JP2023511108A - ウイルス力価を決定する方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、好適には、哺乳動物細胞サンプルからの生体サンプルのウイルス力価を決定するための方法に関する。本方法は、細胞の機械的破壊、続いて、液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）を使用して、ウイルス力価を決定することを含む。機械的破壊の方法は、好適には、ガラスビーズの使用を含む。【選択図】図１

Description

本開示は、好適には、哺乳動物細胞サンプルからの生体サンプルのウイルス力価を決定するための方法に関する。本方法は、細胞の機械的破壊、続いて、液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）を使用して、ウイルス力価を決定することを含む。機械的破壊の方法は、好適には、ガラスビーズの使用を含む。
レンチウイルス（ＬＶ）は、細胞および遺伝子療法において最も普及している送達ビヒクルのうちの１つである。同様に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子療法ビヒクルとしての用途も見出している。感染力価の正確な測定は、ウイルスベクターの製造、精製、および適用のプロセスにおける絶対的な必要条件である。フローサイトメトリーまたは定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）などのウイルス力価を測定する従来のアッセイ方法は、いくつかの主要な欠点を有する。これらのアッセイのためには、感染力価の測定のためのレポーターまたは特異的抗体を有する必要がある。加えて、プライマー、プローブ、および標準物質をｑＰＣＲアッセイに投入する前に、それらを最適化する必要があり、これは非常に煩雑なプロセスである。
液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）は、標準曲線を使用することなく任意の目的の遺伝子の絶対コピー数を定量化するための信頼性の高い最先端技術として浮上している。ＬＶのＲＮＡゲノムは、宿主染色体に組み込まれる前に、最初にそのｃＤＮＡに逆転写される。したがって、ＬＶの感染力価は、標的細胞の染色体への導入遺伝子の組み込み頻度を測定することによって、ｄｄＰＣＲを使用して決定され得る。ＡＡＶウイルスベクターもまた、ｄｄＰＣＲを使用して測定することができる。しかしながら、ｄｄＰＣＲによってウイルス力価を決定するための現在の方法は、多数のウイルス形質導入細胞から染色体ＤＮＡを抽出することを伴う、ゲノムＤＮＡ単離の面倒なプロセスにより、速度が制限される。
したがって、必要とされるものは、ｄｄＰＣＲ用途のためのサンプル調製中のゲノムＤＮＡ抽出を排除し、また、様々な汚染する可能性のある緩衝液および溶液の使用も排除する、高スループット方法である。本発明は、これらの必要性を満たす。
いくつかの実施形態では、ウイルス形質導入細胞を含有する生体サンプルを取得することと、生体サンプルのウイルス形質導入細胞を機械的に破壊することと、破壊されたウイルス形質導入細胞から除去された核酸分子に液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）を行うことと、ウイルス力価を計算することと、を含む、生体サンプル中のウイルス力価を決定する方法が本明細書で提供される。
追加的な実施形態では、ウイルス形質導入細胞を含有する生体サンプルを取得することと、ガラスビーズを用いて生体サンプルのウイルス形質導入細胞を機械的に破壊することと、破壊されたウイルス形質導入細胞から除去された核酸分子に液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）を行うことと、ウイルス力価を計算することとから本質的になる、生体サンプル中のウイルス力価を決定する方法が本明細書で提供される。
本明細書に記載される３つの方法の間のレンチウイルス力価比較を示す。
「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において「含む」という用語と併せて使用されるときに、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つを超える」の意味とも一致する。
本出願の全体を通して、「約」という用語は、値が、その値を決定するために採用されている方法／デバイスについての固有の誤差の変動を含むことを示すために使用される。典型的には、この用語は、状況に応じて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％、もしくはそれ未満の変動を包含するように意図されている。
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すように明示的に示されない限り、または代替物が相互排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ、ならびに「および／または」を指す定義を支持する。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などのｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」などのｈａｖｉｎｇの任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」などのｉｎｃｌｕｄｉｎｇの任意の形態）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎ」などのｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの任意の形態）という単語は、包括的または非制約的であり、追加的な記載されていない要素または方法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法、システム、宿主細胞、発現ベクター、および／または組成物に関して実現され得ることが企図される。