CN107002096A - 基于aav的基因疗法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于腺相关病毒(AAV)的基因疗法领域，尤其是涉及使用重组AAV‑转基因载体与免疫抑制剂和/或空AAV衣壳的组合。本发明还提供组合物和基于此组合物的成套试剂盒。

Description

基于AAV的基因疗法

技术领域

本发明涉及基于腺相关病毒(AAV)的基因疗法领域，尤其是涉及使用重组AAV转基因载体与免疫抑制剂和/或空AAV衣壳的组合。本发明还提供组合物和基于此组合的成套试剂盒。

发明背景

腺相关病毒(AAV)载体是首选的基因转移载体，因为它们被认为就人体内基因递送而言具有最佳安全性和有效性。因此，AAV载体广泛用于体内基因递送并显示对临床前模型以及临床试验安全有效。AAV载体在以下疾病的I/II期研究中获得成功：血友病B、囊性纤维化、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、帕金森病、杜氏肌营养不良和莱伯氏先天性黑蒙症(Leber’scongenital amaurosis)(Selot等.,Current Pharamceutical Biotechnology,2013,14,1072-1082)。阿利泼金(Alipogene tiparvovec)(uniQure)作为治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症(LPLD)的基因疗法已在欧洲获得销售许可。尽管基于AAV的基因疗法有望治疗多种疾病，不需要的免疫应答(在暴露于野生型AAV或基于AAV的载体后)可限制AAV载体的治疗功效。近期，据报道在静脉内施用后向AAV转基因组合物加入大量空衣壳能克服中和抗体的抑制效果并对肝的转基因表达产生缓解效应(WO2013/078400；WO2013/123503)。

基于AAV载体的基因疗法也用于类风湿性关节炎(RA)，这是影响～1％人群的慢性炎性疾病。RA病理遍布滑膜关节。关节的局部性质使得体内基因疗法非常有吸引力。应用提供抗炎蛋白质的疗法，旨在使RA平衡趋向抗炎状态。发明者发现关节内施用表达荧光素酶的AAV后，不是所有关节有效转导(通常<50％)且在注射的关节中的表达变化很大。为了能在关节中持续局部生成有效剂量的治疗性蛋白质，尤其是在类风湿性滑膜中，需要开发有效的基因递送体系。

发明内容

本发明提供rAAV载体组合物和免疫抑制剂以用于含基因疗法的治疗，其中所述治疗包括向个体施用所述rAAV载体组合物和施用所述免疫抑制剂，其中所述rAAV载体组合物包括rAAV转基因载体和空衣壳，空衣壳与rAAV转基因载体之比是至少1:1。

在一个优选实施方式中，所述rAAV载体组合物和免疫抑制剂中至少一种局部施用。

在另一个优选实施方式中，所述rAAV载体组合物和所述免疫抑制剂中至少一种全身施用。

优选地，局部施用所述rAAV载体组合物，优选在含大量先天免疫细胞的部位，甚至更优选地关节内施用所述rAAV载体组合物。

在一个实施方式中，局部施用所述免疫抑制剂，优选在含大量先天免疫细胞的部位，甚至更优选关节内局部施用所述免疫抑制剂。

在另一个实施方式中，全身施用所述免疫抑制剂，优选肌肉内或静脉内。

在某些实施方式中，相继施用所述rAAV载体组合物和所述免疫抑制剂，其中优选地所述免疫抑制剂在所述rAAV载体组合物之前施用。

在一个实施方式中，所述免疫抑制剂是先天免疫细胞抑制剂、细胞稳定药或嘌呤能信号通路修饰药物如甲氨蝶呤(非固醇类抗炎药)和/或免疫抑制生物制剂，如巨噬细胞消耗抗体(macrophage depleting antibody)、TNF阻断剂、IL-6阻断剂和/或IL-2阻断剂。优选地，所述免疫抑制剂是先天免疫细胞抑制剂，优选为糖皮质激素和/或脂质体二膦酸盐。

在某些实施方式中，所述rAAV转基因载体所含的所述转基因编码治疗性蛋白质。

在一个优选实施方式中，所述基因疗法用于预防、延迟、治愈、恢复和/或治疗炎性病症或炎性疾病，且优选其中所述转基因编码治疗性抗炎蛋白质。优选地，所述炎性病症或疾病是风湿性病症或疾病。优选地，所述基因疗法用于治疗、预防、延迟、治愈、恢复和/或治疗非炎性病症或非炎性疾病。

在某些实施方式中，所述rAAV载体组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂、增溶剂、填充剂、防腐剂和/或赋形剂。

在某些实施方式中，所述免疫抑制剂包含在所述rAAV载体组合物内。

本发明还提供组合物，所述组合物包括本文所定义的rAAV转基因载体和本文所定义的空衣壳，空衣壳与rAAV转基因载体之比是至少1:1，以及本文所定义的免疫抑制剂。

本发明还提供成套试剂盒，其包括本文所定义的rAAV载体组合物和本文所定义的免疫抑制剂。

发明内容

定义

“rAAV转基因载体”指重组腺相关病毒(AAV)载体，其用分子方法获得自野生型AAV。rAAV转基因载体不同于野生型(wt)AAV载体，因为所有或部分病毒基因组用转基因取代，其相对于本文进一步定义的AAV核酸序列是非天然核酸。野生型AAV属于依赖病毒属(Dependovirus)，进而属于细小病毒(Parvovirinae)的亚科，也称为细小病毒，其能感染脊椎动物。细小病毒属于小DNA动物病毒科，即细小病毒科。如通过其属名称可推断，依赖病毒的成员的独特性在于其通常需要用辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒感染以在细胞培养物中有效感染。依赖病毒属包括通常感染人的AAV，和感染其它温血动物的相关病毒(如牛、犬、马和绵羊腺相关病毒)。关于细小病毒和细小病毒科其它成员的进一步信息参见KennethI.Berns,"Parvoviridae:The Viruses and Their Replication",《Fields Virology第69章(第3版.1996)。为方便起见，本文通过参考AAV进一步举例说明和描述本发明。然而，应理解，本发明不限于AAV，而可以同样地应用于其他细小病毒。

所有已知AAV血清型的基因组结构非常类似。AAV基因组是线性、单链DNA分子，长度小于约5,000个核苷酸(nt)。末端反向重复(ITR)在独特的非结构复制(Rep)蛋白和结构(VP)蛋白的编码核苷酸序列的侧翼。VP蛋白(VP1、-2和-3)形成衣壳或蛋白质外鞘(shell)。末端145nt自身互补并排列成使得可形成稳定的分子内双链体，其形成T型发夹。这些发夹结构的功能是作为病毒DNA复制起点，用作细胞DNA聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中的wtAAV感染后，Rep基因25(即Rep78和Rep52)分别从P5启动子和P19启动子表达，两种Rep蛋白都在病毒基因组复制中起作用。Rep ORF的剪接事件导致实际上4种Rep蛋白(即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)的表达。然而，显示编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接mRNA在哺乳动物中足够用于AAV载体生成。哺乳动物细胞中的wtAAV感染对于衣壳蛋白生成依赖于交替使用2个剪接受体位点与对于VP2次优使用的ACG起始密码子的组合。

rAAV转基因载体可缺失一个或优选地所有的野生型AAV基因，但可仍包括功能性ITR核酸序列。优选地，所述rAAV转基因载体不包括任何编码病毒蛋白质的核苷酸序列，如AAV的rep(复制)或cap(衣壳)基因。功能性ITR序列对AAV病毒粒子的复制、拯救和包装是必需的。ITR序列可以是野生型序列或可与野生型序列有至少80％、85％、90％、95％或100％序列一致性，或可通过例如核苷酸插入、突变、缺失或取代来改变，只要其保持功能。在此背景下，功能性指指导基因组包装进入衣壳外鞘且随后允许在待转导的宿主细胞或靶细胞中表达的能力。通常，野生型AAV基因组的末端反向重复保留在rAAV转基因载体内。ITR能克隆自AAV病毒基因组或剪切自含AAV ITR的载体。ITR核苷酸序列能使用标准分子生物学技术在本文所定义的转基因的任一末端连接，或ITR之间的野生型AAV序列能用所需核苷酸序列取代。所述rAAV转基因载体优选包括至少一种AAV血清型的末端反向重复区域(ITR)的核苷酸序列或与之基本相同的核苷酸序列，和插入两个ITR之间的至少一种编码治疗性蛋白质(在合适调节元件控制下)的核苷酸序列。大部分当前使用的rAAV转基因载体采用来自AAV血清型2的ITR序列。优选的ITR序列由SEQ ID NO:1-6表示，如表1所示。rAAV转基因载体中存在的最优选的ITR是AAV2ITR。rAAV基因组能包括单链或双链(自身互补)DNA。单链核酸分子是有义或反义链，2种极性同样能表达基因。单链rAAV转基因载体可采用野生型AAV血清型2(AAV2)ITR序列(SEQ ID:24、25)，双链(自身互补)rAAV转基因载体可采用修饰形式的ITR(SEQ ID:26、27)。rAAV转基因载体还可包括标记或报告基因，如编码例如抗生素抗性基因、荧光蛋白(如gfp)的基因，或编码化学、酶学或本领域已知的其他可检测和/或可选择性产物(如lacZ,aph)的基因。

用本领域已知方法生成rAAV转基因载体，包括AAV血清型衣壳和AAV基因组ITR的任何可能组合，所述方法描述于Pan等(J.of Virology(1999)73:3410-3417),Clark等(Human Gene Therapy(1999)10:1031-1039),Wang等(Methods Mol.Biol.(2011)807:361-404)和Grimm(Methods(2002)28(2):146-157)，其通过引用纳入本文。简言之，所述方法一般涉及(a)向宿主细胞引入rAAV基因组构建体，(b)向宿主细胞引入AAV辅助构建体，其中所述辅助构建体包括自野生型rAAV基因组缺少的病毒功能，和(c)向宿主细胞引入辅助病毒构建体。所有用于rAAV载体复制和包装的功能需要存在，以实现rAAV基因组复制并包装入在rAAV载体。所述引入宿主细胞能用标准分子生物学技术完成，并可以是同时或相继完成。最后，所述宿主细胞培养到产生rAAV载体并用标准技术如CsCl梯度(Xiao等1996,J.Virol.70:8098-8108)纯化。纯化的rAAV载体随后能用于所述方法。能获得大于每ml 10¹²颗粒的高效价和高纯度(没有可检测的辅助和野生型病毒)(Clark等同上和Flotte等1995,Gene Ther.2:29-37)。在ITR区域之间插入rAAV载体的转基因的总大小一般小于5千碱基(kb)。

编码所述衣壳蛋白的序列可以是在自然界中发现的衣壳序列，如AAV2、AAV5和AAV8，其核苷酸和氨基酸序列如SEQ ID NO:7-18所示。在一个优选实施方式中，所述AAV衣壳蛋白是AAV血清型5或AAV血清型8的衣壳蛋白。或者，所述序列是人造的，例如该序列可以是杂交形式或可以是密码子优化的，例如通过苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcmNPv)或草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的密码子使用。例如，所述衣壳序列可由AAV1的VP2和VP3序列构成，而剩余VP1序列则为AAV5。所述人造序列可以是合理设计或定向进化实验的结果。这可包括通过DNA重排、易错PCR、生物信息学合理设计、定点饱和突变生成的衣壳库。所得衣壳是基于现有血清型，但包含改善这类衣壳特性的多个氨基酸或核苷酸变化。所得衣壳可以是现有血清型不同部分的组合、“重排衣壳”(“shuffled capsid”)，或包含全新变化，即一或多个氨基酸或核苷酸添加、缺失或取代，成组排列或遍布基因或蛋白质全长。参见例如Schaffer和Maheshri；《第26届IEEE EMBS国际年会会议记录》(Proceedings ofthe 26th Annual International Conference of the IEEE EMBS),美国加利福尼亚州旧金山；2004年9月1-5日,2004,3520-3523页；Asuri等(2012)Molecular Therapy20(2):329-3389；Lisowski等(2014)Nature 506(7488):382-386，其通过引用纳入本文。

