CN111808175B - 重组腺相关病毒颗粒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种重组腺相关病毒颗粒及其应用。重组腺相关病毒颗粒包含变异的AAV6衣壳蛋白，该变异的6型腺相关病毒衣壳蛋白，其中相对于相应野生型AAV6衣壳蛋白，所述变异的AAV6衣壳蛋白中插入有氨基酸片段QTTDKYK，插入位点介于野生型AAV6衣壳蛋白的第588和589位氨基酸之间。该重组腺相关病毒颗粒具有更强的感染能力，因而可以在更低的使用剂量下达到与常用剂量基本相同的感染效果，从而能有效降低在转导过程中对宿主细胞的损伤。

Description

重组腺相关病毒颗粒及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种重组腺相关病毒颗粒及其应用。
背景技术
利用转基因疾病模型进行人类疾病的研究由来已久，合适的转基因动物疾病模型不仅仅为疾病发病机理的研究提供重要的基础理论依据，而且避免了人体实验的造成的风险和伦理问题。转基因动物疾病模型的构建促进了人类对基因功能的了解和研究，同时促进了临床经验的积累和相应罕见病的药物开发。
转基因小鼠的构建一般策略是利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，此方法非常便利，但是依赖于价格高昂、操作精细的显微注射设备及受过训练经验丰富的操作人员。目前关于通过腺相关病毒感染受精卵的相关研究非常有限，根据现有的文献报道显示，重组的腺相关病毒作为载体感染小鼠植入前胚胎制备转基因小鼠的方法比传统通过显微注射技术的方法优势在于操作简便，效率更高，在宿主组织里能达到高水平的基因表达，除此之外，已被证实其在应用于人的基因治疗方面有相对更低的基因毒性。
腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒，它也是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒（通常为腺病毒或疱疹病毒）来完成病毒包装。由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。不同血清型的腺相关病毒在实验动物中有不同的组织亲和性。
AAV病毒，尤其是AAV6血清型，可以有效的感染受精卵。但是相对来说，文献公开报道的AAV6使用的剂量比较大，通常在40ul受精卵培养基中加入（6～9）×109 vg总量的病毒颗粒，才能达到有效的受精卵感染。由于AAV高剂量下会对受精卵存在一定毒性，随着AAV使用剂量的增加，受精卵停止发育(死亡)的比例也会明显增加，此外受精卵移植的存活率也会降低，6×109 vg感染胚胎移植存活率大概18%，而6×107 vg感染移植存活率能达到30%，所以有效降低AAV感染受精卵使用量，一方面节省成本，另一方面可以提高受精卵感染后的存活率以及胚胎移植后的存活率。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种变异的AAV6（6型腺相关病毒）衣壳蛋白，其相对于相应野生型AAV6衣壳蛋白，所述变异的AAV6衣壳蛋白中插入有所述变异的AAV6衣壳蛋白中插入有氨基酸片段QTTDKYK，插入位点介于野生型AAV6衣壳蛋白的第588和589位氨基酸之间。
本发明的第二方面涉及一种重组腺相关病毒颗粒，其包含如上所述的变异的AAV6衣壳蛋白。
本发明的第三方面涉及一种腺相关病毒载体系统，其包含用于编码所述变异的AAV6衣壳蛋白的核酸片段。
本发明的第四方面涉及药物组合物，其包含如上所述的重组腺相关病毒颗粒和/或如上所述的腺相关病毒载体系统，以及药学上可接受的赋形剂。
本发明的第五方面涉及一种将目的基因产物递送到受精卵或囊胚中的非治疗目的方法，包括：
将如上所述的重组腺相关病毒颗粒以（6～9）×109 vg/40μL的浓度与受精卵或囊胚接触；
其中当所述受精卵或囊胚来源于人类时，其为自受精或核移植开始不超过14天的受精卵或囊胚。
本发明的有益效果为：
含有变异的AAV6衣壳蛋白的重组腺相关病毒颗粒具有更强的感染能力，因而可以在更低的使用剂量下达到与常用剂量基本相同的感染效果，从而能有效降低在转导过程中对宿主细胞的损伤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中7个随机氨基酸的插入位点及所在载体结构示意图；
