JP2003527816A - バキュロウイルス由来のベクター及び脊椎動物の神経細胞に核酸を導入するための該ベクターの使用 - Google Patents

バキュロウイルス由来のベクター及び脊椎動物の神経細胞に核酸を導入するための該ベクターの使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は新規な組換えウイルス及び脊椎動物の神経系細胞に遺伝子を導入するための該組換えウイルスの使用に関する。本発明はまた、このような組換えウイルスを含む医薬組成物に関する。より特定的に本発明は、バキュロウイルスから誘導された新規なベクター及び脊椎動物の神経系疾患を治療するための該ベクターの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、新規な組換えウイルス、及び、脊椎動物の神経系の細胞に遺伝子を
導入するための該組換えウイルスの使用に関する。本発明はまた、上記組換えウ
イルスを含む医薬組成物に関する。より特定的には本発明は、バキュロウイルス
に由来の新規なベクター、及び、脊椎動物の神経系疾患を治療するための該ベク
ターの使用に関する。
【０００２】 バキュロウイルスは、エンベロープを有している無脊椎動物に特有の環状二重
鎖ＤＮＡウイルスである。バキュロウイルスの典型であるＡｃＮＰＶ（ａｕｔｏ
ｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス群（ｍｕｌｔｉｐｌ
ｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ））は１３３ｋｂ
のゲノムを有している。バキュロウイルスベクターは昆虫細胞中で２つの強力な
プロモーター〔ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎｅ（Ｐｈ）及びＰ１０〕から真核細胞遺伝
子を発現させるベクターとして広く使用されている（Ｋｉｎｇ ｅｔ Ｐｏｓｓ
ｅｅ，Ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ
，Ｌｏｎｄｏｎ：Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ，１９９２）。
【０００３】 昆虫細胞（Ｓｆ９またはＳｆ２１）に組換えバキュロウイルスを感染させるこ
とによってバキュロウイルスの予製液を調製し得る。タンパク質を産生させるた
めには、昆虫細胞にバキュロウイルスを感染させ、細胞培地を収集し、昆虫細胞
中でｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたタンパク質を抽出する。
【０００４】 組換えバキュロウイルスは、トランスジーンを脊椎動物細胞中で活性のプロモ
ーターのコントロール下に含むシャトルプラスミドと組換え部位の処で直鎖化さ
れたバキュロウイルスのゲノムとを昆虫細胞（一般にはＳｆ９またはＳｆ２１）
中で相同的組換えすることによって得られるか、または、当業者に公知の別の技
術（トランスポゾン、酵母組換え、など）によって得られる。バキュロウイルス
は（昆虫体内で）エピソーム性のウイルスであり、１００ｋｂまでの組換えＤＮ
Ａを取込むことができる。バキュロウイルスは、産生が容易であること（昆虫細
胞による増殖、工業化可能な培養条件、高いウイルス価の実現）、大量クローニ
ング能力を有していること、哺乳類体内の複製及び昆虫類体内の伝播が生じない
ので伝播の危険が小さいこと、などの多くの利点を有している。しかしながらバ
キュロウイルスベクターが遺伝子治療の分野で使用されたことはない。その理由
は、一方では、バキュロウイルスが哺乳類細胞に感染しないという知見が極めて
最近まで得られなかったためであり、他方では、哺乳類体内へのバキュロウイル
スのｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションが確実でなかったからである。
【０００５】 Ｈｏｆｍａｎｎら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９２（１９９５）１００９９−１０１
０３）は、リポーター遺伝子をＣＭＶの初期プロモーターのコントロール下に含
む組換えバキュロウイルスが、ヒトの肝細胞（Ｈｕｈ７細胞系及びＨｅｐＧ２細
胞系の初代培養物）及びネズミの肝細胞（ウサギの初代培養物）に極めて優れた
効率でトランスジーンを感染させ肝細胞中で発現させ得ることを証明した。しか
しながらこの文献の著者らは、神経系細胞（マウスの神経芽腫Ｎｅｕｒｏ−２ａ
、ヒト星状細胞腫ＳＷ１０８８及びラットの褐色細胞腫ＰＣ１２）を含む多様な
起原に由来の一連の細胞系中の全部でトランスジーンの有意な発現を観察するこ
とができなかった。
【０００６】 Ｂｏｙｃｅ Ｆ．Ｍ．及びＢｕｃｈｅｒ Ｎ．Ｌ．Ｒ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９ ３ ２３４８−２３５２（１９９６）は、ＨｅｐＧ２細胞系、並びに、２９３（
ヒト腎臓）、Ａ５４９（ヒト肺）及びＰＣ１２（ラットの褐色細胞腫）などの細
胞系において、ＲＳＶプロモーターのコントロール下に配置されたＬａｃＺ遺伝
子の有意な発現を得ることに成功した。試験したその他の細胞系では有意な発現
は全く得られなかった。
【０００７】 Ｓａｎｄｉｇ Ｖ．ら（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ７ １９３
７−１９４５（１９９６））は、組換えバキュロウイルスＲＳＶ−ＬａｃＺをヒ
ト及びネズミの肝細胞に感染させることを計画した。彼らは、ウイルスが補体に
感受性であること、従って肝臓にｉｎ ｖｉｖｏ感染できないことを知見した。
しかしながら、ｅｘ ｖｉｖｏ潅流して血清を除去したヒト肝臓の一部はバキュ
ロウイルスに感染した。
【０００８】 より最近になって、Ｓｈｏｊｉら（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９９７）が、
リポーター遺伝子をＣＡＧプロモーター（ＣＭＶの初期エンハンサー及びニワト
リのβ−アクチンのプロモーター）のコントロール下に含む組換えバキュロウイ
ルスを使用し、種々の細胞系（ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、ＣＰＫ、Ｃｏｓ７、Ｈｅ
ｌａ、ＦＳ−Ｌ３ ＫＡＴＯ−ＩＩＩ）中で有意な発現を得ることに成功した。
ＲＧＭ−１、ＰＣ１２、ＩＭＲ−３２及びＭＴ−２のような細胞系中でも低度の
発現が検出された。
【０００９】 Ｂａｒｓｏｕｍら（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，８ ２０１１−
２０１８（１９９７））は、ＲＳＶのＬＴＲのコントロール下のβ−ガラクトシ
ダーゼの発現カセットを含むバキュロウイルスのウイルスエンベロープの修飾が
可能であることを証明した。その結果、エンベロープ非修飾のバキュロウイルス
に感染性であった細胞に対するバキュロウイルスの感染力が強化されて、ベクタ
ーの形質導入能力が強化される。また、エンベロープ非修飾のバキュロウイルス
に感染性でなかった細胞にもバキュロウイルスが感染し得る。しかしながら著者
らは、神経細胞に対する感染については試験しなかった。彼らはまた、マウスの
神経芽細胞腫に由来のＮｅｕｒｏ２ａ（またはＮ２ａ）細胞に対する形質導入に
成功しなかった。
【００１０】 従ってこれまでに、神経組織の細胞に遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ
ｖｉｖｏで導入するためにバキュロウイルスベクターが使用されたことはない。
実際、特定条件下で“偽神経細胞性”表現型を有し得るＰＣ１２細胞系（ラット
の褐色細胞腫：末梢神経系）だけがバキュロウイルスに感染されることが判明し
たが、その発現レベルは対照の発現レベルを極く僅かに上回るにすぎなかった。
結局、哺乳動物体内に遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏ導入するためにバキュロウイルス
を使用することが現在まで記載されたことはない。
【００１１】 出願人はここに、好ましくは神経系疾患治療用の治療有効物質をコードする異
種核酸配列を含む組換えバキュロウイルスを構築すること、及び、これらの組換
えバキュロウイルスをｉｎ ｖｉｖｏ投与することが可能であり、この投与によ
ってトランスジーンをｉｎ ｖｉｖｏで局在的、特に神経系局在的に安定に発現
させ得ることを証明した。実際、実施例に示した結果は、本発明のバキュロウイ
ルスが脊椎動物、好ましくはヒトの神経系の細胞にトランスジーンを感染させそ
の発現を誘発し得ることを示している。本発明の代表例を示す本明細書の実施例
は、分化したヒト終脳の初代培養物の細胞の６０％以上で有益なトランスジーン
が発現していること、及び／または、終脳前駆細胞の３０％以上及び成人の大脳
皮質の初代培養物のアストログリア細胞の３０％以上で発現しているという驚異
的な結果を報告している。従って本発明は遺伝子治療に直接使用できるウイルス
ベクターを提供するものであり、該ベクターは、神経系において治療有効トラン
スジーンのｉｎ ｖｉｖｏ発現を誘発するために有効であり、また、移植用の神