在本发明上下文中，衣壳蛋白外鞘可与rAAV转基因载体基因组ITR属于不同血清型。本发明的rAAV转基因载体可因此通过衣壳蛋白外鞘而壳体化，即二十面体衣壳，其包括一种AAV血清型例如AAV血清型5的衣壳蛋白质(VP1、VP2和/或VP3)，而rAAV转基因载体所含的ITR序列可能是上述任何rAAV血清型，包括rAAV5载体。优选的野生型衣壳蛋白质外鞘序列由SEQ ID NO:7-18表示，如表1所示。在一个实施方式中，rAAV转基因载体通过AAV血清型5或AAV血清型2或AAV血清型8的衣壳蛋白质外鞘而壳体化，其中所述rAAV转基因载体中存在的rAAV基因组或ITR来源于AAV血清型2或AAV血清型5(由SEQ ID NO:5和6编码)或AAV血清型8。在此实施方式中，进一步优选rAAV转基因载体通过AAV血清型5(更优选SEQ ID NO:12、13、14，由SEQ ID NO:11编码)的衣壳蛋白质外鞘而壳体化，并且所述rAAV转基因载体中存在的所述rAAV基因组或ITR来源于AAV血清型2(更优选如SEQ ID NO:1、2的单链或如SEQID NO:3、4的双链)。优选此实施方式用于将基因递送到关节。

在另一实施方式中，优选rAAV转基因载体通过AAV血清型8(更优选SEQ ID NO:16、17、18，由SEQ ID NO:15编码)的衣壳蛋白质外鞘而壳体化，并且所述载体中存在的所述rAAV基因组或ITR来源于AAV血清型2(更优选如SEQ ID NO:1、2的单链或如SEQ ID NO:3、4的双链)。优选此实施方式用于全身递送。

在另一实施方式中，优选rAAV转基因载体通过AAV血清型2(更优选SEQ ID NO:8、9、10，由SEQ ID NO:7编码)的衣壳蛋白质外鞘而壳体化，并且所述载体中存在的所述rAAV基因组或ITR来源于AAV血清型2(更优选如SEQ ID NO:1、2的单链或如SEQ ID NO:3、4的双链)。AAV5和其它AAV血清型的完整基因组已经测序(Chiorini等1999,J.of Virology.第73卷,第2期,1309-1319页)，核苷酸序列可获自GenBank(登记号AF085716)。因此，AAV5的ITR核苷酸序列对技术人员而言是容易获得的。AAV2的完整基因组可获自NCBI(NCBI参考序列NC_001401.2)。其能通过本领域已知的化学合成技术，使用例如寡核苷酸合成仪，如由应用生物系统公司(Applied Biosystems Inc.，美国加利福尼亚州福斯特)供应，或通过标准分子生物学技术来克隆或制备。

“血清型”一般在抗体与一种病毒之间相较另一病毒缺乏交叉反应性的基础上定义。这种交叉反应性差异通常归因于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如归因于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)。在传统定义下，血清型意味着感兴趣病毒已经针对特异于所有现有和特征性血清型的血清测试中和活性，且没有发现中和感兴趣病毒的抗体。随着更多天然存在的病毒分离物的发现和衣壳突变体的生成，可能与任何现有血清型有或没有血清学差异。因此，在新AAV没有血清学差异的情况下，此新AAV会是对应血清型的亚组或变体。在许多情况下，血清学检测中和活性尚需要在有衣壳序列修饰的突变病毒上进行，以确定其是否根据传统血清型定义属于另一血清型。因此，为了方便起见和避免重复，术语“血清型”广义上指血清学上不同的病毒(如AAV)以及可能在给定血清型亚组或变体内的非血清学不同的病毒(如AAV)。举例来说，rAAV转基因载体包括多种天然或非天然出现的血清型。这类非限制性血清型包括AAV-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-rh74、-rh10、AAV-DJ和AAV-2i8。再次，为了方便起见，血清型包括有衣壳序列修饰的AAV，其未充分表征为不同血清型，且可实际上构成已知血清型的亚组或变体。

“空AAV衣壳”在本文也命名为“空衣壳”，仅由衣壳蛋白构成且无病毒核酸基因组。空衣壳是病毒样颗粒，因为其与一种或多种结合全载体(含基因组)(如腺相关病毒，AAV)的抗体或清道夫受体结合，从而优选起到诱饵作用以降低针对病毒载体的免疫应答。这种诱饵优选用于吸收针对病毒载体的抗体或清道夫受体，从而在这类抗体或清道夫受体的背景下增加或改善细胞的病毒载体转基因转导(引入转基因)，并且进而增加基因转录物和/或编码蛋白的细胞表达。例如，空AAV8衣壳会保留与一种或多种结合AAV(如野生型AAV8或rAAV8转基因载体或另一AAV血清型)的抗体或清道夫受体结合的能力。例如，空AAV2衣壳会保留与一种或多种结合野生型AAV8或rAAV8转基因载体的抗体或清道夫受体结合的能力。空衣壳可保留进入细胞的能力，但不需进入细胞，例如，修饰或交联空衣壳的衣壳蛋白质序列减弱经修饰的或交联的衣壳进入细胞的能力。因此，相较含转基因的病毒载体，这种空衣壳与细胞的结合减少。因此，空衣壳可能未修饰，或经修饰并且相较含转基因的病毒载体具有减少的与细胞的结合。在特定实施方式中，空衣壳用交联剂处理，或包括显示与AAV受体结合降低或减少的突变的衣壳。在特定方面，突变的衣壳包括一种或多种突变的衣壳蛋白，如WO2013/078400所公开，即其中一或多个有助于硫酸乙酰肝素蛋白多糖结合的精氨酸(R)残基用不带电或疏水残基取代，或任何AAV衣壳蛋白如AAV2VP1(SEQ ID NO:8)和/或VP2(SEQ ID NO:9)，其在任何以下位置具有一或多个精氨酸(R)残基被取代：451、448、530、585或588(如在任何位置的一或多个精氨酸(R)残基被取代：在451位用半胱氨酸取代，在448位用半胱氨酸取代，在530位用丙氨酸取代，在585位用丙氨酸取代或在588位用丙氨酸取代)。

空AAV衣壳或空衣壳有时在AAV载体制品中天然发现。这种天然混合物能根据本发明被使用，或若需要，被操纵以增加或减少空衣壳和/或载体的量。不希望受任何理论约束，所述空衣壳可用作诱饵，从而防止rAAV转基因载体降解。此情况下，空衣壳的量能被调整成预期减少抗体或巨噬细胞的抑制作用的量，所述抗体或巨噬细胞与意在用于在个体中载体介导的基因转导的rAAV载体反应或结合。

空衣壳还能独立于AAV载体制品而生成，若需要，加入AAV载体制品或分开施用于个体。能产生和纯化空衣壳、包含衣壳的基因组和衣壳蛋白质，并且例如根据个体中的AAV抗体效价或血清型确定(任选地调整)他们的量，并根据其预期目的使用或施用。

“先天免疫细胞”在本文理解成嗜中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或树突细胞，其具有参与对外来物质炎性反应的潜力。

“巨噬细胞”在本文理解成先天免疫细胞，其在被称为吞噬作用的过程中吞没和消化细胞碎片、外来物质、微生物和癌细胞。

术语“转基因”用于指相对AAV核酸序列而言的非天然核酸。其用于指能被引入细胞或生物体的多核苷酸。转基因包括任何多核苷酸，如编码多肽或蛋白质的基因，转录成抑制性多核苷酸的多核苷酸，或不转录的多核苷酸(如缺乏表达控制元件，如驱动转录的启动子)。本发明的转基因可包括至少两种核苷酸序列，各自不同或编码不同的治疗性分子。所述至少两种不同的核苷酸序列可由IRES(内部核糖体进入位点)元件连接，其提供在单一启动子控制下的双顺反子转录物。合适的IRES元件描述于例如Hsieh等(1995,BiochemicalBiophys.Res.Commun.214:910-917)。此外，所述编码不同(治疗性)多肽或蛋白质的至少两种不同的核苷酸序列可由病毒2A序列连接，以允许来自单一启动子的两种转基因有效表达。2A序列的示例包括口蹄疫病毒、马甲型鼻炎病毒(equine rhinitis Avirus)、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)和猪捷申病毒-1(porcine teschovirus-1)(Kim等,PLoS One(2011)6(4):e18556)。转基因优选插入rAAV基因组内或如上所示在ITR序列之间。转基因还可以是表达构建体，其包括表达调节元件如启动子或操作性地连接到编码序列和3’终止序列的转录调控序列。优选地，转基因内的编码序列没有可操作性地连接到类固醇诱导型启动子。更优选地，转基因内的编码序列没有可操作性地连接到地塞米松诱导型启动子。

在具有转基因的细胞中，所述转基因已经通过细胞的rAAV“转导”来引入/转移/转导。引入转基因的细胞或其子代被称为“经转导的”细胞。通常，转基因被纳入转导细胞子代或成为发育自细胞的生物体的一部分。因此，“经转导的”细胞(例如，在哺乳动物中，如细胞或组织或器官细胞)指将外源分子(如多核苷酸或蛋白质，例如转基因)纳入细胞后，细胞中的遗传变化。因此，例如，“经转导的”细胞是已经引入外源分子的细胞或其子代。所述细胞能增殖并引入的蛋白被表达，或核酸被转录。

“转导”指转基因通过病毒载体转移进受体宿主细胞。通过本发明的rAAV转基因载体转导靶细胞引起该载体所含的转基因被转入经转导的细胞。“宿主细胞”或“靶细胞”指发生DNA递送的细胞，如个体的滑膜的细胞(synovial cell)或滑膜细胞(synoviocyte)。AAV载体能转导分裂和非分裂细胞。

“基因”或“编码序列”指编码特定蛋白质的DNA或RNA区。编码序列当置于合适调节区(如启动子)的控制下时，转录(DNA)和翻译(RNA)成多肽。基因可包括数个可操作性地连接的片段，如启动子、5’前导序列、内含子、编码序列和3’非编码序列，包括多腺苷酸化位点或信号序列。嵌合或重组基因是通常在自然界中不存在的基因，例如其中启动子不与部分或所有转录DNA区天然相关的基因。“基因表达”指其中基因被转录成RNA和/或被翻译成活性蛋白的过程。

本文所用的术语“启动子”或“转录调控序列”指核酸片段，其作用在于控制一或多个编码序列的转录，且相对于所述编码序列转录起始位点的转录方向而言位于上游，并通过DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点的存在、转录起始位点和任何其它DNA序列(包括但不限于，转录因子结合位点、抑制子和激活蛋白结合位点和本领域技术人员已知的任何其它核苷酸序列，其直接或间接调节来自启动子的转录量)来在结构上鉴别。“组成型”启动子是在大部分生理和发育条件下在大部分组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子是受生理或发育调控的启动子，如通过化学诱导物的应用。优选的诱导型启动子是NF-Kb响应性启动子，其在发炎后可被诱导。更优选的NF-Kb反应启动子包括SEQ ID NO:19。“组织特异性”启动子优选在特定类型的组织或细胞中有活性。合适的启动子序列的选择一般取决于选定用于表达DNA区段的宿主细胞。本发明的rAAV和/或转基因内的优选启动子序列是在类风湿性滑膜的细胞中赋予表达的启动子，如在内膜巨噬细胞和/或成纤维细胞样滑膜细胞和/或其它滑膜细胞，例如但不限于T细胞中。例如，优选的启动子是已知在滑膜细胞中表达的基因的启动子，如CMV启动子(巨细胞病毒)、IL-6基因启动子或SV40启动子、或如本文早前鉴定的NF-κB诱导型启动子，以及其他易由技术人员确定的启动子。或者，转基因可操作性地连接到允许有效全身表达的启动子。合适的启动子序列是CMV启动子、CBA(鸡β肌动蛋白)或肝特异性启动子如人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)或TBG(甲状腺结合球蛋白)。优选地，所述rAAV和/或转基因内的启动子不是类固醇诱导型启动子。更优选地，所述rAAV和/或转基因内的启动子不是地塞米松诱导型启动子。

本文所用的术语“可操作性地连接”指以功能关系连接多核苷酸(或多肽)元件。当核酸被置于与另一核酸序列具有功能关系时，其“可操作性地连接”。例如，转录调控序列可操作性地连接编码序列，只要其影响所述编码序列的转录。“可操作性地连接”指所连接的DNA序列通常是连续的，必要时连续并在读框中连接两个蛋白质的编码区。

本文所用的“基因疗法”是将核酸序列(如本文所定义的转基因)插入个体细胞和/或组织中以治疗疾病。转基因可以是功能性突变体等位基因，其取代或补充缺陷基因。基因疗法还包括插入本质上抑制的转基因，即抑制、减少或降低内源基因或蛋白的表达、活性或功能，如不需要或异常的(如致病)基因或蛋白。这种转基因可以是外源的。外源分子或序列应理解成在待治疗的细胞、组织和/或个体中通常不出现的分子或序列。获得性和先天性疾病均适合基因疗法。

