FR2727867A1 - Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne l'utilisation d'adénovirus recombinants pour le transfert d'acides nucléiques dans les motoneurones médullaires.
Description
Transfert de gènes dans les motoneurones médullaires
au moyen de vecteurs adénoviraux
La présente invention concerne le domaine de la thérapie génique. Elle concerne plus particulièrement une nouvelle méthode de traitement des pathologies du système nerveux par transfert de gènes dans les motoneurones médullaires au moyen de vecteurs adénoviraux.
au moyen de vecteurs adénoviraux
La présente invention concerne le domaine de la thérapie génique. Elle concerne plus particulièrement une nouvelle méthode de traitement des pathologies du système nerveux par transfert de gènes dans les motoneurones médullaires au moyen de vecteurs adénoviraux.
La thérapie génique et l'utilisation de virus modifiés comme vecteurs pour les maladies neurodégénératives constituent des nouvelles approches thérapeutiques particulièrement promotteuses. Parmi les virus utilisés à cet effet dans l'art antérieur, on peut citer en particulier les adénovirus (Le Gal La
Salle et al., Science 259, 988-990), les virus de l'herpès, les virus adénoassociés et les rétrovirus. Les études décrites dans l'art antérieur montrent que ces vecteurs, et en particulier les adénovirus, sont capables d'infecter avec une très grande efficacité les cellules du système nerveux central. Ces résultats permettent ainsi de mettre au point des méthodes de traitement des pathologies du système nerveux central par injection directe au niveau du système nerveux central (en particulier par stéréotaxie) d'adénovirus recombinants comprenant un gène thérapeutique.
Salle et al., Science 259, 988-990), les virus de l'herpès, les virus adénoassociés et les rétrovirus. Les études décrites dans l'art antérieur montrent que ces vecteurs, et en particulier les adénovirus, sont capables d'infecter avec une très grande efficacité les cellules du système nerveux central. Ces résultats permettent ainsi de mettre au point des méthodes de traitement des pathologies du système nerveux central par injection directe au niveau du système nerveux central (en particulier par stéréotaxie) d'adénovirus recombinants comprenant un gène thérapeutique.
Concernant la moelle épinière, dans le cadre de certaines maladies neurodégénératives ou de traumatismes, la thérapie génique pourrait également permettre de lutter contre la dégénérescence des neurones moteurs (motoneurones) en apportant certains gènes codant par exemple pour des facteurs de croissance. Néanmoins, ces applications sont encore limitées par l'absence de méthode simple permettant de transférer spécifiquement un gène au niveau de la moelle. La présente invention permet de remédier à ce problème.
La présente invention décrit en effet une méthode particulièrement efficace pour le transfert sélectif de gènes dans la moelle. La présente invention découle en particulier de la démonstration qu'il est possible de transférer spécifiquement un gène au niveau des motoneurones par administration, au niveau du muscle, d'un vecteur adénoviral incorporant ledit gène. En effet, la demanderesse a maintenant montré que, de manière particulièrement avantageuse, les adénovirus sont absorbés au niveau des jonctions neuromusculaires (plaques motrices), et acheminés jusqu'aux corps cellulaires des motoneurones (corne ventrale de la moelle épinière) par transport rétrograde le long des axones motoneuronaux.L'administration intramusculaire de vecteurs adénoviraux selon l'invention constitue ainsi une nouvelle méthode très spécifique d'infection des motoneurones par transport rétrograde, permettant de cibler de façon précise l'étage médullaire sur lequel on désire intervenir en fonction de la localisation du traumatisme et/ou de la dégénérescence.
Le procédé selon la présente invention est tout particulièrement avantageux puisqu'il permet, en suivant une cartographie précise des jonctions neuromusculaires, d'infecter de façon spécifique et unilatérale les motoneurones des différents étages fonctionnels médullaires. II s'avère de plus beaucoup moins traumatique qu'une injection stéréotaxique dans le parenchyme médullaire, laquelle serait de toutes façons plus diffuse et non restrictive aux motoneurones.
