CN101473033B - 将物质转移进细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种方法，通过该方法，可以通过方便的流程将多种类型的、想要转移进细胞的物质连续转移进多种类型的细胞，本发明还提供了细胞，其已经通过该方法吸纳了想要转移进细胞的物质，本发明还提供了用于通过该方法将物质转移进细胞的装置。前述目标可通过下述过程实现：用不含待转移进细胞的物质的液体对细胞进行电喷雾，同时细胞保持与待转移进细胞的物质相接触，或者首先用不含待转移进细胞的物质的液体对细胞进行电喷雾，然后将细胞与所述待转移进细胞的物质相接触。

Description

将物质转移进细胞的方法

技术领域

本发明涉及将待转移进细胞的物质连续方便地转移进细胞的方法；通过上述方法将待转移进细胞的物质转移进去的细胞；以及用于通过上述方法转移待转移进细胞的物质的装置。更具体地，本发明涉及将物质转移进细胞的方法，所述方法包括：为了使待转移进细胞的物质被允许吸纳进细胞中，对不含待转移进细胞的物质的液体进行电喷雾以产生液滴，并在存在待转移进细胞的物质的情况下将所述液体喷雾到细胞上，或者首先将液滴喷雾到细胞上，然后将待转移进细胞的物质与细胞相接触；还涉及通过上述方法已经吸纳了待转移进细胞的物质的细胞；以及用于通过上述方法将物质转移进细胞的装置。

用于转移基因(例如DNA和RNA)、蛋白质(例如酶和抗体)以及化学物质(例如药品)转移进细胞的方法、通过这些方法获得的细胞以及利用这些方法的装置在生物技术相关领域(例如医药、药学和农业以及临床设置(settings)，例如基因疗法和将疗法靶向癌细胞)的研究和开发中是有用的措施。

背景技术

已经开发了很多方法和装置用于将希望被转移进细胞的物质转移进细胞的流程，特别是基因重组流程，其中基因(DNA和RNA)被引入细胞。

例如，感受态细胞通常用于具有细胞壁(含肽葡聚糖、纤维素等，例如，参见非专利文献1)的细菌和酵母。其是这样的方法，其中细胞被改造以容易地吸纳物质，然后对细胞进行热激等处理，以允许物质被吸纳。但是，该方法存在如下问题：用于培养待使用的细胞的条件必须被严格调控，细胞必须被冷冻或用含有金属离子的溶液处理并且还不能杀死细胞，因此该方法复杂且耗费时间(例如，参见非专利文献2和3)。

动物细胞通常比细菌和生物微生物的细胞增殖更慢，并且具有很不同的细胞结构和细胞膜结构。因此，通常认为将物质转移进动物细胞要比转移进微生物细胞更难，对于动物细胞来说需要非常精细的操作。因此，将基因(例如DNA或RNA)或其它待转移进细胞的物质转移进动物细胞无法轻易实现。

已经提出了靶向动物细胞的若干种方法。一个例子是磷酸钙方法(例如，参见非专利文献4)。其是这样的方法：其中制备含有DNA的磷酸钙颗粒，以允许其通过内吞作用被吸纳。但是，该方法有所缺陷，流程复杂且转移效率低下。作为对该方法的改良，又提出了一种方法，其中，使用阳离子聚合物等试剂和脂质体以允许物质被吸纳进细胞(例如，参见非专利文献5和6)。但是，该方法也存在问题，因为其需要非常复杂的流程来将试剂和细胞混合，并且待使用的试剂价格昂贵。此外，这些试剂可能对细胞有致死作用(取决于剂量)，它们仅可以在非常有限的浓度范围内使用。

除了这些方法之外，利用病毒将物质转移进细胞的方法也是可获得的(例如，参见非专利文献7)。但是，使用病毒时，复杂的纯化流程是必需的。因为使用病毒会有如下风险：物质可能被转移进并不靶向的细胞或组织。此外，因为使用病毒，还要考虑生物危害风险。

电穿孔是允许待转移进细胞的物质被吸纳进细胞的公知方法(例如，参见专利文献1)。其是这样的方法：其中向含有基因和细胞的悬浮液应用高脉冲电压，以允许悬浮液中含有的基因被吸纳进细胞。该方法应用广泛，基因转移效率高。但是，鉴于基因转移效率与细胞死亡率具有比例关系，物质的转移不能独立于细胞死亡而进行。具体地，该方法具有下述缺点：如果脉冲条件不合适的话，不仅靶向的物质难于转移进细胞，并且细胞还可能死亡。此外，为了防止所谓的牵引(towing，这是向溶液中放电)，当应用电压时细胞悬浮液的电导率必须被降低。为达到此目的，用离心等方法来分离和洗涤细胞的流程是必需的，其间细胞可能死亡。

