CA2208224A1 - Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux - Google Patents
Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenovirauxInfo
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Abstract
La présente invention concerne l'utilisation d'adénovirus recombinants pour le transfert d'acides nucléiques dans les motoneurones médullaires.
Description
- - -WO 96/18740 PCI~/FR95/01650 Transfert de gènes dans les motoneurones mé~ ires au moyen de vecteurs adénoviraux La présente invention concerne le domaine de la thérapie génique. Elle concerne plus particulièrement une nouvelle méthode de tr~iteme-nt des pathologies du système 5 nerveux par transfert de gènes dans les motoneurones m~ ires au moyen de vecteurs adénoviraux.
La thérapie génique et 1'1-tili.e~ti-)n de virus mc~lifi~s comme vecteurs pour les m~l~rlies neurodégénératives c--n~it~lent des nouvelles approches thérapeutiquesparticulièrement promotteuses. Parmi les vi~s utilisés à cet effet dans l'art antérieur, on lo peut citer en particulier les adénovirus (Le Gal La Salle et al., Science 259, 988-990), les virus de l'herpès, les virus adéno-associés et les ~ vir~ls. Les études ~léçrit~s dans l'art antérieur montrent que ces vecteurs, et en particulier les adénovirus, sont c~r~hles d'infecter avec une très grande efficacité les cellules du système nerveux central. Ces résultats permettent ainsi de mettre au point des méthodes de traitement des pathologies 15 du système nerveux central par injection directe au niveau du système ne~ ux central (en particulier par stéréotaxie) d'adénovirus recomhin~nt.e comprenant un gène thérapeutique.
Concernant la moelle épinière, dans le cadre de certaines m~ s neurodégénératives ou de tr~llm~tiemes~ la thérapie génique pourrait également 20 permettre de lutter contre la dégénérescence des neurones moteurs (motoneurones) en apportant certains gènes codant par exemple pour des facteurs de croiee~n~e.
Né~nmoine, ces applications sont encore limitées par l'~hs~nce de méthode simplepermettant de transférer spécifiquement un gène au niveau de la moelle. La présente invention permet de remédier à ce problème.
La présente invention décrit en effet une métnode particulièrement efficace pourle transfert sélectif de gènes dans la moelle. La présente invention découle en particulier de la ~7~monetration qu'il est possible de transférer spécifiquement un gène au niveau des motoneurones par ~].~,.n;~ l-on, au niveau du muscle, d'un vecteur adénoviral incorporant ledit gène. En effet, la cl~m~n;e~esse a m~int~n~nt montré que, de manière particulièrement avantageuse, les adénovirus sont absorbés au niveau des jon-~tione ne~u~ sculaires (plaques motrices), et ~-~h~min~s jusqu'aux corps c~ 71~ires desmotoneurones (corne ventrale de la moelle épinière) par transport rétrograde le long des -WO 96/18740 . PCT/FR95/01650 axones motoneuronaux. L'~tlmini~tration ~lL An~,~ea~l~ire de vecteurs adénovi.dux selon l'invention c-netit~-r- ainsi une nouvelle mPthor.e très spérifique d'infection des motoneurones par transport rétrograde, permett~nt de cibler de façon précise l'étage m~.3~ ire sur lequel on désire i,lL~.v~ r en fonction de la lor~lie~tion du Irfl~ e 5 et/ou de la dégénérescence.
Le procédé selon la présente invention est tout particulièl~m~l av~nt~elnc puisqu'il permet, en suivant une carto~rz3rhie précise des jon~ti- ne neu~-..iisct-l~ires, d'infecter de façon spérifique et unilatérale les motonPl~rones des dirréL~,ls étages fonctionnels mé~ ires. Il s'avère de plus beaucoup moins tr~l3m~tique qu'une injection lO stéréotaxique dans le parenchyme mPd11ll~ire, laquelle serait de toutes façons plue diffuse et non restrictive aux motoneurones.
Un premier objet de l'invention réside donc ~lans l'utilisation d'un adénovirus recomhin~nt comprenant dans son ~PnomP un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition ph~rm~cel1tique destinée au tr~nsfert dudit acide 5 nucléique dans les motoneurones m~3l~ ires par ~3~ ion i~lkcLlllusculaire.
Comme indiqué ci-avant, le procédé selon la présente invention est très avantageux puisqu'il permet de cibler préri~r-mPnt les motoneurones de chaque étage fonr,ti0nn~l me~ ire. Ainsi, selon le site de l'altération à traiter, l'~rmini~tration est pratiquée dans un muscle portant une liaison nerveuse avec ledit site. Selon la présente 20 invPnti-n,il est m~int~n~nt possible, par un choix judicieux de diverses injections, d'infecter, de façon spécifique et unilatérale, un grand nombre de motoneurones mer3.l1ll~ires répartis sur les dirrér~ niv~aux. A titre de mode de ré~ ti~-n pl~fer~s, ;n;~ lion dans des ml1~rles des membres supérieurs (biceps, triceps) permet de transférer un gène dans les motoneurones au niveau cervical; l'~-lmini~tration dans des 25 ml1~ du thorax (pectoraux) permet de transférer un gène dans les motoneurones au niveau thoracique; ou encore l'~ l.cl~ion dans des ml1~rles des membres inférieurs (gastrocnémien) permet de transférer un gène dans les motoneurones au niveaux lombaire et sacré. D'autres ml1~r1~ peuv~-ll bien Pnten~ être utilisés pour l'~-lmini~tration au niveau de ces motoneurones, et d'autres motoneurones peuvent 30 é~lemPnt être ciblés. A cet effet, il est possible d'utiliser des cartographies précises des jonrtion.~ neuromusculaires afin de ~ ".;n~r, en fonction de l'étage mi~lllllslire ciblé, le ou les mnsrlPs les plus a~prupLiés pour l'a~ 1ic)n De telles cartographies sont ~ccPs~ihlP~ à l'homme de l'art (voir not~mm~nt Nicholopoulos et al., J. Comp. Neurol.
217, 78-85; Peyronnard et Charon, Exp. Brain Res. 50, 125-132). Selon l'étage WO 96/18740 . PCI~ 'R95/01650 m~ ire qu'il s'avèrera opportun d'il~r~L~ un ou plusieurs m~ lec connus pour être innervés par l'étage en question peuve.lL ainsi être choisis.
L'~ Lion ;nl.n.~ c..l~ire d'adénovirus peut être réalisée de dirréfel-L~s manières. Selon un premier mode de ré~ ti~n, elle est pratiquée par injection en5 plll~iellr.~ points d'un même muscle de façon à concernp-r un très grand nombre de plaques motriceS. Ce mode de r~ tinn est particulii:,~,..en~ ~fflc~ce lorsque le point d'insertion du nerf dans le muscle cnn~itleré n'est pas i(lentifi~hle Lorsque le point d'insertion du nerf est repérable, r~ "n;~ ;on est av~nt~ l~m~nt réalisée par une ou pl1l~ie-~
injections au niveau ou proche(s) dudit point. Selon ce mode de ré~ ti- n, l'effi~ .it~ du 0 L-~lsrel~ est plus grande car une proportion élevée de v~cLe~ .ee est absorbée au niveau de la jonction neuromusculaire.
Dans un premier mode préféré de mise en oeuvre de la présente invention, .aLion intr~ml-~all~ire est réalisée par injections en plusieurs points d'un même muscle.