さらに、本発明の組成物、システム、細胞、および／または核酸は、本明細書に記載されるような方法のうちのいずれかを達成するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「核酸」、「核酸分子」、または「オリゴヌクレオチド」は、共有結合したヌクレオチドを含むポリマー化合物を意味する。「核酸」という用語は、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、これらの両方は、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡには、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、プラスミドまたはベクターＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。ＲＮＡには、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＭＩＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合の「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのアセンブリを指し、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸分子を含む。「遺伝子」はまた、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）で調節配列として作用し得る核酸断片を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子は、複数のコピーとともに組み込まれる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、所定のコピー数において組み込まれる。
ウイルス力価を決定する方法
例示的な実施形態では、生体サンプル中のウイルス力価を決定する方法が本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、「ウイルス力価」は、一般に、ミリリットル（ｍＬ）当たりのウイルス粒子、形質導入単位、または感染粒子として表される、所与の体積内のウイルスの量の数値表現を指す。したがって、ウイルス力価を決定する本明細書に記載の方法は、単純な定性的測定ではなく、ウイルス粒子の実際の数を決定するという点で定量的である。
本明細書で使用される場合、「生体サンプル」は、ウイルスベクターを含有し得る細胞または組織の溶液もしくは懸濁液、または再構築前に乾燥された溶液もしくは懸濁液を指す。好適には、生体サンプルは、少なくとも１つのウイルス形質導入細胞を含有する細胞溶液である。
本明細書で使用される場合、「ウイルス形質導入細胞」は、一過性に組み込まれた（ゲノムに組み込まれずに挿入された）か、またはゲノム的に組み込まれた（細胞のゲノムに挿入された）かのいずれかである、ウイルスベクターが挿入された細胞である。本明細書で使用される場合、「ベクター」または「発現ベクター」は、核酸分子が付着し、細胞中で付着核酸分子の複製および／または発現をもたらし得る、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどのレプリコンである。「ベクター」は、エピソーム（例えば、プラスミド）および非エピソームベクターを含む。「ベクター」という用語は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで細胞に核酸分子を導入するためのウイルス手段および非ウイルス手段の両方を含む。ベクターという用語は、合成ベクターを含み得る。ベクターは、トランスフェクション、形質導入、細胞融合、およびリポフェクションを含むが、これらに限定されない、周知の方法によって所望の細胞に導入され得る。ベクターは、プロモーターを含む様々な調節要素を含むことができる。
本明細書で使用される場合の「形質導入」とは、細胞の中へのベクターを含む外因性核酸分子の導入を意味し、トランスフェクション（例えば、脂質またはポリマーベースの担体の使用、ならびに機械的トランスフェクション、エレクトロポレーション）およびウイルス形質導入を含む。「トランスフェクトされた」細胞は、細胞の内側に外因性核酸分子を含み、「形質転換された」細胞は、細胞内の外因性核酸分子が細胞内の表現型変化を誘導するものである。トランスフェクトされた核酸分子は、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれることができ、および／または細胞によって、一時的に、もしくは染色体外で（一過性に）長期間維持されることができる。外因性核酸分子または断片を発現する宿主細胞または生物は、「組み換え」、「形質転換された」、または「トランスジェニック」生物と称される。いくつかのトランスフェクション技法が、当該技術分野で一般的に公知である。例えば、それぞれの開示が参照することによりそれらの全体として本明細書に組み込まれる、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６ （１９７３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ （１９８６）、およびＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １３：１９７（１９８１）を参照されたい。好適には、１つ以上のベクターを用いた哺乳動物細胞のトランスフェクションは、種々の脂質およびポリマーを含む、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）または他の好適な薬剤などのトランスフェクション剤を利用して、核酸を宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込む。