“治疗性多肽”或“治疗性蛋白质”在本文中应理解成能对个体产生有益效果的多肽或蛋白质，优选所述个体是人，更优选所述人患有疾病。这类治疗性多肽可选自但不限于由酶、辅助因子、细胞因子、抗体、生长因子、激素和抗炎蛋白质组成的组。

本文所用的“治疗有效”量是足以缓解(如缓和、减少、降低)至少一种疾病状态相关症状的量。或者，“治疗有效”量是足以提供使一些个体的病症改善的量。

“序列一致性”在本文中定义为两种或更多种氨基酸(多肽或蛋白)序列或者两种或更多种核酸(多核苷酸)序列之间的关系，如通过比较序列测定。在一个优选实施方式中，序列一致性基于两个给定SEQ ID NO的全长或其部分计算。其部分优选指两个SEQ ID NO的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在本领域中，“一致性”还指氨基酸或核酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，如由这类序列串之间的匹配所测定。除非本文另有说明，给定SEQ ID NO的一致性或相似性指基于所述序列的全长(即在其全长上或作为整体)的一致性或相似性。

两种氨基酸序列之间的“相似性”如下测定：将一种多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸取代基与第二多肽的序列进行比较。“一致性”和“相似性”能通过已知方法容易计算，包括但不限于(《计算分子生物学》(Computational Molecular Biology),Lesk,A.M.编,纽约的牛津大学出版社(Oxford University Press),1988；《生物计算：信息学和基因组项目》(Biocomputing:Informatics and Genome Projects),Smith,D.W.编,纽约的学术出版社(Academic Press),1993；《序列数据的计算机分析》(Computer Analysis of SequenceData),第I部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编,新泽西州的胡马纳出版社(HumanaPress),1994；《分子生物学的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology),von Heine,G.,学术出版社,1987；和《序列分析引物》(Sequence Analysis Primer),Gribskov,M.和Devereux,J.编,纽约的M斯托克顿出版社(M Stockton Press),1991；以及Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)所述的那些。

确定一致性的优选方法设计成给予所测序列之间的最大匹配。测定一致性和相似性的方法编纂在公开可用的计算机程序中。测定两种序列间一致性和相似性的优选计算机程序方法包括例如GCG程序包(Devereux,J.等,Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))和BestFit、BLASTP、BLASTN及FASTA(Altschul,S.F.等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))。BLAST X程序可公开获自NCBI和其它来源(《BLAST手册》(BLAST Manual),Altschul,S.等,NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894；Altschul,S.等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定一致性。

用于多肽序列比较的优选参数包括以下：算法:Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)；比较矩阵:来自Hentikoff和Hentikoff的BLOSSUM62,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915-10919(1992)；缺口罚分:12；和缺口长度罚分(GapLength Penalty):4。具有这些参数的有用的程序作为“Ogap”程序公开获自位于威斯康星州麦迪逊的GCG(Genetics Computer Group)。上述参数是氨基酸比较的默认参数(以及对于端隙(end gap)没有罚分)。

用于核酸比较的优选参数包括以下：算法:Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)；比较矩阵:匹配＝+10,错配＝0；缺口罚分:50；缺口长度罚分:3。作为Gap程序获自位于威斯康星州麦迪逊的GCG。上面给出的是核酸比较的默认参数。

任选地，在测定氨基酸相似性的程度期间，技术人员还可考虑所谓的“保守”氨基酸取代，这对技术人员是清楚的。保守氨基酸取代指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，有脂肪族侧链的氨基酸组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；有含酰胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷氨酰胺；有芳香族侧链的氨基酸组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；有碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基团是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文所公开的氨基酸序列的取代变体是所公开序列中至少一个残基被移出且不同残基插入其位置的那些。优选地，氨基酸变化是保守的。各天然存在氨基酸的优选保守取代如下：Ala到Ser；Arg到Lys；Asn到Gln或His；Asp到Glu；Cys到Ser或Ala；Gln到Asn；Glu到Asp；Gly到Pro；His到Asn或Gln；Ile到Leu或Val；Leu到Ile或Val；Lys到Arg；Gln或Glu；Met到Leu或Ile；Phe到Met,Leu或Tyr；Ser到Thr；Thr到Ser；Trp到Tyr；Tyr到Trp或Phe；和Val到Ile或Leu。

本文所用的“滑膜”或“滑膜组织”或“滑膜细胞”指覆盖滑膜关节的非软骨表面的细胞衬里，如进一步描述于Tak(2000,“检测滑膜和滑液”(Examination of the synoviumand synovial fluid)收录于:Firestein GS,Panyani GS,Wollheim FA编《类风湿性关节炎》(Rheumatoid Arthritis)纽约:牛津大学出版社(Oxford Univ.Press,Inc)55-68)，并通过引用纳入本文。滑膜由内膜衬里层(或滑膜衬里层)和融入关节囊的滑膜衬里下层(滑膜下层)组成。内膜衬里层包括内膜巨噬细胞(或巨噬细胞样滑膜细胞或A型滑膜细胞)和成纤维细胞样滑膜细胞(FLS或B型滑膜细胞)。因此，“滑膜”可由“滑膜组织”取代或与之同义。滑膜细胞能包括滑膜中存在的任何细胞，包括FLS和巨噬细胞样滑膜细胞。滑膜细胞也可以是嗜中性粒细胞，T、B细胞和/或结缔组织细胞，其都可存在于滑膜中。

术语“类风湿性滑膜”或“类风湿性滑膜细胞”或“类风湿性滑膜组织”指患有类风湿性关节炎的个体关节的发炎滑膜。类风湿性滑膜表征为内膜衬里增生和在滑膜衬里下层中积聚FLS、T细胞、浆细胞、巨噬细胞、B细胞、自然杀伤细胞和树突细胞。这些积聚的细胞包括在类风湿性滑膜细胞的定义内。

另外，通过不定冠词“一(a)”或“一(an)”提及要素时，不排除存在多于一种要素的可能性，除非上下文明确要求有且仅有一种要素。因此，不定冠词“一(a)”或“一(an)”通常指“至少一”。

词汇“大致”或“约”当与数值联用(大致10，约10)时，优选指该值可以是给定值10，加减该值的10％。

发明详述

在第一方面，本发明提供重组腺相关病毒(rAAV)载体组合物。优选地，所述rAAV载体组合物用于或适用于在基因疗法中应用。本发明的所述rAAV载体组合物包括至少一个本文所定义的rAAV-转基因载体。优选地，所述转基因具有治疗活性。

优选地，所述转基因编码治疗性(多)肽或治疗性蛋白质。用于本发明背景的治疗性(多)肽和蛋白质包括但不限于：(可溶性)分化簇39(CD39)蛋白质、(可溶性)分化簇73(CD73)蛋白质、重组抗炎融合蛋白(RAIN)(CD73-39融合)、白介素-1抑制剂、肿瘤坏死因子-α抑制剂、白介素-12抑制剂、白介素-1受体拮抗剂、白介素-18结合蛋白、可溶性肿瘤坏死因子-α受体p55或可溶性肿瘤坏死因子-α蛋白75、显性阴性IκB激酶-β、白介素-4、白介素-10、白介素-13、干扰素-β、血管活性肠肽、囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)、肌养蛋白、抗肌萎缩蛋白相关蛋白质(utrophin)、凝血(凝固)因子(如因子XIII、因子IX、因子X、因子VIII、因子VIIa、蛋白C、因子VII、B区缺失因子VIII或凝血因子的高活性或更长半衰期变体、或凝血因子的活性或失活形式)、单克隆抗体(如针对肿瘤坏死因子-α或白介素-12)、视网膜色素上皮细胞特异性65kDa蛋白(RPE65)、红细胞生成素、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β-球蛋白、α-球蛋白、血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶(ADA)、金属转运蛋白(ATP7A或ATP7)、磺酰胺酶、参与溶酶体贮积症(ARSA)的酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、P-25葡糖脑苷酯酶、鞘磷脂酶、溶酶体己糖胺酶、支链酮酸脱氢酶、激素、生长因子、胰岛素样生长因子1或2、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3和-4、脑源性神经营养因子、胶质源性生长因子、转化生长因子α和β、细胞因子、干扰素-α、干扰素-γ、白介素-2、白介素-12、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素、自杀基因产物、单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶、肿瘤坏死因子、药物抗性蛋白、肿瘤抑制蛋白(如p53、Rb、Wt-l、NF1、逢希伯-林道(Von Hippel-Lindau，VHL)、SERCA2a、腺瘤性结肠息肉病(APC))、VEGF、微小抗肌萎缩蛋白(microdystrophin)、溶酶体酸性脂肪酶、芳香基硫酸酯酶A和B、ATP7A和B、有免疫调节特性的肽、致耐受性或免疫原性肽或蛋白Tregitope或hCDR1、胰岛素、葡糖激酶、鸟苷酸环化酶2D(LCA-GUCY2D)、Rab护送蛋白1(无脉络膜)、LCA5(LCA-Lebercilin)、鸟氨酸酮酸转氨酶(回旋形萎缩(Gyrate Atrophy))、视网膜劈裂蛋白(Retinoschisin)1(X-性连锁视网膜先天性裂)、USH1C(尤希尔氏综合征IC)、X-性连锁色素性视网膜炎GTPase(XLRP)、MERTK(RP的AR形式:色素性视网膜炎)、DFNB1(连接蛋白26耳聋)、ACHM 2、3和4(全色盲)、PKD-1或PKD-2(多囊性肾病)、TPP1、CLN2、涉及溶酶体贮积症的基因产物(如硫酸酯酶、N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸转移酶、组织蛋白酶A、GM2-AP、NPC1、VPC2，鞘脂激活蛋白)、或者一种或多种锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、或用于基因组编辑的CRISPER-Cas9蛋白、或用作基因组编辑修复模板的供体序列以及对需要其的个体产生治疗性效果的任何其它肽或蛋白。优选地，治疗性蛋白是治疗性抗炎蛋白，优选选自由(可溶性)分化簇39(CD39)蛋白、(可溶性)分化簇73(CD73)蛋白、白介素-1抑制剂、肿瘤坏死因子-α抑制剂、白介素-1受体拮抗剂、白介素-18结合蛋白、可溶性肿瘤坏死因子-α受体p55或可溶性肿瘤坏死因子-α蛋白75、显性抑制IκB激酶-β、白介素-4、白介素-10、白介素-13、干扰素-β和血管活性肠肽组成的组。

由转基因编码的更多示例性治疗性肽或蛋白包括可用于治疗疾病或紊乱的那些，所述疾病或紊乱包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎(OA)、痛风、脊柱关节炎(spondlyarthritis)(SpA)、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、包括克罗恩氏病或溃疡性结肠炎在内的炎症性肠病、肝炎、败血症、酒精性肝病、和非酒精性脂肪肝、囊性纤维化(和其它肺病)、血友病A、血友病B、地中海贫血、贫血症和其它血液紊乱、AIDS、阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophiclateral sclerosis)、癫痫和其它神经障碍、癌、糖尿病、肌肉营养不良(如Duchenne、Becker)、高歇氏病、赫尔勒氏症、腺苷脱氨酶缺乏、糖原贮积病和其它代谢缺陷、视网膜退行性疾病(和其它眼部疾病)以及实体器官疾病(如脑、肝、肾、心脏)。

如本文所示，本发明的所述转基因可以是抑制性和/或反义核酸序列。抑制性、反义、siRNA、miRNA、shRNA、RNAi和反义寡核苷酸能调节靶基因的表达。这类分子包括能抑制参与调节疾病过程的靶基因的表达，从而减少、抑制或缓解一种或多种疾病的症状的那些。

反义包括单、双或三链多核苷酸和肽核酸(PNA)，其结合RNA转录物或DNA(如基因组DNA)。源自靶基因的转录起始位点如起始位点-10与+10位之间的寡核苷酸是另一具体示例。形成反义的三链体能结合到双链DNA，从而抑制基因的转录。“RNAi”是使用单或双链RNA序列以抑制基因表达(参见例如Kennerdell等,Cell 95:1017(1998)；和Fire等,Nature,391:806(1998))。因此，根据本发明的方法和应用，来自靶基因编码区的双链RNA序列可用于抑制或阻止基因表达/转录。反义和RNAi能基于编码靶基因序列(如HTT)的核酸而生成，如编码哺乳动物和人HTT的核酸。例如，单或双链核酸(如RNA)能靶向HTT转录物(如mRNA)。

