JP2022551219A - レンチウイルスベクターの製造方法および構築物 - Google Patents
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Abstract
本開示は、レンチウイルスベクター産生細胞を産生するための方法に関する。特に、この方法は、必要なパッケージングエレメントを提供し、ベクターを細胞にトランスファーするために、４つではなく２つのプラスミドを利用し、懸濁ベースの細胞を含む多数のレンチウイルス産生細胞の産生、および大量のレンチウイルスの産生を可能にする。これらの方法は、後にレンチウイルスを産生するために誘導され得る細胞の産生を可能にし、特定の目的遺伝子を含むように調整され得る。【選択図】図１
Description
本開示は、レンチウイルスベクター産生細胞を産生するための方法に関する。特に、この方法は、必要なパッケージングエレメントを提供し、ベクターを細胞にトランスファーするために、４つではなく２つのプラスミドを利用し、懸濁ベースの細胞を含む多数のレンチウイルス産生細胞の産生、および大量のレンチウイルスの産生を可能にする。これらの方法は、後にレンチウイルスを産生するために誘導され得る細胞の産生を可能にし、特定の目的遺伝子を含むように調整され得る。
レンチウイルスベクターは、遺伝子および細胞療法の分野において最も一般的に使用される送達方法の１つである。レンチウイルスベクターの生産プロセスでは、ベクターの生産に必要な配列をいくつかの異なるプラスミドまたは発現カセットに分割し、複製能を有するレンチウイルス（ＲＣＬ）が製造される可能性を最小限に抑える。一般に、第３世代レンチウイルス生産システムは、発現する４つの別々のプラスミドまたは発現カセットを利用する：
１）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子とレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）タンパク；
２）エンベロープタンパク（通常は水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ））；
３）ビリオンタンパク（Ｒｅｖ）タンパクの発現のＨＩＶレギュレーター；および
４）目的遺伝子（ＧＯＩ）を含むトランスファーベクター（ＴＶ）。
１）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子とレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）タンパク；
２）エンベロープタンパク（通常は水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ））；
３）ビリオンタンパク（Ｒｅｖ）タンパクの発現のＨＩＶレギュレーター；および
４）目的遺伝子（ＧＯＩ）を含むトランスファーベクター（ＴＶ）。
最も一般的なアプローチでは、上記の４つのプラスミドを一時的に細胞にトランスフェクトしてレンチウイルスベクターを作製するが、これは労力がかかり、費用もかかる。さらに、一過性のトランスフェクションは、大量のプラスミドＤＮＡを必要とするため、スケーラビリティに限界があり、安全性の懸念も生じている。
一過性トランスフェクションに伴う困難を克服するために必要なのは、レンチウイルスベクターの製造に必要な遺伝子または配列のすべてまたは大部分が、簡単な誘導法によりレンチウイルスベクターの製造を可能にする哺乳動物細胞の染色体に安定的に組み込まれるプロデューサー細胞株（ＰＣＬ）を調製する方法である。この発明は、このようなニーズに応えるものである。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を作製する方法であって、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子と、をコードする発現カセットを含むパッケージングベクターにより、哺乳動物細胞をトランスフェクトすることであって、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって発現カセットが５’末端と３’末端の両方に隣接している、トランスフェクトすることと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を単離することと、を含む方法である。
また、本明細書で提供されるのは、レンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を作製する方法であって、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子と、をコードする発現カセットを含むパッケージングベクターであって、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって発現カセットが５’末端と３’末端の両方に隣接しているパッケージングベクターと、第４のプロモーターの制御下にある目的遺伝子をコードする核酸配列を含むトランスファーベクターであって、核酸配列は、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって５’末端および３’末端の両方に隣接しているトランスファーベクターとにより、哺乳動物細胞をトランスフェクトすることと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を単離することと、を含む、方法である。
さらなる実施形態において、本明細書により提供されるのは、本明細書に記載の方法に従ってレンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を産生することと、第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする核酸配列を含むトランスファーベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクトすることと、発現カセットおよび核酸の産生を誘導することと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを回収する工程を含む、レンチウイルスベクターを産生する方法である。
また、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の方法に従ってレンチウイルスベクター製造哺乳動物細胞を産生することと、発現カセットおよび核酸の産生を誘導することと、哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを回収することと、を含む、レンチウイルスベクターを製造する方法である。
さらなる実施形態において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の方法に従って産生されたレンチウイルスベクターを哺乳動物対象に投与することを含む、レンチウイルスベクターによる治療方法である。
さらなる実施形態において、本明細書で提供されるのは、レンチウイルスベクターを産生する哺乳動物細胞であって、哺乳動物細胞において染色体に組み込まれた核酸分子であって、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子とを含む、核酸分子を含み、核酸配列がトランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）の組換えから生じる配列によって５’末端および３’末端の両方に隣接している、哺乳動物細胞である。
また、本明細書で提供されるのは、レンチウイルスベクターを産生する方法であって、本明細書に記載の哺乳動物細胞をトランスファーベクターでトランスフェクトすることであって、トランスファーベクターは第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする核酸配列を含む、トランスフェクトすることと、発現カセットおよび核酸の産生を誘導することと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを回収することを含む方法である。
さらなる実施形態において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の哺乳動物細胞の目的遺伝子をコードする染色体に組み込まれた核酸配列および染色体に組み込まれた核酸配列の産生を誘導することと、哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを回収することを含む、レンチウイルスベクターを産生する方法である。
特許請求の範囲および／または本明細書において、用語「含む」と共に使用される場合の、語句「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味し得るが、それはまた、「１つ以上」、「少なくとも１つ」および「１つまたはそれ以上」の意味と一致する。
本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、その値を決定するために使用される方法／装置についての誤差の固有の変動を含むことを示すために使用される。典型的には、この用語は、状況に応じて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％の変動を包含することを意味する。
請求項中の「または」という用語の使用は、明示的に選択肢のみに言及することが示されない限り、「および／または」を意味するために使用されるか、または、その選択肢は相互に排他的であるが、開示は、選択肢のみおよび「および／または」に言及する定義を支持する。
本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、用語「備えること」（ならびに「備える（comprise）」および「備える（comprises）」などの任意の形態を含む）、「有すること」（ならびに「有する（have）」および「有する（has）」などの任意の形態を有する）、「含むこと」（ならびに「含む（includes）」および「含む（include）」などの任意の形態を含む）または「含有すること」（ならびに「含有する（contains）」および「含有する（contain）」などの任意の形態を含む）は、包含的またはオープンエンドであり、追加の、非列挙の、エレメントまたは方法ステップを除外しない。本明細書で考察される任意の実施形態は、本発明の任意の方法、システム、宿主細胞、発現ベクター、および／または組成物に関して実施できることが考慮される。さらに、本発明の組成物、システム、細胞、および／または核酸を使用して、本明細書に記載の方法のいずれかを達成することができる。
本明細書で使用される場合、「核酸」、「核酸分子」、または「オリゴヌクレオチド」は、共有結合したヌクレオチドを含む高分子化合物を意味する。「核酸」という用語は、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、これらはいずれも一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、限定されるわけではないが、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、プラスミドまたはベクターＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含む。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＭＩＲＮＡを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのアッセンブリを指し、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸分子を含む。「遺伝子」はまた、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列として作用し得る核酸フラグメントを指す。いくつかの実施形態において、遺伝子は、複数の複製と統合される。いくつかの実施形態において、遺伝子は、予め定義された複製数で統合される。
レンチウイルスベクターとそれらの製造
レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ‐１）に基づく良く研究されたベクター系である。他のレンチウイルス系も遺伝子トランスファー系として開発されており、ＨＩＶ－２サル免疫不全ウイルス、非霊長類レンチウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、牛免疫不全ウイルスなどがある。ヒトにおけるＨＩＶ－１の病原性による安全性への懸念から導かれる、臨床および研究開発の目的で使用される最も広く使用されているレンチウイルス系は、
１）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子とレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）タンパク、
２）エンベロープタンパク（通常は水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ））、
３）ビリオンタンパク（Ｒｅｖ）タンパクの発現のＨＩＶレギュレーター、および
４）目的遺伝子（ＧＯＩ）を含有するトランスファーベクター（ＴＶ）、
を発現する４プラスミド系に基づくものである。
レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ‐１）に基づく良く研究されたベクター系である。他のレンチウイルス系も遺伝子トランスファー系として開発されており、ＨＩＶ－２サル免疫不全ウイルス、非霊長類レンチウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、牛免疫不全ウイルスなどがある。ヒトにおけるＨＩＶ－１の病原性による安全性への懸念から導かれる、臨床および研究開発の目的で使用される最も広く使用されているレンチウイルス系は、
１）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子とレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）タンパク、
２）エンベロープタンパク（通常は水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ））、
３）ビリオンタンパク（Ｒｅｖ）タンパクの発現のＨＩＶレギュレーター、および
４）目的遺伝子（ＧＯＩ）を含有するトランスファーベクター（ＴＶ）、
を発現する４プラスミド系に基づくものである。
伝統的に、ヒト胚性腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）のような哺乳動物細胞は、付着細胞培養物として４つのプラスミドの各々でトランスフェクトされ、次いで、目的の遺伝子を含有する所望のレンチウイルスが産生される。一般に、これらの一時的にトランスフェクトされた細胞はレンチウイルスを産生することができる。
レンチウイルスベクターは、一般に、免疫不全症および神経変性疾患を含む療法および疾患療法のために所望の細胞に導入されるべき目的遺伝子を有して産生される。
本発明は、レンチウイルスを生産する改良された方法を提供し、これには、懸濁液中で増殖させることができ、レンチウイルスの生産量を著しく増加させることができるレンチウイルス生産細胞株を調製する方法が含まれる。
レンチウイルス産生細胞株
実施形態では、本明細書において、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を産生する方法が提供される。本明細書で使用される場合、「レンチウイルスパッケージングベクター含有細胞」は、そのゲノムに組み込まれた、レンチウイルスベクターを産生するのに必要なエレメントを含有するが、レンチウイルスベクターによって担持されるべき所望の目的遺伝子を欠く細胞を指す。レンチウイルスパッケージングベクター含有細胞は、後に、目的遺伝子を含有する、例えば、トランスファーベクターでトランスフェクトし、次いで目的遺伝子を最終的に送達するために所望のレンチウイルスを産生するように誘導することができる。
実施形態では、本明細書において、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を産生する方法が提供される。本明細書で使用される場合、「レンチウイルスパッケージングベクター含有細胞」は、そのゲノムに組み込まれた、レンチウイルスベクターを産生するのに必要なエレメントを含有するが、レンチウイルスベクターによって担持されるべき所望の目的遺伝子を欠く細胞を指す。レンチウイルスパッケージングベクター含有細胞は、後に、目的遺伝子を含有する、例えば、トランスファーベクターでトランスフェクトし、次いで目的遺伝子を最終的に送達するために所望のレンチウイルスを産生するように誘導することができる。
適切には、本明細書に記載される種々の方法を用いて産生され得る細胞は、哺乳動物細胞および細胞株または培養物である。本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物細胞」は、哺乳動物目の任意のメンバー、例えば、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、サル細胞、ハムスター細胞などの由来の細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯＫ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、すべての変異体（例えば、ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）Lonza, Slough, UK）を含むＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、すべての変異体（例えば、ＸＣＥＥＤ（商標）Lonza, Slough, UK）を含むＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ（グルタミンシンテターゼノックアウト）細胞である。例示的なヒト細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ細胞、またはＨＴ１０８０細胞などのヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞を含む。
哺乳動物細胞は、接着性培養物または懸濁培養物のいずれかであり得る哺乳動物細胞培養物を含む。接着性培養物は、基材表面、例えば、プラスチックプレート、ディッシュまたは他の適切な細胞培養増殖プラットホーム上で増殖される細胞を指し、固定依存性であり得る。懸濁培養物とは、例えば、ガスおよび栄養交換のための大きな表面積を可能にする培養フラスコまたは大きな懸濁バット中で維持され得る細胞を指す。懸濁細胞培養物は、適切な混合を提供するために、撹拌または撹拌機構を利用することが多い。懸濁液中に細胞を維持するための培地および条件は、当技術分野において一般的に公知である。例示的な懸濁細胞培養物は、ヒトＨＥＫ２９３クローン細胞を含む。
実施形態では、本明細書に記載の方法は、発現カセットを含むパッケージングベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクトすることを含む。本明細書で使用される場合、「ベクター」または「発現ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどのレプリコンであり、本明細書に記載される核酸分子は、細胞内で結合した核酸分子の複製および／または発現をもたらすために結合され得る。「ベクター」は、エピソームベクター（例えば、プラスミド）および非エピソームベクターを含む。「ベクター」という用語は、核酸分子をインビトロ、インビボまたはエクスビボで細胞に導入するためのウイルスおよび非ウイルスの両方の手段を含む。ベクターという用語は、合成ベクターを含むことができる。ベクターは、トランスフェクション、形質導入、細胞融合およびリポフェクションを含むがこれらに限定されない公知の方法によって所望の宿主細胞に導入され得る。ベクターは、プロモーターを含む種々の調節エレメントを含むことができる。
本明細書で使用される「トランスフェクション」は、ベクターを含む外因性核酸分子の細胞への導入を意味する。「トランスフェクトされた」細胞は、細胞内の外因性の核酸分子を含み、「形質転換された」細胞は、細胞内の外因性の核酸分子が細胞の表現型変化を誘発するものである。トランスフェクトされた核酸分子は、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むことができ、および／または一時的に、または長期間、染色体外に、細胞によって維持することができる。外因性核酸分子またはフラグメントを発現する宿主細胞または生物は、「組換え」、「形質転換」、または「トランスジェニック」生物とよばれる。多くのトランスフェクション技術が、当技術分野において一般的に知られている。例えば、Graham et al., Virology, 52:456 (1973); Sambrook et al., MolecularCloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York (1989);Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); および Chu et al., Gene 13:197 (1981) を参照のこと。適切には、哺乳動物細胞を本明細書に記載のベクターの１つ以上でトランスフェクションすることは、核酸を宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むために、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのトランスフェクション剤または種々の脂質およびポリマーを含む他の適切な薬剤を利用する。
本明細書で使用する場合、「パッケージングベクター」とは、レンチウイルスベクターを産生するのに必要な成分を含有し、最終的なレンチウイルスに目的遺伝子を「パッケージング」するベクターを指す。パッケージングベクターは、ベクターの別個の構成要素を指す発現カセットを含み、トランスフェクトされた細胞に挿入され、最終的にそれによって発現される１つ以上の遺伝子および調節配列を含む。
適切には、パッケージングベクターに使用される発現カセットは、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子と、を含む。他の実施形態では、単一のプロモーターは、ＲＥＶ、ＥＮＶ、ＧＡＧおよびＰＯＬ遺伝子の各々の発現を制御することができ、または１つのプロモーターは、ＧＡＧおよびＰＯＬの発現を制御することができ、第２のプロモーターは、発現またはＲＥＶおよびＥＮＶを制御する。他の組合せも可能であり、本明細書に含まれる。
ビリオンタンパク（ＲＥＶ）の発現のレンチウイルスレギュレーターは、後期遺伝子発現を促進するＲＮＡ結合タンパクである。ウイルスの構造タンパクをコードする、スプライシングされていないあるいは単独スプライシングされたｍＲＮＡの核から細胞質への輸送にも重要である。
レンチウイルスエンベロープ（ＥＮＶ）遺伝子は、適切には水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子であり、細胞プロテアーゼによって表面（ＳＵ）エンベロープ糖タンパクｇｐ１２０と膜貫通（ＴＭ）糖タンパクｇｐ４１に切断されるポリタンパク前駆体をコードする。
ＧＡＧはポリタンパクをコードし、スプライシングされていないｍＲＮＡから翻訳されたポリタンパクがウイルスプロテアーゼ（ＰＲ）によってマトリックスタンパク、キャプシド、ヌクレオカプシドタンパクへと切断される。レンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）は、ＧＡＧｍＲＮＡ翻訳時のリボソームフレームシフトの結果としてＧＡＧ－ＰＯＬポリタンパクとして発現し、酵素タンパクである逆転写酵素、プロテアーゼ、およびインテグラーゼをコードする。これら３つのタンパクはウイルスゲノムとビリオン内で会合している。適切には、ＧＡＧ遺伝子はＨＩＶＧＡＧ遺伝子であり、ＰＯＬ遺伝子はＨＩＶ ＰＯＬ遺伝子である。
好適な実施形態において、発現カセットは、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）により５’末端および３’末端の両方に隣接している。本明細書に詳細に記載されるように、発現カセットを標的細胞のゲノムに特異的に組み込むことを可能にするのは、トランスポゾンＩＴＲ（対応するトランスポサーゼと組み合わせて）の使用である。
レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を製造するための方法は、さらに、所望の核酸（すなわち、発現カセット）を細胞のゲノムに組み込むことを可能にするために、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養し、次いで、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を単離することを含む。
トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養するための方法は、当該技術分野において公知であり、種々の細胞培養培地の使用、細胞の増殖および細胞のゲノムへの構築物の組み込みを促進するための適切なガス濃度／交換および温度制御を含む。
所望の細胞を単離する方法には、ふるい、フィルター装置、細胞選択装置および選別、細胞計数などを含む様々な濾過技術が含まれる。
本明細書に記載されるように、発現カセットの各成分は、プロモーターの制御下にある。本明細書で使用される場合、「制御下」とは、「プロモーター」、「プロモーター配列」、または「プロモーター領域」によって制御される遺伝子を指し、これは、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流側コードまたは非コード遺伝子配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域／配列を指す。言い換えれば、プロモーターと遺伝子は、操作可能な組合せにあるか、または操作可能に連結されている。本明細書において言及される場合、「操作可能な組合せで」、「操作可能な順序で」および「操作可能に連結された」という用語は、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク分子の合成を指向することができるプロモーターが産生されるような方法での核酸配列の連結を指す。用語はまた、機能性タンパクが産生されるような方法でのアミノ酸配列の連結を指す。