Un premier objet de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant dans son génome un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones médullaires par administration intramusculaire.
Comme indiqué ci-avant, le procédé selon la présente invention est très avantageux puisqu'il permet de cibler précisément les motoneurones de chaque étage fonctionnel médullaire. Ainsi, selon le site de l'altération à traiter,
I'administration est pratiquée dans un muscle portant une liaison nerveuse avec ledit site. Selon la présente invention,il est maintenant possible, par un choix judicieux de diverses injections, d'infecter, de façon spécifique et unilatérale, un grand nombre de motoneurones médullaires répartis sur les différents niveaux.A titre de mode de réalisation préférés, I'administration dans des muscles des membres supérieurs (biceps, triceps) permet de transférer un gène dans les motoneurones au niveau cervical; I'administration dans des muscles du thorax (pectoraux) permet de transférer un gène dans les motoneurones au niveau thoracique; ou encore l'administration dans des muscles des membres inférieurs (gastrocnémien) permet de transférer un gène dans les motoneurones au niveaux lombaire et sacré. D'autres muscles peuvent bien entendu être utilisés pour l'administration au niveau de ces motoneurones, et d'autres motoneurones peuvent également être ciblés. A cet effet, il est possible d'utiliser des cartographies précises des jonctions neuromusculaires afin de déterminer, en fonction de l'étage médullaire ciblé, le ou les muscles les plus appropriés pour l'administration.De telles cartographies sont accessibles à l'homme de l'art (voir notamment
Nicholopoulos et al., J. Comp. Neurol. 217, 78-85; Peyronnard et Charon, Exp.
I'administration est pratiquée dans un muscle portant une liaison nerveuse avec ledit site. Selon la présente invention,il est maintenant possible, par un choix judicieux de diverses injections, d'infecter, de façon spécifique et unilatérale, un grand nombre de motoneurones médullaires répartis sur les différents niveaux.A titre de mode de réalisation préférés, I'administration dans des muscles des membres supérieurs (biceps, triceps) permet de transférer un gène dans les motoneurones au niveau cervical; I'administration dans des muscles du thorax (pectoraux) permet de transférer un gène dans les motoneurones au niveau thoracique; ou encore l'administration dans des muscles des membres inférieurs (gastrocnémien) permet de transférer un gène dans les motoneurones au niveaux lombaire et sacré. D'autres muscles peuvent bien entendu être utilisés pour l'administration au niveau de ces motoneurones, et d'autres motoneurones peuvent également être ciblés. A cet effet, il est possible d'utiliser des cartographies précises des jonctions neuromusculaires afin de déterminer, en fonction de l'étage médullaire ciblé, le ou les muscles les plus appropriés pour l'administration.De telles cartographies sont accessibles à l'homme de l'art (voir notamment
Nicholopoulos et al., J. Comp. Neurol. 217, 78-85; Peyronnard et Charon, Exp.
Brain Res. 50, 125-132). Selon l'étage médullaire qu'il s'avèrera opportun d'infecter un ou plusieurs muscles connus pour être innervés par l'étage en question peuvent ainsi être choisis.
L'administration intramusculaire d'adénovirus peut être réalisée de différentes manières. Selon un premier mode de réalisation, elle est pratiquée par injection en plusieurs points d'un même muscle de façon à concerner un très grand nombre de plaques motrices. Ce mode de réalisation est particulièrement efficace lorsque le point d'insertion du nerf dans le muscle considéré n'est pas identifiable. Lorsque le point d'insertion du nerf est repérable, I'administration est avantageusement réalisée par une ou plusieurs injections au niveau ou proche(s) dudit point. Selon ce mode de réalisation,
I'efficacité du transfert est plus grande car une proportion élevée de vecteur administrée est absorbée au niveau de la jonction neuromusculaire.
I'efficacité du transfert est plus grande car une proportion élevée de vecteur administrée est absorbée au niveau de la jonction neuromusculaire.