“siRNA”指参与RNA干扰过程的治疗性分子，所述过程用于序列特异性转录后基因沉默或基因敲低。siRNA与靶基因的同源mRNA序列具有同源性。小干扰RNA(siRNA)能在体外合成或者通过核糖核酸酶III从更长的dsRNA切割产生，并且是序列特异性mRNA降解的调节物。siRNA或本发明的其它这类核酸能使用适当受保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成仪被化学合成。所述siRNA能被合成为2个分开的互补的RNA分子，或具有2个互补区的单一RNA分子。合成RNA分子或合成试剂的商业供应商包括应用生物系统公司(AppliedBiosystems，美国加利福尼亚州福斯特)、Proligo(德国汉堡)、Dharmacon公司(DharmaconResearch，美国科罗拉多州拉斐特)、皮尔斯化学(一部分Perbio科技(Perbio Science),美国伊利诺斯州罗克福德)、Glen Research(美国弗吉尼亚州斯特林)、ChemGenes(美国马萨诸塞州亚什兰)和Cruachem(英国格拉斯哥)。用于抑制靶基因mRNA的特异siRNA构建体可以是15-50核苷酸长度，更常是约20-30核苷酸长度。这种核酸分子能使用本领域技术人员已知的常规方法容易地纳入本文所公开的病毒载体。

可被依据本发明的抑制性核酸序列靶向的基因(如基因组DNA)或致病基因转录物(如RNA或mRNA)的具体非限制性示例包括但不限于：与多核苷酸重复疾病相关的致病基因如亨廷顿蛋白(HTT)基因，与齿状核红核苍白球路易体萎缩症(dentatorubropallidolusyan atropy)相关的基因(如atrophin 1、ATNI)；脊髓延髓肌萎缩症中X染色体上的雄激素受体，人Ataxin-l、-2、-3和-7，Ca,2.1P/Q电压依赖性钙通道由(CACNAIA)编码，TATA结合蛋白，Ataxin 8相反链(也称为ATXN8OS)，脊髓小脑性共济失调中的丝氨酸/苏氨酸-蛋白磷酸酶2A55kDa调节亚基Bβ同种型(1、2、3、6、7、8、12、17型)，脆性X综合征中的FMRl(脆性X智力低下I)，脆性X相关震颤/共济失调综合征中的FMRl(脆性X智力低下I)，FMRl(脆性X智力低下2)或脆性XE智力低下中的AF4/FMR2家族成员2；肌强直性营养不良中的强直素蛋白激酶(Myotonin-protein kinase)(MTPK)；弗里德赖希氏共济失调中的共济蛋白；肌萎缩性侧索硬化症中的超氧化物歧化酶1(SOD I)基因的突变体；参与帕金森氏病和/或阿尔茨海默病发病机理的基因；载脂蛋白B(APOB)和前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)(PCSK9)、高胆固醇血症(hypercoloesterolemia)；HIV Tat，HIV感染中转录基因的人免疫缺陷病毒反式激活蛋白；HIV TAR、HIV TAR，HIV感染中人免疫缺陷病毒反式激活蛋白响应元件基因；HIV感染中的C-C趋化因子受体(CCR5)；RSV感染中的劳斯氏肉瘤病毒(RSV)核衣壳蛋白，丙肝病毒感染中的肝特异性微RNA(miR-122)；p53，急性肾损伤或移植肾功能延迟恢复或肾损伤急性肾衰竭；晚期复发性(advance recurrent)或转移性实体恶性肿瘤中的蛋白激酶N3(PKN3)；LMP2，LMP2也称为蛋白酶体亚基β型9(PSMB 9)，转移性黑素瘤；LMP7，也称为蛋白酶体亚基β型8(PSMB 8)，转移性黑素瘤；MECL1也称为蛋白酶体亚基β型10(PSMB 10)，转移性黑素瘤；实体瘤中的血管内皮生长因子(VEGF)；实体瘤中的纺锤体驱动蛋白(kinesin spindleprotein)，慢性髓细胞白血病中的凋亡抑制因子B细胞CLL/淋巴瘤(BCL-2)；实体瘤中的核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)；实体瘤中的弗林蛋白酶(Furin)；肝肿瘤中的极体样激酶1(PLKI)，丙肝感染中的二酰基甘油18酰基转移酶1(DGATI)，家族性腺瘤性息肉病中的β-连环蛋白；β2肾上腺素能受体，青光眼；RTP801/Reddl，也称为糖尿病黄斑水肿(DME)或年龄相关的黄斑变性中的DAN损伤诱导的转录物4蛋白；年龄相关的黄斑变性或脉络膜新生血管(choroidal neivascularization)中的血管内皮生长因子受体I(VEGFRI)，非动脉炎性局部缺血性视神经病变中的胱天蛋白酶2；先天性厚甲症中的角蛋白6AN17K突变蛋白；流感感染中的流感病毒A型基因组/基因序列；SARS感染中的严重急性呼吸系统综合症(SARS)冠状病毒基因组/基因序列；呼吸道合胞体病毒感染中的呼吸道合胞体病毒基因组/基因序列；埃博拉感染中的埃博拉线状病毒基因组/基因序列；乙肝和丙肝感染中的乙肝和丙肝病毒基因组/基因序列；HSV感染中的单纯疱疹病毒(HSV)基因组/基因序列，柯萨奇病毒B3感染中的柯萨奇病毒B3基因组/基因序列；原发性肌张力障碍(primary dystonia)中沉默基因的致病性等位基因(等位基因特异性沉默)如扭转蛋白A(torsin A)(TORIA)，移植物中特异的泛I型(pan-class I)和HLA等位基因；炎性疾病中的促炎性分子(pro-inflammatorymolecule)如IL-6、IL-1B、TNF或CCL2；或常染色体显性遗传性色素性视网膜炎(adRP)中的突变体视紫红质基因(RHO)。

优选地，所述rAAV载体组合物包括如上定义的所述rAAV-转基因载体和本文所定义的空衣壳。相较本发明组合物的所述rAAV-转基因载体，所述空衣壳能属于相同血清型或不同血清型。优选地，所述空衣壳属于与所述rAAV-转基因载体相同的血清型。优选地，在本发明rAAV载体组合物内，所述空衣壳属于与所述rAAV-转基因载体的衣壳相同的血清型，优选是AAV2或AAV5。然而，本发明还涵盖rAAV载体组合物，其中所述空衣壳相较所述rAAV-转基因载体的衣壳属于不同的血清型(例如但不限于AAV2空衣壳与具有AAV5血清型的衣壳的rAAV-转基因载体的组合，或相反)。还包括rAAV载体组合物，其中所述空衣壳具有血清型混合物，例如但不限于AAV2和AAV5衣壳的混合物。在关节内施用混合有大量空衣壳的rAAV-转基因载体后，发明人报告关节中的转基因表达增加的效果。优选地在组合物内存在的rAAV-转基因载体和空衣壳，空衣壳与rAAV-转基因载体之比至少是1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1、15:1、20:1、50:1、100:1或1000:1，优选至少5:1(即空衣壳的量是rAAV转基因载体的量的至少5倍)。所述组合物优选包括rAAV-转基因载体和空衣壳，空衣壳与rAAV-转基因载体之比至多是10000:1、5000:1、4000:1、3000:1、2000:1、1000:1、500:1、400:1、300:1、200:1、100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、15:1、10:1或5:1，优选至多1000:1。所述组合物优选包括rAAV-转基因载体和空衣壳，空衣壳与rAAV转基因载体之比是1:1-100:1、2:1-100:1、5:1-100:1、1:1-20:1、2:1-20:1，或优选5:1-20:1。

上文提供实施方式，其中所述rAAV-转基因载体和所述空衣壳存在于单一组合物内。本发明还涵盖可选的实施方式，其中所述rAAV-转基因载体和空衣壳存在于(至少2个或更多)分开的不同组合物内。在此可选的实施方式中，所述rAAV-转基因载体和所述空衣壳能在时间(如相继)和/或位置上分开施用，其中所述位置应理解为施用部位。此外，所述rAAV-转基因载体和所述空衣壳能同时如基本上在同一时间施用，任选地在分开的位置。如前面实施方式所示，所有涉及所述转基因和所述空衣壳与rAAV-转基因载体之比的更多限制对此实施方式重复。

优选地，如上定义的所述rAAV载体组合物与免疫抑制剂联用。发明人意外地发现当对象同时用免疫抑制剂和rAAV-转基因治疗时，免疫抑制剂对AAV转基因表达的效果增加。此效果令人意外，因为在本领域，已就AAV基因表达测试糖皮质激素的效果，然而，结果相当令人失望。Pfeifer等报道糖皮质激素(地塞米松)对肺中AAV9基因表达没有任何显著效果(Pfeifer等,Gene Therapy(2011)18,1034–1042)。Monahan等报道小鼠中的AAV肝基因表达没有增加，且在一只狗中的基因表达增加较小、不明显(Monahan等.,MolecularTherapy(2010)18,1907–1916)。此外，发明人发现所述免疫抑制剂以及空载体对rAAV转基因表达具有令人意外的协同效应。在一个实施方式中，所述免疫抑制剂与所述rAAV载体组合物分开应用，分开意味着在部位和/或时间上分开。在一个这种实施方式中，所述免疫抑制剂和所述rAAV载体组合物可存在于分开的、不同的组合物内。所述免疫抑制剂、所述rAAV-转基因载体和所述空载体可甚至各自存在于分开的、不同的组合物内。在另一个实施方式中，所述免疫抑制剂和所述rAAV载体组合物可存在于单一组合物内。在另一个实施方式中，所述rAAV-转基因载体和所述免疫抑制剂存在于单一组合物内，且优选此组合物与含所述空衣壳的分开的组合物一起用于治疗。在甚至另一个实施方式中，所述免疫抑制剂和所述空衣壳存在于单一组合物内，且优选此组合物与含所述rAAV-转基因载体的分开的组合物一起用于治疗。因此，本发明还提供含本文所定义的空衣壳和免疫抑制剂的组合物，提供含本文所定义的rAAV-转基因载体和免疫抑制剂的组合物，以及提供含本文所定义的rAAV载体组合物和免疫抑制剂的组合物。

优选地，本发明的所述免疫抑制剂是先天免疫细胞抑制剂，优选巨噬细胞抑制剂。先天免疫细胞在本文中定义为导致先天免疫细胞活性和/或先天免疫细胞数减少的药剂。巨噬细胞抑制剂在本文中定义为导致巨噬细胞活性和/或巨噬细胞数减少的药剂。优选地，本发明的所述先天免疫细胞或巨噬细胞抑制剂导致先天免疫细胞或巨噬细胞的数量或活性相较治疗前先天免疫细胞或巨噬细胞的初始数量或活性减小至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、45％、55％、65％、75％、85％、95％，或优选100％。先天免疫细胞或巨噬细胞活性和/或数量能通过本领域技术人员已知的任何合适试验检测，例如但不限于MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)2,5-二苯基溴化四氮唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide))比色测定以用于测试巨噬细胞的体外细胞毒性，如Ferrari等(Journal of Immunological Methods,131(1990)165-172)所述，通过测量细胞因子水平(如CCL2、TNF)，通过组织学和组织化学检测方法例如CD68标记或通过体内磁共振成像(MRI)检测巨噬细胞的超顺磁性氧化铁(SPIO)摄取，优选在静脉内施用超顺磁性氧化铁(SPIO)后，如Yi-Xiang J.Wang(Quant.Imaging Med Surg(2011)1:35-40)所综述。检测可以在体外或体内。优选地，体内检测是动物模型，优选大鼠或鼠模型。