経系細胞またはその他の細胞（セルトリー細胞、筋肉細胞、など）の培養物に遺
伝子を導入するｅｘ ｖｉｖｏ用途に好適である。従って本発明は、神経変性疾
患の治療及び／または予防に特に有利な新規な方法、または、治療薬が血液脳関
門を通過し難いので治療薬が神経系に到達できないという理由から特殊な治療を
要する代謝異常症の治療に特に有利な新規な方法を提供する。
【００１２】 本発明の第一の目的は、神経系疾患治療用の治療有効物質をコードする異種核
酸配列を含む組換えまたは誘導バキュロウイルスを提供することである。
【００１３】 より特定的には、異種核酸配列が１つまたは複数の治療用遺伝子を含み得る。
【００１４】 導入され得る治療用遺伝子は、ターゲット細胞に転写され場合によっては翻訳
されることによって治療効果をもつ物質を産生する任意の遺伝子である。
【００１５】 このようにコードされたタンパク産物はタンパク質またはペプチドでよい。こ
のタンパク産物はターゲット細胞と同種（ホモロガス）でよい（即ち、ターゲッ
ト細胞が病気でないときにターゲット細胞中で正常に発現される物質）。この場
合、タンパク質の発現は例えば、細胞中の不十分な発現を緩和するか、または、
修飾によって生じたタンパク質発現の不活性化もしくは活性低下を緩和するか、
あるいは、このようなタンパク質を超発現させる。治療用遺伝子はまた、安定性
が強化され且つ活性が修飾されているような細胞性タンパク質の突然変異体をコ
ードしてもよい。タンパク産物はまた、ターゲット細胞に異種（ヘテロロガス）
でもよい。この場合、発現されたタンパク質は例えば、細胞に闘病能力を与える
ように細胞の欠損活性を補完もしくは付与するか、または、例えば陰性突然変異
体を使用することによって細胞中のタンパク質発現を阻害し得る。
【００１６】 本発明によって使用され得る治療用物質としては特に、ホルモン、リンホカイ
ン：インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ、など（ＦＲ９２０３１２０
）、増殖因子、神経伝達物質合成酵素、栄養因子、特に神経変性疾患、神経系が
損傷された外傷または網膜変性を治療するための神経栄養因子がある。栄養因子
としては例えば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４／５、ＮＴ６のようなニュ
ーロトロフィンのファミリーに属する因子及びそれらの誘導体、ＣＮＴＦ、アキ
ソカイン、ＬＩＦのファミリーに属する因子及びそれらの誘導体、ＩＬ６、カル
ジオトロフィン、ＧＤＮＦ及びそれらの誘導体、ＩＧＦ−１、ＩＦＧＦ−２のよ
うなＩＧＦのファミリーに属する因子、ＦＧＦ１、２、３、４、５、６、７、８
、９のようなＦＧＦのファミリーに属する因子及びそれらの誘導体、ＴＧＦ−β
、などが挙げられる。
【００１７】 本発明によって使用され得る治療用物質としてはまた、腫瘍抑制遺伝子：ｐ５
３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖなど（ＦＲ９３０４７４５）、自殺
遺伝子：チミジンキナーゼ、シトシンデスアミナーゼ、などが挙げられる。
【００１８】 また、本発明によって使用され得る治療有効物質をコードする核酸配列という
表現は、アミノ酸、脂質及びその他の細胞構成成分の代謝に関与するタンパク質
をコードする遺伝子を包含する。
【００１９】 糖質代謝異常症に関与する遺伝子の非限定例としては例えば、フルクトース−
１−リン酸アルドラーゼ、フルクトース−１，６−ジホスファターゼ、グルコー
ス−６−ホスファターゼ、リソソームα−１，４−グルコシダーゼ、アミロ−１
，６−グルコシダーゼ、アミロ−（１，４：１，６）−トランスグルコシダーゼ
、筋ホスホリラーゼ、筋ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼ−ｂ−キナー
ゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ピルビン酸デヒド
ロゲナーゼ複合体の全酵素、ピルビン酸カルボキシラーゼ、２−オキソグルタレ
ートグリオキシラーゼカルボキシラーゼ、Ｄ−グリセレートデヒドロゲナーゼな
どがある。
【００２０】 アミノ酸代謝異常症に関与する遺伝子としては例えば、フェニルアラニンヒド
ロキシラーゼ、ジヒドロビオプテリンシンテターゼ、チロシンアミノトランスフ
ェラーゼ、チロシナーゼ、ヒスチジナーゼ、フマリルアセト−アセターゼ、グル
タチオンシンテターゼ、γ−グルタミルシステインシンテターゼ、オルニチン−
δ−アミノトランスフェラーゼ、カルバモイルリン酸シンテターゼ、オルニチン
カルバモイルトランスフェラーゼ、アルギニノスクシネートシンテターゼ、アル
ギニノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−リシンデヒドロゲナーゼ、Ｌ
−リシンケトグルタレートレダクターゼ、バリントランスアミナーゼ、ロイシン
イソロイシントランスアミナーゼ、分枝鎖をもつ２−ケト酸のデカルボキシラー
ゼ、イソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡリアーゼ、アセトアセチル−
ＣｏＡ ３−ケトチオラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、メチル
マロニル−ＣｏＡムターゼ、ＡＴＰ：コバラミンアデノシルトランスフェラーゼ
、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、シスタ
チオニンβ−シンテターゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ複合体、グリシン開裂
系に属するタンパク質、β−アラニントランスアミナーゼ、血清カルノシナーゼ
、脳ホモカルノシナーゼが挙げられる。
【００２１】 脂肪及び脂肪酸の代謝異常症に関与する遺伝子としては例えば、リポタンパク
質リパーゼ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、その他のア
ポリポタンパク質、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、ＬＤＬ
受容体、肝ステロールヒドロキシラーゼ、“フィタン酸”α−ヒドロキシラーゼ
がある。
【００２２】 リソソーム欠損症に関与する遺伝子としては例えば、リソソームα−Ｌ−イズ
ロニダーゼ、リソソームイズロネートスルファターゼ、リソソームヘパランＮ−
スルファターゼ、リソソームＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、リソ
ソームアセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、
リソソームＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミン６−スルファターゼ、リソソー
ムガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、リソソームβ−ガラクトシダーゼ、
リソソームアシルスルファターゼＢ、リソソームβ−グルクロニダーゼ、Ｎ−ア
セチルグルコサミニル−ホスホトランスフェラーゼ、リソソームα−Ｄ−マンノ
シダーゼ、リソソームα−ノイラミニダーゼ、リソソームアスパルチルグリコサ
ミニダーゼ、リソソームα−Ｌ−フコシダーゼ、リソソーム酸性リパーゼ、リソ
ソーム酸性セラミダーゼ、リソソームスフィンゴミエリナーゼ、リソソームグル
コセレブロシダーゼ及びリソソームガラクトセレブロシダーゼ、リソソームガラ
クトシルセラミダーゼ、リソソームアリールスルファターゼＡ、α−ガラクトシ
ダーゼＡ、リソソーム酸性β−ガラクトシダーゼ、リソソームヘキソサミニダー
ゼＡのα鎖がある。
【００２３】 代謝異常症に関与する遺伝子の非限定例としてはまた、ステロイド及び脂質の
代謝異常症に関与する遺伝子、プリン及びピリミジンの代謝異常症に関与する遺
伝子、ポルフィリン及びヘムの代謝異常症に関与する遺伝子を挙げることができ
る。
【００２４】 異種核酸配列は、ターゲット細胞中で発現することによって遺伝子の発現また
は細胞ｍＲＮＡの転写をコントロールし得る遺伝子またはアンチセンス配列でよ
い。このような配列は例えば、ターゲット細胞中で細胞ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡ
として転写され、欧州特許ＥＰ１４０３０８に記載の技術によって細胞ｍＲＮＡ
がタンパク質に翻訳されることを阻止することもでき、リボザイムのような自己
触媒性ＲＮＡとして転写されたり、スプライシングを修飾するＲＮＡとしてトラ
ンス位置に転写されたりすることもできる。
【００２５】 一般的に、異種核酸配列はまた、感染細胞中で機能性の転写プロモーター領域
を含む。考察中の遺伝子の発現を天然に担当するプロモーター領域が感染細胞中
で機能し得るときにはこのプロモーター領域が転写プロモーター領域となっても
よい。または、（別のタンパク質または合成タンパク質の発現を担当する）異な
る起原の領域が転写プロモーター領域となってもよい。特に、真核細胞遺伝子ま