ウイルス力価を決定するための方法は、ウイルス形質導入細胞を含有する生体サンプルを取得することを含む。生体サンプルは、実験室設定、または大規模バッチプロセス、もしくは他の好適な設定から取得されることができ、本明細書に記載されるように調製され、次いで、測定されるサンプル、ならびに他の設定または領域で調製され、貯蔵され、潜在的に出荷され、次いで、本明細書に記載される方法を使用して測定される生体サンプルを含む。
本方法は、生体サンプルのウイルス形質導入細胞を機械的に破壊することをさらに含む。本明細書で使用される場合、「機械的に破壊すること」または「機械的破壊」は、サンプルに固有ではない、その中に含有される細胞を分解または溶解させるために効率的な力の生体サンプルへの印加を指す。例示的な機械的破壊技法には、ガラスビーズを用いた破壊の使用、超音波処理（超音波処理浴ならびに超音波処理先端／プローブまたは超音波先端／プローブの使用を含む）、高出力ボルテックスまたは混合、ガラスまたはプラスチックプレートを介した剪断力の印加、研削、混成、機械的ホモジナイザーの使用などが含まれる。
好適な実施形態では、機械的破壊は、ガラスビーズを用いた破壊を介して生じる。そのような方法では、ウイルス形質導入細胞を含む生体サンプルは、ガラスビーズの溶液と接触させられ、約１分間ボルテックスされ、次いで、それぞれ約１分間、さらに３～５回再びボルテックスされる。ボルテックスの追加的な時間および繰り返し回数もまた、使用することができる。本明細書に記載の方法で使用するためのガラスビーズとしては、ＣＯＬＥ－ＰＡＲＭＥＲ（登録商標）（Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ，ＩＬ）のシリカビーズが挙げられ、好適には、約１００ｍｍ～１ｍｍの直径、より好適には、約１００ｍｍ、約５００ｍｍ、または約１ｍｍのビーズを有する。ジルコニウムビーズ等の他の材料のビーズもまた、利用されることができる。生体サンプルで使用する前に、ガラスビーズは、好適には、酸性溶液（例えば、ＨＣｌ）に浸され、脱イオン水で十分にすすがれ、次いで、それらを完全に乾燥させるために１５０℃を上回って１２～２４時間焼成される。ビーズは、次いで、完全に冷却するために、使用前に、４℃または氷上で約３０分間以上冷却される。酸洗浄および熱処理はまた、ビーズが前処理されて購入され、好適にヌクレアーゼを含まない場合、排除されることができる。
本明細書に記載されるように、本方法は、好適に、界面活性剤または溶解緩衝液を用いて生体サンプルのウイルス形質導入細胞を溶解させることを除外する。本明細書に記載されるように、そのような界面活性剤および溶解緩衝液の使用は、要求されず、それらの排除によって、コスト、サンプル調製および分析の時間が、すべて削減されることができ、また、副産物、不要な残渣または細菌、ならびに緩衝液中の潜在的なヌクレアーゼからの汚染も、削減または排除されることができると決定されている。
ウイルス形質導入細胞の機械的破壊に続いて、液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）が、破壊された細胞から除去された核酸分子に行われる。本明細書で使用される場合、核酸分子は、単純に細胞の溶解または分解の作用によって破壊された細胞から「除去される」。好適には、破壊された細胞からＤＮＡを含む核酸分子を単離するために、さらなる作用は要求されず、粗溶解物（破壊物）は、ｄｄＰＣＲアッセイに直接適用される。本明細書に記載されるように、ｄｄＰＣＲは、水・油エマルション液滴技術に基づくデジタルＰＣＲを実施する。サンプルが、２０，０００個の液滴に分画され、鋳型分子（ＤＮＡ）のＰＣＲ増幅が、各個々の液滴で生じる。ｄｄＰＣＲ技術は、ほとんどの標準的なＴａｑＭａｎプローブベースのアッセイに使用されるものと同様の試薬およびワークフローを使用する。例示的なｄｄＰＣＲ分析キットおよびアッセイは、例えば、ＢＩＯ－ＲＡＤ（登録商標）（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から容易に入手可能である。実施形態では、ｄｄＰＣＲの前に細胞を計数する追加的なステップが含まれ得る。ウイルス力価を決定するためにｄｄＰＣＲを行うための方法は、例えば、Ｄｏｂｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，“Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １０：Ａｒｔｉｃｌｅ １５７０ （２０１９）、およびＡｂａｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｑＰＣＲ ａｎｄ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ，”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ５２：４９－５４（２０１８）で見出され得、そのそれぞれの開示は、特にその中に開示されるｄｄＰＣＲの方法について、参照することによりそれらの全体として本明細書に組み込まれる。