图2A为本发明一个实施例中构建用于测试感染活性的重组腺病毒所述的病毒载体图谱；
图2B和图2C为本发明一个实施例中构建的用于制备转基因小鼠受精卵孵育的重组腺病毒所述的病毒载体图谱；图2B为Cas9所在载体；图2C为gRNA所在载体；
图3A为本发明一个实施例中AAV6突变体NS01与野生型的AAV6载体转导受精卵后第三天的明场和暗场（荧光）拍摄的照片；
图3B为本发明一个实施例中AAV6突变体NS01与野生型的AAV6载体转导受精卵存活率的统计结果；
图4为本发明一个实施例中受精卵PCR产物测序结果；
图5为本发明一个实施例中转基因阳性小鼠的测序结果；
图6为本发明一个实施例中转基因动物构建的整体流程图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及一种变异的AAV6衣壳蛋白，其中相对于相应野生型AAV6衣壳蛋白，所述变异的AAV6衣壳蛋白中插入有氨基酸片段QTTDKYK，插入位点介于野生型AAV6衣壳蛋白的第588和589位氨基酸之间。
“AAV”是腺相关病毒的缩写，并且可用于指病毒本身或其衍生物。除非另有需要时，所述术语包括亚型及自然存在和重组形式。缩写“rAAV”指重组腺相关病毒，也称为重组AAV载体(或“rAAV载”）。术语“AAV”可以用于指代不同血清型的腺相关病毒，例如1型AAV(AAV1)、2型AAV(AAV2)、3型AAV(AAV3)、4型AAV(AAV4)、5型AAV(AAV5)、6型AAV(AAV6)、7型AAV(AAV7)、8型AAV(AAV8)、9型AAV(AAV9)、10型AAV(AAV10)、11型AAV(AAV11)、12型AAV(AAV12)、13型AAV(AAV13)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV和羊AAV。“灵长类AAV”指感染灵长类动物的AAV，“非灵长类AAV”指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”指感染牛哺乳动物的AAV等。不同亚型AAV的基因组序列，以及天然末端重复序列（ITR)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列在本领域中已知。此类序列可在文献或公用数据库例如基因库中找到。
本发明还涉及重组腺相关病毒颗粒（AAV病毒颗粒），其包含如上所述的变异的AAV6衣壳蛋白。
“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“rAAV载体颗粒”指由至少一种AAV衣壳蛋白和壳体化多核苷酸rAAV载体构成的病毒颗粒。
在一些实施方式中，所述重组腺相关病毒颗粒的基因组中包含编码目的基因产物的核苷酸序列的异源核酸。
“异源”指源自和与之比较的其余实体基因型不同的实体。例如，通过基因工程技术引入源自不同物种的质粒或载体中的多核苷酸为异源多核苷酸。取自其天然编码序列并且与并非发现与之天然连接的编码序列操作性连接的启动子为异源启动子。因此，例如，包括编码异源基因产物的异源核酸的rAAV是包括在自然存在的野生型AAV中一般不包括的核酸的rAAV，并且编码的异源基因产物是一般并非自然存在的野生型AAV编码的基因产物。
在一些实施方式中，所述目的基因产物为干扰RNA或适配体。
干扰RNA可以选自例如siRNA或shRNA。
在一些实施方式中，所述目的基因产物为多肽。
本发明还涉及腺相关病毒载体系统，其包含一种或多种载体，其中至少一种载体中包含用于编码所述变异的AAV6衣壳蛋白的核酸片段。
衣壳蛋白的核酸片段在本发明中通常用cap基因片段表示。
在一些实施方式中，所述腺相关病毒载体系统中至少一种载体包含二型腺相关病毒的rep基因片段。
AAV的rep和cap基因指编码腺相关病毒的复制和壳体化蛋白的多核苷酸序列。rep和cap基因可位于相同或不同质粒上。
在一些实施方式中，所述腺相关病毒载体系统中至少一种载体为包装质粒，所述包装质粒负责编码异源核酸以及两个末端反向重复序列；其中所述异源核酸如如上所述的异源核酸所定义。
在一些实施方式中，所述腺相关病毒载体系统中至少一种载体为包含辅助病毒质粒，所述辅助病毒质粒允许哺乳动物细胞复制并包装AAV病毒。