Dans un premier mode préféré de mise en oeuvre de la présente invention, I'administration intramusculaire est réalisée par injections en plusieurs points d'un même muscle.
Dans un autre mode préféré de mise en oeuvre de la présente invention,
I'administration intramusculaire est réalisée par injection(s) au niveau ou proche(s) du point d'insertion du nerf.
I'administration intramusculaire est réalisée par injection(s) au niveau ou proche(s) du point d'insertion du nerf.
Selon un objet particulier, I'invention concerne l'utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant dans son génome un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones médullaires cervicaux par administration dans les muscles des membres supérieurs (exemple biceps, triceps).
Selon un autre objet particulier, I'invention concerne l'utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant dans son génome un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones médullaires thoraciques par administration dans les muscles du thorax (ex. pectoraux).
Toujours selon un objet particulier, I'invention concerne l'utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant dans son génome un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones médullaires lombaire et/ou sacré par administration dans les muscles des membres inférieurs (gastrocnémien par exemple).
La méthode selon l'invention peut être mise en oeuvre en utilisant des adénovirus d'origine diverses. Différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont en effet été caractérisés.
Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, I'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus
CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple].
CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple].
Selon un mode particulier de réalisation préféré de l'invention,
I'adénovirus utilisé est un adénovirus d'origine humaine. Selon un autre mode avantageux, I'adénovirus est un adénovirus d'origine animale.
I'adénovirus utilisé est un adénovirus d'origine humaine. Selon un autre mode avantageux, I'adénovirus est un adénovirus d'origine animale.
Le génome des adénovirus comprend notamment une séquence inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs. Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions El, E2, E3 et E4 Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région El (Ela et E1 b notamment) sont nécessaires à la réplication virale. Les régions E4 et L5 par exemple sont elles impliquées dans la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions L1 à L5. Les génome de l'adénovirus Ad5 a été entièrement séquencé et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank M73260). De même des parties, voire la totalité du génome d'adénovirus de sérotypes différents (Ad2, Ad7, Ad12, etc) ont également été séquencées.Les vecteurs adénoviraux utilisés pour la mise en oeuvre de la présente invention comprenent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et l'acide nucléique d'intérêt.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le génome de l'adénovirus utilisé est dépourvu de tout ou partie de la région El. La région El est en effet essentielle à la réplication virale et son inactivation conduit à la formation de virus défectifs pour la réplication, c'est-à-dire incapables de se répliquer de façon autonome dans les cellules infectées. La région El, ou tout autre région virale considérée, peut être rendue non fonctionnelle par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes.
Avantageusement, le génome de l'adénovirus utilisé est dépourvu d'une partie de la région El correspondant aux résidus 454 à 3328 (fragment Pvull-Bglll) ou 382 à 3446 (fragment Hinfll-Sau3A).
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le génome de l'adénovirus utilisé est également dépourvu de tout ou partie de la région E3 et/ou E4. La demanderesse a maintenant montré qu'il est possible de construire des vecteurs portant ces différents types de délétions. Ces délétions supplémentaires permettent d'accroitre la sécurité du vecteur et d'augmenter sa capacité.
L'acide nucléique d'intérêt peut être inséré en différents sites du génome de l'adénovirus. Avantageusement, il est inséré au niveau de la région El, E3 ou E4. Cependant, il est clair que d'autres sites peuvent être utilisés. En particulier, l'accès à la séquence nucléotidique du génome permet à l'homme du métier d'identifier ou de créer des sites de restriction utilisables à cet effet.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al.,
Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN d'intérêt. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen.Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %).
Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN d'intérêt. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen.Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %).
Une première méthode consiste à transfecter l'ADN du virus recombinant (défectif) préparé in vitro dans une lignée cellulaire compétente, c'est-à-dire portant en trans toutes les fonctions nécessaires à la complémentation du virus défectif. Ces fonctions sont préférentiellement intégrées dans le génome de la cellule, ce qui réduit les risques de recombinaison, et confère une stabilité accrue à la lignée cellulaire. Dans le cas d'adénovirus dans lesquels seule la région El est déficiente, la lignée préférée est la lignée 293.