此外，颗粒枪被用作为将物质转移进细胞的方法(例如，参见专利文献2)。其是这样的方法：将携带基因的金、钨等微颗粒射进细胞。待转移进细胞的物质被微颗粒携带，以增加整体质量，这允许细胞以高能量击中，以穿透细胞膜。该方法允许通过微颗粒击中细胞的高转移效率，但是存在缺陷，当有很多细胞时，微颗粒不能均匀击中细胞，从而难于增加总的转移效率。此外，还方法还具有下述缺点：将细胞附着到微颗粒上的流程等是必需的，耗材(例如用于携带物质的微颗粒和用于释放压力的安全隔膜(rupture disc))价格昂贵。此外，还有如下缺点：装置体积大，因为必须用等离子体爆炸(爆炸性的或压缩气缸)来发射微颗粒，细胞被气体冲击分散，因为颗粒留在细胞中故而细胞容易受到损伤，在发射重复进行后颗粒聚集在细胞内，等等。微颗粒在细胞内的驻留和聚集是人们不想看到的，特别是对于基因疗法来说，因为细胞死亡的可能性将会增加。此外，鉴于待使用的微颗粒的大小是0.5至3μm，因此难于将该方法应用到，例如微小的细胞上，例如，大小为大约1μm的细菌，虽然相对大的细胞，例如，植物和动物细胞(具有10至100μm的大小)则没什么问题。

电喷雾被用作为高速喷雾液体的方法。电喷雾是这样的方法，其中，通过向喷雾管应用高压在喷雾管的尖端收集电荷，液体被运经已经聚集有电荷的管尖端，由此允许液体被转化为微小带电荷液滴，并被高速喷雾到靶上。该方法已具体地用作为质谱中的离子化方法(例如，参见非专利文献8和9)。

作为利用该电喷雾的颗粒枪技术之一有这样一种方法：其中，通过毛细管尖端向含有颗粒的悬浮液应用高压，以将它们喷雾到细胞上(例如，参见专利文献3)。该方法使用电喷雾，以加速附着有待转移进细胞的物质的颗粒或含有物质与颗粒的液体。在某些情况下，该方法具有缺点：毛细管尖端可能被颗粒堵塞，因为使用了含有颗粒的悬浮液。此外，与常用的颗粒枪一样，该方法具有固体留在细胞中的缺点。此外，每次改变待转移进细胞的物质的时候，都必须要进行用于携带颗粒的流程，虽然要转移一种类型的想要转移进细胞的物质使这并非必要。此外，用于悬浮液的液体转移系统每次使用时必须经过洗涤和置换，流程复杂和耗时的问题仍没有解决。此外，鉴于含有待转移的物质的悬浮液被喷雾，装置内部可能被污染。此外，火花放电更可能在管和细胞之间发生，因为喷雾溶液中含有的溶质的量增加了。

在背景领域的一些情况下，需要提供这样的方法和装置，其中，待转移进细胞的物质可被方便并且连续地转移进细胞，并且不需要将待转移进细胞的物质附着到载体例如颗粒上，以及其中，多种类型的待转移进细胞的物质可在短时间内被连续转移进多种类型的细胞。

专利文献1：美国专利No.4945050

专利文献2：日本专利No.2606856

专利文献3：美国专利No.6093557

非专利文献1：H.Inoue，H.Nojima，H.Okayama，Gene，1990，vol.96(1)，p23-28

非专利文献2：J.Haensler，F.C.Szoka Jr，Bioconjugate Chem.，1993，vol.4，p374-379

非专利文献3：P.L.Felgner，T.R.Gadek，M.Holm，R.Roman，H.W.Chan，M.Wenz，J.P.Northrop，G.M.Ringold，and M.Danielsen，1147766570484_-0.’)；1987，vol.84(21)，p7413-7

非专利文献4：F.L.Graham，A.J.Van Der Eb，Virology，1973，vol.52，p446-467

非专利文献5：J.Haensler，F.C.Szoka Jr，Bioconjugate Chem.，1993，vol.4，p374-379

非专利文献6：P.L.Felgner，T.R.Gadek，M.Holm，R.Roman，H.W.Chan，M.Wenz，J.P.Northrop，G.M.Ringold，and M.Danielsen，1147765309078_-0.’)；1987，vol.84(21)，p7413-7

非专利文献7：D.Yu，T.Shioda，A.Kato，M.K.Hasan，Y.Sakai，Y.Nagai，1147765309078_-1.’)；1997，vol.2(7)，p457-66

非专利文献8：J.B.Fenn，M.Mann，C.K.Meng，S.F.Wong，C.M.Whitehouse，Science，1989，vol.246，p64-/1

非专利文献9：Z.Takats，J.M.Wiseman，B.Gologan，R.G.Cooks，Science，2004，vol.306，p471-473

发明内容

本发明要解决的问题

本发明的一个目的是提供将想要转移进细胞的物质引入细胞的方法，例如，将高分子量的生物活性物质(例如基因，包括DNA和RNA)引入细胞，所述方法能连续方便地将物质引入细胞，并且无需复杂的载体附着流程或者混合颗粒的流程或者无需在每次改变待转移物质时洗涤和置换液体转移系统的流程，并且，所述方法能容易地将不同种类的物质转移进不同细胞样品，并且还提供了通过该方法获得的细胞以及用于通过该方法将物质转移进细胞的装置。

