntech).
EXEMPLES
Exemple 1 : construction de différents vecteurs baculovirus
1.1 - Constmction et production du Baculovims RSV-LacZ:
Le baculovims recombinant RSV-LacZ a été obtenu par recombinaison homologue entre un plasmide navette et le génome de Autographa california dans les cellules Sf9 et amplifié dans ces mêmes cellules selon la méthode décrite par Gmenwald S. et Heitz J., 1993 (Baculovims expression vector system, procédure & method manual. Pharmingen Eds, San Diego, CA).
Le plasmide navette a été élaboré par insertion dans le plasmide pVL1392 (Pharmingen, San Diego, CA) d'une cassette d'expression du gène de la beta- galactosidase nucléaire sous contrôle du LTR de RSV, et du signal de polyadénylation de SV40 en aval du gène LacZ. Cette cassette d'expression a été insérée dans le site multiple de clonage en orientation inverse par rapport au promoteur de la polyhédrine contenu dans le plasmide pVL1392.
Le vims est ensuite produit par amplification dans des' cellules Sf9. Il est concentré par ultracentrifugation de 180 ml de surnageant (titré initialement à 3 x 107 pfu/ml) à 25.000 t/min à 4°C pendant 90 minutes dans un rotor SW 28, puis repris dans 2ml de PBS, ultracentrifugé à 25.000 t/min à 4°C pendant 90 minutes dans un rotor SW 41 dans un gradient de saccharose (10% à 60%, en PBS). La bande blanche correspondant aux particules virales purifiées est prélevée et resuspendue dans du PBS et ultracentrifugée à 25.000 t/min à 4°C pendant 90 minutes. Le culot est resuspendu dans 1,5 ml de PBS froid. Ce stock de vims concentré et purifié est conservé à 4°C ou à -80 ° C.
1.2 - Construction et production du Baculovims CAG-LacZ:
Le baculovims recombinant CAG-LacZ a été obtenu en utilisant le plasmide navette pAcYMl (Matsuura et al, J. of Gen. Virol. 68 (1987) 1233-1250). Une cassette d'expression contenant le promoteur CAG contrôlant l'expression du gène LacZ a été insérée dans le plasmide navette. Le promoteur CAG est un promoteur composite consistant en un enhancer CMV IE, le promoteur de la betα-actine de poulet et le signal de polyadénylation de la bet -globine de lapin. Le baculovims recombinant a été obtenu par recombinaison homologue dans les cellules Sf9, puis amplifié dans ces cellules (selon le protocole de Matsuura et al., J. of Gen. Virol. 68 (1987) 1233-1250).
Le vims utilisé a été obtenu par amplification d'un aliquot du baculovims recombinant dans les cellules Sf9. La solution virale est titrée à lxl 09 pfu/ml. Le vims est ensuite concentré d'un facteur 100 et purifié dans les mêmes conditions que celles décrites pour le baculovims RSV-LacZ.
1.3 Construction et production du Baculovims CMV-GFP
Cet exemple a pour but de décrire la construction d'un baculovims recombinant, véhiculant une cassette d'expression très active, clonée à partir du vecteur pCI vector (Promega) et incluant le gène de la Green Fluorescent Protein (EGFP), clonée à partir du plasmide EGFP (Clontech), sous contrôle d'un promoteur CMV et un intron chimérique (comprenant le site d'épissage 5' de l'intron de la β- globine et le site 3' d'épissage d'un intron IgG par exemple) placé en amont du transgène et un polyA de SV 40.
Tout d'abord, un plasmide navette Bac-CMV contenant une cassette d'expresssion comprenant le promoteur précoce du CMV, le signal tardif de polyadénylation de SV40 et un site multiple de clonage a été constmit afin de pouvoir cloner tout ADNc .pour l'expression de ce dernier en cellules de mammifères. Initialement, la cassette a été clonée dans un vecteur pVL1392 (Invitrogene), en orientation inverse du promoteur de la polyhedrine afin de prévenir toute interférence de transcription avec la promoteur de la polyhedrine du baculovims. Le gène reporter GFP a été clone dans le plasmide navette (Bac-CMV) pour produire le plasmide Bac- CMV-GFP.