たはウイルス遺伝子のプロモーター配列が転写プロモーター領域となってもよい
。例えば、感染対象細胞のゲノムに由来のプロモーター配列が転写プロモーター
領域となってもよい。有利な転写プロモーター配列は、神経細胞中または神経組
織中で活性のプロモーター、特に真核細胞プロモーターである。この観点から、
例えば遍在性プロモーター、即ち多数種類の細胞中で機能性のプロモーターが有
利である。従って、真核細胞の遍在性プロモーターが最も好ましい。プロモータ
ーは自己由来プロモーター、即ち、発現が生じる細胞と同じ種に由来のプロモー
ターでもよく、（別の種に由来の）異種（ゼノジェニック）プロモーターでもよ
い。真核細胞の遍在性プロモーターの好ましい例としては、ホスホグリセレート
キナーゼ１（ＰＧＫ）の遺伝子のプロモーターのような強いプロモーターがあり
、また、必須細胞代謝遺伝子（これらの遺伝子は“ドメスティック”または“ハ
ウスキーピング”遺伝子と呼ばれており、すべての細胞に共通の機能に必要なタ
ンパク質をコードしている）の発現を誘導するプロモーターがある。ハウスキー
ピング遺伝子の例は、クレブス回路に関与する遺伝子、細胞呼吸に関与する遺伝
子、または、複製もしくは転写もしくは翻訳に関与する遺伝子（ＥＦ１−α）で
ある。この種の遺伝子のプロモーターとしては特に、α１−アンチトリプシン、
β−アクチン、ビメンチン、アルドラーゼＡまたはＥｆｌα（延長因子）などの
遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【００２６】 本発明の範囲内で使用されるプロモーターはまた、神経細胞特異的な真核細胞
プロモーターでもよい。その例としては、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ
）、ＮＦ（ニューロフィラメント）、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、ＤＡ
Ｔ（ドーパミン輸送体）、ＣｈＡＴ（コリンアセチルトランスフェラーゼ）、Ｄ
ＢＨ（ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ）、ＴＰＨ（トリプトファンヒドロキシ
ラーゼ）、ＧＡＤ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）、ＧＦＡＰ（グリアフィラ
メント酸性タンパク質）の遺伝子のプロモーターがあり、より普遍的には、合成
酵素のプロモーター、ニューロメディエーターの輸送体のプロモーター、または
、所与の神経細胞またはグリア細胞のタイプまたはサブタイプに特異的に発現す
る遺伝子のプロモーターなどの他の任意のプロモーターをすべて包含する。
【００２７】 また、ウイルスプロモーター、例えばＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモ
ーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＴＫ（チミジンキナーゼ
）プロモーター、ＳＶ４０（サルウイルス）プロモーター、並びに、ＲＳＶ、Ｍ
ＬＶ（ネズミ白血病ウイルス）もしくはＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）のＬＴ
Ｒ（末端反復配列）の使用も検討できる。
【００２８】 また、ＣＡＧ（ＣＭＶのエンハンサー及びニワトリのβ−アクチンのプロモー
ター）、ＮＲＳＥ−ＰＧＫのようなキメラプロモーター、テトラサイクリンによ
って誘導されるプロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｎ及びＴｅｔ−Ｏｆｆ）のような誘導
プロモーター、エクジソン誘導プロモーター、あるいはその他の誘導プロモータ
ー（ＲＵ４８６、１７β−エステラジオールなど）、及び、特に熱ショックタン
パク質（ｈｓｐ７０）のようなストレスタンパク質の誘導プロモーターの使用も
検討できる。
【００２９】 更に、活性化配列または調節配列、即ち、組織特異的発現もしくは多数発現を
許容する配列の付加によってこれらのプロモーター領域を修飾し得る。
【００３０】 更に、異種核酸配列はまた、合成された治療用物質をターゲット細胞の分泌経
路または細胞の特定区画に案内するシグナル配列を含み得る。このシグナル配列
は、治療用物質の天然シグナル配列でもよいが、他の任意の機能性シグナル配列
でもよくまたは人工のシグナル配列でもよい。
【００３１】 ウイルスはｅｘ ｖｉｖｏの方法及びｉｎ ｖｉｖｏの方法の双方で使用でき
る。組換えバキュロウイルスによって遺伝的に修飾された細胞を移植するｅｘ
ｖｉｖｏの方法は、ヒトの遺伝子治療に応用できると考えられる。これらの細胞
は例えば、神経（ヒトまたはヒト以外）、セルトリー細胞、クロマフィン細胞な
どの種々の細胞に由来し得る。移植物の固定を強化したりトランスジーンの発現
を促進したりする目的で複数の医薬（免疫抑制剤、抗補体、など）を併用するこ
とも検討できる。また、組換えバキュロウイルスによって遺伝的に修飾された細
胞を不活性の系に封入して移植する方法も検討できる。
【００３２】 本発明のバキュロウイルスは当業者に公知の任意の技術によって作製され得る
。特に、Ｓｆ９細胞中でシャトルプラスミドとＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉｃａのゲノムとの相同的組換えを生じさせ、Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ Ｓ
．及びＨｅｉｔｚ Ｊ．，１９９３（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ，ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ＆ ｍｅｔｈｏｄ
ｍａｎｕａｌ．Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｅｄｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
によって記載された方法に従って同じ細胞中で増幅させることによって本発明の
バキュロウイルスを作製し得る。増幅されたバキュロウイルスを次に、実施例に
示したような慣用の分子生物学の方法によって回収し精製する。
【００３３】 本発明のバキュロウイルスは、上記のごとく作製されたバキュロウイルスのす
べての誘導体を包含する。誘導体という用語は、ゲノム内への配列挿入またはゲ
ノム内のウイルス遺伝子欠失によってそのゲノムが修飾されているすべてのバキ
ュロウイルスを包含すると理解されたい。バキュロウイルスの誘導体は特に、１
つまたは複数のウイルス遺伝子の全部または一部の欠失によって得られる。欠失
の例としては、多角体遺伝子の欠失、Ｐ１０遺伝子の欠失、特に昆虫細胞中のバ
キュロウイルスの複製に必須でない任意の遺伝子の欠失、などがある。特に、バ
キュロウイルス（ｇｕｔｌｅｓｓウイルス）の全部のウイルス遺伝子の欠失によ
って得られる誘導体は、大きいサイズの発現カセットを挿入できる誘導体である
。
【００３４】 また、バキュロウイルスのエンベロープを修飾すること、即ち、バキュロウイ
ルスのエンベロープタンパク質以外のエンベロープタンパク質をバキュロウイル
スの表面に発現させ、これによってウイルスの宿主スペクトルを変更することも
可能である。このようにして、宿主スペクトルを多様な種類の細胞に拡大し得る
エンベロープを使用することもでき、または逆に、宿主スペクトルを特定種類の
神経細胞に限定することもできる。有用なエンベロープタンパク質としては特に
、ＶＳＶの糖タンパク質、ＭＬＶの両向性エンベロープタンパク質が挙げられる
。また、ラブドウイルス、特に狂犬病ウイルスの糖タンパク質、トガウイルス（
セムリキ森林熱ウイルス及びシンドビスウイルスのようなアルファウイルス及び
ルビウイルス）特に風疹ウイルス（ルビウイルス）のエンベロープ糖タンパク質
、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）または他の任意の向神経性ウイルスの糖タンパク
質のような、特に神経細胞（ＣＮＳ及び／またはＰＮＳ）へのウイルス侵入を促
進し得るエンベロープタンパク質を利用し得る。本発明の組換えバキュロウイル
スの好ましい変異体は、狂犬病のウイルス（狂犬病ウイルス）の糖タンパク質ま
たはＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）の糖タンパク質によって偽型化（ｐｓｅｕ
ｄｏｔｙｐｅ）されたバキュロウイルスである。
【００３５】 これらの組換えベクターは、神経組織の細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉ
ｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで核酸を導入するために使用され得る。
【００３６】 ｉｎ ｖｉｖｏ使用のためには特に、中枢神経系（脳、脊髄）及び特に柔組織
または脳脊髄液を含む間隙に組換えバキュロウイルスを定位固定法で（例えば脳
室内または鞘内）注入する。この場合、トランスフェクション効率を改善するた
めに、補体のインヒビター（ＣＶＦ、ｓＣＲ１（Ｈｏｆｆｍａｎら，Ｇｅｎｅ