Dans un autre mode préféré de mise en oeuvre de la présente invention, l'~(~l.";ni~l.a~ion lllL~ all~ire est réalisée par injection(s) au niveau ou proche(s) du point d'insertion du nerf.
Selon un objet particulier, rinvention cnn~rne l'utili.~tinn d'un adénovirus recnmhin~nt comprenant dans son ~.nome un acide nucléique d'intérêt pour la ~r~aL~Lion d'une composition ph~rm~celltique ~ tinée au transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones m~l~ ires cervicaux par aflmini.~tration dans les m~ l~ des membres supérieurs (exemrle biceps, triceps).
Selon un autre objet particulier, l'invention con~erne l'llt~ tion d'un adénovirus rec-~mbin~nt comprenant dans son genome un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition rh~rm~cel~tique (lestinee au transfert dudit acidenucléique dans les motoneurones m~ ires thoraciques par ~mini~tration dans les mn~les du thorax (ex. pectorallx).
Toujours selon un objet particulier, l'invention con~rne l'l~tili~ti-)n d'un adénovirus recomhin~nt COlllpl~l ant dans son ~ nome un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition ph~rm~celltique cle~~nee au transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones m~llll~ires lombaire et/ou sacré par ~mini~tration dans les muscles des membres inférieurs (gastrornemien par exemrle).
La méthode selon l'invention peut être mise en oeuvre en ~lti1i~nt des adénovirus d'origine diverses. Dirr~ L~ sé~Lypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont en effet été car~t~ri~ç~s. Parmi ces séroLypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus l~ de 5 ty-pe 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine ~nim~le (voir (l~m~n~P F~? ~3 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale uh1i~hles dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, m11rine, (exemple:
Mavl, Beard et al., Virology- 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore ~imi~nne (~Yemr1e: SAV). De pl~ri~ ce, radénovirus d'origine animale est un lO adénovirus canin, plus pl~rere"l;e11em~nt un adénovirus CAV2 [souche m~nh~tt~n ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple].
Selon un mode particulier de ré~ ati(m préféré de l'invention, l'adénovirus utilisé
est un adénovirus d'origine h1~m~ine Selon un autre mode avantageux, l'adénovirus est un adénovirus d'origine ~nim~le Le génome des adénovirus comprend not~mment une séquence inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'~n~psitlation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs. Les principaux gènes précoces sont cont~nl1~ dans les régions El, E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région El (Ela et Elb not~mm~nt) sont néc~s~ires à la rép1ic~ti~ n virale. Les régions E4 et L5 par exemple sont elles impliquées dans la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont c~ntçn11~ dans les régions Ll à L5. Les génome de l'adénovirus Ad5 a été
entièrement séquencé et est accessible sur base de rlonnéçs (voir not~mment Genebank M73260). De même des parties, voire la totalité du génome d'adénovirus de sér~Lypes dirr~ Ls (Ad2, Ad7, Adl2, etc) ont éga1em~nt été séqu~-neées. Les vecteurs adénoviraux utilisés pour la mise en oeuvre de la présente invention comprenent les ITR, une séquence permettant l'~ne~r.~i-lation et l'acide nucléique d'intérêt.
Dans un mode de ré~ tion préféré de l'invention, le génome de l'adénovirus utilisé est dépourvu de tout ou partie de la région El. La région El est en effet ~-~sçntielle à la rép1ieation virale et son inactivation conduit à la formation de virus défectifs pour la rép1icatic)n, c'est-à-dire incapables de se répliquer de façon autonome dans les cellules infectées. La région El, ou tout autre région virale considérée, peut être rendue non fonctionnelle par toute technique connue de l'homme du métier, et not~mment par sul)pre~ion totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou WO 96/18740 PCT/1~95/016S0 p~ iel1r~ bases dans le ou les gènes con~ rés. De telles moflifis~tic~n~ peuvent etre obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par tr~item~nt au moyen d'agents mllt~g~n~s Avantagell~em~nt le ~nome de l'adénovirus utilisé est dépourvu d'une partie de la région El correspondant aux résidus 454 à 3328 (fragment PvuII-BglII) ou 382 à 3446 (fragment HinfII-Sau3A).
Selon un mode de ré~ tiQn particulièrement avantageux, le génome de l'adénovirus utilisé est ég~l-?ment dépourvu de tout ou partie de la région E3 et/ou E4. La .lt?m~n~1~resse a .~ nt montré qu'il est possible de construire des vecteurs portant 0 ces dirrer~llLs types de cl~leti~n~. Ces délétions suprlem~nt~ires permettent d'accroitre la sécllrité du vecteur et dl~l1gmenter sa c~p~cité
L'acide nucléique d'intérêt peut être inséré en di~rér~,~L~ sites du génome de l'adénovirus. Avantag~LIselllent, il est inséré au niveau de la région El, E3 ou E4.
Cependant, il est clair que d'autres sites peuv~lll être utilisés. En particulier, l'accès à la séquence nucléotidique du ~ nome permet à l'homme du métier d'i~l~-ntifier ou de créer des sites de restriction utilisables à cet effet.
Les adénovirus rec-~mhin~ntc défectifs selon l'invention pe~lv~"L etre préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent etre pl~pal~s par recombinaison homologue entre un adénovirus et un pl~mi~le portant entre autre la séquence d'ADN d'intéret. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et ~ mille dans une lignée cell~ ire appr~liée. La lignée c~ ire utilisée doit de pl~r~lence (i) etre transformable par lesdits élém~nt.~, et (ii), comporter les séquences c~p~hles de c~mrle."~-"l~ la partie du ~nom~ de l'adénovirus défectif, de pr~r~lence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titred'exemple de lignée, on peut m~ntionner la lignée de rein embryonnaire hllm~in 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient not~mm~nt intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 ~o).
,~ Une première méthode con~i~te à transfecter l'ADN du virus recomhin~nt 30 (défectif) pr~are in vitro ~lans une lignée cellulaire compétente, c'est-à-dire portant en trans toutes les fonctions n~ce~ ires à la complt~-",~?"l;.lion du virus défectif. ~es fone~ti~n.~ sont ~r~Çe~ ;ellem~-nt intégrées dans le génome de la cellule, ce qui réduit les risques de recomhin~ )n, et confère une st~hilité accrue à la lignée cellulaire. Dans le cas CA 02208224 lss7-06-o~
d'adénovirus dans lesquels seule la région El est ~l~fi~ nte, la lignée préférée est la lignée 293.
Une seconde approche consi~Le à co-transfecter dans une lignée c~ ire apppr~priée l'ADN du virus rec~ mhin~nt défectif préparé in vitro et l'ADN d'un ou de 5 plusieurs virus ou pl~cmi~ helper. ~elon cette méthode, il n'est pas n~cçss~ire de disposer d'une lignée c~lh-l~ire comp~ell~e capable de comrl~m~nter toutes les fonctions défectives de l'adénovirus recomhin~nt. Une partie de ces fonctions est en effetcomplfim~ntee par le ou les virus helper. Ce ou ces virus helper sont eux-mêmes défectifs.
Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les ~lçm~n~s n~ FR93/05954 et FR93/08596.
Ensuite, les adénovirus qui se sont mllltipliç,s sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie mol~c~ ire, comme illustré dans les e~mplçs.
