JP7465090B2 - 可逆的透過処理によるベクターフリー細胞内送達法 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第119条の下で、2016年12月22日に出願された米国仮特許出願第62/438,298号、2017年7月5日に出願された米国仮特許出願第62/528,963号、および2017年7月25日に出願された米国仮特許出願第62/536,831号に基づく優先権を主張し、これらの仮特許出願のそれぞれは参照により本明細書に明確に組み入れられる。
発明の分野
本発明は哺乳動物細胞内への作用物質の送達に関する。
発明の背景
異なる細胞タイプ間では細胞トランスフェクション効率にばらつきが存在する。非接着細胞などの浮遊細胞のトランスフェクションは、従来の方法では、非常に困難であることがわかっている。したがって、そのような細胞のトランスフェクションを容易にするための組成物および方法が必要とされている。
本発明は、非接着細胞中にペイロード/カーゴ化合物および組成物を送達するという課題に対する解決策を提供する。したがって、非接着細胞の形質膜を横切ってペイロードを送達する方法は、非接着細胞の集団を提供する工程、および、該細胞の集団をある体積の等張水溶液と接触させる工程であって、該水溶液がペイロードと濃度5％（v/v）超のアルコールとを含む、工程を含む。例えばアルコールはエタノール、例えば10％超のエタノールを含む。いくつかの例において、水溶液は20～30％のエタノール、例えば27％のエタノールを含む。
細胞にカーゴを送達するための水溶液は、塩、例えば12.5～500mMの塩化カリウム（KCl）を含む。例えば溶液は、ヒトT細胞などの哺乳動物細胞の細胞質に対して等張である。そのような等張送達溶液の一例は106mMのKClである。
本方法は、1種類または複数種類の任意のカーゴ分子を、接着性または非接着性の哺乳動物細胞に送達するために使用することができ、非接着細胞へのカーゴの送達には特に有用である。なぜなら、本発明以前は、そうすることに困難が伴ったからである。いくつかの例において、非接着細胞は末梢血単核細胞を含み、例えば非接着細胞はT細胞（Tリンパ球）などの免疫細胞を含む。T細胞などの免疫細胞は、CD3のリガンド、CD28のリガンド、またはそれらの組合せによって任意で活性化される。例えばリガンドは、CD3もしくはCD28またはその両方に結合する抗体または抗体フラグメントである。
本方法では、単層を構成する非接着細胞の集団に、送達溶液中のカーゴが送達される。例えば単層を水性送達溶液のスプレーと接触させる。本方法はペイロード/カーゴ（化合物または組成物）を細胞の細胞質中に送達し、ここで、細胞の集団が、エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションによるペイロードの送達と比較して、より大きい生存百分率を成す。これはソルポレーション（Soluporation）システムの大きな利点である。
任意の化合物または組成物を送達することができる。例えばペイロードはメッセンジャーリボ核酸（mRNA）、例えば遺伝子編集組成物をコードするmRNAを含む。例えば遺伝子編集組成物はPD-1またはPD-L1などの免疫チェックポイント阻害因子の発現を低減する。いくつかの例において、mRNAはキメラ抗原受容体（CAR）をコードする。
ある特定の態様において、非接着/浮遊細胞の単層はメンブレンフィルター上に存在する。いくつかの態様では、細胞単層を送達溶液のスプレーと接触させた後に、メンブレンフィルターを振動させる。メンブレンフィルターは、細胞への送達溶液のスプレー前、スプレー中、および/またはスプレー後に、振動または動揺させうる。
ウェルを含むプレートを受容するように構成された筐体、ウェルに圧力差を適用するように構成された圧力差適用装置、微粒化された送達溶液をウェルに送達するように構成された送達溶液適用装置、停止溶液をウェルに送達するように構成された停止溶液適用装置、および培養用培地をウェルに送達するように構成された培養用培地適用装置を備える、システムも本発明に包含される。停止溶液は細胞膜透過処理剤、例えばエタノールを欠くものである。一例は、リン酸緩衝食塩水または生理学的に適合する任意の緩衝溶液である。本システムは、圧力差をウェルに適用するための圧力差適用装置をウェルに隣接して整列させるように、微粒化された送達溶液をウェルに送達するための送達溶液適用装置をウェルに隣接して整列させるように、停止溶液をウェルに送達するための停止溶液適用装置をウェルに隣接して整列させるように、かつ/または培養用培地をウェルに送達するための培養用培地適用装置をウェルに隣接して整列させるように構成された、アドレス指定可能ウェルアセンブリを任意でさらに備える。
アドレス指定可能ウェルアセンブリは、ウェルを含むプレートを受容してプレートを少なくとも一方向に動かすように構成された可動ベースプレートを含むことができる。アドレス指定可能ウェルアセンブリは、送達溶液適用装置に、停止溶液適用装置に、および培養用培地適用装置に連結するように構成された、装着アセンブリを含むことができる。
送達溶液適用装置は、ネブライザーを含むことができる。送達溶液適用装置は、1回の作動あたり10～300マイクロリットルの送達溶液を送達するように構成されることができる。
本システムは、送達溶液の温度および/またはウェルを含むプレートの温度を制御するように構成された温度制御システムを備えることができる。
本システムは、ウェルを含むプレートの環境を制御するように構成されたエンクロージャを備えることができる。
圧力差適用装置はノズルアセンブリを含むことができ、該ノズルアセンブリは、ウェルの開口部とのシールを形成するように構成されておりかつウェル内の圧力を増大または減少させるために蒸気をウェルに送達するように構成されており、それによって、細胞の層がウェル内に留まっているように培養用培地の液体部分をウェルから押し出す。
停止溶液適用装置は、停止溶液リザーバに連結するように構成されたニードルエミッタを含むことができる。
培養用培地適用装置は、培養用培地リザーバに連結するように構成されたニードルエミッタを含むことができる。
本システムは、ユーザー入力を受け取るように、微粒化された送達溶液をウェル内の細胞単層に送達するために送達溶液適用装置を稼働させるように、送達溶液の適用後に細胞単層を第1のインキュベーション期間にわたってインキュベートするように、停止溶液を細胞単層に送達するために停止溶液適用装置を第1のインキュベーション期間の満了に応答して稼働させるように、かつ、細胞単層を第2のインキュベーション期間にわたってかつ停止溶液の適用に応答してインキュベートするように構成された、制御装置をさらに備えることができる。制御装置は、送達溶液適用装置の稼働、第1のインキュベーション期間にわたるインキュベーション、停止溶液適用装置の稼働、および第2のインキュベーション期間にわたるインキュベーションを、所定の反復回数反復するようにさらに構成されることができる。
本システムは、上清をウェルから除去してウェル内に細胞単層を生成するために陽圧システムを稼働させるように構成された制御装置をさらに備えることができる。
送達溶液適用装置は、スプレーヘッドとスプレーヘッドの遠位端を取り巻くカラーとを含むことができ、ここで、カラーは1枚のマルチウェルプレート中のウェル間での汚染を防止するように構成されており、カラーは、プレートとカラーの間に間隙を提供するように構成されている。
送達溶液適用装置は、スプレーヘッドとスプレーヘッドの遠位端を取り巻くフィルムとを含むことができる。
本システムは振動システムをさらに備えることができ、該振動システムは、メンブレンホルダーに連結されており、かつ、メンブレンを振動させるように構成されている。
本システムは、ウェルが非接着細胞の集団を含有するように構成されている、プレートをさらに備えることができる。
前記送達溶液は等張水溶液を含み、この水溶液は、ペイロードと濃度5パーセント（v/v）超のアルコールとを含む。アルコールはエタノールを含むことができる。水溶液は10％超のエタノールを含むことができる。水溶液は20～30％のエタノールを含むことができる。水溶液は27％のエタノールを含むことができる。水溶液は12.5～500mMのKClを含むことができる。水溶液は106mMのKClを含むことができる。
非接着細胞は末梢血単核細胞を含むことができる。非接着細胞は免疫細胞を含むことができる。非接着細胞はTリンパ球を含むことができる。非接着細胞の集団は単層を構成することができる。
ペイロードはメッセンジャーリボ核酸（mRNA）を含むことができる。mRNAは遺伝子編集組成物をコードすることができる。例えば遺伝子編集組成物はPD-1の発現を低減する。mRNAはキメラ抗原受容体をコードすることができる。
本システムは、カーゴ化合物またはカーゴ組成物を哺乳動物細胞に送達するために使用することができる。
別の一局面において、組成物は等張水溶液を含み、その水溶液は、カーゴ化合物またはカーゴ組成物を哺乳動物細胞に送達するために使用するための濃度10～500mMのKClと濃度5パーセント（v/v）超のエタノールとを含む。KCl濃度は106mMであることができ、かつアルコール濃度は27％であることができる。
MPS組成物に負荷される化合物は処理または精製される。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは他の作用物質は精製および/または単離される。具体的に述べると、本明細書にいう「単離された」または「精製された」核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、組換え技法によって生産された場合には他の細胞材料または培養用培地を実質的に含まず、化学合成された場合には化学前駆体その他の化学物質を実質的に含まない。精製された化合物は、少なくとも60重量％（乾燥重量）の関心対象化合物である。好ましくは、調製物は、少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも90重量％、最も好ましくは少なくとも99重量％の関心対象化合物である。例えば精製された化合物は、所望の化合物が重量で少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％、または100％（w/w）であるものである。純度は、任意の適切な標準的方法によって、例えばカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析によって、測定される。精製または単離されたポリヌクレオチド（リボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA））は、その自然状態においてそれに隣接している遺伝子または配列を含まない。精製されたとは、ヒト対象への投与にとって安全な無菌度、例えば感染性物質または毒性作用物質を欠くことも示す。腫瘍抗原の場合、抗原は精製されるか、または腫瘍細胞溶解物などの処理された調製物であることができる。
同様に、「実質的に純粋」とは、本来それに付随している構成要素から分離されたヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。通例、ヌクレオチドおよびポリペプチドは、それらが、少なくとも60重量％、70重量％、80重量％、90重量％、95重量％、さらには99重量％であり、それらに本来付随しているタンパク質および天然の有機分子を含まない場合、実質的に純粋である。
小分子は、質量が2000ダルトン未満の化合物である。小分子の分子質量は、好ましくは1000ダルトン未満、より好ましくは600ダルトン未満であり、例えば、この化合物は、500ダルトン未満、400ダルトン未満、300ダルトン未満、200ダルトン未満、または100ダルトン未満である。
「を包含する」、「を含有する」、または「を特徴とする」と同義である「を含む/備える」という移行語は、包括的または非制限的であり、かつ、具陳されていない追加の要素または方法工程を排除しない。対照的に、「からなる」という移行句は、当該請求項において明記されていない要素、工程または成分をいずれも排除する。「から本質的になる」という移行句は、特許請求の範囲を、明記された材料または工程に、ならびに特許請求される発明の「基本的で新規な特徴に実質的な影響を及ぼさないもの」に限定する。
[本発明1001]
非接着細胞の集団を提供する工程、および
該細胞の集団をある体積の等張水溶液と接触させる工程であって、該水溶液がペイロードと濃度5％（v/v）超のアルコールとを含む、工程
を含む、非接着細胞の形質膜を横切って該ペイロードを送達する方法。
[本発明1002]
前記アルコールがエタノールを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記水溶液が10％超のエタノールを含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記水溶液が20～30％のエタノールを含む、本発明1002の方法。
[本発明1005]
前記水溶液が27％のエタノールを含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記水溶液が12.5～500mMのKClを含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記水溶液が106mMのKClを含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記非接着細胞が末梢血単核細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記非接着細胞が免疫細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記非接着細胞がTリンパ球を含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記免疫細胞が、CD3のリガンド、CD28のリガンド、またはそれらの組合せによって活性化される、本発明1009の方法。
[本発明1012]
前記非接着細胞の集団が単層を構成する、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記単層を前記水溶液のスプレーと接触させる、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記方法が前記細胞の細胞質中に前記ペイロードを送達し、かつ、該細胞の集団が、エレクトロポレーションによる該ペイロードの送達と比較してより大きい生存百分率を成す、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記ペイロードがメッセンジャーリボ核酸（mRNA）を含む、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記mRNAが遺伝子編集組成物をコードする、本発明1005の方法。
[本発明1017]
前記遺伝子編集組成物がPD-1の発現を低減する、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記単層がメンブレンフィルター上に存在する、本発明1013の方法。
[本発明1019]
前記スプレーとの接触後に前記メンブレンフィルターを振動させる、本発明1013の方法。
[本発明1020]
前記mRNAがキメラ抗原受容体をコードする、本発明1015の方法。
[本発明1021]
ウェルを含むプレートを受容するように構成された筐体、
該ウェルに圧力差を適用するように構成された圧力差適用装置、
微粒化された送達溶液を該ウェルに送達するように構成された送達溶液適用装置、
停止溶液を該ウェルに送達するように構成された停止溶液適用装置、および
培養用培地を該ウェルに送達するように構成された培養用培地適用装置
を備える、システム。
[本発明1022]
アドレス指定可能ウェルアセンブリ
をさらに備え、
該アドレス指定可能ウェルアセンブリが、
前記圧力差を前記ウェルに適用するための前記圧力差適用装置を該ウェルに隣接して整列させる、
微粒化された前記送達溶液を該ウェルに送達するための前記送達溶液適用装置を該ウェルに隣接して整列させる、
前記停止溶液を該ウェルに送達するための前記停止溶液適用装置を該ウェルに隣接して整列させる、かつ/または
前記培養用培地を該ウェルに送達するための前記培養用培地適用装置を該ウェルに隣接して整列させる
ように構成されている、本発明1021のシステム。
[本発明1023]
前記アドレス指定可能ウェルアセンブリが、前記ウェルを含む前記プレートを受容して該プレートを少なくとも一方向に動かすように構成された可動ベースプレートを含む、本発明1022のシステム。
[本発明1024]
前記アドレス指定可能ウェルアセンブリが、前記送達溶液適用装置に、前記停止溶液適用装置に、および前記培養用培地適用装置に連結するように構成された装着アセンブリを含む、本発明1022のシステム。
[本発明1025]
前記送達溶液適用装置がネブライザーを含む、本発明1021のシステム。
[本発明1026]
前記送達溶液適用装置が、1回の作動あたり10～300マイクロリットルの前記送達溶液を送達するように構成されている、本発明1021のシステム。
[本発明1027]
前記送達溶液の温度および/または前記ウェルを含む前記プレートの温度を制御するように構成された温度制御システムをさらに備える、本発明1021のシステム。
[本発明1028]
前記ウェルを含む前記プレートの環境を制御するように構成されたエンクロージャをさらに備える、本発明1021のシステム。
[本発明1029]
前記圧力差適用装置がノズルアセンブリを含み、該ノズルアセンブリが、前記ウェルの開口部とのシールを形成するように構成されておりかつ該ウェル内の圧力を増大または減少させるために蒸気を該ウェルに送達するように構成されており、それによって、細胞の層が該ウェル内に留まっているように前記培養用培地の液体部分を該ウェルから押し出す、本発明1021のシステム。
[本発明1030]
前記停止溶液適用装置が、停止溶液リザーバに連結するように構成されたニードルエミッタを含む、本発明1021のシステム。
[本発明1031]
前記培養用培地適用装置が、培養用培地リザーバに連結するように構成されたニードルエミッタを含む、本発明1021のシステム。
[本発明1032]
ユーザー入力を受け取る、
微粒化された前記送達溶液を前記ウェル内の細胞単層に送達するために前記送達溶液適用装置を稼働させる、
該送達溶液の適用後に該細胞単層を第1のインキュベーション期間にわたってインキュベートする、
前記停止溶液を該細胞単層に送達するために前記停止溶液適用装置を該第1のインキュベーション期間の満了に応答して稼働させる、かつ
該細胞単層を第2のインキュベーション期間にわたってかつ該停止溶液の適用に応答してインキュベートする
ように構成された制御装置をさらに備える、本発明1021のシステム。
[本発明1033]
前記制御装置が、
前記送達溶液適用装置の稼働、前記第1のインキュベーション期間にわたるインキュベーション、前記停止溶液適用装置の稼働、および前記第2のインキュベーション期間にわたるインキュベーションを、所定の反復回数反復する
ようにさらに構成されている、本発明1022のシステム。
[本発明1034]
上清を前記ウェルから除去して該ウェル内に細胞単層を生成するために、陽圧システムを稼働させる
ように構成された制御装置をさらに備える、本発明1021のシステム。
[本発明1035]
前記送達溶液適用装置が、スプレーヘッドと該スプレーヘッドの遠位端を取り巻くカラーとを含み、ここで、該カラーが、1枚のマルチウェルプレート中のウェル間での汚染を防止するように構成されており、該カラーが、該プレートと該カラーの間に間隙を提供するように構成されている、本発明1021のシステム。
[本発明1036]
前記送達溶液適用装置が、スプレーヘッドと該スプレーヘッドの遠位端を取り巻くフィルムとを含む、本発明1035のシステム。
[本発明1037]
振動システムをさらに備え、該振動システムが、メンブレンホルダーに連結されており、かつ、メンブレンを振動させるように構成されている、本発明1021のシステム。
[本発明1038]
前記ウェルが非接着細胞の集団を含有するように構成されている、プレート
をさらに備える、本発明1021のシステム。
[本発明1039]
前記送達溶液が等張水溶液を含み、該水溶液がペイロードと濃度5パーセント（v/v）超のアルコールとを含む、本発明1021のシステム。
[本発明1040]
前記アルコールがエタノールを含む、本発明1038のシステム。
[本発明1041]
前記水溶液が10％超のエタノールを含む、本発明1039のシステム。
[本発明1042]
前記水溶液が20～30％のエタノールを含む、本発明1039のシステム。
[本発明1043]
前記水溶液が27％のエタノールを含む、本発明1038のシステム。
[本発明1044]
前記水溶液が12.5～500mMのKClを含む、本発明1038のシステム。
[本発明1045]
前記水溶液が106mMのKClを含む、本発明1038のシステム。
[本発明1046]
前記非接着細胞が末梢血単核細胞を含む、本発明1037のシステム。
[本発明1047]
前記非接着細胞が免疫細胞を含む、本発明1037のシステム。
[本発明1048]
前記非接着細胞がTリンパ球を含む、本発明1037のシステム。
[本発明1049]
前記ペイロードがメッセンジャーリボ核酸（mRNA）を含む、本発明1038のシステム。
[本発明1050]
前記mRNAが遺伝子編集組成物をコードする、本発明1049のシステム。
[本発明1051]
前記遺伝子編集組成物がPD-1の発現を低減する、本発明1050のシステム。
[本発明1052]
前記mRNAがキメラ抗原受容体をコードする、本発明1049のシステム。
[本発明1053]
カーゴ化合物またはカーゴ組成物を哺乳動物細胞に送達するために使用するための、本発明1021のシステム。
[本発明1054]
前記非接着細胞の集団が単層を構成する、本発明1037のシステム。
[本発明1055]
カーゴ化合物またはカーゴ組成物を哺乳動物細胞に送達するために使用するための濃度10～500mMのKClと濃度5パーセント（v/v）超のエタノールとを含む等張水溶液を含む、組成物。
[本発明1056]
前記KCl濃度が106mMであり、かつ前記アルコール濃度が27％である、本発明1055の組成物。
[本発明1057]
本明細書において説明または図示した装置、システム、技法、組成物、および物品。

本発明の他の特徴および利点は、その好ましい態様の以下の説明および特許請求の範囲から明白になる。別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験では、本明細書に記載するものと類似するか等価な方法および材料を使用することができるが、適切な方法および材料を以下に説明する。本明細書において言及する公開された外国特許および特許出願はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において言及するアクセッション番号によって示されるGenbankおよびNCBI登録物は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において言及する他の公表された参照文献、文書、稿本、および科学文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。矛盾が生じた場合は、定義を含めて本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および例は、単なる例示であり、限定を意図していない。
T細胞活性化の方法としてのフィーダー細胞の評価を図解する棒グラフである。cRPMI培地中で培養したT細胞にGFP mRNAを送達した。 図2Aは、StemCellTech試薬と2種類の濃度のDynabeadsとを比較したRPMI培地の結果を図解する棒グラフである。図2Bは、推奨濃度の3倍にあたるStemCell tech試薬を含むように（図2Aの）実験を繰り返したが、効果は何もなかったことを図解する棒グラフである。 Prime XV培養用培地およびDynabeads（3:1ビーズ対細胞）による活性化を使った取込みの改良を図解する棒グラフである。 図4Aは、Prime XV培地中で培養した場合の低い細胞回収率を図解する棒グラフである。図4Bは、Prime XV中で培養した場合の低い細胞回収率および細胞増殖のばらつきを図示する画像である。細胞はDynabeads（3:1）を使って活性化した。 Immunocult培養用培地中で培養したDynabead活性化T細胞の結果を図解する棒グラフである。 Dynabeadsを活性化試薬として使用してmRNAをT細胞に送達する場合の最適活性化後ウィンドウを図解する棒グラフである。 Immunocult時間経過におけるTransActとDynabeadの対比を図解する棒グラフである。 T細胞活性化因子としてTransActを使用した、TexMACSとImmunocultの対比の結果を図解する棒グラフである。 活性化前に放置して回復させた細胞が、融解後直ちに活性化されたものより高い取込み効率を示した結果を図解する棒グラフである。 ベクターフリー送達技術を使った送達に先だって、細胞を、より高い細胞密度で培養した結果を図解する棒グラフである。より高い細胞密度（5×106個/ml）がより高い取込み効率と相関した。 、培養用培地への塩化亜鉛の添加がより高い取込み効率をもたらしたことを図解する棒グラフである。 CD4＋T細胞での複数回ヒットがCD8マイクロビーズを使ってネガティブに選択されることを表す棒グラフである。ソルポレーションによって細胞にGFP mRNAをトランスフェクトした。複数回ヒットは試験した3つのドナーで取込みを改良した。 PBMC開始（PBMC-initiated）T細胞による、トランスフェクトされたmRNAの発現を表す棒グラフである。2～3日にわたってPBMCからT細胞を富化させた。ソルポレーションによって細胞にGFP mRNAをトランスフェクトした。 図14Aの線図、図14Bの写真、および図14Cの写真は、メンブレンインサートを表している。ThinCert 12ウェルインサートの例示的画像（図14A）。矢印で示されるOリング内にインサートが設置されるインサートデバイスの画像（図14B）。培地を除去するためにインサートに真空を適用することを可能にするためのシリンジに取り付けられたデバイス（図14C）。 浮遊細胞（非接着細胞）へのカーゴのSolupore送達を表す棒グラフである。蛍光標識されたβ-ラクトグロブリン（BLG）、ウシ血清アルブミン（BSA）または卵白アルブミン（OVA）を、インサートデバイスを使って形成させたJurkat細胞の単層に送達した。フローサイトメトリーによって発現レベルを分析した。 図16Aはマイクロタイタープレート（PESフィルタープレート）の写真であり、図16Bおよび図16Cは、トランスフェクトされたmRNAからの産物の発現を表すドットプロットである。Acroprep Advance、Suporメンブレン、96ウェルフィルタープレートの例示的画像（図16A）。T細胞へのmRNA送達の24時間後における5回の実験での5人のランダムドナーからのGFP発現レベル（図16B）。T細胞へのmRNA送達の24時間後におけるT細胞の相対生存率（図16C）。 PCTEフィルタープレートを使ったカーゴ送達の結果を表す棒グラフである。PCTE96ウェルプレートを使ったT細胞へのmRNA送達の24時間後における生存率およびGFP発現。 細胞へのカーゴ送達後のmRNA発現を表す棒グラフである（96ウェルフィルタープレートの比較）。mRNA送達後のT細胞におけるGFP発現。PCTEフィルタープレートまたはPESフィルタープレートのどちらか一方において細胞の単層を形成させた。 図19A～図19BはトランスフェクトされたmRNAの発現を表す棒グラフである。培地除去方法の比較。遠心分離または真空圧のどちらか一方によって、96ウェルフィルタープレートに播種した細胞から培地を除去した。（図19A）。遠心分離または陽圧のどちらか一方によって、96ウェルフィルタープレートに播種した細胞から培地を除去した（図19B）。ソルポレーションによってGFP mRNAを送達し、フローサイトメトリーによって発現を評価した。 図20Aおよび図20Bは細胞の写真である。Dynabeadに結合した細胞を使った単層形成（図20A）。ピペッティングによって培地を除去し、ソルポレーションによってGFP mRNAを送達した。24時間後に蛍光顕微鏡法でGFP発現を検出した（図20B）。 図21Aは、MSCへのGFP mRNAの送達を図解する一連の写真像である。ベクターフリー可逆的透過処理方法によってGFP RNAをBM-MSCおよびiPSC-MSCに送達し、蛍光顕微鏡法（倍率10倍）で分析した。図21Bは、フローサイトメトリーによって分析されたMSCへのGFP mRNAの送達を図解する棒グラフである;n＝3、データを平均±標準偏差として表す。 図22Aは緑色蛍光マーカーを示す細胞の表、図22Bは緑色蛍光マーカーを示す細胞の写真である。超音波ネブライザーを使ったAlexa488デキストラン10KDの取込み。超音波ネブライザーを使ったU2OS細胞へのデキストランの取込みを示す代表的データ。（a）最大64％のデキストラン取込みが達成されたデータを要約した表および（b）緑色デキストラン-Alex488を表す蛍光顕微鏡像。 ピンチバルブを使ったAri Mistネブライザーペイロード流体制御の写真である。画像は、送達溶液の微粒化を最適化するために使用した試験リグでのAri Mistネブライザーへのペイロード溶液の流体制御を示している。Elveflow送達溶液リザーバ（3）に接続されたピンチバルブ（2）にari mistネブライザー（1）が接続されている。 Ari Mist試験リグ縦断データを表すドットプロットである。グラフは、最適化実験中に収集された、Ari Mistネブライザーを使ったT細胞へのGFP mRNA効率を示している。データは、最大25％の平均取込み効率および複数回の繰り返し間の高い再現性を示している。 超音波180kHz試験リグ縦断データを表すドットプロットである。グラフは、最適化実験中に収集された、超音波ネブライザーを使ったT細胞へのGFP mRNA効率を示している。データは、最大30％の平均取込み効率および繰り返しの間の高い再現性を示している。 Nasalヘッド試験リグ縦断データを表すドットプロットである。グラフは、最適化実験中に収集された、MAD nasalヘッドネブライザーを使ったT細胞へのGFP mRNA効率を示している。データは最大22％の平均取込み効率を示し、複数回の繰り返し間の再現性は、Ari Mistおよび超音波スプレーヘッドと比較して低下している。 図27Aおよび図27Bは細胞上のアトマイザー高さを比較した結果を表す棒グラフである。アトマイザー高さを31、26、12、または11mmに設定してmRNAを送達した後のT細胞において、GFP発現を評価した。 送達溶液体積の比較を表す棒グラフである。体積が異なる送達溶液（4、1、または0.5μl）に入れてGFP mRNAを送達した後のT細胞におけるGFP発現。 塩濃度の比較を表す棒グラフである。12mMのKCl（低張）または106mMのKCl（等張）を含有する送達溶液にGFP mRNAを添加した。「低張」および「等張」は細胞の細胞質と比較した張性を指す。24時間における発現レベルをフローサイトメトリーで評価した。 「ヒット」数の比較を表す棒グラフである。T細胞にスプレー（ヒット）を1回、2回または3回行い、各スプレーの間に2時間のインキュベーションを挟んだ。24時間後にフローサイトメトリーでGFP発現を評価した。 T細胞播種密度の比較を表す棒グラフである。ウェル1個あたり1.25、2.5、3.5、5、および7.5×105個のT細胞を播種し、ソルポレーションによってGFP mRNAを送達した。フローサイトメトリーで24時間後にGFP発現を評価した。 細胞直径の分布を表す線グラフである。DynaBeads（ビーズ対細胞比3:1）添加の24時間後における平均T細胞直径（9.5μm）。 図33A～図33Cはエレクトロポレーションと比較したAvectas（ソルポレーション）の送達および生存率を表す棒グラフである。（図33A）において、A549細胞への10kDaデキストラン-Alexa488の送達効率はフローサイトメトリーによる定量で52.8％（±2.7％）であり、無処理対照と比較した細胞生存率はヨウ化プロピジウム排除およびフローサイトメトリーによる決定で78.3％（±4.1％）であった。（図33B）エレクトロポレーションの場合、送達効率は92.9％（±0.6％）であり、細胞生存率は73.0％（±9.8％）であった。（図33C）トランスフェクションスコア（（トランスフェクトされた細胞数/総細胞数）×（生細胞数/総細胞数））は、本主題の技術の場合は0.33（±0.05）およびエレクトロポレーションの場合は0.51（±0.13）で、スコア間に有意差はなかった、p＝0.25。 ソルポレーションとヌクレオフェクションの比較を表す棒グラフである。Soluporeまたはヌクレオフェクションのどちらか一方を使ってヒトT細胞にGFP mRNAをトランスフェクトした。24時間後にフローサイトメトリーによってGFP発現および細胞生存率（7-AAD）を分析した。 図35Aの棒グラフ、図35Bの線グラフ、図35Cおよび図35Dの写真は、カーゴのSolupore媒介送達とヌクレオフェクション媒介送達との間の蛍光強度の比較を表している。GFP mRNA送達の24時間後にヒトT細胞が生成するメジアン蛍光強度をSoluporeとヌクレオフェクションとの間で比較した（図35A）。ヒストグラムは強度の増加を表している（図35B）。ソルポレーション（明るい方）およびヌクレオフェクション後のGFPを発現するT細胞凝集物の例示的画像。 さまざまな量のmRNAを送達したSoluporeとヌクレオフェクションとの間の蛍光強度およびGFP発現の比較を表すドットプロットである。さまざまな量のGFP mRNAを送達した24時間後にヒトT細胞が生成するメジアン蛍光強度における用量応答を、ソルポレーション後およびヌクレオフェクション後に観察した。 図37Aの写真ならびに図37B、図37C、および図37Dの棒グラフは、細胞へのカーゴの送達の評価を表している。細胞中へのカーゴの拡散および形質膜の再シール形成。（図37A）10kDaデキストラン-Alexa488をA549細胞中に送達し、送達の30秒後、1分後、2分後および3分後に蛍光顕微鏡法で分析した（倍率10倍）。（図37B）A549を、クラスリン媒介エンドサイトーシスを阻害するためにDynasore（4mM）またはクロロプロマジン（chloropromazine）（20μM）で前処理するか、カベオラ媒介エンドサイトーシスおよび微飲作用をそれぞれ阻害するためにナイスタチン（20μg/ml）またはEIPA（100μM）で前処理した（n＝3）。これらの阻害因子はいずれもEGFP mRNAの取込みを阻止しなかった。（図37C）Lipofectamine 2000をエンドサイトーシス媒介送達の陽性対照として使用した。Dynasoreで処理したリポフェクトされた細胞（lipofected cell）ではGFP発現が有意に低減した（n＝3）。（図37D）透過処理後の細胞膜の回復を調べるために、送達溶液をカーゴの非存在下でA549細胞上にスプレーし、それ以後の時点（0～182.5分）において培地を取り出し、PBS中のヨウ化プロピジウム（100μg/ml）50μlを加えた。2分間のインキュベーション後に、PI溶液を取り除き、細胞を収穫した。PI取込みの基礎レベルについては、無処理の細胞にPBS中のPI 50μlを与えた。PI取込みをフローサイトメトリーで分析した。データは、細胞が処理後6分まではPIに対して透過性のままであるものの、その後、再シール形成し、その後の取込みを防止することを示す（n＝3）。エラーバーは3回の実験（n＝3）での標準偏差（SE）を表す。＊＊＊p＜0.001、独立した平均（independent means）に関するスチューデントのt検定。 図38Aは、T細胞上のPD-1表面発現を図解する棒グラフである。表示のデータは、対照群を100％に標準化した5回の独立した実験の平均である。図38Bは、トランスフェクションの72時間後にフローサイトメトリーで決定したT細胞上のPD-1表面発現を図解する写真像である。表示のデータは1回の独立した実験からのデータである。 光学顕微鏡による処理（矢印参照）後4日目のT細胞クローンを表す写真像であり、無処理対照および本明細書に記載のベクターフリー細胞内送達方法で処理した細胞における、T細胞の良好な増殖および活性化を示している。エレクトロポレーションを受けた細胞では観察されるクローンが有意に少なかった。表示のデータは1回の独立した実験である。 レンチ-T7-CD19-3rd-CARベクターのCAR構築物の概略図である。 図41Aは一本鎖可変フラグメント（scFv）の配列を図示する概略図である。図41BはCARカセットのヌクレオチド配列（コドンを最適化）を図示する概略図である。図41Cは、CARカセットのタンパク質配列を図示する概略図である。 CARベクターの制限消化地図を表す写真像である。 市販のCARベクターのQC結果および分析証明書を表す表である。 図44A～図44Bは市販のCARベクターのCAR配列アラインメントバリデーションを図示する概略図である。 本明細書に記載のベクターフリー送達技術によるmRNA送達後のヒト初代T細胞におけるCAR発現を表すフローサイトメトリーデータのドットプロットである。 図46Aは電気泳動ゲルの写真であり、図46Bはスーパーコイル核酸と開環状核酸の対比を表す棒グラフである。 図47A～図47Bは、T細胞におけるCD4およびCD8の発現にトランスフェクション方法が及ぼす効果を表すドットプロットである。ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション（Neon）、またはソルポレーションのいずれかの6時間後および24時間後に細胞表面CD4およびCD8の発現を調べた。6時間では、発現レベルは無処理対照細胞と類似していた。しかし24時間では、ソルポレートされた（soluporated）細胞およびヌクレオフェクトされた（nucleofected）細胞における発現が対照無処理細胞と類似していたのに対して、エレクトロポレートされた（electroporated）細胞では発現が有意に低減していた。 図48A～図48CはmRNAマイクロアレイ分析を表すドットプロットである。細胞にGFP mRNAをトランスフェクトした。最も高レベルの遺伝子発現変化はNeonエレクトロポレーション処理で起こった。分析した20,893個の遺伝子のうち、Soluporeでは32個の遺伝子が変化し、ヌクレオフェクションでは24個の遺伝子が変化し、エレクトロポレーションでは317個の遺伝子が変化していた。 細胞増殖を表す線グラフである。T細胞にGFP mRNAをトランスフェクトし、その後毎日7日間にわたって細胞を計数した。ソルポレートされた細胞およびヌクレオフェクトされた細胞における増殖速度は無処理対照細胞と類似していたが、Neonエレクトロポレートされた細胞の能力は、対照細胞と比較して低減していた。 凍結保存後の細胞増殖を表す線グラフである。T細胞にGFP mRNAをトランスフェクトし、トランスフェクションの24時間後に、細胞を10％DMSOおよびウシ胎児血清中で凍結保存した。