在本领域中已知AAV的多种此类辅助病毒，包括(例如)腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(例如牛痘）。已知人、非人类哺乳动物和禽类来源的许多腺病毒并且可从保藏中心例如CCTCC、CGMCC获得。疱疹家族的病毒包括(例如)单纯疱疹病毒(HSV)和埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr viruses) (EBV)以及巨细胞病毒(CMV)和假狂犬病病毒(PRV)。
本发明还涉及药物组合物，其包含如上所述的重组腺相关病毒颗粒和/或如上所述的腺相关病毒载体系统，以及药学上可接受的赋形剂。
本发明还涉及一种将目的基因产物递送到受精卵或囊胚中的非治疗目的方法，包括：
将如上所述的重组腺相关病毒颗粒以5×107～9 vg/40μL的浓度与受精卵或囊胚接触；
其中当所述受精卵或囊胚来源于人类时，其为自受精或核移植开始不超过14天的受精卵或囊胚。
其中vg代表基因组数量（vector genome）用于表示病毒数量。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1
在本实施例中，发明人通过构建AAV6的肽段随机突变文库，筛选到插入了7个氨基酸的新的AAV6突变体。
1. 文库制备
1.1化学合成AAV6-7mer-NNS以下两个片段：
5’cctccagagcagcagcNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSacagaccctgcg 3’；
5’cggtcgcagggtctgtSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNgctgctgctctg 3’；
其中NNS代表随机编码序列。
1.2将合成的AAV6-7mer-NNS正链与反链引物各加10μL（引物的终浓度为10 mM）采用退火的方式来获得AAV6-7mer-NNS模板。退火程序为：95℃，5 min；95℃，1 min；92 min，1min；4℃，60 min。其中，第二步和第三步，每个循环降3℃，一共25个循环。
1.3将质粒pAAV-short UBC-mScarlet-polyA-P40-AAV6-Cap-FLEX-SV40 polyA（其结构和插入位点入图1所示）用BsmBI进行单酶切。50 μL酶切反应体系含pAAV-shortUBC-mScarlet-polyA-P40-AAV6-Cap-FLEX-SV40 polyA 10 μg、10×Cutsmart（NEB）2 μL、BamHI 1μL，用水补足至50 μL，55℃酶切4 h 后进行1% 琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下用刀片将大片段切下并进行回收纯化；
1.4将1.3步得到的纯化的酶切产物和1.2步得到的AAV6-7mer-NNS核苷酸序列采用T4 DNA ligase进行重组。10 μL反应体系分别含1.3步酶切产物100 ng，1.2步AAV6-7mer-NNS模板 4 ng，1 μL T4 DNA ligase，1 μL T4 buffer，其余用水补足至10 μL，4℃过夜酶连。
1.5将10μL酶连产物加入到50 μL Stble3感受态细胞中，冰上放置30 min，随后，在42℃下，热激90 s，将热激完的样品在冰上放置90 s，向里面加入500μL的液体LB于37℃，230 rpm下活化1 h，随后，进行离心涂布。
1.6重复步骤1.4-1.5，直到克隆数量达到5×1011。
2. 文库病毒包装及筛选
2.1 重组AAV病毒包装：按照每皿1.5×107个293-AAV细胞接种到15cm的细胞培养皿中，培养30-48 h，当细胞贴壁后即可开始转染。采用PEI转染试剂将含有AAV6-7mer-NNS片段的pAAV-short UBC-mScarlet-polyA-P40-AAV6-Cap-FLEX-SV40 polyA表达载体文库，AAV2-Rep-AAP Helper，Helper辅助质粒转入到293-AAV细胞中，转染72 h后，于荧光显微镜下计数AAV-293细胞中载体文库细胞的比例，以确定病毒包装效率。待病毒包装完成后，用枪头反复吹打细胞，使所有细胞从培养皿上完全脱落下来，收集所有细胞样品。
2.2 病毒的纯化：将收集到的细胞样品在-80℃和37℃进行反复的冻融，离心，收集上清，用0.45 μm的PVDF滤器去除细胞碎片，随后，再采用AAV纯化试剂盒对收集的重组AAV病毒进行纯化来获取重组AAV病毒。