Ce plasmide navette a ensuite été transfecté en cellules d'insecte Sf9 pour la production des baculovims recombinants, par recombinaison homologue avec le génome linéarisé de Autographa california (AcNPV). Lorsque le vims a été amplifié sur cellules d'insecte Sf9, l'expresssion de la GFP a pu être détectée en microscopie de fluorescence, démontrant ainsi que le promoteur CMV était actif dans ces cellules.
Après ampification, le stock viral (Bac. CMV-GFP) a été successivement concentré et purifié selon les méthodes décrites précédemment. Les aliquots ont été conservés à - 80 ° C.
Exemple 2 : test de l'infection in vitro de différentes cultures cellulaires par le baculovirus RSV-LacZ
2.1 - Infection des cultures primaires d'astrocytes adultes:
Les cellules sont cultivées dans des boites de 4 puits. L'infection se fait à 37°C dans du milieu de culture sans sémm pendant 2 h environ. Elle a été faite avec des concentrations croissantes de vims recombinant. Après 24 h les cellules sont fixées
(PFA 4%) et colorées par du X-Gal. Les contrôles non infectés ne présentent pas de cellule bleue.
L'observation des cultures à 24 et 48 heures après l'infection montre que le baculovims recombinant est capable d'infecter des cellules d'une culture primaire d'astrocytes humains (télencéphale humain cultivé en bFGF) et d'exprimer le gène LacZ (observé par réaction X-Gal).
2.2 - Infection des cultures primaires de télencéphale embryonnaire humain:
Les cellules sont cultivées en milieu contenant du bFGF (milieu permettant de les maintenir dans un état de cellules progénitrices non ou très peu différenciées). L'infection a été faite dans le milieu de culture complet pendant 2 h. Les contrôles non infectés ne présentent pas de cellules bleues.
L'observation des cultures quatre jours après l'infection montre que le baculovims recombinant est capable d'infecter des cellules progénitrices nerveuses humaines (télencéphale humain cultivé en bFGF) et d'exprimer le gène LacZ (observé par réaction X-Gal).
L'ensemble de ces résultats démontrent que les vecteurs recombinants dérivés des baculovims sont capables d'infecter différents types de cultures primaires de cellules neurales in vitro et peuvent être ainsi utilisés comme vecteur de thérapie génique pour le transfert de gènes ex vivo.
Exemple 3 : test de l'infection in vitro de différentes cultures cellulaires par le baculovirus Bac-CMV-GFP
3.1 infection de différentes lignées cellulaires
Afin d'apprécier l'efficacité du vecteur Bac-CMV-GFP pour le transfert de gène dans les cellules de mammifères; l'activité potentielle de ce vecteur à infecter et à diriger l'expression du gène reporter GFP dans différentes lignées neuronales (CHP212) et non neuronale (HuH7, 293, HeLa, Cos7) a été étudiée. Pour cela, les lignées de cellules HuH7 (hépatocytes humains), 293 (reins humains), HeLa (épithélium humain), Cos7 (rein de singe), N2A (cellules de neuroblastome murin) et CHP212 (cellules de neuroblastome humain) ont été infectées par ce vecteur à une MOI de 12,5. A cette concentration de vecteur, l'analyse des cellules fluorescentes par cytométrie de flux, permet de constater que près de 100 % des cellules HuH7 et 293 sont transduites, ainsi qu'une forte proportion des cellules CHP212 et dans une moindre mesure des cellules HeLa, Cos7 et N2A ( de l'ordre de 5 à 20 %).
Afin de documenter les phénomènes de repression transcriptionnelle de ses vecteurs, les cellules transduites ont été traitées par un inhibiteur des déacétylases des histones (butyrate). En effet, cet agent est décrit comme un puissant facteur capable de lever les inhibitions de la transcription dues à la condensation de la chromatine. Ainsi, dans chaque cas, une augmentation significative du nombre de cellules exprimant le transgène a pu être montrée. De la même manière, une forte augmentation de la quantité de fluorescence par cellules après induction au butyrate a été enregistrée. Ces expériences montrent la capacité de ce vecteur à transduire efficacement un large éventail de cellules de mammifères. En outre, il a été observé que ce vecteur permet de transduire très efficacement une lignée neuronale humaine (CHP212).