細胞を融解し、0日目に、0.5×106個/mlでImmunocult培地＋IL-2に播種した。細胞を計数し、5日にわたって毎日、培地を追加することによって再播種した。ソルポレートされた細胞およびヌクレオフェクトされた細胞における増殖率は無処理対照細胞と類似していたが、エレクトロポレートされた（例えばNeon）細胞の能力は対照細胞と比較して低減していた。 インターフェロン-γ（IFNg）生産を表す一連の棒グラフである。ソルポレーション、ヌクレオフェクション、またはエレクトロポレーションの後のT細胞において、トランスフェクションの14日後に測定したIFNg生産は、対照細胞と比べて低減しなかった。 IFNg生産を表す棒グラフである。ソルポレートされた細胞、ヌクレオフェクトされた細胞、エレクトロポレートされた細胞、および無処理細胞を、トランスフェクションの24時間後に凍結保存した。次に、細胞をDynabeadsまたはPMA/イオノマイシンカクテルのどちらか一方で4時間再刺激し、それらの上清をIFN-γ生産について分析した。 図53A～図53Cは、処理後のCD 45＋細胞の評価を表す棒グラフである。NSGマウスへのヒトPBMCの注射後14日目における血液の分析。図53A. 無処理（UT）PBMCおよびソルポレートされた（Sol）PBMCを与えたマウスではヒトCD45＋細胞が検出された。ヌクレオフェクトされた（Nuc）PBMCを与えたマウスでは検出されるヒトCD45＋細胞の数が少なかった。図53B. 第2の群、第5の群、および第6の群ではCD4＋細胞の存在が確認された。図53C. 第2の群、第5の群、および第6の群ではCD8＋細胞の存在が確認された。 elveflow-ピンチバルブシステムを使った送達溶液に関する較正データを表す線グラフである。グラフは体積4μlの送達溶液の繰り返された微粒化に関する較正データを示している。オレンジ色のバーは、送達溶液の11回の繰り返しのスプレーから測定された体積を表し、ここで予期される体積は4μlであった。データは、この体積範囲において9.38％の相対標準偏差（％RSD）を示している。ピンク色のバーは、試料リザーバの再充填後の9回の繰り返しのスプレーから測定された体積を表す。これらのデータは、体積4μlをスプレーする場合の精度および正確度の欠如ならびにシステム再充填後の較正保持の欠如を含むelveflow-ピンチバルブシステムの制約を明確に示している。 力センサーパラメータ化1を表す線グラフである。力センサーをAri Mistアトマイザーの31、26、または11mm下に設置し、アトマイザーによって押し出される空気の圧力を0.5バール～2バールに調節した。Elveflowシステムに適用する圧力の量を調節することで、分注される液体の量も変化した。センサーが感じるピーク圧はボルトで測定される。 力センサーパラメータ化2を表す一連の線グラフである。力センサーをArimistアトマイザーの31、26、または11mm下に設置し、アトマイザーによって押し出される空気の圧力を1.15バール～2.15バールに調節した。センサーが感じるピーク圧はボルトで測定される。 力センサーGFP送達を表す棒グラフである。さまざまな空気圧および体積によるGFP mRNA送達後のGFP発現、生存率（生存）、およびピーク圧（ボルト）が図示されている。 Certus Flex機構の写真である。画像は、送達溶液がチャネル1に充填され、停止溶液がチャネル2に充填され、培養用培地がチャネル3に充填されているCertus flex機構を示している。 小滴アレイパターンの線図である。図は、試験した小滴アレイパターンを示しており、表1においてさらに詳しく説明する。ウェル中に送達される総体積を2μlまたは7μlとし、小滴の数を4個から25個まで増加させた。これは0.08～0.5μlの範囲の小滴体積に対応した。 図60Aの線図および図60Bの棒グラフは、播種マスクおよび播種マスクの効果を、それぞれ示している。播種マスクの存在下または非存在下でPCTEプレートのウェル中に播種された細胞におけるGFP mRNA発現の比較（図60A）。送達の24時間後にGFP発現を測定した（図60B）。 図61Aの棒グラフおよび図61Bの表は、Certus Flexデジタル分注技術を使った場合のGFP mRNA送達の欠如を示すデータを表している。（図61A）グラフは、Certus Flexを使った場合のmRNA送達の欠如を示す代表的データを図示している。このシステムを使用しても細胞生存率に有害な影響はなかった。（図61B）対応するデータセットを表に詳述する。 図62Aはカラーの効果を表す棒グラフであり、図62Bはカラーを表す写真である。Ari Mistスプレーヘッド上のエンクロージングカラーの試験（図62A）。グラフは、エンクロージングカラーなし（-カラー）、エンクロージングカラー付き（＋カラー）およびエンクロージングカラー付きでカラーと96ウェルプレートとの間に1mmの間隙あり（＋カラーおよび1mmの間隙）での送達効率を比較するデータを示している。結果は、エンクロージングカラーの追加がスプレーに対して負の影響を有し、カラーとウェルプレートとの間に1mmの間隙を残すと、それが打ち消されたことを示している。（図62B）画像はエンクロージングカラー機構を示している。カラーはAri Mistスプレーヘッド上に挿入される。スプレーヘッドは、ダブルハイトプレートのウェルの27mm上に位置して、カラーとウェルプレートの上部との間に1mmの間隙を残している。送達効率はこの機構による影響を受けなかった。 図63Aは、Gygerバルブを使った試験の結果を表す棒グラフであり、図63BはX-pierceフィルムの写真像である。グラフは、試験リグ1（Clippardピンチバルブを用いる）、試験リグ3（Gygerマイクロバルブを用いる）および試験リグ3とPCTEフィルタープレート上のX-pierceフィルムでの送達効率を比較した3回の独立した実験からのデータを表す。注:TR3およびGygerバルブのみ（TR3 Gyger）を比較する実験は2回だけ行った。結果は、Clippardバルブ（TR1）の代わりにGygerマイクロバルブ（TR3 Gyger）を使用すると送達効率が増大したことを示している。PCTEプレート上にX-pierceフィルムを追加しても、この送達効率には何も効果がなかった（TR3 Gyger＋エンクロージング）。各バーは最低4回の繰り返しで1回の実験を表している。 本主題のいくつかの局面による例示的プロセスを図解するプロセスフローチャートである。 送達システムの一態様を図解する線図である。 送達システムの9つの要素を図解する線図である。 送達システムの一態様の側面図である。 送達システムの一態様の一部分の透視図である。 図68に示す送達システムの拡大透視図である。 図68に示す送達システムの真空マニホールドアセンブリの分解上面透視図である。 図68に示す送達システムの真空マニホールドアセンブリの分解底面透視図である。 図70に示す真空マニホールドアセンブリのベースプレートの平面図を表す。 図72に示すベースプレートの側面断面図である。 図72に示す真空マニホールドアセンブリのトッププレートの底面図である。 図74に示すトッププレートの側面断面図である。 図74に示すトッププレートの平面図である。 図72に示す真空マニホールドアセンブリのウェルフィルタープレートの平面図である。 図72に示すウェルフィルタープレートの別の平面図であり、ここではウェルフィルタープレートが180°回転されている。 図67に示す高精度リグシステムの一部分の正面透視図である。 図67に示す高精度リグシステムの一部分の背面透視図である。 図67に示す高精度リグシステムの一部分の平面図である。 遠心分離および真空抽出後に観察されるグロージャーム（GlowGerm）粒子の分布である。 陽圧送達システムの6つの要素を図解する線図である。 マニホールドアセンブリ、モジュール式流体ヘッドモジュールを有する装着アレイ、X-Yアクチュエータおよび制御システムを含む陽圧送達システムの一態様の透視図である。 図84に示す陽圧送達システムの一部分の拡大図である。 垂直方向の動きを可能にするモジュール式流体ヘッドモジュールの拡大図である。 ニードルアセンブリが取り付けられた図86に示すモジュール式流体ヘッドモジュールである。ニードルアセンブリは培養用培地および停止溶液を分注するために使用される。 ネブライザーアセンブリが取り付けられた図86に示すモジュール式流体ヘッドモジュールである。ネブライザーアセンブリは、ペイロードおよび送達溶液を微粒化して、その溶液を細胞に送達するために使用される。 陽圧ノズルアセンブリが取り付けられた図86に示すモジュール式流体ヘッドモジュールである。陽圧ノズルアセンブリは培養用培地の除去に使用される。 培養用培地の除去に使用される、図84～85に示す陽圧システムの陽圧ノズルの側面図である。図90は、96ウェルフィルタープレートのウェルと接触しているノズルの遠位端を図解している。 図90に示す陽圧ノズルの一部分の拡大図である。陽圧ノズルはウェルとのシールを形成することが示されている。 フィルタープレートのウェルへの空気の送達を制御するためのバルブを含むノズルアセンブリの一部分の例示的一態様である。 送達溶液の微粒化を最適化するために使用されるネブライザーアセンブリの一態様である。ネブライザーアセンブリは、シリンジ、マイクロバルブおよびネブライザーを含む。ネブライザーは、連結要素（例えばプレカラム連結具）に連結される。マイクロバルブは、アダプターを介してシリンジに連結されるバルブホルダー内に保定され、かつ/または連結される。ネブライザーアセンブリは、ペイロード溶液をネブライザーに高い正確度および精度で送達することを可能にする。 180kHzで稼働する超音波エミッタに関して、ペイロード送達の効率を表すプロットである。 超音波エミッタ、Ari Mistネブライザー、およびMAD nasalスプレーエミッタについて、GFP取込みを特徴決定する一連のデータを表すプロットである。データは、超音波エミッタ（180Hz）、Ari MistネブライザーおよびMAD nasalスプレーエミッタについて、それぞれ32.7％、24.8％、および16.9％のGFP送達効率を示している。 超音波エミッタ、Ari MistネブライザーおよびMAD nasalスプレーエミッタについて、細胞生存率を特徴決定する一連のデータを表すプロットである。データは、超音波（180Hz）ネブライザー、Ari Mistネブライザー、およびMAD nasalネブライザーで、それぞれ72.3％、85.3％、および99.7％の相対細胞生存率を示している。データは、試験した各スプレーヘッドについて最低3回の技術的繰り返し実験を表している。 Ari Mistネブライザーのスプレーヘッドの周りに位置するエンクロージングカラーを含むネブライザーアセンブリの例示的一態様である。カラーはAri Mistスプレーヘッド上に挿入され、スプレーヘッドはフィルタープレートのウェルの底面から27mmに位置することで、カラーとフィルタープレートの上面との間に1mmの間隙が残る。 カラーなしのスプレーヘッド、フィルタープレートとのシールを形成するカラー付きのスプレーヘッド、およびカラーとフィルタープレートとの間に1mmの間隙が存在するカラー付きのスプレーヘッドに対応する効率（GFP取込み）を特徴決定するデータを表すプロットである。データは、フィルタープレートとのシールを形成するカラーの使用がスプレーに負の影響を有することを示している。フィルタープレートの1mm上に位置するカラーは、スプレーに影響しなかった。 X-pierceフィルムがフィルタープレートの上面に接着している96ウェルPCTEフィルタープレートの例示的な態様である。 エンクロージャのないフィルタープレートを使ってリグ1（R1）で行われた試験、エンクロージャのないフィルタープレートを使ってリグ3（R3）で行われた試験、およびフィルタープレートのウェル上にX-pierceフィルムエンクロージャを含むフィルタープレートを使ってR3で行われた試験に対応する効率（GFP取込み）を特徴決定するデータを表すプロットである。R1は、流れを制御するためにclippardピンチバルブを用い、R3はGygerマイクロバルブを用いる。データは、Clippardバルブ（R1）の代わりにGygerマイクロバルブ（R3 Gyger）を使用した場合の送達効率の増大を示している。PCTEフィルタープレートへのX-Pierceフィルムの追加は送達効率に対して何も効果がなかった。各バーは最低4回の繰り返しで1回の実験を表している。 送達溶液、停止溶液、および培養用培地を加熱するために使用することができる加熱システムの一態様である。 送達溶液、停止溶液、および培養用培地を冷却するために使用することができる冷却システムの一態様の側面図である。 送達溶液、停止溶液、および培養用培地を冷却するために使用することができる冷却システムの一態様の透視図である。 ニードルエミッタおよび超音波アトマイザーを解放可能なように保定することができる装着アセンブリの一態様の透視図である。 図90に示す装着アセンブリの一部分の分解透視図である。 ニードルエミッタおよび超音波アトマイザーを解放可能なように保定することができる装着アセンブリの別の一態様の透視図である。 ニードルエミッタおよびネブライザーを解放可能なように保定することができる装着アセンブリの一態様の透視図である。 細胞単層の形成が容易になるように構成された撹拌式セルシステムの例示的一態様の分解組立図である。撹拌式セルシステムは、メンブレンホルダー中にメンブレンを挿入し、ベースにメンブレンホルダーを挿入し、ベースにシステムの本体をねじ込むことによって組み立てられる。細胞（例えば細胞を含有する培養用培地）をベースと本体とによって形成されたチャンバーに送達し、キャップをベースとは反対側の本体上にねじ込むことでチャンバーを閉じる。キャップに連結された導圧管を介して50～100mbarの範囲の陽圧がチャンバーに送達される。圧力は10～60秒間適用される。 図108に示す撹拌式セルシステムのメンブレンホルダーの平面図である。 孔は含むが隆条は含まないメンブレンホルダーの別の一態様の平面図である。 メンブレンホルダーのデザインが細胞単層の形成に及ぼす影響を評価するための試験において図110に示すメンブレンホルダーと共に使用されたメンブレンの平面図である。細胞の代わりにDynabeadsを使用した。結果は、メンブレンホルダー中の孔の場所に対応するメンブレンの場所にDynabeadsがたまったことを示している。 孔、同心円状のチャネル、および直線的チャネルを含むメンブレンホルダーの別の一態様の平面図である。 メンブレンホルダーのデザインが細胞単層の形成に及ぼす影響を評価するための試験において図112に示すメンブレンホルダーと共に使用されたメンブレンの平面図である。細胞の代わりにDynabeadsを使用した。結果は、このメンブレンホルダーがDynabeadsの均等な分布を生じさせることを示している。 培養用培地の効果的な除去と細胞単層の形成が容易になるように構成されたメンブレンホルダーの別の一態様の透視図である。 リグ4（R4）とも呼ばれる溶液送達システムのネブライザーアセンブリの例示的一態様である。このネブライザーアセンブリは、ネブライザー（例えばLB-100スプレーヘッド）、ネブライザーへの空気および液体（例えば透過処理溶液）の送達が容易になるように構成された連結要素（例えばIDEX接続具）、ネブライザーに透過処理溶液を提供するように構成された溶液リザーバ（例えばElveflow試料リザーバ）、ネブライザーへの透過処理溶液の送達を制御するように構成されたピンチバルブを含む。 溶液送達システムの装着システムの透視図である。この装着システムには図115に示すネブライザーアセンブリを装着することができる。この装着システムは、バルブおよびリザーバ装着部、スプレーヘッド装着部およびネブライザーを収容するためのネブライザー保定カラーを含むことができる。 図116に示す装着システムに装着された図115に示すネブライザーアセンブリを図解する溶液送達システムの透視図である。 図116に示す装着システムに装着された図115に示すネブライザーアセンブリを図解する溶液送達システムの側面図である。 例示的な密閉型撹拌式セルシステムの側面図である。3つの構成部品（a）チャンバー蓋、（b）チャンバー壁、および（c）チャンバーベースが示されている。部品（a）蓋は316ステンレス鋼でできており、LB-100スプレーヘッドならびに細胞懸濁液、停止溶液および培養用培地を加えるための注入口を収容する。部品b）壁はガラス製であり、細胞導入部を介した細胞懸濁液の導入を可能にすることができる注入口を含み、湿度またはガスの監視を可能にするための機器の投入を可能にすることができるポートを含む。壁は、膨張チャンバーの付加を可能にする膨張ポートの組込みによって、または壁の一区域においてより大きな直径でデザインすることによって、空気の膨張を許すように設計される。部品c）ベースは316ステンレス鋼製であり、特注メンブレンホルダーを収容することになる。部品bへの部品aの接続および部品cへの部品bの接続は、GMP製造に準拠するステンレス鋼留め金で留め付けされた嵌合NW-KFフランジである。 さまざまな試験パラメータに対応するLB-100ネブライザーの力プロファイルを特徴決定するデータを表すプロットである。 単層形成後の細胞の回収および生存率を特徴決定するデータを表すプロットである。代表的データにより、PESフィルターメンブレンおよびPCTEフィルターメンブレンからの細胞の回収が示されている。細胞懸濁液を、2種類の異なる濃度で、63mm撹拌式セルユニットに適用した。100～250mbarの範囲内の圧力を10秒間適用した。細胞単層の形成後にフィルターをすすぎ、細胞を計数し、生存率を分析した。データは、PCTE（トラックエッチド（track-edged））フィルターでは、細胞の回収と生存率が改良されることを表している。 細胞単層形成後の細胞の回収および生存率を特徴決定するデータを表す別のプロットである。 LB-100ネブライザーを使った送達効率を特徴決定するデータを表す別のプロットである。代表的データにより、試験したさまざまなパラメータでのLB-100ネブライザーを使ったT細胞中へのGFP mRNAの送達効率が示されている（距離100mm、スプレー持続時間420ms、送達される体積100μlに対応する圧力600mBar、および空気圧2.5バール）。加えて、壁およびエンクロージングフィルムの存在を試験した。直径40mmのターゲット区域中の20×106個のT細胞の単層に対し、100μlの送達溶液を、LB-100を使って微粒化した。1回スプレープロトコールでは最大50％の送達効率が、また2回スプレープロトコールでは最大58％の送達効率が達成された。処置群間での平均生存率は60％であった。 作用機序を図解する線図である。 Ari Mistネブライザーの一態様である。ここではネブライザーへの液体用および空気用の接続具が示されている。米国特許第5,411,208号、同第6,634,572号ならびにカナダ国特許第2,112,093号および同第2,384,201号に記載されている。 ペイロード送達システムの例示的一態様（リグ1）である。 ペイロード送達システムの例示的一態様（リグ3）である。 ペイロード送達システムの例示的一態様（リグ4）である。 機械的および電気的システムにローカル制御を与えるPLCにプログラムを出力するために使用されるグラフィカルユーザーインターフェースを含むソフトウェアプラットフォームの概略図である。 本主題のいくつかの局面によるグラフィカルユーザーインターフェース実験キャンバスの例である。このユーザーインターフェースは、ユーザーによるパラメータの変更を可能にする実験キャンバスを含む。ユーザーによる変更が可能なパラメータには、アドレスされるべきウェルの場所および数、真空または陽圧、ペイロード、停止溶液および培養用培地の分注を含む工程のシーケンス、ならびに送達される体積が含まれる。ユーザーはアクチュエータ速度およびインキュベーション時間を変更することもできる。 細胞単層の形成が容易になるように構成された閉鎖型撹拌式セルシステムの例示的一態様である。図解した例に示すとおり、密閉型撹拌式セルシステム12200は、キャップ12202、チャンバー壁を形成する本体12204、細胞導入部12203、およびメンブレンホルダーを含むチャンバーベース12208を含んでいる。 例示的なMidiシステムである。44mmメンブレンホルダー（より良い濾過を促進するために追加の孔を含むように変更されたもの）を含む63mm撹拌式セルユニットが示されている。エンクロージングフィルムが撹拌式セルユニットの上部に接着しているのが見える。LB-100を含むスプレーヘッドホルダーは、エミッタの先端からフィルターメンブレンの表面までの距離が82mmになるように、チャンバーに挿入されている。 LB-100ネブライザーを使った送達効率および生存率を特徴決定するデータを表すプロットである。グラフは、3回の技術的繰り返し実験で59.63％±1.2の平均送達効率および74.6％±5.3の平均生存率データを示している。0.4μm PCTEフィルターメンブレンと20×107個の細胞を使用し、120mbarの圧力を40秒間かけて、細胞単層を形成させた。LB-100スプレーパラメータは圧力2.5バール、スプレー持続時間600mbar 400ms（体積100μl）および距離82mmであった。データは、送達効率および生存率を特徴決定する3回の実験からの結果を表している。 例示的臨床用送達システムの一態様である。
詳細な説明
非接着細胞中に分子をトランスフェクトすることの難しさは、何十年もの間、研究および治療、例えば細胞治療、遺伝子治療、遺伝子改変を悩ませてきた。そのような細胞のトランスフェクションが難しい理由として、非接着細胞は、細胞外マトリックスへの細胞の接着を担う分子である細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンを欠く点を挙げることができる。エレクトロポレーションおよび/またはヌクレオフェクションなどのトランスフェクション法には、それらが細胞の生存率、処置後に増殖を再開する細胞の能力、および細胞の機能、例えばリンパ球の免疫活性を損なうという欠点がある。本明細書に記載のトランスフェクション組成物およびトランスフェクション法（ソルポレーション）は、そのような欠点がないので、例えばトランスフェクションが困難な非接着/浮遊細胞などの哺乳動物細胞中にカーゴ分子を導入する今までの方法と比較して、大きな利点を有するとみなされる。
本発明は、細胞を、送達しようとする化合物（例えばペイロード）と細胞膜を可逆的に透過または溶解する作用物質とを含有する溶液と接触させることによって、化合物または化合物の混合物（組成物）は真核細胞の細胞質中に送達されるという、驚くべき発見に基づく。好ましくは、溶液はスプレーの形態で、例えば水性粒子の形態で、細胞に送達される（例えば参照により本明細書に組み入れられるPCT/US2015/057247およびPCT/IB2016/001895を参照されたい）。例えば細胞はスプレーで被覆されるが、送達化合物含有溶液に浸漬または沈漬されることはない。真核細胞膜を透過または溶解する例示的作用物質として、アルコールおよび洗浄剤、例えばそれぞれエタノールおよびTriton X-100が挙げられる。他の例示的洗浄剤、例えば界面活性剤として、ポリソルベート20（例えばTween 20）、3-[(3-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート（CHAPS）、3-[(3-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート（CHAPSO）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）およびオクチルグルコシドが挙げられる。
被覆された細胞の集団の被覆を達成するための条件の一例は、微粒子スプレーの送達を含み、例えばかなりの数の細胞がボーラス体積の流体によって浸漬または沈漬されるような、細胞へのボーラス体積の溶液の滴下またはピペッティングは、この条件からは除外される。したがってミストまたはスプレーは、細胞体積に対して、ある比率の流体体積を含む。あるいは、条件は、露出細胞面積に対して、例えば細胞が実質的に平坦な表面に、例えばマイクロタイター組織培養プレートなどの組織培養プレートのウェルなどといった組織培養槽の底に、コンフルエントな層または実質上コンフルエントな層として存在する場合に、露出している細胞膜の面積に対して、ある比率のミスト体積またはスプレー体積を含む。
「カーゴ」または「ペイロード」とは、細胞形質膜を横切って細胞の内部へと、水溶液として送達される化合物または組成物を記載するために使用される用語である。
一局面において、細胞の形質膜を横切るペイロードの送達は、細胞の集団を提供すること、およびその細胞の集団をある体積の水溶液と接触させることを含む。水溶液は、ペイロードと濃度5パーセント超のアルコール含量とを含む。水溶液の体積は、細胞の集団の露出表面積の関数でありうるか、細胞の集団中の細胞の数の関数でありうる。
別の一局面において、細胞の形質膜を横切ってペイロードを送達するための組成物は、ペイロードと、濃度5パーセント超のアルコールと、46mM超の塩と、121mM未満の糖と、19mM未満の緩衝剤とを含む水溶液を含む。例えばエタノールなどのアルコールの濃度は50％を超えない。
以下の特徴のうちの1つまたは複数が、考えうる任意の組合せで含まれうる。細胞に送達される溶液の体積は、複数単位、例えばスプレー、例えば水性粒子上の複数の小滴である。体積は、個々の細胞との比較で記載されるか、コンフルエントまたは実質的にコンフルエント（例えば少なくとも75％、少なくとも80％コンフルエント、例えば85％、90％、95％、97％、98％、100％コンフルエント）な細胞集団の露出表面積との比較で記載される。例えば、体積は細胞1個あたり6.0×10-7マイクロリットル～細胞1個あたり7.4×10-4マイクロリットルであることができる。体積は細胞1個あたり4.9×10-6マイクロリットル～細胞1個あたり2.2×10-3マイクロリットルである。体積は細胞1個あたり9.3×10-6マイクロリットル～細胞1個あたり2.8×10-5マイクロリットルであることができる。体積は細胞1個あたり約1.9×10-5マイクロリットルであることができ、約とは10％以内である。体積は細胞1個あたり6.0×10-7マイクロリットル～細胞1個あたり2.2×10-3マイクロリットルである。体積は、露出表面積1平方マイクロメートルあたり2.6×10-9マイクロリットル～露出表面積1平方マイクロメートルあたり1.1×10-6マイクロリットルであることができる。体積は露出表面積1平方マイクロメートルあたり5.3×10-8マイクロリットル～露出表面積1平方マイクロメートルあたり1.6×10-7マイクロリットルであることができる。体積は露出表面積1平方マイクロメートルあたり約1.1×10-7マイクロリットルであることができる。約は10％以内であることができる。
細胞のコンフルエンシーとは表面上で互いに接触している細胞を指す。例えば、コンフルエンシーは推定（または計数）された百分率として表現することができ、例えば10％コンフルエントとは、表面の、例えば組織培養槽の表面の、10％が細胞で覆われていることを意味し、100％とは表面が完全に覆われていることを意味する。例えば接着細胞は組織培養ウェル、プレートまたはフラスコの表面上で二次元的に成長する。非接着細胞は遠沈させるか、真空によって沈降させるか、組織培養用培地を細胞集団の上部から吸引除去するか、槽の底部からの吸引または真空除去によって除去することができる。
細胞の集団と前記体積の水溶液との接触は、ガスにより、水溶液を噴射してスプレーを形成させることによって行うことができる。このガスは、窒素、周囲空気または不活性ガスを含むことができる。スプレーは、直径が1nm～100μm、例えば30～100μmの範囲にある、不連続な体積の単位を含むことができる。スプレーは、約30～50μmの直径を持つ不連続な体積の単位を含む。総体積20μlの水溶液を、スプレーとして、約1.9cm2の細胞占有面積に、例えば24ウェル培養プレートの1ウェルに、送達することができる。総体積10μlの水溶液が、約0.95cm2の細胞占有面積に、例えば48ウェル培養プレートの1ウェルに、送達される。通例、水溶液は、細胞膜を横切って細胞中に送達されるべきペイロードを含み、第2の体積は、ペイロードを含有しない緩衝液または培養用培地である。あるいは、第2の体積（緩衝液または培地）もペイロードを含有することができる。いくつかの態様において、水溶液はペイロードおよびアルコールを含み、第2の体積はアルコールを含有しない（そして任意でペイロードを含有しない）。細胞の集団は、第2の体積の緩衝液または培養用培地を加えて細胞の集団を沈漬または懸濁させる前に、0.1 10分間、該水溶液と接触することができる。緩衝液または培養用培地はリン酸緩衝食塩水（PBS）であることができる。細胞の集団は、第2の体積の緩衝液または培養用培地を加えて細胞の集団を沈漬または懸濁させる前に、2秒～5分間、該水溶液と接触することができる。細胞の集団は、第2の体積の緩衝液または培養用培地、例えばペイロードを含まないものを加えて細胞の集団を沈漬または懸濁させる前に、該水溶液、例えばペイロードを含有する水溶液と、30秒～2分間、接触することができる。細胞の集団は、第2の体積の緩衝液または培養用培地を加えて細胞の集団を沈漬または懸濁させる前に、約1～2分間、スプレーと接触することができる。細胞のスプレー処理と緩衝液または培養用培地の添加との間の時間中、細胞はスプレー体積からの水分の層によって水和されたままである。
水溶液は5～30％のエタノール濃度を含むことができる。水溶液は、75～98％のH2O、2～45％のエタノール、6～91mMのスクロース、2～500mMのKCl、2～35mMの酢酸アンモニウム、および1～14mMの（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸）（HEPES）のうちの1つまたは複数を含むことができる。例えば、送達溶液は106mMのKClおよび27％のエタノールを含有する。
細胞の集団は、接着細胞または非接着細胞を含むことができる。接着細胞は、初代間葉系幹細胞、線維芽細胞、単球、マクロファージ、肺細胞、神経細胞、線維芽細胞、ヒト臍帯静脈（HUVEC）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、およびヒト胎児腎臓（HEK）細胞または不死化細胞、例えば細胞株のうちの少なくとも1つを含むことができる。好ましい態様において、細胞の集団は非接着細胞を含み、例えば集団中の非接着細胞率は、少なくとも50％、60％、75％、80％、90％、95％、98％、99％、または100％の非接着細胞である。非接着細胞は、初代細胞ならびに不死化細胞（例えば細胞株の細胞）である。例示的な非接着/浮遊細胞として、初代造血幹細胞（HSC）、T細胞（例えばCD3＋細胞、CD4＋細胞、CD8＋細胞）、ナチュラルキラー（NK）細胞、サイトカイン誘導性キラー（CIK）細胞、ヒト臍帯血CD34＋細胞、B細胞、またはJurkat T細胞などの細胞株が挙げられる。
ペイロードは、小さい化学分子、ペプチドもしくはタンパク質、または核酸を含むことができる。小さい化学分子は1,000Da未満であることができる。化学分子は、MitoTracker（登録商標）Red CMXRos、ヨウ化プロピジウム、メトトレキサート、および/またはDAPI（4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）を含むことができる。ペプチドは約5,000Daであることができる。ペプチドは、エカランチド（商標Kalbitorと知られ、これは遺伝性血管浮腫の処置および心胸郭手術における失血防止のための60アミノ酸ポリペプチドである）、リラグルチド（商品名Victozaとして販売されてII型糖尿病の処置に使用されており、また商品名Saxendaとして肥満処置用に販売されている）およびイカチバント（商標Firazyer、遺伝性血管浮腫の急性発作を処置するためのペプチドミメティック）を含むことができる。低分子干渉リボ核酸（siRNA）分子は約20～25塩基対の長さであるか、約10,000～15,000Daであることができる。siRNA分子は、例えばグリセルアルデヒド-3リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）siRNA、GAPDH siRNA-FITC、シクロフィリンB siRNA、および/またはラミンsiRNAなど、任意の遺伝子産物の発現を低減することができ、例えば臨床上重要なターゲット遺伝子またはモデル遺伝子の遺伝子発現をノックダウンすることができる。タンパク質治療薬は、ペプチド、酵素、構造タンパク質、受容体、細胞タンパク質もしくは循環タンパク質、またはそれらのフラグメントを含むことができる。タンパク質またはポリペプチドは約100～500,000Da、例えば1,000～150,000Daである。タンパク質は、任意の治療用、診断用または研究用タンパク質またはペプチド、例えばβ-ラクトグロブリン、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン（BSA）、および/またはセイヨウワサビペルオキシダーゼを含むことができる。他の例では、タンパク質はがん特異的アポトーシスタンパク質、例えば腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発タンパク質（TRAIL）を含むことができる。
抗体は一般に分子質量が約150,000Daである。抗体は、抗アクチン抗体、抗GAPDH抗体、抗Src抗体、抗Myc ab、および/または抗Raf抗体を含むことができる。抗体は、緑色蛍光タンパク質（GFP）プラスミド、GLucプラスミド、およびBATEMプラスミドを含むことができる。DNA分子は5,000,000Da超であることができる。いくつかの例において、抗体は、マウス由来のモノクローナル抗体、例えばイブリツモマブチウキセチン（ibritumomab tiuxetin）、ムロモマブ-CD3（muromomab-CD3）、トシツモマブ、ヒト抗体またはヒト化マウス（または他の種に由来する）抗体であることができる。他の例において、抗体はキメラモノクローナル抗体、例えばアブシキシマブ、バシリキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、またはリツキシマブであることができる。さらに別の例において、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体、例えばアレムツザマブ（alemtuzamab）、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、ゲンツブマブオゾガマイシン（gentuzumab ozogamicin）、トラスツズマブ、トシリズマブ、イピリムマンブ（ipilimumamb）、またはパニツムマブであることができる。抗体は、抗体フラグメント、例えばアバテセプト（abatecept）、アフリベルセプト、アレファセプト、またはエタネルセプトを含むことができる。本発明は、インタクトなモノクローナル抗体だけでなく、免疫学的に活性な抗体フラグメント、例えばFabまたは（Fab）2フラグメント、改変一本鎖Fv分子、またはキメラ分子、例えばマウスなどに由来する抗体の結合特異性と、ヒトなどに由来する別の抗体の残りの部分とを含有する抗体も包含する。
ペイロードは治療用作用物質を含むことができる。治療用作用物質、例えば薬物または活性作用物質は、治療目的または診断目的に役立つ任意の化合物を意味することができ、この用語は、ある状態の処置のために患者に投与される任意の化合物を意味すると理解することができる。したがって治療用作用物質は、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメントおよび小分子を含むことができる。本明細書に記載の方法では、米国特許第7,667,004号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載の治療用作用物質を使用することができる。治療用作用物質は、シスプラチン、アスピリン、スタチン類（例えばピタバスタチン、アトルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、プロマジンHCl、クロロプロマジンHCl、チオリダジンHCl、硫酸ポリミキシンB、クロロキシン、ベンフルオレクスHClおよびフェナゾピリジンHCl）、およびフルオキセチンのうちの少なくとも1つを含むことができる。ペイロードは診断用作用物質を含むことができる。診断用作用物質は、検出可能な標識またはマーカー、例えばメチレンブルー、パテントブルーVおよびインドシアニングリーンのうちの少なくとも1つを含むことができる。ペイロードは蛍光分子を含むことができる。ペイロードは検出可能なナノ粒子を含むことができる。ナノ粒子は量子ドットを含むことができる。
非接着細胞の集団は、例えば75％コンフルエントを上回るなど、実質的にコンフルエントであることができる。細胞のコンフルエンシーとは表面上で互いに接触している細胞を指す。例えば、コンフルエンシーは推定（または計数）された百分率として表現することができ、例えば10％コンフルエントとは、表面の、例えば組織培養槽の表面の、10％が細胞で覆われていることを意味し、100％とは表面が完全に覆われていることを意味する。例えば接着細胞は組織培養ウェル、プレートまたはフラスコの表面上で二次元的に成長する。非接着細胞は遠沈させるか、真空によって沈降させるか、組織培養用培地を細胞集団の上部から吸引除去するか、槽の底部からの吸引または真空除去によって除去することができる。細胞の集団は細胞の単層を形成することができる。
アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、およびベンジルアルコールから選択することができる。塩は、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、およびC2H3O2NHから選択することができる。好ましい態様において塩はKClである。糖はスクロースを含むことができる。緩衝剤は4-2-（ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸を含むことができる。
本主題は形質膜を横切って分子を送達するための方法に関する。本主題は細胞内送達の分野において役立ち、例えば細胞、組織または器官などのターゲット部位への分子生物学的および薬理学的治療用作用物質の送達における用途を有する。本主題の方法は、マトリックスを形成させるために水性組成物に分子を導入する工程、マトリックスをスプレーに微粒化する工程およびマトリックスを形質膜と接触させる工程を含む。
この本主題は、形質膜を横切って分子を送達するのに使用される組成物に関する。本主題は細胞内送達の分野において役立ち、例えば細胞、組織または器官などのターゲット部位への分子生物学的および薬理学的治療用作用物質の送達における用途を有する。本主題の組成物は、アルコール、塩、糖、および/または緩衝剤を含む。
いくつかの実施形態では、分子および細胞のタイプとは無関係に分子の細胞内送達を容易にする透過処理技法が示される。ナノ粒子、小分子、核酸、タンパク質、および他の分子を、初代細胞および幹細胞を含むインサイチューの浮遊細胞または接着細胞に低い細胞毒性で効率よく送達することができ、この技術はハイスループットおよび自動化細胞ベースアッセイに適合する。