解决问题的手段

本发明的发明人已经进行了深入的研究，以达成前述目的。结果他们出人意料地发现，应当通过在将待转移进细胞的物质转移进细胞时电喷雾不含待转移进细胞的物质的液体，来产生液滴，并使所述液滴与细胞相接触，由此待转移进细胞的多种类型的物质可被高效转移进多种类型的细胞。因此，本发明已被实现。

具体地，本发明涉及将物质转移进细胞的方法，其特征在于，不含待转移进细胞的物质的液体被电喷雾到细胞上，还涉及通过该方法获得的细胞以及用于通过该方法将物质转移进细胞的装置，如下文(1)至(9)所述。

(1)用于将物质转移进细胞的方法，所述方法包括电喷雾不含待转移进细胞的物质的液体，使得液滴产生，并且与细胞相接触，从而使得物质转移进细胞。

(2)根据前述(1)的用于将物质转移进细胞的方法，其中，所述液体与和待转移进细胞的物质共存的细胞相接触。

(3)根据前述(1)的用于将物质转移进细胞的方法，其中，所述液滴首先与细胞接触，然后所述细胞与待转移进细胞的物质接触。

(4)根据前述(3)的用于将物质转移进细胞的方法，其中，所述细胞与待转移进细胞的物质在所述液滴与所述细胞接触后的30分钟或更少的时间内相接触。

(5)根据前述(1)的用于将物质转移进细胞的方法，其中，液体和细胞之间的电势差为0.1kV至100kV。

(6)根据前述(1)的用于将物质转移进细胞的方法，其中，被电喷雾的所述液体是不含待转移进细胞的物质的水或不含待转移进细胞的物质的水性溶液。

(7)根据前述(1)的用于将物质转移进细胞的方法，其中，所述待转移进细胞的物质是基因。

(8)细胞，其中，待转移进细胞的物质已经通过前述(1)至(7)中任一项所述的方法转移进去。

(9)用于通过前述(1)至(7)中任一项所述的方法将物质转移进细胞的装置。

发明效果

根据本发明，想要被转移进细胞的物质，特别是基因，可无需复杂预处理就被转移进细胞。具体地，想要被转移的物质可直接转移进细胞，而不用进行提前将所述物质附着到载体上的复杂预处理流程，因此细胞中不会留有载体。此外，鉴于载体颗粒大小对本发明没有加以限制，因此本发明可应用于微米以下级至数微米的小细胞(例如细菌)上。

此外，本发明的装置无需任何昂贵的金属微颗粒或安全隔膜，因此处理成本得以降低。此外，鉴于无需改变待喷雾的液体等，多种类型的基因可在短时间内连续转移进多种类型的细胞。由此，较之传统方法，基因重组等流程需要的时间可显著降低，并且可对大量样本加以加工。

附图简述

图1是显示下述情况的示意图，其中进行电喷雾的同时保持细胞与待转移进细胞的物质相接触；

图2是显示下述情况的示意图，其中先进行电喷雾，然后将细胞与待转移进细胞的物质相接触；

图3是用于将物质转移进细胞的示意图；

图4是用于将物质转移进细胞的装置的管的示意图；

图5是具有移动机械的、用于将物质转移进细胞的装置的示意图；

图6是用于实验中的用于将物质转移进细胞的装置的图；

图7是荧光显微照片，其显示了引入了GFP基因的CHO细胞；

图8是电泳照片，其显示了抗氨苄青霉素菌株的质粒；

图9是用于实施例III-1的、用于将物质转移进细胞的装置的示意图；以及

图10是荧光立体显微照片，其显示了引入了GFP基因的鸡胚。

实施本发明的最佳模式

下文中将详细解释本发明的实施方式。

对用于本发明的细胞并没有特别限制，其可以是动物细胞、植物细胞和微生物细胞中的任何。除了细胞之外，组织、器官和生物体也包括在内。并且显而易见地，繁殖性细胞，例如卵、精子、花粉、孢子和种子也可被靶向。

本发明对于动物细胞特别有效。动物细胞被具体定义为基于五界系统属于动物界和属于原生动物的生物以及源自它们的细胞。属于动物届的生物是由真核细胞构成的多细胞生物，它们不具有光合能力并且是异养性的。该届包括多孔动物门、腔肠动物门、扁形动物门、袋形动物门、环节动物门、软体动物门、节肢动物门、毛颚动物门、棘皮动物门、原索动物和脊椎动物门。此外，原生动物是属于原生生物届的单细胞生物，它们由真核细胞构成，并且是异养性的。

当使用细菌、酵母、有丝真菌、古生菌和植物等有细胞壁的细胞时，可以预计到，通过使用具有受损的细胞壁或通过移除细胞壁而使得质膜暴露的那些，转化效率会有所提高。当存在能产生上述状态的物质时，可进行喷雾。此类细胞的具体例子包括感受态细胞和细胞壁被削弱的细胞(例如原生质体)，它们可能被允许与Ca离子、Li离子、Rb离子、Cs离子、Mg离子、Mn离子、Zn离子、纤维素酶、果胶酶和用于制备这些细胞的其它物质共存。此外，它们可被允许与聚合物(例如，聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、聚精胺、聚蓖麻毒(polyricin)和聚乙二醇)和表面活性剂(例如脂质体和胶束)共存。为允许这些物质共存，可适当选择之前将它们加入要进行喷雾的细胞溶液的方法或在喷雾阶段对它们加以混合的方法。