优选地，所述免疫抑制剂是糖皮质激素和/或二膦酸盐(liposomalbisphosphonate)，优选脂质体二膦酸盐。糖皮质激素的特定非限制性示例是皮质醇、可的松、强的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、地塞米松、倍他米松、氟羟脱氢皮醇(triamcinolone)、倍氯米松、醋酸氟氢可的松、醋酸脱氧皮质酮和醛固酮(aldosteron)。优选地，所述免疫抑制剂是氟羟脱氢皮醇。二膦酸盐的特定非限制性示例是依替膦酸盐、氯屈膦酸盐(clodronte)、替鲁膦酸盐、帕米膦酸盐(pamidronate)、奈立膦酸盐(neridronate)、奥帕膦酸盐、阿仑膦酸盐(alendronate)、伊班膦酸盐、利塞膦酸盐和唑来膦酸盐(zoledronate)。优选地，所述二膦酸盐是脂质体包封的二膦酸盐或脂质体二膦酸盐，优选脂质体氯膦酸盐。所述糖皮质激素优选不是地塞米松。应理解本发明的炎性或巨噬细胞抑制剂不限于糖皮质激素和/或二膦酸盐。例如，本发明的所述炎性或巨噬细胞抑制剂还能是炎性或巨噬细胞消耗抗体，如抗F4/80抗体。优选地，这类抗体是人或人源化抗体。待用于本发明的更多相关免疫抑制剂是细胞稳定药(cytostatic drug)(例如烷化剂和/或抗代谢物如甲氨蝶呤)，修饰嘌呤能信号通路的药物(例如甲氨蝶呤、腺苷类似物、腺苷受体拮抗剂或激动剂)，非固醇类抗炎药(NSAIDS，例如布洛芬、双氯芬酸、美洛昔康、萘普生、乙酰水杨酸)，生物制剂如TNF阻断剂(例如英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、赛妥珠单抗(certolizumab)、高利单抗(golimumab))、IL-6阻断剂(例如托珠单抗(tocilizumab))、IL-2阻断剂(例如巴利昔单抗、达利珠单抗(daclizumab))、IL-1β阻断剂(例如阿那白滞素、利洛纳塞(rilonacept)、康纳单抗(canakinumab))、莫罗单抗(muromonab)、阿巴西普(abatacept)和/或利妥昔单抗和/或其它化合物如羟氯喹、氯喹、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢霉素、氯金酸纳(gold salt)和青霉胺。

优选地，所述rAAV载体组合物和/或含空衣壳的组合物和/或含免疫抑制剂的组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂、增溶剂、填充剂、防腐剂和/或赋形剂。例如，这种药学上可接受载体、稀释剂、增溶剂、填充剂、防腐剂和/或赋形剂，示例可参见《雷明顿：药物科学和实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)，第20版；马里兰州巴尔的摩:利平科特威廉姆斯.威尔金斯出版社(Lippincott Williams&Wilkins),2000。

第二方面，本发明提供第一方面所述rAAV载体组合物用于含基因疗法的治疗。此外，本发明提供第一方面所述rAAV载体组合物在制备基因疗法药物中的应用。本发明还提供含基因疗法的治疗方法，其中所述方法包括施用第一方面所述rAAV载体组合物。

优选地，所述基因疗法还包括施用本文所定义的免疫抑制剂，其存在于所述rAAV载体组合物内或包含在分开的、不同的组合物内，即与所述rAAV载体组合物分开且不同。施用时，将本发明的所述rAAV载体组合物和/或空衣壳和/或免疫抑制剂递送给个体，所述个体的细胞、组织或器官，优选患有本文所定义的病症或疾病的个体。优选地，所述rAAV载体组合物和所述免疫抑制剂同时施用。同时施用在本文中应被理解为在大致同一时间施用，优选时间间隔不超过15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、12小时或24小时，优选时间间隔不超过15分钟。在另一实施方式中，所述rAAV载体组合物和所述免疫抑制剂相继施用，其中优选所述免疫抑制剂在所述rAAV载体组合物前施用。优选地，所述免疫抑制剂在所述rAAV载体组合物施用前至少1小时、3小时、12小时、24小时、2天、4天或1周施用。在所述rAAV-转基因载体和所述空衣壳存在于分开的组合物的情况中，所述免疫抑制剂可与所述空衣壳同时或在所述空衣壳前至少15分钟、1小时、2小时、3小时、1天、2天或1周施用，且所述空衣壳进而与所述rAAV-转基因载体同时或在所述rAAV-转基因载体之前至少15分钟、1小时、2小时、3小时、1天、2天或3天内施用。

在本文所定义的实施方式中，所述免疫抑制剂可重复施用，即在所述rAAV载体组合物前和/或与之同时。如上文所示，优选所述rAAV载体组合物包括大量空衣壳。此外，本发明涵盖在分开的、不同的组合物中施用rAAV-转基因载体和空衣壳，其在本发明的方法或应用中可同时或相继给药。如果包含于分开的组合物内，则所述rAAV-转基因载体和空衣壳优选同时施用。在另一个实施方式中，所述空衣壳在rAAV-转基因载体施用前至多3天、2天、1天、24小时、12小时、3小时、2小时、1小时、30分钟、15分钟或5分钟施用，优选至多24小时。此外，如果包含于分开的组合物内，则所述rAAV-转基因载体和空衣壳优选在同一部位施用。

本发明的rAAV载体组合物和/或空衣壳和/或免疫抑制剂可使用本领域已知的合适手段直接或间接施用。本发明的方法和应用包括全身、区域或局部(locally)，或通过任何途径例如注射、输注、口服(如摄入或吸入)或局部(topically)(如经皮)递送和施用所述rAAV载体组合物和/或空衣壳和/或免疫抑制剂。示范性施用和递送途径包括静脉内(i.v.)、关节内、腹腔内(i.p.)、动脉内、肌肉内、胃肠外(parenteral)、皮下、胸膜内、局部(topical)、皮、皮内、经皮、肠胃外的(parenterally)如跨粘膜、颅内、脊柱内、口服(消化)、粘膜、呼吸系统、鼻内、插管、肺内、肺腔滴注、颊部、舌下、血管内、鞘内、腔内、电离子透入、眼内、眼睛、光学、腺内、器官内、淋巴管内。考虑到迄今已实现的进步，可预期向个体或所述个体的细胞、组织、器官提供本发明的rAAV载体组合物和/或空衣壳和/或免疫抑制剂的方法得到改进。这种未来改进当然能纳入以实现本发明所提及的效果。当施用本发明的rAAV载体组合物和/或空衣壳和/或免疫抑制剂时，优选这种组合和/或组合物溶于与递送方法相容的溶液。对于静脉内、皮下、肌肉内、鞘内、关节内和/或心室内施用，优选溶液是生理盐溶液。

优选地，所述rAAV载体组合物局部施用，优选在含大量先天免疫细胞浸润的身体位置，或在存在大量先天免疫细胞的位置，其中优选所述先天免疫细胞是单核细胞和/或巨噬细胞，甚至更优选所述先天免疫细胞是巨噬细胞。先天免疫细胞或巨噬细胞浸润或存在大量先天免疫细胞或巨噬细胞能通过本领域技术人员已知的方法评估，如组织学和组织化学方法例如CD68标记或检测如上所示的静脉内施用后巨噬细胞SPIO摄取的MRI成像，和/或用于检测细胞因子如IL-6、TNF和/或CCL2的方法。优选地，在身体特定位置处的显著先天免疫细胞或巨噬细胞浸润在本文中优选理解为，所存在的先天免疫细胞或巨噬细胞数量和/或活性与为评价如上所定义的先天免疫细胞或巨噬细胞浸润的方法的检测极限在类似位置的先天免疫细胞或巨噬细胞相比，其数量和/或活性至少为2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20倍，优选至少2倍。优选地，身体特定位置处的大量先天免疫细胞或巨噬细胞浸润在本文中优选理解为所存在的先天免疫细胞或巨噬细胞浸润与用治疗有效剂量的氟羟脱氢皮醇治疗后的类似位置的先天免疫细胞或巨噬细胞浸润相比，优选用上示先天免疫细胞或巨噬细胞浸润的评价方法，其数量和/或活性至少为2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20倍，优选至少2倍。所述治疗有效剂量优选是技术人员已知剂量，如口服8-16mg/日，肌肉内3-48mg/日,根据关节大小关节内5-40mg。氟羟脱氢皮醇的最大周剂量是75mg。含显著先天免疫细胞或巨噬细胞浸润或大量先天免疫细胞或巨噬细胞的特定非限制性示例是关节(关节内)、炎症部位、关节炎关节、损伤位点、动脉粥样硬化斑块、肿瘤特别是浸润性肿瘤、CNS(中枢神经系统和/或脑)、肺、皮肤、眼睛、肠、肝、脾和脂肪组织。优选地，含大量先天免疫细胞的组织或位点在本文中理解为先天免疫细胞(优选巨噬细胞)构成所述组织或部位的细胞总量的至少2％(或优选至少5％)的组织或部位。

在免疫抑制剂存在于本发明所述rAAV载体组合物内的情况中，所述免疫抑制剂在与所述rAAV载体组合物相同的部位施用，即优选如上所示的位置。在其中所述免疫抑制剂被包含在不同于所述rAAV载体组合物的分开的组合物内的实施方式中，所述免疫抑制剂可全身施用，优选肌肉内或静脉内。所述rAAV载体组合物还可局部施用，优选在含大量本文所定义的巨噬细胞的身体的部位，所述免疫抑制剂全身施用，优选肌肉内或静脉内。本发明还涵盖所述免疫抑制剂和所述rAAV载体组合物即使存在于不同组合物内，在同一位点施用的实施方式，优选局部，更优选关节内。如本文进一步所示，这种不同组合物的施用可以是同时或相继施用。

在一个优选的实施方式中，本发明疗法用于预防、延迟、治愈、恢复和/或治疗炎性病症或炎性疾病。炎性病症或疾病可以是检测到炎症的任何病症或疾病。炎症可通过在个体样品中评估C-反应蛋白和/或炎性细胞因子/趋化因子(例如IL-6、IL-8或CCL2)的浓度检测。C-反应蛋白和/或炎性细胞因子/趋化因子(例如IL-6、IL-8或CCL2)的浓度的评估可使用ELISA或蛋白质印迹在蛋白水平进行。C-反应蛋白和/或炎性细胞因子/趋化因子(作为IL-6、IL-8或CCL2)的浓度的评估可使用PCR在核酸水平进行。所有这些分析为技术人员已知。在实验部分中描述用于评估炎性细胞因子/趋化因子(例如IL-6、IL-8或CCL2)存在的分析。可检测的C-反应蛋白和/或炎性细胞因子/趋化因子(例如IL-6、IL-8或CCL2)能作为这类炎性疾病或病症的第一或早期参数存在。可检测的C-反应蛋白和/或炎性细胞因子/趋化因子(例如IL-6、IL-8或CCL2)能在所述炎性疾病或病症进程中的后期存在。

炎性疾病或病症可定义为任何疾病或病症，其中ATP的水平增加和/或AMP的水平增加和/或ATPase活性水平的减少(或降低)能在来自个体的样品或组织中评估。炎性疾病或病症可被定义为任何疾病或病症，其中预期腺苷的水平增加可期待缓解与这类炎性疾病或病症相关的参数或症状。前面句子中鉴定的增加或减少优选如本文所解释的进行评价。

炎性病症、疾病或紊乱的特定非限制性示例是类风湿性关节炎(RA)、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎(OA)、痛风、脊柱关节炎(spondlyarthritis)(SpA)、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、包括克罗恩氏病或溃疡性结肠炎在内的炎症性肠病、肝炎、败血症、酒精性肝病和非酒精性脂肪肝。炎性病症或疾病可进一步选自但不限于：疼痛、局部缺血性疾病(ischemic disorder)、青光眼、哮喘、关节炎、癌、神经系统退行性疾病(neurodegenerative disorders)、慢性障碍(chronic disorders)、急性炎症、凝血功能障碍、心力衰竭、血小板功能障碍和炎症能通过技术人员已知的方法检测的其它障碍(Libby,Arteriscler Thromb Vasc Biol(2012)32,20145-20151；Bending等.,Int Immunol(2012)6:339-346；Calle和Fernandez,Diabetes Metab(2012)3:183-191)，优选进一步选自但不限于：疼痛、局部缺血性疾病、青光眼、关节炎、癌、神经系统退行性疾病、慢性障碍、急性炎症、凝血功能障碍、心力衰竭、血小板功能障碍和能检测到炎症的其它障碍。应注意即使目前对骨关节炎(OA)是否被视作炎性或非炎性疾病有争议，骨关节炎被视作通过本发明的方法预防、延迟、治愈、恢复和/或治疗的病症。

在类风湿性关节炎(RA)和其它关节炎类型(OA、银屑病关节炎、脊柱关节炎(SpA)、痛风)的情况中，炎症推断在关节和/或软骨和/或滑膜组织和/或滑膜细胞和/或成纤维细胞样滑膜细胞中出现。这些组织和/或细胞类型各自参与、引起和/或与炎症相关。因此，对于RA和其它关节炎类型(OA、银屑病关节炎、SpA、痛风)，将本发明的所述rAAV-转基因载体递送给关节和/或软骨和/或滑膜组织和/或滑膜细胞和/或成纤维细胞样滑膜细胞。优选地所述关节、软骨、滑膜组织和/或滑膜细胞和/或成纤维细胞样滑膜细胞是患有炎性疾病的个体的。在一个优选实施方式中，本发明的rAAV载体组合物局部或全身施用，优选靶向上面鉴定的任何细胞类型。所述施用更优选是关节内。术语“关节内”指关节内部，如膝盖、肘部、肩膀、踝部、手腕等。因此，关节内注射是注射到关节骨头之间的空间。在膝盖中，“关节内”指股骨与胫骨之间的空间，在膝盖骨后面和周围。

