CN118108810A - 一种靶向骨骼肌的重组腺相关病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种靶向骨骼肌的重组腺相关病毒及其应用。具体地，本公开提供了一种腺相关病毒衣壳蛋白，所述腺相关病毒衣壳蛋白包含：(i)与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少80％相同并且在SEQ ID NO：4的G257位置后具有插入突变的序列，或者(ii)与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少80％相同并且在SEQ ID NO：4的G257位置和S258的位置后均具有插入突变的序列。本公开提供的腺相关病毒衣壳蛋白、包含其的腺相关病毒，具有靶向肝脏嗜性降低并且靶向骨骼肌嗜性增强的特性，可作为递送载体用于骨骼肌相关疾病的治疗。

Description

一种靶向骨骼肌的重组腺相关病毒及其应用

技术领域

本公开涉及病毒载体的技术领域，具体涉及一种靶向骨骼肌的重组腺相关病毒及其应用。

背景技术

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体作为一种领先的基因治疗载体，在科学研究和预临床/临床研究有广泛应用。尽管近年来通过自然发现，理性设计和定向进化等手段发现了一些具有前景的载体，如Ken Y Chan等提供的AAV PHP.eB载体，

(Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to thecentral and peripheral nervous systems，PMID:28671695)，该载体可高效通过血脑屏障，更有效地将基因输送到大脑细胞中。但是非靶向组织(如肝脏)的富集仍然是一个亟待解决的问题。同时，尽管以AAV9为骨架进行改造的突变体如AAV-9P31(Rapid evolution ofblood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning，PMID:33553485)和myoAAV(Directed evolution of a family of AAV capsid variantsenabling potent muscle-directed gene delivery across species，PMID:34506722)发现在小鼠中枢神经系统和非人灵长类肌肉组织具有靶向性和转导能力，但是考虑到AAV9和AAV2蛋白序列的相似性(>80％)，针对AAV9衣壳的预存抗体(preexisting antibody)可能广泛存在于人体内，从而限制了相关AAV血清型的转化应用。

L.H.范登贝格最近发现了AAV9衣壳蛋白(Capsid protein，Cap)在266位的氨基酸G→A突变或者在266位的氨基酸G→A突变加上在268位的氨基酸S→T突变会显著降低AAV9在肝脏的富集，同时仍然保持类似的骨骼肌和心肌转导能力(例如参见：US20230051611A1；WO2022150634A2；WO2021050614A2；和IN202217014261A)。同时L.H.范登贝格指出这一区域的序列保守性和这一区域可能作为与多数AAV相关的粘附受体(attachment receptor)(又称为腺相关病毒受体，AAVR)的界面从而影响AAV组织嗜性(即组织特异性)的改变。但是目前没有实验数据证明该区域是否能够影响其它AAV血清型的组织嗜性。这一AAV-AAVR结合区域以及其中的机制是否可以用于解释，甚至改造AAV的组织靶向性仍不清楚。

作为序列最为多样的血清型之一，AAV5被认为是血清中和抗体存在最少的血清型(Global Seroprevalence of Pre-existing Immunity Against AAV5 and Other AAVSerotypes in People with Hemophilia A，PMID:35156839)，也因此在近来的载体开发逐渐受到关注。同时，AAV5-AAVR结合模式与其它主流血清型也有很大差异(Divergentengagements between adeno-associated viruses with their cellular receptorAAVR，PMID:31434885)。

发明内容

发明要解决技术问题

基于现有技术中存在的上述问题，本公开提供了能够靶向骨骼肌的重组AAV，利用本公开提供的重组AAV能能够提高AAV在骨骼肌的靶向性、降低AAV在肝脏组织的腹肌。

用于解决问题的方案

本公开鉴于上述现有技术中存在的问题，进行了深入研究、反复试验，基于AAV5独特的序列特征和AAV5-AAVR结合模式，根据AAV5与AAVR相互作用的机制，通过对AAV5的改造，改变了AAV5组织靶向性。具体来说，本公开通过对AAV5的衣壳蛋白与AAVR的接触界面进行改造，分别产生AA5-GASN和AAV5-GAST突变体。即本公开如下所述：

[1].一种腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其特征在于，所述腺相关病毒衣壳蛋白包含：(i)与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少80％相同并且在SEQ ID NO：4的G257位置后具有插入突变的序列，或者(ii)与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少80％相同并且在SEQ ID NO：4的G257位置和S258的位置后均具有插入突变的序列。

[2].根据[1]所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其中(i)中所插入突变为在SEQ ID NO：4的G257位置后具有丙氨酸的插入突变。

[3].根据[1]所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其中，(ii)中所插入突变为在SEQ IDNO：4的G257位置后具有丙氨酸的插入突变，并且在SEQ ID NO：4的S258位置后具有苏氨酸的插入突变。