本開示のいくつかの実施例では、プロモーター配列は、転写開始部位を含み、バックグラウンド上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流側に延在する。いくつかの実施形態において、プロモーター配列は、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク結合ドメインを含む。真核生物のプロモーターは、「ＴＡＴＡ」ボックスと「ＣＡＴ」ボックスを含むことが多いが、必ずしもそうではない。誘導性プロモーターを含む種々のプロモーターを用いて、例えば、本開示の宿主細胞またはベクターにおいて遺伝子発現を駆動することができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは漏出性プロモーターではない、すなわち、プロモーターは、本明細書に記載される遺伝子産物のいずれも構成的に発現していない。本明細書に記載の他の実施形態において、プロモーターは、外部調節の影響とは無関係にｍＲＮＡ合成を開始する構成的プロモーターである。
適切には、発現カセット中の種々の遺伝子の転写を制御するために使用されるプロモーターは、抑制解除可能なプロモーターである。本明細書で使用する場合、「抑制解除可能なプロモーター」とは、機能的プロモーターと、機能的プロモーターの抑制を引き起こすためにリプレッサーエレメントに結合することができる追加のエレメントまたは配列とを含む構造を指す。「抑制」とは、プロモーターによる下流側のコード遺伝子または非コード遺伝子配列の転写開始の減少または阻害を指す。「リプレッサーエレメント」とは、プロモーターの活性を減少または阻害するように、プロモーター（またはプロモーターの近傍）に結合することができるタンパクまたはポリペプチドを指す。リプレッサーエレメントは、リプレッサーエレメントの基材または結合パートナーと相互作用することができ、その結果、リプレッサーエレメントはコンホメーション変化を起こす。このリプレッサーエレメントのコンホメーション変化は、リプレッサーエレメントがプロモーターを減少させるか阻害する能力を取り除き、その結果、プロモーターの「抑制解除」が起こり、それによってプロモーターが転写開始を進めることができるようになる。「機能的プロモーター」とは、リプレッサーエレメントの動作を欠くプロモーターであって、転写を開始することができるであろうプロモーターを指す。本発明の実施において使用することができる種々の機能的プロモーターは、当該技術分野において公知であり、例えば、ＰＣＭＶ、ＰＨ１、Ｐ１９、Ｐ５、Ｐ４０、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４Ｏｒｆ６、およびＶＡ）のプロモーターを含む。
抑制解除可能なプロモーターとして使用することができる例示的なリプレッサーエレメントおよびそれらに対応する結合パートナーは、当技術分野で公知であり、クミン酸遺伝子スイッチシステム（ＣｕＯオペレーター、ＣｙｍＲリプレッサーおよびクミン酸結合パートナー）（例えば、Mullick et al., "The cumate gene-switch: a system for regulatedexpression in mammalian cells," BMC Biotechnology 6:43 (1-18) (2006)を参照されたく、この開示は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれ、本明細書に記載される抑制解除可能なプロモーターシステムの開示を含む）および本明細書に記載されるＴｅｔＯ／ＴｅｔＲシステム（例えば、Yao et al., "Tetracycline Repressor, tetR, rather than thetetR-Mammalian Cell Transcription Factor Fusion Derivatives, RegulatesInducible Gene Expression in Mammalian Cells," Human Gene Therapy9:1939-1950 (1998)を参照されたく、この開示は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）。例示的な実施形態では、抑制解除可能なプロモーターは、機能的プロモーターおよび１つの２つのテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯまたはＴｅｔＯ２）のいずれかを含む。適切には、発現カセットは、テトラサイクリンリプレッサータンパクを含む、第１、第２および第３の抑制解除可能なプロモーターのリプレッサーエレメントをさらにコードする。
抑制解除可能なプロモーター系を示す模式図が、図１に提供され、本発明の実施形態による例示的パッケージングプラスミドを示す。ＴｅｔＯ配列を含むＣＭＶプロモーターを含む抑制解除可能なプロモーターが注目される（ＣＭＶ－ＴＯ）。ＣＭＶ－ＴＯ抑制解除可能なプロモーターは、ＲＥＶ、ＶＳＶ－ＧおよびＧＡＧ－ＰＯＬ遺伝子に操作可能に連結されて図示されており、すなわち、第１、第２および第３のプロモーターは、いずれも、好適な実施形態において、抑制解除可能なプロモーターであり得る。また、別のプロモーターシステムであるｈＰＧＫプロモーターの制御下にあるＴｅｔＲリプレッサーエレメントも図示されている。
テトラサイクリンリプレッサータンパク（ＴｅｔＲ－ＴｅｔＯ配列のリプレッサーエレメント）がＴｅｔＯ配列に結合すると、ＣＭＶプロモーターは抑制される。つまり、これらのプロモーターからの転写はほとんど、あるいはまったく起こらない。ＴｅｔＲ（適切にはドキシサイクリン（Ｄｏｘ））の結合パートナーが結合すると、ＴｅｔＲタンパクはコンホメーションを変化させ、ＴｅｔＯ配列から遊離し、機能的プロモーターは天然と同じように正常な転写処理を開始する。
図１に示すように、発現カセットは、リプレッサーエレメント、適切にはテトラサイクリンリプレッサータンパクをコードする配列に続くＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）配列をさらに含むことができる。ＫＲＡＢ配列（約７５アミノ酸）は、ヒトジンクフィンガータンパク１０からの転写抑制ドメインであり、リプレッサーエレメント、適切にはＴｅｔＲリプレッサーエレメントの増加した調節を提供する。ＫＲＡＢドメインは、ＤＮＡ結合ドメインによって鋳型ＤＮＡにつながれると、転写リプレッサーとして機能する。また、５’および３’ＩＴＲトランスポゾン配列の例示的な位置が示されている。前述のように、ＩＴＲ配列は、発現カセットの全体が上記の目的の細胞内に転位し、所望の遺伝子のすべてが宿主ゲノム内に挿入されることを可能にするように位置する。
例示的な実施形態では、発現カセットは、細胞のゲノムへのカセットの適切な組込みを決定するための１つ以上のレポーター遺伝子をさらに含む。本明細書において言及されるように、「レポーター遺伝子」は、その発現が容易に同定され測定され得る細胞に表現型を与える遺伝子である。いくつかの実施形態において、レポーター遺伝子は蛍光タンパク遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、レポーター遺伝子は、選択遺伝子を含む。本明細書中で言及されるように、用語「選択遺伝子」は、必須栄養素であるであろうものを欠く培地中で増殖する能力を与える酵素活性をコードする遺伝子の使用を指し、加えて、選択遺伝子は、選択遺伝子が発現される細胞上で抗生物質または薬物に対する耐性を付与し得る。選択遺伝子を用いて、宿主細胞に特定の表現型を与えることができる。宿主細胞が選択培地で増殖するために選択遺伝子を発現しなければならないとき、その遺伝子は正の選択遺伝子とよばれる。選択遺伝子は、特定の遺伝子を含む宿主細胞に対して選択するためにも用いることができ、この方法で用いられる選択遺伝子はネガティブ選択遺伝子とよばれる。例示的な実施形態では、選択遺伝子は、リプレッサータンパクに続くＫＲＡＢ配列の下流、および配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列の下流にも配置される。例示的な実施形態では、選択遺伝子は、例えば、ゲンタマイシン、チミジンキナーゼ、アンピシリン、プリンマイシン、および／またはカナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を含む抗生物質耐性遺伝子である。
本明細書に詳細に記載されるように、トランスポゾン特異的ＩＴＲの使用は、特異性、頻度および安定性が増大した標的細胞のゲノムへの発現カセットの挿入を可能にすることが決定されている。例示的な実施形態において、トランスポゾン特異的ＩＴＲは鱗翅目トランスポゾン（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））ＩＴＲである。
転移因子（トランスポゾン）は、細胞のゲノム中を移動することができ、トランスジェニック生物の生産のための遺伝子を挿入するのに有用である。鱗翅目トランスポゾンＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）は、多種多様な生物種のゲノム内を移動することができ、遺伝子導入ベクターに有用である。トランスポゾン構造は、内部反復（ＩＲ）、スペーサー、および両端の末端反復（ＴＲ）からなる複雑な反復配列と、トランスポサーゼをコードする単一のオープンリーディングフレームを含む。
鱗翅目の転移因子ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）は、もともと、自然発生バキュロウイルスプラーク形態突然変異体内の挿入を破壊する遺伝子として、ＴＮ－３６８イラクサギンウワバ細胞培養から単離された。ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）は、５’１３－ｂｐＴＲ（末端反復）と１９－ｂｐ ＩＲ（内部反復）の間に３－ｂｐのスペーサーを有し、３’ＴＲとＩＲの間に３１－ｂｐのスペーサーを有する非対称な末端反復構造を有する２４７５ｂｐの短い逆方向反復配列である。単一の２．１ｋｂのオープンリーディングフレームは、機能的トランスポサーゼをコードする（Cary et al., 1989; Fraser et al., 1983, 1995; Elick et al., 1996a;Lobo et al., 1999; Handler et al., 1998）。ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）は、独特のカットアンドペースト機構を介して転位し、挿入時に複製される５’ＴＴＡＡ３’標的部位のみに挿入し、正確に切り出してフットプリントを残さない（Elick et al., 1996b; Fraser et al., 1996; Wang and Fraser 1993）。
本明細書中に記載されるプラスミドおよび発現カセット中で使用され得る例示的な鱗翅目のトランスポゾン（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））ＩＴＲは、米国特許第７，１０５，３４３号に開示されるものを包含し、その開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
好適な実施形態において、パッケージングベクターによる哺乳動物細胞のトランスフェクションは、トランスポゾン特異的ＩＴＲを認識するトランスポサーゼの存在下で行われる。このトランスポサーゼは、標的哺乳動物細胞の細胞ゲノムへの発現カセットの転位を容易にする。トランスポサーゼは、活性酵素として、またはｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを含むトランスポサーゼをコードする核酸配列として、細胞に提供することができる。実施形態において、トランスポサーゼは鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポサーゼｍＲＮＡまたは鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポーズｃＤＮＡである。本明細書に記載されているように、鱗翅目トランスポゾン（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））ＩＴＲおよび対応する鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポサーゼを利用する転位の頻度は、適切には、少なくとも約１０－４である。
さらなる実施形態において、本明細書において、レンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を産生する方法が提供される。本明細書で使用される場合、「レンチウイルスベクター産生細胞」は、そのゲノムに組み込まれた、レンチウイルスベクターを産生するのに必要なエレメント、ならびにレンチウイルスベクターによって担持される所望の目的遺伝子を含有する細胞を指す。レンチウイルスベクター産生細胞を後に誘導して、目的遺伝子の最終的な送達のための所望レンチウイルスを産生させることができる。
レンチウイルスベクター産生細胞、特に哺乳動物細胞を産生する方法は、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーター、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子、およびともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子をコードする発現カセットを含むパッケージングベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクトすることを含む。
本明細書に記載されるように、発現カセットは、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）により５’末端および３’末端の両方に適切に隣接し、標的細胞への高転位を促進する。
本方法はさらに、第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする核酸配列を含む、トランスファーベクターで哺乳動物細胞をトランセクトすることを含む。発現カセットと同様に、目的の遺伝子をコードする核酸配列も、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって５’末端と３’末端の両方に適切に隣接しており、転位が増加する。実施形態では、トランスファーベクターおよびパッケージングベクターの両方を同時にトランスフェクトし、他の実施形態では、トランスファーベクターまたはパッケージングベクターを最初にトランスフェクトし、後に他のベクターをトランスフェクトすることができる。
トランスフェクション後、哺乳動物細胞を培養し、レンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を単離する。
レンチウイルスパッケージングベクター含有細胞と同様に、本明細書中で調製されたレンチウイルスベクター産生細胞は、レンチウイルスベクターを産生するために利用することができる所望のタイミングの前に、適切に保存される。適切な貯蔵技術および特性は当技術分野で公知であり、細胞の冷蔵または凍結、ならびにベクター産生の誘導前に細胞を懸濁状態に維持する他の方法を含むことができる。
本明細書に記載されるように、適切には、哺乳動物細胞は哺乳動物細胞培養物であり、実施形態では懸濁培養物である。実例細胞にはＨＥＫ２９３Ｔ細胞が含まれる。
レンチウイルスパッケージングベクター含有細胞の場合と同様に、発現ベクターの遺伝子には、適切には、ＨＩＶ ＧＡＧ遺伝子であるＧＡＧ遺伝子およびＨＩＶＰＯＬ遺伝子であるＰＯＬ遺伝子が含まれる。適切には、レンチウイルスエンベロープ遺伝子は水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である。
レンチウイルスベクター産生細胞に使用するための例示的なプロモーターは、当該技術分野で公知であり、抑制解除可能なプロモーターを含み、適切には、発現カセットは、第１、第２および第３の抑制解除可能なプロモーターのリプレッサーエレメントをさらにコードする。実施形態では、抑制解除可能なプロモーターは、機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含み、リプレッサーエレメントはテトラサイクリンリプレッサータンパクである。トランスポゾン特異的ＩＴＲを含む発現カセットのさらなる特徴を本明細書に記載する。
適切な実施形態では、レンチウイルスベクターに含まれる目的遺伝子は、治療目的の遺伝子である。本明細書で言及されるように、用語「目的遺伝子」または「ＧＯＩ」は、異種遺伝子を記述するために使用される。本明細書で言及されるように、用語「異種遺伝子」または「ＨＧ」は、コード配列または制御配列などの核酸配列に関連し、通常は一緒に結合されていない、および／または通常は特定の細胞に関連していない核酸配列、例えば遺伝子を示す。いくつかの実施形態において、異種遺伝子は、コード配列自体が天然に見出されない構築物である（例えば、天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子変異または天然に生じる突然変異事象は、本明細書で使用されるように、異種ＤＮＡを生じない。
本明細書において言及されるように、用語「治療目的の遺伝子」は、任意の機能的に関連するヌクレオチド配列を指す。したがって、本開示の治療目的の遺伝子は、治療標的細胞ゲノムに欠陥があるか欠損しているタンパクをコードするか、または所望の生物学的もしくは治療効果（例えば、抗ウイルス機能）を有する非天然タンパクをコードする任意の所望の遺伝子を含むことができ、または配列は、アンチセンスもしくはリボザイム機能を有する分子に対応することができる。治療目的の適切な遺伝子の代表的な（非限定的である）例には、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性および感染性疾患の治療に用いられるものが含まれ、それらには、ＡＩＤＳ、癌、神経疾患、心血管疾患、高コレステロール血症などの障害；各種貧血、サラセミアおよび血友病を含む各種血液障害；のう胞性線維症、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損、肺気腫などの遺伝的欠陥が含まれる。癌およびウイルス疾患のためのアンチセンス治療において有用であるいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡの翻訳開始部位（ＡＵＧコドン）の周りの配列に相補的な短いオリゴヌクレオチド）が、当技術分野において記載されており、また、治療目的の適切な遺伝子の実施例でもある。
図２は、目的遺伝子（例示目的のための増強緑色蛍光タンパク）を含む例示的なトランスファーベクターを示す。目的遺伝子は、プロモーター、適切には構成的プロモーター、この場合はＣＭＶプロモーターの制御下にある。また、５’および３’トランスポゾン配列の例示的な位置が示されている。前述のように、ＩＴＲ配列は、目的の遺伝子およびプロモーターを含む核酸の全体が目的細胞に移送され、所望の遺伝子のすべてが宿主ゲノムに挿入されることを可能にするように位置する。示されるように、例示的なトランスファーベクターはまた、選択遺伝子、この場合、目的遺伝子の下流側のブレオマイシン耐性遺伝子を含む。トランスファーベクターの付加エレメントを図２に示す。
さらなる実施形態において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるレンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を産生または提供し、次いで、第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする核酸配列を含む、トランスファーベクターで哺乳動物細胞にトランスフェクトすることを含む、レンチウイルスベクターを産生する方法である。細胞ゲノムへの目的遺伝子の導入に続いて、発現カセットおよび目的遺伝子をコードする核酸の産生が誘導される。次いで、細胞を培養し、最後に、目的遺伝子を含有するレンチウイルスベクターを回収する。
なおさらなる実施形態において、レンチウイルスベクターを産生する方法は、本明細書に記載のレンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を産生または提供することを好適に包含する。発現カセットの産生および目的遺伝子をコードする核酸が誘導される。次いで、細胞を培養し、最後に、目的遺伝子を含有するレンチウイルスベクターを回収する。
本明細書に記載の細胞を用いてレンチウイルスベクターを産生する方法は、単にレンチウイルスパッケージングベクターを含有するか、または、細胞ゲノムに組み込まれた目的遺伝子も含有するかにかかわらず、誘導が開始する時期および誘導が起こる条件を制御するだけでなく、大量のレンチウイルスベクターを産生するための機構を提供する。誘導は、適切には、リプレッサーエレメントと相互作用し、それによって抑制解除可能なプロモーターを抑制解除し、レンチウイルスベクターのパッケージングコンポーネントの産生を可能にする化学物質または薬剤の導入を含む。
本明細書に記載されているように、発現カセット中の各プロモーターは、適切には、機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含む抑制解除可能なプロモーターであり、リプレッサーエレメントはテトラサイクリンリプレッサータンパクである。上記実施形態において、パッケージングコンポーネントの誘導は、哺乳動物細胞にドキシサイクリンを添加することを含む。
本明細書に記載の方法は、細胞ゲノムへの所望の核酸配列の挿入の増加の結果としてのレンチウイルスベクターの生産量の増加、および大量生産を可能にする懸濁ベースの細胞培養を提供する。実施形態において、産生されるレンチウイルスベクターの量は、少なくとも約１０４、より適切には約１０５または約１０６形質導入ユニット／ｍＬであり、約１～５日間以内、適切には細胞の誘導後約２日間である。
本明細書に記載の細胞を用いる製造方法は、撹拌タンク、エアリフト、繊維、極細繊維、中空繊維、セラミックマトリックス、流動床、固定床、および／または噴出床バイオリアクターを含むがこれらに限定されない任意の適切な反応器を利用することができる。本明細書で使用される場合、「反応器」は、発酵器もしくは発酵ユニット、または任意の他の反応容器を含むことができ、「反応器」という用語は、「発酵器」と交換可能に使用される。用語発酵器もしくは発酵は、微生物培養物および哺乳動物培養物の両方を指す。例えば、いくつかの態様では、例示的バイオリアクターユニットは、以下の、栄養素および／または炭素源の供給、好適なガス（例えば、酸素）の注入、発酵または細胞培養培地の入口および出口の流れ、気相および液相の分離、温度の維持、酸素およびＣＯ２濃度の維持、ｐＨ濃度の維持、アジテーション（例えば、撹拌）、および／または洗浄／殺菌のうちの１つ以上またはすべてを行うことができる。発酵ユニットのような例の反応器ユニットは、ユニット内に複数の反応器を含むことができ、例えば、ユニットは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個以上のバイオリアクターを各ユニット内に有することができ、および／またはファシリティは、ファシリティ内に単一または複数の反応器を有する複数のユニットを含むことができる。様々な実施形態において、バイオリアクターは、バッチ式、半流加バッチ、流加バッチ、潅流、および／または連続発酵プロセスに適することができる。任意の適切な反応器直径を使用することができる。実施形態において、バイオリアクターは、約１００ｍＬから約５０，０００Ｌの間の容量を有することができる。非限定的な例としては、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル、および／または５０，０００リットルが挙げられる。さらに、適切な反応器は、多用途、単一用途、ディスポーザブル、または非ディスポーザブルであり得、ステンレススチール（例えば、３１６Ｌまたは他の適切なステンレススチール）およびインコネル、プラスチック、および／またはガラスなどの金属合金を含む任意の適切な材料で形成することができる。
本明細書に記載されているように、細胞株を産生することを用いてレンチウイルスを産生する方法の少なくとも一部を、シードトレイン産生、細胞継代、大容量細胞培養および／または主要な製造段階を含む抗生物質の非存在下で実施することができることが、驚くべきことに、決定された。レンチウイルス産生処理の少なくとも一部から抗生物質を除去することにより、結果として得られる方法は、細胞処理および最終的にヒトで利用される製品における抗生物質の使用に関連する懸念を低減または除去する。
図１０は、本明細書に記載されるようなプロデューサー細胞株からレンチウイルスを調製するための例示的な製造プロセスフローを示す。示すように、ＰＣＬクローンは、最初に生成され、次いで、ラージスケール製造プロセスで使用するために選択される。製造プロセスの初期段階の間に、ＰＣＬは約３回（例えば、約２Ｌの体積）まで継代され、その時点で、ピューロマイシンおよび／またはゼオシンなどの抗生物質をプロセスから除去することができる。次いで、継代は、例えば、継代数３、継代数４、継代数５などの抗生物質の非存在下で、所望の体積の細胞に達するまで継続することができる。例えば、図１０に示すように、適切には、抗生物質の非存在下で、バイオリアクター中で約５０Ｌの体積に達する。次いで、ＰＣＬは、レンチウイルスベクターの産生を開始するために適切に誘導される（例えば、本明細書に記載のドキシサイクリンを使用して）。したがって、実施形態において、哺乳動物細胞（ＰＣＬ）の培養の少なくとも一部は、抗生物質の非存在下で起こり、この期間は、適切には、継代数３から誘導フェーズまでである。誘導後、回収（ベンゾナーゼ処理および清澄化工程を含む）およびレンチウイルスベクターの精製（接線流濾過および無菌濾過を含む）を含む下流側のプロセスを行うことができる。本明細書に記載されるようなＰＣＬを用いてレンチウイルスベクター製造プロセスのかなりの部分を実施する能力は、驚くべきかつ予期せぬ結果であり、ラージスケール製造プロセスに著しい利点を提供する。