对于IBD和克罗恩氏病，炎症主要在胃和肠(消化道)出现。因此，就IBD和克罗恩氏病而言，本发明的所述rAAV载体组合物能被递送到胃和/或肠。所述胃和/或肠优选是患有这种炎性疾病的个体的。在一个优选实施方式中，所述rAAV载体组合物局部或全身施用。所述施用更优选是局部或全身施用并靶向胃和/或肠。

对于肝炎和肝病，炎症主要在肝出现。因此，就肝炎和肝病而言，本发明的所述rAAV-转基因载体能被递送到肝。所述肝优选是患有这种炎性疾病的个体的。在一个优选实施方式中，本发明的所述rAAV载体组合物局部或全身施用。所述施用更优选是局部或全身并靶向肝。

对于败血症，炎症可以是全身性的。因此，就这类疾病而言，本发明的所述rAAV载体组合物全身施用，优选靶向这些患者的肝。

实现治疗效果的所述rAAV-转基因载体剂量(如rAAV-转基因载体的基因组的剂量/每千克体重(vg/kg))，或转导单位会根据数种因素而变化，包括但不限于：施用途径、实现治疗效果所需的转基因表达水平、所治疗的特定疾病、对rAAV-转基因载体免疫应答的任何宿主、对转基因或表达产物(蛋白质)免疫应答的宿主以及所表达的蛋白质的稳定性。本领域技术人员能基于上述因素以及其它因素容易地确定rAAV-转基因载体剂量范围以治疗具有特定疾病或障碍的患者。一般，剂量范围是至少1x10⁶、1x10⁷、1x10⁸或更多，例如1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、1x10¹²、1x10¹³或1x10¹⁴、1x10¹⁵、1x10¹⁶或更多的载体基因组/千克个体体重(vg/kg)以实现治疗效果。

所述免疫抑制剂剂量取决于免疫抑制剂的类型。有效剂量为技术人员已知。氟羟脱氢皮醇的优选治疗有效剂量如上所示。氯膦酸盐的优选治疗有效剂量优选是技术人员已知的治疗有效剂量，如优选关节内80-320mg/剂，更优选关节内160mg/剂(Barrera等2000,Arthritis&Rheumatism第43(9)卷,1951-1959页)。

在一个更优选的实施方式中，本发明的所述rAAV组合物和本发明的免疫抑制剂作为分别的、不同的组合物的组合或包含在单一组合物内，能缓解所治疗患者的一种或多种症状和/或用本发明组合或组合物改善所治疗患者细胞或组织的一种或多种特征或参数。例如，对于各炎性疾病，技术人员了解至少一种症状、参数或特征、与所述疾病相关的所述参数或特征的值以及如何评估其中的每一个。下面我们给出类风湿性关节炎的特异参数。类风湿性关节炎是优选在评估疾病活动度评分(DAS)指标或相关DAS28(van Riel,BestPractice&Research Clinical Rheumatology(2001)15:67-76)后诊断的疾病，包括测量个体的数个参数和症状。所述指标评估可通过临床医生检查个体来进行。在一个更优选的实施方式中，当本发明组合或组合物能诱导DAS或DAS28显著变化时，本发明组合或组合物能缓解所治疗患者的一种或多种症状和/或用本发明组合或组合物改善所治疗患者细胞或组织的一种或多种特征或参数。还描述评估类风湿性关节炎的其它方法(van Riel,BestPractice&Research Clinical Rheumatology(2001)15:67-76；和Gester A.M.等，Baillière’s Clinical Immunology(1999)13:629-644)。如果用本发明组合和/或组合物治疗至少一周、一个月、六个月、一年或更长后，含本发明组合或组合物的药物能改善一个参数，所述参数的值相较治疗开始前的该参数的值改进至少1％、2％、5％、10％或更多。如果用本发明组合和/或组合物治疗至少一周、一个月、六个月、一年或更长后，含本发明组合或组合物的药物能缓解患者或所述患者细胞、组织或器官的一种症状或一个特征，所述症状或特征不再能检测到。

本发明用于人和兽医应用。合适个体包括哺乳动物如人。本文所用的术语“哺乳动物”包括但不限于：人、牛、绵羊、山羊、马、猫、犬、兔等。最优选人个体。人个体包括胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成人个体。最优选患有本文所示任何类型或疾病或病症的人个体。

在第三方面，本发明提供成套试剂盒，其包括第一方面所述的rAAV载体组合物和第一方面所定义的免疫抑制剂。优选地，所述成套试剂盒还包括所述rAAV载体组合物和所述免疫抑制剂的剂量方案说明书。这些说明优选指示实现所需效果的剂型使用和在特定时间段服用的剂型量，优选如本文第二方面所详细说明的。所述制剂可通过本领域技术人员已知的方法以单位剂型方便地存在。优选地，所述rAAV载体组合物和免疫抑制剂各在分开的单位(或其倍数)中包装，它们的量对应于单一给药(或其倍数)的相关剂量方案。所述包装可采用任何合适形式，例如小瓶、安瓿或用于注射笔的药筒。优选地，所述成套试剂盒若用于治疗，则包括本文所定义的基因疗法。

本说明书引用的所有专利和文献参考资料通过引用全文纳入本文。本文鉴定的各实施方式可组合在一起，除非另有说明。

表1：本申请中鉴定的大部分序列的列表

附图简要说明

图1：通过在关节炎开始前后施用载体对荧光素酶表达的影响。诱发关节炎后，小鼠(每组n＝5)在关节炎开始前第17天或关节炎开始后第24天于关节内注射有1.5e10vg的rAAV5-转基因载体，该载体编码荧光素酶基因(rAAV.CMV.Fluc5)。在载体注射后3天以及之后每周进行成像，直至4周(组第24天)或5周(组第17天)。插图：表达正信号的膝关节百分数。就至少一次及时测量而言，正信号定义为高于对照膝关节的值的上限的1.5倍的值。每组的发光显示为平均数；误差线，SEM。

图2：加入脂质体氯膦酸盐、氟羟脱氢皮醇和空衣壳对rAAV5-荧光素酶表达的影响。诱发关节炎后，小鼠(每组n＝5)关节内注射有1.5e10vg的rAAV5.CMV.FLuc载体。在载体注射后3天以及之后每周进行成像，直至4周。(a)加入脂质体氯膦酸盐(5μl/g i.v.)和氟羟脱氢皮醇(5mg/kg i.m.)导致更高水平的发光。(b)以5:1比例(空与全之比)加入空AAV5衣壳和含衣壳的基因组改善了荧光素酶的表达。(c)表达正信号的膝关节的百分数提高4-9倍。(d)临床评分在氟羟脱氢皮醇治疗动物中显示减少趋势和在脂质体氯膦酸盐治疗动物中显示初始减少趋势。

图3：加入空衣壳和/或氟羟脱氢皮醇对关节内rAAV5-荧光素酶表达的改善。在CIA模型中，小鼠(每组n＝13)注射有1.5e10vg的rAAV5.CMV.Fluc载体(关节内)，有或没有加入空AAV5衣壳(空与全之比为5:1)或氟羟脱氢皮醇(5mg/kg i.m.)。每周跟踪小鼠，持续1个月且之后每月一次，直至6个月。(a)关节炎活动度在各时间点打分并计算临床评分。最初，关节炎活动度在氟羟脱氢皮醇治疗组中较低。(b)所有组的发光增加直至4个月，然后保持稳定。(c)广义估计方程(Generalized estimating equations)分析显示当加入氟羟脱氢皮醇和空衣壳时，发光显著提高。每组的临床评分和发光显示为平均数；误差棒，SEM。

图4：比较局部和全身氟羟脱氢皮醇施用。在CIA模型(n＝18)中，在局部施用(i.a.)rAAV5.CMV.Fluc载体(1.5e10vg)+空AAV5衣壳(空:全比例为5:1)(关节内)前2天，局部(i.a.)或全身(i.m.)施用氟羟脱氢皮醇(5mg/kg)(或盐水)。随着时间跟踪荧光素酶表达。

图5：氟羟脱氢皮醇对脾尺寸和不同组织中细胞群的影响。在数组中诱发关节炎(每组n＝5)，氟羟脱氢皮醇(5mg/kg)或盐水作为对照在第22天(载体施用前2天)肌肉内施用。氟羟脱氢皮醇施用后48小时，通过流式细胞术(FLOW cytometry)分析组织。A)盐水和氟羟脱氢皮醇治疗动物的脾中的巨噬细胞(F4/80+,CD68+)的百分数相似，而氟羟脱氢皮醇组的滑膜(b)中巨噬细胞百分数减少。c-d)氟羟脱氢皮醇治疗动物的脾重量显著降低；图表和照片显示氟羟脱氢皮醇/盐水施用后3天处死的组的脾。

图6：以2种不同比例(5:1和20:1)加入空衣壳改善关节内rAAV5-荧光素酶表达。健康小鼠(每组n＝7)关节内注射有rAAV5.CMV.Fluc(1.5e10vg)，空AAV5衣壳在2组中以不同比例加入。每周测量荧光素酶表达，直至4周后处死小鼠。(a)每组第4周的发光显示为平均数；误差棒，SEM。相较仅接受含载体的基因组的对照组(单尾未配对t检验)，在加入空衣壳的组中，*P<0.05和**P<0.01。

图7：气囊滑膜炎症模型(air pouch model of synovial inflammation)(APSI)中的荧光素酶表达。rAAV5.CMV.Fluc(3.16e11vg)在气囊形成后d0、d11或d18给予小鼠(n＝5)气囊。氟羟脱氢皮醇治疗组中，氟羟脱氢皮醇在d9通过i.m.注射给药(5mg/kg)，然后在d11给予载体。在d30，杀死所有小鼠，移出气囊膜并进行荧光素酶检测。每组的荧光素酶表达显示为平均数和SEM。黑色水平线指示荧光素酶检测极限。显示任何可检测荧光素酶表达的唯一组是当载体在d0注射或当氟羟脱氢皮醇在载体前2天给药时。

图8：空衣壳和氟羟脱氢皮醇在健康小鼠中对关节内AAV5基因表达的影响。在i.m.给予盐水(NaCl)或氟羟脱氢皮醇前2天，健康小鼠(每组n＝17，总共34个注射关节)关节内注射有rAAV5-CMV-Fluc(1.26e10vg/关节)+/-空AAV5衣壳(空与全之比为5:1)。每周通过IVIS测量荧光素酶表达，直至第8周。a)所有组随着时间的荧光素酶测量。b)所有组在第8周的荧光素酶表达。所示数据是每组平均数+SEM。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，如单尾Mann Whitney检验所测定。

图9：空衣壳和氟羟脱氢皮醇在健康小鼠中对关节内AAV2基因表达的影响。在i.m.施用盐水(NaCl)或氟羟脱氢皮醇前2天，健康小鼠(每组n＝17，总共34个注射关节)关节内注射有rAAV2-CMV-Fluc(1.26e10vg/关节)+/-空AAV2衣壳(空与全之比为5:1)。每周通过IVIS测量荧光素酶表达，直至第4周。a)所有组随着时间的荧光素酶测量。b)所有组在第4周的荧光素酶表达。所示数据是每组平均数+SEM。**p<0.01,***p<0.001，如单尾MannWhitney检验所测定。

图10：AAV2与AAV5衣壳(VP1)比对。序列显示57％一致性，如带下划线的氨基酸所示。

本发明进一步通过以下实施例解释。这些实施例不限制本发明的范围，但仅用于阐明本发明。

实施例

方法

载体生成和空衣壳

生成rAAV5-转基因载体(实施例1-7)或rAAV2-转基因载体(实施例8)，其编码如前所述[Matsushita等；Gene Ther 1998:5；938]的带有巨细胞病毒(CMV)启动子(rAAV5.CMV.Fluc；宾夕法尼亚州费城的费城儿童医院)的萤火虫荧光素酶(Fluc)。简言之，所述质粒编码CMV启动子控制下的Fluc基因和人生长激素聚腺苷酸化信号。转基因盒侧翼是AAV-2末端反向重复并被包装在来自AAV5的衣壳中[Gao GP等；PNAS 2002；11854]。含有基因组的载体和空AAV衣壳粒子通过联合色谱与氯化铯密度梯度离心来纯化[Ayuso E,Mingozzi F等；Gene Ther 2010:17；503]。载体效价由qPCR测定并表示为载体基因组/ml(vg/ml)。