本明細書に記載する例示的方法はペイロードを含み、ペイロードはアルコールを含む。「アルコール」という用語は、少なくとも1つの炭素原子に結合したヒドロキシル（-OH）官能基を含む多原子有機化合物を意味する。アルコールは一価アルコールであってよく、メタノールなど、少なくとも1つの炭素原子を含みうる。アルコールは少なくとも2つの炭素原子を含みうる（例えばエタノール）。別の局面において、アルコールは少なくとも3つの炭素を含む（例えばイソプロピルアルコール）。アルコールは少なくとも4つの炭素原子（例えばブタノール）または少なくとも7つの炭素原子（例えばベンジルアルコール）を含みうる。例示的ペイロードは、50％（v/v）以下のアルコールを含むことができ、より好ましくは、ペイロードは、2～45％（v/v）のアルコール、5～40％のアルコール、および10～40％のアルコールを含む。ペイロードは20～30％（v/v）のアルコールを含みうる。
最も好ましくは、ペイロード送達溶液は25％（v/v）のアルコールを含む。あるいはペイロードは2～8％（v/v）のアルコールまたは2％のアルコールを含むことができる。アルコールはエタノールを含むことができ、ペイロードは、5％、10％、20％、25％、30％、および最大40％または50％（v/v）のエタノール、例えば27％エタノールを含む。例示的方法はアルコールとしてメタノールを含むことができ、ペイロードは5、10、20、25、30、または40％（v/v）のメタノールを含みうる。ペイロードは2～45％（v/v）のメタノール、20～30％（v/v）または25％（v/v）のメタノールを含みうる。好ましくはペイロードは20～30％（v/v）のメタノールを含む。さらにあるいは、アルコールはブタノールであり、ペイロードは2、4、または8％（v/v）のブタノールを含む。
本主題のいくつかの局面において、ペイロードは等張溶液または等張緩衝液である。
本主題によれば、ペイロードは少なくとも1つの塩を含みうる。塩は、NaCl、KCl、Na2HPO4、C2H3O2NH4、およびKH2PO4から選択されうる。例えばKCl濃度は2mM～500mMの範囲にある。いくつかの好ましい態様において濃度は100mMを上回り、例えば106mMである。
本主題の例示的方法によれば、ペイロードは糖（例えばスクロースまたは二糖）を含みうる。例示的方法によれば、ペイロードは121mM未満の糖、6～91mMまたは26～39mMの糖を含む。さらにペイロードは32mMの糖（例えばスクロース）を含む。任意で糖はスクロースであり、ペイロードは6.4、12.8、19.2、25.6、32、64、76.8、または89.6mMスクロースを含む。
本主題の例示的方法によれば、ペイロードは緩衝剤（例えば弱酸または弱塩基）を含みうる。緩衝剤は双性イオンを含みうる。例示的方法によれば、緩衝剤は4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸である。ペイロードは、19mM未満の緩衝剤（例えば1～15mMまたは4～6mMまたは5mMの緩衝剤）を含みうる。例示的方法によれば、緩衝剤は4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸であり、ペイロードは1、2、3、4、5、10、12、14mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸を含む。さらに好ましくはペイロードは5mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸を含む。
本主題の例示的方法によれば、ペイロードは酢酸アンモニウムを含む。ペイロードは46mM未満の酢酸アンモニウム（例えば2～35mM、10～15mM、または12mMの酢酸アンモニウム）を含みうる。ペイロードは、2.4、4.8、7.2、9.6、12、24、28.8、または33.6mMの酢酸アンモニウムを含みうる。
水溶液を噴射するガスによって行われる水溶液の体積は、圧縮空気（例えば周囲空気）を含みうる。他の実施形態は不活性ガス、例えばヘリウム、ネオン、およびアルゴンを含みうる。
本主題のある特定の局面において、細胞の集団は、接着細胞（例えば肺、腎臓、マクロファージなどの免疫細胞）または非接着細胞（例えば浮遊細胞）を含みうる。
本主題のある特定の局面において、細胞の集団は、実質的にコンフルエントであることができ、実質的に75パーセントコンフルエントを上回りうる。好ましい実施形態において、細胞の集団は単一の単層を形成しうる。
例示的方法によれば、送達されるべきペイロードは、最大20,000,000Daの平均分子量を有する。いくつかの例において、送達されるべきペイロードは、最大2,000,000Daの平均分子量を有することができる。いくつかの実施形態において、送達されるべきペイロードは最大150,000Daの平均分子量を有しうる。さらなる実施形態において、送達されるべきペイロードは、最大15,000Da、5,000Da、または1,000Daの平均分子量を有しうる。
細胞の形質膜を横切って送達されるべきペイロードは、小さい化学分子、ペプチドまたはタンパク質、多糖または核酸またはナノ粒子を含みうる。小さい化学分子は1,000Da未満であることができ、ペプチドは約5,000Daの分子量を有することができ、siRNAは15,000Da前後の分子量を有することができ、抗体は約150,000Daの分子量を有することができ、DNAは5,000,000Da超または5,000,000Daの分子量を有することができる。好ましい態様においてペイロードはmRNAを含む。
例示的方法によれば、ペイロードは、3.0～150.0μMの送達されるべき分子、より好ましくは6.6～150.0μMの送達されるべき分子（例えば3.0、3.3、6.6、または150.0μMの送達されるべき分子）を含む。いくつかの実施形態において、送達されるべきペイロードは最大15,000Daの平均分子量を有し、ペイロードは3.3μMの送達されるべき分子を含む。
例示的方法によれば、送達されるべきペイロードは最大15,000Daの平均分子量を有し、ペイロードは送達されるべき6.6μMを含む。いくつかの実施形態において、送達されるべきペイロードは最大1,000Daの平均分子量を有し、ペイロードは送達されるべき150.0μMを含む。
本主題のさらなる局面によれば、形質膜を横切って複数の分子量の分子を送達するための方法が提供され、本方法は、複数の分子量の分子を水溶液に導入する工程および水溶液を形質膜と接触させる工程を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、第1の分子量を有する第1の分子および第2の分子量を有する第2の分子をペイロードに導入する工程を含み、ここで、第1の分子および第2の分子は異なる分子量を有しうるか、第1の分子および第2の分子は同じ分子量を有しうる。例示的方法によれば、第1の分子および第2の分子は異なる分子でありうる。
いくつかの実施形態において、送達されるべきペイロードは、治療用作用物質または診断用作用物質、例えばシスプラチン、アスピリン、種々のスタチン類（例えばピタバスタチン、アトルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、プロマジンHCl、クロロプロマジンHCl、チオリダジンHCl、硫酸ポリミキシンB、クロロキシン、ベンフルオレクスHCl、およびフェナゾピリジンHCl）、およびフルオキセチンを含みうる。他の治療用作用物質として、抗微生物薬（アミノグリコシド（aminoclycloside）（例えばゲンタマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン）、ペニシリン類（例えばアモキシシリン、アンピシリン）、糖ペプチド（例えばアボパルシン、バンコマイシン）、マクロライド（例えばエリスロマイシン、チルミコシン、タイロシン）、キノロン類（例えばサラフロキサシン、エンロフロキシン（enrofloxin））、ストレプトグラミン類（例えばビギニアマイシン（viginiamycin）、キヌプリスチン-ダルホプリシチン（dalfoprisitin））、カルバペネム、リポペプチド、オキサゾリジノン、シクロセリン、エタンブトール、エチオンアミド、イソニアズリド（isoniazrid）、パラアミノサリチル酸、およびピラジナミド）が挙げられる。いくつかの例において、抗ウイルス薬（例えばアバカビル、アシクロビル、エンフビルチド、エンテカビル、ネルフィナビル、ネビラピン、ネクサビル（Nexavir）、オセルタミビル ラルテグラビル、リトナビル、スタブジン、およびバラシクロビル）。治療薬は、さまざまな疾患、例えばがん、感染性疾患、血友病、貧血、多発性硬化症、およびB型またはC型肝炎を処置するためのタンパク質ベースの治療を含みうる。
さらなる例示的ペイロードは、検出可能なマーカーまたは標識、例えばメチレンブルー、パテントブルーV、およびインドシアニングリーンも含むことができる。
本明細書に記載する方法は、検出可能な部分または検出可能なナノ粒子（例えば量子ドット）を含むペイロードも含みうる。検出可能な部分は、蛍光分子または放射性作用物質（例えば125I）を含みうる。蛍光分子を適正な波長の光に曝露すると、蛍光によってその存在を検出することができる。最もよく使用される蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、p-フタルデヒド（p-phthaldehyde）、およびフルオレサミンがある。分子は、152Euまたはランタニド系列の他の元素などといった蛍光発光金属によって検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）などの金属キレート基を使って分子に取り付けることができる。分子は、それを化学発光化合物に連結することによって、検出可能に標識することもできる。その場合、化学発光タグ付き分子の存在は、化学反応の過程で生じるルミネセンスの存在を検出することによって判定される。特に有用な化学発光標識化合物の例はルミノール、イソルミノール、テロマティック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
さらなる態様において、送達されるべきペイロードは、ゲノムDNAを編集する組成物（すなわち遺伝子編集ツール）を含みうる。例えば遺伝子編集組成物は、ゲノムDNAを切断し、ゲノムDNAにニックを入れ、ゲノムDNAをスプライスし、再編成し、移動させ、組換え、または他の形で改変する化合物または複合体を含みうる。上記に代えて、または上記に加えて、遺伝子編集組成物は、（i）ゲノムDNAを切断し、ゲノムDNAにニックを入れ、ゲノムDNAをスプライスし、再編成し、移動させ、組換え、または他の形で改変する遺伝子編集複合体に含まれうる化合物、または（ii）ゲノムDNAを切断し、ゲノムDNAにニックを入れ、ゲノムDNAをスプライスし、再編成し、移動させ、組換え、または他の形で改変する遺伝子編集複合体に含まれる化合物にプロセシングまたは改変されうる化合物を含みうる。さまざまな態様において、遺伝子編集組成物は、（a）遺伝子編集タンパク質、（b）RNA分子、および/または（c）リボヌクレオタンパク質（RNP）のうちの1つまたは複数を含む。
いくつかの態様において、遺伝子編集組成物は遺伝子編集タンパク質を含み、遺伝子編集タンパク質はジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、Casタンパク質、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、またはFlpリコンビナーゼである。さらなる態様において、遺伝子編集タンパク質は、ホーミングエンドヌクレアーゼをTALENのモジュラーDNA結合ドメインと組み合わせた融合タンパク質（megaTAL）でありうる。例えばmegaTALをタンパク質として送達するか、あるいはmegaTALタンパク質をコードするmRNAを細胞に送達することができる。
さまざまな態様において、遺伝子編集組成物はRNA分子を含み、RNA分子はsgRNA、crRNA、および/またはtracrRNAを含む。
ある特定の態様において、遺伝子編集組成物はRNPを含み、RNPはCasタンパク質およびsgRNAまたはcrRNAおよびtracrRNAを含む。本主題の諸局面は、特定の遺伝子編集化合物がいつまたはどのくらい長く細胞中に存在するかを制御するのに特に有用である。
本主題のさまざまな実施形態において、遺伝子編集組成物は、細胞の集団またはその子孫において、（a）細胞の集団を水溶液と接触させた後、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48、60、72、0.5～2、0.5～6、6～12、または0.5～72時間にわたって、または（b）細胞の集団を水溶液と接触させた後、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48、60、72、0.5～2、0.5～6、6～12、または0.5～72時間未満にわたって、検出可能である。
いくつかの態様において、細胞の集団中の細胞またはその子孫のゲノムは、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、またはFlpリコンビナーゼのための部位特異的組換え部位を、少なくとも1つは含む。
本発明の諸局面は、1つの遺伝子編集化合物を含む細胞と、その細胞に別の遺伝子編集化合物を挿入することに関する。例えば、RNPの1つの構成要素を、RNPの別の構成要素を発現するか、他の形で既に含有する細胞に導入することができる。例えば細胞の集団中の細胞またはその子孫は、sgRNA、crRNA、および/またはtracrRNAを含みうる。いくつかの態様において、細胞の集団またはその子孫は、sgRNA、crRNA、および/またはtracrRNAを発現する。上記に代えてまたは上記に加えて、細胞の集団中の細胞またはその子孫はCasタンパク質を発現する。
本明細書における主題のさまざまな実施形態はCasタンパク質を含む。いくつかの態様において、Casタンパク質はCas9タンパク質またはその変異体である。例示的なCasタンパク質（Cas9およびCas9変異体の非限定的な例を含む）を、本明細書に記載する。
さまざまな局面において、Cas9タンパク質の濃度は約0.1～約25μgの範囲をとりうる。例えばCas9の濃度は約1μg、約5μg、約10μg、約15μg、または約20μgでありうる。あるいは、Cas9の濃度は、約10ng/μL～約300ng/μL、例えば約10ng/μL～約200ng/μlまたは約10ng/μL～約100ng/μlまたは約10ng/μL～約50ng/μlの範囲をとりうる。
ある特定の態様において遺伝子編集組成物は、（a）第1のsgRNA分子および第2のsgRNA分子を含み、ここで第1のsgRNA分子の核酸配列は第2のsgRNA分子の核酸配列とは異なるか、（b）第1のsgRNAを含む第1のRNPおよび第2のsgRNAを含む第2のRNPを含み、ここで第1のsgRNA分子の核酸配列は第2のsgRNA分子の核酸配列とは異なるか、（c）第1のcrRNA分子および第2のcrRNA分子を含み、ここで第1のcrRNA分子の核酸配列は第2のcrRNA分子の核酸配列とは異なるか、（d）第1のcrRNA分子および第2のcrRNA分子を含み、ここで第1のcrRNA分子の核酸配列は第2のcrRNA分子の核酸配列とは異なり、さらにtracrRNA分子を含むか、または（e）第1のcrRNAおよびtracrRNAを含む第1のRNPならびに第2のcrRNAおよびtracrRNAを含む第2のRNPを含み、ここで第1のcrRNA分子の核酸配列は第2のcrRNA分子の核酸配列とは異なる。
諸局面において、Cas9タンパク質とガイドRNAとの比は、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、または1:10でありうる。
諸態様において、細胞が送達プロセスを経る回数を増やすと（あるいは投与回数を増やすと）編集率が増大しうる。いくつかの態様では、投与回数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回の投与を含みうる。
さまざまな態様において、第1および第2のsgRNAまたは第1および第2のcrRNA分子は全体として、遺伝子、エクソン、イントロン、染色体外配列、またはゲノム核酸配列に隣接するターゲット配列に対して相補的な核酸配列を含み、ここで遺伝子、エクソン、イントロン、染色体外配列、またはゲノム核酸配列は、約1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1～100キロベース長であるか、少なくとも約1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1～100キロベース長である。いくつかの態様において、第1および第2のsgRNAまたは第1および第2のcrRNA分子を含むRNPのペアの使用は、遺伝子、エクソン、イントロン、染色体外配列またはゲノム核酸配列を含むポリヌクレオチド分子を生成するために使用しうる。
ある特定の態様において、sgRNAまたはcrRNAのターゲット配列は約12～約25、または約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、17～23、または18～22ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、ターゲット配列は20ヌクレオチド長または約20ヌクレオチド長である。
さまざまな態様において、第1および第2のsgRNAまたは第1および第2のcrRNA分子は、発現ベクター内にある染色体外配列に隣接する配列に対して相補的である。
本主題の諸局面は、遺伝子編集複合体の複数の構成要素の送達に関し、ここでそれら複数の構成要素は互いに複合体を形成していない。いくつかの態様において、遺伝子編集組成物は、少なくとも1つの遺伝子編集タンパク質および少なくとも1つの核酸を含み、ここで遺伝子編集タンパク質と核酸は互いに結合したり複合体を形成したりしていない。
本主題は、高い細胞生存率を維持しつつ、高い遺伝子編集効率を可能にする。いくつかの態様において、細胞の集団のうちの少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％、1～99％、もしくはそれ以上、またはその子孫が、水溶液との接触後に遺伝子改変体になる。さまざまな態様において、細胞の集団のうちの少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％、1～99％、もしくはそれ以上、またはその子孫が、水溶液との接触後も生存可能である。
ある特定の態様において、遺伝子編集組成物は細胞内のDNAにおける一本鎖切断または二本鎖切断を誘発する。いくつかの態様において、遺伝子編集組成物は修復テンプレートポリヌクレオチドをさらに含む。さまざまな態様において、修復テンプレートは、（a）一本鎖切断または二本鎖切断の一方の側にある約40～約90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第1の隣接領域および一本鎖切断または二本鎖切断の他方の側にある約40～約90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第2の隣接領域を含むか、（b）一本鎖切断または二本鎖切断の一方の側にある少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、または90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第1の隣接領域および一本鎖切断または二本鎖切断の他方の側にある少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、または90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第2の隣接領域を含む。CRISPR-Casシステムを使った遺伝子編集（修復テンプレートを含む）に関する非限定的な説明は、Ran et al.（2013）Nat Protoc.2013 Nov; 8（11）:2281-2308において議論されており、この文献の全内容は参照により本明細書に組み入れられる。修復テンプレートが関与する態様はCRISPR-Casシステムを含むものに限定されない。
本主題のさまざまな実施形態において、水溶液の体積は、スプレーの形態で細胞の集団に送達される。いくつかの態様において、体積は細胞1個あたり6.0×10-7マイクロリットル～細胞1個あたり7.4×10-4マイクロリットルである。ある特定の態様において、スプレーは、10nm～100μmの直径を含むコロイド粒子またはサブ粒子を含む。さまざまな態様において、体積は、露出表面1平方マイクロメートルあたり2.6×10-9マイクロリットル～露出表面積1平方マイクロメートルあたり1.1×10-6マイクロリットルである。
いくつかの態様において、RNPは、およそ100Å×100Å×50Å、すなわち10nm×10nm×5nmのサイズを有する。さまざまな態様において、スプレー粒子のサイズは、スプレー粒子1個あたり少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上のRNPを収容するように調節される。
例えば、細胞の集団を上記体積の水溶液と接触させる工程は、水溶液を噴射してスプレーを形成させるガスによって行いうる。ある特定の態様において、細胞の集団は、第2の体積の緩衝液または培養用培地を加えて細胞の集団を沈漬または懸濁させる前に、0.01～10分間（例えば0.1 10分間）、該水溶液と接触する。
さまざまな態様において、細胞の集団は、初代細胞または不死化細胞のうちの少なくとも1つを含む。例えば細胞の集団は、間葉系幹細胞、肺細胞、神経細胞、線維芽細胞、ヒト臍帯静脈（HUVEC）細胞およびヒト胎児腎臓（HEK）細胞、初代または不死化造血幹細胞（HSC）、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、サイトカイン誘導性キラー（CIK）細胞、ヒト臍帯血CD34＋細胞、B細胞を含みうる。T細胞の非限定的な例として、CD8＋またはCD4＋T細胞を挙げることができる。いくつかの局面では、CD3＋T細胞のCD8＋部分集団が使用される。CD8＋T細胞は、抗CD8ビーズを使ったポジティブ単離によってPBMC集団から精製されうる。いくつかの局面では、初代NK細胞をPBMCから単離して、プラットフォーム送達技術によってGFP mRNAを送達することができる（すなわち24時間で3％の発現および96％の生存率）。さらなる局面では、例えばNK92などのNK細胞株を使用しうる。
細胞タイプには、治療有効性を高めるために既に改変されている細胞、例えばT細胞、NK細胞およびMSCも含まれる。例えば、キメラ抗原受容体を発現するT細胞またはNK細胞（それぞれCAR T細胞、CAR NK細胞）;改変T細胞受容体（TCR）を発現するT細胞;先天的な特性を補完する治療用タンパク質を過剰発現するようにウイルスを使ってまたは非ウイルス的に改変されたMSC（例えばレンチウイルスベクターを使ったEpoの送達またはAAV-6を使ったBMP-2の送達）（Park et al, Methods, 2015 Aug;84-16に概説されている）;有効性を強化してターゲティングを外から調節するためにそれぞれ非ペプチド薬または磁気ナノ粒子でプライミングされたMSC（Park et al., 2015）;酵素修飾（例えばフコシルトランスフェラーゼ）、化学コンジュゲーション（例えばN-ヒドロキシ-スクシンイミド（NHS）化学を使ったMSC上のSLeXの修飾）または非共有結合的相互作用（例えばその後の抗体コンジュゲーションにとって疎水性アンカーとして作用するパルミチン酸化タンパク質（palmitated protein）による細胞表面の工学的改変）を使って治療部位へのホーミングを増強するためにターゲティング部分で機能化されたMSC（Park et al., 2015）。例えば、キメラ抗原受容体を発現するように改変されたT細胞、例えば初代T細胞またはT細胞株（CAR T細胞）は、CARをコードする遺伝子を編集し、それによって改変T細胞におけるCARの発現を低減するためまたは停止させるために、本発明に従って、遺伝子編集タンパク質および/またはCARコード配列に特異的なガイド核酸を含有する複合体で、さらに処理することができる。
本発明の諸局面は、細胞および組織への遺伝子編集化合物および遺伝子編集複合体の発現ベクターフリー送達、例えば初代ヒトT細胞、造血幹細胞（HSC）および間葉系間質細胞（MSC）におけるゲノム編集のためのCas-gRNAリボヌクレオタンパク質の送達に関する。いくつかの例では、上述のタンパク質をコードするmRNAが細胞に送達される。
CRISPR-Casシステムのさまざまな局面は当技術分野において公知である。このシステムの非限定的な局面は、例えば2015年5月5日に発行された米国特許第9,023,649号、2015年7月7日に発行された米国特許第9,074,199号、2014年4月15日に発行された米国特許第8,697,359号、2015年1月13日に発行された米国特許第8,932,814号、2015年8月27日に公開されたPCT国際特許出願公報番号WO 2015/071474、Cho et al.,（2013）Nature Biotechnology Vol 31 No 3 pp 230-232（補足情報を含む）、およびJinek et al.,（2012）Science Vol 337 No 6096 pp 816-821に記載されており、これらの文献のそれぞれの内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる。
Casタンパク質の非限定的な例には、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9（Csn1およびCsx12としても公知である）、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、それらのホモログ、またはそれらの改変型が含まれる。これらの酵素は公知である。例えば化膿レンサ球菌（S.pyogenes）Cas9タンパク質のアミノ酸配列は、SwissProtデータベースにアクセッション番号Q99ZW2として、またNCBIデータベースにアクセッション番号Q99ZW2.1として見いだしうる。UniProtデータベースアクセッション番号A0A0G4DEU5およびCDJ55032は、Cas9タンパク質アミノ酸配列の別の例である。別の非限定的な例はストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）Cas9タンパク質であり、そのアミノ酸配列はUniProtデータベースにアクセッション番号Q03JI6.1として見いだしうる。いくつかの態様において、Cas9など、無改変のCRISPR酵素は、DNA切断活性を有する。ある特定の態様において、CRISPR酵素はCas9であり、化膿レンサ球菌または肺炎レンサ球菌（S.pneumoniae）由来のCas9でありうる。さまざまな態様において、CRISPR酵素は、ターゲット配列の場所、例えばターゲット配列内および/またはターゲット配列の相補鎖内において、一方または両方の鎖の切断を指示する。いくつかの態様において、CRISPR酵素は、ターゲット配列の一番目のヌクレオチドまたは最後のヌクレオチドから約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500、またはそれ以上の塩基対内で、一方または両方の鎖の切断を指示する。いくつかの態様において、ベクターは、対応する野生型酵素と比較して突然変異型CRISPR酵素がターゲット配列を含有するターゲットポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠くように突然変異させたCRISPR酵素をコードする。例えば、化膿レンサ球菌由来のCas9のRuvC I触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換は、Cas9を、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本の鎖を切断する）へと変換する。Cas9をニッカーゼにする突然変異の他の例として、H840A、N854A、およびN863Aが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。本発明の諸局面において、ニッカーゼは相同組換えによるゲノム編集に使用しうる。
ある特定の態様において、Cas9ニッカーゼは、ガイド配列と組み合わせて、例えばDNAターゲットのセンス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれターゲットとする2つのガイド配列と組み合わせて、使用しうる。この組合せは両方の鎖にニックを入れてNHEJの誘発に使用することを可能にする。
さらなる一例として、すべてのDNA切断活性を実質的に欠く突然変異型Cas9を生成するために、Cas9の2つまたはそれ以上の触媒ドメイン（RuvC I、RuvC II、およびRuvC III）を、突然変異させることができる。すべてのDNA切断活性を実質的に欠く突然変異型Cas9を生成するために、D10A突然変異を、H840A、N854A、またはN863A突然変異のうちの1つまたは複数と組み合わせうる。ある特定の態様において、CRISPR酵素は、突然変異型酵素のDNA切断活性が、非突然変異型と比較して約25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％未満であるか、またはそれより低い場合は、すべてのDNA切断活性を実質的に欠くと見なされる。他の突然変異も役立ちうる。Cas9または他のCRISPR酵素が化膿レンサ球菌以外の種に由来する場合、対応するアミノ酸における突然変異を、類似する効果を達成するために導入しうる。
ある特定の態様において、送達されるタンパク質（例えばCasタンパク質またはその変種）は、細胞内局在化シグナルを含みうる。例えばRNP内のCasタンパク質は細胞内局在化シグナルを含みうる。文脈に依存して、例えばCas9および核局在化シグナルを含む融合タンパク質を、本明細書では、核局在化シグナルが含まれていることを明記することなく「Cas9」と呼びうる。いくつかの態様において、ペイロード（RNPなど）は、局在化シグナルを含む融合タンパク質を含む。例えば、融合タンパク質は、核局在化シグナル、核小体局在化シグナルまたはミトコンドリアターゲティングシグナルを含有しうる。そのようなシグナルは当技術分野において公知であり、非限定的な例は、Kalderon et al.,（1984）Cell 39（3 Pt 2）:499-509、Makkerh et al.,（1996）Curr Biol.6（8）:1025-7、Dingwall et al.,（1991）Trends in Biochemical Sciences 16（12）:478-81、Scott et al.,（2011）BMC Bioinfomatics 12:317（7頁）、Omura T（1998）J Biochem. 123（6）:1010-6、Rapaport D（2003）EMBO Rep.4（10）:948-52およびBrocard＆Hartig（2006）Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Molecular Cell Research 1763（12）:1565-1573に記載されており、これらの文献のそれぞれの内容は参照により本明細書に組み入れられる。さまざまな態様において、Casタンパク質は、複数の局在化シグナル、例えば2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の核局在化シグナルを含みうる。いくつかの態様では、局在化シグナルがCasタンパク質のN末端にあり、別の態様では局在化シグナルがCasタンパク質のC末端にある。
いくつかの態様において、CRISPR酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現に関してコドン最適化される。真核細胞は、例えば限定するわけではないがヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類を含む哺乳動物などといった特定の生物のものであるか、それら特定の生物に由来しうる。一般に、コドン最適化とは、関心対象の宿主細胞における発現を強化するために、ネイティブ配列の少なくとも1つのコドン（例えば、約1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個、もしくはそれ以上の数または約1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個、もしくはそれ以上を上回る数のコドン）を、ネイティブアミノ酸配列を維持しつつ、当該宿主細胞の遺伝子中でより高頻度にまたは最も高頻度に使用されているコドンで置き換えることによって核酸配列に変更を加えるプロセスを指す。さまざまな種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して、特定のバイアスを呈する。コドンバイアス（生物間でのコドン使用頻度の相違）は、多くの場合、メッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳効率と相関し、そしてそれは、なかんずく、翻訳されるコドンの特性におよび特定のトランスファーRNA（tRNA）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞における選ばれたtRNAの優位性は一般にペプチド合成に最も高頻度に使用されるコドンの反映である。
したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現に適合させることができる。コドン使用頻度表は例えば「Codon Usage Database」などで容易に入手することができ、これらの表はいくつかの方法で適合させることができる。Nakamura, Y., et al.“Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000”Nucl. Acids Res.28:292（2000）参照。Gene Forge（Aptagen、ペンシルバニア州ジェイコバス）など、特定の配列を特定の宿主細胞における発現に関してコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも用いることができる。いくつかの態様では、CRISPR酵素をコードする配列中の1つまたは複数のコドン（例えば1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個、もしくはそれ以上のコドンまたはすべてのコドン）が、特定のアミノ酸に関して最も高頻度に使用されるコドンに対応する。
一般に、ガイド配列は、ターゲット配列とハイブリダイズし、ターゲット配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指示するのに十分な、ターゲットポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの態様において、ガイド配列とその対応ターゲット配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使って最適にアラインメントした場合に、約50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、もしくはそれ以上であるか、または約50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、もしくはそれ以上を上回る。いくつかの態様において、相補性の程度は100％である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使って決定することができ、そのようなアルゴリズムの非限定的な例として、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler変換に基づくアルゴリズム（例えばBurrows Wheeler Aligner）、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign（Novocraft Technologies、ELAND（Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ）、SOAP（soap.genomics.org.cnで利用可能）およびMaq（maq.sourceforge.netで利用可能）が挙げられる。いくつかの態様において、ガイド配列は、約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75個、もしくはそれ以上の長さ、または約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75個、もしくはそれ以上を上回る長さである。ある特定の態様において、ガイド配列は、約75、50、45、40、35、30、25、20、15、12ヌクレオチド長未満、またはそれらをさらに下回る長さである。ターゲット配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指示するガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって評価しうる。例えば、試験しようとするガイド配列を含むCRISPR複合体を形成させるのに十分なCRISPRシステムの構成要素を、例えばCRISPR配列の構成要素をコードするベクターによるトランスフェクションなどによって、対応ターゲット配列を有する宿主細胞に与え、次にターゲット配列内での優先的切断の評価を、例えば本明細書に記載のSurveyorアッセイによって行うことができる。同様に、ターゲットポリヌクレオチド配列の切断は、ターゲット配列、試験しようとするガイド配列を含むCRISPR複合体の構成要素、および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を提供し、ターゲット配列における結合または切断率を、試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応との間で比較することによって、試験管内で評価することができる。
広範な細胞タイプにおけるゲノム工学を容易にするCRISPR-Cas技術が急速に発展している。Cas9-gRNA編集ツールをリボヌクレオタンパク質（RNP）の形態で送達すると、Cas9およびgRNAをコードするプラスミドの送達と比較して、いくつかの利益が得られることが、最近明らかにされた。利益には、より速くより効率的な編集、より少ないオフターゲット効果およびより少ない毒性が含まれる。RNPは、リポフェクションおよびエレクトロポレーションによって送達されてきたが、これらの送達方法では、特にある特定の臨床上重要な細胞タイプに関して、毒性および低効率を含む制約が、依然として残っている。したがって、生物学的に重要なペイロード、例えばRNPを、形質膜を横切って細胞中に送達するために、ベクターフリーの、例えばウイルスベクターフリーのアプローチを提供する必要がある。「カーゴ」または「ペイロード」とは、細胞形質膜を横切って細胞の内部へと、水溶液として送達される化合物または組成物を記載するために使用される用語である。
本主題は、広範なペイロードを細胞に低い毒性で送達することを容易にする送達技術に関する。ゲノム編集は、本主題のいくつかの局面を使って細胞にRNPを送達することによって達成しうる。その後、レベルは、Cas9がもはや検出不能になるまで低下する。送達技術それ自体は、Jurkat T細胞および初代T細胞の生存率または機能性に有害な影響を及ぼさない。本主題は、臨床上重要な細胞タイプにおけるCas9 RNPによる遺伝子編集を最小限の毒性で可能にする。
Casおよび/またはgRNAなどのCRISPR/Cas構成要素の一過性直接送達には、発現ベクターによる送達と比較して利点がある。例えば、発現ベクターの使用と比較して、ある量のCas、gRNA、またはRNPを、より的確なタイミングで限られた長さの時間にわたって加えることができる。ベクターから発現される構成要素はさまざまな量でさまざまな長さの時間にわたって生産されうるが、そのことが、オフターゲット編集を伴わない首尾一貫した遺伝子編集の達成を困難にしている。加えて、CasとgRNAの予め形成された複合体（RNP）は、発現ベクターでは送達することができない。
一局面において、本主題は、固形支持体（例えばストリップ、ポリマー、ビーズまたはナノ粒子）に取り付けられた細胞を記載する。支持体またはスキャフォールドは、多孔性または非多孔性の固形支持体でありうる。周知の支持体または担体として、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩および磁鉄鉱が挙げられる。本主題の目的にとって、担体の性質はある程度可溶性であるか、不溶性であることができる。支持体材料は、事実上任意の考えうる構造的構成を有しうる。したがって支持体の構成は、ビーズの場合のような球状、または試験官の内面もしくは棒の外面の場合のような円柱状でありうる。あるいは、表面は、例えばシートまたは試験ストリップなど、平坦であってもよい。好ましい支持体としてポリスチレンビーズが挙げられる。
別の局面において固形支持体はポリマーを含み、細胞はそこに化学結合、固定化、分散または会合される。ポリマー支持体はポリマーのネットワークであってよく、（例えば懸濁重合によって）ビーズ状に調製しうる。そのようなスキャフォールド上の細胞には、スキャフォールドの細胞質に所望の化合物を送達するために、本発明のペイロード含有水溶液をスプレーすることができる。例示的なスキャフォールドとしてステントおよび他の埋め込み可能な医用デバイスまたは医用構造物が挙げられる。
本主題はさらに、形質膜を横切ってペイロードを送達するための装置、システム、技法、および物品に関する。本主題は、形質膜を横切ってタンパク質またはタンパク質複合体などのペイロードを送達するための装置にも関係する。本主題は細胞内送達の分野において用いることができ、例えば細胞、組織または器官などのターゲット部位への分子生物学的および薬理学的治療用作用物質の送達における用途を有する。
いくつかの実施形態において、形質膜を横切ってペイロードを送達するための装置は、少なくとも1つのアトマイザーエミッタを有するアトマイザーと、アトマイザーに適応した支持体を含むことができる。本方法は、形質膜をペイロードと接触させる前にペイロードを微粒化する工程をさらに含む。
アトマイザーは、機械式アトマイザー、超音波アトマイザー、エレクトロスプレー、ネブライザー、およびベンチュリ管から選択することができる。アトマイザーは市販のアトマイザーであることができる。アトマイザーは鼻腔内粘膜用微粒化デバイス（intranasal mucosal atomization device）であることができる。アトマイザーは、米国ノースカロライナ州のLMA Teleflexから市販されている鼻腔内粘膜用微粒化デバイスであることができる。アトマイザーは、米国ノースカロライナ州のLMA Teleflexからカタログ番号MAD300として市販されている鼻腔内粘膜用微粒化デバイスであることができる。
アトマイザーは、形質膜をペイロードと接触させる前に30～100μmの直径を有する粒子のコロイド懸濁液を与えるように適合させることができる。アトマイザーは、30～80μmの直径を有する粒子のコロイド懸濁液を与えるように適合させることができる。アトマイザーは、50～80μmの直径を有する粒子のコロイド懸濁液を与えるように適合させることができる。
アトマイザーはガスリザーバを含むことができる。アトマイザーは、ガスが加圧下に維持されているガスリザーバを含むことができる。ガスは空気、二酸化炭素およびヘリウムから選択することができる。ガスリザーバは固定圧力ヘッド発生器（fixed pressure head generator）を含むことができる。ガスリザーバはアトマイザーエミッタと流体連通することができる。ガスリザーバは、アトマイザーエミッタと流体連通することができるガスガイドを含むことができる。ガスガイドは、その中をガスが通過できるように適合させることができる。ガスガイドは中空体を含むことができる。ガスガイドは開口端を有する中空体であることができる。ガスガイドは第1および第2の開口端を有する中空体を含むことができる。ガスガイドは、第1および第2の対抗する開口端を有する中空体であることができる。第1の開口端の直径は第2の開口端の直径とは異なりうる。第1の開口端の直径は第2の開口端の直径とは異なりうる。第1の開口端の直径は第2の開口端の直径より大きくてもよい。第1の開口端はガスリザーバと流体連通することができる。第2の開口端はアトマイザーエミッタと流体連通することができる。
本装置は試料リザーバを備えることができる。試料リザーバはアトマイザーと流体連通することができる。試料リザーバはアトマイザーエミッタと流体連通することができる。ガスリザーバおよび試料リザーバは、どちらもアトマイザーエミッタと流体連通することができる。
本装置は、試料リザーバとガスリザーバとの間に位置する試料バルブを備えることができる。装置は、試料リザーバとガスガイドとの間に位置する試料バルブを備えることができる。試料バルブは、試料リザーバからの試料流を調節するように適合させることができる。試料バルブは、連続または半連続試料流が可能になるように適合させることができる。試料バルブは、半連続試料流が可能になるように適合させることができる。試料バルブは、規定量の半連続試料流が可能になるように適合させることができる。0.5～100μLの半連続試料流が可能になるように試料バルブを適合させる。試料バルブは、10μLの半連続試料流が可能になるように適合させることができる。試料バルブは、0.065～0.085cm2の面積への1μLの半連続試料流が可能になるように適合させることができる。
アトマイザーと支持体は間隔を開けて置くことができる。支持体は固形支持体を含むことができる。支持体は試料ウェルを含むプレートを含むことができる。支持体は、1、6、9、12、24、48、384、1536個、またはそれ以上のウェルから選択される試料ウェルを含むプレートを含むことができる。あるいは、支持体はプレート、例えばマイクロタイタープレートより多くの細胞による単層を収容することができるスケールアップされた構成を含む。固形支持体は不活性材料から形成させることができる。固形支持体はプラスチック材料または金属もしくは合金またはそれらの組合せから形成させることができる。支持体は加熱要素を含むことができる。支持体は抵抗要素を含むことができる。支持体は装置に対して往復的に装着可能であることができる。支持体は装置に対して往復的に可動であることができる。支持体はアトマイザーに対して往復的に可動であることができる。支持体はアトマイザーエミッタに対して往復的に可動であることができる。支持体は、アトマイザーに対して支持体を往復移動させるための支持体アクチュエータを含むことができる。支持体は、アトマイザーエミッタに対して支持体を往復移動させるための支持体アクチュエータを含むことができる。支持体は、アトマイザーエミッタの縦軸に対して支持体を往復移動させるための支持体アクチュエータを含むことができる。支持体は、アトマイザーエミッタの縦軸に対して横方向に支持体を往復移動させるための支持体アクチュエータを含むことができる。
スプレーゾーンの縦軸は、ペイロードが送達される支持体および/または支持体の円形ウェルの縦軸または中心点と同軸であることができる。アトマイザーエミッタの縦軸は、支持体および/または支持体の円形ウェルの縦軸または中心点と同軸であることができる。アトマイザーエミッタの縦軸、支持体の縦軸およびスプレーゾーンの縦軸は、それぞれ同軸であることができる。スプレーゾーンの縦方向の長さは、スプレーゾーンの円形底面（例えばペイロードを送達しようとする細胞の区域）の直径より大きくてもよい（2倍超であってもよい）。
本装置はガスリザーバとアトマイザーとの間に位置するバルブを備えることができる。バルブは、電磁気で稼働するバルブであることができる。バルブはソレノイドバルブであることができる。バルブは空気圧バルブであることができる。バルブはガスガイドに位置することができる。バルブは、ガスガイド内のガス流を調節するように適合させることができる。バルブは、連続または半連続ガス流が可能になるように適合させることができる。バルブは、半連続ガス流が可能になるように適合させることができる。バルブは、規定の時間間隔の半連続ガス流が可能になるように適合させることができる。バルブは、1秒間隔の半連続ガス流が可能になるように適合させることができる。装置は少なくとも1つのフィルターを含むことができる。フィルターは10μm未満の孔径を含むことができる。フィルターは10μmの孔径を有することができる。フィルターはガスガイドに位置することができる。フィルターはガスガイドと流体連通することができる。
本装置は少なくとも1つのレギュレータを備えることができる。レギュレータは電気式レギュレータであることができる。レギュレータは機械式レギュレータであることができる。レギュレータはガスガイドに位置することができる。レギュレータはガスガイドと流体連通することができる。レギュレータは調節バルブであることができる。ガスガイド内の圧力は1.0～2.0バールであることができる。ガスガイド内の圧力は1.5バールであることができる。ガスガイド内の圧力は1.0～2.0バールであることができ、アトマイザーと支持体との間の距離は31mm未満または31mmであることができる。ガスガイド内の圧力は1.5バールであることができ、アトマイザーと支持体との間の距離は31mmであることができる。ガスガイド内の圧力は、アトマイザーと支持体との間の距離1ミリメートルあたり0.05バールであることができる。調節バルブは、ガスガイド内の圧力を1.0～2.0バールに調節するように適合させることができる。調節バルブは、ガスガイド内の圧力を1.5バールに調節するように適合させることができる。調節バルブまたは各調節バルブは、ガスガイド内の圧力を1.0～2.0バールに維持するように適合させることができる。調節バルブまたは各調節バルブは、ガスガイド内の圧力を1.5バールに維持するように適合させることができる。
本装置は2つのレギュレータを備えることができる。装置は第1および第2のレギュレータを含むことができる。第1および第2のレギュレータはガスガイドに位置することができる。第1および第2のレギュレータはガスガイドと流体連通することができる。第1のレギュレータはガスリザーバとフィルターとの間に位置することができる。第1のレギュレータは、ガスガイド内のガスリザーバからの圧力を2.0バールに調節するように適合させることができる。第1のレギュレータは、ガスガイド内の圧力を2.0バールに維持するように適合させることができる。第2のレギュレータはフィルターとバルブとの間に位置することができる。
アトマイザーエミッタは錐状のスプレーゾーン（例えば概して円錐状のスプレーゾーン）を与えるように適合させることができる。アトマイザーエミッタは30°の錐状スプレーゾーンを与えるように適合させることができる。装置は、装置の任意のまたはすべての部品を制御するためのマイクロプロセッサを、さらに含むことができる。マイクロプロセッサは、試料バルブ、支持体アクチュエータ、バルブおよびレギュレータのうちのいずれかまたはすべてを制御するように配置することができる。装置は、少なくとも1つのアトマイザーエミッタを有するアトマイザーとアトマイザーに適応した支持体を含むことができ、アトマイザーは機械式アトマイザー、超音波アトマイザー、エレクトロスプレー、ネブライザーおよびベンチュリ管から選択することができる。アトマイザーは、30～100μmの直径を有する粒子のコロイド懸濁液を与えるように適合させることができる。装置は、試料リザーバおよびガスガイドならびに試料リザーバとガスガイドとの間に位置する試料バルブを含むことができる。試料バルブは、10～100μLの半連続試料流が可能になるように適合させることができる。アトマイザーと支持体は間隔を開けて置くことができ、それらの間に概して錐状のスプレーゾーンを画定することができる。また、アトマイザーと支持体との間の距離は、分子を送達しようとする細胞の区域の円形底面の直径の約2倍であることができ、アトマイザーと支持体との間の距離は31mm、分子を送達しようとする細胞の区域の円形底面の直径は15.5mmであることができる。装置はガスガイドを含むことができ、ガスガイド内の圧力は1.0～2.0バールである。装置は、10μm未満の孔径を有するフィルターを少なくとも1つは含むことができる。
水溶液および/または組成物はサポニン非含有であることができる。
本明細書に記載する主題の1つまたは複数の変形物の詳細を、添付の図面および以下の説明において述べる。本明細書に記載する主題の他の特徴および利点は以下の説明および図面ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
ソルポレーション用T細胞調製物の最適化
ベクターフリーの可逆的な透過処理方法を使ったmRNA送達の効率を最大にするためのT細胞培養条件の最適化を以下に説明する。本明細書に記載する、高分子および核酸を細胞内送達するためのベクターフリー法は、CRISPR/Cas9およびmRNAなどの遺伝子編集ツールの、初代ヒト免疫細胞などの哺乳動物細胞への送達を容易にすることに成功した。ベクターフリー送達プラットフォームを使ってヒトT細胞にmRNAを効率よく導入するための培養条件を決定した。
ヒトリンパ球のエクスビボ活性化には、臨床グループおよびT細胞エンジニアリング会社間で、かなりの相違が存在する。初代ヒトT細胞の増大のための単一の標準化されたプロトコールはない。そこで、ベクターフリーの可逆的透過処理法技術を使ったmRNAの最大効率での導入を促進する最適なエクスビボ培養条件を同定するために、培養用培地、添加剤、活性化方法、およびタイミングスケジュールの包括的評価に着手した。ここでは、着手した各実験の細胞単離プロトコールおよびその結果/結論を記載する。
浮遊細胞（すなわち非接着細胞）に対処するために、遠心分離工程を、送達プロセスの一部として開発した。この工程は浮遊細胞の露出単層の形成を可能にするために開発された。この遠心分離工程は、単層の形成と上清の除去の両方を、一工程で可能にする。これに対して、接着細胞では、細胞が既に単層を形成しており、ピペッティングによって培地を除去した。
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション。Leuko Pak（AllCells、カリフォルニア州アラメダ）から、パーコール勾配での遠心分離によって、ヒト末梢血単核球（PBMC）を回収した。CD3マイクロビーズ（Miltenyi）を用いる磁気活性化細胞選別によってCD3＋富化リンパ球を単離した。10％ジメチルスルホキシド（DMSO）およびウシ胎児血清（FBS）中で細胞を凍結保存した。保存アリコートからの初回融解後に、CD3＋T細胞を、37℃および5％CO2の加湿組織培養インキュベータにおいて、ヒト組換えインターロイキン-2（IL-2）中で培養すると共に、さまざまなプロトコール（下記参照）を使った一次刺激および共刺激抗体活性化を行った。
送達手法。活性化T細胞を、96ウェルフィルタープレート（Acroprep、1.2μm Suporメンブレン、Pall、米国）にウェル1個あたり1.5×106個の細胞で播種した。培地を300×gで5分間の遠心分離によってウェルから除去した。次に、4μgのGFP mRNAを含有する7μlの送達溶液（モレキュラーグレード水（molecular grade water）中の32mMのスクロース、12mMの塩化カリウム、12mMの酢酸アンモニウム、5mMのHEPES、および27％のエタノール（いずれもSigma-Aldrich製））を、各ウェル中に、ベクターフリー送達スプレー機器を使ってスプレーした。この機器に使用したアトマイザーはMAD Nasal（商標）鼻腔内粘膜用微粒化デバイス（Wolfe Tory Medical Inc、米国ソルトレイクシティ）である。アトマイザーを、ウェルの底から26mm上で、レトルト台に保持し、ポリウレタン管（外径6mm、内径4mm、SMC、日本、東京）を介して6バールコンプレッサー（Circuit Imprime Francais、フランス国バニューCedex）に接続した。カーゴを含有する送達溶液を、アトマイザーの上部に位置する送達ポートにピペットで注入し、スプレーアクチュエータボタン（SMC、日本、東京）を使って1.5バールでスプレーを生成した。送達後に、細胞をこの溶液中で2分間インキュベートしてから、50μlの停止溶液（0.5×PBS）を加えた。30秒後にT細胞培地を加え（100μl）、細胞を37℃および5％CO2で一晩回復させた。送達の24時間後に取込みおよび生存率を評価した。
細胞生存率、FACS試料調製、および分析。ベクターフリー送達方法後の細胞生存率を評価するために、7-アミノアクチノマイシンD（7-AAD）（Sigma）を使って細胞を染色した。簡単に述べると、細胞をPBS＋1％ウシ胎児血清（FACS緩衝液）中で洗浄してから、7-AADと共にインキュベートし（1:40、遮光下、室温で5～10分）、次にPBS＋1％FBS（FACS緩衝液）に再懸濁した。試料をBD Accuri C6フローサイトメーター（Becton Dickinson、米国）で処理し、C6ソフトウェアを使ってデータを分析した。前方散乱パラメータおよび側方散乱パラメータを使って細胞デブリを全細胞から排除した。FSC高さ対FSC面積のプロットでダブレットを排除することによって単一細胞を選択した。ゲーティングされた生細胞でGFP発現を分析した。
培地、活性化試薬、およびタイミング
T細胞の培養および増大のための4種類の培地を、カーゴとしてmRNA、例えばモデルカーゴGFP mRNAを使用し、好結果な培養方法の指標としてGFP発現を使用して、評価した。初代免疫細胞の培養に典型的に使用される血清含有培地であるcRPMIを試験した。しかし血清は、細胞培養用培地における、ばらつきの大きい補充物であるため、ヒトT細胞のインビトロ培養用に最適化された3種類の無血清およびゼノフリー増大培地も評価した。
cRPMIは、RPMI、熱非働化ウシ胎児血清（FBS）（10％v/v）、ペニシリン-ストレプトマイシン、L-グルタミンを使って調製し、IL-2（100U/ml）を補充した。さまざまなT細胞増殖プロトコールの成績を評価する実験における培養用培地として、cRPMIを用いた。試験した第1の増殖プロトコールは、Tリンパ球上のCD3およびCD28細胞表面リガンドに結合する可溶性四量体型抗体複合体からなる、ImmunoCult（商標）ヒトCD3/CD28 T細胞アクチベーターである。これを、T細胞の増殖を誘発するために抗原をT細胞受容体（TCR）に提示する手段として「フィーダー」細胞を使用する代替活性化方法と一緒に評価した（図1）。
フィーダー細胞としてPBMCまたはA549を使用するT細胞活性化
自家PBMCを組織培養プレートに移した。2時間のインキュベーション後に上清を除去して、接着した単球を残した。cRPMI中で培養したT細胞をプレートに加え、単球と共に数日間、共インキュベートしておいた。類似するプロトコールでは、A549細胞株を最大2時間接着させておいた。培地を除去し、T細胞をプレートに加えて、共インキュベートしておいてから、ベクターフリー送達技術を使ってmRNAを送達した。フィーダー細胞を使った場合、取込み効率は実験内でも実験間でもばらついたので（図1）、さらなる評価ではImmunoCult（商標）ヒトCD3/CD28 T細胞アクチベーター試薬を用いた。
Dynabeads（登録商標）を使用するT細胞活性化
T細胞は、当技術分野において公知の方法、例えばCD3および/またはCD28などの細胞表面タンパク質に結合する抗体、フィーダー細胞、および/または免疫賦活分子を含む磁気ビーズを使って、活性化される。例えばDynabeads（登録商標）を、ImmunoCult（商標）ヒトCD3/CD28 T細胞アクチベーターの代替物として検討した。Dynabeads（登録商標）は、T細胞の活性化および増大に必要な一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルを与えるヒトCD3およびCD28に対する抗体でコートされた超常磁性ビーズである。推奨されるビーズ対細胞比は1:1であるが、より効率のよい迅速な増大がソルポレーション送達法を使ったT細胞中へのmRNAの取込みに正の影響を及ぼすかどうかを評価するために、細胞1個あたり3つのビーズを用いる別の条件も使用した。ビーズ対細胞比を増加させると、取込み率が有意に改良された（図2A）。次に、繰り返し実験を行って、ImmunoCult（商標）ヒトCD3/CD28 T細胞アクチベーターを製造者が推奨する濃度の3倍で含めたが、この濃度は、Dynabeadsを使って観察されたものと同じ効率の改良はもたらさなかった（図2B）。
培養用培地:Prime XV
本送達方法では細胞に適合する培養用培地を使用した。例えばPrime-XV（Irvine Scientific）は、ベクターフリー送達技術で試験された最初の無血清および動物構成要素非含有培地である。Dynabeadsを3:1のビーズ対細胞比で使って観察された肯定的データに基づき（図2ならびに図2Aおよび2B）、この活性化方法を使って代替培養用培地の試験を続けることにした。抗ヒトCD3抗体を細胞培養プレートに結合させた後、可溶性抗CD28を培地に添加することによってT細胞増殖を刺激する代替的活性化方法と共に、増殖を誘導するためにDynabeadsを使って、この培地を試験した。Prime XV中で培養したDynabead活性化T細胞は、可溶性α-CD3/CD28を使って刺激した細胞（＜20％）と比較して、有意に向上した取込み効率（最大50％）を示した（図3）。
Prime XV中で培養したT細胞への送達はベクターフリー技術を使ったmRNAの取込みを改良したが、これには、例えば最初の播種から24時間後に細胞を培養から取り出すことおよび洗浄時のDynabeadsからの細胞の回収率など、細胞取扱い上の問題が伴った（図4Aおよび図4B）。
培養用培地:補充サイトカイン
いくつかの例では、増殖率を強化するために高濃度のIL-2（100U/mlではなく200U/ml）を細胞培養用培地に補充した（Tumeh P, et al., J Immunother 2010. 33（6）:759-768およびBesser MJ, et al., Cytotherapy 2009. 11:206-217）。
培養用培地:Immunocult
Immunocult（商標）-XF増大培地（StemCell Technologies）を評価した。Prime XVのように、これも無血清ゼノフリーT細胞培養用培地である。この例では、T細胞をImmunocult増大培地中で培養し、ビーズ対細胞比3対1のDynabeads（登録商標）を使って活性化した。活性化後1日目および2日目にGFP mRNAを細胞に送達し、24時間後に評価した（図5）。
T細胞の活性化後の送達のタイミング
細胞は15～21時間活性化され、19時間が好ましい。
Dynabeadsを添加した後の活性化後の送達にとって好ましい「ウィンドウ」を同定した。ベクターフリー技術を使って、いくつかの時点で、mRNAを送達した。mRNAペイロード、例えばモデルペイロードGFP mRNAが、17時間および21時間との比較で活性化19時間後に送達された場合に、最適なGFP発現が観察された（図6）。増大した細胞サイズと活性化後の時間との間に相関関係があるかどうかを判定するための研究に着手した。細胞サイズは、フローサイトメトリー分析から得られる前方散乱（FSC）データを使って見積った。最大トランスフェクション効率は細胞のサイズが活発に増大している時間と相関することが観察された。例示的な結果を下記の表に図示する。
（表）T細胞の活性化後の送達のタイミング
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TransActを使用するT細胞活性化
T cell TransAct（商標）（Miltenyi）は、T細胞の活性化および増大のためのシグナルを与えるCD3およびCD28アゴニストにコンジュゲートされたナノマトリックスからなるコロイド試薬である。これは、過剰な試薬を遠心分離によって除去することができ、細胞からのビーズの磁気分離とその後の洗浄がすべて必要ないので、Dynabeads（登録商標）と比較して有益である。そこで、Immunocultを培地として使用して、この試薬を3日間にわたって評価することで、本明細書に記載のベクターフリー送達技術によるmRNAの送達にとって好ましい日を決定した。TransActによるT細胞増殖の開始はDynabeadsほど活発ではなかった。それゆえに、T細胞へのmRNAの最適な送達は、ビーズ活性化を使った場合に示されるものより24時間遅く観察されたが、これには、トランスフェクション効率の強化が伴った（図7）。
培養用培地:TexMACS
T細胞培養用の代替的無血清培地としてTexMACS（Miltenyi Biotech）も試験した。このT細胞刺激および増大試薬は有用であったが、この後日常的には使用しなかった（図8）。
活性化前の融解後回復期間の効果
回復期間なしで融解後直ちに回復剤を添加する場合と比較して、活性化試薬の添加前に細胞を一晩回復させることの送達にとっての利益を評価した。液体窒素貯蔵からT細胞を融解したら、活性化試薬の添加前に、細胞を培養用培地だけで一晩回復させた。この工程はトランスフェクション効率に30％の改良をもたらした。いくつかの例では、本方法において新鮮初代非接着細胞を使用し、別の例では、初代非接着細胞を例えば貯蔵のために凍結してから、ペイロード送達方法の前に融解する。したがって本方法は任意で初代非接着細胞の凍結/融解工程を含みうる。これらのデータは、活性化前の（融解後の）回復期間が有用であることを示している。
細胞培養密度
ベクターフリー送達に先だって、細胞を、Immunocult増大培地中、さまざまな播種密度（1×106個/mlおよび5×106個/ml）で培養した。ソルポレーション前の培養時の細胞密度は1～5×106個/mLである。播種数の増加は取込み効率の向上につながった（図10）。
亜鉛を使用するT細胞活性化
亜鉛流入はT細胞活性化を支援できるが（Yu M, et al., J. Exp. Med. 208（4）:775-785）、核酸のトランスフェクションも改良しうる（Niedzinski EJ, et al. Mol Ther 2003 7（3）:396-400）。亜鉛は2回の独立した実験においてT細胞増殖を改良した（図11）。トランスフェクション効率が向上する傾向が見られた。このように亜鉛は活性化工程において細胞培養用培地の随意の構成要素である。亜鉛濃度の範囲は0.03mMから3mMである。
mRNA送達の効率を最大にするためのT細胞培養条件の最適化
複数の培養用培地、活性化法、補充物、および時間経過の評価により、ベクターフリー送達技術を使ったヒト初代T細胞へのmRNA、例えばモデルペイロードGFP mRNAのトランスフェクション効率を最大化する前条件付けプロトコールがもたらされた。この評価では、200U/mlのIL-2を補充したImmunocult（商標）T細胞増大培地中、5×106個/mlの密度で、細胞を培養した。細胞を融解後に一晩回復させてから、核酸のベクターフリー送達前に48時間にわたって、1×T cell TransAct（商標）（Miltenyi）を加えた。
Leuko Pak（AllCells、カリフォルニア州アラメダ）から、パーコール勾配での遠心分離によって、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を回収した。精製された集団を抗CD8マイクロビーズを使って回収するために、ネガティブ選択によってCD4富化T細胞を単離し、LDカラム（Miltenyi）から素通り画分を収集した。細胞を、標準的細胞培養用培地、例えばRPMI基本培地、熱非働化ウシ胎児血清（FBS）（10％v/v）、ペニシリン-ストレプトマイシン、L-グルタミンを使ってIL-2（200U/ml）を補充した完全RPMIで、培養した。細胞を4時間回復させてから、Dynabeads（登録商標）を3対1のビーズ対細胞比で加えた。活性化後1日目にmRNAを細胞に送達し、24時間後に取込みについて評価した。この細胞タイプでは複数回ヒットによって取込み効率の向上が達成された、＞30％（図12）。
2mMのGlutaMAX、10mMのHEPES、および5％のヒトAB血清ならびに250IU/mlのIL-2を補充したX-VIVO 15中で培養したPBMCからT細胞を富化させた。細胞を1×106個/mLの密度で播種し、培養前に抗CD3および抗CD28抗体（Miltenyi）を補充した。開始後2日目または3日目のどちらかにソルポレーションによってmRNA、例えば試験ペイロードGFP mRNAを細胞に送達し、24時間後に取込みについて評価した（図13）。
T細胞単層形成の最適化
細胞単層は、細胞が基体上の単一の層に配向されている培養物である。基体は一般的にはプレート、例えばマイクロタイタープレート、フラスコ、ペトリ皿、メンブレンまたはフィルターであり、その上に細胞がのる。細胞培養において、単層とは、細胞が同じ表面上で実質的に並んでいて、多くの場合、互いに接触している細胞の層を指す。細胞は接着細胞（基体に付着する細胞）または非接着細胞（培養用培地中に浮遊または懸濁する細胞）である。接着細胞は基体上で成長し、付着し、それによって単層を形成する。単層は、非接着細胞または「浮遊細胞」から生成することもできる。「非接着細胞」および「浮遊細胞」という用語は、本明細書では相互可換的に使用される。
細胞へのペイロードの送達に先だって非接着細胞または浮遊細胞から細胞単層を生成するには、いくつかの技法を使用しうる。そのような技法には、培養浮遊細胞を基体上に沈降させること、遠心分離、真空への曝露、陽圧への曝露、磁気T細胞活性化ビーズの使用、および/またはメンブレンへの沈着（例えば後述するトランスウェルインサートシステムの使用）などがある。
トランスウェルインサート
細胞がスプレーに対して最適に提示されることを可能にする浮遊細胞の単層を形成させるために、トランスウェルインサートシステムを使用した。インサート1個あたり400μl中に1×106個で細胞を播種し、トランスウェルインサート（Greiner bio-one;カタログ番号655640;12ウェルThinCert;PET 0.4μm）を、インサートの底に真空（-0.5バール～-0.65バール）を適用することを可能にするデバイスに入れることによって、培地を除去した（図14A、B、C参照）。培地が除去されると、残留した細胞は、スプレーを適用することができる単層を形成した。PBMC、初代T細胞または細胞株、例えばJurkat T細胞などの非接着細胞をインサートシステムに加え、真空を適用し、インサートを12ウェルプレート中に設置し、蛍光標識β-ラクトグロブリン（BLG）、ウシ血清アルブミン（BSA）または卵白アルブミン（OVA）のいずれかなどの試験ペイロードを含有する送達溶液（10μl）をスプレーした。2分間のインキュベーション後に停止溶液（50μl）を適用し、30秒後に通常培地（100μl）を適用した。55.6、28.5、および15.3％の発現レベルが達成された（図15）。インサートシステムは、非接着細胞を使って単層を生成するための例示的技法として有用であることがわかった。
96ウェルポリエーテルスルホン（PES）プレート
培養用培地の濾過を可能にする透過性メンブレンも細胞単層の生成には有用である。そのようなメンブレンとして、硝酸セルロースメンブレン、酢酸セルロースまたはPESメンブレンが挙げられる。
浮遊細胞単層を生成するために、そのようなメンブレンベースのシステムを評価した。96ウェルフィルターボトムプレートは、ウェルにフィルターボトムを持つ96ウェルフォーマットを与える。Pall Suporフィルタープレート（AcroPrep Advance;PES 1.2μm、カタログ番号8039）を評価した。1×106個のヒト初代T細胞をウェル1個あたり100μlで播種し、プレートを300×gで5分間遠心分離した。培地が遠心分離で除去され、残留した細胞が単層を形成したら、プレートをSoluporeデバイス内に設置し、mRNAを含有する送達溶液を細胞にスプレーした。2分間のインキュベーション後に停止溶液（50μl）を適用し、30秒後に通常培地（100μl）を適用した。細胞を2時間インキュベートしてから、このプロセスを繰り返した。このスプレーの最後に、加湿インキュベータ中、37℃および5％CO2で、細胞を一晩インキュベートし、フローサイトメトリーによってGFP蛍光について評価した。5人のドナーおよび5回の実験で52％±3.6のGFP発現レベルが達成され、生存率は97％±3.3であった（図16A、B、C）。PESプレートは、細胞が回収不可能になる可能性があるメッシュ状のフィルターを含有する。他のフィルタータイプ、例えばトラックエッチドフィルターを評価した。トラックエッチドメンブレンは薄い（約5～25マイクロメートル）ポリマーメンブレンであり、その小孔は、最初の非多孔性材料に高エネルギー粒子を照射し、次に潜在飛跡のエッチング（通常は苛性エッチング液（例えばNaOH）による）を行って、メンブレンを通る所与の直径の小孔を形成させることによって、形成される。
96ウェルポリカーボネートトラックエッチド（PCTE）プレート
非接着細胞の細胞単層の生成には代替的メンブレンフィルターシステムを使用しうる。例えば、0.4μm親水性PCTEフィルターを持つ代替的フィルタープレートをAgilent technologiesから入手した。ウェル1個につき100μlあたり2.5×105個の細胞でヒト初代T細胞を播種し、350×gで2分間遠心分離した。培地が除去され細胞単層が形成されたら、プレートをSoluporeデバイス内に設置し、GFP mRNAなどの試験ペイロードを含有する送達溶液を細胞にスプレーした。2分間のインキュベーション後に停止溶液（50μl）を適用し、30秒後に通常培地（100μl）を適用した。細胞を2時間インキュベートしてから、このプロセスを繰り返した。このスプレーの最後に、加湿インキュベータ中、37℃および5％CO2で、細胞を一晩インキュベートし、フローサイトメトリーによってGFP蛍光について評価した。72％±5のGFP発現レベルが達成され、生存率は75.0％±3.5であった（図17）。PESプレートとPCTEプレートを比較した結果を図18に示す。この結果は、PCTEプレートを使用すると取込みが強化されることを示している。このように親水性メンブレンフィルター、任意でトラックエッチドフィルターは、有用な例示的メンブレンであり、いくつかの態様において好ましい。
溶媒除去
細胞から培地を除去するための方法にも取り組んだ。フィルタープレートを使って、遠心分離、真空圧および陽圧を評価した。96ウェルフィルタープレート（Pall;Supor, 1.2μm;カタログ番号8039）にウェル1個あたり1×106個のヒト初代T細胞を播種した。培地を、300×gで5分間の遠心分離によって、または真空圧（-20mBar、30秒;図105～107参照）によって、培地を除去した。0.57μg/μlのGFP mRNAを含有する4μlの送達溶液を細胞単層にスプレーした。2分間のインキュベーション後に停止溶液（50μl）を適用し、30秒後に通常培地（100μl）を適用した。加湿インキュベータ中、37℃および5％CO2で、細胞を一晩インキュベートし、フローサイトメトリーによってGFP蛍光について評価した（図19A、B）。別の実験では、Agilent PCTEフィルタープレート（Agilent;PCTE 0.4μm）に、ウェル1個あたり100μl中に2.5×105個の細胞で、ヒト初代T細胞を播種した。遠心分離（350×gで2分間）または陽圧（200mBarで1分間）のいずれかによって培地を除去した。培地が除去され細胞単層が形成されたら、プレートをSoluporeデバイス内に設置し、GFP mRNAを含有する送達溶液を細胞にスプレーした。2分間のインキュベーション後に停止溶液（50μl）を適用し、30秒後に通常培地（100μl）を適用した。細胞を2時間インキュベートしてから、このプロセスを繰り返した。このスプレーの最後に、加湿インキュベータ中、37℃および5％CO2で、細胞を一晩インキュベートし、フローサイトメトリーによってGFP蛍光について評価した（図19A、B）。真空圧を使ってウェルから培地を除去することで、細胞単層を得る。任意で、陽圧と遠心分離の両方を使って単層を生成する。いくつかの態様では、後者の技法が好ましい。
磁気ビーズ
代替的方法では、T細胞活性化ビーズ（例えばDynaBeads 3:1比）の使用と磁石を組み合わせる。一晩活性化した後、T細胞（DynaBeadsに結合しているもの）を96ウェルプレートに播種した。磁石をウェルの下に設置し、培地をピペットで除去した。磁石は、培地が除去される間、ビーズと細胞をその場に保持する。次にmRNAをソルポレーションによって送達した。24時間後に光学顕微鏡法によってGFP発現を検出した。
MSCへのmRNA送達
単層中の細胞への送達を確認するために、間葉系間質細胞（初代ヒト細胞またはiPSC由来細胞）を、コンフルエンシーが24時間までに80～90％になるように、96ウェルプレートに播種した。
BM-MSCおよびiPSC-MSCへのmRNA、例えば試験ペイロード/カーゴGFP mRNAの送達を評価した。可逆的透過処理を伴うベクターフリー細胞内送達方法を使った初代BM-MSCへの10kDaデキストランなどのさまざまなカード化合物の送達は以前に報告した（O'Dea S, et al., PLoS One. 2017. 30;12（3）:e0174779）。mRNAなどの機能的分子の送達方法も評価した。BM由来MSCおよびiPSC由来MSCへのmRNA送達効率を評価するためにレポーターGFP mRNAを使用した。
複数回の処理、例えば3回のGFP mRNAを、2日間にわたってBM-MSCおよびiPSC-MSCに送達した。蛍光顕微鏡法により、最後のmRNAを送達した24時間後に、細胞におけるGFPタンパク質の発現を確認した（図72A）。フローサイトメトリー分析は、BM-MSCおよびiPSC-MSCにおいてそれぞれ29.5±10.4％および31.0±2.2％（n＝3）の送達効率を示した（図21A、B）。