また、本明細書で提供されるのは、哺乳動物対象、適切にはヒト対象を、本明細書に記載の種々の方法に従って産生されたレンチウイルスベクターで治療する方法である。適切には、方法は、治療目的の遺伝子を含む、目的遺伝子を有するヒト対象を治療するために使用される。ヒト対象への投与は、例えば、吸入、注射、または静脈内投与、ならびに当技術分野で公知の他の投与方法を含むことができる。
また、本明細書で提供されるのは、レンチウイルスベクターを産生するための哺乳動物細胞である。本明細書に記載の方法、またはその変形を用いて、哺乳動物細胞において染色体に組み込まれた核酸分子を含む哺乳動物細胞が容易に作製され、核酸分子は、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子を含む。さらなる実施形態において、ゲノムに組み込まれたパッケージングコンポーネントを含有する哺乳動物細胞は、第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする染色体に組み込まれた核酸配列をさらに含むことができる。
本明細書に記載されるように、ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）トランスポサーゼを含むトランスポサーゼに基づく方法を使用すると、宿主細胞ゲノム中の核酸配列が、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）の組換えから得られる配列によって５’末端および３’末端の両方に隣接することになる。
発現カセットおよび目的遺伝子をコードする核酸の遺伝子コンポーネントと同様に、例示的な哺乳動物細胞が本明細書に記載される。
これらの細胞を利用してレンチウイルスを産生する方法は、本明細書に記載されており、適切には、目的遺伝子をコードする発現カセットおよび核酸の産生を誘導すること、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養すること、およびレンチウイルスベクターを回収することを含む。
さらなる例示的実施形態
実施形態１は、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を作製する方法であって、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子と、をコードする発現カセットを含むパッケージングベクターにより、哺乳動物細胞をトランスフェクトすることであって、発現カセットは、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって５’末端と３’末端の両方に隣接している、トランスフェクトすることと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を単離することと、を含む方法である。
実施形態１は、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を作製する方法であって、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子と、をコードする発現カセットを含むパッケージングベクターにより、哺乳動物細胞をトランスフェクトすることであって、発現カセットは、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって５’末端と３’末端の両方に隣接している、トランスフェクトすることと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を単離することと、を含む方法である。
実施形態２は、哺乳動物細胞が哺乳動物細胞培養物である、実施形態１記載の方法を含む。
実施形態３は、哺乳動物細胞培養物が懸濁培養物である、実施形態２の方法を含む。
実施形態４には、哺乳動物細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞であることを特徴とする、実施形態３の方法が含まれる。
実施形態５は、ＧＡＧ遺伝子がＨＩＶ ＧＡＧ遺伝子であり、ＰＯＬ遺伝子がＨＩＶ ＰＯＬ遺伝子である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法を含む。
実施形態６は、レンチウイルスエンベロープ遺伝子が水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法を含む。
実施形態７は、第１、第２および第３のプロモーターが抑制解除可能なプロモーターである、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法を含む。
実施形態８は、発現カセットが、第１、第２および第３の抑制解除可能なプロモーターのリプレッサーエレメントをさらにコードする、実施形態７の方法を含む。
実施形態９は、抑制解除可能なプロモーターの各々が機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含み、リプレッサーエレメントがテトラサイクリンリプレッサータンパクである、実施形態８記載の方法を含む。
実施形態１０は、発現カセットがテトラサイクリンリプレッサータンパクをコードする配列に続くＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス配列をさらに含む、実施形態９記載の方法を含む。
実施形態１１は、トランスポゾン特異的ＩＴＲが鱗翅目トランスポゾン（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））ＩＴＲである、実施形態１～１０のいずれか１つの方法を含む。
実施形態１２は、トランスフェクトが、トランスポゾン特異的ＩＴＲを認識するトランスポサーゼの存在下にある、実施形態１～１１のいずれか１つの方法を含む。
実施形態１３は、トランスポサーゼが鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポサーゼｍＲＮＡまたは鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポーズｃＤＮＡである、実施形態１２記載の方法を含む。
実施形態１４は、レンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を産生する方法であって、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子と、をコードする発現カセットを含むパッケージングベクターであって、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって発現カセットが５’末端と３’末端の両方に隣接しているパッケージングベクターと、第４のプロモーターの制御下にある目的遺伝子をコードする核酸配列を含むトランスファーベクターであって、核酸配列は、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって５’末端および３’末端の両方に隣接しているトランスファーベクターとにより、哺乳動物細胞をトランスフェクトすることと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を単離することと、を含む。
実施形態１５は、哺乳動物細胞が哺乳動物細胞培養物である、実施形態１４記載の方法を含む。
実施形態１６は、哺乳動物細胞培養物が懸濁培養物である、実施形態１５記載の方法を含む。
実施形態１７は、哺乳動物細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、実施形態１６の方法を含む。
実施形態１８は、ＧＡＧ遺伝子がＨＩＶ ＧＡＧ遺伝子であり、ＰＯＬ遺伝子がＨＩＶ ＰＯＬ遺伝子である、実施形態１４～１７のいずれか１つに記載の方法を含む。
実施形態１９は、レンチウイルスエンベロープ遺伝子が水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である実施形態１４～１８のいずれか１つに記載の方法を含む。
実施形態２０は、第１、第２および第３のプロモーターが抑制解除可能なプロモーターである、実施形態１４～１９のいずれか１つに記載の方法を含む。
実施形態２１は、発現カセットが、第１、第２および第３の抑制解除可能なプロモーターのリプレッサーエレメントをさらにコードする、実施形態２０に記載の方法を含む。
実施形態２２は、抑制解除可能なプロモーターの各々が機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含み、リプレッサーエレメントがテトラサイクリンリプレッサータンパクである、実施形態２１記載の方法を含む。
実施形態２３は、発現カセットがテトラサイクリンリプレッサータンパクをコードする配列に続くＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス配列をさらに含む、実施形態２２記載の方法を含む。
実施形態２４は、トランスポゾン特異的ＩＴＲが鱗翅目トランスポゾン（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））ＩＴＲである、実施形態１４～２３のいずれか１つの方法を含む。
実施形態２５は、トランスフェクトがトランスポゾン特異的ＩＴＲを認識するトランスポサーゼの存在下にある実施形態１４～２４のいずれか１つの方法を含む。
実施形態２６は、トランスポサーゼが鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポサーゼｍＲＮＡまたは鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポーズｃＤＮＡである、実施形態２５記載の方法を含む。
実施形態２７は、目的遺伝子が治療目的遺伝子である、実施形態１４～２６のいずれか１つの方法を含む。
実施形態２８は、レンチウイルスベクターを製造する方法であって、実施形態１に記載のレンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を産生することと、哺乳動物細胞をトランスファーベクターでトランスフェクトすることであって、第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする核酸配列を含み、発現カセットおよび前記核酸の産生を誘導することと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを回収することと、を含む、方法である。
実施形態２９は、レンチウイルスベクターを製造する方法であって、実施形態１４に記載のレンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を産生することと、発現カセットおよび核酸の産生を誘導することと、哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを回収することと、を含む方法である。
実施形態３０は、発現カセット中のプロモーターの各々が、機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含む抑制解除可能なプロモーターであり、リプレッサーエレメントがテトラサイクリンリプレッサータンパクであり、誘導が哺乳動物細胞にドキシサイクリンを添加することを含む、実施形態２８または実施形態２９の方法を含む。
実施形態３１は、産生されるレンチウイルスベクターの量が、誘導の２日後に少なくとも約１０６形質導入ユニット／ｍＬである、実施形態２８または実施形態２９記載の方法を含む。
実施形態３２は、実施形態２８または実施形態２９に従って産生されたレンチウイルスベクターを哺乳動物対象に投与することを含む、レンチウイルスベクターにより治療する方法である。
実施形態３３は、投与が吸入、注射または静脈内投与を含む、実施形態３２記載の方法を含む。
実施形態３４は、レンチウイルスベクターを製造するための哺乳動物細胞であって、哺乳動物細胞において染色体に組み込まれた核酸分子であって、該核酸分子は、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子とレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子と、を含み、ここで、核酸配列は、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）の組換えから生じる配列によって５’末端と３’末端の両方に隣接している、核酸分子を含む、哺乳動物細胞である。
実施形態３５は、第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする染色体に組み込まれた核酸配列をさらに含む、実施形態３４の哺乳動物細胞を含む。
実施形態３６は、哺乳動物細胞が哺乳動物細胞培養物である、実施形態３４または実施形態３５の哺乳動物細胞を含む。
実施形態３７は、哺乳動物細胞培養物が懸濁培養物である、実施形態３６記載の哺乳動物細胞を含む。
実施形態３８は、実施形態３７の哺乳動物細胞を含み、ここに、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
実施形態３９は、ＧＡＧ遺伝子がＨＩＶ ＧＡＧ遺伝子であり、ＰＯＬ遺伝子がＨＩＶ ＰＯＬ遺伝子である、実施形態３４～３８のいずれか１つの哺乳動物細胞を含む。
実施形態４０は、レンチウイルスエンベロープ遺伝子が水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である、実施形態３４～３９のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞を含む。
実施形態４１は、実施形態３４～４０のいずれか１つの哺乳動物細胞を含み、ここで、第１、第２および第３のプロモーターは、抑制解除可能なプロモーターである。
実施形態４２は、発現カセットが、第１、第２および第３の抑制解除可能なプロモーターのリプレッサーエレメントをさらにコードする、実施形態４１の哺乳動物細胞を含む。
実施形態４３は、抑制解除可能なプロモーターの各々が機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含み、リプレッサーエレメントがテトラサイクリンリプレッサータンパクである実施形態４２の哺乳動物細胞を含む。
実施形態４４は、発現カセットがテトラサイクリンリプレッサータンパクをコードする配列に続くＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス配列をさらに含む、実施形態４３記載の哺乳動物細胞を含む。
実施形態４５は、トランスポゾン特異的ＩＴＲが鱗翅目トランスポゾン（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））ＩＴＲである、実施形態３４～４４のいずれか１つの哺乳動物細胞を含む。
実施形態４６は、目的遺伝子が治療目的遺伝子である、実施形態３５記載の哺乳動物細胞を含む。
実施形態４７は、レンチウイルスベクターを製造する方法であって、実施形態３４の哺乳動物細胞をトランスファーベクターでトランスフェクトすることであって、トランスファーベクターは第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする核酸配列を含む、トランスフェクトすることと、発現カセットおよび核酸の産生を誘導することと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを回収することと、を含む方法である。
実施形態４８は、レンチウイルスベクターを製造する方法であって、実施形態３５の哺乳動物の関心目的遺伝子をコードする染色体に組み込まれた核酸配列および染色体に組み込まれた核酸配列の産生を誘導することと、哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを回収することと、を含む。
実施形態４９は、方法実施形態４７または実施形態４８を含み、発現カセット中のプロモーターの各々は、機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含む抑制解除可能なプロモーターであり、リプレッサーエレメントはテトラサイクリンリプレッサータンパクであり、誘導は哺乳動物細胞にドキシサイクリンを添加することを含む。
実施形態５０は、産生されるレンチウイルスベクターの量が、誘導の２日後に少なくとも約１０６形質導入ユニット／ｍＬである、方法実施形態４７または実施形態４８を含む。
実施形態５１は、レンチウイルスベクターで治療する方法であって、実施形態４７または実施形態４８に従って産生されたレンチウイルスベクターを哺乳動物対象に投与することを含む、方法である。
実施形態５２は、投与が吸入、注射または静脈内投与を含む、実施形態５１記載の方法を含む。
実施形態５３は、哺乳動物細胞の培養の少なくとも一部が抗生物質の非存在下で起こる、実施形態２８～３１および４７～５０のいずれかの方法を含む。
実施形態５４は、培養の一部が継代数３から誘導フェーズまでである、実施形態５３に記載の方法を含む。
実施例
実施例
実施例１：レンチウイルス産生細胞株の設計および構築物
材料および方法
レンチウイルス産生細胞株を構築するため、２種類のプラスミドを設計した：
１）調節された様式でＧＡＧ－Ｐｏｌ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｒｅｖを発現するパッケージングプラスミド、および
２）目的遺伝子を発現するトランスファーベクター。
材料および方法
レンチウイルス産生細胞株を構築するため、２種類のプラスミドを設計した：
１）調節された様式でＧＡＧ－Ｐｏｌ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｒｅｖを発現するパッケージングプラスミド、および
２）目的遺伝子を発現するトランスファーベクター。
ＶＳＶ‐Ｇのコード配列、およびＲｅｖは、タンパクの実際のアミノ酸配列を変化させずにタンパク合成を増加させる最も有効な方法の一つとして、コドン最適化（ｃｏ）が証明されているので、コドン最適化（ｃｏ）されている。
ＧＡＧ－Ｐｏｌをコードする配列はコドン最適化されていない。これらの配列はすべてＣＭＶ－ＴＯプロモーターの制御下に置かれ、その活性はＴｅｔＲによってテトラサイクリンまたはドキシサイクリンの非存在下で抑制される。我々のデザインでは、ＣＭＶ‐ＴＯのより厳密な調節を達成するために、ヒトジンクフィンガータンパク１０からの転写抑制ドメインであるＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）の配列をＴｅｔＲコード配列の直後に挿入した。
ＴｅｔＲへのその結合時におけるドキシサイクリンの添加は、ＴｅｔＲのコンホメーション変化を誘発してＣＭＶ－ＴＯからＴｅｔＲを放出する。その結果、ＣＭＶ‐ＴＯは活性化し、ＶＳＶ‐Ｇ、Ｒｅｖ、ＧＡＧ‐Ｐｏｌを発現する。ＶＳＶ－Ｇ、Ｒｅｖ、およびＧＡＧ－Ｐｏｌの調節された発現は、これらのタンパクに関連するあらゆる細胞毒性を最小限にし、またレンチウイルスベクター産生を任意の誘導前の基礎レベルに保つ。選択処理を容易にするために、抗生物質耐性マーカー（ピューロマイシン）をＩＲＥＳ配列の下流側のこのプラスミドに導入し、これをＫＲＡＢ配列の直後に置いた。したがって、ヒトホスホグリセリン酸プロモーターは、ＴｅｔＲ－ＫＲＡＢおよびピューロマイシン耐性遺伝子の発現を全面的に駆動する。
レンチウイルスベクター産生を試験するために、目的遺伝子（ＧＯＩ）として増強緑色蛍光タンパク（ｅＧＦＰ）を選択した。それをＣＭＶプロモーター下に置いて恒常的発現させた。選択処理をより効率的にするために、ブレオマイシン耐性マーカー（ＢｌｅｏＲ）をトランスファーベクターに導入した。
従来のアプローチでは、発現カセットの統合は、ランダム統合イベントに依存する。したがって、それは本質的に管理された効率的なプロセスではなかった。さらに、不完全な発現カセットを有する断片化された部分的抗生物質マーカー（複数可）が偶然に染色体に組み込まれ得るので、最終的に選択されたクローンは、偽陽性（すなわち、意図されたＧＯＩを発現しない）であり得る。
プロデューサー細胞株生成のこれらの望ましくない事象を回避するために、パッケージングおよびトランスファーベクタープラスミド中のすべての発現カセットをＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）逆位末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接させた。ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）トランスポサーゼはこれらのＩＴＲ配列を特異的に認識し、ｉｎｖｉｖｏで部位特異的組換えを促進する。したがって、ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）トランスポサーゼｍＲＮＡの同時トランスフェクションに際して、全発現カセットを含むプラスミド領域は、細胞の染色体に効率的に組み込まれる。
パッケージングベクターの模式図を図１に示し、トランスファーベクターの模式図を図２に示す。プロモーターをもつｅＧＦＰをコードする配列を示す。ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）５’および３’ＩＴＲも示される。５’ＬＴＲ、ＨＩＶ‐１ψ、ＲＲＥ、ｃＰＰＴ／ＣＴＳ，３’ＬＴＲなどのレンチウイルスベクター産生のエレメントも示される。
図１に示されるパッケージングベクターについての核酸配列は、以下に提供される：
ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCCCGCCGGGTAACTCACGGGGTATCCATGTCCATTTCTGCGGCATCCAGCCAGGATACCCGTCCTCGCTGACGTAATATCCCAGCGCCGCACCGCTGTCATTAATCTGCACACCGGCACGGCAGTTCCGGCTGTCGCCGGTATTGTTCGGGTTGCTGATGCGCTTCGGGCTGACCATCCGGAACTGTGTCCGGAAAAGCCGCGACGAACTGGTATCCCAGGTGGCCTGAACGAACAGTTCACCGTTAAAGGCGTGCATGGCCACACCTTCCCGAATCATCATGGTAAACGTGCGTTTTCGCTCAACGTCAATGCAGCAGCAGTCATCCTCGGCAAACTCTTTCCATGCCGCTTCAACCTCGCGGGAAAAGGCACGGGCTTCTTCCTCCCCGATGCCCAGATAGCGCCAGCTTGGGCGATGACTGAGCCGGAAAAAAGACCCGACGATATGATCCTGATGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTAAGATCTAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAAGCCATACCAATGGGCCCTAAAAAAGGAATCCAGTCAATTCCGGGGCTAAACCTGGCTGCCACTGTTTCTTTAGGGACTTCGTTCCTGTGAGGACAccTGCAggCCGGCCGGATccTAGgTATacGCGtTAATTAaAGCTTGTTAACGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGAACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGATCGTCGACGAGgtgagtttggggacccttgattgttctttctttttcgctattgtaaaattcatgttatatggagggggcaaagttttcagggtgttgtttagaatgggaagatgtcccttgtatcaccatggaccctcatgataattttgtttctttcactttctactctgttgacaaccattgtctcctcttattttcttttcattttctgtaactttttcgttaaactttagcttgcatttgtaacgaatttttaaattcacttttgtttatttgtcagattgtaagtactttctctaatcacttttttttcaaggcaatcagggtatattatattgtacttcagcacagttttagagaacaattgttataattaaatgataaggtagaatatttctgcatataaattctggctggcgtggaaatattcttattggtagaaacaactacatcctggtcatcatcctgcctttctctttatggttacaatgatatacactgtttgagatgaggataaaatactctgagtccaaaccgggcccctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCTGCCACCATGGCTGGAAGATCTGGCGACTCTGACGAGGACCTGCTGAAAGCTGTGCGGCTGATCAAGTTCCTGTACCAGAGCAACCCTCCACCTAATCCTGAGGGCACCAGACAGGCCAGAAGAAACAGGCGGAGAAGATGGCGCGAGCGGCAGAGACAGATCCACTCCATCTCCGAGCGGATCCTGTCCACCTACCTGGGAAGATCCGCTGAGCCTGTTCCTCTGCAGCTGCCTCCTCTGGAAAGACTGACCCTGGACTGCAACGAGGACTGCGGCACCTCTGGAACACAAGGCGTTGGCTCTCCACAGATCCTGGTGGAAAGCCCCACCATCCTGGAATCCGGCGCCAAAGAATGAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTG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ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCCCGCCGGGTAACTCACGGGGTATCCATGTCCATTTCTGCGGCATCCAGCCAGGATACCCGTCCTCGCTGACGTAATATCCCAGCGCCGCACCGCTGTCATTAATCTGCACACCGGCACGGCAGTTCCGGCTGTCGCCGGTATTGTTCGGGTTGCTGATGCGCTTCGGGCTGACCATCCGGAACTGTGTCCGGAAAAGCCGCGACGAACTGGTATCCCAGGTGGCCTGAACGAACAGTTCACCGTTAAAGGCGTGCATGGCCACACCTTCCCGAATCATCATGGTAAACGTGCGTTTTCGCTCAACGTCAATGCAGCAGCAGTCATCCTCGGCAAACTCTTTCCATGCCGCTTCAACCTCGCGGGAAAAGGCACGGGCTTCTTCCTCCCCGATGCCCAGATAGCGCCAGCTTGGGCGATGACTGAGCCGGAAAAAAGACCCGACGATATGATCCTGATGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTAAGATCTAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAAGCCATACCAATGGGCCCTAAAAAAGGAATCCAGTCAATTCCGGGGCTAAACCTGGCTGCCACTGTTTCTTTAGGGACTTCGTTCCTGTGAGGACAccTGCAggCCGGCCGGATccTAGgTATacGCGtTAATTAaAGCTTGTTAACGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGAACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGATCGTCGACGAGgtgagtttggggacccttgattgttctttctttttcgctattgtaaaattcatgttatatggagggggcaaagttttcagggtgttgtttagaatgggaagatgtcccttgtatcaccatggaccctcatgataattttgtttctttcactttctactctgttgacaaccattgtctcctcttattttcttttcattttctgtaactttttcgttaaactttagcttgcatttgtaacgaatttttaaattcacttttgtttatttgtcagattgtaagtactttctctaatcacttttttttcaaggcaatcagggtatattatattgtacttcagcacagttttagagaacaattgttataattaaatgataaggtagaatatttctgcatataaattctggctggcgtggaaatattcttattggtagaaacaactacatcctggtcatcatcctgcctttctctttatggttacaatgatatacactgtttgagatgaggataaaatactctgagtccaaaccgggcccctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCTGCCACCATGGCTGGAAGATCTGGCGACTCTGACGAGGACCTGCTGAAAGCTGTGCGGCTGATCAAGTTCCTGTACCAGAGCAACCCTCCACCTAATCCTGAGGGCACCAGACAGGCCAGAAGAAACAGGCGGAGAAGATGGCGCGAGCGGCAGAGACAGATCCACTCCATCTCCGAGCGGATCCTGTCCACCTACCTGGGAAGATCCGCTGAGCCTGTTCCTCTGCAGCTGCCTCCTCTGGAAAGACTGACCCTGGACTGCAACGAGGACTGCGGCACCTCTGGAACACAAGGCGTTGGCTCTCCACAGATCCTGGTGGAAAGCCCCACCATCCTGGAATCCGGCGCCAAAGAATGAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTG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図２に示すトランスファーベクターについての核酸配列を以下に示す：
ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCCCGCCGGGTAACTCACGGGGTATCCATGTCCATTTCTGCGGCATCCAGCCAGGATACCCGTCCTCGCTGACGTAATATCCCAGCGCCGCACCGCTGTCATTAATCTGCACACCGGCACGGCAGTTCCGGCTGTCGCCGGTATTGTTCGGGTTGCTGATGCGCTTCGGGCTGACCATCCGGAACTGTGTCCGGAAAAGCCGCGACGAACTGGTATCCCAGGTGGCCTGAACGAACAGTTCACCGTTAAAGGCGTGCATGGCCACACCTTCCCGAATCATCATGGTAAACGTGCGTTTTCGCTCAACGTCAATGCAGCAGCAGTCATCCTCGGCAAACTCTTTCCATGCCGCTTCAACCTCGCGGGAAAAGGCACGGGCTTCTTCCTCCCCGATGCCCAGATAGCGCCAGCTTGGGCGATGACTGAGCCGGAAAAAAGACCCGACGATATGATCCTGATGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTAAGATCTAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAAGCCATACCAATGGGCCCTAAAAAAGGAATCCAGTCAATTCCGGGGCTAAACCTGGCTGCCACTGTTTCTTTAGGGACTTCGTTCCTGTGAGGACAccTGCAggCCGGCCGGATccTAGgTATacGCGtTAATTAaAGCTTGTTAACGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGCGCGTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAG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ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCCCGCCGGGTAACTCACGGGGTATCCATGTCCATTTCTGCGGCATCCAGCCAGGATACCCGTCCTCGCTGACGTAATATCCCAGCGCCGCACCGCTGTCATTAATCTGCACACCGGCACGGCAGTTCCGGCTGTCGCCGGTATTGTTCGGGTTGCTGATGCGCTTCGGGCTGACCATCCGGAACTGTGTCCGGAAAAGCCGCGACGAACTGGTATCCCAGGTGGCCTGAACGAACAGTTCACCGTTAAAGGCGTGCATGGCCACACCTTCCCGAATCATCATGGTAAACGTGCGTTTTCGCTCAACGTCAATGCAGCAGCAGTCATCCTCGGCAAACTCTTTCCATGCCGCTTCAACCTCGCGGGAAAAGGCACGGGCTTCTTCCTCCCCGATGCCCAGATAGCGCCAGCTTGGGCGATGACTGAGCCGGAAAAAAGACCCGACGATATGATCCTGATGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTAAGATCTAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAAGCCATACCAATGGGCCCTAAAAAAGGAATCCAGTCAATTCCGGGGCTAAACCTGGCTGCCACTGTTTCTTTAGGGACTTCGTTCCTGTGAGGACAccTGCAggCCGGCCGGATccTAGgTATacGCGtTAATTAaAGCTTGTTAACGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGCGCGTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAG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ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の単一細胞クローンを分離し、パッケージングおよびトランスファーベクタープラスミドのトランスフェクションに適応した。ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）トランスポサーゼの効果を試験および確認するために、ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）トランスポサーゼｍＲＮＡの非存在下または存在下でトランスフェクションを実施した。トランスフェクションにはＰＥＩｐｒｏトランスフェクション剤を用いた。
レンチ－ｅＧＦＰのパッケージング細胞株を作製するために、パッケージングプラスミドおよびｅＧＦＰをコードするトランスファーベクターを同時トランスフェクトした。パッケージング単独のためのパッキング細胞株（すなわち、目的の遺伝子発現がない）を作製するために、パッケージングプラスミド単独をトランスフェクトした。トランスフェクションの４日後に、レンチ－ｅＧＦＰのためのピューロマイシンおよびゼオシン、およびパッケージング細胞株のためのピューロマイシンのみを添加することによって、安定にトランスフェクトされた細胞を選択した。
結果
トランスポサーゼｍＲＮＡの同時トランスフェクションは抗生物質耐性コロニーを有意に増強し、トランスポサーゼ発現が実際に発現カセットの染色体積分を促進することを示した。図表３Ａ～３Ｄは、パッケージングおよびｅＧＦＰトランスファーベクターでトランスフェクトされた、トランスポサーゼｍＲＮＡ（ＴＰｍＲＮＡ）の非存在時（図３Ａおよび図３Ｃ）または存在時（図３Ｂおよび図３Ｄ）のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果を示している。トランスフェクションの４日後、ピューロマイシン（０．５ｕｇ／ｍＬ）およびゼオシン（３００ｕｇ／ｍＬ）を添加することにより抗生物質耐性細胞を選択した。トランスフェクション後２６日目に、細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、ＧＦＰおよび白黒（Ｂ／Ｗ）の画像を収集した。
トランスポサーゼｍＲＮＡの同時トランスフェクションは抗生物質耐性コロニーを有意に増強し、トランスポサーゼ発現が実際に発現カセットの染色体積分を促進することを示した。図表３Ａ～３Ｄは、パッケージングおよびｅＧＦＰトランスファーベクターでトランスフェクトされた、トランスポサーゼｍＲＮＡ（ＴＰｍＲＮＡ）の非存在時（図３Ａおよび図３Ｃ）または存在時（図３Ｂおよび図３Ｄ）のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果を示している。トランスフェクションの４日後、ピューロマイシン（０．５ｕｇ／ｍＬ）およびゼオシン（３００ｕｇ／ｍＬ）を添加することにより抗生物質耐性細胞を選択した。トランスフェクション後２６日目に、細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、ＧＦＰおよび白黒（Ｂ／Ｗ）の画像を収集した。
同様に、トランスポサーゼｍＲＮＡの同時トランスフェクションは、細胞株の生成をパッケージングする過程で抗生物質耐性コロニーを増強した（データは現在示されている）。
抗生物質耐性パッケージング細胞株を増幅し、特徴付け前に凍結した。ＬＶ－ｅＧＦＰをコードするパッケージング細胞を解凍し、ピューロマイシンおよびゼオシンの存在下で懸濁液中で培養した。レンチウイルスベクター産生を誘導するために、酪酸ナトリウム（６ｍＭ）およびドキシサイクリン（２ｕｇ／ｍＬ）をパッケージング細胞培養物に添加し、さらにインキュベートした。
誘導後２日目および３日目に、培養上清を回収し、レンチウイルス力価を測定した。非誘導レンチウイルスベクター力価の測定には、非誘導試料の培養上清を用いた。導入時（２日目および３日目）に４Ｅ６以上のレンチウイルスベクター形質導入ユニット／ｍＬが産生されたが、いずれかの誘導前（０日目）のレンチウイルスベクター産生の基礎量は基礎レベルであったことが観察された（図４）。
実施例２：レンチウイルス産生細胞株のさらなる特徴付け
Ａ．さらなる研究は、本明細書に記載されるベクターを有する異なるトランスフェクション剤の使用を検討するためにデザインされた。図５に示すように、ＰＥＩおよびリポフェクタミン３０００の両方は、ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）トランスポサーゼｍＲＮＡの存在下でＰＣＬプールからの感染性レンチウイルス力価を約１００倍増加させることに成功し、トランスポサーゼの発現が宿主細胞の染色体へのカーゴ配列の効率的な組込みをもたらすことを実証した。
Ａ．さらなる研究は、本明細書に記載されるベクターを有する異なるトランスフェクション剤の使用を検討するためにデザインされた。図５に示すように、ＰＥＩおよびリポフェクタミン３０００の両方は、ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）トランスポサーゼｍＲＮＡの存在下でＰＣＬプールからの感染性レンチウイルス力価を約１００倍増加させることに成功し、トランスポサーゼの発現が宿主細胞の染色体へのカーゴ配列の効率的な組込みをもたらすことを実証した。
Ｂ．さらに実験を行い、レンチウイルス産生の成功に対する抗生物質の除去の効果を判定した。このような実験では、ＤＨ４と指定された単一細胞クローン（ＳＣＣ）であるＨＥＫ－２９３Ｔを、継代数２１までの誘導時に一貫した感染力価を示すために選択した。
図６に示されるように、非誘導細胞は、低いレベルの感染力価を示した。継代数７（２日目）の後、誘導された細胞は１．２Ｅ７ ＴＵ／ｍＬ（形質導入ユニット／ｍＬ）を示した。細胞の選択のために、抗生物質を除去し、細胞を継代し続けた。継代数１１（２、３日目）では、抗生物質投与細胞は１．５Ｅ７ＴＵ／ｍＬ（２日目）および５．３Ｅ７ ＴＵ／ｍＬ（３日目）の力価を達成した。抗生物質非投与と比較して、感染力価は２日目でも１．６Ｅ７ ＴＵ／ｍＬに達した。継代数１７、継代数２１（約７週間）まで拡大すると、抗生物質の存在下と同様に抗生物質なしでウイルス力価は同レベルを維持し続けた（４．４Ｅ７）。２日目ｖｓ３日目とは、誘導後回収前のＰＣＬのインキュベーション日数をいい、誘導と回収の間の追加日数の影響を比較する。
図７は、別の単一細胞クローンＥＤ８を用いた同様の結果を示す。ＤＨ４クローンの場合と同様に、継代数７での抗生物質の除去は、抗生物質で処理した細胞と同じスケールの感染性ウイルス力価を産生するための細胞クローンの能力に有意な影響を及ぼさなかった。前述のように、継代数２１までに、３．５Ｅ７ＴＵ／ｍＬの感染力価が達成され、抗生物質による処置を継続した細胞では４．３Ｅ７ ＴＵ／ｍＬと同様であった。
図８は、ｄｄＰＣＲアッセイを用いて測定した宿主細胞染色体に組み込まれた複製数（目的遺伝子またはパッケージングプラスミド）を示す。ベクター複製数（ＶＣＮ）は、式、ＶＣＮ＝標的配列の複製数／ＲＰＰ３０（リボヌクレアーゼＰ／ＭＲＰサブユニットＰ３０）の複製数＊２により計算した。長末端反復（ＬＴＲ）および水疱性口内炎ウイルス糖タンパクＧ（ＶＳＶ‐Ｇ）に特異的なプライマー／プローブセットを用いて、それぞれＧＯＩおよびパッケージングプラスミドを検出した。両方の細胞クローンについて述べたように、目的の遺伝子およびパッケージングプラスミドの両方が、細胞の染色体に効率的に組み込まれた。細胞の継代中（継代数７０で再び）に抗生物質を除去すると、複製数がわずかに減少したが、ＧＯＩとパッケージングプラスミドの細胞への十分な統合が依然として認められた。
これは驚くべき予期せぬ結果であり、抗生物質がない場合でも、本明細書に記載される方法に従って調製されたプロデューサー細胞株は、高いウイルス力価を産生することができることを示している。このことは、後にヒト患者集団で使用される製品の抗生物質汚染等に関連するリスクを最小限にするために、プロデューサー細胞株培養から抗生物質を除去することが非常に望ましいため、レンチウイルスの製造に著しい利点をもたらす。
Ｃ．一過性トランスフェクションから産生されたレンチウイルスと比較して、本明細書に記載のプロデューサー細胞株を用いて産生されたレンチウイルスベクターの形質導入効率を決定するために実験も行った。レンチウイルスは、ＨＥＫ－２９３細胞の一過性トランスフェクションと共に、ＤＨ４およびＥＤ８細胞株の両方からＰＣＬを用いて産生された。製造後、レンチウイルスベクターをヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に形質導入し、感染多重度（ＭＯＩ）を５とした。簡単に言えば、ＰＭＢＣを２４ウェルプレート中の４Ｅ５細胞／ウェルで平板培養した。１日目に、細胞をＩＬ‐２（１５ｎｇ／ｍＬ）と抗ＣＤ３および抗ＣＤ‐２８（２５μＬ／１Ｅ６細胞）で刺激した。次に、目的遺伝子（ＧＯＩ）として緑色蛍光タンパクを用いて、細胞にレンチウイルスを５の感染多重度で形質導入した。５日後、フローサイトメトリーを用いて細胞を分析し、蛍光陽性細胞の画分を決定し、形質導入効率を計算した。
図９に示されるように、ＰＭＢＣが５の多重感染で形質導入される場合、ＰＣＬ（ＤＨ４およびＥＤ８ライン）および本明細書に記載される方法を用いて産生されるレンチウイルス（約５５％～６２％の形質導入効率）と比較すると、一過性トランスフェクション法を用いて産生されるレンチウイルスに関して同様の形質導入効率が観察される。
当業者には、本明細書に記載された方法および用途に対する他の適切な修正および適応が、実施形態のいずれかの範囲から逸脱することなく行えることが容易に明らかであろう。
特定の実施形態が本明細書に図示され記載されているが、特許請求の範囲は、記載され図示されている部分の特定の形態または配列に限定されるものではないことを理解されたい。本明細書において、例示的な実施形態が開示されており、特定の用語が使用されるが、それらは、限定の目的ではなく、包括的かつ記述的な意味でのみ使用される。上記の教示に照らして、実施形態の修正および変形が可能である。したがって、実施形態は、具体的に記載されている以外の方法で実施することができることを理解されたい。
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願はＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年９月２２日に作成された当該ＡＳＣＩＩの複写は、０１３２－００５１ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは４０，９４５バイトである。
本出願はＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年９月２２日に作成された当該ＡＳＣＩＩの複写は、０１３２－００５１ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは４０，９４５バイトである。
本開示は、レンチウイルスベクター産生細胞を産生するための方法に関する。特に、この方法は、必要なパッケージングエレメントを提供し、ベクターを細胞にトランスファーするために、４つではなく２つのプラスミドを利用し、懸濁ベースの細胞を含む多数のレンチウイルス産生細胞の産生、および大量のレンチウイルスの産生を可能にする。これらの方法は、後にレンチウイルスを産生するために誘導され得る細胞の産生を可能にし、特定の目的遺伝子を含むように調整され得る。
レンチウイルスベクターは、遺伝子および細胞療法の分野において最も一般的に使用される送達方法の１つである。レンチウイルスベクターの生産プロセスでは、ベクターの生産に必要な配列をいくつかの異なるプラスミドまたは発現カセットに分割し、複製能を有するレンチウイルス（ＲＣＬ）が製造される可能性を最小限に抑える。一般に、第３世代レンチウイルス生産システムは、発現する４つの別々のプラスミドまたは発現カセットを利用する：
１）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子とレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）タンパク；
２）エンベロープタンパク（通常は水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ））；
３）ビリオンタンパク（Ｒｅｖ）タンパクの発現のＨＩＶレギュレーター；および
４）目的遺伝子（ＧＯＩ）を含むトランスファーベクター（ＴＶ）。
１）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子とレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）タンパク；
２）エンベロープタンパク（通常は水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ））；
３）ビリオンタンパク（Ｒｅｖ）タンパクの発現のＨＩＶレギュレーター；および
４）目的遺伝子（ＧＯＩ）を含むトランスファーベクター（ＴＶ）。
最も一般的なアプローチでは、上記の４つのプラスミドを一時的に細胞にトランスフェクトしてレンチウイルスベクターを作製するが、これは労力がかかり、費用もかかる。さらに、一過性のトランスフェクションは、大量のプラスミドＤＮＡを必要とするため、スケーラビリティに限界があり、安全性の懸念も生じている。
一過性トランスフェクションに伴う困難を克服するために必要なのは、レンチウイルスベクターの製造に必要な遺伝子または配列のすべてまたは大部分が、簡単な誘導法によりレンチウイルスベクターの製造を可能にする哺乳動物細胞の染色体に安定的に組み込まれるプロデューサー細胞株（ＰＣＬ）を調製する方法である。この発明は、このようなニーズに応えるものである。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を作製する方法であって、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子と、をコードする発現カセットを含むパッケージングベクターにより、哺乳動物細胞をトランスフェクトすることであって、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって発現カセットが５’末端と３’末端の両方に隣接している、トランスフェクトすることと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を単離することと、を含む方法である。
また、本明細書で提供されるのは、レンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を作製する方法であって、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子と、をコードする発現カセットを含むパッケージングベクターであって、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって発現カセットが５’末端と３’末端の両方に隣接しているパッケージングベクターと、第４のプロモーターの制御下にある目的遺伝子をコードする核酸配列を含むトランスファーベクターであって、核酸配列は、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって５’末端および３’末端の両方に隣接しているトランスファーベクターとにより、哺乳動物細胞をトランスフェクトすることと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を単離することと、を含む、方法である。
さらなる実施形態において、本明細書により提供されるのは、本明細書に記載の方法に従ってレンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を産生することと、第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする核酸配列を含むトランスファーベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクトすることと、発現カセットおよび核酸の産生を誘導することと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを回収する工程を含む、レンチウイルスベクターを産生する方法である。
また、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の方法に従ってレンチウイルスベクター製造哺乳動物細胞を産生することと、発現カセットおよび核酸の産生を誘導することと、哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを回収することと、を含む、レンチウイルスベクターを製造する方法である。
さらなる実施形態において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の方法に従って産生されたレンチウイルスベクターを哺乳動物対象に投与することを含む、レンチウイルスベクターによる治療方法である。
さらなる実施形態において、本明細書で提供されるのは、レンチウイルスベクターを産生する哺乳動物細胞であって、哺乳動物細胞において染色体に組み込まれた核酸分子であって、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子とを含む、核酸分子を含み、核酸配列がトランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）の組換えから生じる配列によって５’末端および３’末端の両方に隣接している、哺乳動物細胞である。
また、本明細書で提供されるのは、レンチウイルスベクターを産生する方法であって、本明細書に記載の哺乳動物細胞をトランスファーベクターでトランスフェクトすることであって、トランスファーベクターは第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする核酸配列を含む、トランスフェクトすることと、発現カセットおよび核酸の産生を誘導することと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを回収することを含む方法である。