小鼠中的体内成像实验

在5个动物实验中在雄性DBA小鼠中(8-12周龄；荷兰奥尔斯特的HSD(HarlanSprague Dawley,Horst,The Netherlands))研究关节内rAAV5表达。小鼠的2个膝关节(有或没有注射踝关节)注射有rAAV5.CMV.Fluc，定期检测荧光素酶表达(从5天直至6个月)。对于没有关节炎的动物，载体在第1天给予，在关节炎动物中，载体在免疫接种后、疾病开始时的第17或24天注射。动物接受每膝关节1.26e10-1.5e10vg(5μl体积)和每踝关节0.75e10vg(2.5μl体积)。空衣壳与含基因组的粒子在数组中以5:1或20:1的比例共同施用(比例表示为空衣壳与含基因组的载体之比)。组由5-18只动物组成。

胶原诱导的关节炎

胶原诱导的关节炎(CIA)通过皮内注射100μl II型胶原(2mg/ml)方式来诱导，所述胶原在CFA中1:1稀释(矿物油和热灭活结核分枝杆菌(M.Tuberculosis)2mg/ml))(美国华盛顿州雷德蒙德的Chondrex公司(Chondrex Inc.))。第21天，腹腔施用加强注射，含有溶于100μl NaCl的100μg II型胶原。

关节炎活动度从第18天开始每3周用半定量计分系统评分，各小鼠的爪单独分析(0-正常；1-1个关节肿胀和/或红斑；2–多关节肿胀；3–所有关节肿胀；4–全爪肿胀和至少一个以下症状：僵硬，功能丧失)。

气囊滑膜炎症(APSI)模型

气囊如前所述形成(O′Boyle等(2009)FASEBJ.23(11):3906-3916)。简言之，3ml空气皮下注入各动物的背部。必要时，气囊通过再注入空气保持膨胀。rAAV5.CMV.Fluc载体(3.16e11vg)在气囊形成后的d0、d11或d18以1ml体积给予到囊内。对于氟羟脱氢皮醇处理的动物，在d11施用载体前2天通过i.m.注射施用氟羟脱氢皮醇(5mg/kg)。在d30，处死小鼠，移出气囊膜并速冻。冷冻气囊组织在被动裂解缓冲液(普洛麦格(Promega))中匀化，荧光素酶通过标准荧光素酶分析来测量(普洛麦格)。

巨噬细胞抑制

在施用载体前2天，肌肉内(i.m.)施用氟羟脱氢皮醇，类似在RA患者中的应用。RA患者以每kg体重0.4-1.0mg的剂量接受氟羟脱氢皮醇。考虑小鼠代谢速率更快(因子12.5)，使用5mg/kg体重的剂量，以50μl体积施用。对照组接受用50μl NaCl的i.m.注射。第四个实验中，i.m.氟羟脱氢皮醇与施用载体前2天关节内(i.a.)施用作比较，采用可比较的剂量(5μl体积)。对照组接受用5μl NaCl的i.a.注射。

荧光素酶表达成像

在施用载体后不同时间点测量荧光素酶表达，在不同实验中从第3天直至6个月。D-荧光素钾-盐底物(美国马萨诸塞州霍普金顿的Caliper生命科学公司(Caliper LifeSciences))腹膜内注射(150mg/kg体重，体积约200μl)。在5分钟施用底物后，10分钟后使用冷却电荷耦合装置(CCD)摄像系统(Photon Imager，法国巴黎的生物空间实验室(BiospaceLab))获取光子计数，。各光子计数期后立即获得光表面图像以提供动物解剖视图。图像处理和信号强度定量及分析用M3Vision(生物空间实验室)进行。图像展示为伪彩色(pseudo-color)光子计数图，叠加在灰度解剖的白光图上，允许评估生物发光强度和其解剖源。通过在膝关节区画出椭圆ROI，来定义感兴趣区(ROI)。ROI表面积保持恒定。计算每秒每平方厘米每球面度的发射光子数作为荧光素酶活性量度。

一般动物情况和道德声明

免疫接种、关节内注射和体内成像在异氟烷麻醉(3％异氟烷和氧)下进行。实验结束时，在异氟烷麻醉下通过心脏穿刺然后颈椎脱臼来处死动物，之后收集后爪、血、淋巴结和脾。研究由阿姆斯特丹大学动物护理和使用委员会(荷兰阿姆斯特丹；许可证编号：ART102881,ART 102656,ART102793,ART 102948和ART 103021)评审和批准，并严格根据荷兰动物福利法(Wet op Dierproeven)的建议完成。动物维持于阿姆斯特丹大学无病原体条件下的动物设施中。

流式细胞术

脾和滑膜中的巨噬细胞通过流式细胞术分析。简言之，滑膜细胞(synovialcells)如下提取：从关节刮下细胞，然后用Liberase/DNase在37℃消化30min。随后洗涤(PBS/EDTA)细胞并通过细胞筛网。滑膜细胞(synovial cells)离心(1400rpm,5min,4℃)并重悬于FACS缓冲液(PBS+1％BSA)。由于滑膜中的细胞数低，集合来自各组的所有动物。通过机械破碎和经细胞筛网冲洗细胞分离脾细胞。红细胞如下裂解：加入RBC裂解缓冲液(生命技术公司(Life Technologies))，然后冰上孵育10分钟。细胞离心并重悬于FACS缓冲液。细胞(集合的滑膜或脾细胞(1e6细胞))用5％正常小鼠血清(Sanquin)封闭并用F4/80-APC和CD68-FITC标记抗体(BD生物科学(BD Biosciences))染色。在BD Canto2上获取数据并用FlowJo软件(俄勒冈州阿什兰的FLOWJO LLC)分析。

统计分析

随着时间的发光用广义估计方程(generalized estimating equations)(GEE)研究以允许纵向分析(包括所有可用的纵向数据且允许数目不等的重复测量)(Twisk(2004)Eur.J.Epidemiol.19(8):769-776)。所有其它统计用Graphpad Prism(美国加利福尼亚州的Ja Jolla)分析。对于所有试验，p值<0.05的差异视作显著。

实施例1

炎症影响关节内rAAV5转基因表达

已知成纤维细胞样滑膜细胞(synoviocytes)(FLS)在RA患者的发炎关节中明显增加(Bartok和Firestein,Immunol Rev,201)。这对于RA小鼠模型也如此，包括胶原诱导的关节炎(CIA)模型。由于FLS是关节中AAV5的主要靶细胞，我们假设在CIA模型中炎症开始后施用rAAV5-转基因载体会导致更高的表达，这归因于更高数目的转导FLS。为检验此假设，在关节炎开始前(d17)或后(d24)向CIA小鼠关节内施用rAAV5-转基因载体，所述载体编码萤火虫荧光素酶基因(rAAV5.CMV.Fluc)。令人意外的是，此实验显示相较炎症开始前(第17天)施用载体，炎症开始后(第24天)施用rAAV5-转基因载体导致各关节表达更低以及表达转基因的关节百分数更少(图1)。

实施例2

免疫抑制剂改善rAAV5转基因表达

对于关节发炎动物中表达减少的解释可能是载体在其能转导靶细胞前降解或中和。炎症期间，不仅FLS数量增加，而且巨噬细胞的数目和活化也增加，因此我们假设表达减少可能是由于巨噬细胞对载体的中和(例如，经吞噬作用或通过可溶性因子(补体)调理)。为调查此可能性，我们研究施用影响巨噬细胞活性/数目的药剂是否对rAAV5转基因表达产生影响。氟羟脱氢皮醇(一种糖皮质激素)通过抑制巨噬细胞活化和增殖来发挥作用[FauciAS,Dale DC,Balow JE；Ann Intern Med 1976；84；304-15]。其是常用于人的药理学药剂，例如用于治疗RA患者关节的急性炎症。也已知全身施用糖皮质激素可通过降低RA患者滑膜组织中的巨噬细胞数目和活性来发挥局部作用[Gerlag DM等；Arthritis Rheum 2004；50(12):3783]。用于消耗巨噬细胞的第二试剂是含氯膦酸盐的脂质体[van Roijen和Hendrikx,Methods in Molecular Medicine(605)189-203页,2010]。2种药剂在施用载体前48小时于分开的组中施用。

氟羟脱氢皮醇和脂质体氯膦酸盐在4周时间段内中提高rAAV5.CMV.Fluc表达，显示消耗或抑制巨噬细胞导致基因表达增加(图2a)。

我们假设另一防止巨噬细胞载体中和的方法可以是在施用载体后加入空衣壳粒子。这些空衣壳能作为诱饵防止含基因组的载体降解并因此增加全病毒粒子能到达靶细胞的可能性。当空(AAV5)衣壳以5:1比例(空与全之比)加入含全基因组的衣壳时，表达显著提高(图2b)。这些数据支持我们的假设：载体可能被巨噬细胞中和。在所有3个组中，还发现阳性关节百分数增加(图2c)。

由于氟羟脱氢皮醇是抗炎剂，密切监测关节炎活动度。氟羟脱氢皮醇处理的小鼠显示关节炎活动度降低的趋势(图2d)。

实施例3

氟羟脱氢皮醇和诱饵衣壳对rAAV5-转基因表达具有协同效应

我们然后进行长期随访研究以评估提高表达的持续时间。研究显示药物抑制和空诱饵衣壳的组合导致基因表达协同增强。如所预期，由于其抗炎效果，直至第4周氟羟脱氢皮醇处理组中的关节炎活动度更低(图3a)。组之间的长期关节炎活动度(arthritisactivity)相当。监测6个月时间段的荧光素酶表达，初始增加后保持稳定直至1个月(图3b)。用广义估计方程(GEE)纵向分析加入氟羟脱氢皮醇和/或空衣壳的效果，这允许我们包括所有可用的纵向数据且允许数目不等的重复测量。当加入2种化合物(5.85比例；p＝0.001)时，观察到发光显著增加。化合物分别显示表达增加的趋势(不显著)。这显示氟羟脱氢皮醇和空衣壳的组合对基因表达增加具有协同效应。

在健康与关节炎小鼠中观察到类似表达水平(数据未显示)。由于技术问题，8周时间点无IVIS数据。由于达到人道终点，在实验结束前，处死总共15只动物(每组2-4只)。

由于关节内施用氟羟脱氢皮醇是RA患者的标准护理，我们想要确定氟羟脱氢皮醇施用途径(全身相比局部)是否对功效产生任何效果。为研究这个问题，在i.a.施用rAAV5.CMV.Fluc载体和空衣壳的组合物前2天，局部(关节内(i.a.))(或盐水作为对照)或全身(肌肉内(i.m.))给予小鼠(n＝18)氟羟脱氢皮醇，空衣壳:rAAV5.CMV.Fluc载体之比是5:1。如图4可见，氟羟脱氢皮醇预处理动物引起基因表达增强。无论氟羟脱氢皮醇是全身(i.m.)还是局部(i.a.)给药，这都如此，表明氟羟脱氢皮醇给药途径不是功效的关键因素。

实施例4

氟羟脱氢皮醇对脾与滑膜中巨噬细胞的影响不同

为进一步研究氟羟脱氢皮醇对转基因表达影响的作用机制，对滑膜组织和脾细胞进行离体分析以评估对巨噬细胞以及其它细胞类型数目和活性的影响。氟羟脱氢皮醇施用后48小时，通过FACS分析比较氟羟脱氢皮醇与NaCl处理的动物之间不同组织的细胞群。

值得注意的是，尽管脾中的巨噬细胞(CD68+,F4-80+)的相对百分比在剩余氟羟脱氢皮醇处理动物中保持类似(相较盐水)(图5a)，脾绝对体积在氟羟脱氢皮醇处理后第25天减少(4倍)(p＝0.0011)(图5c和d)，到第29天差异减小。与脾相反，滑膜中的巨噬细胞百分比在氟羟脱氢皮醇处理后减少(图5b)。应注意，考虑到能提取自滑膜的细胞数少，我们不得不收集所有在一组中的动物以获得足够细胞计数。