3.2 Infection de cultures primaires de cellules nerveuses in vitro
De la même façon que pour les lignées cellulaires, le vecteur Bac-CMV-GFP a été utilisé pour transduire des cellules nerveuses primaires de rongeur ou humaines.
Initialement des cellules progénitrices neuroépithéliales primaires humaines ont été infectées et cultivées en milieu contenant du bFGF (état progéniteur) ou bien cultivées en présence de semm (cellules différenciées majoritairement dans la voie gliale), avec une gamme croissante de vecteur jusqu'à une une quantité correspondant à une MOI de 25. Deux jour après l'infection, l'analyse par cytométrie de flux révèle la présence de l'ordre de 30 % de cellules progénitrice-bFGF et de l'ordre de 60 % de cellules progéniteurs différenciés, exprimant la GFP comme le montrent respectivement les figures 1 et 2 . Il est intéressant de remarqué que la courbe dose/réponse dans le cas des cellules progénitrices n'a pas atteint de plateau à une MOI de 25, suggérant que ces cellules peuvent être infectées de manière plus imporatnte.
Par ailleurs, des expériences de double marquage in vitro sur les cellules humaines du télencéphale embryonnaire à l'aide des marqueurs GFAP (marqueur des astrocytes) et MAP 5 (marqueurs des neurones) montrent nettement que ces deux types cellulaires sont infectables. En effets, les résultats fournissent un marquage GFAP/GFP et MAP5/GFP démontrant de manière inattendue que non seulement les astrocytes mais également les neurones sont infectés.
En parallèle, sur les mêmes cellules il a été vérifié que le taux de "pseudotransduction" c'est-à-dire que le nombre de cellules GFP+ qui n'ont synthétisé de novo de nouvelles du gène reporter était dans tout les cas inférieur à 3 % des cellules GFP positives. Pour cela, la présence d'une fluorescence a été recherchée, trois heures après l'infection, durée qui ne permet pas une expression effective de la GFP suivant le mécanisme de transcription et traduction du gène de la GFP (figures 4Aet 4B).De plus, l'inactivation des vims par irradiation aux UV (avec un UV-cross- linker à une dose de 100 000 μjoules environ) avant l'infection a permis de montrer qu'il n'y avait quasiment plus (moins de 3%) de cellules GFP positives, confirmant donc les résultats obtenus en pseudotransduction.
L'effet du butyrate a été également évalué sur des cellules gliales obtenues par différenciation de cultures de progéniteurs nerveux humains, infectés par Bac-CMV- GFP. Vingt-quatre heures après suplémentation de l'inducteur dans le milieu de culture, un doublement du nombre de cellules GFP positives par rapport aux cellules non traitées a été observé. La valeur moyenne de fluorescence dans les cellules traitées, était cependant, environ quatre fois supérieur à celle observée dans les cellules non traitées. Ces données suggèrent fortement un mécanisme épigénétique de repression transcriptionnelle de la même manière que décrit précédemment pour les lignées cellulaires. Ces résultats montrent en outre que le vecteur de l'invention permet d'infecter des astrocytes primaires humains adultes, ainsi que des pinéalocytes primaire de rat.
Cet exemple démontre donc qu'un baculovims contenant une cassette d'expression comprenant un promoter (CMV) et un gène hétérologue (GFP) est capable d'infecter des cellules non neuronales mais également et de manière surprenante, des cellules neuronales (lignée CHP212) ainsi que des cellules nerveuses issues de cultures primaires (embryonaires ou adultes) et de diriger l'expression du gène hétérologue dans lesdites cellules à un taux très significatif.
Exemple 4 : Test in vivo avec le baculovirus RSV-LacZ
4.1 - Injection stéréotaxique dans le striatum de rat:
Des rats femelles adultes Sprague-Dowley ont été injectées avec 9 μl de vims
RSV-LacZ concentré. L'injection a été faite par injection lente de 1 μl de vims (0,25 μl/min) dans trois sites d'injections avec 3 sous-sites pour chacun des sites. Coordonnées stéréotaxiques par rapport au Bregma :
A: +1,8 , L: + 2,5 , V0: -5 , VI : -4,6 , V2: -4,2 A: +0,6 , L: + 3,2 , V0: -5 , VI : -4,6 , V2: -4,2 A: + 0,6 , L: +2 , V0: -5 , VI : -4,6 , V2: -4,2 5 jours après l'infection, les rats sont fixés par perfusion intracardiale de PFA
4% en PBS et les cerveaux post-fixes pendant 24 h à 4°C dans du PFA 4%. Les cerveaux sont ensuites cryoprotégés par immersion dans du saccharose 15% dans du PBS pendant 72h. Les cerveaux sont ensuites congelés dans de l'isopentane froid (- 50°C) et préservés à - 80°C.