さらなる実施形態において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の哺乳動物細胞の目的遺伝子をコードする染色体に組み込まれた核酸配列および染色体に組み込まれた核酸配列の産生を誘導することと、哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを回収することを含む、レンチウイルスベクターを産生する方法である。
特許請求の範囲および／または本明細書において、用語「含む」と共に使用される場合の、語句「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味し得るが、それはまた、「１つ以上」、「少なくとも１つ」および「１つまたはそれ以上」の意味と一致する。
本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、その値を決定するために使用される方法／装置についての誤差の固有の変動を含むことを示すために使用される。典型的には、この用語は、状況に応じて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％の変動を包含することを意味する。
請求項中の「または」という用語の使用は、明示的に選択肢のみに言及することが示されない限り、「および／または」を意味するために使用されるか、または、その選択肢は相互に排他的であるが、開示は、選択肢のみおよび「および／または」に言及する定義を支持する。
本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、用語「備えること」（ならびに「備える（comprise）」および「備える（comprises）」などの任意の形態を含む）、「有すること」（ならびに「有する（have）」および「有する（has）」などの任意の形態を有する）、「含むこと」（ならびに「含む（includes）」および「含む（include）」などの任意の形態を含む）または「含有すること」（ならびに「含有する（contains）」および「含有する（contain）」などの任意の形態を含む）は、包含的またはオープンエンドであり、追加の、非列挙の、エレメントまたは方法ステップを除外しない。本明細書で考察される任意の実施形態は、本発明の任意の方法、システム、宿主細胞、発現ベクター、および／または組成物に関して実施できることが考慮される。さらに、本発明の組成物、システム、細胞、および／または核酸を使用して、本明細書に記載の方法のいずれかを達成することができる。
本明細書で使用される場合、「核酸」、「核酸分子」、または「オリゴヌクレオチド」は、共有結合したヌクレオチドを含む高分子化合物を意味する。「核酸」という用語は、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、これらはいずれも一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、限定されるわけではないが、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、プラスミドまたはベクターＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含む。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＭＩＲＮＡを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのアッセンブリを指し、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸分子を含む。「遺伝子」はまた、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列として作用し得る核酸フラグメントを指す。いくつかの実施形態において、遺伝子は、複数の複製と統合される。いくつかの実施形態において、遺伝子は、予め定義された複製数で統合される。
レンチウイルスベクターとそれらの製造
レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ‐１）に基づく良く研究されたベクター系である。他のレンチウイルス系も遺伝子トランスファー系として開発されており、ＨＩＶ－２サル免疫不全ウイルス、非霊長類レンチウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、牛免疫不全ウイルスなどがある。ヒトにおけるＨＩＶ－１の病原性による安全性への懸念から導かれる、臨床および研究開発の目的で使用される最も広く使用されているレンチウイルス系は、
１）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子とレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）タンパク、
２）エンベロープタンパク（通常は水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ））、
３）ビリオンタンパク（Ｒｅｖ）タンパクの発現のＨＩＶレギュレーター、および
４）目的遺伝子（ＧＯＩ）を含有するトランスファーベクター（ＴＶ）、
を発現する４プラスミド系に基づくものである。
レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ‐１）に基づく良く研究されたベクター系である。他のレンチウイルス系も遺伝子トランスファー系として開発されており、ＨＩＶ－２サル免疫不全ウイルス、非霊長類レンチウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、牛免疫不全ウイルスなどがある。ヒトにおけるＨＩＶ－１の病原性による安全性への懸念から導かれる、臨床および研究開発の目的で使用される最も広く使用されているレンチウイルス系は、
１）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子とレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）タンパク、
２）エンベロープタンパク（通常は水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ））、
３）ビリオンタンパク（Ｒｅｖ）タンパクの発現のＨＩＶレギュレーター、および
４）目的遺伝子（ＧＯＩ）を含有するトランスファーベクター（ＴＶ）、
を発現する４プラスミド系に基づくものである。
伝統的に、ヒト胚性腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）のような哺乳動物細胞は、付着細胞培養物として４つのプラスミドの各々でトランスフェクトされ、次いで、目的の遺伝子を含有する所望のレンチウイルスが産生される。一般に、これらの一時的にトランスフェクトされた細胞はレンチウイルスを産生することができる。
レンチウイルスベクターは、一般に、免疫不全症および神経変性疾患を含む療法および疾患療法のために所望の細胞に導入されるべき目的遺伝子を有して産生される。
本発明は、レンチウイルスを生産する改良された方法を提供し、これには、懸濁液中で増殖させることができ、レンチウイルスの生産量を著しく増加させることができるレンチウイルス生産細胞株を調製する方法が含まれる。
レンチウイルス産生細胞株
実施形態では、本明細書において、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を産生する方法が提供される。本明細書で使用される場合、「レンチウイルスパッケージングベクター含有細胞」は、そのゲノムに組み込まれた、レンチウイルスベクターを産生するのに必要なエレメントを含有するが、レンチウイルスベクターによって担持されるべき所望の目的遺伝子を欠く細胞を指す。レンチウイルスパッケージングベクター含有細胞は、後に、目的遺伝子を含有する、例えば、トランスファーベクターでトランスフェクトし、次いで目的遺伝子を最終的に送達するために所望のレンチウイルスを産生するように誘導することができる。
実施形態では、本明細書において、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を産生する方法が提供される。本明細書で使用される場合、「レンチウイルスパッケージングベクター含有細胞」は、そのゲノムに組み込まれた、レンチウイルスベクターを産生するのに必要なエレメントを含有するが、レンチウイルスベクターによって担持されるべき所望の目的遺伝子を欠く細胞を指す。レンチウイルスパッケージングベクター含有細胞は、後に、目的遺伝子を含有する、例えば、トランスファーベクターでトランスフェクトし、次いで目的遺伝子を最終的に送達するために所望のレンチウイルスを産生するように誘導することができる。
適切には、本明細書に記載される種々の方法を用いて産生され得る細胞は、哺乳動物細胞および細胞株または培養物である。本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物細胞」は、哺乳動物目の任意のメンバー、例えば、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、サル細胞、ハムスター細胞などの由来の細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯＫ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、すべての変異体（例えば、ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）Lonza, Slough, UK）を含むＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、すべての変異体（例えば、ＸＣＥＥＤ（商標）Lonza, Slough, UK）を含むＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ（グルタミンシンテターゼノックアウト）細胞である。例示的なヒト細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ細胞、またはＨＴ１０８０細胞などのヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞を含む。
哺乳動物細胞は、接着性培養物または懸濁培養物のいずれかであり得る哺乳動物細胞培養物を含む。接着性培養物は、基材表面、例えば、プラスチックプレート、ディッシュまたは他の適切な細胞培養増殖プラットホーム上で増殖される細胞を指し、固定依存性であり得る。懸濁培養物とは、例えば、ガスおよび栄養交換のための大きな表面積を可能にする培養フラスコまたは大きな懸濁バット中で維持され得る細胞を指す。懸濁細胞培養物は、適切な混合を提供するために、撹拌または撹拌機構を利用することが多い。懸濁液中に細胞を維持するための培地および条件は、当技術分野において一般的に公知である。例示的な懸濁細胞培養物は、ヒトＨＥＫ２９３クローン細胞を含む。
実施形態では、本明細書に記載の方法は、発現カセットを含むパッケージングベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクトすることを含む。本明細書で使用される場合、「ベクター」または「発現ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどのレプリコンであり、本明細書に記載される核酸分子は、細胞内で結合した核酸分子の複製および／または発現をもたらすために結合され得る。「ベクター」は、エピソームベクター（例えば、プラスミド）および非エピソームベクターを含む。「ベクター」という用語は、核酸分子をインビトロ、インビボまたはエクスビボで細胞に導入するためのウイルスおよび非ウイルスの両方の手段を含む。ベクターという用語は、合成ベクターを含むことができる。ベクターは、トランスフェクション、形質導入、細胞融合およびリポフェクションを含むがこれらに限定されない公知の方法によって所望の宿主細胞に導入され得る。ベクターは、プロモーターを含む種々の調節エレメントを含むことができる。
本明細書で使用される「トランスフェクション」は、ベクターを含む外因性核酸分子の細胞への導入を意味する。「トランスフェクトされた」細胞は、細胞内の外因性の核酸分子を含み、「形質転換された」細胞は、細胞内の外因性の核酸分子が細胞の表現型変化を誘発するものである。トランスフェクトされた核酸分子は、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むことができ、および／または一時的に、または長期間、染色体外に、細胞によって維持することができる。外因性核酸分子またはフラグメントを発現する宿主細胞または生物は、「組換え」、「形質転換」、または「トランスジェニック」生物とよばれる。多くのトランスフェクション技術が、当技術分野において一般的に知られている。例えば、Graham et al., Virology, 52:456 (1973); Sambrook et al., MolecularCloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York (1989);Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); および Chu et al., Gene 13:197 (1981) を参照のこと。適切には、哺乳動物細胞を本明細書に記載のベクターの１つ以上でトランスフェクションすることは、核酸を宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むために、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのトランスフェクション剤または種々の脂質およびポリマーを含む他の適切な薬剤を利用する。
本明細書で使用する場合、「パッケージングベクター」とは、レンチウイルスベクターを産生するのに必要な成分を含有し、最終的なレンチウイルスに目的遺伝子を「パッケージング」するベクターを指す。パッケージングベクターは、ベクターの別個の構成要素を指す発現カセットを含み、トランスフェクトされた細胞に挿入され、最終的にそれによって発現される１つ以上の遺伝子および調節配列を含む。
適切には、パッケージングベクターに使用される発現カセットは、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子と、を含む。他の実施形態では、単一のプロモーターは、ＲＥＶ、ＥＮＶ、ＧＡＧおよびＰＯＬ遺伝子の各々の発現を制御することができ、または１つのプロモーターは、ＧＡＧおよびＰＯＬの発現を制御することができ、第２のプロモーターは、発現またはＲＥＶおよびＥＮＶを制御する。他の組合せも可能であり、本明細書に含まれる。
ビリオンタンパク（ＲＥＶ）の発現のレンチウイルスレギュレーターは、後期遺伝子発現を促進するＲＮＡ結合タンパクである。ウイルスの構造タンパクをコードする、スプライシングされていないあるいは単独スプライシングされたｍＲＮＡの核から細胞質への輸送にも重要である。
レンチウイルスエンベロープ（ＥＮＶ）遺伝子は、適切には水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子であり、細胞プロテアーゼによって表面（ＳＵ）エンベロープ糖タンパクｇｐ１２０と膜貫通（ＴＭ）糖タンパクｇｐ４１に切断されるポリタンパク前駆体をコードする。
ＧＡＧはポリタンパクをコードし、スプライシングされていないｍＲＮＡから翻訳されたポリタンパクがウイルスプロテアーゼ（ＰＲ）によってマトリックスタンパク、キャプシド、ヌクレオカプシドタンパクへと切断される。レンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）は、ＧＡＧｍＲＮＡ翻訳時のリボソームフレームシフトの結果としてＧＡＧ－ＰＯＬポリタンパクとして発現し、酵素タンパクである逆転写酵素、プロテアーゼ、およびインテグラーゼをコードする。これら３つのタンパクはウイルスゲノムとビリオン内で会合している。適切には、ＧＡＧ遺伝子はＨＩＶＧＡＧ遺伝子であり、ＰＯＬ遺伝子はＨＩＶ ＰＯＬ遺伝子である。
好適な実施形態において、発現カセットは、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）により５’末端および３’末端の両方に隣接している。本明細書に詳細に記載されるように、発現カセットを標的細胞のゲノムに特異的に組み込むことを可能にするのは、トランスポゾンＩＴＲ（対応するトランスポサーゼと組み合わせて）の使用である。
レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を製造するための方法は、さらに、所望の核酸（すなわち、発現カセット）を細胞のゲノムに組み込むことを可能にするために、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養し、次いで、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を単離することを含む。
トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養するための方法は、当該技術分野において公知であり、種々の細胞培養培地の使用、細胞の増殖および細胞のゲノムへの構築物の組み込みを促進するための適切なガス濃度／交換および温度制御を含む。
所望の細胞を単離する方法には、ふるい、フィルター装置、細胞選択装置および選別、細胞計数などを含む様々な濾過技術が含まれる。
本明細書に記載されるように、発現カセットの各成分は、プロモーターの制御下にある。本明細書で使用される場合、「制御下」とは、「プロモーター」、「プロモーター配列」、または「プロモーター領域」によって制御される遺伝子を指し、これは、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流側コードまたは非コード遺伝子配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域／配列を指す。言い換えれば、プロモーターと遺伝子は、操作可能な組合せにあるか、または操作可能に連結されている。本明細書において言及される場合、「操作可能な組合せで」、「操作可能な順序で」および「操作可能に連結された」という用語は、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク分子の合成を指向することができるプロモーターが産生されるような方法での核酸配列の連結を指す。用語はまた、機能性タンパクが産生されるような方法でのアミノ酸配列の連結を指す。
本開示のいくつかの実施例では、プロモーター配列は、転写開始部位を含み、バックグラウンド上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流側に延在する。いくつかの実施形態において、プロモーター配列は、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク結合ドメインを含む。真核生物のプロモーターは、「ＴＡＴＡ」ボックスと「ＣＡＴ」ボックスを含むことが多いが、必ずしもそうではない。誘導性プロモーターを含む種々のプロモーターを用いて、例えば、本開示の宿主細胞またはベクターにおいて遺伝子発現を駆動することができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは漏出性プロモーターではない、すなわち、プロモーターは、本明細書に記載される遺伝子産物のいずれも構成的に発現していない。本明細書に記載の他の実施形態において、プロモーターは、外部調節の影響とは無関係にｍＲＮＡ合成を開始する構成的プロモーターである。
適切には、発現カセット中の種々の遺伝子の転写を制御するために使用されるプロモーターは、抑制解除可能なプロモーターである。本明細書で使用する場合、「抑制解除可能なプロモーター」とは、機能的プロモーターと、機能的プロモーターの抑制を引き起こすためにリプレッサーエレメントに結合することができる追加のエレメントまたは配列とを含む構造を指す。「抑制」とは、プロモーターによる下流側のコード遺伝子または非コード遺伝子配列の転写開始の減少または阻害を指す。「リプレッサーエレメント」とは、プロモーターの活性を減少または阻害するように、プロモーター（またはプロモーターの近傍）に結合することができるタンパクまたはポリペプチドを指す。リプレッサーエレメントは、リプレッサーエレメントの基材または結合パートナーと相互作用することができ、その結果、リプレッサーエレメントはコンホメーション変化を起こす。このリプレッサーエレメントのコンホメーション変化は、リプレッサーエレメントがプロモーターを減少させるか阻害する能力を取り除き、その結果、プロモーターの「抑制解除」が起こり、それによってプロモーターが転写開始を進めることができるようになる。「機能的プロモーター」とは、リプレッサーエレメントの動作を欠くプロモーターであって、転写を開始することができるであろうプロモーターを指す。本発明の実施において使用することができる種々の機能的プロモーターは、当該技術分野において公知であり、例えば、ＰＣＭＶ、ＰＨ１、Ｐ１９、Ｐ５、Ｐ４０、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４Ｏｒｆ６、およびＶＡ）のプロモーターを含む。
抑制解除可能なプロモーターとして使用することができる例示的なリプレッサーエレメントおよびそれらに対応する結合パートナーは、当技術分野で公知であり、クミン酸遺伝子スイッチシステム（ＣｕＯオペレーター、ＣｙｍＲリプレッサーおよびクミン酸結合パートナー）（例えば、Mullick et al., "The cumate gene-switch: a system for regulatedexpression in mammalian cells," BMC Biotechnology 6:43 (1-18) (2006)を参照されたく、この開示は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれ、本明細書に記載される抑制解除可能なプロモーターシステムの開示を含む）および本明細書に記載されるＴｅｔＯ／ＴｅｔＲシステム（例えば、Yao et al., "Tetracycline Repressor, tetR, rather than thetetR-Mammalian Cell Transcription Factor Fusion Derivatives, RegulatesInducible Gene Expression in Mammalian Cells," Human Gene Therapy9:1939-1950 (1998)を参照されたく、この開示は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）。例示的な実施形態では、抑制解除可能なプロモーターは、機能的プロモーターおよび１つの２つのテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯまたはＴｅｔＯ２）のいずれかを含む。適切には、発現カセットは、テトラサイクリンリプレッサータンパクを含む、第１、第２および第３の抑制解除可能なプロモーターのリプレッサーエレメントをさらにコードする。
抑制解除可能なプロモーター系を示す模式図が、図１に提供され、本発明の実施形態による例示的パッケージングプラスミドを示す。ＴｅｔＯ配列を含むＣＭＶプロモーターを含む抑制解除可能なプロモーターが注目される（ＣＭＶ－ＴＯ）。ＣＭＶ－ＴＯ抑制解除可能なプロモーターは、ＲＥＶ、ＶＳＶ－ＧおよびＧＡＧ－ＰＯＬ遺伝子に操作可能に連結されて図示されており、すなわち、第１、第２および第３のプロモーターは、いずれも、好適な実施形態において、抑制解除可能なプロモーターであり得る。また、別のプロモーターシステムであるｈＰＧＫプロモーターの制御下にあるＴｅｔＲリプレッサーエレメントも図示されている。
テトラサイクリンリプレッサータンパク（ＴｅｔＲ－ＴｅｔＯ配列のリプレッサーエレメント）がＴｅｔＯ配列に結合すると、ＣＭＶプロモーターは抑制される。つまり、これらのプロモーターからの転写はほとんど、あるいはまったく起こらない。ＴｅｔＲ（適切にはドキシサイクリン（Ｄｏｘ））の結合パートナーが結合すると、ＴｅｔＲタンパクはコンホメーションを変化させ、ＴｅｔＯ配列から遊離し、機能的プロモーターは天然と同じように正常な転写処理を開始する。
図１に示すように、発現カセットは、リプレッサーエレメント、適切にはテトラサイクリンリプレッサータンパクをコードする配列に続くＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）配列をさらに含むことができる。ＫＲＡＢ配列（約７５アミノ酸）は、ヒトジンクフィンガータンパク１０からの転写抑制ドメインであり、リプレッサーエレメント、適切にはＴｅｔＲリプレッサーエレメントの増加した調節を提供する。ＫＲＡＢドメインは、ＤＮＡ結合ドメインによって鋳型ＤＮＡにつながれると、転写リプレッサーとして機能する。また、５’および３’ＩＴＲトランスポゾン配列の例示的な位置が示されている。前述のように、ＩＴＲ配列は、発現カセットの全体が上記の目的の細胞内に転位し、所望の遺伝子のすべてが宿主ゲノム内に挿入されることを可能にするように位置する。
例示的な実施形態では、発現カセットは、細胞のゲノムへのカセットの適切な組込みを決定するための１つ以上のレポーター遺伝子をさらに含む。本明細書において言及されるように、「レポーター遺伝子」は、その発現が容易に同定され測定され得る細胞に表現型を与える遺伝子である。いくつかの実施形態において、レポーター遺伝子は蛍光タンパク遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、レポーター遺伝子は、選択遺伝子を含む。本明細書中で言及されるように、用語「選択遺伝子」は、必須栄養素であるであろうものを欠く培地中で増殖する能力を与える酵素活性をコードする遺伝子の使用を指し、加えて、選択遺伝子は、選択遺伝子が発現される細胞上で抗生物質または薬物に対する耐性を付与し得る。選択遺伝子を用いて、宿主細胞に特定の表現型を与えることができる。宿主細胞が選択培地で増殖するために選択遺伝子を発現しなければならないとき、その遺伝子は正の選択遺伝子とよばれる。選択遺伝子は、特定の遺伝子を含む宿主細胞に対して選択するためにも用いることができ、この方法で用いられる選択遺伝子はネガティブ選択遺伝子とよばれる。例示的な実施形態では、選択遺伝子は、リプレッサータンパクに続くＫＲＡＢ配列の下流、および配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列の下流にも配置される。例示的な実施形態では、選択遺伝子は、例えば、ゲンタマイシン、チミジンキナーゼ、アンピシリン、プリンマイシン、および／またはカナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を含む抗生物質耐性遺伝子である。