本发明的特征在于，不含待转移进细胞的物质的液体被电喷雾，使得液滴产生，并与细胞相接触，以将物质转移进细胞。更具体地，为使得待转移进细胞的物质被吸纳进细胞，不含待转移进细胞的物质的液体被电喷雾到细胞上，同时细胞保持与待转移进细胞的物质相接触，或者不含待转移进细胞的物质的液体先被电喷雾到细胞上，然后令细胞与待转移进细胞的物质相接触。

电喷雾在本发明中表示：通过允许液体穿过高压应用的细管尖端以将液体转化为液滴，以及将小的液体微颗粒以高速喷射到靶细胞上，这是通过液滴表面的电荷排斥实现的。图1显示了本发明的一种实施方式，其中不含待转移进细胞的物质的液体被电喷雾到细胞上，同时细胞与待转移进细胞的物质相接触。

在图1中，细胞(细胞)与待转移进细胞的物质(材料A)共存。不含待转移进细胞的物质的液体(材料B)被电喷雾到其上。随后可以获得已转移进待转移进细胞的物质(细胞中的材料A)的细胞。通过将不含物质的液体电喷雾到与所述物质共存的细胞上来将待转移进细胞的物质转移进细胞。即，液体并非用以直接转移进细胞，而是用于允许物质被吸纳进细胞。

图2显示了另一实施方式，其中，不含待转移进细胞的物质的液体首先被电喷雾到细胞上，然后令细胞与待转移进细胞的物质相接触。

在图2中，用不含待转移进细胞的物质的液体(材料B)对细胞(细胞)进行喷雾。然后，加入待转移进细胞的物质。随后，待转移进细胞的物质可被转移进细胞。当细胞在喷雾后的较短时间内与所述物质接触时，物质更易于转移。这取决于细胞的状况和类型以及喷雾条件，但是理想地，细胞在30分钟或更少的时间内与所述物质接触，优选15分钟或更少的时间内，更优选3分钟或更少的时间内。当待转移进细胞的物质与细胞接触时，所述物质优选以溶液形式存在，但其也可以是含有所述物质的粉末等形式，只要细胞不受影响即可。

应用到管尖端的电压可被设置为最优值，这是从与细胞的距离、管的尺寸、流速和待被电喷雾的液体的性质等获得的。关于管尖端的液体和细胞的电势差而言，电压优选在0.1kV至100kV的范围内，更优选在1kV至20kV的范围内。当电压低于0.1kV时，靶标物质进入细胞的转移效率较低。此外，高于100kV的电压并非优选的，因为所述物质进入细胞的转移效率预计没有显著提高，而细胞死亡的风险有所增加。

管尖端的内部直径优选为0.01μm至10mm，更优选为1μm至5mm。小于0.01μm的管尖端并不优选，因为过窄的流通通道从而需要非常高的压力。另一方面，当内部直径高于10mm时，喷雾的液体并不转化为液滴，从而可能不产生电喷雾。

当进行电喷雾时，管尖端和细胞之间的距离优选为0.1μm至2000mm。当所述距离比该范围更短时，容易发生故障。当所述距离比该范围更长时，应用的电压对于理想状况而言过高了。所述距离优选为1μm至500mm。

待被电喷雾到细胞上的液体的量可以根据细胞的数量、类型和形状而有所改变。此外，电喷雾时间因此而改变。

具体地，例如，当直径为3.5cm的培养皿上的粘着动物细胞被电喷雾时，待喷雾的液体的量优选在1μL至4mL的范围内，更优选在10μL至2mL的范围内。

此外，当直径为6cm的培养皿上的微生物菌落被电喷雾时，待喷雾的液体的量优选在1μL至8mL的范围内，更优选在10μL至4mL的范围内。

为实现本发明的目标，待被电喷雾的液体需要不含对细胞产生不利影响的物质。用水或水性溶液作为此类液体是优选的。水可以是离子交换水、蒸馏水或灭菌水中的任何。此外，水性溶液可含有金属离子、有机溶剂、大分子化合物、培养基、缓冲物质等。作为可被含有于水中的金属离子的更具体的例子，周期表中I至XV组的金属离子是优选的，I至III组或VI至XII组的金属离子是优选的。特别地，经常用于生物化学实验的Li、Na、K、Cs、Mg、Ca、La、Cr、Mo、W、Mn、Fe、Co、Ni、Cu和Zn离子的水性溶液易于使用。这些金属离子可以以卤化物、有机酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硼酸盐、碳酸盐、硅酸盐等的任何形式提供。

可被待电喷雾的液体含有的有机溶剂的例子包括：甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、聚丙二醇、丙酮、甲乙酮、乙酸乙酯、二甲基亚砜、环丁砜、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、丙醇胺、二丙醇胺、三丙醇胺、氯仿、亚甲基氯、乙酰胺、甲基乙酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、甲酰胺、甲基甲酰胺、二甲基甲酰胺、聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、己烷、三醋精等。

可使用的大分子化合物的例子包括聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、聚乙二醇、聚乙烯醇、亚精胺、琼脂、淀粉、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸、角叉胶等。