Une seconde approche consiste à co-transfecter dans une lignée cellulaire apppropriée l'ADN du virus recombinant défectif préparé in vitro et l'ADN d'un ou de plusieurs virus ou plasmide helper. Selon cette méthode, il n'est pas nécessaire de disposer d'une lignée cellulaire compétente capable de complémenter toutes les fonctions défectives de l'adénovirus recombinant. Une partie de ces fonctions est en effet complémentée par le ou les virus helper. Ce ou ces virus helper sont eux-mêmes défectifs.
Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les demandes n" FR 93 05954 et FR 93 08596.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Pour leur utilisation selon la présente invention, les adénovirus sont préférentiellement associés à un ou des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. II peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses de virus utilisées pour l'administration peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du site (muscle) d'administration considéré, du nombre d'injections, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu, et de préférence 106 à 1O10 pfu. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Le procédé selon la présente invention est particulièrement avantageux pour le traitement des traumatismes médullaires ou des maladies de dégénérescence motoneuronale. Les traumatismes médullaires correspondent plus particulièrement à des sections au niveau des motoneurones qui les privent de leurs afférences provenant des centres supérieurs et entrainent leur dégénérescence. Le transfert de gènes codant des facteurs de croissance dans les motoneurones sous lésionnels par transport rétrograde selon l'invention offre maintenant la possibilité de réduire voire empêcher cette dégénérescence. S'agissant de neuropathies du motoneurone, on peut citer par exemple la sclérose latérale amyotrophique, les amyotrophies spinales de type I (maladie de Werdnig Hoffman) de type Il ou III (maladie de Kugelberg
Welander), les amyotrophies spinales bulbaires (telles que la maladie de
Kennedy).Le transfert de gènes codant pour des facteurs de croissance ou autres molécules connues pour exercer un effet neurotrophique sur le motoneurone en dégénérescence selon la présente invention offre également une nouvelle voie pour le traitement de ce type de pathologies. L'efficacité du procédé de l'invention peut en particulier être mise en évidence sur modèle animaux: modèle de section partielle ou complète de la moelle épinière, souris
Wobbler (modèle animal d'étude de la sclérose latérale amyotrophique (Leestma J. E., Am. J.Pathol., 100, 821-824)); souris mnd ("motoneurone degeneration" : modèle animal d'étude de la sclérose latérale amyotrophique (Messer et al., 1992, Genomics, 18, 797-802)) ou souris pmn ("progressive motoneurone neuropathy" : modèle animal d'étude de la dégénérescence motoneuronale lors du développement), comme illustré dans les exemples.
Welander), les amyotrophies spinales bulbaires (telles que la maladie de
Kennedy).Le transfert de gènes codant pour des facteurs de croissance ou autres molécules connues pour exercer un effet neurotrophique sur le motoneurone en dégénérescence selon la présente invention offre également une nouvelle voie pour le traitement de ce type de pathologies. L'efficacité du procédé de l'invention peut en particulier être mise en évidence sur modèle animaux: modèle de section partielle ou complète de la moelle épinière, souris
Wobbler (modèle animal d'étude de la sclérose latérale amyotrophique (Leestma J. E., Am. J.Pathol., 100, 821-824)); souris mnd ("motoneurone degeneration" : modèle animal d'étude de la sclérose latérale amyotrophique (Messer et al., 1992, Genomics, 18, 797-802)) ou souris pmn ("progressive motoneurone neuropathy" : modèle animal d'étude de la dégénérescence motoneuronale lors du développement), comme illustré dans les exemples.
L'incorporation, la tolérance et l'innocuité pour l'homme peuvent être testés sur des modèles in vitro de culture de neurones médullaires embryonnaires humains.