本明細書に詳細に記載されるように、トランスポゾン特異的ＩＴＲの使用は、特異性、頻度および安定性が増大した標的細胞のゲノムへの発現カセットの挿入を可能にすることが決定されている。例示的な実施形態において、トランスポゾン特異的ＩＴＲは鱗翅目トランスポゾン（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））ＩＴＲである。
転移因子（トランスポゾン）は、細胞のゲノム中を移動することができ、トランスジェニック生物の生産のための遺伝子を挿入するのに有用である。鱗翅目トランスポゾンＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）は、多種多様な生物種のゲノム内を移動することができ、遺伝子導入ベクターに有用である。トランスポゾン構造は、内部反復（ＩＲ）、スペーサー、および両端の末端反復（ＴＲ）からなる複雑な反復配列と、トランスポサーゼをコードする単一のオープンリーディングフレームを含む。
鱗翅目の転移因子ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）は、もともと、自然発生バキュロウイルスプラーク形態突然変異体内の挿入を破壊する遺伝子として、ＴＮ－３６８イラクサギンウワバ細胞培養から単離された。ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）は、５’１３－ｂｐＴＲ（末端反復）と１９－ｂｐ ＩＲ（内部反復）の間に３－ｂｐのスペーサーを有し、３’ＴＲとＩＲの間に３１－ｂｐのスペーサーを有する非対称な末端反復構造を有する２４７５ｂｐの短い逆方向反復配列である。単一の２．１ｋｂのオープンリーディングフレームは、機能的トランスポサーゼをコードする（Cary et al., 1989; Fraser et al., 1983, 1995; Elick et al., 1996a;Lobo et al., 1999; Handler et al., 1998）。ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）は、独特のカットアンドペースト機構を介して転位し、挿入時に複製される５’ＴＴＡＡ３’標的部位のみに挿入し、正確に切り出してフットプリントを残さない（Elick et al., 1996b; Fraser et al., 1996; Wang and Fraser 1993）。
本明細書中に記載されるプラスミドおよび発現カセット中で使用され得る例示的な鱗翅目のトランスポゾン（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））ＩＴＲは、米国特許第７，１０５，３４３号に開示されるものを包含し、その開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
好適な実施形態において、パッケージングベクターによる哺乳動物細胞のトランスフェクションは、トランスポゾン特異的ＩＴＲを認識するトランスポサーゼの存在下で行われる。このトランスポサーゼは、標的哺乳動物細胞の細胞ゲノムへの発現カセットの転位を容易にする。トランスポサーゼは、活性酵素として、またはｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを含むトランスポサーゼをコードする核酸配列として、細胞に提供することができる。実施形態において、トランスポサーゼは鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポサーゼｍＲＮＡまたは鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポーズｃＤＮＡである。本明細書に記載されているように、鱗翅目トランスポゾン（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））ＩＴＲおよび対応する鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポサーゼを利用する転位の頻度は、適切には、少なくとも約１０－４である。
さらなる実施形態において、本明細書において、レンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を産生する方法が提供される。本明細書で使用される場合、「レンチウイルスベクター産生細胞」は、そのゲノムに組み込まれた、レンチウイルスベクターを産生するのに必要なエレメント、ならびにレンチウイルスベクターによって担持される所望の目的遺伝子を含有する細胞を指す。レンチウイルスベクター産生細胞を後に誘導して、目的遺伝子の最終的な送達のための所望レンチウイルスを産生させることができる。
レンチウイルスベクター産生細胞、特に哺乳動物細胞を産生する方法は、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーター、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子、およびともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子をコードする発現カセットを含むパッケージングベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクトすることを含む。
本明細書に記載されるように、発現カセットは、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）により５’末端および３’末端の両方に適切に隣接し、標的細胞への高転位を促進する。
本方法はさらに、第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする核酸配列を含む、トランスファーベクターで哺乳動物細胞をトランセクトすることを含む。発現カセットと同様に、目的の遺伝子をコードする核酸配列も、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって５’末端と３’末端の両方に適切に隣接しており、転位が増加する。実施形態では、トランスファーベクターおよびパッケージングベクターの両方を同時にトランスフェクトし、他の実施形態では、トランスファーベクターまたはパッケージングベクターを最初にトランスフェクトし、後に他のベクターをトランスフェクトすることができる。
トランスフェクション後、哺乳動物細胞を培養し、レンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を単離する。
レンチウイルスパッケージングベクター含有細胞と同様に、本明細書中で調製されたレンチウイルスベクター産生細胞は、レンチウイルスベクターを産生するために利用することができる所望のタイミングの前に、適切に保存される。適切な貯蔵技術および特性は当技術分野で公知であり、細胞の冷蔵または凍結、ならびにベクター産生の誘導前に細胞を懸濁状態に維持する他の方法を含むことができる。
本明細書に記載されるように、適切には、哺乳動物細胞は哺乳動物細胞培養物であり、実施形態では懸濁培養物である。実例細胞にはＨＥＫ２９３Ｔ細胞が含まれる。
レンチウイルスパッケージングベクター含有細胞の場合と同様に、発現ベクターの遺伝子には、適切には、ＨＩＶＧＡＧ遺伝子であるＧＡＧ遺伝子およびＨＩＶ ＰＯＬ遺伝子であるＰＯＬ遺伝子が含まれる。適切には、レンチウイルスエンベロープ遺伝子は水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である。
レンチウイルスベクター産生細胞に使用するための例示的なプロモーターは、当該技術分野で公知であり、抑制解除可能なプロモーターを含み、適切には、発現カセットは、第１、第２および第３の抑制解除可能なプロモーターのリプレッサーエレメントをさらにコードする。実施形態では、抑制解除可能なプロモーターは、機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含み、リプレッサーエレメントはテトラサイクリンリプレッサータンパクである。トランスポゾン特異的ＩＴＲを含む発現カセットのさらなる特徴を本明細書に記載する。
適切な実施形態では、レンチウイルスベクターに含まれる目的遺伝子は、治療目的の遺伝子である。本明細書で言及されるように、用語「目的遺伝子」または「ＧＯＩ」は、異種遺伝子を記述するために使用される。本明細書で言及されるように、用語「異種遺伝子」または「ＨＧ」は、コード配列または制御配列などの核酸配列に関連し、通常は一緒に結合されていない、および／または通常は特定の細胞に関連していない核酸配列、例えば遺伝子を示す。いくつかの実施形態において、異種遺伝子は、コード配列自体が天然に見出されない構築物である（例えば、天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子変異または天然に生じる突然変異事象は、本明細書で使用されるように、異種ＤＮＡを生じない。
本明細書において言及されるように、用語「治療目的の遺伝子」は、任意の機能的に関連するヌクレオチド配列を指す。したがって、本開示の治療目的の遺伝子は、治療標的細胞ゲノムに欠陥があるか欠損しているタンパクをコードするか、または所望の生物学的もしくは治療効果（例えば、抗ウイルス機能）を有する非天然タンパクをコードする任意の所望の遺伝子を含むことができ、または配列は、アンチセンスもしくはリボザイム機能を有する分子に対応することができる。治療目的の適切な遺伝子の代表的な（非限定的である）例には、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性および感染性疾患の治療に用いられるものが含まれ、それらには、ＡＩＤＳ、癌、神経疾患、心血管疾患、高コレステロール血症などの障害；各種貧血、サラセミアおよび血友病を含む各種血液障害；のう胞性線維症、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損、肺気腫などの遺伝的欠陥が含まれる。癌およびウイルス疾患のためのアンチセンス治療において有用であるいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡの翻訳開始部位（ＡＵＧコドン）の周りの配列に相補的な短いオリゴヌクレオチド）が、当技術分野において記載されており、また、治療目的の適切な遺伝子の実施例でもある。
図２は、目的遺伝子（例示目的のための増強緑色蛍光タンパク）を含む例示的なトランスファーベクターを示す。目的遺伝子は、プロモーター、適切には構成的プロモーター、この場合はＣＭＶプロモーターの制御下にある。また、５’および３’トランスポゾン配列の例示的な位置が示されている。前述のように、ＩＴＲ配列は、目的の遺伝子およびプロモーターを含む核酸の全体が目的細胞に移送され、所望の遺伝子のすべてが宿主ゲノムに挿入されることを可能にするように位置する。示されるように、例示的なトランスファーベクターはまた、選択遺伝子、この場合、目的遺伝子の下流側のブレオマイシン耐性遺伝子を含む。トランスファーベクターの付加エレメントを図２に示す。
さらなる実施形態において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるレンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を産生または提供し、次いで、第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする核酸配列を含む、トランスファーベクターで哺乳動物細胞にトランスフェクトすることを含む、レンチウイルスベクターを産生する方法である。細胞ゲノムへの目的遺伝子の導入に続いて、発現カセットおよび目的遺伝子をコードする核酸の産生が誘導される。次いで、細胞を培養し、最後に、目的遺伝子を含有するレンチウイルスベクターを回収する。
なおさらなる実施形態において、レンチウイルスベクターを産生する方法は、本明細書に記載のレンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を産生または提供することを好適に包含する。発現カセットの産生および目的遺伝子をコードする核酸が誘導される。次いで、細胞を培養し、最後に、目的遺伝子を含有するレンチウイルスベクターを回収する。
本明細書に記載の細胞を用いてレンチウイルスベクターを産生する方法は、単にレンチウイルスパッケージングベクターを含有するか、または、細胞ゲノムに組み込まれた目的遺伝子も含有するかにかかわらず、誘導が開始する時期および誘導が起こる条件を制御するだけでなく、大量のレンチウイルスベクターを産生するための機構を提供する。誘導は、適切には、リプレッサーエレメントと相互作用し、それによって抑制解除可能なプロモーターを抑制解除し、レンチウイルスベクターのパッケージングコンポーネントの産生を可能にする化学物質または薬剤の導入を含む。
本明細書に記載されているように、発現カセット中の各プロモーターは、適切には、機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含む抑制解除可能なプロモーターであり、リプレッサーエレメントはテトラサイクリンリプレッサータンパクである。上記実施形態において、パッケージングコンポーネントの誘導は、哺乳動物細胞にドキシサイクリンを添加することを含む。
本明細書に記載の方法は、細胞ゲノムへの所望の核酸配列の挿入の増加の結果としてのレンチウイルスベクターの生産量の増加、および大量生産を可能にする懸濁ベースの細胞培養を提供する。実施形態において、産生されるレンチウイルスベクターの量は、少なくとも約１０４、より適切には約１０５または約１０６形質導入ユニット／ｍＬであり、約１～５日間以内、適切には細胞の誘導後約２日間である。
本明細書に記載の細胞を用いる製造方法は、撹拌タンク、エアリフト、繊維、極細繊維、中空繊維、セラミックマトリックス、流動床、固定床、および／または噴出床バイオリアクターを含むがこれらに限定されない任意の適切な反応器を利用することができる。本明細書で使用される場合、「反応器」は、発酵器もしくは発酵ユニット、または任意の他の反応容器を含むことができ、「反応器」という用語は、「発酵器」と交換可能に使用される。用語発酵器もしくは発酵は、微生物培養物および哺乳動物培養物の両方を指す。例えば、いくつかの態様では、例示的バイオリアクターユニットは、以下の、栄養素および／または炭素源の供給、好適なガス（例えば、酸素）の注入、発酵または細胞培養培地の入口および出口の流れ、気相および液相の分離、温度の維持、酸素およびＣＯ２濃度の維持、ｐＨ濃度の維持、アジテーション（例えば、撹拌）、および／または洗浄／殺菌のうちの１つ以上またはすべてを行うことができる。発酵ユニットのような例の反応器ユニットは、ユニット内に複数の反応器を含むことができ、例えば、ユニットは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個以上のバイオリアクターを各ユニット内に有することができ、および／またはファシリティは、ファシリティ内に単一または複数の反応器を有する複数のユニットを含むことができる。様々な実施形態において、バイオリアクターは、バッチ式、半流加バッチ、流加バッチ、潅流、および／または連続発酵プロセスに適することができる。任意の適切な反応器直径を使用することができる。実施形態において、バイオリアクターは、約１００ｍＬから約５０，０００Ｌの間の容量を有することができる。非限定的な例としては、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル、および／または５０，０００リットルが挙げられる。さらに、適切な反応器は、多用途、単一用途、ディスポーザブル、または非ディスポーザブルであり得、ステンレススチール（例えば、３１６Ｌまたは他の適切なステンレススチール）およびインコネル、プラスチック、および／またはガラスなどの金属合金を含む任意の適切な材料で形成することができる。
本明細書に記載されているように、細胞株を産生することを用いてレンチウイルスを産生する方法の少なくとも一部を、シードトレイン産生、細胞継代、大容量細胞培養および／または主要な製造段階を含む抗生物質の非存在下で実施することができることが、驚くべきことに、決定された。レンチウイルス産生処理の少なくとも一部から抗生物質を除去することにより、結果として得られる方法は、細胞処理および最終的にヒトで利用される製品における抗生物質の使用に関連する懸念を低減または除去する。
図１０は、本明細書に記載されるようなプロデューサー細胞株からレンチウイルスを調製するための例示的な製造プロセスフローを示す。示すように、ＰＣＬクローンは、最初に生成され、次いで、ラージスケール製造プロセスで使用するために選択される。製造プロセスの初期段階の間に、ＰＣＬは約３回（例えば、約２Ｌの体積）まで継代され、その時点で、ピューロマイシンおよび／またはゼオシンなどの抗生物質をプロセスから除去することができる。次いで、継代は、例えば、継代数３、継代数４、継代数５などの抗生物質の非存在下で、所望の体積の細胞に達するまで継続することができる。例えば、図１０に示すように、適切には、抗生物質の非存在下で、バイオリアクター中で約５０Ｌの体積に達する。次いで、ＰＣＬは、レンチウイルスベクターの産生を開始するために適切に誘導される（例えば、本明細書に記載のドキシサイクリンを使用して）。したがって、実施形態において、哺乳動物細胞（ＰＣＬ）の培養の少なくとも一部は、抗生物質の非存在下で起こり、この期間は、適切には、継代数３から誘導フェーズまでである。誘導後、回収（ベンゾナーゼ処理および清澄化工程を含む）およびレンチウイルスベクターの精製（接線流濾過および無菌濾過を含む）を含む下流側のプロセスを行うことができる。本明細書に記載されるようなＰＣＬを用いてレンチウイルスベクター製造プロセスのかなりの部分を実施する能力は、驚くべきかつ予期せぬ結果であり、ラージスケール製造プロセスに著しい利点を提供する。
また、本明細書で提供されるのは、哺乳動物対象、適切にはヒト対象を、本明細書に記載の種々の方法に従って産生されたレンチウイルスベクターで治療する方法である。適切には、方法は、治療目的の遺伝子を含む、目的遺伝子を有するヒト対象を治療するために使用される。ヒト対象への投与は、例えば、吸入、注射、または静脈内投与、ならびに当技術分野で公知の他の投与方法を含むことができる。
また、本明細書で提供されるのは、レンチウイルスベクターを産生するための哺乳動物細胞である。本明細書に記載の方法、またはその変形を用いて、哺乳動物細胞において染色体に組み込まれた核酸分子を含む哺乳動物細胞が容易に作製され、核酸分子は、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子を含む。さらなる実施形態において、ゲノムに組み込まれたパッケージングコンポーネントを含有する哺乳動物細胞は、第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする染色体に組み込まれた核酸配列をさらに含むことができる。
本明細書に記載されるように、ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）トランスポサーゼを含むトランスポサーゼに基づく方法を使用すると、宿主細胞ゲノム中の核酸配列が、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）の組換えから得られる配列によって５’末端および３’末端の両方に隣接することになる。
発現カセットおよび目的遺伝子をコードする核酸の遺伝子コンポーネントと同様に、例示的な哺乳動物細胞が本明細書に記載される。
これらの細胞を利用してレンチウイルスを産生する方法は、本明細書に記載されており、適切には、目的遺伝子をコードする発現カセットおよび核酸の産生を誘導すること、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養すること、およびレンチウイルスベクターを回収することを含む。
さらなる例示的実施形態
実施形態１は、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を作製する方法であって、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子と、をコードする発現カセットを含むパッケージングベクターにより、哺乳動物細胞をトランスフェクトすることであって、発現カセットは、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって５’末端と３’末端の両方に隣接している、トランスフェクトすることと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を単離することと、を含む方法である。
実施形態１は、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を作製する方法であって、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子と、をコードする発現カセットを含むパッケージングベクターにより、哺乳動物細胞をトランスフェクトすることであって、発現カセットは、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって５’末端と３’末端の両方に隣接している、トランスフェクトすることと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を単離することと、を含む方法である。
実施形態２は、哺乳動物細胞が哺乳動物細胞培養物である、実施形態１記載の方法を含む。
実施形態３は、哺乳動物細胞培養物が懸濁培養物である、実施形態２の方法を含む。
実施形態４には、哺乳動物細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞であることを特徴とする、実施形態３の方法が含まれる。
実施形態５は、ＧＡＧ遺伝子がＨＩＶ ＧＡＧ遺伝子であり、ＰＯＬ遺伝子がＨＩＶＰＯＬ遺伝子である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法を含む。
実施形態６は、レンチウイルスエンベロープ遺伝子が水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法を含む。
実施形態７は、第１、第２および第３のプロモーターが抑制解除可能なプロモーターである、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法を含む。
実施形態８は、発現カセットが、第１、第２および第３の抑制解除可能なプロモーターのリプレッサーエレメントをさらにコードする、実施形態７の方法を含む。
実施形態９は、抑制解除可能なプロモーターの各々が機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含み、リプレッサーエレメントがテトラサイクリンリプレッサータンパクである、実施形態８記載の方法を含む。
実施形態１０は、発現カセットがテトラサイクリンリプレッサータンパクをコードする配列に続くＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス配列をさらに含む、実施形態９記載の方法を含む。
実施形態１１は、トランスポゾン特異的ＩＴＲが鱗翅目トランスポゾン（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））ＩＴＲである、実施形態１～１０のいずれか１つの方法を含む。
実施形態１２は、トランスフェクトが、トランスポゾン特異的ＩＴＲを認識するトランスポサーゼの存在下にある、実施形態１～１１のいずれか１つの方法を含む。
実施形態１３は、トランスポサーゼが鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポサーゼｍＲＮＡまたは鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポーズｃＤＮＡである、実施形態１２記載の方法を含む。
実施形態１４は、レンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を産生する方法であって、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子と、をコードする発現カセットを含むパッケージングベクターであって、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって発現カセットが５’末端と３’末端の両方に隣接しているパッケージングベクターと、第４のプロモーターの制御下にある目的遺伝子をコードする核酸配列を含むトランスファーベクターであって、核酸配列は、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって５’末端および３’末端の両方に隣接しているトランスファーベクターとにより、哺乳動物細胞をトランスフェクトすることと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を単離することと、を含む。
実施形態１５は、哺乳動物細胞が哺乳動物細胞培養物である、実施形態１４記載の方法を含む。
実施形態１６は、哺乳動物細胞培養物が懸濁培養物である、実施形態１５記載の方法を含む。
実施形態１７は、哺乳動物細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、実施形態１６の方法を含む。
実施形態１８は、ＧＡＧ遺伝子がＨＩＶ ＧＡＧ遺伝子であり、ＰＯＬ遺伝子がＨＩＶＰＯＬ遺伝子である、実施形態１４～１７のいずれか１つに記載の方法を含む。
