JPH05276928A

JPH05276928A - 細胞培養試験用基材およびその製造方法

Info

Publication number: JPH05276928A
Application number: JP4095919A
Authority: JP
Inventors: Manabu Yamazaki; 学山崎; Yuichi Mori; 森　　有一; Michiko Tsuchida; 路子土田
Original assignee: WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co
Priority date: 1992-03-23
Filing date: 1992-03-23
Publication date: 1993-10-26

Abstract

(57)【要約】【目的】細胞の接着性、増殖性、機能維持、分化の発現
など、その使用目的にあった培養基材を簡単に判定でき
る細胞培養試験用基材およびその製造方法を提供するこ
と。【構成】細胞接着性物質が基材表面に固定されている細
胞培養試験用基材であって、該細胞接着性物質が架橋さ
れており、その架橋の程度が異なる複数の部分からなる
ことを特徴とする細胞培養試験用基材。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞培養に適した基材
を簡単に判定することができる細胞培養試験用基材に関
する。さらに詳しくは、接着依存性細胞の接着、増殖
性、機能性維持や、分化の誘発など、その使用目的に適
した細胞培養用基材を簡単に判定することができる細胞
培養試験用基材に関する。また、本発明はかかる細胞培
養試験用基材の製造方法にも関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、細胞培養技術は、１）細胞産生物
の生産、２）生体病変部や欠損部へ補綴材、３）薬剤の
毒性および薬理活性評価用のシュミレーターなどの分野
で、研究、応用されている。

【０００３】今日、細胞培養に用いられている動物細胞
は２種類に分類される。即ち、接着非依存性細胞（anch
orage independent cells）と接着依存性細胞（anchora
gedependent cells）である。前者の接着非依存性細胞
は、生存、増殖、物質産生能などの細胞機能が細胞の足
場である基質が存在しなくても正常に発現される細胞で
ある。典型的な例としてミエローマ細胞、リンホーマ細
胞などから形成されるハイブリドーマが挙げられる。

【０００４】一方、後者の接着依存性細胞は、生存、増
殖、物質産生などの細胞機能が細胞の足場である基質が
存在しなくては正常に発現されない細胞である。初代培
養細胞をはじめとした正常二倍体細胞の大部分は接着依
存性である。さらに無限に増殖可能な樹立細胞系にも、
接着依存性を示すものが数多く知られている。例えば、
インターフェロン、インターロイキンなどのサイトカイ
ン類、エリスロポエチン、コロニー・ステュミレイティ
ング・ファクター、トロンボボエチンなどの各種分化成
長ホルモン、ティッシュ・プラスミノーゲン・アクチべ
ーター、ワクチンなどの有用な細胞産生物を生産する樹
立細胞系にも接着依存性を示すものが多く知られてい
る。従って、これら有用な細胞産生物の生産のためにも
接着依存性細胞の培養技術の確立は非常に重要である。

【０００５】一般に細胞を物質生産のために利用する場
合、細胞の機能を生体内の状態と同じレベルで維持し、
かつ高密度に培養することが重要である。このような分
野において、従来接着依存性動物細胞の培養は、ガラ
ス、プラスチック製のシャーレ、試験管、培養ビンなど
を用いて行われてきた。また、最近マイクロキャリアや
中空糸を培養用基材として用い、より高密度の培養や長
期の培養を行う試みがなされつつある。接着依存性動物
細胞を培養用基材上に接着させ、増殖させるには、該基
材表面と細胞の接着性が良好であるとともに、接着した
細胞の形態、配列が、細胞の伸展、増殖に適した状態に
なっていることが必要である。しかしながら、従来から
細胞培養用基材として用いられている高分子材料、特に
ポリスチレンは、賦形性、耐久性、透明性、無毒性、低
コストの点で優れているものの、ポリスチレン表面は疎
水性のため、上記接着性の点に関して不適当であった。
そこで、ポリスチレン表面をコロナ放電処理することに
より表面にのみ陰イオン基を導入し、親水性を付与する
ことにより、細胞の接着性、増殖性を改善した細胞培養
用基材が開発され広く用いられている。しかしながら、
この程度の改善では細胞のもつ特異的な機能を発現さ
せ、かつ、それを長期間維持させることは困難であるこ
とがわかってきた。そこで最近では、培養細胞の環境
を、細胞が生体内に存在するときと同じ状態にできるだ
け近づけることにより、細胞の接着、増殖、分化、物質
産生などの機能を向上させる研究が行われて来た。すな
わち、細胞外マトリクスを培養用基材表面に固定する方
法である。