ｄｄＰＣＲ分析に基づいて、ウイルス力価が、次いで、計算される。ウイルス力価の計算は、ｄｄＰＣＲ分析および結果出力から容易に実行される。ｄｄＰＣＲからの感染性ウイルス力価は、式、ＴＵ／ｍＬ＝Ｆ×Ｃ×Ｄ／Ｖを使用することによって計算されることができ、式中、ＴＵ／ｍＬは、形質導入単位／ｍＬであり、Ｆは、形質導入された細胞の分画であり、Ｃは、形質導入時にアッセイに投入された細胞の数であり、Ｄは、ウイルス接種の希釈倍数であり、Ｖは、アッセイに投入されたウイルス接種の体積（ｍＬ）である。
例えば、細胞の２０％が、１，０００個の細胞が接種時に播種されたアッセイにおいて形質導入されたと仮定されたい。ウイルスは、アッセイに投入される前に１００倍希釈され、０．１ｍＬが、アッセイに投入された。次いで、ＴＵ／ｍＬ＝２０×０．０１×１，０００×１００／０．１＝２．０Ｅ＋０５であった。形質導入された細胞の分画（Ｆ）を求めるために、ｄｄＰＣＲの結果から測定された染色体に組み込まれたウイルスゲノムの総コピー数が、収穫時の総細胞数で割られる。
本明細書に記載されるように、好適には、ウイルスベクターを含むウイルス形質導入細胞は、哺乳動物細胞である。本明細書で使用される場合、「哺乳動物細胞」という用語は、例えば、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、サル細胞、ハムスター細胞、および同等物などの哺乳類目の任意の構成員由来の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯＫ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、すべての変異型（例えば、ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）、Ｌｏｎｚａ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）を含むＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、すべての変異型（例えば、ＸＣＥＥＤ（商標）、Ｌｏｎｚａ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）を含むＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ（グルタミン合成酵素ノックアウト）細胞である。例示的なヒト細胞には、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ細胞、またはＨＴ１０８０細胞等のヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞が含まれる。
哺乳動物細胞には、接着培養物または懸濁培養物のいずれかであり得る、哺乳動物細胞培養物が含まれる。接着培養物は、基質表面、例えば、プラスチックプレート、皿、または他の好適な細胞培養増殖プラットフォーム上で増殖され、足場依存性であり得る細胞を指す。懸濁培養物は、例えば、気体および栄養素交換のための広い表面積を可能にする、培養フラスコまたは大型懸濁バット内で維持され得る細胞を指す。懸濁細胞培養物は、適切な混合を提供するために、かき混ぜまたは撹拌機構をしばしば利用する。細胞を懸濁液中で維持するための培地および条件は、当該技術分野で一般的に公知である。例示的な懸濁細胞培養物には、ヒトＨＥＫ２９３クローン細胞が含まれる。
本明細書に記載されるように、提供される方法を使用して決定されることができる例示的なウイルスベクター力価には、レンチウイルスウイルス力価およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルス力価、ならびに他のウイルスベクター力価が含まれる。
レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１）に基づく十分に研究されたベクター系である。ＨＩＶ－２サル免疫不全ウイルス、非霊長類レンチウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、およびウシ免疫不全ウイルスなどを含む、他のレンチウイルス系もまた、遺伝子導入系として開発されている。ヒトにおけるＨＩＶ－１の病原性による安全性の懸念によって誘導され、臨床および研究開発目的で使用するために最も広く使用されているレンチウイルス系は、以下を発現する４つのプラスミド系に基づく。
１）レンチウイルス群特異抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）タンパク質
２）エンベロープタンパク質（通常、水疱口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ））
３）ビリオンタンパク質（Ｒｅｖ）タンパク質の発現のＨＩＶ調節因子、ならびに
４）目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含有する導入ベクター（ＴＶ）
レンチウイルスベクターは、一般に、免疫不全および神経変性疾患を含む、療法および疾患治療のために所望の細胞に導入される目的の遺伝子を用いて産生される。