実施形態１９は、レンチウイルスエンベロープ遺伝子が水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である実施形態１４～１８のいずれか１つに記載の方法を含む。
実施形態２０は、第１、第２および第３のプロモーターが抑制解除可能なプロモーターである、実施形態１４～１９のいずれか１つに記載の方法を含む。
実施形態２１は、発現カセットが、第１、第２および第３の抑制解除可能なプロモーターのリプレッサーエレメントをさらにコードする、実施形態２０に記載の方法を含む。
実施形態２２は、抑制解除可能なプロモーターの各々が機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含み、リプレッサーエレメントがテトラサイクリンリプレッサータンパクである、実施形態２１記載の方法を含む。
実施形態２３は、発現カセットがテトラサイクリンリプレッサータンパクをコードする配列に続くＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス配列をさらに含む、実施形態２２記載の方法を含む。
実施形態２４は、トランスポゾン特異的ＩＴＲが鱗翅目トランスポゾン（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））ＩＴＲである、実施形態１４～２３のいずれか１つの方法を含む。
実施形態２５は、トランスフェクトがトランスポゾン特異的ＩＴＲを認識するトランスポサーゼの存在下にある実施形態１４～２４のいずれか１つの方法を含む。
実施形態２６は、トランスポサーゼが鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポサーゼｍＲＮＡまたは鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポーズｃＤＮＡである、実施形態２５記載の方法を含む。
実施形態２７は、目的遺伝子が治療目的遺伝子である、実施形態１４～２６のいずれか１つの方法を含む。
実施形態２８は、レンチウイルスベクターを製造する方法であって、実施形態１に記載のレンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を産生することと、哺乳動物細胞をトランスファーベクターでトランスフェクトすることであって、第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする核酸配列を含み、発現カセットおよび前記核酸の産生を誘導することと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを回収することと、を含む、方法である。
実施形態２９は、レンチウイルスベクターを製造する方法であって、実施形態１４に記載のレンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を産生することと、発現カセットおよび核酸の産生を誘導することと、哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを回収することと、を含む方法である。
実施形態３０は、発現カセット中のプロモーターの各々が、機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含む抑制解除可能なプロモーターであり、リプレッサーエレメントがテトラサイクリンリプレッサータンパクであり、誘導が哺乳動物細胞にドキシサイクリンを添加することを含む、実施形態２８または実施形態２９の方法を含む。
実施形態３１は、産生されるレンチウイルスベクターの量が、誘導の２日後に少なくとも約１０６形質導入ユニット／ｍＬである、実施形態２８または実施形態２９記載の方法を含む。
実施形態３２は、実施形態２８または実施形態２９に従って産生されたレンチウイルスベクターを哺乳動物対象に投与することを含む、レンチウイルスベクターにより治療する方法である。
実施形態３３は、投与が吸入、注射または静脈内投与を含む、実施形態３２記載の方法を含む。
実施形態３４は、レンチウイルスベクターを製造するための哺乳動物細胞であって、哺乳動物細胞において染色体に組み込まれた核酸分子であって、該核酸分子は、第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子発現のレンチウイルスレギュレーターと、第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子とレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子と、を含み、ここで、核酸配列は、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）の組換えから生じる配列によって５’末端と３’末端の両方に隣接している、核酸分子を含む、哺乳動物細胞である。
実施形態３５は、第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする染色体に組み込まれた核酸配列をさらに含む、実施形態３４の哺乳動物細胞を含む。
実施形態３６は、哺乳動物細胞が哺乳動物細胞培養物である、実施形態３４または実施形態３５の哺乳動物細胞を含む。
実施形態３７は、哺乳動物細胞培養物が懸濁培養物である、実施形態３６記載の哺乳動物細胞を含む。
実施形態３８は、実施形態３７の哺乳動物細胞を含み、ここに、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
実施形態３９は、ＧＡＧ遺伝子がＨＩＶ ＧＡＧ遺伝子であり、ＰＯＬ遺伝子がＨＩＶＰＯＬ遺伝子である、実施形態３４～３８のいずれか１つの哺乳動物細胞を含む。
実施形態４０は、レンチウイルスエンベロープ遺伝子が水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である、実施形態３４～３９のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞を含む。
実施形態４１は、実施形態３４～４０のいずれか１つの哺乳動物細胞を含み、ここで、第１、第２および第３のプロモーターは、抑制解除可能なプロモーターである。
実施形態４２は、発現カセットが、第１、第２および第３の抑制解除可能なプロモーターのリプレッサーエレメントをさらにコードする、実施形態４１の哺乳動物細胞を含む。
実施形態４３は、抑制解除可能なプロモーターの各々が機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含み、リプレッサーエレメントがテトラサイクリンリプレッサータンパクである実施形態４２の哺乳動物細胞を含む。
実施形態４４は、発現カセットがテトラサイクリンリプレッサータンパクをコードする配列に続くＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス配列をさらに含む、実施形態４３記載の哺乳動物細胞を含む。
実施形態４５は、トランスポゾン特異的ＩＴＲが鱗翅目トランスポゾン（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））ＩＴＲである、実施形態３４～４４のいずれか１つの哺乳動物細胞を含む。
実施形態４６は、目的遺伝子が治療目的遺伝子である、実施形態３５記載の哺乳動物細胞を含む。
実施形態４７は、レンチウイルスベクターを製造する方法であって、実施形態３４の哺乳動物細胞をトランスファーベクターでトランスフェクトすることであって、トランスファーベクターは第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする核酸配列を含む、トランスフェクトすることと、発現カセットおよび核酸の産生を誘導することと、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを回収することと、を含む方法である。
実施形態４８は、レンチウイルスベクターを製造する方法であって、実施形態３５の哺乳動物の関心目的遺伝子をコードする染色体に組み込まれた核酸配列および染色体に組み込まれた核酸配列の産生を誘導することと、哺乳動物細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを回収することと、を含む。
実施形態４９は、方法実施形態４７または実施形態４８を含み、発現カセット中のプロモーターの各々は、機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含む抑制解除可能なプロモーターであり、リプレッサーエレメントはテトラサイクリンリプレッサータンパクであり、誘導は哺乳動物細胞にドキシサイクリンを添加することを含む。
実施形態５０は、産生されるレンチウイルスベクターの量が、誘導の２日後に少なくとも約１０６形質導入ユニット／ｍＬである、方法実施形態４７または実施形態４８を含む。
実施形態５１は、レンチウイルスベクターで治療する方法であって、実施形態４７または実施形態４８に従って産生されたレンチウイルスベクターを哺乳動物対象に投与することを含む、方法である。
実施形態５２は、投与が吸入、注射または静脈内投与を含む、実施形態５１記載の方法を含む。
実施形態５３は、哺乳動物細胞の培養の少なくとも一部が抗生物質の非存在下で起こる、実施形態２８～３１および４７～５０のいずれかの方法を含む。
実施形態５４は、培養の一部が継代数３から誘導フェーズまでである、実施形態５３に記載の方法を含む。
実施例
実施例
実施例１：レンチウイルス産生細胞株の設計および構築物
材料および方法
レンチウイルス産生細胞株を構築するため、２種類のプラスミドを設計した：
１）調節された様式でＧＡＧ－Ｐｏｌ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｒｅｖを発現するパッケージングプラスミド、および
２）目的遺伝子を発現するトランスファーベクター。
材料および方法
レンチウイルス産生細胞株を構築するため、２種類のプラスミドを設計した：
１）調節された様式でＧＡＧ－Ｐｏｌ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｒｅｖを発現するパッケージングプラスミド、および
２）目的遺伝子を発現するトランスファーベクター。
ＶＳＶ‐Ｇのコード配列、およびＲｅｖは、タンパクの実際のアミノ酸配列を変化させずにタンパク合成を増加させる最も有効な方法の一つとして、コドン最適化（ｃｏ）が証明されているので、コドン最適化（ｃｏ）されている。
ＧＡＧ－Ｐｏｌをコードする配列はコドン最適化されていない。これらの配列はすべてＣＭＶ－ＴＯプロモーターの制御下に置かれ、その活性はＴｅｔＲによってテトラサイクリンまたはドキシサイクリンの非存在下で抑制される。我々のデザインでは、ＣＭＶ‐ＴＯのより厳密な調節を達成するために、ヒトジンクフィンガータンパク１０からの転写抑制ドメインであるＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）の配列をＴｅｔＲコード配列の直後に挿入した。
ＴｅｔＲへのその結合時におけるドキシサイクリンの添加は、ＴｅｔＲのコンホメーション変化を誘発してＣＭＶ－ＴＯからＴｅｔＲを放出する。その結果、ＣＭＶ‐ＴＯは活性化し、ＶＳＶ‐Ｇ、Ｒｅｖ、ＧＡＧ‐Ｐｏｌを発現する。ＶＳＶ－Ｇ、Ｒｅｖ、およびＧＡＧ－Ｐｏｌの調節された発現は、これらのタンパクに関連するあらゆる細胞毒性を最小限にし、またレンチウイルスベクター産生を任意の誘導前の基礎レベルに保つ。選択処理を容易にするために、抗生物質耐性マーカー（ピューロマイシン）をＩＲＥＳ配列の下流側のこのプラスミドに導入し、これをＫＲＡＢ配列の直後に置いた。したがって、ヒトホスホグリセリン酸プロモーターは、ＴｅｔＲ－ＫＲＡＢおよびピューロマイシン耐性遺伝子の発現を全面的に駆動する。
レンチウイルスベクター産生を試験するために、目的遺伝子（ＧＯＩ）として増強緑色蛍光タンパク（ｅＧＦＰ）を選択した。それをＣＭＶプロモーター下に置いて恒常的発現させた。選択処理をより効率的にするために、ブレオマイシン耐性マーカー（ＢｌｅｏＲ）をトランスファーベクターに導入した。
従来のアプローチでは、発現カセットの統合は、ランダム統合イベントに依存する。したがって、それは本質的に管理された効率的なプロセスではなかった。さらに、不完全な発現カセットを有する断片化された部分的抗生物質マーカー（複数可）が偶然に染色体に組み込まれ得るので、最終的に選択されたクローンは、偽陽性（すなわち、意図されたＧＯＩを発現しない）であり得る。
プロデューサー細胞株生成のこれらの望ましくない事象を回避するために、パッケージングおよびトランスファーベクタープラスミド中のすべての発現カセットをＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）逆位末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接させた。ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）トランスポサーゼはこれらのＩＴＲ配列を特異的に認識し、ｉｎｖｉｖｏで部位特異的組換えを促進する。したがって、ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）トランスポサーゼｍＲＮＡの同時トランスフェクションに際して、全発現カセットを含むプラスミド領域は、細胞の染色体に効率的に組み込まれる。
パッケージングベクターの模式図を図１に示し、トランスファーベクターの模式図を図２に示す。プロモーターをもつｅＧＦＰをコードする配列を示す。ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）５’および３’ＩＴＲも示される。５’ＬＴＲ、ＨＩＶ‐１ψ、ＲＲＥ、ｃＰＰＴ／ＣＴＳ，３’ＬＴＲなどのレンチウイルスベクター産生のエレメントも示される。
図１に示されるパッケージングベクターについての核酸配列は、以下に提供される：
ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCCCGCCGGGTAACTCACGGGGTATCCATGTCCATTTCTGCGGCATCCAGCCAGGATACCCGTCCTCGCTGACGTAATATCCCAGCGCCGCACCGCTGTCATTAATCTGCACACCGGCACGGCAGTTCCGGCTGTCGCCGGTATTGTTCGGGTTGCTGATGCGCTTCGGGCTGACCATCCGGAACTGTGTCCGGAAAAGCCGCGACGAACTGGTATCCCAGGTGGCCTGAACGAACAGTTCACCGTTAAAGGCGTGCATGGCCACACCTTCCCGAATCATCATGGTAAACGTGCGTTTTCGCTCAACGTCAATGCAGCAGCAGTCATCCTCGGCAAACTCTTTCCATGCCGCTTCAACCTCGCGGGAAAAGGCACGGGCTTCTTCCTCCCCGATGCCCAGATAGCGCCAGCTTGGGCGATGACTGAGCCGGAAAAAAGACCCGACGATATGATCCTGATGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTAAGATCTAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAAGCCATACCAATGGGCCCTAAAAAAGGAATCCAGTCAATTCCGGGGCTAAACCTGGCTGCCACTGTTTCTTTAGGGACTTCGTTCCTGTGAGGACAccTGCAggCCGGCCGGATccTAGgTATacGCGtTAATTAaAGCTTGTTAACGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGAACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGATCGTCGACGAGgtgagtttggggacccttgattgttctttctttttcgctattgtaaaattcatgttatatggagggggcaaagttttcagggtgttgtttagaatgggaagatgtcccttgtatcaccatggaccctcatgataattttgtttctttcactttctactctgttgacaaccattgtctcctcttattttcttttcattttctgtaactttttcgttaaactttagcttgcatttgtaacgaatttttaaattcacttttgtttatttgtcagattgtaagtactttctctaatcacttttttttcaaggcaatcagggtatattatattgtacttcagcacagttttagagaacaattgttataattaaatgataaggtagaatatttctgcatataaattctggctggcgtggaaatattcttattggtagaaacaactacatcctggtcatcatcctgcctttctctttatggttacaatgatatacactgtttgagatgaggataaaatactctgagtccaaaccgggcccctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCTGCCACCATGGCTGGAAGATCTGGCGACTCTGACGAGGACCTGCTGAAAGCTGTGCGGCTGATCAAGTTCCTGTACCAGAGCAACCCTCCACCTAATCCTGAGGGCACCAGACAGGCCAGAAGAAACAGGCGGAGAAGATGGCGCGAGCGGCAGAGACAGATCCACTCCATCTCCGAGCGGATCCTGTCCACCTACCTGGGAAGATCCGCTGAGCCTGTTCCTCTGCAGCTGCCTCCTCTGGAAAGACTGACCCTGGACTGCAACGAGGACTGCGGCACCTCTGGAACACAAGGCGTTGGCTCTCCACAGATCCTGGTGGAAAGCCCCACCATCCTGGAATCCGGCGCCAAAGAATGAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTG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ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCCCGCCGGGTAACTCACGGGGTATCCATGTCCATTTCTGCGGCATCCAGCCAGGATACCCGTCCTCGCTGACGTAATATCCCAGCGCCGCACCGCTGTCATTAATCTGCACACCGGCACGGCAGTTCCGGCTGTCGCCGGTATTGTTCGGGTTGCTGATGCGCTTCGGGCTGACCATCCGGAACTGTGTCCGGAAAAGCCGCGACGAACTGGTATCCCAGGTGGCCTGAACGAACAGTTCACCGTTAAAGGCGTGCATGGCCACACCTTCCCGAATCATCATGGTAAACGTGCGTTTTCGCTCAACGTCAATGCAGCAGCAGTCATCCTCGGCAAACTCTTTCCATGCCGCTTCAACCTCGCGGGAAAAGGCACGGGCTTCTTCCTCCCCGATGCCCAGATAGCGCCAGCTTGGGCGATGACTGAGCCGGAAAAAAGACCCGACGATATGATCCTGATGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTAAGATCTAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAAGCCATACCAATGGGCCCTAAAAAAGGAATCCAGTCAATTCCGGGGCTAAACCTGGCTGCCACTGTTTCTTTAGGGACTTCGTTCCTGTGAGGACAccTGCAggCCGGCCGGATccTAGgTATacGCGtTAATTAaAGCTTGTTAACGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGAACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGATCGTCGACGAGgtgagtttggggacccttgattgttctttctttttcgctattgtaaaattcatgttatatggagggggcaaagttttcagggtgttgtttagaatgggaagatgtcccttgtatcaccatggaccctcatgataattttgtttctttcactttctactctgttgacaaccattgtctcctcttattttcttttcattttctgtaactttttcgttaaactttagcttgcatttgtaacgaatttttaaattcacttttgtttatttgtcagattgtaagtactttctctaatcacttttttttcaaggcaatcagggtatattatattgtacttcagcacagttttagagaacaattgttataattaaatgataaggtagaatatttctgcatataaattctggctggcgtggaaatattcttattggtagaaacaactacatcctggtcatcatcctgcctttctctttatggttacaatgatatacactgtttgagatgaggataaaatactctgagtccaaaccgggcccctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCTGCCACCATGGCTGGAAGATCTGGCGACTCTGACGAGGACCTGCTGAAAGCTGTGCGGCTGATCAAGTTCCTGTACCAGAGCAACCCTCCACCTAATCCTGAGGGCACCAGACAGGCCAGAAGAAACAGGCGGAGAAGATGGCGCGAGCGGCAGAGACAGATCCACTCCATCTCCGAGCGGATCCTGTCCACCTACCTGGGAAGATCCGCTGAGCCTGTTCCTCTGCAGCTGCCTCCTCTGGAAAGACTGACCCTGGACTGCAACGAGGACTGCGGCACCTCTGGAACACAAGGCGTTGGCTCTCCACAGATCCTGGTGGAAAGCCCCACCATCCTGGAATCCGGCGCCAAAGAATGAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTG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図２に示すトランスファーベクターについての核酸配列を以下に示す：
ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCCCGCCGGGTAACTCACGGGGTATCCATGTCCATTTCTGCGGCATCCAGCCAGGATACCCGTCCTCGCTGACGTAATATCCCAGCGCCGCACCGCTGTCATTAATCTGCACACCGGCACGGCAGTTCCGGCTGTCGCCGGTATTGTTCGGGTTGCTGATGCGCTTCGGGCTGACCATCCGGAACTGTGTCCGGAAAAGCCGCGACGAACTGGTATCCCAGGTGGCCTGAACGAACAGTTCACCGTTAAAGGCGTGCATGGCCACACCTTCCCGAATCATCATGGTAAACGTGCGTTTTCGCTCAACGTCAATGCAGCAGCAGTCATCCTCGGCAAACTCTTTCCATGCCGCTTCAACCTCGCGGGAAAAGGCACGGGCTTCTTCCTCCCCGATGCCCAGATAGCGCCAGCTTGGGCGATGACTGAGCCGGAAAAAAGACCCGACGATATGATCCTGATGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTAAGATCTAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAAGCCATACCAATGGGCCCTAAAAAAGGAATCCAGTCAATTCCGGGGCTAAACCTGGCTGCCACTGTTTCTTTAGGGACTTCGTTCCTGTGAGGACAccTGCAggCCGGCCGGATccTAGgTATacGCGtTAATTAaAGCTTGTTAACGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGCGCGTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAG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ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCCCGCCGGGTAACTCACGGGGTATCCATGTCCATTTCTGCGGCATCCAGCCAGGATACCCGTCCTCGCTGACGTAATATCCCAGCGCCGCACCGCTGTCATTAATCTGCACACCGGCACGGCAGTTCCGGCTGTCGCCGGTATTGTTCGGGTTGCTGATGCGCTTCGGGCTGACCATCCGGAACTGTGTCCGGAAAAGCCGCGACGAACTGGTATCCCAGGTGGCCTGAACGAACAGTTCACCGTTAAAGGCGTGCATGGCCACACCTTCCCGAATCATCATGGTAAACGTGCGTTTTCGCTCAACGTCAATGCAGCAGCAGTCATCCTCGGCAAACTCTTTCCATGCCGCTTCAACCTCGCGGGAAAAGGCACGGGCTTCTTCCTCCCCGATGCCCAGATAGCGCCAGCTTGGGCGATGACTGAGCCGGAAAAAAGACCCGACGATATGATCCTGATGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTAAGATCTAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAAGCCATACCAATGGGCCCTAAAAAAGGAATCCAGTCAATTCCGGGGCTAAACCTGGCTGCCACTGTTTCTTTAGGGACTTCGTTCCTGTGAGGACAccTGCAggCCGGCCGGATccTAGgTATacGCGtTAATTAaAGCTTGTTAACGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGCGCGTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAG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ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の単一細胞クローンを分離し、パッケージングおよびトランスファーベクタープラスミドのトランスフェクションに適応した。ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）トランスポサーゼの効果を試験および確認するために、ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）トランスポサーゼｍＲＮＡの非存在下または存在下でトランスフェクションを実施した。トランスフェクションにはＰＥＩｐｒｏトランスフェクション剤を用いた。