【０００６】ところで、生体内での細胞外マトリクスの
機能についての研究が近年急速に進み、従来から知られ
ていた細胞を支持、固定化するという単純な受動的な役
割だけではなく、細胞の機能を能動的に制御する機能も
有していることがわかってきた。

【０００７】例えば、細胞外マトリクスの主成分である
コラーゲンには１０種以上あることが発見されており、
それぞれのコラーゲンは決まった細胞によって合成さ
れ、一定の組織に局在し、そして異なる細胞機能を制御
する役割を有していることが解明されつつある。また、
同一タイプのコラーゲンでも、高次構造の変性あるいは
種々の官能基を導入するなどの改質によっても細胞機能
に影響があることがわかってきた。

【０００８】また、細胞外マトリクスの第２成分であ
る、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プ
ロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどは、コラー
ゲンおよび細胞膜に対して特異的な結合部位を有し、細
胞の基質への接着に重要な役割を果たしている。なお、
接着性タンパク質はそれぞれ一定種の細胞、コラーゲン
に特異的に結合する。例えば、フィブロネクチンは主と
して繊維芽細胞およびI型、II型のコラーゲンに、ラミ
ニンは上皮、内皮細胞およびIV型コラーゲンにそれぞれ
特有の結合部位を有している。さらに上記の細胞外マト
リクス以外にも細胞機能に大きな影響を与えるものとし
てコラーゲンの熱変性物であるゼラチン、細胞膜上の糖
鎖に特異的に結合するレクチン、フィブロネクチンなど
の結合部位である接着性オリゴペプチド、イガイから得
られた細胞接着タンパク質などが知られている。上記の
細胞の接着、増殖を制御する因子を培養用基材に組合せ
た例としては、コラーゲンをコートした培養用基材（K.
Yoshizato.et al..Annals ofPlastic Surgery. Vol.13,
No.1, 1984年7月）、またフィブロネクチンをコートし
た基材（F.Grinnell.Expl.Cell Res.,102.51.1984）、
またイガイから得られた細胞接着蛋白をコートした基材
（P.T.Picciano.et al, In Vitro Cellularand Develop
mental Biology 22(3).24A.1986）などが開発され、細
胞接着および増殖効果の改善が認められている。さらに
は生体由来の細胞外マトリクスの代わりにガラクトース
末端を側鎖に有するポリスチレンをコートした基材（赤
池敏宏ら、人工臓器、17,227, 1988）が開発され、特に
肝細胞の接着性の向上および生存性の維持が認められて
いる。従来、培養条件が厳しく接着が非常に困難であっ
た細胞も上記したような方法で表面を処理した培養用基
材を用いることによって培養が可能になってきた。以上
述べてきた基材のほとんどが、既に市販されており、こ
の他にも現在研究が進行しているものもいくつかある。
しかしながら、これらの基材を用いても生体内で細胞が
持っていた機能をすべて再現することは不可能であっ
た。その原因の一つは、前にも述べたように、細胞外マ
トリクスの高次構造の変化である。コラーゲンを例にと
ると、生体内と同じ高次構造を形成させたときと、熱や
紫外線で変性させて、高次構造形成能を消失させた場合
では、細胞の形態や増殖能に差があることが知られてい
る（K. Toshizato, et al.,Biomedical Research, Vol
9, No.1, 33-45, 1988）。しかしながら、基材表面に固
定された細胞外マトリクスの高次構造を生体外で再現す
ることは必ずしも容易なことではないし、それを再現性
良く実現することはかなり困難なことである。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、現在
ではさまざまな分野で細胞培養技術が利用されており、
その使用目的もまた多岐にわたっている。しかしなが
ら、一般に細胞はその増殖性が抑制されると機能の発現
・分化の誘発が促進され、逆に増殖性が促進されると機
能の発現・分化の誘発が抑制されるといわれている。こ
のため、細胞の増殖性と機能の発現・分化の誘発性を同
時に満足させることは困難であった。そこで、使用目的
にあった適切な培養用基材を選択し、細胞の増殖性と機
能の発現・分化の誘発性を程よく制御することが、細胞
培養技術を有効に利用するための重要なポイントの１つ
となっている。しかし、たとえ使用目的が同じであって
も、用いる細胞の種類が異なればその細胞にとって最適
な条件も異なるのが一般的であるため、最も適した細胞
培養用基材を選択することは容易なことではない。

