JP7187036B2 - 外因性ミトコンドリアを細胞内に送達する方法 - Google Patents
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Description
ヒト脂肪細胞由来間葉系幹細胞(AD-MSC;PCS-500-011、パッセージ#7)、ヒト乳がん細胞株(MCF-7;HTB-22、パッセージ#20)、ヒト腺癌肺胞上皮細胞(A549;CCL-185、パッセージ#20)、ヒト白血病細胞株(K562;CCL-243、パッセージ#20)、ヒト肝細胞株(WRL-68;CL-48、パッセージ#9)、ヒト皮膚線維芽細胞(HDF;PCS-201-012、パッセージ#9)およびヒトナチュラルキラー細胞株(NK-92;CRL-2407、パッセージ#10)はAnimal Type Culture Collection社(Manassas、VA)より購入した。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC;MSC-001F、パッセージ#7)はSTEMCELL Technologies,Inc.(Vancouver、Canada)より購入した。細胞型による送達効率(%)を比較するため、完全に解凍するまで全ての細胞株を37℃の浴に保存した。その後、直ちに細胞株をミトコンドリア送達に用いた。
以下の例では、ミトコンドリアの送達を追跡するために10×および20×の開口数を有するTCS SP5 II共焦点顕微鏡(Leica、Heidelberg、Germany)を用いた。デジタルイメージはLeica LAS AFソフトウェア(Leica Microsystems、Mannheim、Germany)の2.6バージョンを用いて確認した。
ミトコンドリアの単離
1.1.L6細胞中のミトコンドリアの単離
調製例2で培養したL6を緑色のミトコンドリア特異的マーカー(Mitotracker green)で染色した。緑色蛍光が細胞内ミトコンドリアで良好にラベルされるかを確認するために蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。
ヒト臍帯由来間葉系幹細胞(UC-MSC、CHA bundang medical centerより提供、IRB No.201412-BR-003-02)からミトコンドリアを単離するため、分別遠心分離を用いた。ミトコンドリアを抽出するため、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を測定し、約2×107細胞の量の細胞を収集した。
ドナー細胞から単離したミトコンドリアの活性および機能の確認
2.1.ドナー細胞から単離したミトコンドリアの活性の測定
例1の方法に従ってヒト肝細胞株、WRL-68、ヒト皮膚線維芽細胞、HDF、およびヒト臍帯由来間葉系幹細胞、UC-MSCからミトコンドリアをさらに単離した。このようにして単離したミトコンドリアの活性を測定するため、シトクロムc酸化活性アッセイキット(BioVision Inc.)を用いた。それぞれの細胞中のミトコンドリアをキットに含まれた還元型シトクロムcと反応させ、1分間隔で30分間、550nmの吸光度を測定した。経時的に測定した吸光度の変化から、還元型に対するミトコンドリアの酸化能を計算した。それぞれの細胞株から得られたミトコンドリアのシトクロムc酸化活性を測定し、図4に示す。
UC-MSCから単離したミトコンドリアの機能を確認するため、単離したミトコンドリアについてビシンコニン酸(BCA)アッセイを用いてミトコンドリアタンパク質の濃度を定量し、種々の濃度(0.05μg、0.5μg、および5μg)でATPを測定した。ミトコンドリア中のATPの量は、ATPの量に比例して発光シグナルを発生するCellTiter-Gloル発光キット(Promega Corporation、Madison、WI)を用いて測定した。
ドナー細胞から単離したミトコンドリアの純度の測定
UC-MSCから単離したミトコンドリアの純度を測定するため、ミトコンドリアの単離プロセスで得られたサイトゾル分画とミトコンドリア分画中のミトコンドリアマーカー[シトクロムCオキシダーゼ(COX IV)およびシトクロム]ならびに核マーカー[増殖細胞核抗原(PCNA)およびβ-アクチン]の発現をウェスタンブロット解析で確認した。結果を図6に示す。
ドナー細胞から単離したミトコンドリアの送達の確認
4.1.WRL-68から単離したミトコンドリアの送達および活性の確認
ミトコンドリア特異的MitoTrackerプローブを用いて、WRL-68から単離したミトコンドリアの送達および送達されたミトコンドリアの活性を確認した。ミトコンドリアの生存率および呼吸能を、赤色蛍光を有するMitoTracker Red CMXRos(CMXRos)プローブがミトコンドリア膜電位(MMP)に応じて集積するという特徴によって確認した。さらに、レシピエント細胞であるUC-MSC中のミトコンドリアをMitoTracker Green(MTG)プローブで染色した。MitoTracker Red CMXRosプローブで染色したWRL-68から単離した外因性ミトコンドリアを、MitoTracker Greenプローブで染色したUC-MSCと混合した。次いで遠心分離を開始した。MitoTracker Red CMXRos(CMXRos)プローブおよびMitoTracker Green(MTG)プローブのそれぞれによる観察で得られたイメージをそれぞれ図7Aおよび7Bに示し、2つのイメージが合体したイメージを図7Cに示す。