待喷雾的液体中可含有的培养基的例子包括LB培养基、Sauton’s培养基、SOB培养基、Ham’s培养基、Eagle’s培养基、经修饰的Eagle’s培养基、RPMI培养基、Fisher’s培养基、MCDB培养基、white’s培养基和Murashige and Skoog培养基。除了这些之外，氨基酸、蔗糖、山梨糖醇、蛋白胨、酵母提取物、表面活性剂、血清等也可作为培养基组分被含有在内。

用于生物化学实验中的混合物，例如，EDTA水溶液、tris(羟甲基)氨基甲烷氯化氢缓冲液(tris缓冲液)、tris-EDTA缓冲液(TE缓冲液)、磷酸盐缓冲液(PBS)、tris-乙酸-EDTA缓冲液(TAE缓冲液)、Hanks’平衡盐溶液(HBSS)和Eagle’s平衡盐溶液(EBSS)可以作为平衡缓冲液使用。

对将在本发明中使用的水性溶液的浓度并没有特别限制。但是如果溶液与所用的细胞的渗透压差异过大以至于对其有不利影响的话，那么应当对浓度加以调节。此外，为提高转移效率，优选地，允许共存在有通常可用于靶标细胞的基因转移试剂(例如脂质体和碱性聚合物)。

对本发明中的待转移进细胞的物质并没有特别限制，其特别有用的例子是基因。具体例子包括DNA、RNA和其相似化合物或衍生物。它们以质粒、噬菌体、病毒、类病毒、寡聚DNA、寡聚RNA、微小RNA等形式提供。对核苷酸序列的大小并没有特别限制。核苷酸可以是双链或单链的。

此外，通常，比基因更小的物质可在本发明中更容易地转移。此类物质的例子包括蛋白质、肽、糖、脂类、农业化学品、杀细菌剂、金属离子、经荧光标记的试剂、经同位素标记的试剂等。

通过本发明的方法将物质转移进细胞的机制尚未明确，但预测为如下机制。当液体成为电喷雾状态时，产生了大量的小电荷液滴。它们被喷雾以轰击细胞。由此，细胞内外的电场不平衡，从而在细胞膜中产生了孔，然后再这些孔附近存在的物质被认为经由所述孔被吸纳进细胞。我们认为，这些孔在电喷雾后开始闭合，其在大约30分钟内恢复。

液体可在对细胞没有致死作用或爆炸危险的气体(例如空气、氮气、二氧化碳、氩气和SF6)氛围下被喷雾。在这方面，空气和氮气是通常使用并且易于使用的。

对压力没有特别限制，只要细胞可被处理而不会杀死它们即可，1pa至1Mpa的范围是易于使用的。大气压是特别易于使用的。

为防止污染，例如其它微生物的掺入，在抗菌条件下进行喷雾是非常重要的。具体地，可通过在箱盒中喷雾或者通过使用干净的橱柜等来防止污染。此外，鉴于可通过本发明以与重力相反的方向喷雾液体，细胞可被置于上方，以防止在喷雾进行时掺入下落的污染来源。

对电喷雾期间的温度没有特别限制。细胞不会死的任何温度都可使用，室温是容易使用的。

图3显示了用于通过本发明将物质转移进细胞的方法将物质转移进细胞的装置的示意结构，其中，电喷雾在细胞和待转移进细胞的物质共存的情况下进行。

所述装置由高压电源1、管2、液体(材料B)3和细胞和待转移进细胞的物质(细胞+材料A)4组成。向其应用电压的液体3经由管2喷雾到细胞和待转移进细胞的物质4上。此时，通过高压电源1向液体3应用电压。随后，液体3被电荷化，并从管2喷雾到细胞和待转移进细胞的物质4上。更具体地参照该机械，用于向液体3应用电压的高压电源1与管2通过电缆等相连。此外，所述的管位于细胞和待转移进细胞的物质4可被喷雾的位置。

通过高压电源在应用电压的管尖端将液体电荷化并转化为液滴，以产生电喷雾状态。当应用电压时，液滴表面的电荷排斥变得比液滴表面张力更大，液体被制为微小的，由于电场作用，带电荷的液滴被高速喷雾到细胞上。鉴于电喷雾的形成取决于电压、与细胞的距离、管的尺寸、液体流速、液体性质等而有所变化，所述装置具有可根据目的加以适当调节的结构。

所述装置具有泵，使得液体可定量供给给所述管。如果所述装置没有泵的话，那么材料利用重力或压力供给给所述的管。相反，泵使得更容易地定量供给液体成为可能。管泵、活塞泵、隔膜泵、注射泵等可作为泵使用，技术人员可根据目的从中选择。

所述装置的结构将被更具体地解释。高压电源在待喷雾的液体和靶细胞之间产生电势差。在本发明中，流经的电流的量很小，对其没有特别限制。1mA或更低就足够了。高压电源和管连到一起。它们可通过高压电缆相连。