【００１０】現在までのところ、用いようとしている個
々の細胞にとって最適な細胞培養用基材を簡単に判定で
きる細胞培養試験用基材は開発されるに至っていない。
そこで、本発明は、細胞の接着性、増殖性、機能維持、
分化の発現など、その使用目的にあった培養基材を簡単
に判定できる細胞培養試験用基材およびその製造方法を
提供することを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記目的は、細胞接着性
物質が基材表面に固定されている細胞培養試験用基材で
あって、該細胞接着性物質が架橋されており、その架橋
の程度が異なる複数の部分からなることを特徴とする細
胞培養試験用基材を提供することにより達成された。

【００１２】本発明の細胞培養試験用基材に使用する細
胞接着性物質は、試料として与えられた細胞を変性する
ことなく接着する物質を１以上含み、コラーゲンを５０
％以上含有するものを意味する。細胞を変性させること
なく接着する物質としては、コラーゲン、フィブロネク
チン、ビトロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、
グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリクス成分や、
コラーゲンの熱変性物質であるゼラチンやその他コラー
ゲン誘導体、細胞膜上の糖鎖に親和力を有するコンカナ
バリンＡなどのレクチン、イガイ由来の接着タンパク
質、フィブロネクチンと細胞との接着部位に対応する接
着性オリゴペプチドなどがあげられる。一方、細胞接着
性物質に含有させることができるコラーゲンの種類は、
特に限定されない。したがって各種タイプのコラーゲン
やそれらの混合物を広く用いることができる。

【００１３】本発明の細胞培養試験用基材に固定されて
いる細胞接着性物質の量は、培養する細胞に適した量で
あれば特に限定されない。しかしながら、一般に細胞接
着性物質は非常に高価であるため、経済性を考慮すれば
固定量は１,０００μg/cm²以下にするのが好ましい。

【００１４】本発明の細胞培養試験用基材は、細胞接着
性物質の架橋の程度が異なる複数の部分からなることが
必要である。上述したように、細胞の形態や増殖性は細
胞外マトリクスの高次構造を変えることによってコント
ロールすることができる。その細胞外マトリクスの高次
構造は、細胞接着性物質に適度の架橋を導入することに
よって制御することができる。このため、本発明の細胞
培養試験用基材のように架橋の程度が異なる複数の部分
を基材表面に設けておき、その上で細胞の培養試験を行
えば、使用目的にあった高次構造を簡単に選択すること
ができる。

【００１５】本明細書において使用する「複数の部分」
という言葉は、２箇所以上であればよいが、通常は２〜
１０箇所程度であるのが望ましい。さらに望ましいの
は、４〜８箇所である。

【００１６】本発明の細胞培養試験用基材の製造方法は
特に制限されないが、本発明の製造方法にしたがえば効
率良く製造することができる。本発明の製造方法は、
（ａ）培養試験用基材表面に細胞接着性物質を含有する
層を形成する工程、（ｂ）架橋の程度が異なる複数の部
分を形成するように、細胞接着性物質に架橋を導入する
工程からなる。