[4].根据[1]～[3]中任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％相同的序列。

[5].根据[1]～[4]中任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

[6].根据[1]～[5]中任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其中，腺相关病毒选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、rh.10、rh.39、rh.43和rh.74中的一种或多种；

在一些优选的实施方案中，AAV包括AAV5。

[7].一种多核苷酸，其编码[1]～[6]中任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白；

在一些优选的实施方案中，所述多核苷酸的序列分别如SEQ ID：2和SEQ ID NO：3所示。

[8].一种腺相关病毒，其包含[1]～[6]中任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白；

在一些优选的实施方案中，所述腺相关病毒具有靶向肝脏嗜性降低并且靶向骨骼肌嗜性增强的特性；

在一些更优选的实施方案中，所述骨骼肌为长收肌或股内侧肌。

[9].一种转基因递送载体，其包括如[8]所述的腺相关病毒。

[10].一种药物组合物，其包含：

(a)如[8]所述的腺相关病毒、或如[9]所述的转基因递送载体；以及，可选的，

(b)药学上可接受的载体。

[11].如[8]所述的腺相关病毒、如[9]所述的转基因递送载体、或如[10]所述的药物组合物在制备用于递送转基因至细胞的试剂中的用途。

[12].根据[11]所述的用途，其中，所述细胞来自受试者；

在一些优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物受试者；

在一些更优选的实施方案中，所述受试者是人。

[13].根据[11]或[12]所述的用途，其中，所述细胞来自骨骼肌。

[14].根据[12]或[13]所述的用途，其中，所述受试者患有骨骼肌疾病；

在一些优选的实施方案中，所述骨骼肌疾病选自由肌肉疼痛、肌肉强直、肌肉无力、肌肉萎缩、肌肉肥大、肌张力低下、肌肉痉挛及肌肉挛缩组成的组中的任一种。

[15].根据[11]～[14]任一项中所述的用途，其中，所述腺相关病毒、所述转基因递送载体、或所述药物组合物通过肌肉注射来施用至受试者。

[16].如[8]所述的腺相关病毒、如[9]所述的转基因递送载体、或如[10]所述的药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途；

在一些优选的实施方案中，所述疾病包括骨骼肌疾病；

在一些更优选的实施方案中，所述骨骼肌疾病选自由肌肉疼痛、肌肉强直、肌肉无力、肌肉萎缩、肌肉肥大、肌张力低下、肌肉痉挛及肌肉挛缩组成的组中的任一种。

[17].一种疾病治疗方法，其包括将如[8]所述的腺相关病毒、如[9]所述的转基因递送载体、或如[10]所述的药物组合物施用至受试者的步骤；

在一些优选的实施方案中，所述的疾病包括骨骼肌疾病；

在一些更优选的实施方案中，所述骨骼肌疾病选自由肌肉疼痛、肌肉强直、肌肉无力、肌肉萎缩、肌肉肥大、肌张力低下、肌肉痉挛及肌肉挛缩组成的组中的任一种。

发明的效果

本公开提供的腺相关病毒衣壳蛋白、包含其的腺相关病毒，具有靶向肝脏嗜性降低并且靶向骨骼肌嗜性增强的特性，可作为递送载体用于骨骼肌相关疾病的治疗。对拓展AAV相关的基因治疗具有重要作用。

附图说明

图1A为pssAAV-ITR-CMV-hluc-P2A-EGFP-3flag-WPRE-SV40_polyA-ITR载体的结构示意图。其中，ITR(inverted terminal repeat)代表长度为145bp的反向末端重复序列；CMV promoter代表人巨细胞病毒早期启动子；hLuc代表萤火虫荧光素酶基因编码序列；SV40 polyA代表猴空泡病毒的多聚核苷酸加尾信号；WPRE代表土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件；Amp代表氨苄西林抗性基因读框。

图1B为pRep2/Cap5载体的结构示意图。其中，AAV2 Rep代表AAV2 Rep基因，通过p5启动子和p19启动子驱动表达AAV5复制相关蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。AAV5 Cap基因通过p40启动子驱动表达AAV结构蛋白VP1、VP2和VP3；Amp代表氨苄西林抗性基因读框。Cap基因序列信息见SEQ ID NO.1，Cap蛋白序列信息见SEQ ID NO.4。

图1C为pRep2/Cap5-GASN载体结构示意图。其中，AAV2 Rep代表AAV2 Rep基因，通过p5启动子和p19启动子驱动表达AAV5复制相关蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。AAV5Cap基因通过p40启动子驱动表达AAV结构蛋白VP1、VP2和VP3，在原第257位甘氨酸(glycine，G)后插入了丙氨酸(alanine，A)；Amp代表氨苄西林抗性基因读框。Cap-GASN基因序列信息见SEQ ID NO.2，Cap-GASN蛋白序列信息见SEQ ID NO.5。