Pour leur utilisation selon la présente invention, les adénovirus sont ~l~fé.~ iellement associés à un ou des véhicules ph~rm~ceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, pot~s.sil1m, calcium ou m~gn~sillm, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, not~mm~nt lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau st~rili~ee ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses de virus lltilisé~s pour mini.stration peuvent être ~ptées en fonction de (liCîérell~ paramètres, et not~mm~nt en fonction du site (muscle) d'~fl. ~ lion considéré, du nombre d'injections, du gène à
exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recomhin~nt.s selon l'invention sont formlll~s et ~ s sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu, et de pl~rellce 106 à 101~ pfu. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appl~Liée, et mesure, génér~lement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de ~l~termin~tion du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Le procédé selon la présente invention est particulièrement avantageux pour le traitement des tr~-lm~tismes m~ ires ou des maladies de dégénérescence motoneuronale. Les tr~llm~tism~s m~lllll~ires correspondent plus particulièrement à des sections au niveau des motoneurones qui les privent de leurs afférences provenant des WO 96/18740 Pcr/FR9~/01650 centres supérieurs et entrainent leur ~légPnPrPsGen~-p~ Le transfert de gènes codant des facteurs de cn~ nre dans les moluneur~nes sous lPci~nnPlc par transport rétrograde selon l'invention offre ~ n~l~l la po.scihilité de réduire voire empêcher cette dégénérescence. S'~ice~nt de nellrop~l~lies du motoneurone, on peut citer par exemple la sclérose latérale alllyoko~hique~ les alllyoll~phies spin~lPs de type I (m~ lie de Werdnig Hoffman) de ty-pe II ou III (m~ ie de Kugelberg-Welander), les al~ly~ko~hies spin~lPe bulbaires (telles que la m~ lie de Kennedy). Le transfert de gènes codant pour des facteurs de cru;~s~i-re ou autres moléc~ ,e c-)nnlles pour exercer un effet neu~olr(~phique sur le motoneurone en dégénérescen~e selon la présente invention offre é~l~m~nt une nouvelle voie pour le k~ilel-,ent de ce ty-pe de pathologies. L'Pffi~rité du procédé de l'invention peut en particulier être mise en évidence sur modèle ~nim~l1x:
modèle de section partielle ou complète de la moelle épinière, souris Wobbler (modèle animal d'étude de la sclérose latérale anly~,lrupl~ique (T eP,stm~ J. E., Am. J. Pathol., 100, 821-824)); souris mnd ("motoneurone degeneration": modèle animal d'étude de la sclérose latérale a,llyollu~l~ique (Messer et al., 1992, GPnomies, 18, 797-802)) ou souris pmn ("progressive motoneurone ne~uop~ y'': modèle animal d'étude de la dégénérescence motoneuronale lors du développement), comme illustré dans les PxemrlPe L'incorporation, la tolérance et l'inocuité pour rhomme peuvent être testés sur des modèles in vitro de culture de neurones m~ ires embryonnaires hllm~ine.
A cet égard, l'acide nucléique d'intérêt incorporé dans les vecteurs adénovirauxselon l'invention code ~ rélt?llliellPment pour une substance neuroactive, c'est-à-dire capable d'exercer un effet bénéfique sur les cellules nerveuses. Il peut s'agir d'une sllhst~n~e capable de compenser un déficit en ou de réduire un excès d'une sllh.st~n~e endogène, ou ég~lçm~nt d'une ~lhst~nce conférant aux cellules des propriétés nouvelles.
Il peut s'agir plus particuliè~ ~lll d'un facteur de croie.e~nr,e, d'un facteur neun~kophique~ d'une c-ytokine, d'un neurukansllletteur ou encore d'une enzyme, ou d'un récepteur de neur~.ailsmetteur ou d'hormone.
Pl~rélel-l;PllPmçnt parmi les facteurs de croies~nre, on peut citer les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, GM-CSF, M-CSF, CSF, etc), ou les facteurs de croies~nre des fibroblastes (FGFa, FGFb) ou des cellules vasculaires (VEGF). Parmi les facteurs neurotrophiques, les facteurs préférés sont notamment le facteur neulul.ophique ciliaire (CNTF), les facteurs de maturation des cellules gliales (GMFa,b) le GDNF, le BDNF, le NT3, le NT5, etc. Les cytokines préférées sont les interleukines et les~ elrér~ns et, parmi les enzymes, on utilise pr~ri~ iellement les enzymes de 3~ biosyntnèse de neuruk~lsmetteurs (tyrosine hy~u~ylase, acétyl choline transférase, CA 02208224 1997-06-0~
Wo 96/18740 Pcr~R95/01650 glutamic acide décarboxylase), les enzymes ly~os~ e (héxos~mini-3~eee, arylsulfatase, glucocérébrosidase, HGPRT), les enzymes impliqués dans la détoxification des radicaux libres (superoxyde tliemut~ee I, II ou III, c~t~l~ee, gluthation peroxydase). Parmi les récepteurs, on utilisera entre autres les réc~euls aux androgènes (impliqués dans la 5 m~ ie de Kennedy).
Ces dirré ~ll~ f~ctel-r.e peuvent être utilisés sous forme native, ou sous forme de variant ou fragment ayant une activité de même type.
Il est également possible de transférer des séquences ~ntieene L'acide nucléique peut être d'origine naturelle ou artificielle. Il peut s'agir 0 notamment d'ADN génomique (ADNg), d'ADN complémentaire (ADNc), de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Il peut être d'origine hum~in~, ~nim~le, végétale, bac-teri~nne, virale, etc. Il peut être obtenu par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, parsynthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes in~ nt la modification chimique 15 ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Il s'agit préférentiellement d'ADNc ou d'ADNg.
Généralement, l'acide nucléique comprend ég~l~m~nt une région promotrice de la transcription foncti~nnelle dans les motoneurones, ainsi qu'une région située en 3' du gène d'intérêt, et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de 20 polyadénylation. L'ensemble de ces ~l~m~nte con~tit~le la cassette d'expression.
Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de régions d'origine dirfé~ L~ (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques).
25 Not~mment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du ~nome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes ElA, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces régions promotrices 30 peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire (promoteurs GFAP, enolase, etc). Par ailleurs, lorsque l'acide nucléique hétérologue ne comporte pas de séquences promotrices, il peut être inséré dans le génome du virus en aval d'une telle séquence.
WO 96/18740 PCT/FRg5/01650 La présente invention a e~,ql~mPnt pour objet une méthode pour le transfert d'acides nucléiques d,qns les motoneurones co~ nant l'~-lr";n;~l~dLion musculaire d'un vecteur adénoviral incoporant ledit acide ntlclPiqlue dans son génome. ~rc~ .mçnt la méthode selon l'invention est réalisée par injechon(s) en plusieurs points d'un même 5 muscle ou, lorsque le point ~l'insellion du nerf est repérable, par une ou plusieurs injections au niveau ou proche(s) dudit point.
La pf~sen~e invention sera décrite plus en détail à l'aide des e~.~.mples qui suivent, qui doivent être c~onxitlPrés comme illi-.~;l- ,rl;rx et non l;~ rl;l' L~ende des fi~ures 10 F~GURE 1 (PHOTO A):
Marquage ~-Galacto.~ l,qxe de coupes lon~ittl-iin,qles (50 !lm) de moelle épinière de rat au niveau lombaire, après injection il~ ire d'adénovirus 13-G,ql,qct~ lq~e dans le muscle gastro~némien.
- marquage diffus de nombreux corps cellulaires motoneuronaux (/\).
5 - marquage plus intense de quelques motoneurones au niveau du corps cellulaire et des neurites, mettant en évidence la morphologie typique des motoneurones (--).
F~GURE 2 (PHOTO B): idem A, grQxxi.~ix~ supérieur.