2.3 重组AAV病毒滴度的测定：取20 μL浓缩病毒液，加1 μL RNase-free DNase，混匀，37℃，孵育30 min，10000 rpm离心10 min，取20 μL上清加80 μL稀释Buffer至另一个无菌管中，混匀，100℃金属浴反应10 min。自然冷却至室温，加入3μL蛋白酶K，37℃孵育60min，100℃金属浴反应10 min，冷却至室温。将上述样品稀释后用做模板，采用实时定量PCR检测法测定重组AAV病毒滴度(使用引物: DU-F: 5’GCTGAAGGTGACCAAGGGTGG3’ DU-R:ATCACGCGCTCCCACTTGAAG)。qPCR反应体系及反应条件为：95℃，10 min；95℃，30 s；60℃ ，30 s，35个循环。
2.4 AAV病毒感染受精卵：将来自Cre小鼠的受精卵置于40ul培养基中，待受精卵发育到3.5天后，收集所有受精卵样品。
2.5 将收集到的细胞抽提基因组后进行PCR扩增，PCR产物高通量测序。
第一轮引物：
AAV6-F：CCGTGGCCACCGAAAGATTTG（载体上的正引物）
AAV6-R：TTCCAGGTAAGGCTCCCATAA（载体上的反引物）
高通量接头引物使用如下:
NGS-AAV6-F：TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGACCGTGGCCACCGAAAGATTTG
NGS-R1：
GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTACACTGACCTCAAGTCTGCACACGAG AAGGCTAGCGAGTAATTTCCAGGTAAGGCTCCCATAA
NGS-R2：
GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTACACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGTCTCCGGATTCCAGGTAAGGCTCCCATAANGS-R3：GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTACACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAATGAGCGTTCCAGGTAAGGCTCCCATAA
NGS-R4：GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTACACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGGGAATCTCTTCCAGGTAAGGCTCCCATAA
NGS-R5：GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTACACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGTTCTGAATTTCCAGGTAAGGCTCCCATAA
NGS-R6：GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTACACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACGAATTCTTCCAGGTAAGGCTCCCATAA
获得预测序列:
CCGTGGCCACCGAAAGATTTGGGACTGTGGCAGTCAACCTCCAGAGCAGCAGC
NNSNNSNNSNNSNNSNNSNNS
ACAGACCCTGCGACCGGAGATGTGCATGTTATGGGAGCCTTACCTGGAA
分析高通量测序结果并验证，将出现频率高的突变体命名为AAV6- NS01。
突变体序列如下:
> AAV6- NS01-DNA：
CAGACGACGGACAAGTACAAG；
> AAV6- NS01-AA：
QTTDKYK。
实施例2 AAV6突变体NS01构建及病毒包装
1. 以天然血清型AAV2/6为模板，在588-589为氨基酸处插入AAV6- NS01-DNA片段CAGACGACGGACAAGTACAAG获得血清型载体AAV6-NS01。