4.2 - Histologie sur les cerveaux des rats injectés:
Les cerveaux sont coupés au niveau du striatum au cryostat (épaisseur de coupe: 20 μm). Les coupes sont étudiées en immunohistochimie pour détecter la présence de β-galactosidase d'E coli. Les lames sont lavées en PBS, incubées en méthanol + H2O2 0,3% pendant 1 heure, lavées en PBS, puis préincubées pendant 2 h avec du PBS + 10% SVF + 0,1% de Triton. Ensuite elles sont incubées toute la nuit avec de l'anticorps anti-β-Gal (Cappel: l :5000ème), lavées avec du PBS, puis incubées avec l'anticorps secondaire (Kit Vectastain Goat Anti-Rabbit). La révélation est faite en DAB + Nickel. Ainsi un grand nombre de cellules marquées a été observé dans les deux cerveaux (sur environ 100 coupes, faisant une épaisseur d'environ 2 mm autour du point d'injection).
Un double-marquage fluorescent β-Gal + GFAP a été fait en utilisant un anticorps monoclonal anti-β-Gal (Promega) et un anticorps anti-GFAP polyclonal. Très peu de cellules sont doublement marquées.
On observe une transduction et un marquage plus prononcé des cellules à la périphérie du corps calleux ainsi que cellules dans le striatum.
L'étude par immunohistochimie avec l'anticorps anti-βGal démontre que le baculovims recombinant permet l'infection et l'expression du transgène dans un grand nombre de cellules nerveuses. Elle montre aussi que le baculovims recombinant n'est pas inactivé par le complément dans le CNS.
Exemple 5 : test in vivo avec le baculovirus Bac-CMV-GFP
Cet exemple a pour but de démonter la capacité du vecteur Bac CMV-GFP à infecter des cellules nerveuses in vivo.
Le vecteur Bac-CMV-GFP à 106 pfu a été injecté dans le striatum de rat Sprague Dawley adultes et de souris Nude ou Balb-C adultes. Les coordonées stéréotaxiques d'injection sont les suivantes :
- Pour les rats (femelles adultes Sprague Dawley, 200-250g) : injection de 9 μl à raison de 0,25 μl par minutes dans le cas d'injection de vims dilué, effectuée selon les mêmes conditions que dans l'exemple 4. Une injection 2 μl à raison de 0,125 μl/minute peut également être effectuée.
Coordonnées stéréotaxiques par rapport au Bregma :
A: +l , V: + 2,3 , L: -5 , - Pour les souris (femelles adultes Nude ou Balb-C, 20-25g) : injection de 2 μl à raison de 0,1 μl par minute.
Coordonnées stéréotaxiques par rapport au Lambda :
A: + 4,7 , L: + l,7 , V: -3,6 ,
A deux jours et une semaine post-injection, la présence de cellules striatales exprimant la GFP a été détectée dans les deux espèces. Outre le striatum, d'autres cellules exprimant la GFP ont également été détectées dans le corps callum et dans l'épendyme (Figures 6 A, 6 B, 6C et Figure 7).
Le phénotypage immunohistochimique a permis de mettre en évidence une très grande majorité de cellules GFP/GFAP positive, suggérant un tropisme très préférentiellement glial de ce vecteur dans le cerveau. Ces resulats démontrent donc de manière évidente la capacité du baculovims à infecter des cellules neurales in vivo.

Claims

REVENDICATIONS
1. Baculovims recombinant ou dérivé comprenant une séquence d'acides nucléiques hétérologue codant pour un produit d'intérêt thérapeutique pour le traitement des maladies du système nerveux.
2. Baculovims recombinant ou dérivé comprenant une séquence d'acides nucléiques hétérologue codant pour un produit d'intérêt thérapeutique et capable d'infecter et de diriger l'expression dudit produit thérapeutique dans les cellules du système nerveux de vertébrés, préférentiellement humaines.