ｔｈｅｒａｐｙ，１９９８，ｖｏｌ．５，ｐｐ５３１−５３６），ＦＵＴ１７５
、など）の組合せを使用することが可能である。また、バキュロウイルス及び／
または治療用物質を逆輸送によって神経系に到達させるために、特に筋肉の処に
バキュロウイルスを投与することも計画できる。この後者の場合、注入に先立っ
てｉｎ ｖｉｖｏの補体系を阻害するのが有利であろう。
【００３７】 上述のように本発明はまた、神経系の疾患の治療及び／または予防に適用され
る医薬組成物を製造するための上記のようなバキュロウイルスの使用全般に関す
る。より特定的には本発明は、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋委縮性側
索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン舞踏病、癲癇、多発性硬化症、または、その
他の髄鞘形成異常を生じる疾患、並びに、リソソーム病特にムコ多糖症ＶＩＩ型
もしくはスライ症候群のような代謝異常を生じる疾患の治療及び／または予防に
適用される医薬組成物を製造するためのこれらのバキュロウイルスの使用全般に
関する。
【００３８】 本発明はまた、１種または複数の上記のような組換えバキュロウイルスを含む
医薬組成物に関する。これらの医薬組成物は、種々の経路、特に筋肉内、皮下、
眼内、経皮、脳内、脳室内、髄内、などの経路で投与できるように製剤化され得
る。
【００３９】 好ましくは本発明の医薬組成物は、注入用製剤を得るため、特に患者の神経組
織に直接注入できる製剤を得るために医薬的に許容されるビヒクルを含有してい
る。より特定的にはビヒクルは、無菌等張性溶液であるか、または、乾燥組成物
、特に必要に応じて滅菌水もしくは生理的血清を添加することによって注射液に
復元できる凍結乾燥組成物である。患者の神経組織内への直接注入は、治療効果
を罹患組織に集中させ得るという利点を有している。患者の中枢神経系への直接
注入は定位固定装置を用いて実施できるという利点を有している。実際、このよ
うな装置を使用すると、極めて高いターゲッティング精度で注入部位を設定し得
る。
【００４０】 この観点から本発明はまた、上記に定義のような組換えバキュロウイルスを患
者に投与することから成る神経系疾患、例えば神経変性疾患または代謝性疾患の
治療方法に関する。より特定的には本発明は、上記に定義のような組換えバキュ
ロウイルスの定位固定法による投与から成る神経変性疾患及び／またはリソソー
ム病の治療方法に関する。
【００４１】 注入に使用されるウイルスの用量は種々のパラメーター、特に使用される投与
形態、治療対象疾患、発現させる遺伝子、または、所望の治療期間に従って適宜
調節され得る。本発明の組換えバキュロウイルスは、一般的に１０４−１０１４ ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０６−１０１０ｐｆｕ／ｍｌの範囲の用量の形態に
製剤化されて投与される。ｐｆｕ（“プラーク形成単位”）なる用語は、ウイル
ス溶液の感染能に対応し、昆虫細胞培養物の感染によって決定される。一般には
５日後の感染細胞のプラーク数を測定するかまたは限界希釈によって滴定する。
ウイルス溶液のｐｆｕ価の測定技術は文献に十分に記載されている。
【００４２】 本発明の別の目的は、上記に記載のような１種または複数の組換えバキュロウ
イルスに感染した任意の哺乳類細胞に関する。より特定的には本発明は、これら
のバキュロウイルスに感染したヒトの神経系の細胞の任意の集団に関する。特に
、グリア細胞（アストログリア細胞、マイクログリア細胞、オリゴデンドログリ
ア細胞、シュワン細胞）、上衣細胞、神経細胞、などに関する。
【００４３】 本発明の細胞は初代培養物に由来する。初代培養物を当業者に公知の任意の技
術によって採取し、次いで細胞の増殖が可能な条件下で培養する。より詳細には
、自家移植物の場合、好ましくは成人のアストログリア細胞を用いる。異種移植
物の場合、好ましくはヒトの胚細胞、または、移植に先立って任意にｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで分化させ得るヒトの終脳もしくは間葉に由来の前駆細胞のような神経細
胞即ちニューロンの前駆細胞、または、胚性アストログリア細胞を用いる。これ
らの細胞は生検によって容易に得られる。また、褐色細胞腫、胚細胞、アストロ
グリア細胞に由来するか、または、セルトリー細胞のような別の種類の細胞に由
来する異種移植物も使用し得る。細胞はまた、例えば神経経路に分化したＥＳ細
胞（胚性幹細胞）、好ましくはヒトＥＳ細胞でもよい。これらの細胞をバキュロ
ウイルス感染用に直接使用してもよく、または、例えば後で使用する自家バンク
を作製するために凍結保存してもよい。本発明の細胞はまた、例えば予め作製し
たバンクから得られた継代培養物でもよい。
【００４４】 次いで、治療有効物質を産生する能力を与えるために培養細胞に組換えバキュ
ロウイルスを感染させる。当業者に公知の技術を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで感
染させる。当業者は、特に使用される細胞の種類及び細胞あたりのウイルスの所
望コピー数に従って感染多重度及び任意に感染サイクルの実施回数を適宜調節し
得る。細胞のｉｎ ｖｉｖｏ投与を計画するときは勿論これらの段階を無菌条件
下で行う必要がある。細胞の感染に使用される組換えバキュロウイルスの用量は
所望の目的に従って当業者が適宜調節する。上記に記載のｉｎ ｖｉｖｏ投与条
件をｉｎ ｖｉｔｒｏ感染にも応用できる。
【００４５】 本発明のいま１つの目的は、１種または複数の上記に記載のような組換えバキ
ュロウイルスに感染したヒト細胞と細胞外マトリックスとから成る移植組織に関
する。本発明の移植組織は好ましくは１０４−１０１０個の細胞を含む。本発明
の移植組織はより好ましくは１０６−１０８個の細胞を含む。
【００４６】 より特定的には本発明の移植組織中の細胞外マトリックスは、ゲル化剤となる
化合物を含み、また細胞を付着させる支持体を任意に含む。
【００４７】 本発明の移植組織を作製するために多様な種類のゲル化剤を使用し得る。ゲル
化剤は、ゲル構造をもつマトリックス中に細胞を封入するために使用され、また
必要な場合には細胞の支持体付着を促進するために使用される。従って、特にコ
ラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、レシチン、な
どのような種々の細胞接着剤をゲル化剤として使用し得る。本発明の範囲ではコ
ラーゲンの使用が好ましい。コラーゲンは、ヒト、ウシまたはネズミに由来のコ
ラーゲンがよい。より好ましくはコラーゲンＩ型を使用する。
【００４８】 上述のように本発明組成物は細胞を付着させる支持体を含むのが有利である。
付着という用語は、細胞を支持体に接着及び／または定着させ得る生物的及び／
または化学的及び／または物理的なすべての形態の相互作用を意味する。細胞は
また、使用された支持体を被覆してもよく、支持体の内部に侵入してもよく、そ
の双方が生じてもよい。本発明の範囲では無毒性及び／または生体適合性の固体
支持体を使用するのが好ましい。特に、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ
）繊維または生物起原の支持体を使用し得る。
【００４９】 本発明の移植組織は生物の種々の部位に移植され得る。特に、筋肉、腫瘍、中
枢神経系の内部または粘膜の下方に移植され得る。本発明の移植組織は特に、生
物体内で治療用物質の遊離をコントロールできるという利点を有している。治療
用物質の遊離は感染多重度及び移植細胞数によって最初に決定されている。後で
遊離をコントロールするためには、移植組織を摘出して治療を完全に停止しても
よく、または、治療用遺伝子の発現を誘発もしくは抑制し得る調節自在な発現系
を使用してもよい。
【００５０】 このように本発明は、神経系疾患の治療または予防に極めて有効な手段を提供
する。本発明は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、Ａ
ＬＳまたはリソソーム病の治療に特に好適である。本発明のバキュロウイルスは
更に、バキュロウイルスのタンパク質が哺乳類細胞中で発現しないので免疫原性
が弱いことに起因する重要な利点を有している。
【００５１】 本発明を実施例に基づいてより詳細に以下に説明する。実施例は本発明を代表
する非限定例であることを理解されたい。
【００５２】 材料及び方法 分子生物学の普遍的技術 プラスミドＤＮＡの分取的抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心、
アガロースゲルまたはアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡフラ
グメントの精製、フェノールまたはフェノール−クロロホルムによるタンパク質
の抽出、エタノールまたはイソプロパノールによる生理食塩水培地中のＤＮＡ沈
降、大腸菌の形質転換、などのような分子生物学で慣用の方法は当業者に公知で