2.使用穿梭载体pAAV-CMV-EGFP-WPRE-PolyA(载体图谱见图2A)，以AAV6-NS01作为血清型载体包装AAV病毒。
3. 使用WPRE引物对以上病毒进行滴度测定。并使用考染确认VP1,VP2,VP3表达正常。
实施例3 AAV6突变体NS01感染受精卵
1.获取受精卵
本实施例中的野生型C57BL/6J小鼠为上海西普尔-必凯实验动物有限公司产品。胚胎操作液M2及胚胎培养液M16，卵丘细胞团消化液透明质酸酶Hyaluronidase，胚胎孵育时覆盖的矿物油用于保持培养液滴中渗透压的稳定，以上产品均来源于sigma公司，产品目录号分别是M7167、M7292、H4272、M8410。
为了增加实验时可操作的受精卵，通过人为注射激素，来诱导供体鼠多排卵。PMSG(孕马血清）是模拟FSH（卵泡刺激素）促进卵泡生长和发育的效果，HCG（人绒毛膜促性腺激素）则是模拟LH（黄体生成素）的促进排卵效果，此处两种激素来源于宁波第二激素厂。
小鼠受精卵来自于4-6W C57BL/6J雌鼠超排后与性成熟的C57BL/6J雄鼠交配，挑选见栓鼠取受精卵；
2.受精卵感染测试
将实施例2中所述的病毒载体按照5×107 vg、5×108vg和5×109 vg梯度分别与胚胎共同于胚胎培养液M16中共同孵育，胚胎培养液体积为40μL，胚胎密度为20~30枚，在AAV6突变体NS01与野生型的AAV6载体转导受精卵后第三天进行受精卵成活率比较，结果如图3A所示。从图中可以看出，相比于野生型的AAV6载体，相同病毒滴度下NS01的转导效率更高，并且受精卵成活率也更高。统计结果如图3B所示，AAV6突变体NS01感染组的成活率明显高与野生型的AAV6；AAV6突变体NS01的高剂量组（5×109 vg）存活率略高于野生型AAV6中剂量组（5×108 vg）的存活率。
实施例4使用AAV6-NS01感染受精卵，检测活性后移植受体母鼠，获得Rosa 26locus 点突变小鼠
本实施例中的野生型C57BL/6J小鼠为上海西普尔-必凯实验动物有限公司产品。
用于受精卵注射的注射针和固定针为Ependorf公司产品，产品目录号为170685（规格 BF100-78-10）和5195000036。
胚胎操作液M2及胚胎培养液M16，卵丘细胞团消化液透明质酸酶Hyaluronidase，胚胎孵育时覆盖的矿物油用于保持培养液滴中渗透压的稳定，以上产品均来源于sigma公司，产品目录号分别是M7167、M7292、H4272、M8410。
为了增加实验时可操作的受精卵，通过人为注射激素，来诱导供体鼠多排卵。PMSG(孕马血清）是模拟FSH（卵泡刺激素）促进卵泡生长和发育的效果，HCG（人绒毛膜促性腺激素）则是模拟LH（黄体生成素）的促进排卵效果，此处两种激素来源于宁波第二激素厂。
构建用于制备转基因小鼠受精卵孵育的重组腺病毒所述的病毒载体图谱为图2B和图2C所示。
病毒载体及滴度信息:
AAV2/6-NS01-CMV-spCas9 5.20E+12 vg/ml
AAV2/6-NS01-U6-Rosa26 gRNA，gRNA靶点序列: CAGAGAACTCCCAGAAAGGTAT2.55E+13 vg/ml
小鼠受精卵来自于4-6W C57BL/6J雌鼠超排后与性成熟的C57BL/6J雄鼠交配，挑选见栓鼠取受精卵，将病毒载体AAV2/6-NS01-CMV-spCas9和AAV2/6-NS01-U6-Rosa26 gRNA各2.5×108 vg混匀后，与胚胎共同于胚胎培养液M16中共同孵育，胚胎培养液体积为40μL，胚胎密度为20~30枚，部分卵2.5天后送样检测活性。
受精卵活性检测：
小鼠受精卵的制备：取20枚AAV感染2.5天的受精卵，加入350μL PBS、缓冲液buffer C-L 150 μL和20μL蛋白酶K（15mg/ml），56°消化过夜，离心取上清后过柱，此处用到的试剂均来源于AXYGEN基因组抽提试剂盒（AXYGEN，美国）
设计并合成如下引物：
Rosa26- F1：AGACCTCCATCGCGCACTC
Rosa26-R1：TCTAGGGGTTGGATAAGCCAG
Rosa26-F2：CGCTCTGAGTTGTTATCAGTAAG
Rosa26-R2：CTGCATAAAACCCCAGATGAC
空白对照组：以去离子水为模板，以Rosa26 -F1和Rosa26 -R1为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