送達溶液の微粒化の最適化
ペイロード溶液を微粒化するために使用した粘膜用微粒化デバイス（Mucosal Atomization Device）（MAD Nasal（商標））スプレーヘッドはミリリットル量の体積を分注し、一方、ソルポレーションはマイクロリットル体積で作動する。マイクロリットル体積のアトマイザー/小滴送達システムの使用が好ましい。
2つの主目的である、取込みを増大させること、ならびに複数回の繰り返し（実験内）および複数の実験（実験間）にまたがる再現性を改良することのために、代替的スプレーヘッドを調べた。T細胞へのmRNA送達にはどれが最適か見いだすために、代替的アトマイザーデバイスの評価に着手した。アトマイザーは、送達溶液を小滴化された形態で細胞単層に適用することを可能にする。アトマイザーの同定に加えて、微粒化プロセスの微細制御を可能にする制御装置デバイスを設計し、組み立てた。T細胞にmRNAを送達するための最適パラメータを見いだすために、さまざまなパラメータセットを試験した。
結果は、Ari Mistネブライザーおよび180kHz超音波ネブライザーなどのマイクロリットル体積送達デバイスは、同等な取込みおよび再現性を与え、細胞生存率はAri Mistの方がわずかに高いことを示した。そのようなマイクロリットル体積送達デバイス、例えばAri Mistヘッドは、サイズが小さく、取扱いが容易であり、稼働させるために電源ボックスを必要としないことから好ましく、自動化ソリューションに組み込むことができる。Burgener噴霧化技術（参照によって組み入れられる米国特許第6,634,572号）などの他のユニットも、ソルポレーションのスケールアップに適切である。これらを総合して、自動化およびスケーリングに向けて、Ari Mistおよび他のBurgenerネブライザーを使用した。
単分散小滴を生成するための送達溶液の微粒化
さまざまな方法を使って細胞膜透過処理溶液を細胞の単層上に送達した。例えば透過処理溶液は超音波を使って微粒化するか、空気圧ネブライザーを使って噴霧化することができる。
送達方法として空気支援超音波処理および空気圧噴霧化の両方を試験した。3種類の超音波ヘッド、すなわち60KHz（Sonaer）、130kHz（Sonaer）、および180kHz（Sonotek Echo）、ならびに5つの空気圧ネブライザー、すなわちAri Mist、X-175、PFA250、T2100、およびPeek Mira Mist（Burgener Research）の、合計8つの異なるスプレーヘッドを試験した。
超音波処理試験は、60kHz、130kHz、および180kHzで行った。液体はポンピングシステムによって超音波ノズルへと押し出すことができ、高周波音波振動を使って微細ミストスプレーに微粒化することができる。
ガス（空気）のカーテンはこのプロセスを支援することができる。シェーパーと呼ばれる補助片が超音波ヘッドの周りに装着され、空気の機能は超音波処理された液体のミストを成形することである。例えば空気は、スプレーを成形するだけでなく、ペイロードが細胞に進入するのを促進するという、二重の機能を持った。これは、シェーパーを介して供給された空気が成形機能のために使用される圧力を越える圧力であったので、可能になった。
超音波ネブライザーによる試験は、哺乳動物細胞、例えば非接着細胞へのカーゴ/ペイロードの送達に有用な結果を与えた。180kHz超音波ヘッドを使って最大60％のデキストラン-Alexa488（モデルカーゴ）がU2OS細胞に送達された（図22A、B）。
圧電変換器を使って電気的入力を振動という形の機械的エネルギーに伝えることができる。この振動は、ノズル中に導入されると、液体中に表面張力波を生じさせ、液体の微粉化をもたらした。各超音波プローブは所与の共鳴周波数で作動した。稼働周波数は生成する液滴のサイズを決定することができる。小滴のサイズは、稼働周波数ほどではないが、超音波プローブを稼働させるパワーによる影響も受けうる。スプレーの制御と成形を助けるために、補助空気流を使用することができる。
例示的超音波スプレーエミッタは、小滴のサイズ分布が狭い微細スプレーを生成し、そしてその狭いサイズ分布が、細胞への送達溶液およびペイロードの均等な沈着をもたらす。例えばMAD nasalスプレーヘッドについて評価された好ましいパラメータに関して、送達される体積を低減し、エタノール濃度を低減することで、超音波スプレーヘッドでの送達効率が改良され、生存率が改良された。
Ari Mist、Peek Mira Mist、T2100、X175、およびPFA250ネブライザー（Burgener Research）など、小滴（マイクロリットル体積）を生成するためのさらなるネブライザーを試験した。これらの例示的ネブライザーは圧縮ガスで稼働し、試料溶液を供給するためのポンプを必要とする。これらの例示的アトマイザーは2本の並行チャネルを有し、一方はガス（空気）用であり、他方は噴霧化される液体用である。どちらの経路も、ネブライザーの先端において、ガス用のオリフィスおよび液体用の出口で終わっている。ガス流は液体をガス流中に引き込むことができる。ガス分子との衝突は液体を小さな小滴へと砕いて噴霧化をもたらすことができる。
試験したBurgenerネブライザー（米国特許第6,634,572号）は、内径、材料、および最適流速が異なる。予備試験においてネブライザーは、同等なカーゴmRNAの発現を与えた。小滴サイズの特徴決定により、小滴は1～20μmの範囲にわたり、小滴のピーク数は5～7μmの範囲にあることが明らかになった。ザウター平均（D32）直径として定義される平均粒子サイズは13μmである（http://www.burgener.com/EnhancedData.html参照）。試験した一組のBurgener製ネブライザーのうち、次に挙げるいくつかの因子に基づいて、Ari Mistを優先的スプレーヘッドとして選んだ:取込みおよび生存率が良好であり、その仕様（最適流速、内径）がポンピングシステムの特徴と釣り合っていて、その内径（225μm）は、目詰まりという不都合を伴わずに低体積の液体を取り扱えるほど十分に小さかった。
Certusデジタル分注技術
Certus Flex液体分注機器に8チャネル分注ヘッド（カタログ番号D196057）および2つのバルブサイズ（ノズル直径0.10、トラベル0.03（カタログ番号21765）およびノズル直径0.15、トラベル0.03（カタログ番号21766））を装着した。各チャネルはCertusの専売ソフトウェアおよび電子機器を使って個別に制御される。Certus Flexは、Gygerマイクロバルブ技術および空気圧制御を使った液体および大分子の無接触分注を可能にする。ナノリットル（nl）域の体積を高い精度で送達することができる（100nlでCV 5％;CVは変動係数または相対標準偏差を表す）。
Certus Flexマイクロ流体プラットフォームを使ったT細胞へのmRNA送達の実現可能性を評価するために、ナノリットル（nl）～μlサイズ域の小さな小滴の生成によるT細胞へのmRNAの送達を調べた。
CD3＋T細胞を、例えばDynabeadsまたはTransActのどちらかを使って活性化した。96ウェルフィルタープレート（PES）に、ウェル1個あたり1.5×106個の細胞で、細胞を播種した。プレートを、例えば300×gで5分間、遠心分離することで、細胞培養用培地を除去した。送達溶液は、表1に列挙したパラメータで、チャネル1を介して各ウェルに分注した。マイクロリットル量の総体積、例えば2μlまたは7μlを、体積が7～0.08μlの範囲にわたる小滴として送達した。小滴の体積は、ウェル中に分注された滴の数によって決定した。図58は試験した小滴アレイパターンを表す（図58）。バルブタイプ、圧力および高さは表2に略述するようにさまざまであった。送達溶液の適用後に細胞を2分間インキュベートした。チャネル2を介して50μlの停止溶液を加え、30秒間インキュベートした。チャネル3を介して100μlの培養用培地を加えた。分析に先だってプレートを37度で24時間インキュベートした（図58）。
結果は、このシステムを使用すると細胞生存率が無処理細胞と同等であったことを示している。このシステムを使った場合、GFP mRNAの送達は観察されなかった。これは試験したすべてのパラメータで見られた（図61）。このように、nl～μl域の小滴を送達するためにCertusデジタル分注技術を使用しても、T細胞へのGFP mRNAの取込みは起こらなかった。
（表１）プレート送達テンプレートパラメータ
Figure 0007465090000002
（表２）分注ヘッドチャネル構成
Figure 0007465090000003
スプレーの微細制御を可能にするための機器使用
重要なスプレーパラメータを制御し、スプレーの機械化を可能にするために、試験リグを組み立てた。細胞懸濁液が入っているプレートは、試験リグに設置する前に遠心分離した。ペイロードを含有する送達溶液をelveflow流体リザーバまたはシリンジシステムに充填した。ペイロードを含有する送達溶液の流体制御は、ピンチバルブまたはマイクロバルブのどちらかを使って達成した。停止および培養用培地の添加は手作業で行った。
ペイロードを含有する送達溶液の流体制御は、2つのシステムであるelveflow-ピンチバルブシステムおよびシリンジ-マイクロバルブシステムを使って達成した。シリンジ-マイクロバルブシステムにはelveflow-ピンチバルブシステムを上回る利益があることがわかった。
（a）ペイロードを含有する送達溶液の流体制御
（i）Elveflow-ピンチバルブ
Elveflowとは、必要な試料リザーバサイズに応じて1.5mlエッペンドルフチューブまたは50mlファルコンチューブと共に使用したマイクロ流体リザーバを指す（Elvesys、フランス、パリ、75011、アベニューフィリップオーギュスト83、イノベーションセンター）。ピンチバルブは任意のピンチバルブを指すことができ、一例は電子Clippardピンチバルブ（Clippard、米国オハイオ州45239、シンシナティ、コールレインアベニュー7390）である。流体制御は、ピンチバルブを通して流体を押し出すためにelveflow流体リザーバに定圧を適用することができる流体制御システムによって達成することができる（図23）。分注することができる流体の体積は、適用する圧力の量、バルブを開放しておく時間の長さ、および/または使用する管の直径によって制御することができる。
バルブは、マイクロプロセッサによって制御することができる酸化金属半導体電界効果トランジスター（MOS FET）によって作動させることができる。
（ii）シリンジ-マイクロバルブ
上述のElveflow-ピンチバルブシステムには以下の制約があった。
- elveflow試料リザーバを再充填した場合にシステムの較正が保持されなかった。
- 5μl未満の体積を分注する際の正確度および精度が不十分だった（低体積（＜5μl）の場合、繰り返された分注での相対標準偏差はおよそ9％であった。これらのデータはAvectasにおいて作成されたものであり、図54に要約する）。送達溶液に関する較正データはElveflow-ピンチバルブシステムを使用。
これらの制約に対処するために新しい流体システムを使用した。
これは、Gygerマイクロバルブ（SMLD300、Fritz Gyger AG、スイス、グヴァット（トゥーン）3645、ボドマーシュトラッセ12）などのマイクロバルブ流体システムの使用を伴いうる。このシステムは、Air Mistネブライザーに接続されたマイクロバルブに接続されたシリンジ試料リザーバを祖なる。1μl～100μlの範囲内の体積を送達する場合はこのシステムの方が正確度および精度が高かった。マイクロバルブおよびピンチバルブを使って送達効率を比較すると、送達効率に相違はない（図63A、B）。
（b）空気の流体制御
空気圧は、任意で、ソレノイドバルブによって制御される。
（c）スプレー作動を制御するための電子機器
電子制御されたスプレー作動を可能にするために、時間制御シーケンスの容易な開発が可能になるようにマイクロプロセッサベースの開発ボードを使って、システムを設計した。開発ボードには、マイクロプロセッサ、例えばPIC16F1619を使用した。スプレー作動時間および流体送達時間は、開発ボードのインターフェースソフトウェアによって操作することができる。このマイクロプロセッサ開発ボードは、ネブライザースプレーのパルシングを可能にする。
次に、繰り返し可能な高速PLC技術（プログラマブルロジック制御装置）を活用することで、業界標準とより良く整合し、自動化Solupore（商標）技術（これは超高速プログラマブルロジック制御装置（PLC）技術に基づく）の実証実験として役立つように、このシステムをアップグレードした。試験リグ制御装置は、PLCとGyger制御装置およびこれら2つのハードウェア間で通信するプログラムからなった。ハードウェアにはモメンタリ押しボタンによるオペレーターとの対話がある。
（d）スプレーヘッドのアラインメント
Ari Mistネブライザー並行経路デザインなどのスプレーヘッドは、ネブライザーの先端から偏心したスプレーを生み出す。ゴニオメーターを装着した特注スプレーヘッドホルダーを使って、スプレーヘッドのアラインメントを調節することができる。
T細胞へのmRNAの送達に関する最適パラメータの同定
3種類の超音波ヘッドおよびAri Mistヘッドによるスプレーを特徴決定して最適化するための作業を行った。さまざまなスプレーの特徴を高速度カメラ記録を使って評価した。細胞単層が受けるスプレーの力を力センサー分析によって測定した。いくつかの例では、96ウェルプレートのウェルに送達される体積を、比色アッセイを使って評価した。
最適化研究のために、表示した範囲で以下のパラメータを試験した:
（a）空気圧:0.5～2バール、
（b）送達される体積:1～7μl、
（c）ターゲット区域までのアトマイザーの高さ:26mmおよび31mm、
（d）スプレー作動の長さ:50～900ms、
（e）流速:1～20μl/s、
（f）超音波プローブのパワー:40～80％、
（g）スプレーヘッド:Ari Mist、超音波60kHz、超音波130kHz、超音波180kHz。
EGFP mRNAをペイロードとして使用し、3種類の超音波プローブおよびAri Mistネブライザーを使って、パラメータの組合せのセットを数多く試験した。
パラメータのセットはすべてGFP発現をもたらし、取込みは5％から30％まで変動した。
超音波エミッタのうち、180kHzは、130kHzおよび60kHz超音波ヘッドと比較して、より効果的に、ペイロードをT細胞に送達することがわかった。試験結果は、ペイロードが、およそ15～28％の効率でT細胞にうまく送達され、複数回の繰り返し間の一貫性は高レベルと（±1％）であったことを示した。細胞の健全性は送達後も維持された（相対生存率85％）。
Ari Mist、180kHz超音波、およびMad Nasalスプレーヘッドで得られる取込みおよび再現性を比較した。結果を、Ari Mist、180kHz超音波、およびMad Nasalスプレーヘッドに関する縦断データプロットに表す（それぞれ図24、図25および図26）。縦断データは数週間にわたる送達パラメータの最適化の推移も示している。取込みは180kHz超音波（図25）およびAri Mist（図24）では改良されて20～30％陽性細胞に達したが、細胞をMAD nasalスプレーヘッドを使ってソルポレートした場合には20％未満で上下した（図26）。
超音波ネブライザーまたはBurgenerネブライザーを使用すると（図24、図25）、MAD nasalスプレーヘッド（図26）と比較して、再現性の改良が見られた。取込みの再現性を標準偏差（StDev）によって表した。他のスプレーヘッドを評価する主目的は、1つ実験の複数回の繰り返し内で可能な限り狭い取込みの標準偏差を与えるネブライザーを同定することであった。すべての実験にわたる取込みの標準偏差を平均することによって縦断データを検討したところ、取込みの平均標準偏差は、180kHz超音波スプレーヘッドでは2.4％、Ari Mistでは2.1％であり、一方、MAD nasalでは4.5％であった。どちらの場合もMAD nasalネブライザーより改良されていた。
結果は、Ari Mistおよび180kHz超音波ネブライザーが、同等レベルの送達効率を与え、20～30％のGFP陽性細胞が検出されることを示した。細胞生存率はAri Mistヘッドの方が高かった。さらにまた、このネブライザーは、より小さく、取扱いがより容易であり、稼働させるために動力を供給する必要がない。これらの理由すべてが、ソルポレーション用のスプレーヘッドとしてのネブライザー、例えばAri Mistネブライザーの選択、および例えば表4.1に示すように、mRNA送達について評価した最適送達パラメータに寄与した。このパラメータのセットは幅広いスクリーニングの結果であり、mRNA送達をさらに改良するために体積、スプレーの距離および長さに加えて、送達溶液の構成成分、細胞数、およびフィルタープレートなどといった他のパラメータを微調整する、洗練された最適化のさらなる研究の開始点になった。表4.1は、試験したパラメータおよび範囲の一覧を示し、T細胞へのmRNA（例えばモデルカーゴGFP mRNA）の送達にとって好ましいパラメータを含む。表4.1には、ベンチトップFlexi（ベンチトップ）システムとMidi（スケールアップ）システムの両方について、試験した範囲および好ましいパラメータが含まれている。
細胞に送達溶液を適用するための工程の最適化
アトマイザー高さ
ヒト初代T細胞におけるmRNAの取込み効率および発現を増大させるために、いくつかのパラメータを評価した。T細胞へのGFP mRNAの送達に対する効果が存在するかどうかを観察するために、AriMistアトマイザーの高さを評価した。96ウェルフィルタープレート（Pall;Supor, 1.2μm;カタログ番号8039）にウェル1個あたり1×106個のヒト初代T細胞を播種した。プレートを300×gで5分間遠心分離し、0.57μg/μlのGFP mRNAを含有する4μlの送達溶液を細胞単層にスプレーした。アトマイザー高さを、ウェルの底から31、26、および11mm上で評価した（別の実験では26mmと12mmの比較を評価した）。2分間のインキュベーション後に停止溶液（50μl）を適用し、30秒後に通常培地（100μl）を適用した。細胞を加湿インキュベータ中、37℃および5％CO2で一晩インキュベートし、フローサイトメトリーによってGFP蛍光について評価した。アトマイザーをウェルの底から31mm上および26mm上に設置した場合に、T細胞によるmRNAの取込みが達成された。送達された4μlの一部がウェルに入らない場合もあった。ウェルの底から12mm上という好ましい高さを選んだ（図27A、B）。これによって、ペイロードの正確な投与が可能になり、他のウェルを汚染するスプレーしぶき（overspray）が防止された。高さの低減は送達される体積の低減も可能にした。高さの範囲は、ウェルの底（フィルター）から11mm上～31mm上である。
送達される体積
T細胞によるmRNAの取込みを最大にしうる最適な送達される体積を決定するために、体積の比較に着手した。96ウェルフィルタープレート（Pall;Supor, 1.2μm;カタログ番号8039）にウェル1個あたり1×106個のヒト初代T細胞を播種した。プレートを300×gで5分間遠心分離し、0.57μg/μlのGFP mRNAを含有する4、1または0.5μlの送達溶液を細胞単層にスプレーした。2分間のインキュベーション後に停止溶液（50μl）を適用し、30秒後に通常培地（100μl）を適用した。細胞を加湿インキュベータ中、37℃および5％CO2で一晩インキュベートし、フローサイトメトリーによってGFP蛍光について評価した。ウェル1個あたり1μlという最適体積が決定された（図28）。Solupore試験リグシステムでは、ElveFlowに適用される圧力を変化させることによって、またはバルブを開放しておく持続時間によって、スプレーされる体積を調節することができる。第1の条件では、バルブ開放の持続時間を280ms、圧力を70mBarに設定した。第2の条件では、バルブ開放時間を140msに低減し、圧力を140mBarに設定した。最適な方法は、バルブ開放時間を140msに低減することであった。
送達溶液の張性
先の実験では細胞と比較して低張である送達溶液を使用した。KClのさらなる添加によって張性を変化させた送達溶液の評価を行った。96ウェルフィルタープレート（Pall;Supor, 1.2μm;カタログ番号8039）に、ウェル1個あたり1×106個で、ヒト初代T細胞を播種した。プレートを300×gで5分間遠心分離し、0.57μg/μlのGFP mRNAを含有する4μlの送達溶液を細胞単層にスプレーした。第1の条件では送達溶液が、細胞に対して低張な溶液をもたらす12.5mMのKClを含有した。第2の条件は、細胞の細胞質に等張な溶液をもたらす106mMのKClを含有した。10mMと500mMの間にある他の濃度、例えば12.5mMのKCl、328mMおよび500mMのKClも試験した。高い張性、328mMおよび500mMのKClでは、レベルの低下したGFP発現が示された。したがって有用な範囲は12.5～500mM、例えば50～150mM、例えば100～125mM、例えば100～110mMであり、106mMは好ましいKCl濃度である。
細胞がスプレーされたら、2分間のインキュベーション後に停止溶液（50μl）を適用し、30秒後に通常培地（100μl）を適用した。細胞を加湿インキュベータ中、37℃および5％CO2で一晩インキュベートし、フローサイトメトリーによってGFP蛍光について評価した。細胞と等張である106mM KClという最適濃度が決定された（図29）。
複数回「ヒット」
Solupore技術の温和な性質ゆえに、細胞の生存率または機能性の下落を伴うことなく、細胞を何度も処理することができる。例えば1回ヒット、2回ヒット、および3回ヒット戦略で、好ましい「ヒット」（処理）数の評価に着手した。96ウェルフィルタープレート（Pall;PES, 1.2μm）に、ウェル1個あたり1×106個の細胞で、ヒト初代T細胞を播種した。プレートを300×gで5分間遠心分離し、0.57μg/μlのGFP mRNAを含有する1μlの送達溶液を細胞単層にスプレーした。細胞がスプレーされたら、2分間のインキュベーション後に停止溶液（50μl）を適用し、30秒後に通常培地（100μl）を適用した。2回ヒット戦略の場合、スプレープロセスを繰り返す前に細胞を2時間インキュベートし、3回ヒット戦略では、2時間のインキュベーション後にさらに1回繰り返した。各追加ヒットの前および2時間インキュベーションの最後に、細胞懸濁液が入っているウェルを、フィルム（例えばParafilm M）を使ってシールし、プレートをボルテックスミキサーなどの撹拌機の上に設置し、15秒間保持した。次に細胞懸濁液をピペットで3回混合した。ボルテックスの振動と混合により、次のヒットの前に細胞の配向を「シャッフル」することが可能になった。細胞を加湿インキュベータ中、37℃および5％CO2で一晩インキュベートし、フローサイトメトリーによってGFP蛍光について評価した。取込み、生存率および細胞収率に着眼すると、3回ヒット戦略が最適であると考えられた（図30）。
細胞播種密度
Agilent PCTEプレートを使って最適なT細胞播種密度の評価に着手した。96ウェルフィルタープレート（Agilent;PCTE、0.4μm）に、ウェル1個あたり1.25、2.5、3.5、5、および7.5×105個の細胞で、ヒト初代T細胞を播種した。350×gで2分間プレートを遠心分離し、0.57μg/μlのmRNAを含有する1μlの送達溶液を細胞単層にスプレーした。細胞がスプレーされたら、2分間のインキュベーション後に停止溶液（50μl）を適用し、30秒後に通常培地（100μl）を適用した。細胞を2時間インキュベートしてから、このプロセスを繰り返した。このスプレーの最後に、加湿インキュベータ中、37℃および5％CO2で、細胞を一晩インキュベートし、フローサイトメトリーによってGFP蛍光について評価した。3.5×105個の細胞の播種密度が最適であることが示された（図31）。Dynabead活性化後の平均T細胞サイズは約9.5μm（70.9μm2;図32）である。播種密度を確認するために、活性化T細胞の平均直径とフィルターウェルのアドレス指定可能区域の面積（19.6mm2）とに基づく密度を算出した。この計算から、フィルター上で単層を形成する細胞の数はおよそ2.77×105個である。
マスキング
ウェルの辺縁付近に陰性細胞の領域が存在することは、以前に気付いていた。この辺縁効果が存在する理由は、不十分なスプレーターゲティング、メニスカスによる辺縁付近での体積の増加、または辺縁における効果的でない小滴衝突、辺縁における圧力撹乱のいずれか（または組合せ）であることが考えられる。辺縁効果を克服するための戦略は、播種中は存在し遠心分離後に除去されて、細胞がウェル辺縁近くに播種されることを防止する、播種マスクを生成すると考えられる。この理論を検証するために、ウェルの直径を5.2mmから4mmに低減するマスクをPCTEプレートウェル中に設置した。2.5×105個の細胞のヒトT細胞をマスク内に播種し、対照として3.5×105個の細胞をマスクなしのウェル内に播種した。プレートを350×gで2分間遠心分離し、細胞をスプレー処理する前にマスクを除去した。これは、ウェルの壁から最大約0.5mmまでにのみ、細胞が播種されたことを意味する。0.57μg/μlのGFP mRNAを含有する送達溶液を、1回ヒット戦略を使って細胞にスプレーした。このプロセスの最後に、加湿インキュベータ中、37℃および5％CO2で、細胞を一晩インキュベートし、フローサイトメトリーによってGFP蛍光について評価した。結果は、マスクしたウェルからの試料は67.7％の取込みを与えるが、マスクなしの試料は53.1％の取込みを与えることを示した。これは、辺縁効果があること、そして播種用にマスクを存在させることによって、それが打ち消されることを示唆している（図60A、B）。したがって、任意で、細胞がウェルの辺縁まで播種されることを防止することにより、トランスフェクション効率の増大がもたらされる。
力
スプレーから発揮される力と取込みとの間の相関関係を調べるために、異なる高さおよび圧力で力センサー分析を行って、結果のベースラインを確立した。アトマイザーを通して空気を押し出す圧力を0.5～2バールに調節し、力センサーを使って、ウェルの底が受ける力を測定した。高さも31、26、および11mmに調節した。その結果、空気圧はスプレーが発揮する力に影響を及ぼす唯一最大の因子であり、11mmという低い高さでは力の小さな下落が起きることが示された。11mmで2.0バールの力の場合、それと同じ力は、それより大きな高さおよび1.65バールの通常圧でも生じる（図55）。この実験を繰り返して、スプレーが発揮する力に影響を及ぼす因子のさらに堅牢な分析とした。ここでも、空気圧は、スプレーが発揮する力にとって最大の要因であった（図56）。低圧の場合、異なる高さでの力の体験は無視できるほどになり、1.15バール、高さ11、26、および31mmでの力は区別できない。2.15バールの場合、高さ26mmおよび31mmでの力は、11mmでの力より大きかった。これは、力＝質量×加速度により、高圧では高さが高い方が、雰囲気からより多くの空気をスプレー経路中に引きずりこみ、それゆえにスプレーの質量が増加するという事実で説明することができる。次に、図4.11と同じパラメータを試験して、力プロファイルをCD3＋T細胞におけるGFP mRNAの取込みと相関させた。96ウェルフィルタープレート（Pall;Supor, 1.2μm;カタログ番号8039）にウェル1個あたり1×106個のヒト初代T細胞を播種した。プレートを300×gで5分間遠心分離し、0.57μg/μlのGFP mRNAを含有する4、2、1または0.67μlの送達溶液を細胞単層にスプレーした。2分間のインキュベーション後に停止溶液（50μl）を適用し、30秒後に通常培地（100μl）を適用した。細胞を加湿インキュベータ中、37℃および5％CO2で一晩インキュベートし、フローサイトメトリーによってGFP蛍光について評価した。GFP発現結果は、GFP mRNA取込みが、送達体積、距離、および空気圧の異なる幅広い条件下で達成されうることを示した（図57）。スプレーから受ける力は取込みと直接的には相関しない。取込みを達成するのに必要な最小の力と、生存率の低下が見られない最大の力とが存在しうるが、この範囲は広い（1～2バール）。
非接着細胞、例えば初代ヒトT細胞などのT細胞へのmRNAの送達に適した条件の範囲を、以下に要約する。
Figure 0007465090000004
T細胞にmRNAを送達するための好ましい、例えば最適な、条件を表4.1に略述する。
（表４．１）経時的なT細胞へのmRNA送達のための条件
Figure 0007465090000005
トランスフェクションの比較
エレクトロポレーションと比較した送達および生存率 - エレクトロポレーションは広く使用されているベクターフリー細胞内送達の方法である。そこで、本主題の送達方法を使った送達効率および細胞生存率のレベルをエレクトロポレーションと比較した。
本主題の技術を使って3μMのモデルペイロード10kDaデキストラン-Alexa488をA549細胞に送達した場合、送達効率は、エレクトロポレーションの92.9％（±0.6％）と比較して、52.8％（±2.7％）であった（図33A、B、C）。送達プロセスに耐えて生き残った細胞の百分率をヨウ化プロピジウム排除法およびフローサイトメトリー分析によって分析した。本主題の技術の場合、無処理対照細胞と比較した細胞の生存率は、エレクトロポレーションの73.0％（±9.8％）と比較して、78.3％（±4.1％）であった（図33A、B、C）。
大半の送達方法では、効果的な送達と細胞生存率の維持との間でバランスをとらなければならない。このバランスを調べるために、トランスフェクションスコア（（トランスフェクトされた細胞/総細胞数）×（生細胞/総細胞数））を使って、エレクトロポレーションと比較した本主題の送達技術について、細胞損失、細胞生存率、およびトランスフェクション効率の集成的特徴を得た。1.0というスコアは、100％のトランスフェクション効率および100％の細胞生存率を示し、この手法の間に細胞が失われないことを示す。トランスフェクションスコアは、本主題の技術の場合は0.33（±0.05）、エレクトロポレーションの場合は0.51（±0.13）であり、スコア間に有意差はなかった（図33C）。
本技術をベンチマーク試験するために、ヒトT細胞へのmRNAのSolupore送達およびヌクレオフェクション（4D;Lonza）送達の比較に着手した。細胞1個あたりのmRNAの送達量（μg）を一致させた。ソルポレーションの場合、96ウェルフィルタープレート（Pall;PES、1.2μm）に、ウェル1個あたり1×106個の細胞で、ヒト初代T細胞を播種した。プレートを300×gで5分間遠心分離し、0.57μg/μlのGFP mRNAを含有する1μlの送達溶液を細胞単層にスプレーした。細胞がスプレーされたら、2分間のインキュベーション後に停止溶液（50μl）を適用し、30秒後に通常培地（100μl）を適用した。細胞を加湿インキュベータ中、37℃および5％CO2で一晩インキュベートし、フローサイトメトリーによってGFP蛍光について評価した。ヌクレオフェクションの場合、5×106個のヒト初代T細胞をPBS中で洗浄し、2μgのGFP mRNA（Lonza）を含有する40μlのP3緩衝液に再懸濁した。次に、細胞をヌクレオキュベットストリップに加え、説明書に従ってヌクレオフェクトした。各ウェルに100μlの培地を加え、10mlの培地が入っている回復フラスコに移した。細胞を加湿インキュベータ中、37℃および5％CO2で一晩インキュベートし、フローサイトメトリーによってGFP蛍光について評価した。GFP mRNA発現レベルは、それぞれ40.3％および89.3％であった（図34）。5回の実験および2人のドナーからの平均メジアン蛍光強度は、それぞれ203,059および113,895であった（図35A、B、C、D）。各技術によって送達されるmRNAの用量応答を図36に示す。
エンドサイトーシス非依存的
細胞中へのカーゴの拡散および形質膜の再シール形成。広範なカーゴを一連の細胞タイプに送達するこの方法の能力が実証されたので、細胞中へのカーゴ取込みの機序および細胞透過性の反転を調べた。他の送達技法の制約は、それらがエンドサイトーシスなどの能動的取込み経路に依存し、それが、カーゴを細胞における機能には用いることができないようにするカーゴの隔離につながりうることである。例えば、リポソーム媒介送達はクラスリン媒介エンドサイトーシスとカベオラ媒介エンドサイトーシスをどちらも必要とし（Cui S, Wang B, Zhao Y, Chen H, Ding H, Zhi D, et al. Transmembrane routes of cationic liposome-mediated gene delivery using human throat epidermis cancer cells. Biotechnol Lett.2014;36（1）:1-7.doi:10.1007/s10529-013-1325-0.PubMed PMID:24068499;PubMed Central PMCID:PMCPMC3889874）、一方、iTOP送達はマクロ飲作用を必要とする（D'Astolfo DS, Pagliero RJ, Pras A, Karthaus WR, Clevers H, Prasad V, et al. Efficient intracellular delivery of native proteins.Cell.2015;161（3）:674-90. doi:10.1016/j.cell.2015.03.028.PubMed PMID:25910214.）。
ソルポレーションを使った実験の間、細胞へのカードの即時取込みが観察された。10kDaデキストラン-FITCをモデルカーゴとして使用すると、停止溶液を加える前に、送達溶液の適用から30秒以内で、カーゴを細胞内に見ることができた（図37A、B、C、C）。細胞へのカーゴの迅速な流入は、その送達にエンドサイトーシスが関与する可能性は低いことを示す。一連の細胞タイプへの広範な分子種の負荷を示す結果は、細胞膜を通る拡散機序が細胞への高分子の侵入機序であることを示している。能動的経路およびエンドサイトーシス小胞への内在化などといった代替取込み機序の寄与を調べる目的で、A549細胞を、クラスリン媒介エンドサイトーシスを阻害するためにDynasore（4mM）またはクロロプロマジン（chloropromazine）（20μM）で前処理するか、カベオラ媒介エンドサイトーシスおよび微飲作用をそれぞれ阻害するためにナイスタチン（20μg/ml）またはEIPA（100μM）で前処理した。EGFP mRNAの発現はこれらの阻害因子の存在下でも不変であったことから、この方法は細胞の細胞質中への直接送達をもたらすこと、そしてエンドサイトーシスに依拠しないことが示された（図37C）。さらにまた、D'Astolfoらが報告した手法（D'Astolfo et al. 2015）に従うことに加えて、クラスリン媒介エンドサイトーシスのDynasore媒介阻害を確認するために、Lipofectamine 2000を陽性対照として含めた（図37C）。
本送達方法は細胞に対して極めて温和であり、目に見える細胞死または細胞損傷は、仮にあったとしても、ごくわずかであることがわかった。本方法では、透過処理された形質膜が迅速に再シール形成することが可能であるため、高レベルの細胞生存率が保たれる。透過処理後の細胞膜の回復速度を調べるために、送達溶液をカーゴなしでA549細胞に適用した。後続の時点（0～182.5分）において、この送達溶液を除去し、ヨウ化プロピジウム（PI）を含有するPBS 50μl（100μg/ml）を加えた。2分間のインキュベーション後に、PI溶液を取り除き、細胞を収穫した。PI取込みをフローサイトメトリーによって分析した。PI取込みの基礎レベルについては、無処理細胞にPBS中のPI 50μlを与えた。結果は、細胞が数分間はPIに対する透過性を保つが、処理後6分かけて再シール形成することを示している（図37C）。6分後はさらなる取込みがない。このように、細胞には送達溶液への曝露から2分以内に負荷が起こるだけでなく、膜は、この手法の開始から6分以内に効果的にその完全性を回復した。これらのデータは、ソルポレーションを使った作用物質の送達にエンドサイトーシスが関与しないことを示している。
T細胞における遺伝子編集
カーゴを送達した後のT細胞のさらなる機能的出力を実証するために、CRISPR/Cas9 RNP送達を使ってT細胞の遺伝子編集を評価した。
CRISPR/Cas9 RNP送達。PD-1タンパク質をコードするPDCD1遺伝子
Figure 0007465090000006
をノックダウンするために2ガイドRNA戦略を使用した。
Figure 0007465090000007
（PD1-1タンパク質アミノ酸配列、SEQ ID NO:2）。等モル量のcrisprRNA（同様に等モル量の
Figure 0007465090000008
crisprRNAと
Figure 0007465090000009
crisprRNAとの混合物（Su, S.et al. CRISPR-Cas9 mediated efficient PD-1 disruption on human primary T cells from cancer patients. Sci.Rep.6, 20070;doi:10.1038/srep20070（2016）））とtracrRNAとを、室温で10分間インキュベートした。次に、Cas9対ガイドRNAの最終モル比が1:3になるように5μgのCas9（IDT）を加え、室温でさらに10分間インキュベートした。Cas9 RNP（緩衝液中、α-クリスタリン（220μM）およびエタノール（25％v/v）を含む）を、記載のベクターフリー細胞内送達方法を使ってT細胞に送達した。本明細書に記載のベクターフリー送達方法を使って、処理1回あたり1.5×106個の細胞にRNPを送達し、トランスフェクションの72時間後にPD-1発現を分析した。
細胞生存率。FACS試料の調製および分析:ベクターフリー細胞内送達方法後の細胞生存率を、7-AAD生存率染色溶液（Sigma）を使って評価した。細胞をPBS＋1％ウシ胎児血清（FACS緩衝液）中で洗浄してから、7-AADと共にインキュベートし（1:40、遮光下、室温で5～10分）、次にPBS＋1％FBS（FACS緩衝液）に再懸濁した。APCコンジュゲート抗ヒトCD279（PD-1）（Biolegend）を使ってPD-1ラベリングを行い、BD Accuri C6フローサイトメーター（Becton Dickinson、米国）で処理した。C6ソフトウェアを使ってデータを解析した。前方散乱パラメータおよび側方散乱パラメータを使って細胞デブリを全細胞から排除した。FSC高さ対FSC面積のプロットでダブレットを排除することによって単一細胞を選択した。ゲーティングされた生細胞でGFP発現を分析した。
CRISPR/Cas9 RNPのベクターフリー送達後のT細胞におけるPD-1などの免疫チェックポイント遺伝子発現のノックダウン
PDCD1遺伝子を標的とするCRISPR/Cas9 RNPを、本明細書に記載のベクターフリー細胞内送達方法またはエレクトロポレーションによって、T細胞に送達した。トランスフェクションの72時間後にフローサイトメトリーによってPD-1発現を分析した。