3. Baculovims selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence d'acides nucléiques hétérologue est un gène ou une séquence antisens.
4. Baculovims selon la revendication 3, caractérisé en ce que la séquence d'acides nucléiques hétérologue est un gène codant pour un produit d'intérêt thérapeutique choisi parmi les hormones, les lymphokines, les facteurs de croissance, les enzymes de synthèse de neurotransmetteurs, les facteurs trophiques, les protéines impliquées dans le métabolisme des acides aminés, des lipides ou des carbohydrates.
5. Baculovims selon la revendication 4, caractérisé en ce que les facteurs trophiques sont choisis parmi les membres de la famille des neurotrophines tels que le NGF, BDNF, NT3, NT4/5, NT6 , les membres de la familles du CNTF tels que le CNTF, l'axokine, le LLF, 1TL6 , la cardiotrophine , le GDNF, les membres de la famille des IGF, tels que l'IGF-1, l'IFGF-2 , les membres de la famille de FGF, tels que le FGF 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et le TGF-β.
6. Baculovims selon la revendication 4, caractérisé en ce que le gène codant pour un produit d'intérêt thérapeutique est le gène codant pour la β-glucuronidase.
7. Baculovims recombinant selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un baculovims exprimant une protéine d'enveloppe autre que celle des baculovims.
8. Baculovims selon la revendication 7, caractérisé en ce que la protéine d'enveloppe est la glycoprotéine du vims de la rage ou la glycoprotéine de VSV (Vesicular Stomatitis Viras).
9. Baculovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend également des séquences promotrices permettant l'expression de la séquence d'acides nucléiques hétérologue.
10. Baculovirus selon la revendication 9, caractérisé en ce que la séquence promotrice est choisie parmi les promoteurs des gènes NSE (Neuron Spécifie Enolase), NF (Neurofilament), TH (Tyrosine Hydroxylase), DAT (Dopamine Transporter), ChAT (Choline Acetyl Transférase), DBH (Dopamine β-Hydroxylase), TPH (Tryptophane Hydroxylase), GAD (Glutamic Acid Déshydrogénase), GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein).
11. Baculovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend également des séquences signal permettant d'induire une sécrétion ou une compartimentation spécifique du produit thérapeutique.
12. Utilisation d'un baculovirus recombinant ou dérivé comprenant dans son génome une séquence d'acides nucléiques hétérologue codant pour un produit d'intérêt thérapeutique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des maladies du système nerveux.
13. Utilisation d'un baculovirus recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce que la séquence d'acides nucléiques hétérologue est un gène ou une séquence antisens.
14. Utilisation d'un baculovirus recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce que la séquence d'acides nucléiques hétérologue est un gène codant pour un produit d'intérêt thérapeutique choisi parmi les hormones, les lymphokines, les facteurs de croissance, les enzymes de synthèse de neurotransmetteurs, les facteurs trophiques, les protéines impliquées dans le métabolisme des acides aminés, des lipides ou des carbohydrates.
15. Utilisation d'un baculovirus recombinant selon la revendication 14, caractérisé en ce que les facteurs trophiques sont choisis parmi les membres de la famille des neurotrophines tels que le NGF, BDNF, NT3, NT4/5 et NT6, les membres de la familles du CNTF tels que le CNTF, l'axokine, le LIF, l'IL6 , la cardiotrophine , le GDNF, les membres de la famille des IGF, tels que l'IGF-1, l'IFGF-2 , les membres de la famille de FGF, tels que le FGF 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, et le TGF-β.
16. Utilisation d'un baculovims recombinant selon la revendication 14, caractérisé en ce que le gène codant pour un produit d'intérêt thérapeutique est impliqué dans les maladies lysosomiales et en particulier le gène codant pour la β-glucuronidase
17. Population de cellules du système nerveux (e.g. cerveau, moelle épinière, cellules neurales, gliales, épendymales, infectée par un ou plusieurs baculovims recombinants selon l'une des revendications 1 à 11.
18. Implant comprenant des cellules humaines infectées par un ou plusieurs baculovirus recombinants selon l'une des revendications 1 à 11.
19. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs baculovirus recombinants selon l'une des revendications 1 à 1 1, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
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