Marquage ~ G,ql l;tosi(1,qxe de coupes lon~ihl-lin,qk~-~ (50 ~lm) de moelle épinière de rat au niveau lombaire, après injection "~ cul,qire d'adénovirus ~3-Galactosidase 20 dans le muscle gastrocnémien.
F~GURE 3 (PHOTO C):
Co-marquage ~3-G,ql,qcto.~ fq~e-Tmmlmocytochimie "C,qkit-)nin Gene Related Peptide" (CGRP) de coupes lonEih~ in,qles (50 ~m) de moelle épinière de rat au niveau lombaire, après injection i,~ "~ ire d'adénovirus B-Gal,qr,to~ ,q.ce dans le muscle 25 gastro~némi~n.
Exemples 1. Injection de l'adénovirus b-Galactosidase dans le muscle gastrocnémien chez le rat intact ou chez le rat ayant subi une hémisection thoracique de la moelle épinière.
CA 02208224 lss7-06-o~
Wo 96/18740 PCT/FR95/01650 Cet exemple décrit le transfert du gène b-gal au niveau des motoneurones lombaires par ~minietration dans le muscle gastr~n~-mi~-n d'un adénovirus incorporant ledit gène.
Plus particulièrement, l'étude a été réalisée sur un modèle de section partielle ou 5 complète de la moelle épinière de rat pratiquée au niveau thoracique bas ayant pour effet de paralyser l'animal pour l'un ou ses deux membres inférieurs. Une telle section prive les motoneurones de leurs afférences provenant des centres supérieurs et en entr~in~ la dégénér~ecen~e. L'~tlmini~tration a été réalisée de manière à infecter les motoneurones sous lçeionnel~ par transport rétrograde.
Le vecteur adénoviral utilisé dans cet ex~mrle est le vecteur Ad.RSV.~gal. Ce vecteur est dépourvu des séquences nécessaires à sa réplication, mais comporte néanmoins les séquences néce~s~ires pour pénétrer dans les cellules infectables par celui-ci ainsi que l'~-n~emhle des séquences essentiell~s n~cee~ires à l'~ne~r~ ti-)n de cet adénovirus. Il porte é~lçment, sous le controle du promoteur RSV, le gène de la ~
15 g~l~cto,si~l~ee de E.coli. La construction de l'adénovirus recomhin~nt défectif Ad.RSV~3gal a été décrite dans la liliéL~Lu~ (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest.
90 (1992) 626). Brièvement, l'adénovirus Ad.RSVbGal est un adénovirus recombinant défectif (délété des régions E1 et E3 ) obtenu par recomhin~i.eon homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dl324 (Thimm~rpaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le 20 pl~mi~le pAd.RSVbGal (Akli et al. 1993).
Le pl~micie pAd.RSVbGal contient, dans l'orient~ti~n 5'->3~, - le fragment PvuII correspondant à l'e~e~ gauche de l'adénovirus Ad5 co.5l5~ nant: la séquence ITR, l'origine de réplication, les signaux d'~n~ps~ tion et l'~mplifi~t~ur ElA;
- le gène codant pour la b-g~l~cto~ e sous le contrôle du promoteur RSV
(du virus du sarcome de Rous), - un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue entre le pl~cmi~ pAd.RSVbGal et l'adénovirus dl324.
Après liné~ri~tion par l'enzyrne ClaI, le pl~mi~l~ pAd.RSVbGal et l'adénovirus dl324 sont co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosrh~te de calcium pour permettre la recombinaison homologue. I,es adénovirus rec- mhin~nt.~ ainsi générés sont sélectionnés par pl~rifi~tion sur plaque. Après isolem~nt l'ADN de l'adénovirus rec-~mhin~nt est ~mplifié dans la lignée celll-l~ire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture conten~nt l'adénovirus défectif rec-mhin~nt non purifié ayant un titre d'environ 101~ pfu/ml. Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient Wo 96/18740 Pcr/FR9S/01650 de chlorure de césium selon les techniques c~nmles (voir not~mm~nt Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus a ensuite été utilisé sous forme purifiée dans une solution saline phosphate (PBS).
Trois injections d'adénovirus Ad-RSV-b-Gal (107 pfu par injection) ont été
5 pratiquées dans le muscle gastro~n~-mi~-n, juste après que ranimal ait subi (ou pas) une h~mi.eectic)n de la moelle épinière (niveau thoracique bas, ayant pour effet de paralyser l'animal pour l'un de ses membres i lré,ie~). 9 ,ul d'adén~viLus sont injectés par point d'injection à la seringue ~milton Les ~nim~llx ont été s~crifi~.s (perfusion 4~o pa,~ çhyde) quatre jours après lo injection, temps l..;ll;,-....-~ pour que le transport rétrograde s'effectue du muscle à la moelle épinière. Trois blocs de moelle épinière ont été coupés longit~lAin~lement aux niveaux cervical, thoracique et lombaire, en coupes de 50 mM d'épaisseur. Les coupes ont été traitées pour la révélation de la 13-G~l~ctQ.ei~l~ee p~rm~tt~nt de mettre en évidence les cellules ayant été infectées par le virus. Certaines coupes ont de plus subi une 5 immlmQcytochimie anti-"C~lcitonin Gene Related Peptide" (CGRP), p~rmett~nt de marquer spe~ifiquement les motoneurones.
La ~-Galactosidase a été révélée à partir de son substrat, le X-Gal, et le produit de la réaction donne une coloration bleue.
Le "C~lcit )nin Gene Related Peptide", CGRP, est un neurotransmetteur, 20 marqueur spé~ifique des motoneurones. Il est révélé par imm1ln~cytQf~himi~ avec un anticorps secondaire couplé à la péroxidase et comme substrat de l'enzyme la diaminob~n7i~in~; le produit de la réaction donne une coloration marron.
La révélation de la b-G~l~ctosi~ e a permis de mettre en évidence la présence demotoneurones infectés, exclusivement au niveau lombaire, sous le~ionntq.l dans le cas des 2s rats hémi~ectionnés, et du coté correspondant à l'injection.
Deux types de marquage ont été obtenus, un marquage diffus du corps c~ ire d'un grand nombre de motoneurones, et un marquage plus intense du corps c~ ire et des neurites d'un nombre plus limité de motoneurones (photos A et B). Cette différence d'int~n~ité de marquage est prob~hlçm~nt due au fait que se~ m~-nt quelques 30 motoneurones, très proches du site d'injection, ont pu absorber le virus de fac~on int~n~e L'immnn-~cytQchimie anti-CGRP couplée à la révélation b-G~l~ctosi~ e a permis de mettre en évidence par une double coloration que la quasi totalité des corps c~ ires CGRP positifs (i.e. motoneurones) étaient infectés par le virus (photo C).
La thérapie génique et 1'1-tili.e~ti-)n de virus mc~lifi~s comme vecteurs pour les m~l~rlies neurodégénératives c--n~it~lent des nouvelles approches thérapeutiquesparticulièrement promotteuses. Parmi les vi~s utilisés à cet effet dans l'art antérieur, on lo peut citer en particulier les adénovirus (Le Gal La Salle et al., Science 259, 988-990), les virus de l'herpès, les virus adéno-associés et les ~ vir~ls. Les études ~léçrit~s dans l'art antérieur montrent que ces vecteurs, et en particulier les adénovirus, sont c~r~hles d'infecter avec une très grande efficacité les cellules du système nerveux central. Ces résultats permettent ainsi de mettre au point des méthodes de traitement des pathologies 15 du système nerveux central par injection directe au niveau du système ne~ ux central (en particulier par stéréotaxie) d'adénovirus recomhin~nt.e comprenant un gène thérapeutique.