A cet égard, L'acide nucléique d'intérêt incorporé dans les vecteurs adénoviraux selon l'invention code préférentiellement pour une substance neuroactive, c'est-à-dire capable d'exercer un effet bénéfique sur les cellules nerveuses. Il peut s'agir d'une substance capable de compenser un déficit en ou de réduire un excès d'une substance endogène, ou également d'une substance conférant aux cellules des propriétés nouvelles. II peut s'agir plus particulièrement d'un facteur de croissance, d'un facteur neurotrophique, d'une cytokine, d'un neurotransmetteur ou encore d'une enzyme, ou d'un récepteur de neurotransmetteur ou d'hormone.
Préférentiellement, parmi les facteurs de croissance, on peut citer les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, GM-CSF, M-CSF, CSF, etc), ou les facteurs de croissance des fibroblastes (FGFa, FGFb) ou des cellules vasculaires (VEGF). Parmi les facteurs neurotrophiques, les facteurs préférés sont notamment le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF), les facteurs de maturation des cellules gliales (GMFa,(3) le GDNF, le BDNF, le NT3, le NT5, etc.Les cytokines préférées sont les interleukines et les interférons et, parmi les enzymes, on utilise préférentiellement les enzymes de biosynthèse de neurotransmetteurs (tyrosine hydroxylase, acétyl choline transférase, glutamic acide décarboxylase), les enzymes lysosomales (héxosaminidases, arylsulfatase, glucocérébrosidase, HGPRT), les enzymes impliqués dans la détoxification des radicaux libres (superoxyde dismutase I, II ou III, catalase, gluthation peroxydase). Parmi les récepteurs, on utilisera entre autres les récepteurs aux androgènes (impliqués dans la maladie de Kennedy).
Ces différents facteurs peuvent être utilisés sous forme native, ou sous forme de variant ou fragment ayant une activité de même type.
II est également possible de transférer des séquences antisens.
L'acide nucléique peut être d'origine naturelle ou artificielle. Il peut s'agir notamment d'ADN génomique (ADNg), d'ADN complémentaire (ADNc), de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. II peut être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. Il peut être obtenu par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. II s'agit préférentiellement d'ADNc ou d'ADNg.
Généralement, L'acide nucléique comprend également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans les motoneurones, ainsi qu'une région située en 3' du gène d'intérêt, et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de polyadénylation. L'ensemble de ces éléments constitue la cassette d'expression. Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter.De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire (promoteurs GFAP, enolase, etc). Par ailleurs, lorsque l'acide nucléique hétérologue ne comporte pas de séquences promotrices, il peut être inséré dans le génome du virus en aval d'une telle séquence.
La présente invention a également pour objet une méthode pour le transfert d'acides nucléiques dans les motoneurones comprenant l'administration musculaire d'un vecteur adénoviral incoporant ledit acide nucléique dans son génome. Préférentiellement, la méthode selon l'invention est réalisée par injection(s) en plusieurs points d'un même muscle ou, lorsque le point d'insertion du nerf est repérable, par une ou plusieurs injections au niveau ou proche(s) dudit point.
La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures
FIGURE 1 (PHOTO A):
Marquage B-Galactosidase de coupes longitudinales (50 pm) de moelle épinière de rat au niveau lombaire, après injection intramusculaire d'adénovirus ss-Galactosidase dans le muscle gastrocnémien.
FIGURE 1 (PHOTO A):
Marquage B-Galactosidase de coupes longitudinales (50 pm) de moelle épinière de rat au niveau lombaire, après injection intramusculaire d'adénovirus ss-Galactosidase dans le muscle gastrocnémien.
- marquage diffus de nombreux corps cellulaires motoneuronaux (A).
- marquage plus intense de quelques motoneurones au niveau du corps cellulaire et des neurites, mettant en évidence la morphologie typique des motoneurones (A).
FIGURE 2 (PHOTO B): idem A, grossissement supérieur.