本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）」という用語は、パルボウイルス科およびデペンドパルボウイルス属の一本鎖ＤＮＡを含有する、小さなサイズの複製欠損非エンベロープウイルスを指す。これまでに１０種を超えるアデノ随伴ウイルス血清型が同定されており、血清型ＡＡＶ２が最もよく特性評価されている。ＡＡＶ血清型の他の非限定的な例は、ＡＮＣ８０、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、およびＡＡＶ１１である。これらの血清型に加えて、ＡＡＶ偽型が開発されている。ＡＡＶ偽型は、第１の血清型のカプシドおよび第２の血清型のゲノムを含有する（例えば、偽型ＡＡＶ２／５は、血清型ＡＡＶ２のゲノムおよびＡＡＶ５のカプシドを伴うＡＡＶに対応するであろう）。
本明細書で参照される場合、「アデノウイルス」という用語は、アデノウイルス科の二本鎖ＤＮＡを含有する二十面体ヌクレオカプシドを伴う非エンベロープウイルスを指す。５０種を超えるアデノウイルスサブタイプが、ヒトから単離されており、多くの追加的なサブタイプが、他の哺乳動物および鳥類から単離されている。鳥類。例えば、Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ ａｎｉｍａｌｓ，”Ｉｎ Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．４９７－５６２（１９８４）、Ｓｔｒａｕｓｓ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ，”Ｉｎ Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．４５１－５９６（１９８４）を参照されたい。これらのサブタイプは、現在、２つの属、すなわち、マストアデノウイルスおよびアビアデノウイルスに分けられている、アデノウイルス科に属する。すべてのアデノウイルスは、形態学的および構造的に類似している。しかしながら、ヒトでは、アデノウイルスは、異なる免疫学的特性を示し、したがって、血清型に分けられる。アデノウイルスの２つのヒト血清型、すなわち、ＡＶ２およびＡＶ５は、集中的に研究されており、アデノウイルスについての一般的な情報の大部分を提供している。
さらなる実施形態では、ウイルス形質導入細胞を含有する生体サンプルを取得することと、ガラスビーズを用いて生体サンプルのウイルス形質導入細胞を機械的に破壊することと、破壊されたウイルス形質導入細胞から除去された核酸分子に液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）を行うことと、ウイルス力価を計算することとから本質的になる、生体サンプル中のウイルス力価を決定する方法が本明細書で提供される。
列挙されたステップ「から本質的になる」本明細書に記載の方法は、溶解緩衝液、界面活性剤を使用するステップ、または界面活性剤ステップもしくは溶解ステップを除外し、そのようなステップは、列挙されたステップから本質的になる方法への物質的変更とみなされ、したがって、そのような方法から具体的に除外される。好適には、カラム精製ステップもまた、列挙されたステップから本質的になる方法から除外される。
本明細書に記載の方法を使用して測定され得るウイルス形質導入細胞を産生する方法は、かき混ぜられたタンク、気泡ポンプ、繊維、マイクロファイバー、ホローファイバー、セラミックマトリックス、流動床、固定床、および／または噴流床生物反応器を含むが、これらに限定されない、任意の好適な反応器内で産生されることができる。本明細書で使用される場合、「反応器」は、発酵器もしくは発酵ユニット、または任意の他の反応容器を含むことができ、「反応器」という用語は、「発酵器」と同義的に使用される。発酵器または発酵という用語は、微生物培養物および哺乳動物培養物の両方を指す。例えば、いくつかの態様では、例示的な生物反応器ユニットは、以下、すなわち、栄養素および／または炭素源の供給、好適な気体（例えば、酸素）の注入、発酵または細胞培養培地の流入および流出量、気相および液相の分離、温度の維持、酸素およびＣＯ２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、撹拌（例えば、かき混ぜること）、ならびに／もしくは洗浄／滅菌のうちの１つ以上またはすべてを実施することができる。発酵ユニット等の例示的な反応器ユニットは、ユニット内に複数の反応器を含有してもよく、例えば、ユニットは、各ユニット内に１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、もしくは１００個、またはそれ以上の生物反応器を有してもよく、および／または施設は、施設内に単一または複数の反応器を有する複数のユニットを含有してもよい。様々な実施形態では、生物反応器は、バッチ、半供給バッチ、供給バッチ、灌流、および／または連続発酵プロセスに好適であり得る。任意の好適な反応器直径が、使用され得る。実施形態では、生物反応器は、約１００ｍＬ～約５０，０００Ｌの容積を有することができる。非限定的な例には、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル、および／または５０，０００リットルの容積が含まれる。追加的に、好適な反応器は、複数回使用、単回使用、使い捨て、または非使い捨てであり得、ステンレス鋼（例えば、３１６Ｌまたは任意の他の好適なステンレス鋼）ならびにインコネル等の金属合金、プラスチック、および／またはガラスを含む、任意の好適な材料で形成されることができる。
追加的な例示的実施形態
実施形態１は、ウイルス形質導入細胞を含有する生体サンプルを取得することと、生体サンプルのウイルス形質導入細胞を機械的に破壊することと、破壊されたウイルス形質導入細胞から除去された核酸分子に液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）を行うことと、ウイルス力価を計算することと、を含む、生体サンプル中のウイルス力価を決定する方法である。