Concernant la moelle épinière, dans le cadre de certaines m~ s neurodégénératives ou de tr~llm~tiemes~ la thérapie génique pourrait également 20 permettre de lutter contre la dégénérescence des neurones moteurs (motoneurones) en apportant certains gènes codant par exemple pour des facteurs de croiee~n~e.
Né~nmoine, ces applications sont encore limitées par l'~hs~nce de méthode simplepermettant de transférer spécifiquement un gène au niveau de la moelle. La présente invention permet de remédier à ce problème.
La présente invention décrit en effet une métnode particulièrement efficace pourle transfert sélectif de gènes dans la moelle. La présente invention découle en particulier de la ~7~monetration qu'il est possible de transférer spécifiquement un gène au niveau des motoneurones par ~].~,.n;~ l-on, au niveau du muscle, d'un vecteur adénoviral incorporant ledit gène. En effet, la cl~m~n;e~esse a m~int~n~nt montré que, de manière particulièrement avantageuse, les adénovirus sont absorbés au niveau des jon-~tione ne~u~ sculaires (plaques motrices), et ~-~h~min~s jusqu'aux corps c~ 71~ires desmotoneurones (corne ventrale de la moelle épinière) par transport rétrograde le long des -WO 96/18740 . PCT/FR95/01650 axones motoneuronaux. L'~tlmini~tration ~lL An~,~ea~l~ire de vecteurs adénovi.dux selon l'invention c-netit~-r- ainsi une nouvelle mPthor.e très spérifique d'infection des motoneurones par transport rétrograde, permett~nt de cibler de façon précise l'étage m~.3~ ire sur lequel on désire i,lL~.v~ r en fonction de la lor~lie~tion du Irfl~ e 5 et/ou de la dégénérescence.
Le procédé selon la présente invention est tout particulièl~m~l av~nt~elnc puisqu'il permet, en suivant une carto~rz3rhie précise des jon~ti- ne neu~-..iisct-l~ires, d'infecter de façon spérifique et unilatérale les motonPl~rones des dirréL~,ls étages fonctionnels mé~ ires. Il s'avère de plus beaucoup moins tr~l3m~tique qu'une injection lO stéréotaxique dans le parenchyme mPd11ll~ire, laquelle serait de toutes façons plue diffuse et non restrictive aux motoneurones.
Un premier objet de l'invention réside donc ~lans l'utilisation d'un adénovirus recomhin~nt comprenant dans son ~PnomP un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition ph~rm~cel1tique destinée au tr~nsfert dudit acide 5 nucléique dans les motoneurones m~3l~ ires par ~3~ ion i~lkcLlllusculaire.
Comme indiqué ci-avant, le procédé selon la présente invention est très avantageux puisqu'il permet de cibler préri~r-mPnt les motoneurones de chaque étage fonr,ti0nn~l me~ ire. Ainsi, selon le site de l'altération à traiter, l'~rmini~tration est pratiquée dans un muscle portant une liaison nerveuse avec ledit site. Selon la présente 20 invPnti-n,il est m~int~n~nt possible, par un choix judicieux de diverses injections, d'infecter, de façon spécifique et unilatérale, un grand nombre de motoneurones mer3.l1ll~ires répartis sur les dirrér~ niv~aux. A titre de mode de ré~ ti~-n pl~fer~s, ;n;~ lion dans des ml1~rles des membres supérieurs (biceps, triceps) permet de transférer un gène dans les motoneurones au niveau cervical; l'~-lmini~tration dans des 25 ml1~ du thorax (pectoraux) permet de transférer un gène dans les motoneurones au niveau thoracique; ou encore l'~ l.cl~ion dans des ml1~rles des membres inférieurs (gastrocnémien) permet de transférer un gène dans les motoneurones au niveaux lombaire et sacré. D'autres ml1~r1~ peuv~-ll bien Pnten~ être utilisés pour l'~-lmini~tration au niveau de ces motoneurones, et d'autres motoneurones peuvent 30 é~lemPnt être ciblés. A cet effet, il est possible d'utiliser des cartographies précises des jonrtion.~ neuromusculaires afin de ~ ".;n~r, en fonction de l'étage mi~lllllslire ciblé, le ou les mnsrlPs les plus a~prupLiés pour l'a~ 1ic)n De telles cartographies sont ~ccPs~ihlP~ à l'homme de l'art (voir not~mm~nt Nicholopoulos et al., J. Comp. Neurol.
217, 78-85; Peyronnard et Charon, Exp. Brain Res. 50, 125-132). Selon l'étage WO 96/18740 . PCI~ 'R95/01650 m~ ire qu'il s'avèrera opportun d'il~r~L~ un ou plusieurs m~ lec connus pour être innervés par l'étage en question peuve.lL ainsi être choisis.
L'~ Lion ;nl.n.~ c..l~ire d'adénovirus peut être réalisée de dirréfel-L~s manières. Selon un premier mode de ré~ ti~n, elle est pratiquée par injection en5 plll~iellr.~ points d'un même muscle de façon à concernp-r un très grand nombre de plaques motriceS. Ce mode de r~ tinn est particulii:,~,..en~ ~fflc~ce lorsque le point d'insertion du nerf dans le muscle cnn~itleré n'est pas i(lentifi~hle Lorsque le point d'insertion du nerf est repérable, r~ "n;~ ;on est av~nt~ l~m~nt réalisée par une ou pl1l~ie-~
injections au niveau ou proche(s) dudit point. Selon ce mode de ré~ ti- n, l'effi~ .it~ du 0 L-~lsrel~ est plus grande car une proportion élevée de v~cLe~ .ee est absorbée au niveau de la jonction neuromusculaire.
Dans un premier mode préféré de mise en oeuvre de la présente invention, .aLion intr~ml-~all~ire est réalisée par injections en plusieurs points d'un même muscle.
Dans un autre mode préféré de mise en oeuvre de la présente invention, l'~(~l.";ni~l.a~ion lllL~ all~ire est réalisée par injection(s) au niveau ou proche(s) du point d'insertion du nerf.
Selon un objet particulier, rinvention cnn~rne l'utili.~tinn d'un adénovirus recnmhin~nt comprenant dans son ~.nome un acide nucléique d'intérêt pour la ~r~aL~Lion d'une composition ph~rm~celltique ~ tinée au transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones m~l~ ires cervicaux par aflmini.~tration dans les m~ l~ des membres supérieurs (exemrle biceps, triceps).
Selon un autre objet particulier, l'invention con~erne l'llt~ tion d'un adénovirus rec-~mbin~nt comprenant dans son genome un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition rh~rm~cel~tique (lestinee au transfert dudit acidenucléique dans les motoneurones m~ ires thoraciques par ~mini~tration dans les mn~les du thorax (ex. pectorallx).
Toujours selon un objet particulier, l'invention con~rne l'l~tili~ti-)n d'un adénovirus recomhin~nt COlllpl~l ant dans son ~ nome un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition ph~rm~celltique cle~~nee au transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones m~llll~ires lombaire et/ou sacré par ~mini~tration dans les muscles des membres inférieurs (gastrornemien par exemrle).