应用到待喷雾液体上的电压可以是正的或负的。在本发明中，将液滴喷雾到细胞上可以通过放电来进行，但是自然放电持续持续时间长到损伤细胞是不优选的。

所述管的材料可以是金属、塑料、玻璃、陶瓷等，对其没有特别限制。但是，当使用非导电材料制成的管时，需要使用其中提供有与液体相接触的电极的管，或者在其表面涂布有导电物质的管。图4示意性显示了管和高压电源之间连接的例子。

当导电材料(例如金属)用于A中示出的管时，管连接有电极，使得供给其中的液体可被电荷化。B显示了绝缘体(例如玻璃)用于管的情况。在该情况中，导电电极(例如金属)被放置于其中，以使得液体被电荷化。C显示了这样的情况，其中，电极内部涂布有导电物质，管的内部与高压电源相连，以使得液体被电荷化。

管尖端的形状不仅可以是直的，其还可以是锥形的，但是对其没有特别限制。此外，管可以是双管结构，气体可以与液体一起供给。用于质谱的电喷雾管等可以用作为所述的管。此外，可使用可供给痕量液体的纳米喷雾，只要待转移进细胞的物质的转移效率不降低即可。

对于喷雾来说至少一只管就是足够的，但多只管使得将液体更广泛地喷雾到细胞表面成为可能，并且使得同时处理多个样本成为可能。

其中细胞和待转移进细胞的物质放到一起的容器并没有被特别限制，只要其可接收从管喷雾的液体，并且当喷雾在细胞聚集体(例如菌落、组织和个体生物)上进行时，其是可应用的。例如，当细胞被靶向时，容器(例如培养皿和试管)是易于使用的。

为对液体加以喷雾以将物质高效转移进细胞，可制造出与地的连接，以使得静电势消失，从而可获得优选范围内的细胞和容器间电势差。具体地，当喷雾在与待转移进细胞的物质一起放置于培养皿中的细胞上进行时，优选地，细胞通过培养皿中与细胞接触的溶液或凝胶与地相接。即使在可旋转或被定位成使得细胞可均匀获得液滴喷雾的台上放置或移动细胞时，也不会产生问题。

如果向装置提供了电磁光学系统，那么喷雾的位置和液体喷雾上的区域程度就可被控制。例如，可通过将具有屏障(mask)、透镜和瞄准器功能的组分放到喷雾进行的区域上游，就可在更加固定的区域上喷雾液滴。此外，四极透镜等能对喷雾加以定位、扫描等等。对于屏障功能而言，可使用有机聚合物材料、金属或陶瓷制成的板状(膜)元件来确定喷雾范围。此外，带电荷的金属屏障或电介质屏障元件可用于透镜和瞄准器功能。

在本发明中，待电喷雾的液体不一定要改变，其可以是同样的液体，即使细胞或待转移物质的类型有所改变。因此，例如，可使用96孔微板等容器，将不同物质连续转移进每个孔中的不同细胞。例如，如果每个孔中放有不同细胞与不同基因，那么可在短时间内进行高效基因转移。

具体地，例如，可通过将电喷雾管附着到可以以XY方向移动的臂上，，来连续处理大量样品。备选地，可以在XY台上放置并移动细胞，使得细胞可被移动。此外，可以使用沿着X轴移动的管和沿着Y轴移动的台的组合。移动机械可以是XY型的或者是阶梯形的，电动、气动或人力中的任何可用作为这种移动的能量。它们还可被进一步提供机械位置控制功能，使得可实现操作的自动化和节省劳力。

图5显示了具体移动机械。D是其中的台以XY方向移动的机械。E是其中的管以XY方向移动的机械。F是其中的管以X方向移动并且其中的台以Y方向移动的机械。

根据本发明，待转移进细胞的物质或转移所靶向的细胞的类型可以改变，而无须改变待电喷雾的液体。此外，此类改变可通过应用上述机械高效实现。此外，即使细胞被改变，待电喷雾的液体也无须改变，从而可以实现高效转移。此外，鉴于本发明中的主要耗材是待电喷雾的液体，其可以是水，因此物质的转移可以以非常低的成本进行。

此外，无需复杂流程，可通过电喷雾液体和将细胞与待转移进细胞的物质接触，来将生物化学上重要的物质(例如基因)容易地转移进细胞。此外，在进行电喷雾之前，可以任选地加上除去用于细胞培养的培养基或者用洗涤剂洗细胞等流程。

下文中将通过实施例和比较实施例更具体地解释本发明。但是，本发明并不限于这些实施例。

实施例I-1

1.实验装置

用于本实验的装置如图6所示。

高压电源1与管2通过高压电缆相连，再进一步与地相接。管2由不锈钢制成，其是luer lock类型的，外径为0.36mm，内径是0.18mm。其与样品注射端口6相连。待喷雾的液体3从该样品注射端口转移。泵5是供给空气的管泵。通过该气压将待被电荷化的液体3推至管。此时，经由纤维素乙酸盐制成的过滤器8提供空气。动物细胞和待转移进细胞的物质4倍放置到60mm的聚苯乙烯培养皿上。培养皿被设置到支柱10上。该支柱与地相接。培养皿的内部通过不锈钢带9与支柱相连，使得内部与地相接。待喷雾的部分被设置于带铝框的丙烯酸容器中，该容器具有272x260x370mm的内部尺寸，HEPA清洁单元7被设置在容器的顶部，其能以大约0.25m/s的速度以0.5m³/分钟的量喷发(blast out)。清洁的空气从顶部流下，在容器底部提供了出口。