图1D为pRep2/Cap5-GAST载体结构示意图。其中，AAV2 Rep代表AAV2 Rep基因，通过p5启动子和p19启动子驱动表达AAV复制相关蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40；AAV5 Cap基因通过p40启动子驱动表达AAV55结构蛋白VP1、VP2和VP3，在第257位甘氨酸(glycine，G)后插入丙氨酸(alanine，A)同时在原258位丝氨酸(serine,S)后插入苏氨酸(threonine，T)；Amp代表氨苄西林抗性基因读框。Cap-GAST基因序列信息见SEQ ID NO.3；Cap-GAST基因序列信息见SEQ ID NO.6。

图2示出了AAV5、AAV5-GASN和AAV5-GAST病毒包装产量(package yield)对比结果。

图3A-图3D分别示出了AAV5、AAV5-GASN和AAV5-GAST(MOI＝5.0E+5)感染人肝癌细胞系Huh7细胞、人肝癌细胞系HepG2细胞、人心肌细胞AC16和人骨骼肌细胞HSMC，48h小时后通过流式细胞术(FACS)检测EGFP表达阳性细胞数，从而计算在Huh7细胞、HepG2细胞、AC16细胞和HSMC细胞的转导效率。

图3E示出了AAV5、AAV5-GASN和AAV5-GAST在不同细胞系的转导效率的对比结果。

图4A示出了通过小鼠活体成像系统检测小鼠(活体)全身萤光素酶基因表达水平。图4B示出了小鼠(活体)全身萤光素酶基因表达水平的定量结果。

图4C示出了通过小鼠活体成像系统检测小鼠(组织)萤光素酶基因表达水平。

图4D示出了小鼠(组织)萤光素酶基因表达水平的定量结果。

图5示出了AAV5和AAV5-GASN在小鼠不同组织中转基因mRNA表达能力对比。

具体实施方式

为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本说明书中，使用“基本上”或“实质上”表示与理论模型或理论数据的标准偏差在5％、优选为3％、更优选为1％范围以内。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

本公开的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本公开中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

根据本公开，“Vg”是指病毒基因组(Viral Genome)；等同于基因组拷贝(GenomeCopy)。

根据本公开，术语“多肽”、“蛋白质”、“肽”在本文中可互换的使用，指任何长度的氨基酸的聚合形态，可包括编码的和非编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸，和具有相似的肽骨架的多肽。

根据本公开，术语“核酸分子”、“多核苷酸”、“多聚核酸”、“核酸”可互换的使用，指任何长度的核苷酸的聚合形态，不论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，可实施任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制例子包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、控制区、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。核酸分子可以是线性或环状的。

如本公开所使用的，术语“氨基酸”可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物以及所有它们的D和L立体异构体。根据本公开，所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。本公开中氨基酸及缩写和英文简称如下所示：组氨酸(His，H)；丝氨酸(Ser，S)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；甘氨酸(Gly，G)；苏氨酸(Thr，T)；苯丙氨酸(Phe，F)；天冬氨酸(Asp，D)；酪氨酸(Tyr，Y)；亮氨酸(Leu，L)；异亮氨酸(Ile，I)；精氨酸(Arg，R)；丙氨酸(Ala，A)；缬氨酸(Val，V)；色氨酸(Trp，W)；甲硫氨酸(Met，M)；天冬酰胺(Asn，N)；半胱氨酸(Cys，C)；赖氨酸(Lys，K)；脯氨酸(Pro，P)。

根据本公开，氨基酸“添加”指在氨基酸序列的C端或N端添加氨基酸。根据本公开，氨基酸“缺失”指可以从氨基酸序列中删除1、2或3个以上氨基酸。根据本公开，氨基酸“插入”指在氨基酸序列中的适当位置插入氨基酸残基，插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻，或插入的氨基酸之间都不彼此相邻。根据本公开，氨基酸“取代”指在氨基酸序列中的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代；其中，“取代”可以是保守氨基酸取代。

根据本公开，“保守修饰”、“保守取代”或“保守置换”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破坏生物学活性。示例性保守取代于以下“示例性氨基酸保守取代”中陈述。

示例性氨基酸保守取代

原始残基	保守取代
		Ala(A)	Gly；Ser
Arg(R)	Lys；His
		Asn(N)	Gln；His；Asp
Asp(D)	Glu；Asn
		Cys(C)	Ser；Ala；Val
Gln(Q)	Asn；Glu
		Glu(E)	Asp；Gln
Gly(G)	Ala
		His(H)	Asn；Gln
Ile(I)	Leu；Val
		Leu(L)	Ile；Val
Lys(K)	Arg；His
		Met(M)	Leu；Ile；Tyr
Phe(F)	Tyr；Met；Leu
		Pro(P)	Ala
Ser(S)	Thr
		Thr(T)	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe
		Tyr(Y)	Trp；Phe
Val(V)	Ile；Leu