活性化T細胞へのCRISPR/Cas9遺伝子編集ツールの送達は、本明細書に記載のベクターフリー細胞内送達では、PD-1発現に28％の低減をもたらし、一方、エレクトロポレートされた細胞では53％阻害であった（図38A、B）。
遺伝子編集された細胞の増殖能を、培養におけるT細胞凝集の形成を観察することにより、4日間にわたって評価した。RNPの送達後に細胞を培養に戻した。4日後に顕微鏡を使って細胞を観察した。ベクターフリー細胞内方法でトランスフェクトされた細胞における細胞凝集は無処理対照活性化細胞の場合と類似していたことから、それらは記載のベクターフリー細胞内送達方法による影響を受けないことが示された。対照的に、エレクトロポレートされた細胞の増殖速度は、細胞凝集が有意に少ないことによって示されるとおり、有意に影響を受けた（図39）。
CAR-T:mRNA送達後の初代T細胞におけるキメラ抗原受容体（CAR）の発現
市販のCD19 CARプラスミドから生成されたmRNAは、ヒト由来活性化T細胞にうまく送達された。CARの表面発現がフローサイトメトリーによって検出され、集団の最大50％がCAR発現に関して陽性であった。
材料および方法
細胞培養。Leuko Pak（AllCells、カリフォルニア州アラメダ）から、パーコール勾配での遠心分離によって、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を回収した。CD3マイクロビーズ（Miltenyi）を用いる磁気活性化細胞選別によってCD3＋富化リンパ球を単離した。10％ジメチルスルホキシド（DMSO）およびウシ胎児血清（FBS）中で細胞を凍結保存した。保存アリコートからの初回融解後に、CD3＋T細胞を、37℃および5％CO2の加湿組織培養インキュベータにおいて、ヒト組換えインターロイキン-2（IL-2）中で培養すると共に、さまざまなプロトコール（下記参照）を使った一次刺激および共刺激抗体活性化を行った。
CD19 CARプラスミドの構築
CD19 CARプラスミドは市販品を入手し（Creative Biolabs、米国ニューヨーク州）、そのプラスミドからmRNAを生成した。キメラ抗原受容体（CAR）の全長を合成し、レンチウイルスベクターにサブクローニングした。サンガーシークエンシングによってインサートを確認した。CARベクターの構造を図86に図解する。scFv（抗CD19 scFv VL-リンカー-VH）のアミノ酸配列を図87Aに図示する。CARカセットのヌクレオチド配列（コドンを最適化）を図87Bに図示する。CARカセットのアミノ酸配列を図87Cに図示する。制限消化地図を図88に図示する。ベクターデザインの品質管理結果を図89に図示する。CAR配列アラインメントバリデーションを図90に図示する。配列アラインメント結果は、構築されたプラスミドの配列がデザインと合致していることを示した。
CAR mRNA送達
4μgのmRNA（上述のCD19 CARプラスミドから）を緩衝液に加え、エタノール（27％v/v）も加え、本明細書に記載の技術を使って1.5×106個のT細胞に送達した。24時間後に細胞を収穫し、フローサイトメトリーを使ってmRNA発現について分析した。
フローサイトメトリー
ビオチン化プロテインL（AcroBiosystems）をリン酸緩衝食塩水（PBS）に1mg/mlで再構成した。FACS染色のために、1×106個の細胞を収穫し、4％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有する氷冷PBSの洗浄緩衝液で3回洗浄した。洗浄後に細胞を0.2mlの洗浄緩衝液に再懸濁し、1μgのプロテインLと共に4℃で45分間インキュベートした。細胞をさらに3回洗浄してから、暗所で、0.2mlの洗浄緩衝液中、10μlのPEコンジュゲートストレプトアビジンと共にインキュベートした。本明細書に記載のベクターフリー送達方法後の細胞生存率を評価するために、7-AAD（Sigma）を使って細胞を染色した。簡単に述べると、細胞をPBS＋1％ウシ胎児血清（FACS緩衝液）中で洗浄してから、7-AADと共にインキュベートし（1:40、遮光下、室温で5～10分）、次にPBS＋1％FBS（FACS緩衝液）に再懸濁した。試料をBD Accuri C6フローサイトメーター（Becton Dickinson、米国）で処理し、C6ソフトウェアを使ってデータを分析した。前方散乱パラメータおよび側方散乱パラメータを使って細胞デブリを全細胞から排除した。FSC高さ対FSC面積のプロットでダブレットを排除することによって単一細胞を選択した。ゲーティングされた生細胞でCAR-T発現を分析した。
非トランスフェクト細胞を無処理対照（UT）として使用した。処理細胞の場合、本送達方法を使って観察された蛍光強度のシフトは、mRNA送達後のCAR発現を示した（図45）。
ソルポレーション後のT細胞の機能性の評価
Solupore技術を使ってトランスフェクトされたT細胞の機能性が、例えばNeonエレクトロポレーターによるエレクトロポレーションおよび例えばLonza 4Dヌクレオフェクターを用いるヌクレオフェクションを使ってトランスフェクトされた細胞と同等またはそれ以上であることを実証するために、細胞膜タンパク質発現、遺伝子発現、細胞増殖速度、インビトロ機能性、およびインビボ機能性のアッセイを行った。
（i）T細胞膜タンパク質発現分析
この研究の目的は、T細胞における細胞表面タンパク質の発現がソルポレーションプロセスによって影響を受けるかどうかを判定すること、ならびにエレクトロポレーションおよびヌクレオフェクションと比較することであった。
方法:96ウェルフィルタープレート（Acroprep、1.2μm Suporメンブレン;Pall、米国）に、ウェル1個あたり1.5×106個の細胞で、活性化T細胞を播種した。培地を300×gで5分間の遠心分離によってウェルから除去した。次に、4μgのGFP mRNAを含有する7μlの送達溶液（モレキュラーグレード水中の、32mMのスクロース、12mMの塩化カリウム、12mMの酢酸アンモニウム、5mMのHEPES、および27％のエタノール（いずれもSigma-Aldrich製））を、各ウェル中に、ベクターフリー送達スプレー機器を使ってスプレーした。送達後に、細胞をこの溶液中で2分間インキュベートしてから、50μlの停止溶液（0.5×PBS）を加えた。30秒後にT細胞培地を加え（100μl）、細胞を37℃および5％CO2で一晩回復させた。エレクトロポレーションおよびヌクレオフェクションの場合は、トランスフェクション1回あたり5×106個および2.5×106個の細胞をそれぞれ使用した。送達の6時間後および24時間後にGFP発現および生存率を評価した。
ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、またはソルポレーションのいずれか1つの6時間後および24時間後に細胞表面CD4およびCD8の発現を調べた。トランスフェクションの6時間後に、CD4およびCD8を発現するT細胞のパーセンテージは、各トランスフェクション方法について、無処理対照細胞と比較して変化していなかった。しかし24時間では、エレクトロポレートされた細胞において発現が有意に低減したのに対し、ソルポレートされた細胞およびヌクレオフェクトされた細胞における発現は対照無処理細胞と類似していた（図47A、B）。
（ii）グローバルmRNA発現分析
この研究の目的は、ソルポレーションプロセスによって誘発される細胞摂動の分子シグネチャーを得ること、ならびにそのシグネチャーをエレクトロポレーションおよびヌクレオフェクションと比較することであった。mRNAマイクロアレイを使って16試料を分析した。2種類のドナーT細胞を採取し、試料には、6時間時点および24時間時点における、無処理対照と、GFP-mRNAによるneon、ヌクレオフェクター、およびSoluporeでトランスフェクトされた細胞とを含めた。
方法:96ウェルフィルタープレート（1.2μm PESメンブレン;Pall、米国）に、ウェル1個あたり1.5×106個の細胞で、活性化T細胞を播種した。培地を300×gで5分間の遠心分離によってウェルから除去した。次に、0.2μgのGFP mRNAを含有する1μlの送達溶液（モレキュラーグレード水中の、32mMのスクロース、12mMの塩化カリウム、12mMの酢酸アンモニウム、5mMのHEPES、および27％のエタノール（いずれもSigma-Aldrich製））を、各ウェル中に、ベクターフリー送達スプレー機器を使ってスプレーした。スプレー後に、細胞をこの溶液中で2分間インキュベートしてから、50μlの停止溶液（0.5×PBS）を加えた。30秒後にT細胞培地を加えた（100μl）。1回目のスプレーの2時間後に2回目のスプレーを実行した。細胞を37℃および5％CO2のインキュベータに移した。エレクトロポレーションおよびヌクレオフェクションの場合は、トランスフェクション1回あたり5×106個および2.5×106個の細胞をそれぞれ使用した。送達の6時間後および24時間後にGFP発現および生存率を評価した。
最も高レベルの遺伝子発現変化はNeonエレクトロポレーション処理で起こった。しかしエレクトロポレーションの欠点は、エレクトロポレーション後の処理細胞の生存率および機能性の低減である。分析した20,893個のmRNAのうち、Neonエレクトロポレーションでは、すべての時点（6時間および24時間）および両ドナーにおいて、合わせて計317個が変化しており、Soluporeでは32個が変化しており（表5.1および表5.2）、ヌクレオフェクターでは24個が変化していた（表5.3および表5.4;図48A、B、C）。注目すべきことに、このマイクロアレイ分析に関して疑陽性のバックグラウンドレベルはおよそ10％であった。Soluporeとヌクレオフェクションの場合、変化した遺伝子の数は、この閾よりわずかに高いだけであったことから、Soluporeおよびヌクレオフェクターが引き起こす細胞遺伝子発現に対する摂動のレベルはごくわずかであることが実証された。高レベルの遺伝子発現変化は、Neonエレクトロポレーションプロセスがソルポレーションまたはヌクレオフェクションより多くの摂動を細胞にもたらすことを示している。細胞摂動は望ましくないので、このデータは、Neonエレクトロポレーションがソルポレーションおよびヌクレオフェクションと比較してそれほど望ましいトランスフェクション方法ではないことを示している。ソルポレーションは、エレクトロポレーションおよびヌクレオフェクションと比較して、大きな利点をいくつか伴っている。それらの利点には、処理された細胞の完全性、機能、および増殖能を保った状態での、初代ヒト細胞への例えばmRNAなどのカーゴの高レベルで信頼性の高い送達が含まれる。
（表５．１）トランスフェクションの6時間後における無処理対照細胞と比較したソルポレートされた細胞における遺伝子発現変化の一覧
（数字は無処理対照細胞と比較した変化倍率を示す）
Figure 0007465090000010
このデータは、ソルポレートされた細胞ではトランスフェクションの6時間後に遺伝子発現の変化が少数（例えば無視できる程度）しか起こらないことを示している。
（表５．２）トランスフェクションの24時間後における無処理対照細胞と比較したソルポレートされた細胞における遺伝子発現変化の一覧
数字は無処理対照細胞と比較した変化倍率を示す。
Figure 0007465090000011
このデータは、ソルポレートされた細胞ではトランスフェクションの24時間後に遺伝子発現の変化が少数（例えば無視できる程度）しか起こらないことを示している。
（表５．３）トランスフェクションの6時間後における無処理対照細胞と比較したヌクレオフェクトされた細胞における遺伝子発現変化の一覧
数字は無処理対照細胞と比較した変化倍率を示す。
Figure 0007465090000012
このデータは、ヌクレオフェクトされた細胞ではトランスフェクションの6時間後に遺伝子発現の変化が少数（例えば無視できる程度）しか起こらないことを示している。
（表５．４）トランスフェクションの24時間後における無処理対照細胞と比較したヌクレオフェクトされた細胞における遺伝子発現変化の一覧
数字は無処理対照細胞と比較した変化倍率を示す。
Figure 0007465090000013
このデータは、ヌクレオフェクトされた細胞ではトランスフェクションの24時間後に遺伝子発現の変化が少数（例えば無視できる程度）しか起こらないことを示している。
（iii）細胞増殖分析
治療的適用には、T細胞が改変後に増殖できる必要がある。そこで、ソルポレーション、エレクトロポレーションおよびヌクレオフェクション後のT細胞の増殖能を調べた。凍結保存および融解後の細胞の増殖能も試験した。
方法:96ウェルフィルタープレート（Acroprep、1.2μm Suporメンブレン;Pall、米国）に、ウェル1個あたり1.5×106個の細胞で、活性化T細胞を播種した。次に、0.2μgのGFP mRNAを含有する1μlの送達溶液を各ウェルにスプレーした。2時間後に2回目のスプレーを実行した。エレクトロポレーションおよびヌクレオフェクションの場合は、トランスフェクション1回あたり5×106個および2.5×106個の細胞を使用した。細胞を37℃および5％CO2のインキュベータに移した。翌日、細胞を収穫し、計数した。次に、培地＋IL-2を7日間にわたって毎日追加することにより、0.5×106個/mlで細胞を再播種した。別の実験では、トランスフェクションの24時間後に、細胞を10％DMSOおよびウシ胎児血清中で凍結保存した。細胞を融解し、0日目に、0.5×106個/mlでImmunocult培地＋IL-2に播種した。細胞を計数し、5日にわたって毎日、培地を追加することによって再播種した。
T細胞にトランスフェクションを行い、その後毎日7日間にわたって細胞を計数した。ソルポレートされた細胞およびヌクレオフェクトされた細胞における増殖速度は無処理対照細胞と類似していたが、Neonエレクトロポレートされた細胞の能力は、対照細胞と比較して低減していた（図49）。ソルポレーションでは凍結保存とそれに続く融解後に増殖が影響を受けることはなかった（図50）。これらのデータは、エレクトロポレーションおよび/またはヌクレオフェクションの大きな欠点が細胞増殖の失速であることを示している。Soluporeシステムの大きな利点は、細胞増殖の失速がないことである。
（iv）インターフェロン-γ（IFNg）分泌分析
治療的適用には、T細胞が改変後にIFNgを生産できる必要がある。そこで、ソルポレーション、エレクトロポレーションおよびヌクレオフェクション後のT細胞のIFNg生産能を調べた。2つの異なる活性化方法、ホルボールミリステートアセテート/イオノマイシン（PMA/I）およびDynabeadsを調べた。ソルポレーションに続く凍結保存および融解後にも、細胞のIFN-γ分泌能を試験した。
方法:96ウェルフィルタープレート（Acroprep、1.2μm Suporメンブレン;Pall、米国）に、ウェル1個あたり1.5×106個の細胞で、活性化T細胞を播種した。次に、0.2μgのGFP mRNAを含有する1μlの送達溶液を各ウェルにスプレーした。2時間後に2回目のスプレーを実行した。エレクトロポレーションおよびヌクレオフェクションの場合は、トランスフェクション1回あたり5×106個および2.5×106個の細胞をそれぞれ使用した。細胞を37℃および5％CO2で回復させた。翌日、細胞を収穫し、計数した。次に、培地＋IL-2を7日間にわたって毎日追加することにより、細胞を0.5×106個/mlで再播種し、その後、細胞サイズを監視することにより、細胞を休止状態に戻らせた。これは、初期活性化のおよそ2週間後であった。次に、細胞をDynabeadsまたはPMA/イオノマイシンカクテルのどちらか一方で4時間再刺激し、その後、上清を回収し、サイトカイン分析まで-20℃で保存した。すべての試料でIFN-γ ELISA（Biotechne）を実行した。別の実験では、ソルポレートされた細胞、ヌクレオフェクトされた細胞、およびエレクトロポレートされた細胞をトランスフェクションの24時間後に収穫し、計数した。次に、培地＋IL-2を7日間にわたって毎日追加することにより、0.5×106個/mlで細胞を再播種し、その後、細胞サイズを監視することにより、細胞を休止状態に戻らせた。これは、初期活性化のおよそ2週間後であった。次に、細胞をDynabeadsまたはPMA/イオノマイシンカクテルのどちらか一方で4時間再刺激し、その後、上清を回収し、サイトカイン分析まで-20℃で保存した。すべての試料でIFN-γ ELISA（Biotechne）を実行した。
ソルポレーション、ヌクレオフェクション、またはエレクトロポレーション後のT細胞において、IFNg生産は、対照細胞と比較して低減していなかった（図51）。融解したばかりのソルポレートされた細胞は、無処理対照と比較した場合に、そのIFN-γ分泌能を失っていなかった（図52）。
（v）3kDaデキストランを送達した後のT細胞のインビボ生着
Solupore技術がT細胞の機能性に及ぼす効果を判定するために、NSGマウスモデルにおいてGvHDを誘発するトランスフェクトされたPBMCの能力を研究した。NOD scidγマウス（NSGマウス）は、The Jackson Laboratoryの、当技術分野において承認された免疫不全実験マウス系統である。
トランスフェクトされた細胞がSolupore送達技術によって有害な影響を受けるのであれば、生着して移植片対宿主病（GvHD）を誘発するそれらの能力は損なわれるであろう。ヌクレオフェクションとの比較も実行した。Neonエレクトロポレーションをコンパレータとして含めることは非現実的であった。なぜなら、このプロセスでは細胞の損失が大きいため、エレクトロポレーションに付す必要がある細胞数が実行不可能なほど多くなるからである。
方法:3kDaデキストラン-Alexa488を20×106個および5×106個のPBMCにそれぞれソルポレーションおよびヌクレオフェクションによって送達した。ソルポレーションは44.45mm撹拌式セルシステムを使って実行した。すべての培地が除去されるまで100mbarの圧力を15～25秒間適用することによって、1μm PCTE親水性メンブレン（Sterlitech）上に細胞の単層を形成させた。3μMデキストラン3000を含有する送達溶液5mlを調製し、LP100アトマイザーに充填した。細胞にソルポレーションを行い、1分30秒後に、メンブレンを60mm細胞培養用ペトリ皿に、そっと移した。2分後に、1mlの停止溶液をメンブレンに加え、30秒間インキュベートしておいた後、4mlの培地を細胞に加えた。ペトリ皿を37℃で5％CO2のインキュベータに30分間移した。ヌクレオフェクションの場合は、トランスフェクション1回あたり5×106個の細胞を使用した。細胞を収穫し、1×PBSで2回洗浄し、マウスの体重に応じて、すなわち1グラムあたり1×106個を、再懸濁し、マウスごとの体重に基づいて（1グラムあたり1×106個）、尾静脈から静脈内注射した。マウスを週に2～3回体重測定し、GvHD様症状の出現について監視した。注射の9～12日後に末梢血を収集し、フローサイトメトリー分析用に処理した。また、研究の最後に血液および脾臓を収集し、分析のために調製した。
3人の異なるドナー（D119、D120、D121）からPBMCを単離し、各ドナーからの細胞をソルポレーションまたはヌクレオフェクションに付した。この研究については、1群あたり5匹で4群のNOD scidγ（NSG）マウスであった。各群は、1.細胞なし、2.UT、3.ソルポレーション、4.ヌクレオフェクションであった（4群×マウス5匹p/群×ドナー3人＝マウス60匹）。細胞を0日目にマウスに注射した。動物を毎日監視したところ、細胞を投与されたすべての動物に、注射後14日目までにGvHD症状が存在したことから、細胞は生存可能であり機能的であることが示された。血液試料を14日目にマウスから採取し、CD45発現によって示されるヒトPBMCおよびT細胞サブセットの存在について、フローサイトメトリーによって分析した。結果は、この時点で無処理群およびソルポレート群にはCD45＋細胞が存在することを示したことから、細胞は生存可能であり、機能的であることが確認された（図53A、B、C）。この時点において、ヌクレオフェクトされた細胞には、これより少ない数のCD45＋細胞が検出された。これらのデータは、ソルポレートヒトPBMCがインビボで生存性および機能性を保ち、NSGマウスにおいてGvHDを誘発する能力を有することを示している。これらの結果は、NSGマウスへのソルポレートされた細胞の生着の成功を実証しており、ソルポレーション後にそれらの生存性および機能性が保たれることを示している。
細胞にペイロード組成物を送達するためのフィルターメンブレン条件
透過処理溶液への細胞（非接着細胞または接着細胞）の曝露を容易にし、強化するために、送達前もしくは送達後もしくは送達中またはこれらの並べ替えにおいて、任意で、フィルターメンブレンを振動させる。フィルターメンブレン上での細胞の単層の形成を支援するために、送達前もしくは送達後もしくは送達中またはこれらの並べ替えにおいて、メンブレンは振動することができる。フィルターメンブレンの振動は、すぐに入手できるデバイス、例えばMiniature Triaxial DeltaTron（登録商標）加速度計（Bruel and Kjaer, www.bksv.comから入手可能）などの圧電型加速度計を使って実行することができる。Precision Microdrives（www.precisionmicrodrives.com）から適切な振動モーターをいくつか入手することもできる。
例えば、振動は、偏心回転質量（ERM）システムまたは線形共振アクチュエータ（LRA）システムによってもたらされうる。好ましくは、X軸、Y軸、およびZ軸に対応する1、2、または3個のアクチュエータ（LRA）を、アクチュエータへの機械的連結によってメンブレンが振動するように、メンブレンまたはメンブレンホルダーに取り付けることができる。
LRAシステムの利点は、各軸が独立して駆動されうることである。したがって、複雑だが制御可能な振動パターンをメンブレンに発生させることができる。加えて、メンブレンの物理的特徴による機械的共振点を同定すれば、メンブレンに対して示されうる制御度が改良されるであろう。メンブレンが起こした偏移をフィードバックするために、3軸加速度計デバイスがフィルターメンブレンまたはホルダーに機械的に連結されるであろう。加速度計システムを、モニタリングに使用すること、または振動システムへの制御フィードバックシグナルとして使用することで、所望の振動パターンと達成された振動パターンの間の誤差信号を生成しうる。駆動振動周波数の選択は、メンブレンの剛性およびメンブレン上の細胞のサイズに基づいてなされる。例示的振動パターンは、x軸上およびy軸上での3000Hzの正弦波信号ならびにz軸上での無信号でもたらされる。偏移はピーク間で1mmであり、x駆動波形とy駆動波形との間に位相差はなく、両者はコヒーレントである。他にも、x、y、および/またはz軸に回旋、振とうをもたらすものなど、多くのパターンが可能である。
哺乳動物細胞にカーゴ分子を送達するためのデバイス
本主題は概して細胞への生物学的ペイロードの送達に関する。細胞への生物学的ペイロードの送達は、細胞の単層への透過処理溶液の微粒化および送達を伴いうる。現在の技法はいくつかの部分で十分でない場合がある。それを以下に詳述する。
ペイロードを与えられる前に、細胞は培養用培地内に沈漬または懸濁された状態でありうる。効果的なペイロード取込みを達成するには、細胞が透過処理溶液に曝露されうるように培養用培地を除去すること、および細胞を単層の形態に組織化することが有益でありうる。現在の技法のいくつかでは、培地が遠心分離によって除去される。この技法は培地の除去には有効であるが、通例、細胞の一様な単層の形成をもたらさない。
細胞の単層への透過処理溶液の適切な分布が保証されるように、細胞を溶液アトマイザーまたは溶液ネブライザーの下に整列させることができる。現在の技法では、一般に手動システムを使って細胞をアトマイザーの下に整列させるが、これはオペレーターによるばらつきを生じやすい。アトマイザー/ネブライザーは、細胞の単層上に透過処理溶液を分注するために使用することができる。しかし、ある特定のアトマイザーがミリリットル量の溶液を分注するように設計されているのに対し、分配体積はマイクロリットル程度であることが好ましく、さらにはその必要さえありうる。加えて、ペイロード送達のためのトランスフェクションプロトコールは、時間が肝心な工程をいくつか伴いうる。現在、流体の取扱いは一般に手作業で制御されているので、本質的に不安定である。
これらの短所ゆえに、データは生来的に一貫性を欠きうる。データの再現性の欠如は、ペイロード送達プロセスのさらなる発展を妨げうる。上述の問題に対処するために、本主題のいくつかの局面は、細胞の健全性を維持しつつ、送達プロセスの一貫性および送達効率を高めることができる送達システムを提供する。
例示的送達システム
図65に、細胞にペイロードを送達するように構成された送達システムの一例8800を示す。送達システム8800は、ウェルを含むプレート8804を受容するように構成された筐体8802を備えうる。送達システム8800は、ウェルに圧力差を適用するように構成された圧力差適用装置8806、微粒化された送達溶液をウェルに送達するように構成された送達溶液適用装置8808、停止溶液をウェルに送達するように構成された停止溶液適用装置8810、および培養用培地をウェルに送達するように構成された培養用培地適用装置8812を備えうる。
一例として、いくつかの態様において、圧力差適用装置8806は、図84および89～91に関して後述するノズルバルブアセンブリ、例えばノズルバルブアセンブリ9310であるか、それを含むことができる。別の一例として、圧力差適用装置8806は、図93～107に関して後述する真空マニホールドアセンブリ、例えば真空マニホールドアセンブリ9008であるか、それを含むことができる。いくつかの態様において、送達溶液適用装置8808は、図85、88、93、および115～118に関して後述するネブライザー9304、9804などのネブライザーであるか、それを含むことができる。いくつかの態様において、停止溶液適用装置8810は、例えば図85、87に関して後述するニードルエミッタ9303などのニードルエミッタであるか、それを含むことができる。別の一例として、いくつかの態様において、培養用培地適用装置8812は、ニードルエミッタ9303であるか、それを含むことができる。
送達システム8800は、制御システム8814、作動システム8816、支持体フレーム8818、ならびに感知および管理システム8820も備えうる。いくつかの態様では、圧力差適用装置8806、送達溶液適用装置8808、停止溶液適用装置8810、および/または培養用培地適用装置8812を、支持フレーム8818に連結することができる。作動システム8816は、支持フレーム8818、筐体8802、および/またはプレート8804に連結することができ、支持フレーム8818、筐体8802、および/またはプレート8804を動かすように構成することができる。別の一例として、作動システム8816は、圧力差適用装置8806、送達溶液適用装置8808、停止溶液適用装置8810、および/または培養用培地適用装置8812に連結して、それらを動かすように構成することができる。例えば支持フレーム8818は、図84～89に関して後述する流体ヘッドモジュール9308であるか、それを含むことができる。作動システムは、図84、85に関して後述するアクチュエータ9319であるか、それらを含むことができる。いくつかの実施形態では、メンブレン（例えばプレートのウェル内に位置するもの）を振動させるために振動システムを含めることができる。
感知および管理システム8820はセンサーおよび/または熱管理システムを含むことができる。一例として、センサーおよび/または熱管理システムは、圧力差適用装置8806、送達溶液適用装置8808、停止溶液適用装置8810、および/または培養用培地適用装置8812に連結することができ、圧力、温度、位置、および流速を測定しかつ/または制御するように構成することができる。
制御システム8814は、少なくとも1つのデータプロセッサを含むことができ、作動システム8816ならびに感知および管理システム8820に電気的に連結することができる。制御システムは作動システム8816ならびに感知および管理システム8820を制御するように構成することができる。一例として、制御システム8814は、図84に関して後述する制御システム9306であるか、それを含むことができる。
例示的真空圧システム
図66に、送達システムの9要素を図解する線図8900を示す。本システムは、アドレス指定可能ウェル真空マニホールドアセンブリ、微粒化、流体制御、送達溶液の温度制御、装着、自動化、およびソフトウェア、エンクロージャ、フィルター、ベースプレートの温度制御を含む。
本送達システムは、細胞へのペイロード送達に関係して変動性を生じる以下の部分に対処することができる:単層形成、微粒化、ペイロード送達の自動化、ならびに溶液および培養容器の温度制御。
データの一貫性およびペイロード送達の送達効率を改良するために、本システムはある特定の公知の変動性発生源をプロセスから取り除く。本システムは、真空を使った培地の除去および細胞の単層の生成、単分散小滴を生成するための透過処理溶液の微粒化、自動化を可能にするための溶液の流体制御、溶液の温度制御、スプレーヘッドおよび温度リザーバの装着、自動化およびソフトウェアデザイン、機器のエンクロージャ、ならびにベースプレートの温度制御に対処することができる。
図67～69に高精度リグシステムの例示的一態様9000を示す。高精度リグシステム9000は、ニードルエミッタ9002、アトマイザー9004、および真空マニホールドシステム9006を含むことができる。真空マニホールドシステム9006は、真空マニホールドアセンブリ9008、並進ステージ9010、バルブ9011（図68～69に示すもの）、およびマニホールド9024を含むことができる。いくつかの態様において、真空マニホールドアセンブリ9008は、連結部材9012を介して並進ステージ9010に連結することができる。いくつかの態様において、バルブ9011はピンチバルブであることができる。真空マニホールドアセンブリ9008は、フィルタープレート9014、ベースプレート9016、およびトッププレート9018（図68～69に示すもの）を含むことができる。図68～69に示すように、フィルタープレートは96ウェルフィルタープレートであることができる。フィルタープレート9014はベースプレート9016の凹部内に着座することができ、トッププレートはフィルタープレート9014上に位置して、フィルタープレート9014を正しい位置に固定するためにベースプレート9016に連結することができる。
ニードルエミッタ9002は、フィルタープレート9014のウェルに、細胞を含有することができる培養用培地を送達するように機能することができる。ベースプレート9016は、その底面から延びる真空継手9020を有することができる。真空継手9020は一般に円柱管の形態をとることができ、フィルタープレート9014の対応ウェルに真空圧を適用することを可能にすることができる。真空圧は、マニホールド9024のポート9024aを介して各バルブ9011に送られ、真空継手9020に送られうる。アトマイザー9004は、透過処理溶液を微粒化して、それをフィルタープレート9014のウェル内の細胞に送達することができる。細胞の単層への透過処理溶液の送達に関係するシステム、デバイス、および方法を、以下にさらに詳しく論じる。
図68～69に示すように、高精度リグシステム9000は、X軸に沿って延びることができるガイドレール9022を含むことができる。いくつかの態様において、並進ステージ9010はガイドレール9022に連結することができ、これにより、真空マニホールドアセンブリ9008をX軸に沿って並進させることが可能になる。これにより、真空マニホールドアセンブリ9008を、他の構成要素、例えばニードルエミッタ9002および/またはアトマイザー9004に対して動かすことが可能になる。
図70～71に真空マニホールドアセンブリ9008の分解組立図を示す。図72～73に、ベースプレート9016のそれぞれ平面図および側面断面図を示す。図70～71に示すように、真空マニホールドアセンブリは、フィルタープレート9014、ベースプレート9016、ガスケット9026、および連結孔9018bを有することができるトッププレート9018を含むことができる。
図70～73を参照して説明すると、ベースプレート9016は、連結孔9016b、9016cの第1のセットおよび第2のセットを含むことができる。連結孔9016bの第1のセットは、ベースプレート9016を、連結孔9016b、9018bを通って延びることができる例えばボルトまたはネジなどの連結部材によって、トッププレート9018に連結することができるように、トッププレート9018中の連結孔9018bと整列することができる。連結部材9012は、連結9016cの第2のセット中に延びることができる連結要素を介してベースプレート9016に連結することができる。
ベースプレート9016は、フィルタープレート9014を受容するまたは着座させることができる第1の凹部9028、ならびにガスケット9026を受容することができる二次凹部9030を含むことができる。二次凹部のそれぞれは、開口部9030bまたは対応する真空継手9020と連結することができる通路を有することができる。
フィルタープレート9014は、非有効開口部（inactive opening）9014cを有するウェルを有することに加えて、有効開口部（active opening）9014bを有するウェルを有することができる。有効開口部9014bは、ベースプレート9016中の開口部9030bの上に位置して、そこに流体連結することができる。言い換えると、フィルタープレート9014のある特定のウェルは有効であり、フィルタープレート9014の他のウェルは非有効であることができる。
ガスケット9026は、フィルタープレート9014中のウェルの有効開口部9014bおよびベースプレート9016中の開口部9030bと整列することができる孔9026bを有することができる。ガスケット9026は、ベースプレート9016とフィルタープレート9014との間にシールを形成するように機能することができ、それによって、ウェルの有効開口部9014bと対応する真空継手9020との間の流体連通を可能にしつつ、各有効開口部9014bを他の有効開口部9014bおよび非有効開口部9014cから隔離することを可能にする。
図74～76にトッププレート9018のさまざまな図を示す。図70～71および9～11に示すように、トッププレート9018は、フィルタープレート9014の一部分を収容することができる凹部9032を含むことができる。真空マニホールドアセンブリ9008を組み立てるときに、ガスケット9026は、ベースプレート9016の二次凹部9030に着座させることができ、フィルタープレート9014は第1の凹部9028内に受容することができ、トッププレートはフィルタープレート9014の上に位置して、上述のようにベースプレート9016に連結することができる。
いくつかの態様では、すべてのウェルが有効であることができるように、フィルタープレート9014のウェルのすべてを、異なるバルブ9011およびマニホールドに連結することができる。
真空を使った培地の除去および細胞単層の生成
真空マニホールドシステム9006は、フィルタープレート9014の1～12個のウェルから培養用培地を除去することができ、合計6つのウェルに一度にアドレスすることができる。図77～78にフィルタープレート9014の平面図を示す。図77において、フィルタープレート9014は、フィルタープレート9014をベースプレート9016の第1の凹部9028内に受容した場合に、ウェルF2、F4、F6、F8、F10、およびF12が有効であることができるような第1の位置にある。フィルタープレート9014は、図78に示すとおり、ウェルC1、C3、C5、C7、C9、およびC11が有効になるように、180°回転させることができる。
上述のとおり、真空圧は、マニホールド9024を介して各バルブ9011に送られ、真空継手9020に送られうる。図79～81に、高精度リグシステム9000の一部分のさまざまな図を示す。図79～81に示すとおり、マニホールドは8つのポート9024aを含むことができ、管9034はマニホールド上の6つのポート9024aから6つのバルブ9011へと延びることができる。管は、各バルブ9011上のポートを、ベースプレート9016に接続された真空継手9020に接続することもできる。真空ライン（図示されていない）を、マニホールド9024上の残り2つの開放ポート9024aのうちの1つに接続して、残りのポート9024aをシールすることができる。
真空マニホールドシステム9006は、浮遊細胞の単層の形成を可能にするために使用することができる。上述のように、ニードルエミッタ9002は、フィルタープレート9014のウェルに、細胞を含有することができる培養用培地を送達することができる。真空圧は、真空ラインを介して8チャネルマニホールドに適用することができる。バルブ9011は個別に開閉することができる。それゆえに、各有効ウェルへのアクセスは個別に制御することができる。バルブ9011を開放した場合、適用される真空圧は、損傷につながりうるずり応力を引き起こすことなく、細胞が懸濁している培養用培地の効果的な除去にとって十分でありうる。抽出された培地は、管9034およびバルブ9011を通り、マニホールド9024を通って、真空ラインが取り付けられたポート9024aの外に出る。このようにして、細胞単層を形成させ、細胞生存率を維持することができる。細胞単層の形成は細胞を損傷することなく達成することができる。
真空マニホールドシステム9006を組み立てて試験した。試験中は細胞を含む培養用培地を96ウェルフィルタープレート9014のウェルに加えた。マニホールド9024を介して真空圧を適用した。ウェルに付随するバルブ9011を開放することによって10バール～100mbarの範囲の真空圧を個々のウェルに適用した。
-100mBar～-75mBarのより高い真空圧では、フィルタープレート9014を取り出したときに培養用培地が「ウィッキング」によってウェルに戻ることがない程、十分遠くまで、ウェルから除去された。
-50～-10mBarのより低い圧力では、培地は、フィルタープレート9014を真空マニホールドアセンブリ9008から取り出した場合に培地の一部が「ウィッキング」によってウェルに戻る程十分ウェルの近くに留まっていた。ウィッキングによってウェルに戻る液体の量はおよそ5～10μlであった。これは、真空マニホールドアセンブリ9008が高精度リグシステム9000の一部である場合には、フィルタープレート9014をマニホールドから取り出す前に、ウェルにスプレーされ、培養用培地が置き換えられるので、問題にならない。
いくつかの態様では、濾紙または他の材料を使って、ウィッキングを防止することができる。例えば、培地がウィッキングによってウェルに戻るのを防止するために、ガスケット9026とベースプレート9016の間に濾紙を設置することができる。
-10mBar程度の低い圧力では、培養用培地は、細胞に対してより温和な、穏やかな制御された速度で除去された。これは細胞の存在下でも細胞の非存在下でも起こった。これは、ウェルからの細胞についての生存率および回収率の向上につながりうる。
試験中にバルブ9011をパルス状にオン-オフしても培養用培地の除去を促進することはないと考えられた。