あり、文献にも十分に記載されている〔Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ら，“Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら（
ｅｄｓ），“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
，１９８７〕。
【００５３】 結合のためには、ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルまたはアクリルアミド
ゲル電気泳動によってサイズに従って分離し、フェノールまたはフェノール／ク
ロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈降させ、次いでファージＴ４（Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）のＤＮＡリガーゼの存在下で製造業者の指示通りにインキュベート
する。
【００５４】 ５’付着末端の埋戻しは、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメ
ント（Ｂｉｏｌａｂｓ）によって製造業者の指示通りに行う。３’付着末端の破
壊は、ファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で製造業
者の指示通りに行う。５’付着末端の破壊は、ヌクレアーゼＳ１で調節的に処理
することによって行う。
【００５５】 合成オリゴデオキシヌクレオチドによるｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発は、Ａ
ｍｅｒｓｈａｍによって販売されているキットを使用し、Ｔａｙｌｏｒら〔Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４〕によ
って開発された方法に従って行うことができる。
【００５６】 所謂ＰＣＲ技術〔Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒ ｅａｃｔｉｏｎ，Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０（１９８
５）１３５０−１３５４；Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．＆ Ｆａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ
．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０〕によるＤＮＡ
フラグメントの酵素的増幅は、“ＤＮＡサーマルサイクラー”（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を製造業者の指示通りに使用することによって行う。
【００５７】 ヌクレオチド配列の検証は、Ａｍｅｒｓｈａｍによって販売されているキット
を使用し、Ｓａｎｇｅｒらによって開発された方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３−５４６７〕で行う。
【００５８】 （図面の簡単な説明） 図１：培地にｂＦＧＦを添加することによって未分化状態で保存したＧＦＰ陽
性細胞のパーセンテージをバキュロウイルスＢａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰの量（１μ
ｌがＭＯＩ＝５に対応する）の関数として表すグラフ。
【００５９】 図２：１０％の血清の存在下で培養した（分化状態の）ＧＦＰ陽性細胞のパー
センテージをバキュロウイルスＢａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰの量（１μｌがＭＯＩ＝
５に対応する）の関数として表すグラフ。
【００６０】 図３：複数の細胞系：ＣＨＰ−２１２、Ｈｅｌａ、Ｃｏｓ７中の酪酸塩の作用
を比較及び証明するグラフ。感染及び発現は特にＣＨＰ−２１２細胞で極めて顕
著である。酪酸塩を添加したＣＨＰ−２１２細胞では実質的に１００％の細胞が
ＧＦＰを発現し得る。
【００６１】 図４：感染後に１０％のＦＢＳ（ウシ胎仔血清）の存在下で４８時間培養した
前駆細胞の感染に対する酪酸塩の作用を示すグラフ。
【００６２】 図４Ａは、酪酸塩の作用をＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージとして表すグラフ
である。感染４８時間後に６０％を上回る細胞がＧＦＰを発現している。
【００６３】 図４Ｂは、酪酸塩の作用を蛍光強度として表すグラフである。感染４８時間後
に、酪酸塩を作用させた細胞の蛍光強度が顕著に増加している（酪酸塩使用の強
度約４２５に対して酪酸塩非使用の強度約１００）。
【００６４】 図５：ヒト胚性終脳細胞の培養物にＢａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰを感染させた後の
ＧＦＰのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現の結果。
【００６５】 図５Ａは、１０％ＦＢＳを用いたヒト胚性終脳細胞の培養物。これらの細胞の
大多数はアストログリア細胞である。
【００６６】 図５Ｂは、１０％ＦＢＳと酪酸塩とを用いたヒト胚性終脳細胞の培養物。全部
の細胞がＧＦＰを発現している。
【００６７】 図６：バキュロウイルスｂａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰを定位固定法で注入したＢａ
ｌｂ Ｃマウスによる注入１週後のＧＦＰのｉｎ ｖｉｖｏ発現の結果。
【００６８】 図６Ａは、線状体中のＧＦＰの発現を示す。形態学的に判断すると、標識され
た細胞は血管上皮細胞及び血管を包囲する幾つかの神経細胞（アストログリア細
胞）であると考えられる。
【００６９】 図６Ｂは、線状体中のＧＦＰの発現を示す。標識された細胞はアストログリア
細胞である。
【００７０】 図６Ｃは、側脳室中のＧＦＰの発現を示す。標識された細胞は上衣細胞である
。
【００７１】 図７：バキュロウイルスｂａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰを定位固定法で注入したラッ
トの線状体中の注入４８時間後ＧＦＰのｉｎ ｖｉｖｏ発現の結果。実施例４に
記載の条件で注入した（１：１０に希釈した９μｌのウイルスを注入）。抗ＧＦ
Ｐ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を標識としてＧＦＰの発現を検出した。
【００７２】 実施例 実施例１：種々のバキュロウイルスベクターの構築 １．１−バキュロウイルスＲＳＶ−ＬａｃＺの構築及び産生 Ｓｆ９細胞中でシャトルプラスミドとＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒ
ｎｉａのゲノムとの相同的組換えを行って組換えバキュロウイルスＲＳＶ−Ｌａ
ｃＺを作製し、同じ細胞中でＧｒｕｅｎｗａｌｄ Ｓ．及びＨｅｉｔｚ Ｊ．，
（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅ
ｍ，ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ＆ ｍｅｔｈｏｄ ｍａｎｕａｌ．Ｐｈａｒｍｉｎｇ
ｅｎ Ｅｄｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって記載された方法に従って増
幅した。
【００７３】 シャトルプラスミドは、ＲＳＶのＬＴＲのコントロール下の核性β−ガラクト
シダーゼの遺伝子とＬａｃＺ遺伝子の下流のＳＶ４０のポリアデニル化シグナル
とを含む発現カセットをプラスミドｐＶＬ１３９２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓ
ａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に挿入することによって作製した。この発現カセット
を、プラスミドｐＶＬ１３９２に含まれていた多角体のプロモーターに対して逆
方向で多重クローニグ部位に挿入した。
【００７４】 次に、Ｓｆ９細胞中で増幅させることによってウイルスを産生させる。ＳＷ２
８ロータを使用し、１８０ｍｌの上清（力価の初期値３×１０７ｐｆｕ／ｍｌ）
を２５，０００ｒｐｍで４℃で９０分間超遠心することによってウイルスを濃縮
し、次いで２ｍｌのＰＢＳに入れ、ＳＷ４１ロータを使用しショ糖勾配（ＰＢＳ
中に１０％から６０％まで）中で２５，０００ｒｐｍで４℃で９０分間超遠心す
る。精製されたウイルス粒子に対応する白色バンドを採取し、ＰＢＳに再懸濁さ
せ、２５，０００ｒｐｍで４℃で９０分間超遠心する。残渣を１．５ｍｌの低温
ＰＢＳに再懸濁させる。濃縮し精製したこのウイルス予製液を４℃または−８０
℃で保存する。
【００７５】 １．２−バキュロウイルスＣＡＧ−ＬａｃＺの構築及び産生： 組換えバキュロウイルスＣＡＧ−ＬａｃＺは、シャトルプラスミドｐＡｃＹＭ
１（Ｍａｔｓｕｕｒａら，Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８（１９８７）１