2.将基因转移进动物细胞

上述装置1被用作为实验装置。

掺有绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒(4.7kbp)被用作为待转移进细胞的物质。从中华仓鼠卵巢活检建立的成纤维细胞(CHO细胞)被用作为细胞。CHO细胞以1.0×10⁴的浓度被接种到35mm的培养皿上，在CO₂培养箱中于37℃在α-MEM培养基+10％FBS组成的培养基中培养4天。用于细胞的培养基被移除，向其中加入浓度为50μg/mL的100μL质粒。

将100μL水以从管尖端到支柱2cm的距离喷雾。此时，向管应用-7kV。电喷雾形式的水从管喷雾到培养皿中的动物细胞上。喷雾后，培养基被放置于培养皿中，再培养4天。

通过用荧光显微镜观察到显示出绿色荧光的细胞验证了基因的转移。图7显示了转移进GFP基因的CHO细胞的荧光显微图像。

实施例I-2

以与实施例I-1相同的方式来进行实验，区别在于：向细胞和质粒溶液中进一步加入400μL培养基后进行100μL水的喷雾。此时，向管应用-7kV。结果，通过用荧光显微镜观察到显示出绿色荧光的细胞验证了基因的转移。

实施例I-3

以与实施例I-1相同的方式来进行实验，区别在于：向管应用-10kV的电压。结果，通过用荧光显微镜观察到显示出绿色荧光的细胞验证了基因的转移。

实施例I-4

以与实施例I-1相同的方式来进行实验，区别在于：100μL水被喷雾到细胞上，而不加质粒。此时，向管应用-7kV，在喷雾后1分钟加入质粒溶液。结果，通过用荧光显微镜观察到显示出绿色荧光的细胞验证了基因的转移。

实施例I-5

以与实施例I-1相同的方式来进行实验。区别在于：使用24孔聚苯乙烯板作为容器，每个孔都与金属地线相接。向管应用-10kV的电压。结果，通过用荧光显微镜观察到每个孔中显示出绿色荧光的细胞验证了基因的转移。

比较实施例I-1

以与实施例I-1相同的方式来进行实验，区别在于：在混合质粒之后不进行电喷雾。培养之后，用荧光显微镜观察细胞，但是细胞没有显示出任何荧光，即，基因转移失败。

实施例II-1

1.实验装置

用于本实验的装置如图6所示。高压电源1与管2通过高压电缆相连，再进一步与地相接。管2由不锈钢制成，其是luer lock类型的，外径为0.36mm，内径是0.18mm。其与样品注射端口6相连。待喷雾的液体3从该样品注射端口转移。泵5是供给空气的管泵。通过该气压将待被电荷化的液体3推至管。此时，经由纤维素乙酸盐制成的过滤器8提供空气。待使用的高压电源1被提供有断路器并且具有1mA的电流上限。细胞和待转移进细胞的物质4倍放置到60mm的聚苯乙烯培养皿上。培养皿被设置到支柱10上。该支柱与地相接。培养皿的内部通过不锈钢带9与支柱相连，使得内部与地相接。待喷雾的部分被设置于带铝框的丙烯酸容器中，该容器具有272 x 260 x 370mm的内部尺寸，HEPA清洁单元7被设置在容器的顶部，其能以大约0.25m/s的速度以0.5m³/分钟的量喷发(blast out)。清洁的空气从顶部流下，在容器底部提供了出口。

2.将物质转移进细胞的实验

将1.5％的琼脂糖-B培养基放在直径为6cm的聚苯乙烯培养皿中，埃希氏大肠杆菌HB101菌株被接种到整个培养皿上，在25℃培养两天，以使得菌落长满培养皿。

向培养基中加入100μL质粒pUC19(具有氨苄青霉素抗性基因)的TE缓冲液(105μg/mL)。然后通过不锈钢带，将培养皿中的琼脂糖培养基与地相接，将100μL水从2.5cm的高度喷雾到Escherichia coli菌落上。向管应用-7kV。

喷雾后，刮下培养皿中的菌落细胞，加入LB培养基，并离心。获得的细菌细胞沉淀物被接种到含有氨苄青霉素的1.5％琼脂糖-LB培养基上，在30℃培养两天。结果，菌落生长，显示Escherichia coli获得了氨苄青霉素抗性。

实施例II-2

重复与实施例II-1中所示相同的流程，区别在于，在喷雾期间应用-18kV的电压。获得的经离心细菌细胞被接种到含有氨苄青霉素的1.5％琼脂糖-LB培养基上，在30℃培养两天。结果，菌落生长，显示Escherichia coli获得了氨苄青霉素抗性。

实施例II-3

电泳实验

使用QIAGEN制造的质粒纯化试剂盒，从实施例II-1和II-2获得的抗氨苄青霉素Escherichia coli和经历了喷雾的HB101菌株收集质粒，然后在琼脂糖凝胶上进行电泳。