La méthode selon l'invention peut être mise en oeuvre en ~lti1i~nt des adénovirus d'origine diverses. Dirr~ L~ sé~Lypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont en effet été car~t~ri~ç~s. Parmi ces séroLypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus l~ de 5 ty-pe 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine ~nim~le (voir (l~m~n~P F~? ~3 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale uh1i~hles dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, m11rine, (exemple:
Mavl, Beard et al., Virology- 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore ~imi~nne (~Yemr1e: SAV). De pl~ri~ ce, radénovirus d'origine animale est un lO adénovirus canin, plus pl~rere"l;e11em~nt un adénovirus CAV2 [souche m~nh~tt~n ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple].
Selon un mode particulier de ré~ ati(m préféré de l'invention, l'adénovirus utilisé
est un adénovirus d'origine h1~m~ine Selon un autre mode avantageux, l'adénovirus est un adénovirus d'origine ~nim~le Le génome des adénovirus comprend not~mment une séquence inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'~n~psitlation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs. Les principaux gènes précoces sont cont~nl1~ dans les régions El, E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région El (Ela et Elb not~mm~nt) sont néc~s~ires à la rép1ic~ti~ n virale. Les régions E4 et L5 par exemple sont elles impliquées dans la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont c~ntçn11~ dans les régions Ll à L5. Les génome de l'adénovirus Ad5 a été
entièrement séquencé et est accessible sur base de rlonnéçs (voir not~mment Genebank M73260). De même des parties, voire la totalité du génome d'adénovirus de sér~Lypes dirr~ Ls (Ad2, Ad7, Adl2, etc) ont éga1em~nt été séqu~-neées. Les vecteurs adénoviraux utilisés pour la mise en oeuvre de la présente invention comprenent les ITR, une séquence permettant l'~ne~r.~i-lation et l'acide nucléique d'intérêt.
Dans un mode de ré~ tion préféré de l'invention, le génome de l'adénovirus utilisé est dépourvu de tout ou partie de la région El. La région El est en effet ~-~sçntielle à la rép1ieation virale et son inactivation conduit à la formation de virus défectifs pour la rép1icatic)n, c'est-à-dire incapables de se répliquer de façon autonome dans les cellules infectées. La région El, ou tout autre région virale considérée, peut être rendue non fonctionnelle par toute technique connue de l'homme du métier, et not~mment par sul)pre~ion totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou WO 96/18740 PCT/1~95/016S0 p~ iel1r~ bases dans le ou les gènes con~ rés. De telles moflifis~tic~n~ peuvent etre obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par tr~item~nt au moyen d'agents mllt~g~n~s Avantagell~em~nt le ~nome de l'adénovirus utilisé est dépourvu d'une partie de la région El correspondant aux résidus 454 à 3328 (fragment PvuII-BglII) ou 382 à 3446 (fragment HinfII-Sau3A).
Selon un mode de ré~ tiQn particulièrement avantageux, le génome de l'adénovirus utilisé est ég~l-?ment dépourvu de tout ou partie de la région E3 et/ou E4. La .lt?m~n~1~resse a .~ nt montré qu'il est possible de construire des vecteurs portant 0 ces dirrer~llLs types de cl~leti~n~. Ces délétions suprlem~nt~ires permettent d'accroitre la sécllrité du vecteur et dl~l1gmenter sa c~p~cité
L'acide nucléique d'intérêt peut être inséré en di~rér~,~L~ sites du génome de l'adénovirus. Avantag~LIselllent, il est inséré au niveau de la région El, E3 ou E4.
Cependant, il est clair que d'autres sites peuv~lll être utilisés. En particulier, l'accès à la séquence nucléotidique du ~ nome permet à l'homme du métier d'i~l~-ntifier ou de créer des sites de restriction utilisables à cet effet.
Les adénovirus rec-~mhin~ntc défectifs selon l'invention pe~lv~"L etre préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent etre pl~pal~s par recombinaison homologue entre un adénovirus et un pl~mi~le portant entre autre la séquence d'ADN d'intéret. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et ~ mille dans une lignée cell~ ire appr~liée. La lignée c~ ire utilisée doit de pl~r~lence (i) etre transformable par lesdits élém~nt.~, et (ii), comporter les séquences c~p~hles de c~mrle."~-"l~ la partie du ~nom~ de l'adénovirus défectif, de pr~r~lence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titred'exemple de lignée, on peut m~ntionner la lignée de rein embryonnaire hllm~in 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient not~mm~nt intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 ~o).
,~ Une première méthode con~i~te à transfecter l'ADN du virus recomhin~nt 30 (défectif) pr~are in vitro ~lans une lignée cellulaire compétente, c'est-à-dire portant en trans toutes les fonctions n~ce~ ires à la complt~-",~?"l;.lion du virus défectif. ~es fone~ti~n.~ sont ~r~Çe~ ;ellem~-nt intégrées dans le génome de la cellule, ce qui réduit les risques de recomhin~ )n, et confère une st~hilité accrue à la lignée cellulaire. Dans le cas CA 02208224 lss7-06-o~
d'adénovirus dans lesquels seule la région El est ~l~fi~ nte, la lignée préférée est la lignée 293.
Une seconde approche consi~Le à co-transfecter dans une lignée c~ ire apppr~priée l'ADN du virus rec~ mhin~nt défectif préparé in vitro et l'ADN d'un ou de 5 plusieurs virus ou pl~cmi~ helper. ~elon cette méthode, il n'est pas n~cçss~ire de disposer d'une lignée c~lh-l~ire comp~ell~e capable de comrl~m~nter toutes les fonctions défectives de l'adénovirus recomhin~nt. Une partie de ces fonctions est en effetcomplfim~ntee par le ou les virus helper. Ce ou ces virus helper sont eux-mêmes défectifs.
Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les ~lçm~n~s n~ FR93/05954 et FR93/08596.
Ensuite, les adénovirus qui se sont mllltipliç,s sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie mol~c~ ire, comme illustré dans les e~mplçs.
Pour leur utilisation selon la présente invention, les adénovirus sont ~l~fé.~ iellement associés à un ou des véhicules ph~rm~ceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, pot~s.sil1m, calcium ou m~gn~sillm, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, not~mm~nt lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau st~rili~ee ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses de virus lltilisé~s pour mini.stration peuvent être ~ptées en fonction de (liCîérell~ paramètres, et not~mm~nt en fonction du site (muscle) d'~fl. ~ lion considéré, du nombre d'injections, du gène à
exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recomhin~nt.s selon l'invention sont formlll~s et ~ s sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu, et de pl~rellce 106 à 101~ pfu. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appl~Liée, et mesure, génér~lement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de ~l~termin~tion du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Le procédé selon la présente invention est particulièrement avantageux pour le traitement des tr~-lm~tismes m~ ires ou des maladies de dégénérescence motoneuronale. Les tr~llm~tism~s m~lllll~ires correspondent plus particulièrement à des sections au niveau des motoneurones qui les privent de leurs afférences provenant des WO 96/18740 Pcr/FR9~/01650 centres supérieurs et entrainent leur ~légPnPrPsGen~-p~ Le transfert de gènes codant des facteurs de cn~ nre dans les moluneur~nes sous lPci~nnPlc par transport rétrograde selon l'invention offre ~ n~l~l la po.scihilité de réduire voire empêcher cette dégénérescence. S'~ice~nt de nellrop~l~lies du motoneurone, on peut citer par exemple la sclérose latérale alllyoko~hique~ les alllyoll~phies spin~lPs de type I (m~ lie de Werdnig Hoffman) de ty-pe II ou III (m~ ie de Kugelberg-Welander), les al~ly~ko~hies spin~lPe bulbaires (telles que la m~ lie de Kennedy). Le transfert de gènes codant pour des facteurs de cru;~s~i-re ou autres moléc~ ,e c-)nnlles pour exercer un effet neu~olr(~phique sur le motoneurone en dégénérescen~e selon la présente invention offre é~l~m~nt une nouvelle voie pour le k~ilel-,ent de ce ty-pe de pathologies. L'Pffi~rité du procédé de l'invention peut en particulier être mise en évidence sur modèle ~nim~l1x:
modèle de section partielle ou complète de la moelle épinière, souris Wobbler (modèle animal d'étude de la sclérose latérale anly~,lrupl~ique (T eP,stm~ J. E., Am. J. Pathol., 100, 821-824)); souris mnd ("motoneurone degeneration": modèle animal d'étude de la sclérose latérale a,llyollu~l~ique (Messer et al., 1992, GPnomies, 18, 797-802)) ou souris pmn ("progressive motoneurone ne~uop~ y'': modèle animal d'étude de la dégénérescence motoneuronale lors du développement), comme illustré dans les PxemrlPe L'incorporation, la tolérance et l'inocuité pour rhomme peuvent être testés sur des modèles in vitro de culture de neurones m~ ires embryonnaires hllm~ine.