２３３−１２５０）を使用することによって得られた。ＬａｃＺ遺伝子の発現を
コントロールするＣＡＧプロモーターを含む発現カセットをシャトルプラスミド
に挿入した。ＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶ ＩＥエンハンサーと、ニワトリの
ベータ−アクチンのプロモーターと、ウサギのベータ−グロビンのポリアデニル
化シグナルとから成る複合プロモーターである。
【００７６】 細胞Ｓｆ９中で相同的組換えを生じさせることによって組換えバキュロウイル
スを作製し、次いでこれらの細胞中で（Ｍａｔｓｕｕｒａら，Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎ
．Ｖｉｒｏｌ．６８（１９８７）１２３３−１２５０のプロトコルに従って）増
幅した。
【００７７】 組換えバキュロウイルスのアリコートをＳｆ９細胞中で増幅することによって
使用ウイルスを作製した。ウイルス溶液は１×１０９ｐｆｕ／ｍｌの力価を有し
ていた。次にウイルスを１００倍に濃縮し、バキュロウイルスＲＳＶ−ＬａｃＺ
に関して記載した条件と同じ条件で精製した。
【００７８】 １．３−バキュロウイルスＣＭＶ−ＧＦＰの構築及び産生 この実施例の目的は、ｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）からクローニングさ
れた極めて活性の発現カセットを含み、且つ、ＣＭＶプロモーターのコントロー
ル下のプラスミドＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からクローニングされた緑色蛍
光タンパク質（ＥＧＦＰ）の遺伝子と、トランスジーンの上流に配置されたキメ
ライントロン（例えばβ−グロビンのイントロンの５’スプライシング部位とＩ
ｇＧイントロンの３’スプライシング部位とを含む）と、ＳＶ４０のポリＡとを
含む組換えバキュロウイルスの構築を記載することである。
【００７９】 最初に、任意のｃＤＮＡを哺乳類細胞中で発現させ得るようなｃＤＮＡクロー
ニング能力を有しているＣＭＶの初期プロモーターとＳＶ４０の後期ポリアデニ
ル化シグナルと多重クローニング部位とから成る発現カセットを含むシャトルプ
ラスミドＢａｃ−ＣＭＶを構築した。先ず、バキュロウイルスの多角体のプロモ
ーターによる転写作用を完全に防止するためにカセットを多角体のプロモーター
に対して逆方向でベクターｐＶＬ１３９２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）にクロー
ニングした。リポーター遺伝子ＧＦＰをシャトルプラスミド（Ｂａｃ−ＣＭＶ）
にクローニングしてプラスミドＢａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰを作製した。
【００８０】 次にこのシャトルプラスミドを昆虫細胞Ｓｆ９にトランスフェクトし、Ａｕｔ
ｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（ＡｃＮＰＶ）の直鎖化ゲノムとの相同
的組換えを生じさせることによって組換えバキュロウイルスを作製した。ウイル
スをＳｆ９細胞中で増幅し、ＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で検出した。このように
してＣＭＶプロモーターがこれらの細胞中で活性であることを証明する。
【００８１】 増幅後、上記に記載の方法でウイルス予製液（Ｂａｃ．ＣＭＶ−ＧＦＰ）を順
次に濃縮し精製した。アリコートを−８０℃で保存した。
【００８２】 実施例２：バキュロウイルスＲＳＶ−ＬａｃＺによる種々の細胞培養物のｉｎ
ｖｉｔｒｏ感染試験 ２．１−成熟アストログリア細胞の初代培養物の感染 ４ウェルの容器で細胞を培養する。無血清培養培地中で３７℃で約２時間感染
させる。感染には漸増濃度の組換えウイルスを用いた。２４時間後、細胞を固定
し（４％ＰＦＡ）、Ｘ−Ｇａｌで染色した。非感染対照は青色細胞を有していな
い。
【００８３】 感染２４時間後及び４８時間後に培養物を観察すると、組換えバキュロウイル
スがヒトのアストログリア細胞の初代培養物の細胞（ｂＦＧＦ中で培養したヒト
終脳）に感染してＬａｃＺ遺伝子を発現させる能力を有している（Ｘ−Ｇａｌ反
応によって観察）ことが判明する。
【００８４】 ２．２−ヒト胚性終脳の初代培養物の感染 細胞をｂＦＧＦ含有培地（細胞が殆どまたは全く分化しない前駆細胞状態に維
持される培地）中で培養する。完全培養培地中で２時間感染させた。非感染対照
は青色細胞を有していない。
【００８５】 感染４日後に培養物を観察すると、組換えバキュロウイルスがヒト神経前駆細
胞（ｂＦＧＦ中で培養したヒト終脳）に感染してＬａｃＺ遺伝子を発現させる能
力を有している（Ｘ−Ｇａｌ反応によって観察）ことが判明する。
【００８６】 これらの結果を総合すると、バキュロウイルスから誘導された組換えベクター
が多様な種類の神経細胞の初代培養物にｉｎ ｖｉｔｒｏ感染する能力を有して
いること、従って遺伝子治療でｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入用ベクターとして有用
であることが判明する。
【００８７】 実施例３：種々の細胞培養物に対するバキュロウイルスＢａｃ−ＣＭＶ−ＧＦ
Ｐのｉｎ ｖｉｔｒｏ感染試験 ３．１−種々の細胞系の感染 哺乳類細胞に対するベクターＢａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰの遺伝子導入効率を評価
するために、種々の神経細胞系（ＣＨＰ２１２）及び非神経細胞系（ＨｕＨ７、
２９３、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ７）にリポーター遺伝子ＧＦＰを感染させ、該遺伝子
の発現を誘発するこのベクターの潜在的活性を測定した。このために、ＨｕＨ７
（ヒト肝細胞）、２９３（ヒト腎臓）、ＨｅＬａ（ヒト上皮）、Ｃｏｓ７（サル
腎臓）、Ｎ２Ａ（ネズミの神経芽細胞腫）及びＣＨＰ２１２（ヒトの神経芽細胞
腫）などの細胞系にこのベクターを１２．５の感染多重度で感染させた。ベクタ
ーをこの濃度で使用したときの蛍光細胞をフローサイトメトリーで分析すること
によって、ＨｕＨ７細胞及び２９３細胞のほぼ１００％、ＣＨＰ２１２細胞のか
なりの割合に形質導入が生じており、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ７細胞及びＮ２Ａ細
胞ではもっと少ない割合（５−２０％のオーダ）の細胞に形質導入が生じている
ことが確認される。
【００８８】 これらのベクターの転写抑制現象を具体的に検証するために、形質導入が生じ
た細胞をヒストンのデアセチラーゼのインヒビター（酪酸塩）によって処理した
。実際、このインヒビターは、染色質（クロマチン）の縮合に起因する転写抑制
を排除し得る強力な因子であると記載されている。従ってどの場合にも、トラン
スジーンを発現する細胞数の有意な増加が観察された。同様にして、酪酸塩によ
る誘発後に細胞あたりの蛍光量の顕著な増加が記録された。
【００８９】 これらの実験は、このベクターが広い範囲の哺乳類細胞に形質導入を有効に生
じさせる能力を有することを証明する。更に、このベクターがヒト神経細胞系（
ＣＨＰ２１２）に形質導入を極めて有効に生じさせることが観察された。
【００９０】 ３．２−ｉｎ ｖｉｔｒｏ神経細胞の初代培養物の感染 細胞系に関する試験と同様の方法で、齧歯類またはヒトの一次神経細胞に形質
導入するためにベクターＢａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰを使用した。
【００９１】 最初に、ＭＯＩ＝２５に対応する量までの漸増範囲のベクターをヒト一次神経
上皮前駆細胞に感染させ、ｂＦＧＦ含有培地中で培養するか（前駆状態）または
血清の存在下で培養した（大半はグリア経路で分化した細胞）。感染２日後にフ
ローサイトメトリーで分析すると、図１及び図２にそれぞれ示すように、前駆細
胞−ｂＦＧＦでは約３０％、分化した前駆細胞では約６０％の細胞がＧＦＰを発
現していることが判明した。前駆細胞の場合にＭＯＩ＝２５で用量／応答曲線が
プラトーに到達しなかったことは注目に値する。これは、前駆細胞のほうが強力
に感染され得ることを示唆する。
【００９２】 更に、ＧＦＡＰラベル（アストログリア細胞のラベル）及びＭＡＰラベル（ニ
ューロンのラベル）でヒトの胚性終脳細胞を二重標識したｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
は、これらの２種類の細胞が感染可能であることをはっきりと示す。実際、ＧＦ
ＡＰ／ＧＦＰ及びＭＡＰ５／ＧＦＰラベルによる標識試験は、アストログリア細
胞だけでなくニューロンも感染されるという予想外の結果を示す。
【００９３】 また、同じ細胞についてどの場合にも、“擬似形質導入”の割合、即ち新しい
リポーター遺伝子を新生（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成しなかったＧＦＰ陽性細胞の数
がＧＦＰ陽性細胞の３％未満であることが平行試験で確認された。平行試験のた