结果，实施例II-1和II-2中获得的抗氨苄青霉素菌株的质粒移动到了与用于基因转移的pUC19相同的电泳位置，这表明，通过使用本发明的方法，待转移进细胞的物质已经转移进细胞。在HB101菌株中没有观察到质粒(图8)。

实施例II-4

装备有用于移动喷雾位置的机械的小尺寸配送器机器人的喷嘴部分被电喷雾管替换。该机器人具有可以在X轴方向改变喷嘴位置并且在Y轴方向改变台的位置的机械，使得喷雾进行的同时可以对位置加以二维控制。具有四个孔的芯片状板通过金属线与地相连，进行喷雾。通过移动喷雾管对所有四个孔都进行喷雾。

比较实施例II-1

重复与实施例II-1中所示相同的流程，区别在于，不进行喷雾。获得的经离心细菌细胞被接种到含有氨苄青霉素的1.5％琼脂糖-LB培养基上，在30℃培养两天。结果没有菌落生长。

比较实施例II-2

重复与实施例II-1中所示相同的流程，区别在于，喷雾期间不应用电压。获得的经离心细菌细胞被接种到含有氨苄青霉素的1.5％琼脂糖-LB培养基上，在30℃培养两天。结果没有菌落生长。

实施例III-1(将基因转移进鸡胚的例子)

1.实验装置

用于该实验的电喷雾装置如图9所示。在图9的装置中，干电池被用作为电源13，以提供3V。该3V被升压电路11转化为+10kV，以与槽12相连。槽12由导电塑料制成，其被绝缘塑料覆盖，除了接触高电压的部分。槽的容量大约10mL。内部提供了气缸17，当轴18通过马达19旋转时，槽中的液体被转移至不锈钢管16，所述不锈钢管具有0.1mm的内径，并且具有与luer lock型的接合点15相连的luer lock。待喷雾液体从管中的供应速度是120μL/分钟。在该装置中，升压电路11、槽12、电源13、气缸17、轴18和马达19被装纳于装置箱14中，通过装置箱14外侧表面上提供的开关20来操作喷雾。

2.将基因转移进鸡胚的实验

用于本实验中的磷酸盐缓冲液(PBS)是由8g/L NaCl、0.2g/LKCl、2.9g/L NaHPO₄·12H₂O和0.2g/L KH₂PO₄组成的pH 7.3的溶液。

蛋孵化(37.8℃)其实后一天半，移出鸡胚，将其放到蛋白和琼脂的混合培养基上。向靶向区域逐滴加入0.1μL浓度为4.3μg/μL的质粒(4.7kba)溶液，其中掺有绿色荧光蛋白(GFP)基因(通过上述PBS中2％Fast Green令其发色)。30秒后，使用上述电喷雾装置从10cm的高度对上述PBS进行电喷雾15秒，同时通过显微镜加以监测。在37.8℃孵育细胞，第二天用荧光立体显微镜观察。结果显示于图10中。在图10中，在全长6-7mm的1mm区域中观察到了GFP的表达，这验证了基因已被转移。

符号描述

材料A：待转移进细胞的物质。

材料B：不含待转移进细胞的物质的液体。

细胞中的材料A：待转移进细胞的物质已经转移进去的细胞。

1：高压电源。

2：管。

3.不含待转移进细胞的物质的液体(材料B)。

4.细胞(细胞)和待转移进细胞的物质(材料A)。

5.管泵。

6.液体(材料B)注射端口。

7.清洁单元。

8.纤维素乙酸盐过滤器。

9.用于接地的不锈钢带。

10.支柱。

11.升压电路。

12.槽。

13.电源。

14.装置箱。

15.luer lock型接合点。

16.管。

17.气缸。

18.轴。

19.马达。

20.开关。

A：其中导电材料用于管的情况。

B：其中使用绝缘体(例如玻璃)的情况。

C：其中电极内部涂布有导电材料的情况。

D：其中装置具有使得所述台以XY方向移动的机械的情况。

E：其中装置具有使得所述管以XY方向移动的机械的情况。

F：其中装置具有使得所述管以X方向移动以及所述台以Y方向移动的机械的情况。

道a：大小标记。

道b：pUC19。

道c：HB101菌株。

道d：实施例II-1。

道e：实施例II-2。

Claims (4)

1.将物质转移进细胞的方法，所述方法包括：(a)不含待转移进细胞的物质的液体被电喷雾，使得液滴产生，并使之与细胞相接触，同时细胞保持与待转移进细胞的物质相接触，或

(b)不含待转移进细胞的物质的液体先被电喷雾，使得液滴产生，并使之与细胞相接触，然后令细胞与待转移进细胞的物质相接触，

其中被电喷雾的液体是水或水性溶液，

且所述方法排除用于疾病治疗或者人的繁殖性细胞。

2.根据权利要求1的将物质转移进细胞的方法，其中所述步骤(b)的细胞与所述待转移进细胞的物质在所述液滴与所述细胞接触后的30分钟或更少的时间内相接触。

3.根据权利要求1的将物质转移进细胞的方法，其中所述液体和所述细胞之间的电势差为0.1kV至100kV。

4.根据权利要求1的将物质转移进细胞的方法，其中所述待转移进细胞的物质是基因。

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