【００１７】工程（ａ）では、キャスト法やディップ法
など層を形成させることができる方法を広く採用するこ
とができる。

【００１８】工程（ｂ）において細胞接着性物質に架橋
を導入する方法は特に限定されるものではなく、一般に
用いられる方法であればいかなる方法を用いてもよい。
例えば、グルタールアルデヒドなどを用いた化学処理
法、オゾン処理法、紫外線処理法、電子線処理法、プラ
ズマ処理法などを用いることができるが、操作の簡便さ
および経済性を考慮すれば、化学処理法や紫外線処理法
が適していると思われる。また、細胞接着性物質の架橋
の程度が異なる複数の部分を形成させるには、紫外線処
理法、電子線処理法、プラズマ処理法が適していると思
われる。

【００１９】紫外線処理法を用いる場合には、紫外線が
透過する部分と透過しない部分から構成されるマスク
（図１）を用いて、紫外線を照射し架橋を導入すること
が望ましい。また、紫外線透過部分の透過率が異なる複
数の部分からなる単一のマスクを用いてもよい（図
２）。前者のマスクを使用する場合は、紫外線が透過す
る位置や紫外線の照射量を変えて紫外線照射を複数回行
う。また、後者のマスクを使用する場合は紫外線照射は
１回で済ませてもよいし、紫外線強度を変えながら複数
回行ってもよい。紫外線の照射量（照射強度×照射時
間）は、細胞接着性物質の種類によって異なるが、コラ
ーゲンを例にとると２５４nmの紫外線で２,５００J/m²
以上の照射量があればほぼ１００％架橋が導入されると
考えられる。したがって、２,５００J/m²以下で照射量
をコントロールすることによって、細胞接着性物質の架
橋の程度を調節することができる。なお、紫外線の波長
は、使用する細胞接着性物質を架橋するのに適した波長
を用いるのが望ましい。

【００２０】以上述べたように、本発明の細胞培養試験
用基材は、固定されている細胞接着性物質の架橋の程度
が異なる複数の部分からなるために、細胞の接着性、増
殖性、特異的な機能維持、分化の誘発など、その使用目
的に最も適した基材の条件を簡単に判定できるところに
特徴がある。さらに、本発明の細胞培養試験用基材の製
造方法によれば、性能が安定した細胞培養試験用基材を
簡便かつ経済的な方法で製造することができる。

【００２１】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的
に説明する。本発明の範囲は特許請求の範囲により特定
されるものであり、以下の実施例により限定されるもの
ではない。実施例１１．コートディッシュの作製０.５％（ｗ／ｖ）牛真皮ペプシン可溶化タイプＩコラ
ーゲン溶液（ｐＨ３）（KOKEN CELLGEN I-PC,（株）高
研製）４００μｌを、市販のφ３５mmディッシュ（Falc
on #3001、日本ベクトン製）に分注し、すばやく均一に
のばしてコーティングした。その後、１０℃のインキュ
ベーター内で約５時間乾燥させた。乾燥後のコート層の
厚みは約２μｍであった。また、ディッシュには、あら
かじめ面積が均等に４分割になるような線を引いておい
た。

【００２２】次に、図１に示すような４分割した中の１
つの場所だけが紫外線が透過できるような窓をもったマ
スクをつくり、これをディッシュにのせて紫外線照射装
置（ＸＸ−１００、波長２５４nm、フナコシ製）で紫外
線を照射した。同様の操作を、マスクの紫外線透過部分
の位置を変えて３回行った。このときの紫外線照射エネ
ルギーは表１に示す値とした。以上のような手順で作製
したディッシュを用い、以下に示すような実験を行っ
た。

【００２３】表１ ───────────────────────────────── エリアＮｏ．紫外線照射量（Ｊ／ｍ²） ───────────────────────────────── １０２１,０００３２,０００４５,０００ ───────────────────────────────── ２．培養評価実験ヒト真皮由来の線維芽細胞をダルベッコ改変イーグル培
地（Ｄ−ＭＥＭ、１０％牛胎児血清含有、ＧＩＢＣＯ社
製）を用いて、最終細胞濃度が、５×１０⁴細胞／ｍｌ
になるように細胞分散液を作成し、３７℃に保温した。
この細胞分散液の２ｍｌを上記の方法で作製したサンプ
ルディッシュに注入した。これを素早く３７℃の炭酸ガ
スインキュベーター（５％炭酸ガス）に移し培養した。
また、対照としてコラーゲンをコートしていないディッ
シュも一緒に評価した。なお、培養液の交換は、１週間
に２回の割合で行った。