めには、ＧＦＰの遺伝子の転写及び翻訳のメカニズムによるＧＦＰの有効な発現
が生じない期間である感染後３時間の蛍光の存在を観察した（図４Ａ及び４Ｂ）
。更に、感染前にＵＶ照射（ＵＶ−架橋剤を約１００，０００μジュールの線量
で照射）によってウイルスを失活させると、ＧＦＰ陽性細胞が殆ど存在しない（
３％未満）ことが判明した。これは擬似形質導入で得られた結果を裏付ける。
【００９４】 また、Ｂａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰに感染させたヒト神経前駆細胞培養物の分化に
よって得られたグリア細胞に対する酪酸塩の効果を試験した。この誘導物質を培
養培地に補充すると２４時間後にＧＦＰ陽性細胞の数が非処理細胞の２倍に増加
していることが観察された。しかしながら処理細胞中の蛍光の平均値は非処理細
胞で観察された値のほぼ４倍であった。これらのデータは、細胞系に対する上記
同様の転写抑制メカニズムが後成的に存在することを有力に示唆する。これらの
結果は更に、本発明のベクターが、成熟したヒト一次アストログリア細胞及びラ
ットの一次松果体細胞の双方に感染し得ることを示す。
【００９５】 従ってこの実施例は、プロモーター（ＣＭＶ）と異種遺伝子（ＧＦＰ）とから
成る発現カセットを含むバキュロウイルスが、非ニューロン細胞に感染できるだ
けでなく、意外にもニューロン細胞（ＣＨＰ２１２系）及び初代培養物（胚性ま
たは成熟）に由来の神経細胞にも感染でき、これらの細胞中で異種遺伝子を極め
て有意な割合で誘発し得ることを示す。
【００９６】 実施例４：バキュロウイルスＲＳＶ−ＬａｃＺによるｉｎ ｖｉｖｏ試験 ４．１−ラットの線状体への定位固定法による注入 雌の成熟スプレーグ・ドーリーネズミに濃縮した９μｌのＲＳＶ−ＬａｃＺウ
イルスを感染させた。１μｌのウイルス（０．２５μ／分）を３つの注入部位で
、各注入部位あたり３つのサブサイトにゆっくりと注入した。
【００９７】 ブレグマに対する定位座標は： Ａ：＋１．８，Ｌ：＋２．５，Ｖ０：−５，Ｖ１：−４．６，Ｖ２：−４．２ Ａ：＋０．６，Ｌ：＋３．２，Ｖ０：−５，Ｖ１：−４．６，Ｖ２：−４．２ Ａ：＋０．６，Ｌ：＋２，Ｖ０：−５，Ｖ１：−４．６，Ｖ２：−４．２。
【００９８】 感染５日後、ＰＢＳ中の４％ＰＦＡの心内潅流によってラットを固定し、脳を
４℃の４％ＰＦＡ中で２４時間後固定する。次いで脳をＰＢＳ中の１５％ショ糖
に７２時間浸漬させることによって極低温保護する。次に脳を低温（−５０℃）
イソペンタン中で冷凍して−８０℃で保存する。
【００９９】 ４．２−注入されたラットの脳に関する組織学 クリオスタットを使用し脳を線状体の処で切断する（切片の厚み：２０μｍ）
。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼの存在を検出するために切片の免疫組織化学試
験を行う。スライドグラスをＰＢＳで洗浄し、メタノール＋０．３％のＨ２Ｏ２ 中で１時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いでＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ＋
０．１％トリトンで２時間プレインキュベートする。次にスライドグラスを抗−
β−Ｇａｌ抗体（Ｃａｐｐｅｌ：１：５０００）で一夜インキュベートし、ＰＢ
Ｓで洗浄し、次いで第二抗体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎヤギ抗ウサギキット）と共
にインキュベートする。ＤＡＢ＋ニッケル中で検出する。この実験で、２つの脳
（注入点の周囲約２ｍｍの厚みの約１００個の切片）で多数の標識細胞が観察さ
れた。
【０１００】 抗β−Ｇａｌモノクローナル抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）と抗ＧＦＡＰポリクロー
ナル抗体とを使用してβ−Ｇａｌ＋ＧＦＡＰの蛍光二重標識を行った。脳梁周囲
細胞と線状体細胞とにおいて顕著な形質導入及び標識が観察される。
【０１０１】 抗β−Ｇａｌ抗体による免疫組織化学試験では、組換えバキュロウイルスが多
数の神経細胞にトランスジーンを感染させトランスジーンを発現し得ることが判
明する。この試験はまた、組換えバキュロウイルスがＣＮＳ中で補体によって失
活されないことを示す。
【０１０２】 実施例５：バキュロウイルスＢａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰによるｉｎ ｖｉｖｏ試
験 この実施例の目的は、神経細胞に対するベクターＢａｃ ＣＭＶ−ＧＦＰのｉ
ｎ ｖｉｖｏ感染能力を証明することである。
【０１０３】 ベクターＢａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰを１０６ｐｆｕで成熟スプレーグ・ドーリー
ネズミ及び成熟したヌードマウスまたはＢａｌｂ−Ｃマウスの線状体に注入した
。注入の定位座標を以下に示す。
【０１０４】 −ネズミ（体重２００−２５０ｇの成熟した雌のスプレーグ・ドーリーネズミ
）の場合：希釈ウイルス注入のときは、０．２５μｌ／分の割合で９μｌの量を
実施例４と同じ条件で注入した。０．１２５μｌ／分の割合で２μｌの量を注入
してもよい。
【０１０５】 ブレグマに対する定位座標： Ａ：＋１，Ｖ：＋２．３，Ｌ：−５、 −マウス（体重２０−２５ｇの成熟したヌードマウスまたＢａｌｂ−Ｃマウス
）の場合：０．１μｌ／分の割合で２μｌの量を注入した。
【０１０６】 ラムダに対する定位座標： Ａ：＋４．７，Ｌ：＋１．７，Ｖ：−３．６。
【０１０７】 注入の２日後及び一週後に、２種類の動物の体内でＧＦＰを発現している線状
体細胞の存在を検出した。脳梁及び上衣中では線状体以外の細胞でＧＦＰを発現
している細胞も検出された（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ及び図７）。
【０１０８】 免疫組織化学的表現型を判別することによって、極めて多数のＧＦＰ／ＧＦＡ
Ｐ陽性細胞を検出できる。これは、このベクターが脳内で極めて優先的にグリア
向性であることを示唆する。
【０１０９】 従ってこれらの結果は、バキュロウイルスが神経細胞に対してｉｎ ｖｉｖｏ
感染能力を有することをはっきりと証明する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 培地にｂＦＧＦを添加することによって未分化状態で保存したＧＦＰ陽性細胞
のパーセンテージをバキュロウイルスＢａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰの量（１μｌがＭ
ＯＩ＝５に対応する）の関数として表すグラフ。
【図２】 １０％の血清の存在下で培養した（分化状態の）ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテ
ージをバキュロウイルスＢａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰの量（１μｌがＭＯＩ＝５に対
応する）の関数として表すグラフ。
【図３】 複数の細胞系：ＣＨＰ−２１２、Ｈｅｌａ、Ｃｏｓ７中の酪酸塩の作用を比較
及び証明するグラフ。
【図４Ａ】 感染後に１０％のＦＢＳ（ウシ胎仔血清）の存在下で４８時間培養した前駆細
胞の感染に対する酪酸塩の作用を示すグラフであり、酪酸塩の作用をＧＦＰ陽性
細胞のパーセンテージとして表すグラフである。感染４８時間後に６０％を上回
る細胞がＧＦＰを発現している。
【図４Ｂ】 感染後に１０％のＦＢＳ（ウシ胎仔血清）の存在下で４８時間培養した前駆細
胞の感染に対する酪酸塩の作用を示すグラフであり、酪酸塩の作用を蛍光強度と
して表すグラフである。感染４８時間後に、酪酸塩を作用させた細胞の蛍光強度
が顕著に増加している（酪酸塩使用の強度約４２５に対して酪酸塩非使用の強度
約１００）。
【図５Ａ】 ヒト胚性終脳細胞の培養物にＢａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰを感染させた後のＧＦＰ
のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現の結果であり、１０％ＦＢＳを用いたヒト胚性終脳細胞
の培養物。これらの細胞の大多数はアストログリア細胞である。
【図５Ｂ】 ヒト胚性終脳細胞の培養物にＢａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰを感染させた後のＧＦＰ
のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現の結果であり、１０％ＦＢＳと酪酸塩とを用いたヒト胚
性終脳細胞の培養物。全部の細胞がＧＦＰを発現している。
【図６Ａ】 バキュロウイルスｂａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰを定位固定法で注入したＢａｌｂ
Ｃマウスによる注入１週後のＧＦＰのｉｎ ｖｉｖｏ発現の結果であり、線状体
中のＧＦＰの発現を示す。形態学的に判断すると、標識された細胞は血管上皮細
胞及び血管を包囲する幾つかの神経細胞（アストログリア細胞）であると考えら
れる。