実施形態２は、本方法が、界面活性剤または溶解緩衝液を用いてウイルス形質導入細胞を溶解させることを含まない、実施形態１に記載の方法を含む。
実施形態３は、機械的に破壊することが、ガラスビーズを用いた破壊を含む、実施形態１または２に記載の方法を含む。
実施形態４は、機械的に破壊することが、超音波処理を含む、実施形態１または２に記載の方法を含む。
実施形態５は、ウイルス形質導入細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法を含む。
実施形態６は、哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、実施形態５に記載の方法を含む。
実施形態７は、ヒト細胞が、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞である、実施形態６に記載の方法を含む。
実施形態８は、ウイルス力価が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルス力価である、実施形態７に記載の方法を含む。
実施形態９は、ウイルス力価が、レンチウイルスウイルス力価である、実施形態７に記載の方法を含む。
実施形態１０は、哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、実施形態５に記載の方法を含む。
実施形態１１は、ウイルス力価が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルス力価である、実施形態１０に記載の方法を含む。
実施形態１２は、ウイルス力価が、レンチウイルスウイルス力価である、実施形態１０に記載の方法を含む。
実施形態１３は、ウイルス形質導入細胞を含有する生体サンプルを取得することと、ガラスビーズを用いて生体サンプルのウイルス形質導入細胞を機械的に破壊することと、破壊されたウイルス形質導入細胞から除去された核酸分子に液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）を行うことと、ウイルス力価を計算することと、から本質的になる、生体サンプル中のウイルス力価を決定する方法である。
実施形態１４は、ウイルス形質導入細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態１３に記載の方法を含む。
実施形態１５は、哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、実施形態１４に記載の方法を含む。
実施形態１６は、ヒト細胞が、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞である、実施形態１５に記載の方法を含む。
実施形態１７は、ウイルス力価が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルス力価である、実施形態１６に記載の方法を含む。
実施形態１８は、ウイルス力価が、レンチウイルスウイルス力価である、実施形態１６に記載の方法を含む。
実施形態１９は、哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、実施形態１４に記載の方法を含む。
実施形態２０は、ウイルス力価が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルス力価である、実施形態１９に記載の方法を含む。
実施形態２１は、ウイルス力価が、レンチウイルスウイルス力価である、実施形態１９に記載の方法を含む。
実施例１：ウイルス力価の測定のための高スループットフォーマット
一般的に界面活性剤媒介性細胞溶解およびその後のＤＮＡのカラム精製を伴う、面倒なＤＮＡ抽出プロセスを回避するために、細胞は、代わりにガラスビーズを使用して機械的に破壊される。
緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをコードするレンチウイルス（ＬＶ）を形質導入された細胞から調製された粗溶解物が、ｄｄＰＣＲアッセイに直接適用された。このアプローチを従来の方法と比較し、検証するために、ＤＮＡもまた、Ｑｉａｇｅｎから市販されているキット（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を使用することによって、ＬＶ形質導入細胞から単離された。ＬＶの長い末端反復（ＬＴＲ）領域に特異的なプライマープローブセットおよび宿主のベータアクチン配列が、標的配列を増幅するために使用された。感染力価を計算するために、以下の３つの方法が比較された。
１．ｄｄＰＣＲのためのサンプルＤＮＡが、Ｑｉａｇｅｎキットを使用して単離された。対応するサンプル中の細胞数が、同じサンプル中のベータアクチンのコピー数から計算され、それに基づいてＬＶ力価が較正された。
２．ｄｄＰＣＲのためのサンプルＤＮＡが、Ｑｉａｇｅｎキットを使用して単離された。ＲＮａｓｅ Ａが、任意の細胞ＲＮＡを除去するために単離手順中に含まれた。対応するサンプル中の細胞数が、同じサンプル中のＤＮＡ量から計算され、それに基づいてＬＶ力価が較正された。
３．粗細胞溶解物が、ガラスビーズを使用して細胞を破壊することによって調製され、ｄｄＰＣＲに直接適用された。対応するサンプル中の細胞数が、ＶｉＣｅｌｌを使用することによって、細胞の破壊の前に直接計数され、それに基づいてＬＶ力価が較正された。