实施例5

AAV空衣壳在没有炎症和预存体液免疫的情况下提高转基因表达

所有先前实验都在CIA模型中进行，其中动物在施用载体时经历明显关节炎症。随后我们决定研究是否也能在健康关节中发现荧光素酶表达增强。

当空衣壳分别以2种不同比例加入含基因组的粒子时，即空衣壳与rAAV5.CMV.Fluc载体之比分别是5:1和20:1，我们观察到发光的剂量依赖性增加(图6)。从注射荧光素酶后第3天开始，在向含基因组的载体以剂量依赖性方式加入空衣壳后，表达增加(图6)。在以5:1空衣壳与全衣壳比例注射到动物中，平均增加4.8倍(p<0.01)。20:1比例(空与全之比)使表达提高多至20倍(<0.05)。

实施例6

回避/抑制巨噬细胞可允许气囊滑膜炎症(APSI)模型中的表达

气囊滑膜炎症(APSI)模型最初开发作为在小鼠中模拟人滑膜的方式。其涉及在小鼠背部皮肤下注入空气。6-7天后，衬膜会在此气囊周围形成。此衬里非常类似在关节腔周围形成的滑膜衬里，主要由成纤维细胞样细胞和巨噬细胞组成。当表达荧光素酶的AAV在d7(形成气囊衬里后)施用在气囊内，我们未能发现任何表达，即使采用高载体剂量(数据未显示)。我们假设也许衬里气囊膜的巨噬细胞抑制载体的转导(与关节内注射载体我们所观察到的类似)。我们通过如下检验此假设：a)施用载体前2天施用氟羟脱氢皮醇，或b)巨噬细胞浸润到气囊衬里前，在d0施用载体。如图7可见，仅当巨噬细胞受抑制(如氟羟脱氢皮醇)或被避免(在d0施用载体)时，观察到荧光素酶表达。这些数据进一步支持巨噬细胞不利于AAV转导的假设以及希望得到避免/抑制巨噬细胞对AAV中和的策略。

实施例7

空衣壳与氟羟脱氢皮醇的组合提高关节内AAV5基因表达

由于我们已显示空诱饵衣壳与氟羟脱氢皮醇的组合有效增加CIA小鼠发炎关节的基因表达(实施例3)，且我们已显示单独空衣壳能增加健康关节的关节内基因表达(实施例5)，我们想要确定空诱饵衣壳与氟羟脱氢皮醇的组合是否会在甚至没有炎症(健康关节)的情况下提高基因表达。为确定此问题，向小鼠组(n＝18)i.m.施用(50μL总体积)氟羟脱氢皮醇(5mg/kg)或盐水(对照)。随后通过关节内注入双膝(5μL总体积)向组施用AAV5-CMV-Fluc(1.26e10vg/关节)或AAV5-CMV-Fluc+空AAV5衣壳(空:全之比＝5:1)。荧光素酶表达通过活动物IVIS成像监测。如图8可见，空诱饵衣壳与氟羟脱氢皮醇处理的动物都显示基因表达相较用单独载体的动物增加。空衣壳与氟羟脱氢皮醇的组合使基因表达水平增长最高，与发炎(CIA)关节中观察到的类似。这些数据表明氟羟脱氢皮醇与空衣壳的组合不仅有效增加患病关节的表达，而且能增加健康关节的表达。这些结果支持以下假设：滑膜衬里中(甚至在健康关节中)的高巨噬细胞数抑制AAV介导的表达，以及加入诱饵衣壳粒子和/或抑制巨噬细胞活性能克服此抑制，导致基因表达增加。

实施例8

空衣壳与氟羟脱氢皮醇的组合对AAV5非特异，但提高来自其它血清型的关节内基因表达

因此，我们的研究迄今为止聚焦于AAV5，因为此血清型对关节有优秀的趋向性，然而我们假设AAV的巨噬细胞中和是非血清型特异性的。这是由于通过巨噬细胞AAV更新是采用清道夫受体的普遍现象，并因而不应限于任何一种血清型或无论任何病毒类型，因为已知巨噬细胞摄取广泛范围的病毒和细菌。

为检验此假设，我们进行实验评估氟羟脱氢皮醇和空衣壳是否能提高来自与AAV5大不相同的血清型(AAV2)的基因表达。AAV5和AAV2在氨基酸水平仅共有57％同源性(见图10)，使得他们成为已知AAV中最不同的两种血清型。

为确定此问题，我们进行与实施例7相同的实验，然而我们使用AAV2载体来取代AAV5。向小鼠组(n＝18)i.m.施用(50μL总体积)氟羟脱氢皮醇(5mg/kg)或盐水(对照)。随后通过关节内注入双膝(5μL总体积)，向组施用AAV2-CMV-Fluc(1.26e10vg/关节)或AAV2-CMV-Fluc+空AAV2衣壳(空:全之比＝5:1)。荧光素酶表达通过活动物IVIS成像监测。如图9可见，与AAV5所见结果类似，空诱饵衣壳与氟羟脱氢皮醇处理的动物都显示与施用AAV2后用单独载体的动物相比增加的基因表达。空衣壳与氟羟脱氢皮醇的组合使基因表达水平增长最高，与AAV5处理动物中观察到的类似。这些数据表明氟羟脱氢皮醇与空衣壳的组合不仅有效增加用AAV5的表达，而且对其它不同的血清型有效，如AAV2。因此，显然通过巨噬细胞抑制来提高基因表达不限于AAV5，而适用于所有AAV血清型。

考虑到空AAV2和AAV5衣壳都能增加基因表达，推断此表达提高并非特异于特定衣壳血清型。我们因此得出结论，空衣壳的血清型不需与含全基因组的载体具有相同血清型，且任何空衣壳血清型(天然或突变)应能提高来自任何其它AAV载体血清型(天然或突变)的关节内表达。

序列表

<110> 阿罗根有限公司

<120> 基于AAV的基因疗法

<130> P6051827PCT

<150> EP15179501.0

<151> 2015-08-03

<150> EP14187777.9

<151> 2014-10-06

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 145

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> single stranded AAV2 ITR, 5' ITR

<400> 1

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttcct 145

<210> 2

<211> 142

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> single stranded AAV2 ITR, 3'ITR

<400> 2

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag ctgcctgcag gg 142

<210> 3

<211> 95

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> double stranded AAV2 ITR, 5'ITR

<400> 3

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc 60

ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtgg 95

<210> 4

<211> 142

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> double stranded AAV2 ITR, 3' ITR

<400> 4

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag ctgcctgcag gg 142

<210> 5

<211> 167

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> AAV5 ITR: 5'ITR

<400> 5

ctctcccccc tgtcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60

agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120

cgcgacaggg gggagagtgc cacactctca agcaaggggg ttttgta 167

<210> 6

<211> 167

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> AAV5 ITR: 3'ITR

<400> 6

tacaaaacct ccttgcttga gagtgtggca ctctcccccc tgtcgcgttc gctcgctcgc 60

tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg 120

cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa cgcgacaggg gggagag 167

<210> 7

<211> 2208

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> AAV2 Capsid

<400> 7

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60

cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120

gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180

aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240

cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300

caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360

gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420

ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480

aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540

tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600

aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660

gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720

accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780

tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840

tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900

aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960

aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020

caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080

tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140

aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200

cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260

cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320

tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccaccacgca gtcaaggctt 1380

cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440

ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaatac 1500

tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560

ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620

atctttggga agcaaggctc agagaaaaca aatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680

gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740

accaacctcc agagaggcaa cagacaagca gctaccgcag atgtcaacac acaaggcgtt 1800

cttccaggca tggtctggca ggacagagat gtgtaccttc aggggcccat ctgggcaaag 1860

attccacaca cggacggaca ttttcacccc tctcccctca tgggtggatt cggacttaaa 1920

caccctcctc cacagattct catcaagaac accccggtac ctgcgaatcc ttcgaccacc 1980

ttcagtgcgg caaagtttgc ttccttcatc acacagtact ccacgggaca ggtcagcgtg 2040

gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac agcaaacgct ggaatcccga aattcagtac 2100

acttccaact acaacaagtc tgttaatgtg gactttactg tggacactaa tggcgtgtat 2160

tcagagcctc gccccattgg caccagatac ctgactcgta atctgtaa 2208

<210> 8

<211> 735

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> AAV2 VP1

<400> 8

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly

145 150 155 160

Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr

260 265 270

Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His

275 280 285

Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

290 295 300

Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val

305 310 315 320

Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu

325 330 335

Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr

340 345 350

Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp

355 360 365

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser

370 375 380

Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser

385 390 395 400

Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu

405 410 415

Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg

420 425 430

Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr

435 440 445

Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln

450 455 460

Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly

465 470 475 480

Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn

485 490 495

Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly

500 505 510

Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp

515 520 525

Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys

530 535 540

Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr

545 550 555 560

Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr

565 570 575

Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr

580 585 590

Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp

595 600 605

Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr

610 615 620

Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys

625 630 635 640

His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn

645 650 655

Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln

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Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys

675 680 685

Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr

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Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr

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Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

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<210> 9

<211> 598

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> AAV2 VP2

<400> 9

Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro

1 5 10 15

Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys

20 25 30

Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro

35 40 45

Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn

50 55 60

Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly

65 70 75 80

Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr

85 90 95

Trp Met Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu

100 105 110

Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly

115 120 125

Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr

130 135 140

Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln

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Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe

165 170 175

Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr

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Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp

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Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys

210 215 220

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ggcctgaaac atcctccgcc tcagatcctg atcaagaaca cgcctgtacc tgcggatcct 1980

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<400> 16

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gtacggtggg aggcttatat aagcagagct caagcttggt accgag 166

Claims (16)

1.用于含基因疗法的治疗的rAAV载体组合物和免疫抑制剂，其中所述治疗包括向个体施用所述rAAV载体组合物和施用所述免疫抑制剂，其中所述rAAV载体组合物包括rAAV-转基因载体和空衣壳，空衣壳与rAAV-转基因载体之比至少是1:1。

2.根据权利要求1所述的用于治疗的rAAV载体组合物和免疫抑制剂，其中所述rAAV载体组合物和免疫抑制剂至少一种局部施用。

3.根据权利要求1或2所述的用于治疗的rAAV载体组合物和免疫抑制剂，其中所述rAAV载体组合物和免疫抑制剂至少一种全身施用。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于治疗的rAAV载体组合物和免疫抑制剂，其中所述rAAV载体组合物和所述免疫抑制剂相继施用。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于治疗的rAAV载体组合物和免疫抑制剂，其中所述免疫抑制剂是先天免疫细胞抑制剂、细胞稳定药、非固醇类抗炎药和/或免疫抑制生物制剂如巨噬细胞消耗抗体、TNF阻断剂、IL-6阻断剂和/或IL-2阻断剂和/或嘌呤能信号通路修饰药物。

6.根据权利要求5所述的用于治疗的rAAV载体组合物和免疫抑制剂，其中所述免疫抑制剂是先天免疫细胞抑制剂，如糖皮质激素和/或脂质体二膦酸盐。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的用于治疗的rAAV载体组合物和免疫抑制剂，其中所述rAAV-转基因载体所含的转基因编码治疗性蛋白质。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的用于治疗的rAAV载体组合物和免疫抑制剂，其中所述基因疗法用于预防、延迟、治愈、恢复和/或治疗炎性病症或炎性疾病。

9.根据权利要求8所述的用于治疗的rAAV载体组合物和免疫抑制剂，其中所述转基因编码治疗性抗炎蛋白。

10.根据权利要求8或9所述的用于治疗的rAAV载体组合物和免疫抑制剂，其中所述炎性病症或疾病是风湿性病症或疾病。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的用于治疗的rAAV载体组合物和免疫抑制剂，其中所述rAAV载体组合物关节内施用。

12.根据权利要求1-7中任一项所述的用于治疗的rAAV载体组合物和免疫抑制剂，其中所述基因疗法用于治疗、预防、延迟、治愈、恢复和/或治疗非炎性病症或非炎性疾病。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的用于治疗的rAAV载体组合物和免疫抑制剂，其中所述rAAV载体组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂、增溶剂、填充剂、防腐剂和/或赋形剂。

14.根据权利要求1-3和5-13中任一项所述的用于治疗的rAAV载体组合物和免疫抑制剂，其中所述免疫抑制剂包含在所述rAAV载体组合物内。

15.rAAV载体组合物，其中所述免疫抑制剂包含在所述rAAV载体组合物内。

16.一种成套试剂盒，其包括：

-rAAV载体组合物，其包括rAAV-转基因载体和空衣壳，空衣壳与rAAV-转基因载体之比至少是1:1，和；

-免疫抑制剂。