【図６Ｂ】 バキュロウイルスｂａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰを定位固定法で注入したＢａｌｂ
Ｃマウスによる注入１週後のＧＦＰのｉｎ ｖｉｖｏ発現の結果であり、線状体
中のＧＦＰの発現を示す。標識された細胞はアストログリア細胞である。
【図６Ｃ】 バキュロウイルスｂａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰを定位固定法で注入したＢａｌｂ
Ｃマウスによる注入１週後のＧＦＰのｉｎ ｖｉｖｏ発現の結果であり、側脳室
中のＧＦＰの発現を示す。標識された細胞は上衣細胞である。
【図７】 バキュロウイルスｂａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰを定位固定法で注入したラットの線
状体中の注入４８時間後ＧＦＰのｉｎ ｖｉｖｏ発現の結果。実施例４に記載の
条件で注入した（１：１０に希釈した９μｌのウイルスを注入した）。抗ＧＦＰ
抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を標識としてＧＦＰの発現を検出する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/46 Ａ６１Ｐ 25/14 38/53 25/16 48/00 25/28 Ａ６１Ｐ 25/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 25/08 15/00 Ａ 25/14 5/00 Ｂ 25/16 Ａ６１Ｋ 37/24 25/28 37/48 Ｃ１２Ｎ 5/10 37/60 7/00 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA01 BA12 BA21 BA32 CA04 DA02 EA02 FA06 FA15 HA17 4B065 AA90X AA91Y AA93Y AA95Y AB01 BD39 CA24 CA31 CA44 4C084 AA13 CA62 DA01 DB01 DB52 DC22 DC28 MA55 MA58 MA63 MA66 NA14 ZA012 ZA022 ZA062 ZA162 4C086 EA16 MA55 MA58 MA63 MA66 NA14 ZA01 ZA02 ZA06 ZA16 4C087 BC83 MA55 MA58 MA63 MA66 NA14 ZA01 ZA02 ZA06 ZA16

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 神経系疾患治療用の治療有効物質をコードする異種核酸配列
    を含む組換えまたは誘導バキュロウイルス。
  2. 【請求項２】 治療有効物質をコードする異種核酸配列を含んでおり、脊椎
    動物、好ましくはヒトの神経系の細胞に感染し該細胞中で前記治療有効物質を発
    現させる能力を有している組換えまたは誘導バキュロウイルス。
  3. 【請求項３】 異種核酸配列が遺伝子またはアンチセンス配列であることを
    特徴とする請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 異種核酸配列が、ホルモン、リンホカイン、増殖因子、神経
    伝達物質合成酵素、栄養因子、または、アミノ酸、脂質もしくは糖質の代謝に関
    与するタンパク質から選択される治療有効物質をコードする遺伝子であることを
    特徴とする請求項３に記載のバキュロウイルス。
  5. 【請求項５】 栄養因子が、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４／５、ＮＴ
    ６のようなニューロトロフィンのファミリーに属する因子、ＣＮＴＦ、アキソカ
    イン、ＬＩＦ、ＩＬ６、カルジオトロフィン、ＧＤＮＦのようなＣＮＴＦのファ
    ミリーに属する因子、ＩＧＦ−１、ＩＦＧＦ−２のようなＩＧＦのファミリーに
    属する因子、ＦＧＦ１、２、３、４、５、６、７、８、９のようなＦＧＦのファ
    ミリーに属する因子及びＴＧＦ−βから選択されることを特徴とする請求項４に
    記載のバキュロウイルス。
  6. 【請求項６】 治療有効物質をコードする遺伝子がβ−グルクロニダーゼを
    コードする遺伝子であることを特徴とする請求項４に記載のバキュロウイルス。
  7. 【請求項７】 バキュロウイルスのエンベロープタンパク質以外のエンベロ
    ープタンパク質を発現するバキュロウイルスであることを特徴とする請求項１か
    ら６のいずれか一項に記載の組換えバキュロウイルス。
  8. 【請求項８】 エンベロープタンパク質が、狂犬病ウイルスの糖タンパク質
    であるかまたはＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）の糖タンパク質であることを特
    徴とする請求項７に記載のバキュロウイルス。
  9. 【請求項９】 異種核酸配列を発現させ得るプロモーター配列を更に含むこ
    とを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の組換えバキュロウイルス
    。
  10. 【請求項１０】 プロモーター配列が、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラー
    ゼ）、ＮＦ（ニューロフィラメント）、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、Ｄ
    ＡＴ（ドーパミン輸送体）、ＣｈＡＴ（コリンアセチルトランスフェラーゼ）、
    ＤＢＨ（ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ）、ＴＰＨ（トリプトファンヒドロキ
    シラーゼ）、ＧＡＤ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）、ＧＦＡＰ（グリアフィ
    ラメント酸性タンパク質）、などの遺伝子のプロモーターから選択されることを
    特徴とする請求項９に記載のバキュロウイルス。
  11. 【請求項１１】 治療有効物質の分泌または特異的区画形成を誘発し得るシ
    グナル配列を更に含むことを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載
    の組換えバキュロウイルス。
  12. 【請求項１２】 神経系疾患治療用医薬組成物の製造を目的とする、治療有
    効物質をコードする異種核酸配列をゲノムに含む組換えまたは誘導バキュロウイ
    ルスの使用。
  13. 【請求項１３】 異種核酸配列が遺伝子またはアンチセンス配列であること
    を特徴とする請求項１２に記載の組換えバキュロウイルスの使用。
  14. 【請求項１４】 異種核酸配列が、ホルモン、リンホカイン、増殖因子、神
    経伝達物質合成酵素、栄養因子、または、アミノ酸、脂質もしくは糖質の代謝に
    関与するタンパク質から選択される治療有効物質をコードする遺伝子であること
    を特徴とする請求項１３に記載の組換えバキュロウイルスの使用。
  15. 【請求項１５】 栄養因子が、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４／５、Ｎ
    Ｔ６のようなニューロトロフィンのファミリーに属する因子、ＣＮＴＦ、アキソ
    カイン、ＬＩＦ、ＩＬ６、カルジオトロフィン、ＧＤＮＦのようなＣＮＴＦのフ
    ァミリーに属する因子、ＩＧＦ−１、ＩＦＧＦ−２のようなＩＧＦのファミリー
    に属する因子、ＦＧＦ１、２、３、４、５、６、７、８、９のようなＦＧＦのフ
    ァミリーに属する因子及びＴＧＦ−βから選択されることを特徴とする請求項１
    ４に記載の組換えバキュロウイルスの使用。
  16. 【請求項１６】 治療有効物質をコードする遺伝子が、リソソーム病に関与
    する治療有効物質をコードする遺伝子、特に、β−グルクロニダーゼをコードす
    る遺伝子であることを特徴とする請求項１４に記載の組換えバキュロウイルスの
    使用。
  17. 【請求項１７】 請求項１から１１のいずれか一項に記載の１種または複数
    の組換えバキュロウイルスに感染した神経系細胞（例えば、脳細胞、脊髄細胞、
    神経細胞、グリア細胞、上衣細胞）の集団。
  18. 【請求項１８】 請求項１から１１のいずれか一項に記載の１種または複数
    の組換えバキュロウイルスに感染したヒト細胞を含む移植組織。
  19. 【請求項１９】 医薬として許容されるビヒクルに会合した請求項１から１
    １のいずれか一項に記載の１種または複数の組換えバキュロウイルスを含む医薬
    組成物。
JP2000561340A 1998-07-24 1999-07-23 バキュロウイルス由来のベクター及び脊椎動物の神経細胞に核酸を導入するための該ベクターの使用 Withdrawn JP2003527816A (ja)

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