細胞単層を形成させる方法として遠心分離も調べた。しかしこれは、均等でない細胞層を形成するので、効果的でないことがわかった。図82に、遠心分離後および真空抽出後に観察されたグロージャーム粒子の分布を示す。グロージャーム粒子は含む。上3つの画像は、真空圧を使って培養用培地を除去した場合に得られたグロージャーム粒子の分布を表し、下3つの画像は遠心分離を使って培養用培地を除去した場合に得られたグロージャーム粒子の分布を表す。遠心分離試料は、350×gで5分間遠心分離し、真空圧試料は-800mbarで15秒間減圧した。
図82に示すように、真空圧試料の方がグロージャーム粒子の均等な分布を示し、一方、遠心分離後は、グロージャーム粒子の均等でない三日月形の分布が見られた。
-10mBarでも、真空法および遠心法を用いたmRNA取込みは同等の結果が達成された。GFP MFIは、遠心法と比べて、真空法で調製された試料の方が高いことがわかった（約300,000単位と50,000単位）。これは、より多くのmRNAが陽性細胞に入ったことを示している。
ウェルから培養用培地を抽出するのに必要な時間はおよそ3秒から20秒までの間と推定される。ただし、培養用培地をウェルから除去するのに要する時間の量は、適用する真空圧の量に依存しうる。より多くの作業を行うことで、より低い真空圧で培地を除去するのに必要な時間の長さを調べることができる。
いくつかの実施形態では、残存培地を吐出口から除去するために低い圧力ですべてのウェルから同時に排液することができると考えられる（マニホールド上にプレートなし）。
真空マニホールドシステム9006は、真空圧をフィルタープレート9014の個々のウェルに適用することを可能にする。フィルタープレート9014上の個々のウェルに真空圧を適用することにより、真空圧のより高精度な制御、各ウェルに適用される真空圧のより高い一貫性を達成することができる。既存の真空マニホールドは、96ウェルフィルタープレート全体に真空を適用する。試験中は、低い真空圧が、培養用培地の除去およびウェル内での細胞の均等な単層の生成に有効であった。
例示的陽圧システム
図83に、例示的陽圧送達システムの6要素を図解する線図9200を示す。これらの要素には、微粒化、流体制御、陽圧、モジュール式ヘッド、自動化およびソフトウェア、ならびにエンクロージャが含まれる。
陽圧送達システムは、細胞へのペイロード送達に関係して変動性を生じる以下の部分に対処することができる:単層形成、微粒化、ペイロード送達の自動化、ならびに溶液および培養容器の温度制御。
データの一貫性およびペイロード送達の送達効率を改良するために、本システムはある特定の公知の変動性発生源をプロセスから取り除く。本システムは、陽圧を使った培地の除去および細胞の単層の生成、単分散小滴を生成するための透過処理溶液の微粒化、自動化を可能にするための溶液の流体制御、溶液の温度制御、エミッタ、アトマイザー、ネブライザーおよび温度リザーバの装着、自動化およびソフトウェアデザイン、機器のエンクロージャ、ならびにウェルプレートを保定するように構成されたベースプレートの温度制御に対処することができる。
図84～85に陽圧システムの例示的一態様9300を示す。この陽圧システム9300は、培養用培地を除去するために真空に代わるものとして陽圧を用いる。陽圧は、ウェルプレートのウェルから培養用培地を押し出すための小体積（1μl～100μl）の流体の送達の正確度および精度を高める。陽圧システム9300は、装着アレイ9302、マニホールドアセンブリ9305ならびに作動および制御システム9306を含むことができる。
マニホールドアセンブリ9305は、マニホールドアセンブリ9305の筐体9314から延びることができる、プレートホルダーとも呼ばれるベース9312を含むことができる。ベース9312はフィルタープレート9316を受容するように構成することができる。図解した例に示すように、フィルタープレート9316は96ウェルフィルタープレートであることができる。
装着アレイ9302は、ニードルエミッタ9303、ネブライザー9304および/または陽圧ノズルアセンブリ9310が取り付けられている流体ヘッドモジュール9308を含むことができる。ニードルエミッタ9303は、細胞を含有することができる培養用培地および停止溶液をフィルタープレート9316のウェルに送達するように構成することができる。ネブライザー9304は、透過処理溶液を微粒化し、それをフィルタープレート9316のウェル内の細胞に送達するように構成することができる。陽圧ノズルアセンブリ9310は、ウェルから培養用培地の液体部分を除去し、それによって細胞の単層を生成するために、ウェルフィルタープレート9316のウェルに陽圧を適用するように構成することができる。細胞の単層への透過処理溶液の送達に関係するシステム、デバイス、および方法を以下にさらに詳しく論じる。
いくつかの態様において、陽圧システム9300はガイドレール9318を含むことができる。図解した例において、フィルタープレート9316は不動に保たれ、装着アレイ9302の位置をフィルタープレート9316の位置に対して調節することができる。例えば、装着アレイ9302をガイドレール9318に連結することができ、これにより、装着アレイ9302をガイドレール9318によって定義される軸X2に沿って並進させることを可能にすることができる。例えばアクチュエータ9319は装着アレイ9302をガイドレール9318に沿って動かすことができる。ガイドレール9318は、軸X2に対して垂直であることができる軸Y2に沿って動かすこともできる。アクチュエータ9319は、装着アレイ9302を軸Y2に沿って動かすこともできる。それゆえに、ニードルエミッタ9303、ネブライザー9304および/または陽圧ノズルアセンブリ9310を含む装着アレイ9302は、フィルタープレート9316が筐体9314内に位置する場合に、フィルタープレート9316のウェル上に選択的に位置することができる。
一例として、ユーザーは、フィルタープレート9316をベース9312中に挿入することができ、次にそれを筐体9314内に位置させることができる。フィルタープレート9316は、筐体9314内に受容された後は、不動に保つことができる。フィルタープレート9316は、装着アレイ9302の流体ヘッドモジュール9308に連結されたニードルエミッタ9303、ネブライザー9304および/または陽圧ノズルアセンブリ9310によって選択的にアドレスされうる。図解した例において、装着アレイ9302は6つの流体ヘッドモジュール9308を含む。2つの流体ヘッドモジュール9308はニードルエミッタ9303を含み、3つの流体ヘッドモジュール9308はネブライザー9304を含み、1つの流体ヘッドモジュール9308は陽圧ノズルアセンブリ9310を含む。装着アレイ9302は、ニードルエミッタ9303、ネブライザー9304、および/または陽圧ノズルアセンブリ9310を含む流体ヘッドモジュール9308のそれぞれがフィルタープレート9316上の任意の場所にアドレスすることができるように、軸X2、Y2に沿って動かすことができる。
いくつかの態様において、個々の流体ヘッドモジュール9308のそれぞれは、軸Z2に平行に上下に移動する能力を有することができ、これにより、流体ヘッドモジュール9308の独立した作動が可能になる。いくつかの態様では、流体ヘッドモジュール9308の動きならびにニードルエミッタ9303、ネブライザー9304、および/または陽圧ノズルアセンブリ9310の作動が、独立して制御される。流体ヘッドモジュール9308の1つまたは複数の動き、ならびにそこに取り付けられたニードルエミッタ9303、ネブライザー9304および/または陽圧ノズルアセンブリ9310の作動は、同時に起こりうる。いくつかの実施形態において、流体ヘッドモジュール9308は、それらがフィルタープレート9316に向かって移動するときに、ニードルエミッタ9303、ネブライザー9304、および/または陽圧ノズルアセンブリ9310を作動させる。流体ヘッドモジュール9308は、図84～85に示すように、限定するわけではないがニードルアセンブリ、Ari Mistネブライザーおよび陽圧ノズルアセンブリを含むさまざまな流体分注アセンブリを収容することができる。
作動および制御システム（ACS）9306は少なくとも1つのデータプロセッサを含むことができ、装着アレイ9302および/または流体ヘッドモジュール9308の動きを制御することができる。ACS9306は、流体ヘッドモジュール9308に取り付けられたニードルエミッタ9303、ネブライザー9304、および/または陽圧ノズルアセンブリ9310の作動も制御することができる。例えばACS9306は、ACS9306のデータプロセッサによって解釈されうる命令を有するソフトウェアを含むことができる。データプロセッサは命令を受け取り、命令を処理し、命令を実行することができる。例えばデータプロセッサは、装着アレイ9302の位置を調節するために、および/またはニードルエミッタ9303、ネブライザー9304および/または陽圧ノズルアセンブリ9310を作動させるために、ACS9306のアクチュエータおよび/またはモーターに制御シグナルを送達することができる。
例示的流体ヘッドモジュール
上述のように、流体ヘッドモジュール9308は、さまざまな流体分注アセンブリ（例えばニードルエミッタ9303、ネブライザー9304および/または陽圧ノズルアセンブリ9310）のための装着点となって、それらを装着アレイ9302に連結することができるようにする。流体ヘッドモジュール9308は、分注アセンブリを選択的に作動させることができるように、軸Z2に沿った作動も提供する。
図86に流体ヘッドモジュール9308の拡大図を示す。流体ヘッドモジュール9308はフレーム9350を有することができる。すなわち、フレーム9350を形成する一連の機械処理されたアルミニウム片を含む。例えば、フレーム9350は、ベースプレート9352、バックプレート9354ならびに上側および下側装着要素9356、9358を含むことができる。機械処理されたアルミニウム片は、流体ヘッドモジュール9308の高公差位置決め（high tolerance locating）を可能にすることができる。
流体ヘッドモジュール9308は、ベースプレート9352と上側装着要素9356との間に延びるシャフト9360を含むことができる。シャフト9360は、下側装着要素9358にある開口部を通って延びることができる。例えばボールスプラインなどのガイド9362をシャフト9360に装着して下側装着要素9358に連結することができる。ガイド9362は、軸Z2に沿った流体分注アセンブリ（例えばニードルエミッタ9303、ネブライザー9304および/または陽圧ノズルアセンブリ9310）の上下動を容易にする。例えば、上側および下側装着要素9356、9358の間に位置する空気圧アクチュエータ9364は、下側装着要素9358をシャフト9360に沿って上下に駆動することができる。空気圧アクチュエータ9364は関連空気圧装具ならびに2つの近接センサーを駆動することができる。例えばセンサーはシリンダーの壁に埋め込むことができる。図87、88および89は、それぞれ、ニードルエミッタ9303、ネブライザー9304を含むネブライザーアセンブリ9301、および陽圧ノズルアセンブリ9310が装着された、流体ヘッドモジュール9308を示す。
陽圧を使った培地の除去および細胞単層の生成
上述のように、陽圧ノズルは、培養用培地を除去して細胞の単層を生成するために、ウェルフィルタープレートのウェルに陽圧を適用するように構成することができる。図84～85に示す陽圧システム9300で使用される陽圧ノズルアセンブリ9310の拡大図を、図90～91に示す。図解した例において、ノズルアセンブリ9310は、筐体9322内に位置するチューブ9320から形成されうる内部ルーメンを含む。チューブ9320は、陽圧ノズルアセンブリ9310の第1の端および第2の端9326、9327に隣接する開口部9321、9323を有しうる。いくつかの態様において、筐体9322はチューブ9320に構造的安定性を与えることができる。
図90に示すように、ノズルアセンブリ9310は、チューブ9320の第1の端9326に連結された連結部材9324を含む。連結部材9324は、加圧蒸気（例えば空気）がフィルタープレート9316のウェル9316aに送達されうるように、チューブ9320の第1の端9326に隣接する開口部9321とのシールを形成するように構成することができる。例えば圧縮空気を、コンプレッサーから、連結部材9324の内部ルーメン9325に送達することができる。連結部材9324の内部ルーメン9325は開口部9321を介してチューブ9320のルーメンと流体連通することができ、チューブ9320のルーメンは開口部9323を介してウェル9316aと流体連通することができる。圧縮空気は、チューブ9320内の圧力を増大させ、それによってウェル9316a内の圧力を増大させることができる。したがって陽圧ノズルアセンブリ9310は、圧縮空気の流れおよび圧力を制御する。
図91に示すように、チューブ9320の第2の端9327は、開口部9323に隣接してチューブ9320の外側に位置するシール形成要素9328を含む。シール形成要素9328は、ウェル9316aを包含し、フィルタープレート9316の上面9330とのシールを形成し、それによってウェル9316aを隔離するように構成されている。シール形成要素9328は、ノズルアセンブリ9310の第2の端9327とフィルタープレート9316の上面9330との間で空気が洩れるのを防ぎ、それによってウェル9316a内の圧力の制御の正確度および精度を改良するように構成されている。例えば、ノズルアセンブリ9310をフィルタープレート9316と係合させると、圧縮空気の適用により、液体は、個々のウェルのフィルターベース9332を通って流れることになる。
いくつかの態様において、陽圧ノズルアセンブリは、その長さに沿って位置するバルブを含むことができる。バルブは、フィルタープレートのウェルに送達される空気の圧力を制御するための手動制御として機能することができる。図92に、バルブ9432を含むノズルアセンブリ9410の一部分の一例を示す。図解した例において、ノズルアセンブリ9410は、バルブ9432に連結された第1のチューブ部分9420aおよび第2のチューブ部分9420bを含む。第2のチューブ部分9420bは、第2のチューブ部分9420bの遠位開口部9423に隣接して位置するシール形成要素を含むことができる。このノズルは、概して、図90～91に関して上述したノズルアセンブリ9310と同様に機能することができる。例えば第2のチューブ部分の遠位端は、シール形成要素9428がウェルの開口部を包含して、フィルタープレートの上面とのシールを形成するように、フィルタープレートの上面に隣接して位置することができる。第1のチューブ部分9420aの内部ルーメンに圧縮空気を送達することができる。バルブが開放位置にある場合、空気はバルブ9432を通り抜けて第2のチューブ部分9420bを経由してフィルタープレートのウェル中に至ることができる。あるいは、ウェルへの気流を防止するために、バルブ9432をオフ位置に調節することもできる。ウェル内の空気圧を制御するためにバルブ9432を調節することができる。
単分散小滴を生成するための送達溶液の微粒化
図93に、流体ヘッドモジュール9308に連結することができるネブライザーアセンブリ9301の拡大図を示す。図解した例において、ネブライザーアセンブリ9301は、シリンジ9366、マイクロバルブ9368およびネブライザー9304を含む。ネブライザー9304は、連結部材9370（例えばプレカラム連結具）を介してマイクロバルブ9368に連結することができる。マイクロバルブ9368は、アダプター9374を介してシリンジ9366に連結することができるバルブホルダー9372内に保定されかつ/または連結されうる。ネブライザーアセンブリ9301は、ペイロード溶液をネブライザー9304に高い正確度および精度で送達することを可能にする。
透過処理溶液を細胞の単層に送達することができる異なる方法がいくつかある。例えば、透過処理溶液は、超音波を使って微粒化することができるか、ネブライザーを使って噴霧化することができる。
送達方法として超音波処理および噴霧化の両方を試験した。合計4つの異なるスプレーヘッドを試験した。
各スプレーヘッドについて以下のパラメータを評価した:空気圧、流速、距離、送達される体積、細胞数、スプレー時間、超音波プローブの周波数、超音波プローブのパワー。
高速度カメラ記録を使って、スプレーの特徴に対する効果を評価した。細胞が受ける力を力センサー分析によって測定した。ウェル中に送達される体積は比色アッセイを使って評価した。
超音波処理試験は、60kHz、130kHz、および180kHzで行った。液体はポンピングシステムによって超音波ノズルへと押し出すことができ、高周波音波振動を使って微細ミストスプレーに微粒化することができる。
圧電変換器を使って、電気的入力を、ノズル中に導入した場合に液体中に表面張力波を生じさせて液体の微粉化をもたらす振動という形の機械的エネルギーに変換した。各超音波プローブは所与の共鳴周波数で作動した。稼働周波数は生成する液滴のサイズを決定することができる。小滴のサイズは、稼働周波数ほどではないが、超音波プローブを稼働させるパワーによる影響も受けうる。スプレーの制御と成形を助けるために、補助空気流を使用することができる。
噴霧化試験はAri Mistネブライザー9304（図125）を使って行った。図125に示すように、ネブライザー9304は、液体用の接続具9307および空気用の接続具9309を含む。Ari Mistネブライザーは圧縮ガスで稼働し、試料溶液を供給するためのポンプを必要とする。このアトマイザーは2つのチャネルを有する。一方はガス（空気）用であり、他方は噴霧化される液体用であり、両者は並行経路に沿って流れる。どちらの経路も、ネブライザーの先端において、ガス用のオリフィスおよび液体用の出口で終わっている。ガス流は液体をガス流中に引き込むことができる。ガス分子との衝突は液体を小さな小滴へと砕いて噴霧化をもたらすことができる。
180kHzで稼働する超音波エミッタは、T細胞へのペイロードの送達において、130kHz、60kHz超音波ヘッド、およびAri Mistネブライザーと比較して、より効果的であることがわかった。図94に、180kHzで稼働する超音波エミッタについて、ペイロード送達の効率を特徴決定する一連の結果を示す。試験結果は、ペイロードが、およそ15～25％の効率でT細胞にうまく送達され、複数回の繰り返し間の一貫性は高レベル（±1％）であったことを示した。細胞の健全性は送達後も維持された（生存率85％）。
これらの結果は、超音波スプレーエミッタが、細胞への送達溶液およびペイロードの均等な沈着をもたらす単分散スプレーを生成することを示している。さらに、送達される体積を低減しかつエタノール濃度を下げると、超音波スプレーヘッドによる送達効率が改良された。
図95に、超音波エミッタ、Ari Mistネブライザー、およびMAD nasalスプレーエミッタについて、GFP取込みを特徴決定する別の一連の結果を示す。MAD Nasal（商標）鼻腔内粘膜用微粒化デバイス（Teleflex、ノースカロライナ州27560モリスビル、キャリントンミルブルバード3015）を使って、ペイロードを含有する送達溶液を微粒化した。簡単に述べると、7μlの送達溶液をnasalヘッドに直接ピペッティングした。スプレーヘッドを、ルアーロック接続具を介して空気圧源に直接接続した。1.5バールの空気圧を330msにわたってスプレーヘッドに供給してスプレーを生成した。現在のデータによれば、T細胞にmRNAを送達するには、180kHzで稼働する超音波スプレーエミッタの方が効率がよい。超音波スプレーエミッタでは32.7％GFP取込みが得られたのに対して、Ari Mistネブライザー（例えばネブライザー9304）では24.8％であった。超音波エミッタとAri Mistネブライザーはどちらも、16.9％の送達効率をもたらしたNAD nasalスプレーエミッタと比較して、より高いGFP mRNA送達をもたらした。
図96に、超音波エミッタ、Ari Mistネブライザー、およびMAD nasalスプレーエミッタについて、細胞生存率を特徴決定する一連の結果を示す。これらの結果は、試験した各スプレーヘッド（例えば超音波エミッタ、Ari Mistネブライザー、およびMAD nasalスプレーエミッタ）について、最低3回の技術的繰り返し実験を表す。無処理細胞との比較で平均72.3％の細胞生存率であった超音波ヘッドと比較して、Ari Mistネブライザーは、無処理細胞との比較で85.3％と、細胞生存率を向上させた。MAD nasalスプレーエミッタは最も高い細胞生存率をもたらし、細胞生存率は無処理細胞との比較で99.7％であった。
エンクロージャ微粒化
例えばアトマイザー、ネブライザー、および/または超音波エミッタを使った溶液の送達中に、微細エアロゾルが生成する。いくつかの例では、その微細エアロゾルがマルチウェルフィルタープレートの隣接ウェルを汚染しうる。いくつかの態様では、アトマイザー、ネブライザー、および/または超音波エミッタの遠位端部分にエンクロージャを設けることができ、これにより、フィルタープレートの隣接ウェルの汚染を防止しうる。
3つのリグプラットフォーム：リグ1（R1）、リグ3（R3）、およびリグ4（R4）を組み立てた（図126～128）。下記の表にリグの特徴をいくつか示す。
図126に図解するとおり、R1 11700は、透過処理溶液をAri Mistネブライザー9804に提供するように構成された溶液リザーバ9810（例えばElveflow試料リザーバ）およびネブライザー9804への透過処理溶液の送達を制御するように構成されたピンチバルブ9808（例えばElveflowピンチバルブ）を含む。ネブライザー9304は、ネブライザー9304を保定しスプレーヘッドのアラインメントを容易にするように構成することができるスプレーヘッド装着部11714に装着することができる。ピンチバルブ9808は、ネブライザー9304へのペイロード溶液の流体制御を可能にするように構成されている。スプレーヘッド装着部11714は、垂直軸Z3に沿ったスプレーヘッド装着部11714の上下動を容易にするように構成されたガイド11717に装着することができる。ネブライザー9804を含むスプレーヘッド装着部11714は、フィルタープレート11716を受容するように構成することができるプレートホルダー11718の上部に装着することができる。
図127に図解するように、R3 11800は、ネブライザー9304への透過処理溶液の送達を制御するように構成されたマイクロバルブ9368を介してAri Mistネブライザー9304に連結された試料リザーバシリンジ9366を有するネブライザーアセンブリ9301を含む。ネブライザーアセンブリ9301は流体ヘッドモジュール9308に装着することができる。流体ヘッドモジュール9308は、垂直軸に沿った流体ヘッドモジュール9308の上下動を容易にするように構成されたガイド11717に装着することができる。
図128に図解するように、R4 9800は、試料リザーバ（例えばElveflow試料リザーバ、図示していない）からアトマイザーへの透過処理溶液の送達を制御するように構成されたピンチバルブ9808（例えばElveflowピンチバルブ）に連結されたLB-100アトマイザー（図示していない）を含む。アトマイザーは、アトマイザーを保定してスプレーヘッドのアラインメントを容易にするように構成することができるスプレーヘッド装着部9814のカラー9816内に位置することができる。アトマイザーを含むカラー9816は、アトマイザーが撹拌式セルシステム11900内の細胞にペイロードを送達することができるように、撹拌式セルシステム11900の開口部の上に位置することができる。
（表）リグの特徴
Figure 0007465090000014
以下に、スプレーパラメータの微細制御を可能にするリグの特徴について詳述する。
いくつかの態様（例えばR1およびR4）において、ペイロードを含有する送達溶液の流体制御はElveflowピンチバルブを使って達成することができる。流体制御は、ピンチバルブ9808を通して流体を押し出すためにElveflow流体リザーバに定圧を適用することができる流体制御システムによって達成することができる。分注することができる流体の体積は、少なくとも、適用する圧力の量、バルブ9808を開放しておく時間の長さ、および/または使用する管の直径によって制御することができる。バルブ9808は、マイクロプロセッサによって制御することができる酸化金属半導体電界効果トランジスター（MOS FET）によって作動させることができる。
上記のElveflow-ピンチバルブ9808にはいくつかの制約があった。例えばシステムを再充填する度にR1およびR4の再較正が必要であった。体積5μl未満の分注では正確度および精度が不十分であった。低体積（＜5μl）の場合、繰り返された分注（10）での相対標準偏差はおよそ9％であった。観察された制約に対処するために、R3を開発した。上述のようにR3はピンチバルブ9808ではなくマイクロバルブ9368を含んでいる。ペイロードを含有する送達溶液の流体制御は、マイクロバルブ9368を使って達成することができる。1μl～100μlの範囲の体積を送達する場合、正確度および精度は、マイクロバルブ9368を使用するR3の方が高かった。
ネブライザー/アトマイザーに送達される空気の流体制御はソレノイドバルブを使って達成することができる。いくつかの態様では、ネブライザー/アトマイザーの作動を制御するために電子機器を使用することができる。電子制御されたスプレー作動を可能にするために、時間制御シーケンスの容易な開発が可能になるようにマイクロプロセッサベースの開発ボードを使って、システムを設計した。この開発ボードにはマイクロプロセッサPIC16F1619を使用した。スプレー作動時間および流体送達時間は、開発ボードのインターフェースソフトウェアによって操作することができる。このマイクロプロセッサ開発ボードは、ネブライザー/アトマイザースプレーのパルシングを可能にする。次に、繰り返し可能な高速PLC（プログラマブルロジック制御装置）技術を含めることで、業界標準とより良く整合し、自動化送達技術（これは超高速PLC技術に基づく）の実証実験として役立つように、このシステムをアップグレードした。このリグ制御装置は、PLCおよびGyger制御装置、ならびにこれら2つのハードウェア間での通信を容易にするプログラムからなった。ハードウェアにはモメンタリ押しボタンによるオペレーターとの対話がある。
Ari Mistネブライザー9304の並行経路デザインは、生来的に、ネブライザー9304の先端から偏心したスプレーを生み出す。ゴニオメーターを装着した特注スプレーヘッドホルダーを使って、スプレーヘッドのアラインメントを調節することができる。
エンクロージャ付き（enclosed）エミッタを使って溶液を送達するためのいくつかの方法を試験した。エンクロージャ付きエミッタを使ったGFP取込みの結果を、エンクロージャなしの（unenclosed）エミッタを使ったGFP取込みの結果と比較した。
方法1:エミッタを囲うためのカラーの使用
図97に、Ari Mistネブライザー（例えばネブライザー9304）のスプレーヘッド9504の周りに位置するエンクロージングカラー9502を含むネブライザーアセンブリの一例9501を示す。図解した例において、スプレーヘッド9504は、ダブルハイトフィルタープレート9516のウェル9516aの27mm上に位置する。カラー9502は、Ari mistスプレーヘッド9504用に設計され、製造されたものである。このカラーをスプレーヘッド9504上に装備した。ダブルハイトの壁を持つ96ウェルフィルタープレート9516を使用した。
方法1A:カラーがウェルプレートとのシールを形成する
スプレーヘッド9504の先端からウェル9516aの底面までの距離が26mmのところで、カラー9502はフィルタープレート9516のウェル9516aの上端とかみ合ってシールを形成した。CD3＋T細胞1.5×106個をフィルタープレート9516に播種し、培養用培地を除去するために350×gで5分間遠心分離した。GFP mRNAを含有する送達溶液（4μl）を細胞にスプレーし、2分間インキュベートした。2分間のインキュベーション後に50μlの停止溶液を加え、30秒間インキュベートした。最後に100μlの培養用培地を加えた。
方法1B:カラーとフィルタープレートの間に1mmの間隙を設ける
カラー9502をスプレーヘッド9504に装備し、スプレーヘッド9504の先端をウェル9516aの底面から27mmの距離に位置させた。したがってカラーは、フィルタープレート9516の上面の1mm上に保持された。注:エンクロージング実験では1回ヒットプロトコール（例えば送達溶液および停止溶液への1回の曝露）に従った。
方法1:結果
図98に、カラー9502なしのスプレーヘッドに、フィルタープレートとのシールを形成するカラーありのスプレーヘッドに、およびカラー9502とフィルタープレートとの間に1mmの間隙が存在する、カラーありのスプレーヘッドに対応する効率（GFP取込み）を特徴決定する結果を示す。
カラー9502とフィルタープレート9516の上面との間に1mmの間隙がある方法1Bに対応する試験は、カラー9502がGFP取込みに影響しなかったことを示している。これらの結果は、この機構では、カラー9502ありのウェルとカラー9502なしのウェルとの間でデータが同等であることを明確に示した。どちらの機構でエンクロージングカラーを使用しても、T細胞の生存率は影響を受けなかった。
方法1:結論
この結果は、カラー9502がT細胞の生存率に影響を及ぼさないことを示している。スプレーにはカラー9502がさまざまな程度に影響を及ぼす。この差異はシステムがシールされる度合に帰することができる。システムをシールすることで（例えば方法1A）、スプレーを阻害する局所的な圧力極大が形成された。方法1Bについては、カラー9502とフィルタープレート9516の上面との間に間隙を設けることで、圧力の出口が与えられた。この間隙は、ウェル内での空気の膨張を可能にし、スプレーを正しく作動させた。したがって、スプレープロセス中に空気が膨張するための膨張スペースを許容するのであれば、スプレーを囲うためにカラーを使用することができる。
方法2:スプレーを囲うためのX-pierceフィルムの使用
カラーを使ってスプレーヘッドを囲うのではなく、X-pierceフィルム（Sigma Aldrich、カタログ番号Z722529）を使ってスプレーを囲った。スプレーを囲うが、スプレーを阻害しうるシールの形成を回避するには、X-pierceフィルムを使ってスプレーヘッドを囲う方が、カラー（例えばカラー9502）を使用するより有益でありうる。
図99に、X-pierceフィルム9602がフィルタープレート9616の上面に接着している96ウェルPCTEフィルタープレートの一例9616を示す。フィルタープレート9616のウェルのフィルターベースは0.4μmの孔径を有する。図解した例に示すとおり、X-pierceフィルムは、フィルタープレート9616の各ウェルの開口部の上に位置するプレカット「X」を含む。実験では、CD3＋T細胞2.5×105個を各ウェルに播種した。培養用培地を除去して細胞の単層を生成するために、フィルタープレート9616を350×gで1分間遠心分離した。ネブライザーに送達される空気圧を1.65バールに設定し、ネブライザーのスプレーヘッドの先端を、ウェル内に位置していて細胞の単層がその上に形成されているフィルターメンブレンの上面から12mm上に位置させた。GFP mRNA（2μg）を含有する送達溶液（1μl）を細胞単層にスプレーした。次に細胞を2分間インキュベートした。2分間のインキュベーション後に、50μlの停止溶液を各ウェルに加え、ウェルを30秒間インキュベートした。その後、図99に示すように、100μlの培養用培地を各セルに加えた。フィルタープレートを37℃で17～24時間インキュベートしてから分析した。このエンクロージング実験では1回ヒットプロトコールに従った。
方法2:結果
図100に、エンクロージャのないフィルタープレートを使用しリグ1（R1）で行われた試験、エンクロージャのないフィルタープレートを使用しリグ3（R3）で行われた試験、およびフィルタープレートのウェル上にX-pierceフィルムエンクロージャを含むフィルタープレートを使用しR3で行われた試験に対応する効率（GFP取込み）を特徴決定する結果を示す。リグについては上に説明した。これらの結果は、フィルム付きのウェルでもフィルムなしのウェルでも効率は同等であることを示しており、したがってx-pierceフィルムはスプレーに負の影響を及ぼさなかったことを示している。X-pierceフィルムの使用は細胞生存率に影響しなかった。
x-pierceフィルムを使用して、効率（GFP取込み）も細胞生存率も低減することなく、スプレーを囲ってウェル間の交差汚染を避けることができる。
自動化を可能にするための溶液の流体制御
いくつかの態様において、本高精度リグは、ペイロード送達プロセスの自動化エンジニアリングソリューションを提供しうる。これを可能にするために、送達溶液、冷停止溶液、および培養用培地の微細流体制御を使用することができる。
流体制御は、ピンチバルブまたはマイクロバルブを通して流体を押し出すためにシステムに定圧を適用することができる流体制御システムによって達成することができる。分注することができる流体の体積は、適用する圧力の量、バルブを開放しておく時間の長さ、および/または使用する管の直径によって制御することができる。
バルブは、マイクロプロセッサによって制御することができる酸化金属半導体電界効果トランジスター（MOS FET）によって作動させることができる。
流体制御システムは、微細流体制御を使って2～10μlの範囲の体積の流体を送達することを可能にすることができる。それゆえに高精度リグシステム9000は、2～10μlの範囲の計量された体積単位の送達を制御することができる。いくつかの実施形態では、他の体積も可能である。
溶液の温度制御（温度リザーバ）
いくつかの態様では、送達溶液、停止溶液および培養用培地の温度を制御するために、流体温度制御システムを実装することができる。流体温度制御システムは、加熱システムおよび冷却システムを含むことができる。
図101に、送達溶液、停止溶液および培養用培地を加熱するために使用することができる加熱システムの一例11000を示す。加熱システムは流体リザーバ11002、筐体11004、および加熱要素11006を含むことができる。流体リザーバ11002は、一般に例えば培養用培地などの流体を充填することができる円柱管の形状をとることができる。筐体11004は、例えば、流体リザーバ11002を受容するための通路を有するアルミニウムブロックであることができる。加熱要素11006は筐体11004の遠位端に位置することができる。加熱要素11006は電源からの電力を受け取ることができ、筐体11004を加熱することによって、流体リザーバ内の流体を加熱することができる。加熱要素11006は伝導によって筐体11004を加熱することができる。
図76～77に、送達溶液、停止溶液、および培養用培地を加熱するために使用することができる冷却システムの一例11100を示す。冷却システム11100は、1つまたは複数の流体リザーバ11102、例えば1.5mlエッペンドルフチューブ、筐体11104、冷却要素11106、例えば電熱冷却器、ヒートシン11108およびファン11110を含むことができる。送達および/または停止溶液は、1つまたは複数の流体リザーバ11102に充填することができる。電力を冷却要素11106に送達することができ、冷却要素は熱表面および冷表面を生成することができる。冷表面は筐体11104と接触させておくことができ、熱表面はヒートシンク11108と接触させておくことができる。ファン11110は、冷却要素11106の熱表面から熱を除去するために、ヒートシンク11108に連結することができるか、またはヒートシンク11108上に位置することができる。
実際には、送達溶液および停止溶液をおよそ4℃に保つことができ、培養用培地をおよそ20℃～37℃に保つことができる。
スプレーヘッドおよび温度リザーバの装着
ニードルエミッタ9002およびアトマイザー9004は支持体に装着することができる。図104に、ニードルエミッタ9002およびアトマイザー11304を開放可能に保定することができる装着アセンブリの一例11300を示す。アトマイザー11304は、60kHz～120kHzの周波数で稼働することができる超音波アトマイザーであることができる。装着アセンブリ11300は、連結部材11305が取り付けられた支持体プレート11302を含むことができる。支持体プレートは、アトマイザー11304を受容することができる孔11306と、ニードルエミッタ9002が連結されていてもよい保定要素11310を受容することができる開口部11308とを含むことができる。孔11306はそこから延びるスロット11312を有することができる。場合により、60kHzで稼働することができる超音波アトマイザーは、120kHzで稼働するものと同じデザインを有することができる。それゆえに装着アセンブリ11300は、どちらかの周波数で稼働することができる超音波アトマイザーを収容することができる。
図105に、保定要素11310およびニードルエミッタ9002を備えた装着アセンブリ11300の一部分の分解組立図を示す。図105に示すとおり、ニードルエミッタ9002は、保定要素11310の孔11310aに挿入することができ、保定要素は開口部11308に挿入することができる。スライドインサートとしての保定要素11310のデザインは、スプレーヘッドエミッタに対してニードルエミッタ9002の独立したZ位置決め、すなわち垂直方向位置決めを可能にすることができる。これは、一貫したニードルエミッタ高さを維持したまま、エミッタの先端からフィルタープレートのウェルの底面まで15～31mmの範囲のさまざまなアトマイザー高さに適応することができる。
図106に、ニードルエミッタ9002および超音波アトマイザー11504を開放可能に保定することができる装着アセンブリの一例11500を示す。装着アセンブリ11500は、概して、装着アセンブリ11300と同様であることができるが、180kHzで稼働することができる超音波アトマイザー11504で機能するように設計することができる。装着アセンブリ11500は連結部材11505が取り付けられた支持体プレート11502を含むことができる。支持体プレートは、アトマイザー11504を受容することができる孔（図示されていない）と、ニードルエミッタ9002が連結されていてもよい保定要素11510を受容することができる開口部11508とを含むことができる。孔はそこから延びるスロット11512を有することができる。
図解した態様において、カラー11514は、アトマイザー11504および同じヘッドホルダー中のカラースロットに同じ高さで他の2つのヘッドに同心的に取り付けることができる。
図107に、ニードルエミッタ9002およびネブライザー11604を解放可能なように保定することができる装着アセンブリの一例11600を示す。装着アセンブリ11600は、概して、装着アセンブリ11300と類似することができ、連結部材11505が取り付けられた支持体プレート11602を含むことができる。ネブライザー11604は、ブラケット11606を介して支持体プレート11602に連結することができる。支持体プレート11602は、ニードルエミッタ9002が連結されていてもよい保定要素11610を受容することができる開口部11608を含むことができる。