レンチ－ｅＧＦＰのパッケージング細胞株を作製するために、パッケージングプラスミドおよびｅＧＦＰをコードするトランスファーベクターを同時トランスフェクトした。パッケージング単独のためのパッキング細胞株（すなわち、目的の遺伝子発現がない）を作製するために、パッケージングプラスミド単独をトランスフェクトした。トランスフェクションの４日後に、レンチ－ｅＧＦＰのためのピューロマイシンおよびゼオシン、およびパッケージング細胞株のためのピューロマイシンのみを添加することによって、安定にトランスフェクトされた細胞を選択した。
結果
トランスポサーゼｍＲＮＡの同時トランスフェクションは抗生物質耐性コロニーを有意に増強し、トランスポサーゼ発現が実際に発現カセットの染色体積分を促進することを示した。図表３Ａ～３Ｄは、パッケージングおよびｅＧＦＰトランスファーベクターでトランスフェクトされた、トランスポサーゼｍＲＮＡ（ＴＰｍＲＮＡ）の非存在時（図３Ａおよび図３Ｃ）または存在時（図３Ｂおよび図３Ｄ）のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果を示している。トランスフェクションの４日後、ピューロマイシン（０．５ｕｇ／ｍＬ）およびゼオシン（３００ｕｇ／ｍＬ）を添加することにより抗生物質耐性細胞を選択した。トランスフェクション後２６日目に、細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、ＧＦＰおよび白黒（Ｂ／Ｗ）の画像を収集した。
トランスポサーゼｍＲＮＡの同時トランスフェクションは抗生物質耐性コロニーを有意に増強し、トランスポサーゼ発現が実際に発現カセットの染色体積分を促進することを示した。図表３Ａ～３Ｄは、パッケージングおよびｅＧＦＰトランスファーベクターでトランスフェクトされた、トランスポサーゼｍＲＮＡ（ＴＰｍＲＮＡ）の非存在時（図３Ａおよび図３Ｃ）または存在時（図３Ｂおよび図３Ｄ）のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果を示している。トランスフェクションの４日後、ピューロマイシン（０．５ｕｇ／ｍＬ）およびゼオシン（３００ｕｇ／ｍＬ）を添加することにより抗生物質耐性細胞を選択した。トランスフェクション後２６日目に、細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、ＧＦＰおよび白黒（Ｂ／Ｗ）の画像を収集した。
同様に、トランスポサーゼｍＲＮＡの同時トランスフェクションは、細胞株の生成をパッケージングする過程で抗生物質耐性コロニーを増強した（データは現在示されている）。
抗生物質耐性パッケージング細胞株を増幅し、特徴付け前に凍結した。ＬＶ－ｅＧＦＰをコードするパッケージング細胞を解凍し、ピューロマイシンおよびゼオシンの存在下で懸濁液中で培養した。レンチウイルスベクター産生を誘導するために、酪酸ナトリウム（６ｍＭ）およびドキシサイクリン（２ｕｇ／ｍＬ）をパッケージング細胞培養物に添加し、さらにインキュベートした。
誘導後２日目および３日目に、培養上清を回収し、レンチウイルス力価を測定した。非誘導レンチウイルスベクター力価の測定には、非誘導試料の培養上清を用いた。導入時（２日目および３日目）に４Ｅ６以上のレンチウイルスベクター形質導入ユニット／ｍＬが産生されたが、いずれかの誘導前（０日目）のレンチウイルスベクター産生の基礎量は基礎レベルであったことが観察された（図４）。
実施例２：レンチウイルス産生細胞株のさらなる特徴付け
Ａ．さらなる研究は、本明細書に記載されるベクターを有する異なるトランスフェクション剤の使用を検討するためにデザインされた。図５に示すように、ＰＥＩおよびリポフェクタミン３０００の両方は、ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）トランスポサーゼｍＲＮＡの存在下でＰＣＬプールからの感染性レンチウイルス力価を約１００倍増加させることに成功し、トランスポサーゼの発現が宿主細胞の染色体へのカーゴ配列の効率的な組込みをもたらすことを実証した。
Ａ．さらなる研究は、本明細書に記載されるベクターを有する異なるトランスフェクション剤の使用を検討するためにデザインされた。図５に示すように、ＰＥＩおよびリポフェクタミン３０００の両方は、ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標）トランスポサーゼｍＲＮＡの存在下でＰＣＬプールからの感染性レンチウイルス力価を約１００倍増加させることに成功し、トランスポサーゼの発現が宿主細胞の染色体へのカーゴ配列の効率的な組込みをもたらすことを実証した。
Ｂ．さらに実験を行い、レンチウイルス産生の成功に対する抗生物質の除去の効果を判定した。このような実験では、ＤＨ４と指定された単一細胞クローン（ＳＣＣ）であるＨＥＫ－２９３Ｔを、継代数２１までの誘導時に一貫した感染力価を示すために選択した。
図６に示されるように、非誘導細胞は、低いレベルの感染力価を示した。継代数７（２日目）の後、誘導された細胞は１．２Ｅ７ＴＵ／ｍＬ（形質導入ユニット／ｍＬ）を示した。細胞の選択のために、抗生物質を除去し、細胞を継代し続けた。継代数１１（２、３日目）では、抗生物質投与細胞は１．５Ｅ７ＴＵ／ｍＬ（２日目）および５．３Ｅ７ ＴＵ／ｍＬ（３日目）の力価を達成した。抗生物質非投与と比較して、感染力価は２日目でも１．６Ｅ７ ＴＵ／ｍＬに達した。継代数１７、継代数２１（約７週間）まで拡大すると、抗生物質の存在下と同様に抗生物質なしでウイルス力価は同レベルを維持し続けた（４．４Ｅ７）。２日目ｖｓ３日目とは、誘導後回収前のＰＣＬのインキュベーション日数をいい、誘導と回収の間の追加日数の影響を比較する。
図７は、別の単一細胞クローンＥＤ８を用いた同様の結果を示す。ＤＨ４クローンの場合と同様に、継代数７での抗生物質の除去は、抗生物質で処理した細胞と同じスケールの感染性ウイルス力価を産生するための細胞クローンの能力に有意な影響を及ぼさなかった。前述のように、継代数２１までに、３．５Ｅ７ＴＵ／ｍＬの感染力価が達成され、抗生物質による処置を継続した細胞では４．３Ｅ７ ＴＵ／ｍＬと同様であった。
図８は、ｄｄＰＣＲアッセイを用いて測定した宿主細胞染色体に組み込まれた複製数（目的遺伝子またはパッケージングプラスミド）を示す。ベクター複製数（ＶＣＮ）は、式、ＶＣＮ＝標的配列の複製数／ＲＰＰ３０（リボヌクレアーゼＰ／ＭＲＰサブユニットＰ３０）の複製数＊２により計算した。長末端反復（ＬＴＲ）および水疱性口内炎ウイルス糖タンパクＧ（ＶＳＶ‐Ｇ）に特異的なプライマー／プローブセットを用いて、それぞれＧＯＩおよびパッケージングプラスミドを検出した。両方の細胞クローンについて述べたように、目的の遺伝子およびパッケージングプラスミドの両方が、細胞の染色体に効率的に組み込まれた。細胞の継代中（継代数７０で再び）に抗生物質を除去すると、複製数がわずかに減少したが、ＧＯＩとパッケージングプラスミドの細胞への十分な統合が依然として認められた。
これは驚くべき予期せぬ結果であり、抗生物質がない場合でも、本明細書に記載される方法に従って調製されたプロデューサー細胞株は、高いウイルス力価を産生することができることを示している。このことは、後にヒト患者集団で使用される製品の抗生物質汚染等に関連するリスクを最小限にするために、プロデューサー細胞株培養から抗生物質を除去することが非常に望ましいため、レンチウイルスの製造に著しい利点をもたらす。
Ｃ．一過性トランスフェクションから産生されたレンチウイルスと比較して、本明細書に記載のプロデューサー細胞株を用いて産生されたレンチウイルスベクターの形質導入効率を決定するために実験も行った。レンチウイルスは、ＨＥＫ－２９３細胞の一過性トランスフェクションと共に、ＤＨ４およびＥＤ８細胞株の両方からＰＣＬを用いて産生された。製造後、レンチウイルスベクターをヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に形質導入し、感染多重度（ＭＯＩ）を５とした。簡単に言えば、ＰＭＢＣを２４ウェルプレート中の４Ｅ５細胞／ウェルで平板培養した。１日目に、細胞をＩＬ‐２（１５ｎｇ／ｍＬ）と抗ＣＤ３および抗ＣＤ‐２８（２５μＬ／１Ｅ６細胞）で刺激した。次に、目的遺伝子（ＧＯＩ）として緑色蛍光タンパクを用いて、細胞にレンチウイルスを５の感染多重度で形質導入した。５日後、フローサイトメトリーを用いて細胞を分析し、蛍光陽性細胞の画分を決定し、形質導入効率を計算した。
図９に示されるように、ＰＭＢＣが５の多重感染で形質導入される場合、ＰＣＬ（ＤＨ４およびＥＤ８ライン）および本明細書に記載される方法を用いて産生されるレンチウイルス（約５５％～６２％の形質導入効率）と比較すると、一過性トランスフェクション法を用いて産生されるレンチウイルスに関して同様の形質導入効率が観察される。
当業者には、本明細書に記載された方法および用途に対する他の適切な修正および適応が、実施形態のいずれかの範囲から逸脱することなく行えることが容易に明らかであろう。
特定の実施形態が本明細書に図示され記載されているが、特許請求の範囲は、記載され図示されている部分の特定の形態または配列に限定されるものではないことを理解されたい。本明細書において、例示的な実施形態が開示されており、特定の用語が使用されるが、それらは、限定の目的ではなく、包括的かつ記述的な意味でのみ使用される。上記の教示に照らして、実施形態の修正および変形が可能である。したがって、実施形態は、具体的に記載されている以外の方法で実施することができることを理解されたい。
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (54)
- レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を製造する方法であって、
ａ．哺乳動物細胞を、
ｉ．発現カセットを含むパッケージングベクターであって、
１．第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーター、
２．第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子、および
３．ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子とレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子、をコードし、
前記発現カセットはトランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）により５’末端と３’末端の両方に隣接する、パッケージングベクター、でトランスフェクトすることと、
ｂ．前記トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、
ｃ．前記レンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を単離することと、を含む、方法。 - 前記哺乳動物細胞が哺乳動物細胞培養物である、請求項１に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞培養物が懸濁培養物である、請求項２に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項３に記載の方法。
- 前記ＧＡＧ遺伝子がＨＩＶ ＧＡＧ遺伝子であり、前記ＰＯＬ遺伝子がＨＩＶ ＰＯＬ遺伝子である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レンチウイルスエンベロープ遺伝子が、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１、第２および第３のプロモーターが抑制解除可能なプロモーターである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発現カセットが、前記第１、第２および第３の抑制解除可能なプロモーターのリプレッサーエレメントをさらにコードする、請求項７に記載の方法。
- 前記抑制解除可能なプロモーターの各々が、機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含み、前記リプレッサーエレメントがテトラサイクリンリプレッサータンパクである、請求項８に記載の方法。
- 前記発現カセットが、前記テトラサイクリンリプレッサータンパクをコードする配列に続くＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス配列をさらに含む、請求項９に記載の方法。
- 前記トランスポゾン特異的ＩＴＲが鱗翅目トランスポゾン（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））ＩＴＲである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記トランスフェクトすることが、前記トランスポゾン特異的ＩＴＲを認識するトランスポサーゼの存在下である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記トランスポサーゼが、鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポサーゼｍＲＮＡまたは鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポーズｃＤＮＡである、請求項１２に記載の方法。
- レンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を製造する方法であって、
ａ．哺乳動物細胞を、
ｉ．発現カセットを含むパッケージングベクターであって、
１．第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子発現のレンチウイルスレギュレーター、
２．第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子、および
３．ともに第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子とレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子、をコードし、
前記発現カセットはトランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）により５’末端と３’末端の両方に隣接する、パッケージングベクター、ならびに、
ｉｉ．トランスファーベクターであって、
１．第４のプロモーターの制御下にある目的遺伝子をコードする核酸配列を含み、
前記核酸配列はトランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）により５’末端と３’末端の両方に隣接する、トランスファーベクター、でトランスフェクトすることと、
ｂ．前記トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、
ｃ．前記レンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を単離することと、を含む、方法。 - 前記哺乳動物細胞が哺乳動物細胞培養物である、請求項１４に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞培養物が懸濁培養物である、請求項１５に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項１６に記載の方法。
- 前記ＧＡＧ遺伝子がＨＩＶ ＧＡＧ遺伝子であり、前記ＰＯＬ遺伝子がＨＩＶ ＰＯＬ遺伝子である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レンチウイルスエンベロープ遺伝子が水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１、第２および第３のプロモーターが抑制解除可能なプロモーターである、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発現カセットが、前記第１、第２および第３の抑制解除可能なプロモーターのリプレッサーエレメントをさらにコードする、請求項２０に記載の方法。
- 前記抑制解除可能なプロモーターの各々が、機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含み、前記リプレッサーエレメントがテトラサイクリンリプレッサータンパクである、請求項２１に記載の方法。
- 前記発現カセットが、前記テトラサイクリンリプレッサータンパクをコードする配列に続くＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス配列をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
- 前記トランスポゾン特異的ＩＴＲが鱗翅目トランスポゾン（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））ＩＴＲである、請求項１４～２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記トランスフェクトすることが、前記トランスポゾン特異的ＩＴＲを認識するトランスポサーゼの存在下におけるものである、請求項１４～２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記トランスポサーゼが、鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポサーゼｍＲＮＡまたは鱗翅目（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））トランスポーズｃＤＮＡである、請求項２５に記載の方法。
- 前記目的遺伝子が治療目的遺伝子である、請求項１４～２６のいずれか一項に記載の方法。
- レンチウイルスベクターを製造する方法であって、
ａ．請求項１に記載のレンチウイルスパッケージングベクター含有哺乳動物細胞を産生することと、
ｂ．前記哺乳動物細胞を、
ｉ．第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする核酸配列
を含む、トランスファーベクターでトランスフェクトすることと、
ｃ．前記発現カセットおよび前記核酸の産生を誘導することと、
ｄ．前記トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、
ｅ．前記レンチウイルスベクターを回収することと、を含む、方法。 - レンチウイルスベクターを製造する方法であって、
ａ．請求項１４に記載のレンチウイルスベクター産生哺乳動物細胞を産生することと、
ｂ．前記発現カセットおよび前記核酸の産生を誘導することと、
ｃ．前記哺乳動物細胞を培養することと、
ｄ．前記レンチウイルスベクターを回収することと、を含む、方法。 - 前記発現カセット中の前記プロモーターの各々が、機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含む抑制解除可能なプロモーターであり、前記リプレッサーエレメントがテトラサイクリンリプレッサータンパクであり、前記誘導が、前記哺乳動物細胞にドキシサイクリンを添加することを含む、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
- 前記レンチウイルスベクターの産生量が、前記誘導の２日後に少なくとも約１０６形質導入ユニット／ｍＬである、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
- レンチウイルスベクターにより治療する方法であって、
ａ．請求項２８または請求項２９に記載の産生されたレンチウイルスベクターを哺乳動物対象に投与すること、を含む、方法。 - 前記投与することが、吸入、注射または静脈内投与を含む、請求項３２に記載の方法。
- レンチウイルスベクターを製造するための哺乳動物細胞であって、
ａ．前記哺乳動物細胞において染色体に組み込まれた核酸分子であって、前記核酸分子は、
ｉ．第１のプロモーターの制御下にあるビリオンタンパク（ＲＥＶ）遺伝子発現のレンチウイルスレギュレーターと、
ｉｉ．第２のプロモーターの制御下にあるレンチウイルスエンベロープ遺伝子と、
ｉｉｉ．いずれも第３のプロモーターの制御下にあるレンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子とレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子と、を含み、
前記核酸配列は、トランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）の組換えから生じる配列によって５’末端と３’末端の両方に隣接している、核酸分子、を含む、哺乳動物細胞。 - 第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする染色体に組み込まれた核酸配列をさらに含む、請求項３４に記載の哺乳動物細胞。
- 前記哺乳動物細胞が哺乳動物細胞培養物である、請求項３４または請求項３５に記載の哺乳動物細胞。
- 前記哺乳動物細胞培養物が懸濁培養物である、請求項３６に記載の哺乳動物細胞。
- 前記哺乳動物細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項３７に記載の哺乳動物細胞。
- 前記ＧＡＧ遺伝子がＨＩＶ ＧＡＧ遺伝子であり、前記ＰＯＬ遺伝子がＨＩＶ ＰＯＬ遺伝子である、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
- 前記レンチウイルスエンベロープ遺伝子が水疱性口内炎ウイルス糖タンパク（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
- 前記第１、第２および第３のプロモーターが抑制解除可能なプロモーターである、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
- 前記発現カセットが、前記第１、第２および第３の抑制解除可能なプロモーターのリプレッサーエレメントをさらにコードする、請求項４１に記載の哺乳動物細胞。
- 前記抑制解除可能なプロモーターの各々が、機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含み、前記リプレッサーエレメントがテトラサイクリンリプレッサータンパクである、請求項４２に記載の哺乳動物細胞。
- 前記発現カセットが、前記テトラサイクリンリプレッサータンパクをコードする配列に続くＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス配列をさらに含む、請求項４３に記載の哺乳動物細胞。
- 前記トランスポゾン特異的ＩＴＲが鱗翅目トランスポゾン（ＰＩＧＧＹＢＡＣ（登録商標））ＩＴＲである、請求項３４～４４のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
- 前記目的遺伝子が治療目的遺伝子である、請求項３５に記載の哺乳動物細胞。
- レンチウイルスベクターを製造する方法であって、
ａ．請求項３４に記載の哺乳動物細胞を、
ｉ．第４のプロモーターの制御下で目的遺伝子をコードする核酸配列
を含む、トランスファーベクターでトランスフェクトすることと、
ｂ．前記発現カセットおよび前記核酸の産生を誘導することと、
ｃ．前記トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養することと、
ｄ．前記レンチウイルスベクターを回収することと、を含む、方法。 - レンチウイルスベクターを製造する方法であって、
ａ．前記染色体に組み込まれた核酸配列および請求項３５に記載の哺乳動物の目的遺伝子をコードする前記染色体に組み込まれた核酸配列の産生を誘導することと、
ｂ．前記哺乳動物細胞を培養することと、
ｃ．前記レンチウイルスベクターを回収することと、を含む、方法。 - 前記発現カセット中の前記プロモーターの各々が、機能的プロモーターおよびテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ）を含む抑制解除可能なプロモーターであり、前記リプレッサーエレメントがテトラサイクリンリプレッサータンパクであり、前記誘導が、前記哺乳動物細胞にドキシサイクリンを添加することを含む、請求項４７または請求項４８に記載の方法。
- 前記レンチウイルスベクターの産生量が、前記誘導の２日後に少なくとも約１０６形質導入ユニット／ｍＬである、請求項４７または請求項４８に記載の方法。
- レンチウイルスベクターで治療する方法であって、
ａ．請求項４７または請求項４８に記載の産生されたレンチウイルスベクターを哺乳動物対象に投与すること、を含む、方法。 - 前記投与することが、吸入、注射または静脈内投与を含む、請求項５１に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞の培養の少なくとも一部が、抗生物質の非存在下で行われる、請求項２８～３１および４７～５０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養の一部が、継代数３から誘導フェーズまでである、請求項５３に記載の方法。
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