A cet égard, l'acide nucléique d'intérêt incorporé dans les vecteurs adénovirauxselon l'invention code ~ rélt?llliellPment pour une substance neuroactive, c'est-à-dire capable d'exercer un effet bénéfique sur les cellules nerveuses. Il peut s'agir d'une sllhst~n~e capable de compenser un déficit en ou de réduire un excès d'une sllh.st~n~e endogène, ou ég~lçm~nt d'une ~lhst~nce conférant aux cellules des propriétés nouvelles.
Il peut s'agir plus particuliè~ ~lll d'un facteur de croie.e~nr,e, d'un facteur neun~kophique~ d'une c-ytokine, d'un neurukansllletteur ou encore d'une enzyme, ou d'un récepteur de neur~.ailsmetteur ou d'hormone.
Pl~rélel-l;PllPmçnt parmi les facteurs de croies~nre, on peut citer les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, GM-CSF, M-CSF, CSF, etc), ou les facteurs de croies~nre des fibroblastes (FGFa, FGFb) ou des cellules vasculaires (VEGF). Parmi les facteurs neurotrophiques, les facteurs préférés sont notamment le facteur neulul.ophique ciliaire (CNTF), les facteurs de maturation des cellules gliales (GMFa,b) le GDNF, le BDNF, le NT3, le NT5, etc. Les cytokines préférées sont les interleukines et les~ elrér~ns et, parmi les enzymes, on utilise pr~ri~ iellement les enzymes de 3~ biosyntnèse de neuruk~lsmetteurs (tyrosine hy~u~ylase, acétyl choline transférase, CA 02208224 1997-06-0~
Wo 96/18740 Pcr~R95/01650 glutamic acide décarboxylase), les enzymes ly~os~ e (héxos~mini-3~eee, arylsulfatase, glucocérébrosidase, HGPRT), les enzymes impliqués dans la détoxification des radicaux libres (superoxyde tliemut~ee I, II ou III, c~t~l~ee, gluthation peroxydase). Parmi les récepteurs, on utilisera entre autres les réc~euls aux androgènes (impliqués dans la 5 m~ ie de Kennedy).
Ces dirré ~ll~ f~ctel-r.e peuvent être utilisés sous forme native, ou sous forme de variant ou fragment ayant une activité de même type.
Il est également possible de transférer des séquences ~ntieene L'acide nucléique peut être d'origine naturelle ou artificielle. Il peut s'agir 0 notamment d'ADN génomique (ADNg), d'ADN complémentaire (ADNc), de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Il peut être d'origine hum~in~, ~nim~le, végétale, bac-teri~nne, virale, etc. Il peut être obtenu par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, parsynthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes in~ nt la modification chimique 15 ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Il s'agit préférentiellement d'ADNc ou d'ADNg.
Généralement, l'acide nucléique comprend ég~l~m~nt une région promotrice de la transcription foncti~nnelle dans les motoneurones, ainsi qu'une région située en 3' du gène d'intérêt, et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de 20 polyadénylation. L'ensemble de ces ~l~m~nte con~tit~le la cassette d'expression.
Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de régions d'origine dirfé~ L~ (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques).
25 Not~mment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du ~nome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes ElA, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces régions promotrices 30 peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire (promoteurs GFAP, enolase, etc). Par ailleurs, lorsque l'acide nucléique hétérologue ne comporte pas de séquences promotrices, il peut être inséré dans le génome du virus en aval d'une telle séquence.
WO 96/18740 PCT/FRg5/01650 La présente invention a e~,ql~mPnt pour objet une méthode pour le transfert d'acides nucléiques d,qns les motoneurones co~ nant l'~-lr";n;~l~dLion musculaire d'un vecteur adénoviral incoporant ledit acide ntlclPiqlue dans son génome. ~rc~ .mçnt la méthode selon l'invention est réalisée par injechon(s) en plusieurs points d'un même 5 muscle ou, lorsque le point ~l'insellion du nerf est repérable, par une ou plusieurs injections au niveau ou proche(s) dudit point.
La pf~sen~e invention sera décrite plus en détail à l'aide des e~.~.mples qui suivent, qui doivent être c~onxitlPrés comme illi-.~;l- ,rl;rx et non l;~ rl;l' L~ende des fi~ures 10 F~GURE 1 (PHOTO A):
Marquage ~-Galacto.~ l,qxe de coupes lon~ittl-iin,qles (50 !lm) de moelle épinière de rat au niveau lombaire, après injection il~ ire d'adénovirus 13-G,ql,qct~ lq~e dans le muscle gastro~némien.
- marquage diffus de nombreux corps cellulaires motoneuronaux (/\).
5 - marquage plus intense de quelques motoneurones au niveau du corps cellulaire et des neurites, mettant en évidence la morphologie typique des motoneurones (--).
F~GURE 2 (PHOTO B): idem A, grQxxi.~ix~ supérieur.
Marquage ~ G,ql l;tosi(1,qxe de coupes lon~ihl-lin,qk~-~ (50 ~lm) de moelle épinière de rat au niveau lombaire, après injection "~ cul,qire d'adénovirus ~3-Galactosidase 20 dans le muscle gastrocnémien.
F~GURE 3 (PHOTO C):
Co-marquage ~3-G,ql,qcto.~ fq~e-Tmmlmocytochimie "C,qkit-)nin Gene Related Peptide" (CGRP) de coupes lonEih~ in,qles (50 ~m) de moelle épinière de rat au niveau lombaire, après injection i,~ "~ ire d'adénovirus B-Gal,qr,to~ ,q.ce dans le muscle 25 gastro~némi~n.
Exemples 1. Injection de l'adénovirus b-Galactosidase dans le muscle gastrocnémien chez le rat intact ou chez le rat ayant subi une hémisection thoracique de la moelle épinière.
CA 02208224 lss7-06-o~
Wo 96/18740 PCT/FR95/01650 Cet exemple décrit le transfert du gène b-gal au niveau des motoneurones lombaires par ~minietration dans le muscle gastr~n~-mi~-n d'un adénovirus incorporant ledit gène.