他のエミッタタイプを収容するために図78～81に示すものと類似するデザインテンプレートを使用することができる。
装着アセンブリ11300、11500、および11600のデザインは、本高精度リグシステムが送達プロセスの最適化のためのプラットフォームとして機能することを可能にする。例えば4種類の異なるスプレーヘッドを収容することができる。
自動化およびソフトウェア設計
高精度リグシステム9000および/または陽圧システム9300は、送達プロセス工程の自動化を可能にすることができるソフトウェアプログラムおよびユーザーインターフェースを含むことができる。例えばソフトウェアは、並進ステージ9010およびバルブ9011を制御するように設計することができる。別の一例として、ソフトウェアプログラムは、装着アレイ9302の動きを制御するように構成することができる。ユーザーインターフェースは、決定的パラメータの入力を可能にすることができる。機能単位のシーケンスはユーザーによって選択されうる。
実験の繰り返し精度を確保する能力を持つが実験固有のパラメータを調節する柔軟性も提供することができるシステムが設計された。そのようなパラメータには、アドレスしたいウェルの数またはウェル中に分注される体積を含めることができる。この同期を達成するために、トラバース機構（例えばアクチュエータ9319）を含め、それを、必要な時間、200mmロケーション内で、そのキャリッジを位置決めするようにソフトウェア制御することができる。キャリッジは6ポジションを含み、これらのポジションのそれぞれは、個別に制御された高精度流体エスケープメントチャンバーに連結されている。分注場所（例えばペイロード、培養用培地および停止溶液ステーション）の選択下で、各位置を動かすことが可能である。デバイス固有のソフトウェアプラットフォームを含めることができる。このソフトウェアプラットフォームは、（1）ユーザーによる実験のデザインを可能にするグラフィカルユーザーインターフェースおよび（2）制御装置（例えばプログラマブルロジック制御装置（PLC））、例えばオムロンPLCによる、ローカル制御を含むことができる。図129に、ソフトウェアプラットフォームデザインの概略図12000を示す。ソフトウェアは、ユーザーフレンドリーな実験作成セクションおよびバックグラウンドシーケンス発生器を含むことができる。ユーザーインターフェースは、ユーザーが実験のパラメータを変化させることを可能にする実験キャンバスを含むことができる。ユーザーによる変更が可能なパラメータには、アドレスされるべきウェルの場所および数、真空および/または陽圧、ペイロードの分注、停止溶液および培養用培地を含む工程のシーケンス、ならびに対応する送達されるべき体積が含まれる。ユーザーはアクチュエータ速度およびインキュベーション時間を変更することもできる（図130）。図130に、ソフトウェアプラットフォームのグラフィカルユーザーインターフェース（GUI）12100を示す。図解した例において、GUIは、ユーザーによるパラメータの変更を可能にする実験キャンバスを含む。例えばユーザーによる変更が可能なパラメータには、アドレスされるべきウェルの場所および数、真空または陽圧、ペイロード、停止溶液および/または培養用培地の分注を含む工程のシーケンス、ならびに対応する送達されるべき体積が含まれる。バックグラウンドシーケンス発生器は、PLC用のプログラムを出力し、それが、機械的システムおよび電子的システムのローカル制御をもたらす。このソフトウェアにより、オペレーターは（例えば統合ディスプレイを介して）、最適な実験の成功のために、ウェル間のドウェル時間を手作業で計算しなくても、ウェル、培地および時間のさまざまな並べ替えを試験できるようになる。これらのインプットにより、エンドユーザーは、複数の実験を行うことができるようになる。
いくつかの実施形態において、システムは、フィルタープレート基体内の96個の位置にアドレスすることができる。このシステムはより高速であることができ、複数のトラバース機構およびユーザーフレンドリーなHMI（ヒューマンマシンインターフェース）を有することができる。HMIは、自動システムパージまたはタッチスクリーン駆動の較正シーケンスなど、さらなる自動化ユーテリティーをオペレーターに提供することができる。このシステムは、実験を計画するために実験計画者との連係を依然として維持したスタンドアローンソリューションとして稼働することができる。実験のさらなる局面をウェルごとに調節することができ、これは可能な並べ替えが著しく増大することを意味する。例えば流体をいくつかのウェルに分注した後、次の実験セクションのために流体送達システムに適用される圧力は、自動的に調節されうる。この例示的システムは、さらなるオフライン分析のために、実験からの分析を記録する能力を有する。
図64は、本主題のいくつかの局面による例示的プロセスを図解するプロセスフローチャートである。この例示的プロセスは、例えば送達システムの制御装置によって実装することができる。1610では、ユーザー入力を例えば制御装置によって受け取らせることができる。1620では、送達溶液適用装置を稼働させて、微粒化された送達溶液をウェル内の細胞単層に送達することができる。1630では、送達溶液の適用後、細胞単層を第1の時間にわたってインキュベートすることができる。1640では、停止溶液適用装置をこの第1のインキュベーション期間の満了に応答して稼働させることができる。この稼働は、細胞単層に停止溶液を送達するために行うことができる。1650では、停止溶液の適用に応答して、細胞単層を第2の時間にわたってインキュベートすることができる。
いくつかの実施形態では、送達溶液適用装置の稼働、第1のインキュベーション期間にわたるインキュベーション、停止溶液適用装置の稼働、および第2のインキュベーション期間にわたるインキュベーションの反復を、所定の反復回数行うことができる。
本明細書に記載する主題の1つまたは複数の局面または特徴は、デジタル電子回路設計、集積回路設計、特別に設計された特定用途向け集積回路（ASIC）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（FPGA）コンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、および/またはそれらの組合せにおいて実現することができる。これらのさまざまな局面または特徴は、記憶システム、少なくとも1つの入力デバイスおよび少なくとも1つの出力デバイスとの間でデータおよび命令を送受信するために連結された、専用であっても汎用であってもよい、少なくとも1つのプログラマブルプロセッサを含むプログラマブルシステムで実行可能および/または解釈可能な、1つまたは複数のコンピュータプログラムにおける実装を含むことができる。プログラマブルシステムまたはコンピューティングシステムは、クライアントおよびサーバーを含みうる。クライアントおよびサーバーは一般に互いに遠く離れており、典型的には通信ネットワークを介して対話する。クライアントとサーバーの関係は、それぞれのコンピュータ上で動作して互いにクライアント-サーバー関係を有するコンピュータプログラムによって生じる。
これらのコンピュータプログラムは、プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション、アプリケーション、コンポーネント、またはコードと呼ぶこともでき、プログラマブルプロセッサのための機械命令を含み、高水準手続き型言語、オブジェクト指向プログラム言語、関数型プログラム言語、論理型プログラム言語および/またはアセンブリ/機械言語で実装することができる。本明細書において使用する「機械可読媒体」という用語は、例えば磁気ディスク、光学ディスク、メモリおよびプログラマブルロジックデバイス（PLD）など、機械命令および/またはデータをプログラマブルプロセッサに提供するために使用される任意のコンピュータプログラム製品、装置および/またはデバイスを指し、機械命令を機械可読信号として受け取る機械可読媒体を包含する。「機械可読信号」という用語は、機械命令および/またはデータをプログラマブルプロセッサに提供するために使用される任意の信号を指す。機械可読媒体は、例えば非一過性ソリッドステートメモリまたは磁気ハードドライブまたは任意の等価な記憶媒体がそうであるように、そのような機械命令を一時的にではなく記憶することができる。上記に代えてまたは上記に加えて、機械可読媒体は、例えば1つまたは複数の物理プロセッサコアに付随するプロセッサキャッシュまたは他のランダムアクセスメモリがそうであるように、そのような機械命令を一過性に記憶することもできる。
ユーザーとの対話を提供するために、本明細書に記載する主題の1つまたは複数の局面または特徴は、ユーザーに情報を表示するための陰極線管（CRT）または液晶ディスプレイ（LCD）または発光ダイオード（LED）モニターなどのディスプレイデバイス、ユーザーによるコンピュータへの入力手段となるキーボードおよび例えばマウスまたはトラックボールなどのポインティングデバイを有するコンピュータ上に実装することができる。ユーザーとの対話に対応するために、他の種類のデバイスも同様に使用することができる。例えば、ユーザーに提供されるフィードバックは、例えば視覚フィードバック、聴覚フィードバックまたは触覚フィードバックなど、任意の形態の感覚フィードバックであることができ、ユーザーからの入力は、限定するわけではないが、音響入力、音声入力または触覚入力など、任意の形態で受け取られうる。考えうる他の入力デバイスには、例えばタッチスクリーンまたは他のタッチセンサー式デバイス、例えばシングルポイントまたはマルチポイントの抵抗式または容量式トラックパッド、音声認識ハードウェアおよびソフトウェア、光学スキャナ、光学式ポインター、デジタル画像キャプチャデバイスおよび関連する解釈ソフトウェアなどがあるが、それらに限定されるわけではない。
機器用のエンクロージャ
高精度リグシステム9000および/または陽圧システム9300は、安定した周囲条件を維持するためにエンクロージャ内に保定することができる。エンクロージャは、エンクロージャのデザインを左右するパラメータに基づいて特注することができる。
ベースプレートの温度および制御
いくつかの態様では、ベースプレート9016の温度を制御するために、温度制御システムを実装することができる。例えばカートリッジヒーターを、真空マニホールドアセンブリ9008のベースプレート9016上のさまざまな場所に装着することができる。カートリッジヒーターからウェルフィルタープレート9014への熱伝達を調べるために、熱力学的分析を行うことができる。ペイロード送達に対する温度の効果を調べるために温度昇降実験を行うことができる。
上にいくつかのバリエーションを説明したが、他の変更態様も可能である。例えばフィルタープレートは任意のウェル数を含むことができ、96ウェルフィルタープレートである必要はない。加えて、システムは、任意の数の有効ウェルへの真空圧を制御することができる任意の数のバルブを含むことができる。別の一例としてシステムは、それぞれを独立して装着し制御することができる1つまたは複数のニードルエミッタ、アトマイザー、および/またはネブライザーを含むことができる。
本主題には多くの技術的利点がある。一般に、本主題は、細胞の健全性を維持しつつ、送達プロセスの一貫性および送達効率を高めることができる送達システムを提供する。
本送達システムは、培養用培地を除去し、それによって細胞の単層を生成するために、フィルタープレートの個々のウェルに真空圧を提供することを可能にする。フィルタープレート上の個々のウェルに真空圧を適用することにより、真空圧のより高精度な制御、各ウェルに適用される真空圧の一貫性を達成することができる。
本送達システムは、マイクロリットル程度の体積での透過処理溶液の分注を可能にする。マイクロリットル量の分注体積によって溶液への細胞の曝露をより良く制御することが可能になり、それが、透過処理溶液過剰な曝露を低減することによって総合的な細胞の生存率を増加させうる。さらにまた、本システムは自動化することができ、それが誤差を最小限にして、精度を向上させる。
本システムは、送達溶液の温度、停止溶液の温度、および培養用培地の温度の制御を可能にする。それゆえに各溶液は、ペイロード送達の効率および細胞生存率を増加させるために、最適な温度に維持することができる。ベースプレートの温度も制御することができる。これにより、ペイロード送達の効率を最大化するための温度の最適化が可能になる。
ニードルエミッタならびにアトマイザーおよび/またはネブライザーは、ニードルエミッタ高さを一定に保ちながら、エミッタの先端からフィルタープレートのウェルの底面まで15～31mmの範囲のさまざまなアトマイザー/ネブライザー高さに対応することができる装着アセンブリに連結することができる。これは可能にする。
本システムは、送達プロセス工程を自動化することを可能にすることができるハードウェア、1つまたは複数のソフトウェアプログラム、およびユーザーインターフェースを備えることができる。ソフトウェアは、並進ステージおよびバルブを制御するように設計することができる。ユーザーインターフェースは、決定的パラメータを入力することを可能にすることができる。機能単位のシーケンスはユーザーによって選択されうる。これは以下の理由で有益である。
エンクロージャは安定した周囲条件を維持するように機能しうる。
さらなる例示的送達システム局面
送達プロセスのスケーリングは、最適化を可能にするためのシステムを設計すること、より大きな規模での細胞単層の形成方法を決定すること、およびT細胞へのmRNAの細胞内送達を可能にするために微粒化を最適化することを伴った。
最適化作業により、現在までに、＞60％の細胞生存率および最大80％の細胞回収率で、＞50％のT細胞へのmRNA送達効率が達成されている。
送達プロセスのスケーリングを容易にするために、システムを設計および構築した。本システムは、市販製品であるAmicon撹拌式セル、圧力ベースの試料濃縮ユニット（サイズ50mlおよび200ml、それぞれカタログUFSC05001およびUFSC20001）に基づく。図108に、細胞の単層を形成させることが容易になるように構成された撹拌式セルシステムの一例9700を示す。
撹拌式セルシステム9700は、キャップ9702、本体9704、メンブレンホルダー9706、およびベース9708を含むことができる。撹拌棒9710は本体9704内に位置しうる。キャップ9702は、本体9704の第1の端で本体9704に連結するように構成することができる。シール形成要素9712（例えばガスケット）は、キャップ9702と本体9704の第1の端との間にシールを形成するように、キャップ9702と本体9704の第1の端の間に位置しうる。メンブレンホルダー9706はメンブレン9714を受容することができ、メンブレンホルダー9706の連結部材9716が本体9704の第2の端における開口部9718を通って延びるように、本体9704の第2の端に隣接して位置することができる。本体9704の第2の端はベース9708に連結することができ、シールを形成するために、それらの間にシール形成要素9720（例えばoリング）が位置しうる。キャップ9702、本体9704、およびベース9708によって形成される本体チャンバーに加圧ガスを送達することができるように、導圧管アセンブリ9722をキャップ9702に連結することができる。圧を適用するとチャンバーから流体を排出されうるように、濾液管アセンブリ9724をメンブレンホルダー9706の連結部材9716に連結することができる。
稼働時には、細胞を含有する培養用培地をチャンバーに送達し、キャップ9702を本体9704に連結することができる。導圧管アセンブリ9722はキャップ9702に連結することができ、注入口管アセンブリ9722を介してチャンバーに陽圧を適用することができる。いくつかの態様において、圧力は50～1000mbarの範囲にあることができ、圧力は10～60秒間適用することができる。したがって、陽圧を適用すると、培養用培地はメンブレン9714越しに連結部材9716および濾液管アセンブリ9724を通してチャンバーから押し出されうる。培養用培地が排除されると、細胞の単層がメンブレン9714上に残りうる。したがって撹拌式セルシステム9700は、撹拌式セルのメンブレンホルダーに設置されたフィルターメンブレン上に細胞単層を形成させるために使用することができる。単層が形成されたら、ネブライザー（例えばBurgener ResearchのLB-100）を使って、フィルターメンブレン上にある細胞上に送達溶液を微粒化することができる。
図108に示す撹拌式セルシステム9700はいくつかの制約を有しうる。例えば場合により、撹拌式セルシステム9700はある特定の濃度（例えばPCTEメンブレンを使用した場合に10×106/mLを上回る濃度）を上回る上記細胞懸濁液を有する培養用培地を濾過することができない。これは、一つには、メンブレンホルダー9706の形状によるものでありうる。図109に示すように、培養用培地はメンブレンホルダー9706の唯一つのチャネル9706aによって流れ出る。チャネル9706aは、ある特定の濃度を上回る細胞懸濁液を有する培養用培地を濾過すると、目詰まりを起こしうる。別の一例として、メンブレン9714における細胞の均等な分布は、メンブレンホルダー9706を使っていては達成されなかった。
メンブレンホルダー9706に伴うこれらの制約に対処するために、図110に示すメンブレンホルダー9906を構築した。この態様においてメンブレンホルダー9906はPTFE製であり、同心円を形成するパターンで底面を突き通す複数の孔9906aを含みうる。使用中、圧力が撹拌式セルシステムのチャンバー内に適用されると、培養用培地は孔9906aを通って流れ出ることができる。dynabeads（細胞を模倣するために使用されるマイクロビーズ）を使ってメンブレンホルダー9906を評価した。図111に、dynabead評価の際にメンブレンホルダー9906と共に使用されたメンブレン9914を示す。図111に示すとおり、結果は、孔9906aの近くにdynabeadsが蓄積したことを示している。このホルダーを使った送達プロセスに付された細胞は、不十分な取込みをもたらした。
孔の付近に細胞が蓄積するのを防止するため、およびメンブレン上に細胞のより均等な分布を生成するために、メンブレンホルダーは、孔9906aに似た孔を含むことができるが、孔と孔の間の半径方向流を容易にすることができる同心円状のチャネルも含みうる。図112に、撹拌式セルシステム（例えば撹拌式セルシステム9700）と共に使用することができるメンブレンホルダーの別の態様10006を示す。図解した態様において、メンブレンホルダー10006は、孔10006a、同心円状チャネル10006b、およびまっすぐな、すなわち直線的チャネル10006cを含む。孔10006aは、中心円、外円、および中心円から外円に向かって延びる直線的スポークを含むパターンに沿って形成される。直線的チャネル10006cは、メンブレンホルダー10006の中心点から外に向かって半径方向に延び、同心円状チャネル10006bはメンブレンホルダー10006の中心点の周りに同心円を形成する。孔10006aおよびチャネル10006b、10006cは、メンブレン全体にわたる細胞の均等な分布を促進することができ、培養用培地の迅速な除去を促進することができる。いくつかの態様において、図82～83に図解したメンブレンホルダー9706は、孔（例えば孔10006a）を開けることにより、メンブレンホルダー10006が形成されるように改変することができる。
dynabeadsを使ってメンブレンホルダー10006を評価した。図113に、dynabead評価においてメンブレンホルダー10006と共に使用したメンブレン10014を示す。図113に示すように、結果は、メンブレンホルダー10006と共に使用したメンブレン10014には、メンブレンホルダー9906と共に使用したメンブレン9914の場合よりも均等に、dynabeadsが分布することを示している。
いくつかの態様において、メンブレンホルダーは、同心円状チャネル内に形成された孔を含むことができる。図114に、孔10106a、同心円状チャネル10106b、および直線的チャネルチャネル10106cを含むメンブレンホルダーの一例10106を示す。図解した例において、孔10106は、同心円状チャネル10106b内および直線状チャネル10106c内に形成される。この形状は、メンブレン上に細胞の単層が形成されうるように、培養用培地の均等な流出を容易にすることができる。
LB-100スプレーヘッドを使った送達溶液の微粒化を可能にするために、R4を組み立てた。図115～118および128に、細胞の単層に透過処理溶液を送達するために使用することができるR4とも呼ばれる溶液送達システムの一例を示す。溶液送達システムは、図115に示すネブライザーアセンブリ9801および図116に示す装着システム9802を備えることができる。
ネブライザーアセンブリ9801は、ネブライザー9804（例えばLB-100スプレーヘッド）、ネブライザー9804への空気および液体（例えば透過処理溶液）の送達が容易になるように構成された連結要素9806（例えばIDEX接続具）、ネブライザー9804に透過処理溶液を提供するように構成された溶液リザーバ9810（例えばElveflow試料リザーバ）、ネブライザー9804への透過処理溶液の送達を制御するように構成されたピンチバルブ9808を含む。装着システム9802は、バルブおよびリザーバ装着部9812、スプレーヘッド装着部9814、ならびにネブライザー9804を収容するためのネブライザー保定カラー9816を備えることができる。ネブライザーアセンブリ9801は、定位置に固定されるように、図91～92に図解するとおり、装着システム9082に連結することができる。装着システム9082は、ネブライザー9804とターゲット領域との正確なアラインメントを容易にする。
細胞単層の形成へのさらなる例示的アプローチ
細胞単層を生成するための2つのアプローチを説明する。どちらの方法でも、撹拌式セルユニットは、図108に示したように組み立てた。0.4～10×106個の細胞/mlを含有する体積5～10mlの細胞懸濁液を撹拌式セルチャンバーに加え、次にチャンバーの蓋を閉じた。
単層は撹拌式セルの底面に真空圧を適用することによって生成することができる。この方法では、-50～-1000mbarをチャンバーに、10～60秒間にわたって、または目視でフィルターメンブレンが乾いたように見えるまで適用した。
あるいは、撹拌式セルの蓋上の管接続具を介して陽圧を適用することによって単層を形成させた。圧力は設定時間（10～60秒間）にわたって、また目視でフィルターメンブレンが乾いたように見えるまで適用した。場合によっては、より低い圧力を使って、培養用培地の＞90％をフィルター越しに押し出してから、圧力を10～15秒にわたって緩やかに増大させることで、最終的に培養用培地の完全な除去を達成した。単層を形成させ、細胞培養用培地を完全に除去するために、100～200mbarの圧力を適用した。
実際の具体的な圧力および時間は、細胞濃度、メンブレンタイプ、孔径、およびメンブレンホルダーのタイプに依存して変動した。例えば元の無改変メンブレンホルダーでは、50～100×106個のT細胞を使って、63.5mm撹拌セル中に単層を形成させた。PES（ポリエチレンスルホン）メンブレンでは、50×106個の細胞の場合は150mbarを20～30秒間適用することによって培地を除去することが可能であったが、60×106個の細胞では培地を除去するのに30～60秒および200mbarが必要であった。PCTE（ポリカーボネートトラックエッチド）メンブレンでは、低い方の細胞濃度について、250mbarで60秒を要した。100×106個の細胞の場合、250mbarで2分後でもまだ、培地はフィルターメンブレン上に存在すると考えられる。これを除去するために、圧力を10秒で1バールまで上昇させてから、通常レベル（100mbar）まで減少させた。培地除去を助けるために、これを数回行った。
陽圧は、63.5mmおよび44.5mm撹拌式セル中の無改変フィルターホルダー（図109）で、約50×10^6個の細胞と、2.0μmの細孔を持つ親水性PCTEメンブレンとを使用して試験した。この機構ではどの段階でも培地がすべて除去されることはなかった（0～600bar、0～6分間）。
44.5mmメンブレンにおいて改変フィルターホルダー（図113）を使用すると、1μm PCTE疎水性メンブレンと20×106個の細胞では、わずか100mbar、10秒で単層が達成されたが、より高い圧力ではさらに短い時間で達成することができた（500mbar、5秒間）。
単層を生成するために使用するフィルターのタイプを調べた。フィルターは材料、疎水性、および孔径が異なった。試験した材料には、PES、ならびにポリカーボネートトラックエッチドフィルターPCTE疎水性および親水性メンブレンコーティングが含まれ、サイズには、直径13、25mm、47mm、および63mmが含まれ、孔径は0.4μmから1.2μmの範囲にわたった。PETE（ポリエステル）メンブレン、銀メンブレン、および金メンブレンも試験した（下記の表参照）。
（表）
Figure 0007465090000015
均等な単層の形成、培養用培地の除去における効率、およびフィルターメンブレンからの細胞の回収率について、フィルターを評価した。単層形成を評価するための細胞の見本としてDynabeadsを使用した。加えて、増大培養したT細胞を使って、単層形成、回収率および単層形成後の生存率を評価した。
PESフィルターを調べて、これらのフィルターでは均等な単層の形成および培養用培地の効率のよい除去が可能であることがわかった。しかし、フィルターメンブレンからの細胞の回収率は低かった（50％）。PCTEトラックエッジフィルターは、フィルターメンブレンからの細胞回収率の改良（50～90％）をもたらした（図121）。しかし、培養用培地除去の効率はPESフィルターに比べて遅かった（（150mbarで）培地の除去に要する時間は、PESフィルターでは10秒であるのに対して、PCTEフィルターでは45秒）。達成された回収率で最も良いのは、PCTE 0.4 疎水性 20×106 100mbar、60秒での約87％であった（図122）。
T細胞へのmRNAの細胞内送達を可能にするための微粒化
LB-100スプレーヘッドを調べたところ、直径60mmのターゲット区域が明らかになった。LB-100の力分析を実行した（図120）。より大きなターゲット区域（25～65mmフィルターメンブレン）へのLB-100スプレーによる送達を最適化するために、高さ、空気圧、送達される体積、ヒットの数、細胞数、およびスプレー持続時間を調節した。
LB-100スプレー送達を最適化するために、ターゲット区域までのスプレーヘッドの高さを調節した。スプレーヘッドの先端からターゲット区域まで30mm～160mmの範囲の距離を調べた。最適な距離範囲はスプレーヘッドの先端からターゲット区域まで60～100mm内に見いだされた。取込みは、距離が小さいほど増大し、離れると減少した。
LB-100スプレー送達を最適化するために、1～6バールの範囲で空気圧を変動させたところ、2.5～3.0バールが細胞内送達にとって最適な範囲であることがわかった。GFP mRNA送達は2.5バールより低い圧力において低減し、細胞生存率は3.0バールより高い圧力において低減した。空気圧を増大させると有効ターゲット面積が増大した。
LB-100スプレー送達を最適化するために、送達される体積を10～300μlの範囲で変動させたところ、80～100μlの体積が細胞内送達にとって最適であることがわかった。0.4～10×106個/mlの範囲のヒト初代T細胞の細胞懸濁液5～10mlを撹拌式セルユニット（Merck Millipore;PCTEフィルター、孔径0.4μmまたは1μm）に加えた。100～150mbarの範囲の陽圧を20～50秒間適用することで細胞単層を形成させた。細胞単層に、0.1μg/μlのGFP mRNAを含有する送達溶液10～300μlをスプレーし、2分間インキュベートした。停止溶液（1ml）を加え、その後、30秒間インキュベートし、培養用培地（4ml）をフィルターメンブレンに加えた。細胞を加湿インキュベータ中、37℃および5％CO2で一晩インキュベートし、17～24時間後に、フローサイトメトリーによってGFP蛍光について評価した。
送達効率を増大させるために、1回ヒット戦略と2回ヒット戦略を比較する最適ヒット数の評価を行った。データは、細胞が2回目のヒットを受けた場合に、送達効率の増大を示した。0.4～10×106個/mlの範囲のヒト初代T細胞の細胞懸濁液5～10mlを撹拌式セルユニット（Merck Millipore;PCTEフィルター、孔径0.4μmまたは1μm）に加えた。100～150mbarの範囲の陽圧を20～50秒間適用することで細胞単層を形成させた。細胞単層に、0.1μg/μlのGFP mRNAを含有する送達溶液80～100μlをスプレーし、2分間インキュベートした。停止溶液（1ml）を加え、その後30秒間インキュベートし、培養用培地（4ml）をフィルターメンブレンに加えた。2回ヒット戦略の場合は、細胞を2時間インキュベートしてから、スプレープロセスを繰り返した（上述のとおり）。細胞を、加湿インキュベータ中、37℃および5％CO2で一晩インキュベートし、17～24時間後に、フローサイトメトリーによってGFP蛍光について評価した。二重ヒットプロセスは送達効率の増大をもたらした（図123）。
図132に、Midiシステムの例示的一態様12300を示す。図解した例において、Midiシステム12300は、メンブレンホルダー10006（例えば44mmメンブレンホルダー）を持つ撹拌式セルシステム11900（例えば63mm撹拌式セルシステム）を備える。エンクロージングフィルム12303が撹拌式セルユニットの開口部に接着している。スプレーヘッドホルダー9814のカラーは、エンクロージングフィルム12303中の「スリット」を通して撹拌式セルシステム11900中に挿入されている。図解した例では、LB-100アトマイザーがスプレーヘッドホルダー9814のカラー内に保定され、スプレーヘッドの先端がメンブレンホルダー10006の上面表面から82mmになるように位置している。
図133は、Midiシステム12300で行った試験に対応する効率（GFP取込み）および生存率を特徴決定するデータを表すプロットである。データは、3回の技術的繰り返し実験で59.63％±1.2の平均送達効率および74.6％±5.3の平均生存率データを示している。
送達効率を増大させるために、フィルターメンブレン上に播種する細胞の数を調べた。細胞13×103個/mm2の細胞密度を撹拌式セルユニット（Merck Millipore;PCTEフィルター、孔径0.4μmまたは1μm）に播種した。100～200mbarの範囲の陽圧を10～50秒間適用することで細胞単層を形成させた。細胞単層に、0.1μg/μlのGFP mRNAを含有する送達溶液80～100μlをスプレーし、2分間インキュベートした。停止溶液（1ml）を加え、30秒間インキュベートした後、培養用培地（4ml）をフィルターメンブレンに加えた。細胞を加湿インキュベータ中、37℃および5％CO2で一晩インキュベートし、17～24時間後に、フローサイトメトリーによってGFP蛍光について評価した。
スプレーの持続時間を調べた。これは、アトマイザーへの空気およびペイロードの流れを制御するバルブの開放時間を調節することによって達成された。280～700msのスプレー持続時間を試験した。
図134に、細胞の単層の生成および細胞へのペイロードの送達を容易にするように構成された送達システムの例示的一態様を示す。
いくつかの態様では、透過処理溶液への細胞の曝露を容易にし、強化するために、透過処理溶液の送達前、送達後、および/または送達中に、フィルターメンブレンを振動させることができる。フィルターメンブレン上での細胞の単層の形成を支援するために、単層の形成前、形成後、および/または形成中に、メンブレンを振動させることができる。
振動は、偏心回転質量（ERM）システムまたは線形共振アクチュエータ（LRA）システムによってもたらされうる。例えば好ましい一態様では、アクチュエータを作動させるとメンブレンが振動するように、X軸、Y軸、およびZ軸に対応する1つ、2つ、または3つのアクチュエータ（LRA）を、メンブレンまたは対応するメンブレンホルダー（例えばメンブレンホルダー10006、10106）に取り付けることができる。LRAの利点は、各振動軸を独立して駆動させうることである。したがって、制御可能な振動パターンをメンブレンに発生させることができる。加えて、メンブレンの物理的特徴による機械的共振点を同定すれば、メンブレンに対して示されうる制御度を改良することができる。いくつかの態様では、メンブレンおよび/またはメンブレンホルダーの動きおよび/または偏移を特徴決定するデータを得るために、3軸加速度計デバイスをメンブレンおよび/またはメンブレンホルダーに機械的に連結することができる。加速度計からのデータは、LRAの作動を制御するためのフィードバック制御システム内で使用することができる。例えば加速度計を使ってメンブレンおよび/またはメンブレンホルダーの振動をモニターすることができる。いくつかの態様において、加速度計からのデータは、LRAによって生成する振動を調節するための制御フィードバック信号として使用することができる。例えば加速度計からのデータは、所望の振動パターンと達成された振動パターンとの間の誤差信号を生成するために使用することができる。一例として、駆動振動周波数は、メンブレンの剛性および/またはメンブレン上の細胞のサイズに基づいて決定することができる。例示的振動パターンは、x軸上およびy軸上での3000Hzの正弦波信号およびz軸上での無信号でもたらされうる。偏移はピーク間で1mmであり、x駆動波形とy駆動波形との間に位相差はなく、両者はコヒーレントであることができる。他にも、x、y、および/またはz軸に回旋および/または振とうをもたらすものなど、多くのパターンが可能である。
本主題は、温和な可逆的透過処理によって細胞内送達を達成する非ウイルス的ベクターフリー方法を含むことができる。本主題は、（1）低用量のエタノールを透過処理作用物質として含有する透過処理溶液、および（2）送達溶液を小滴化された形態で標的細胞に適用する手段を含むことができる。本技術は、透過処理溶液を細胞に適用する際の体積、時間および圧力に関する厳格な制御を提供し、これにより、高レベルな送達効率および細胞生存率を達成することができる。
本プロセスの工程は以下を含みうる:ターゲット細胞の単層を生成すること;上清を細胞から除去すること;カーゴを送達溶液と混合し、小滴化された形態で細胞に適用し、2分間インキュベートすること;この期間中に、エタノールが細胞膜を透過化し、カーゴが細胞内に拡散すること;カーゴはエンドサイトーシス非依存的に細胞質中に直接進入すること;次に「停止」溶液を適用し、30秒間インキュベートすること-これは透過化送達溶液を希釈するように作用し、細胞膜が再シール形成し始めることを可能にする;次に培養用培地を加えてプロセスを完了する。
他の態様
本発明をその詳細な説明と合わせて記載したが、上記の説明は本発明を例示することを意図し、添付の請求項によって規定されるその範囲を限定することを意図しない。他の局面、利点、および変更態様は、添付の請求項の範囲内にある。
本明細書において言及した特許文献および科学文献は、当業者にとって利用可能な知識を確立している。本明細書において言及された米国特許および公開または未公開米国特許出願は、参照により組み入れられる。本明細書において言及する公開された外国特許および特許出願はすべて、参照により組み入れられる。本明細書において言及する他の公表された参照文献、文書、稿本、および科学文献はすべて、参照により組み入れられる。
本発明をその好ましい実施形態について具体的に示し、説明したが、添付の請求項に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、その形態および詳細にさまざまな変更を加えうることは、当業者には理解されるであろう。

Claims (22)

  1. 非接着哺乳動物細胞の集団を提供する工程、および
    該哺乳動物細胞の集団をある体積の等張水溶液と接触させる工程であって、ここで、該溶液は、該哺乳動物細胞の細胞質に対して等張であり、該水溶液がペイロードと濃度5％（v/v）超かつ最大50%（v/v）のアルコールとを含み、さらにここで、該ペイロードは核酸もしくは遺伝子編集組成物を含む、工程
    を含む、非接着哺乳動物細胞の形質膜を横切って該ペイロードを送達するインビトロの方法。
  2. 前記アルコールがエタノールを含む、請求項1に記載の方法。
  3. 前記水溶液が10％超のエタノールを含む、請求項2に記載の方法。
  4. 前記水溶液が20～30％のエタノールを含む、請求項2に記載の方法。
  5. 前記水溶液が27％のエタノールを含む、請求項1に記載の方法。
  6. 前記水溶液が100～125mMのKClを含む、請求項1に記載の方法。
  7. 前記水溶液が106mMのKClを含む、請求項1に記載の方法。
  8. 前記非接着哺乳動物細胞が末梢血単核細胞を含む、請求項1に記載の方法。
  9. 前記非接着哺乳動物細胞が免疫細胞を含む、請求項1に記載の方法。
  10. 前記非接着哺乳動物細胞がTリンパ球を含む、請求項1に記載の方法。
  11. 前記免疫細胞が、CD3のリガンド、CD28のリガンド、またはそれらの組合せによって活性化される、請求項9に記載の方法。
  12. 前記非接着哺乳動物細胞の集団が単層を構成する、請求項1に記載の方法。
  13. 前記単層を前記水溶液のスプレーと接触させる、請求項12に記載の方法。
  14. 前記方法が前記細胞の細胞質中に前記ペイロードを送達し、かつ、該細胞の集団が、エレクトロポレーションによる該ペイロードの送達と比較してより大きい生存百分率を成す、請求項1に記載の方法。
  15. 前記核酸がメッセンジャーリボ核酸（mRNA）、RNA、プラスミド、または遺伝子編集組成物を含む、請求項1に記載の方法。
  16. 前記核酸がmRNA、RNA、プラスミド、または遺伝子編集組成物をコードするmRNAである、請求項15に記載の方法。
  17. 前記遺伝子編集組成物がPD-1の発現を低減する、請求項16に記載の方法。
  18. 前記単層がメンブレンフィルター上に存在する、請求項13に記載の方法。
  19. 前記スプレーとの接触後に前記メンブレンフィルターを振動させる、請求項18に記載の方法。
  20. 前記mRNAがキメラ抗原受容体をコードする、請求項15に記載の方法。
  21. 前記遺伝子編集組成物が、
    (a)ゲノムDNAを切断し、ゲノムDNAにニックを入れ、ゲノムDNAをスプライスし、再編成し、移動させ、組換え、または他の形で改変する化合物または複合体を含む、または、
    (b)（i）ゲノムDNAを切断し、ゲノムDNAにニックを入れ、ゲノムDNAをスプライスし、再編成し、移動させ、組換え、または他の形で改変する遺伝子編集複合体に含まれうる化合物、または（ii）ゲノムDNAを切断し、ゲノムDNAにニックを入れ、ゲノムDNAをスプライスし、再編成し、移動させ、組換え、または他の形で改変する遺伝子編集複合体に含まれる化合物にプロセシングまたは改変されうる化合物を含む、
    請求項1に記載の方法。
  22. 前記遺伝子編集組成物が、（a）遺伝子編集タンパク質、（b）RNA分子、および/または（c）リボヌクレオタンパク質（RNP）のうちの1つまたは複数を含む、請求項1に記載の方法。
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