Marquage ss-Galactosidase de coupes longitudinales (50 pm) de moelle épinière de rat au niveau lombaire, après injection intramusculaire d'adénovirus
B-Galactosidase dans le muscle gastrocnémien.
B-Galactosidase dans le muscle gastrocnémien.
FIGURE 3 (PHOTO C):
Co-marquage B-Galactosidase-lmmunocytochimie "Calcitonin Gene
Related Peptide" (CGRP) de coupes longitudinales (50 Cim) de moelle épinière de rat au niveau lombaire, après injection intramusculaire d'adénovirus ss-
Galactosidase dans le muscle gastrocnémien.
Co-marquage B-Galactosidase-lmmunocytochimie "Calcitonin Gene
Related Peptide" (CGRP) de coupes longitudinales (50 Cim) de moelle épinière de rat au niveau lombaire, après injection intramusculaire d'adénovirus ss-
Galactosidase dans le muscle gastrocnémien.
Exemples 1. Iniection de l'adénovirus ss-Galactosidase dans le muscle gastrocnémien chez le rat Intact ou chez le rat ayant subi une hemisection thoracique de la moelle épinière.
Cet exemple décrit le transfert du gène Egal au niveau des motoneurones lombaires par administration dans le muscle gastrocnémien d'un adénovirus incorporant ledit gène.
Plus particulièrement, L'étude a été réalisée sur un modèle de section partielle ou complète de la moelle épinière de rat pratiquée au niveau thoracique bas ayant pour effet de paralyser l'animal pour l'un ou ses deux membres inférieurs. Une telle section prive les motoneurones de leurs afférences provenant des centres supérieurs et en entraine la dégénérescence. L'administration a été réalisée de manière à infecter les motoneurones sous lésionnels par transport rétrograde.
Le vecteur adénoviral utilisé dans cet exemple est le vecteur Ad.flSV.Sgal. Ce vecteur est dépourvu des séquences nécessaires à sa réplication, mais comporte néanmoins les séquences nécessaires pour pénétrer dans les cellules infectables par celui-ci ainsi que l'ensemble des séquences essentielles nécessaires à l'encapsidation de cet adénovirus. II porte également, sous le controle du promoteur RSV, le gène de la B galactosidase de E.coli. La construction de l'adénovirus recombinant défectif Ad.RSVBgal a été décrite dans la littérature (Strafford-Perricaudet et al., J.
Clin. Invest. 90 (1992) 626). Brièvement, I'adénovirus Ad.RSVssGal est un adénovirus recombinant défectif (délété des régions El et E3 ) obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-d1324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le plasmide pAd.RSVssGal (Akli et al. 1993).
Le plasmide pAd.RSVssGal contient, dans l'orientation 5'- > 3',
- le fragment Pvull correspondant à l'extrémité gauche de l'adénovirus
Ad5 comprenant : la séquence ITR, L'origine de réplication, les signaux d'encapsidation et l'amplificateur E1A;
- le gène codant pour la ss-galactosidase sous le contrôle du promoteur
RSV (du virus du sarcome de Rous),
- un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue entre le plasmide pAd.RSVssGal et l'adénovirus d1324.
- le fragment Pvull correspondant à l'extrémité gauche de l'adénovirus
Ad5 comprenant : la séquence ITR, L'origine de réplication, les signaux d'encapsidation et l'amplificateur E1A;
- le gène codant pour la ss-galactosidase sous le contrôle du promoteur
RSV (du virus du sarcome de Rous),
- un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue entre le plasmide pAd.RSVssGal et l'adénovirus d1324.
Après linéarisation par l'enzyme Clal, le plasmide pAd.flSVal et l'adénovirus d1324 sont co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés sont sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml. Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment
Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus a ensuite été utilisé sous forme purifiée dans une solution saline phosphate (PBS).
Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus a ensuite été utilisé sous forme purifiée dans une solution saline phosphate (PBS).