６ウェル培養プレート内の細胞が、ＬＶ－ＧＦＰを形質導入され、上記の３つの異なる方法によって処理された。ｄｄＰＣＲのための３つのサンプルが、各方法のために調製された。これらのサンプルからのＬＶ力価が、計算され、形質導入単位（ＴＵ）／ｍＬとして図１に提示される。以下の表１は、統計分析による結果を要約する。
Figure 2023511108000002
３つの異なる方法から計算された感染性ＬＶ力価は、試験された３つのサンプルについて相互に同等であり、ビーズ破壊によって調製された粗細胞溶解物が、直接ｄｄＰＣＲ適用のために十分であることを示す。また、第３の方法（ビーズ破壊－細胞数）からの変動係数（ＣＶ）は、他の方法よりも有意に小さく（８．２％）、それにより一貫性があり、再現性があることを示唆する。
本明細書に記載の方法および用途に対する他の好適な修正および適合は、実施形態のうちのいずれかの範囲から逸脱することなく行われ得ることが、関連技術分野の当業者に容易に明らかとなるであろう。
特定の実施形態が本明細書に例示および記載されているが、特許請求の範囲は、記載および図示される部分の特定の形態または配列に限定されるものではないことを理解されたい。本明細書では、例証的な実施形態が開示されており、特定の用語が採用されるが、それらは、限定の目的のためではなく、一般的かつ説明的な意味でのみ使用される。実施形態の修正および変形例が、上記の教示に照らして可能である。したがって、実施形態は、具体的に記載される以外の方法で実践され得ることを理解されたい。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示される場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (21)

  1. 生体サンプル中のウイルス力価を決定する方法であって、
    ａ．ウイルス形質導入細胞を含有する前記生体サンプルを取得することと、
    ｂ．前記生体サンプルの前記ウイルス形質導入細胞を機械的に破壊することと、
    ｃ．破壊された前記ウイルス形質導入細胞から除去された核酸分子に液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）を行うことと、
    ｄ．前記ウイルス力価を計算することと、を含む、方法。
  2. 前記方法が、界面活性剤または溶解緩衝液を用いて前記ウイルス形質導入細胞を溶解させることを含まない、請求項１に記載の方法。
  3. 前記機械的に破壊することが、ガラスビーズを用いた破壊を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記機械的に破壊することが、超音波処理を含む、請求項１または２に記載の方法。
  5. 前記ウイルス形質導入細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ヒト細胞が、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ウイルス力価が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルス力価である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ウイルス力価が、レンチウイルスウイルス力価である、請求項７に記載の方法。
  10. 前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項５に記載の方法。
  11. 前記ウイルス力価が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルス力価である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ウイルス力価が、レンチウイルスウイルス力価である、請求項１０に記載の方法。
  13. 生体サンプル中のウイルス力価を決定する方法であって、
    ａ．ウイルス形質導入細胞を含有する前記生体サンプルを取得することと、
    ｂ．ガラスビーズを用いて前記生体サンプルの前記ウイルス形質導入細胞を機械的に破壊することと、
    ｃ．破壊された前記ウイルス形質導入細胞から除去された核酸分子に液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）を行うことと、
    ｄ．前記ウイルス力価を計算することと、から本質的になる、方法。
  14. 前記ウイルス形質導入細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ヒト細胞が、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ウイルス力価が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルス力価である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ウイルス力価が、レンチウイルスウイルス力価である、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１４に記載の方法。
  20. 前記ウイルス力価が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルス力価である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ウイルス力価が、レンチウイルスウイルス力価である、請求項１９に記載の方法。

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