ミトコンドリア特異的MitoTracker Red CMXRos(CMXRos)プローブを用いて、UC-MSCから単離したミトコンドリアの送達および送達されたミトコンドリアの活性を確認した。さらに、細胞内ミトコンドリアをMitoTracker Green(MTG)プローブで染色した。さらに、ミトコンドリアの単離の前にUC-MSCをMitoTrackerプローブで染色し、37℃で30分インキュベートした。ミトコンドリアの単離プロセスを行った後、ミトコンドリアペレットを10μlのPBSと混合し、スライドに載せ、カバースライドで覆い、蛍光顕微鏡で観察した。MitoTracker Red CMXRos(CMXRos)プローブおよびMitoTracker Green(MTG)プローブのそれぞれによる観察で得られたイメージをそれぞれ図7Gおよび7Hに示し、2つのイメージが合体したイメージを図7Iに示す。
ミトコンドリア送達率を確認するため、MitoTracker Greenを用いて例5.1と同じ方法でFACSを行った。これらの結果を図8に示す。
ミトコンドリアの送達を実証するため、ミトコンドリア送達の後のドナー細胞またはレシピエント細胞を、特異的プライマーを用いる従来のPCRに供し、レシピエント細胞中におけるmtDNAの発現を実証した。
例4.4で確認した定性的結果とともに定量的結果を得るため、外因性ミトコンドリアが送達されたL6細胞において、送達されたミトコンドリアに特異的なヒトmtDNAコピーの数とミトコンドリア送達の前のヒトmtDNAコピーの数との比較を行った。この結果を図10に示す。図21において、黒色の棒(上から1番目)は、ミトコンドリアを抽出した後の送達すべきミトコンドリアの濃度に対するmtDNAのコピー数を確認することにより得られた結果を表わす。明灰色の棒(上から2番目)は、遠心分離によってレシピエント細胞にミトコンドリアを送達した後のレシピエント細胞中のmtDNAのコピー数を確認することにより得られた結果を表わす。暗灰色の棒(上から3番目)は、遠心分離でなく共インキュベーション(24時間)によるミトコンドリア送達の後のmtDNAのコピー数を確認することにより得られた結果を表わし、これは遠心分離法によって得られた送達率に対する比較の数値を示すことを意図している。
レシピエント細胞の性質によるミトコンドリア送達の相違を比較するため、種々の細胞へのミトコンドリアの送達率をFACS解析によって測定した。3つの細胞株(幹細胞、がん細胞、および体細胞)を選択した。細胞を付着性および浮遊性細胞型に分類し、UC-MSC由来のミトコンドリアを遠心分離によってそれぞれの細胞型に送達した。その後、FACS解析を行った。結果を図11に示す。
レシピエント細胞へのミトコンドリアの送達
例1に従って単離した外因性ミトコンドリアをレシピエント細胞に効果的に送達するため、図12に示した迅速かつ簡単な遠心分離法を用いた。図12に示すように、本方法は良好なミトコンドリア活性能を有するドナー細胞からミトコンドリアを迅速に単離するプロセス(工程1)、単離したミトコンドリアをレシピエント細胞に送達するプロセス(工程2)、および得られた細胞を種々の用途(インビトロ、インビボ(臨床および前臨床))に適用するプロセス(工程3)に大別することができる。
例1に従ってWRL68から抽出したミトコンドリアをレシピエント細胞である1×105個のUC-MSCと混合することによって得られた組成物を例2の方法で処理して、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、および20μgのミトコンドリアがUC-MSCと混合されるようにした。ここで、FACS解析を行ってミトコンドリアの濃度による送達率を測定し、その結果を図13および14に示す。
ヒト肝細胞株、WRL-68から抽出したミトコンドリアと、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞、UC-MSCとを例1の方法で混合し、1,500×gの速度、約4℃の温度で15分の遠心分離に供した。上清を除去し、PBSで洗浄し、約4℃の温度で5分の遠心分離に供した。洗浄は同じ条件下で2回行った。レシピエント細胞1×105個あたりミトコンドリア重量6.25、12.5、および25μgで送達されたドナー細胞のミトコンドリアを確認するため、レシピエント細胞中のDNAを抽出し、PCRで確認した。
種々の遠心速度(500×g、1,000×g、1,500×g、および2,000×g)および種々の遠心時間(5分、10分、および15分)によるそれぞれの濃度(0.05μg、0.5μg、および5μg)でのミトコンドリアの送達を評価した。それぞれの条件によってレシピエント細胞に送達されたミトコンドリアを、FACS解析による緑色蛍光の割合によって確認した。結果を図17に示す。
ドナー細胞、UC-MSCから単離したミトコンドリアをレシピエント細胞L6細胞と混合した。例5.3で確認したミトコンドリア送達の最適条件によって、得られた混合物を速度1,500×g、約4℃の温度で5分の遠心分離に供した。上清を除去し、PBSによる洗浄を2回行ない、約4℃の温度で5分の遠心分離を行った。レシピエント細胞1×105個あたり送達されたドナー細胞のミトコンドリアを確認するため、レシピエント細胞中のDNAを抽出し、PCRで確認した。
界面活性剤処理後のミトコンドリア送達率の測定
6.1.界面活性剤処理およびインキュベーション後のWRL-68由来のミトコンドリアの送達率の測定
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を小径チューブに採取した。次いで細胞の上層に、Mitotracker greenで染色した肝細胞株WRL-68由来のミトコンドリアを少量添加した。界面活性剤(PF-68;BASF SE)を組成物中それぞれ0、10、および30mg/mlになるようにチューブに添加し、37℃の温度で0、1、2、および4時間、インキュベーションプロセスを行ない、全部で12種の実験群を構成するようにした。次いで遠心分離プロセスを行ない、例5の方法でWRL-68由来のミトコンドリアをCHO細胞に送達した。これをFACSで解析し、結果をそれぞれ図19および20に示す。