Trois injections d'adénovirus Ad-RSV-(3-Gal (107 pfu par injection) ont été pratiquées dans le muscle gastrocnémien, juste après que l'animal ait subi (ou pas) une hémisection de la moelle épinière (niveau thoracique bas, ayant pour effet de paralyser l'animal pour l'un de ses membres inférieurs). 9 pI d'adénovirus sont injectés par point d'injection à la seringue Hamilton.
Les animaux ont été sacrifiés (perfusion 4% paraformaldéhyde) quatre jours après injection, temps minimum pour que le transport rétrograde s'effectue du muscle à la moelle épinière. Trois blocs de moelle épinière ont été coupés longitudinalement aux niveaux cervical, thoracique et lombaire, en coupes de 50 mM d'épaisseur. Les coupes ont été traitées pour la révélation de la ss-Galactosidase permettant de mettre en évidence les cellules ayant été infectées par le virus. Certaines coupes ont de plus subi une immunocytochimie anti-"Calcitonin Gene Related Peptide" (CGRP), permettant de marquer spécifiquement les motoneurones.
La ss-Galactosidase a été révélée à partir de son substrat, le X-Gal, et le produit de la réaction donne une coloration bleue.
Le "Calcitonin Gene Related Peptide", CGRP, est un neurotransmetteur, marqueur spécifique des motoneurones. II est révélé par immunocytochimie avec un anticorps secondaire couplé à la péroxidase et comme substrat de l'enzyme la diaminobenzidine; le produit de la réaction donne une coloration marron.
La révélation de la (3-Galactosidase a permis de mettre en évidence la présence de motoneurones infectés, exclusivement au niveau lombaire, sous lésionnel dans le cas des rats hémisectionnés, et du coté correspondant à l'injection.
Deux types de marquage ont été obtenus, un marquage diffus du corps cellulaire d'un grand nombre de motoneurones, et un marquage plus intense du corps cellulaire et des neurites d'un nombre plus limité de motoneurones (photos A et B). Cette différence d'intensité de marquage est probablement due au fait que seulement quelques motoneurones, très proches du site d'injection, ont pu absorber le virus de façon intense.
L'immunocytochimie anti-CGRP couplée à la révélation b-Galactosidase a permis de mettre en évidence par une double coloration que la quasi totalité des corps cellulaires CGRP positifs (i.e. motoneurones) étaient infectés par le virus (photo C).
Claims (13)
1. Utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant dans son génome un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones médullaires par administration intramusculaire.
2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'adénovirus est un adénovirus d'origine humaine.
3. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'adénovirus est un adénovirus d'origine animale.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que le génome de l'adénovirus est dépourvu de tout ou partie de la région El.
5. Utilisation selon la revendication 4 caractérisée en ce que le génome de l'adénovirus est également dépourvu de tout ou partie de la région E3 et/ou
E4.
6. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'acide nucléique d'intérêt est inséré dans le génome de l'adénovirus au niveau de la région El, E3 ou E4.
8. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'acide nucléique d'intérêt code pour une substance neuroactive.
9. Utilisation selon la revendication 8 caractérisée en ce que l'acide nucléique d'intérêt code pour un facteur de croissance, un facteur neurotrophique, une cytokine, un neurotransmetteur ou une enzyme, ou un récepteur.
10. Utilisation selon la revendication 8 caractérisée en ce que l'acide nucléique d'intérêt comprend en outre des signaux permettant l'expression de la substance neuroactive dans les motoneurones.
11. Utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant dans son génome un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones médullaires cervicaux par administration dans les muscles des membres supérieurs (exemple :biceps, triceps).
12. Utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant dans son génome un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones médullaires thoraciques par administration dans les muscles du thorax (ex. pectoraux).
13. Utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant dans son génome un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones médullaires lombaire et/ou sacré par administration dans les muscles des membres inférieurs (gastrocnémien par exemple).
14. Utilisation selon l'une des revendications précédentes pour le traitement des traumatismes médullaires ou des maladies de dégénérescence motoneuronale.
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