Plus particulièrement, l'étude a été réalisée sur un modèle de section partielle ou 5 complète de la moelle épinière de rat pratiquée au niveau thoracique bas ayant pour effet de paralyser l'animal pour l'un ou ses deux membres inférieurs. Une telle section prive les motoneurones de leurs afférences provenant des centres supérieurs et en entr~in~ la dégénér~ecen~e. L'~tlmini~tration a été réalisée de manière à infecter les motoneurones sous lçeionnel~ par transport rétrograde.
Le vecteur adénoviral utilisé dans cet ex~mrle est le vecteur Ad.RSV.~gal. Ce vecteur est dépourvu des séquences nécessaires à sa réplication, mais comporte néanmoins les séquences néce~s~ires pour pénétrer dans les cellules infectables par celui-ci ainsi que l'~-n~emhle des séquences essentiell~s n~cee~ires à l'~ne~r~ ti-)n de cet adénovirus. Il porte é~lçment, sous le controle du promoteur RSV, le gène de la ~
15 g~l~cto,si~l~ee de E.coli. La construction de l'adénovirus recomhin~nt défectif Ad.RSV~3gal a été décrite dans la liliéL~Lu~ (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest.
90 (1992) 626). Brièvement, l'adénovirus Ad.RSVbGal est un adénovirus recombinant défectif (délété des régions E1 et E3 ) obtenu par recomhin~i.eon homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dl324 (Thimm~rpaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le 20 pl~mi~le pAd.RSVbGal (Akli et al. 1993).
Le pl~micie pAd.RSVbGal contient, dans l'orient~ti~n 5'->3~, - le fragment PvuII correspondant à l'e~e~ gauche de l'adénovirus Ad5 co.5l5~ nant: la séquence ITR, l'origine de réplication, les signaux d'~n~ps~ tion et l'~mplifi~t~ur ElA;
- le gène codant pour la b-g~l~cto~ e sous le contrôle du promoteur RSV
(du virus du sarcome de Rous), - un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue entre le pl~cmi~ pAd.RSVbGal et l'adénovirus dl324.
Après liné~ri~tion par l'enzyrne ClaI, le pl~mi~l~ pAd.RSVbGal et l'adénovirus dl324 sont co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosrh~te de calcium pour permettre la recombinaison homologue. I,es adénovirus rec- mhin~nt.~ ainsi générés sont sélectionnés par pl~rifi~tion sur plaque. Après isolem~nt l'ADN de l'adénovirus rec-~mhin~nt est ~mplifié dans la lignée celll-l~ire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture conten~nt l'adénovirus défectif rec-mhin~nt non purifié ayant un titre d'environ 101~ pfu/ml. Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient Wo 96/18740 Pcr/FR9S/01650 de chlorure de césium selon les techniques c~nmles (voir not~mm~nt Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus a ensuite été utilisé sous forme purifiée dans une solution saline phosphate (PBS).
Trois injections d'adénovirus Ad-RSV-b-Gal (107 pfu par injection) ont été
5 pratiquées dans le muscle gastro~n~-mi~-n, juste après que ranimal ait subi (ou pas) une h~mi.eectic)n de la moelle épinière (niveau thoracique bas, ayant pour effet de paralyser l'animal pour l'un de ses membres i lré,ie~). 9 ,ul d'adén~viLus sont injectés par point d'injection à la seringue ~milton Les ~nim~llx ont été s~crifi~.s (perfusion 4~o pa,~ çhyde) quatre jours après lo injection, temps l..;ll;,-....-~ pour que le transport rétrograde s'effectue du muscle à la moelle épinière. Trois blocs de moelle épinière ont été coupés longit~lAin~lement aux niveaux cervical, thoracique et lombaire, en coupes de 50 mM d'épaisseur. Les coupes ont été traitées pour la révélation de la 13-G~l~ctQ.ei~l~ee p~rm~tt~nt de mettre en évidence les cellules ayant été infectées par le virus. Certaines coupes ont de plus subi une 5 immlmQcytochimie anti-"C~lcitonin Gene Related Peptide" (CGRP), p~rmett~nt de marquer spe~ifiquement les motoneurones.
La ~-Galactosidase a été révélée à partir de son substrat, le X-Gal, et le produit de la réaction donne une coloration bleue.
Le "C~lcit )nin Gene Related Peptide", CGRP, est un neurotransmetteur, 20 marqueur spé~ifique des motoneurones. Il est révélé par imm1ln~cytQf~himi~ avec un anticorps secondaire couplé à la péroxidase et comme substrat de l'enzyme la diaminob~n7i~in~; le produit de la réaction donne une coloration marron.
La révélation de la b-G~l~ctosi~ e a permis de mettre en évidence la présence demotoneurones infectés, exclusivement au niveau lombaire, sous le~ionntq.l dans le cas des 2s rats hémi~ectionnés, et du coté correspondant à l'injection.
Deux types de marquage ont été obtenus, un marquage diffus du corps c~ ire d'un grand nombre de motoneurones, et un marquage plus intense du corps c~ ire et des neurites d'un nombre plus limité de motoneurones (photos A et B). Cette différence d'int~n~ité de marquage est prob~hlçm~nt due au fait que se~ m~-nt quelques 30 motoneurones, très proches du site d'injection, ont pu absorber le virus de fac~on int~n~e L'immnn-~cytQchimie anti-CGRP couplée à la révélation b-G~l~ctosi~ e a permis de mettre en évidence par une double coloration que la quasi totalité des corps c~ ires CGRP positifs (i.e. motoneurones) étaient infectés par le virus (photo C).
Claims (13)
1. Utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant dans son génome un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones médullaires cervicaux par administration dans les muscles des membres supérieurs (exemple:
biceps, triceps).
biceps, triceps).
2. Utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant dans son génome un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones médullaires thoraciques par administration dans les muscles du thorax (ex. pectoraux).
3. Utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant dans son génome un acide nucléique d'intérêt pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones médullaires lombaire et/ou sacré par administration dans les muscles des membres inférieurs (gastrocnémien par exemple).
4. Utilisation d'un adénovirus recombinant dont le génome est dépourvu de tout ou partie de la région E1 et de tout ou partie de la région E3 et/ou E4, comprend un acide nucléique d'intérêt, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones médullaires par administration intramusculaire.
5. Utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant dans son génome un acide nucléique codant pour la NT3 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au transfert dudit acide nucléique dans les motoneuronesmédullaires par administration intramusculaire.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que l'adénovirus est un adénovirus d'origine humaine.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que l'adénovirus est un adénovirus d'origine animale.
8. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'acide nucléique d'intérêt est inséré dans le génome de l'adénovirus au niveau de la région E1, E3 ou E4.
9. Utilisation selon l'une quelconques des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que l'acide nucléique d'intérêt code pour une substance capable d'exercer un effet bénéfique sur les cellules nerveuses.
10. Utilisation selon la revendication 9 caractérisée en ce que l'acide nucléique d'intérêt code pour un facteur de croissance, un facteur neurotrophique, une cytokine, un neurotransmetteur ou une enzyme, ou un récepteur.
11. Utilisation selon la revendication 9 caractérisée en ce que l'acide nucléique d'intérêt comprend en outre des signaux permettant l'expression de la substance dans les motoneurones.
12. Utilisation selon l'une quelconques des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que l'administration intramusculaire est réalisée par injections en plusieurs points d'un même muscle.
13. Utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant dans son génome un acide nucléique codant pour un facteur neurotrophique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de la sclérose latérale amyotrophique par transfert dudit acide nucléique dans les motoneurones médullaires par administration intramusculaire.
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