阴性对照组：提取野生型C57BL/6J小鼠的脚趾基因组DNA为模板，以Rosa26 -F1和Rosa26 -R1为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR反应体系均为：模板2μL，浓度为100nmol的引物Rosa26 -F1和Rosa26 -R1各1μL，1μL，2×Taq；
Master Mix（上海翊圣生物科技有限公司）产品12.5μL，ddH2O 8.5μL，总体积20μL；
PCR反应条件均为：95℃预变性5min；94℃变性30sec，54℃复性30sec，72℃延伸；
30sec，共34个循环；72℃延伸7min。
受精卵PCR产物测序结果如图4所示：可见明显杂峰，证实AAV6-NS01血清型的Cas9及gRNA病毒能有效感染受精卵，并有效切割目的靶点Rosa26。
取发育状态好的受精卵移植到0.5天代孕母鼠输卵管内，每只假孕母鼠输卵管单侧移植25枚。移植后的假孕母鼠饲养于SPF级动物房，孕育出生的小鼠即为F0代小鼠。待F0代小鼠出生10天后剪小鼠脚趾编号并将脚趾组织与编号对应，提取小鼠脚趾组织的DNA进行PCR扩增基因组，并测序。
小鼠基因组的制备：取新生小鼠的脚趾样品约0.3cm，加入350μL PBS、缓冲液buffer C-L 150μL和20μL蛋白酶K（15mg/ml），56°消化过夜，离心取上清后过柱，此处用到的试剂均来源于AXYGEN基因组抽提试剂盒（AXYGEN，美国）。
PCR方法同受精卵鉴定，PCR产物送测序。
代表性的阳性小鼠的测序结果如图5所示：
经过将PCR产物装载T载体测序后证实，该小鼠为杂合型双等位基因突变体。
一条染色体Rosa26 locus插入2个碱基（aa），另一条染色体Rosa26 locus缺失3个碱基（aga）。
由此可见，经过本发明方法改造得到的重组腺病毒，在转导受精卵后，可以以更低的病毒剂量获得理想的转导效果，并且所得受精卵可用于转基因动物的制备。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.重组腺相关病毒颗粒，其特征在于，包含变异的AAV6衣壳蛋白，相对于相应野生型AAV6衣壳蛋白，所述变异的AAV6衣壳蛋白中插入有氨基酸片段QTTDKYK，插入位点介于野生型AAV6衣壳蛋白的第588和589位氨基酸之间；其中所述野生型AAV6衣壳蛋白的长度为736个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒颗粒，其特征在于，所述重组腺相关病毒颗粒的基因组中包含编码目的基因产物的核苷酸序列的异源核酸。
3.根据权利要求2所述的重组腺相关病毒颗粒，其特征在于，所述目的基因产物为干扰RNA或适配体。
4.根据权利要求2所述的重组腺相关病毒颗粒，其特征在于，所述目的基因产物为多肽。
5.腺相关病毒载体系统，其特征在于，包含一种或多种载体，其中至少一种载体中包含用于编码权利要求1中所述变异的AAV6衣壳蛋白的核酸片段。
6.根据权利要求5所述的腺相关病毒载体系统，其特征在于，至少一种载体包含二型腺相关病毒的rep基因片段。
7.根据权利要求5所述的腺相关病毒载体系统，其特征在于，至少一种载体为包装质粒，所述包装质粒负责编码异源核酸以及两个末端反向重复序列；其中所述异源核酸如权利要求2～4中的异源核酸所定义。
8.根据权利要求5～7任一项所述的腺相关病毒载体系统，其特征在于，至少一种载体为辅助病毒质粒，所述辅助病毒质粒允许哺乳动物细胞复制并包装AAV病毒。
9.根据权利要求8所述的腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述辅助病毒质粒中的辅助病毒选自腺病毒、疱疹病毒和痘病毒。
10.药物组合物，其特征在于，包含权利要求1～4任一项所述的重组腺相关病毒颗粒和/或权利要求5～9任一项所述的腺相关病毒载体系统，以及药学上可接受的赋形剂。
11.一种将目的基因产物递送到受精卵或囊胚中的非治疗目的方法，其特征在于，包括：
将权利要求1～4任一项所述的重组腺相关病毒颗粒以5×107～9 vg/40μL的浓度与受精卵或囊胚接触；
其中当所述受精卵或囊胚来源于人类时，其为自受精或核移植开始不超过14天的受精卵或囊胚。
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