【００２４】細胞の形態および接着性、増殖性を位相差
顕微鏡下で観察した。細胞播種後２時間目では、対照
（コラーゲンをコートしていないディッシュ）、エリア
３（紫外線を２,０００Ｊ／ｍ²照射した部分）、エリア
４（紫外線を５,０００Ｊ／ｍ²照射した部分）では細胞
は伸展を開始しているにもかかわらず、エリア１（紫外
線未照射部分）、エリア２（紫外線を１,０００Ｊ／ｍ²
照射した部分）では細胞はまったく伸展してなかった。
その後、培養日数１日目、２日目、４日目にも観察を行
った。エリア１、２、３、４の順に細胞の増殖性が良く
なっていた。エリア４と対照は、ほぼ同じレベルであっ
た。培養日数７日目では、やはりエリア１、２、３、４
の順に細胞の増殖性がよく、エリア４と対照は１００％
コンフルエントに達していた。しかしながら、エリア１
では３０％コンフルエント程度、エリア２では６０％コ
ンフルエント程度の増殖性であった（図３）。

【００２５】一般に、細胞の増殖性が抑制されると細胞
の機能発現、分化の誘発が促進されるといわれている。
したがって、この実験に用いた細胞では、機能または分
化の発現を細胞培養の目的とするならば、エリア１また
はエリア２の基材が適しており、増殖を目的とするなら
ば、エリア４の基材が適していると簡単に判定すること
ができた。

【００２６】

【発明の効果】本発明の細胞培養試験用基材は、基材表
面に固定されている細胞接着性物質の架橋の程度が異な
る複数の部分を有しているため、細胞の接着性、増殖
性、特異的な機能維持、分化の誘発など、その使用目的
に最も適した基材の条件を簡単に判定することができ
る。さらに本発明の細胞培養試験用基材の製造方法によ
れば、性能が安定した細胞培養試験用基材を簡便かつ経
済的な方法で製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の製造方法の一実施態様において使用す
る紫外線透過マスクを示したものである。ａ：紫外線透過部分ｂ：紫外線不透過部分

【図２】本発明の製造方法の一実施態様において使用す
る紫外線透過マスクを示したものである。ｃ：紫外線不透過部分ｄ：紫外線透過率２０％部分ｅ：紫外線透過率４０％部分ｆ：紫外線透過率１００％部分

【図３】細胞播種２時間後、１日後、２日後、４日後、
７日後の細胞の接着性、増殖性およびそのときの細胞の
形態を示す位相差顕微鏡写真である。 Blank ：対照（コラーゲンをコートしていないディッ
シュ） Area １：紫外線未照射部分 Area ２：紫外線を１,０００Ｊ／ｍ²照射した部分 Area ３：紫外線を２,０００Ｊ／ｍ²照射した部分 Area ４：紫外線を５,０００Ｊ／ｍ²照射した部分２ hours：細胞播種２時間後 Day １：細胞播種１日後 Day ２：細胞播種２日後 Day ４：細胞播種４日後 Day ７：細胞播種７日後

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者土田路子神奈川県厚木市戸室671−１ＳＡＴＩＩＩＡＴＳＵＧＩ 306

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞接着性物質が基材表面に固定されてい
る細胞培養試験用基材であって、該細胞接着性物質が架
橋されており、その架橋の程度が異なる複数の部分から
なることを特徴とする細胞培養試験用基材。
【請求項２】（ａ）培養試験用基材表面に細胞接着性物
質を含有する層を形成する工程、（ｂ）架橋の程度が異
なる複数の部分を形成するように、細胞接着性物質に架
橋を導入する工程からなる請求項１の細胞培養試験用基
材の製造方法。