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を小径チューブに採取した。次いで細胞の上層に、Mitotracker greenで染色したドナー細胞、UC-MSCのミトコンドリアを少量添加した。界面活性剤(PF-68;BASF SE)を組成物中それぞれ0mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、および30mg/mlになるようにチューブに添加し、37℃で0、1、および2時間、インキュベーションプロセスを行ない、全部で12種の実験群を構成するようにした。遠心分離プロセスを行っていない実験群のミトコンドリア送達率をFACS解析によって測定することにより得られた結果を図21に示す。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
[1] 外因性ミトコンドリアをレシピエント細胞に送達する方法であって、
a)前記レシピエント細胞を、ドナー細胞から単離したミトコンドリアと混合する工程、および
b)得られた混合物を遠心分離する工程
を含む方法。
[2] 前記工程a)において、前記ミトコンドリアが前記レシピエント細胞の細胞1×10 5 個あたり0.005~25μgの重量で含まれるように、前記ミトコンドリアおよび前記レシピエント細胞が前記混合物中に存在する、[1]に記載の方法。
[3] 前記工程b)において、前記遠心分離が1~2,400×gで0℃~40℃の温度で0.5~20分間行われる、[1]に記載の方法。
[4] 前記工程b)の前に界面活性剤を添加する工程をさらに含む、[1]に記載の方法。
[5] 前記混合物中の前記界面活性剤が1および100mg/mlの濃度を有する、[4]に記載の方法。
[6] 前記工程b)の前にインキュベーションを行う工程をさらに含む、[1]に記載の方法。
[7] 前記インキュベーションが0℃~40℃の温度で0.1~4時間行われる、[6]に記載の方法。
[8] 前記ドナー細胞および前記レシピエント細胞がそれぞれ、体細胞、幹細胞、がん細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される何れか1つである、[1]に記載の方法。
[9] 前記体細胞が筋細胞、肝細胞、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞、骨細胞、白血球、リンパ球、粘膜細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される何れか1つである、[8]に記載の方法。
[10] 前記ドナー細胞が前記レシピエント細胞と同種または異種である、[1]に記載の方法。
[11] 前記ドナー細胞および前記レシピエント細胞が同じ対象からまたは異なった対象から得られたものである、[1]に記載の方法。
[12] [1]~[11]の何れか1つに記載の方法によって外因性ミトコンドリアが送達された細胞。
Claims (11)
- 外因性ミトコンドリアをレシピエント細胞に送達する方法であって、
a)前記レシピエント細胞を、ドナー細胞から単離したミトコンドリアと混合する工程、
b)非イオン性界面活性剤を添加する工程、ここで、前記非イオン性界面活性剤はポロキサマーである、および
c)得られた混合物を遠心分離する工程
を含む方法。 - 前記工程a)において、前記ミトコンドリアが前記レシピエント細胞の細胞1×105個あたり0.005~25μgの重量で含まれるように、前記ミトコンドリアおよび前記レシピエント細胞が前記混合物中に存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程c)において、前記遠心分離が1~2,400×gで0℃~40℃の温度で0.5~20分間行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記混合物中の前記界面活性剤が1mg/ml~100mg/mlの濃度を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程c)の前にインキュベーションを行う工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記インキュベーションが0℃~40℃の温度で0.1~4時間行われる、請求項5に記載の方法。
- 前記ドナー細胞および前記レシピエント細胞がそれぞれ、体細胞、幹細胞、がん細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される何れか1つである、請求項1に記載の方法。
- 前記体細胞が筋細胞、肝細胞、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞、骨細胞、白血球、リンパ球、粘膜細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される何れか1つである、請求項7に記載の方法。
- 前記ドナー細胞が前記レシピエント細胞と同種または異種である、請求項1に記載の方法。
- 前記ドナー細胞および前記レシピエント細胞が同じ対象からまたは異なった対象から得られたものである、請求項1に記載の方法。
- 前記ポロキサマーがPF-68である、請求項1に記載の方法。
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