根据本公开，“中等至非常高等严格条件”包括“中等严格条件”，“中-高严格条件”，“高严格条件”或“非常高严格条件”，其描述了核酸杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导参见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，其通过引用并入本文。在该文献中描述了含水的和非含水的方法，且可以使用任一种。例如，具体的杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约45℃，然后在至少50℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤2次(对于低严格性条件，可以将洗涤温度升高到55℃)；(2)中等严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在60℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次；(3)高严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在65℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次且优选；(4)非常高的严格性杂交条件是0.5M磷酸钠，7％SDS，在65℃，然后在65℃，在0.2×SSC，1％SDS中洗涤1次或多次。

“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同一性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100％的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同一性百分率时进行比较。

“施用”、“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断剂、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗、预防或预防性措施，研究和诊断应用。

“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本公开的任一种抗体，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。

在本说明书中，术语“预防”是指对现在没有和过去没有疾病但有发展成疾病的风险或过去患有疾病，现在没有疾病但有疾病复发风险的受试者的预防性治疗。在某些实施方案中，与受试者群体的平均健康成员相比，受试者患疾病的风险更高或疾病复发的风险更高。

“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

在本说明书中，“治疗有效量”是足以在病症的治疗中提供治疗益处或足以延迟或最小化与病症有关的一种或多种症状的量。治疗有效量是指单独或与其他疗法组合的治疗剂的量，其在病症的治疗中提供治疗益处。术语“治疗有效量”可以包括改善总体疗法；减少或避免病症的症状、体征或原因；和/或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。

在本说明书中，“预防有效量”是足以预防病症或与病症相关的一种或多种症状或预防其复发的量。预防有效量是指单独或与其它药剂组合的治疗剂的量，其在预防病症中提供预防益处。术语“预防有效量”可以包括改善总体预防或增强另一种预防剂的预防功效的量。

在本说明书中，术语“受试者”是指人(即，任何年龄段的男性或女性，例如，儿科受试者(例如，婴儿、儿童或青少年)或成人受试者(例如，年轻人、中年人或老年人))或非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如灵长类动物(例如食蟹猴或恒河猴)、商业相关的哺乳动物(例如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫或狗)或鸟。非人动物可以是处于任何发育阶段的雄性或雌性。非人动物可以是转基因动物或基因工程化动物。

实施例

下面结合具体实施方式对本公开进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本公开，而不是为了限制本公开的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本公开的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

材料和方法

pCis质粒，该质粒是在原始质粒pHS-B-0594(采购自北京北因健康科技有限公司)的基础上通过Gibson组装(Gibson assembly)，在所述原始质粒中插入绿色荧光蛋白EGFP基因、2A肽和萤火虫萤光素酶基因hLuc构建得到的目的载体，该质粒又称为pssAAV-ITR-CMV-hluc-P2A-EGFP-3flag-WPRE-SV40_polyA-ITR(图1A)。

pTrans质粒：pRep2/Cap5由北京因诺惟康医药科技有限公司保存。

pHelper质粒购自Cell Biolabs公司并由北京因诺惟康医药科技有限公司保存。

上述pCis质粒中包含报告基因萤火虫萤光素酶基因hLuc和荧光蛋白EGFP基因。

上述pTrans质粒中包含AAV复制蛋白Rep和衣壳Cap蛋白。

上述pHelper质粒中包含腺病毒(AdV)的基因E2、E4和VA RNA。

PKU HEK293T细胞由北京因诺惟康医药科技有限公司保存。

Huh7和HepG2细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

AC16和HSMC细胞购自浙江美森细胞科技有限公司。

PCR突变试剂盒：High-Fidelity 2×Master Mix。

c57小鼠：购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。

实施例1：质粒载体的构建

为了构建在AAV5衣壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)中第257位的氨基酸残基甘氨酸(G)后带有丙氨酸(A)的插入突变载体pRep2/Cap5-GASN，或者在AAV5衣壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)中第257位的氨基酸残基甘氨酸(G)和第258位的氨基酸残基丝氨酸(S)后分别带有丙氨酸(A)和苏氨酸(T)的插入突变载体pRep2/Cap5-GAST，本发明人通过擎科公司(天津)合成的以下点突变引物:

AAV5 cap GASN mut F：5’-gacggagccagcaacgccaacgcctacttt-3’(SEQ ID NO：7)；

AAV5 cap GASN mut R：5’-gctggctccgtcgacggagccgcttttgat-3’(SEQ ID NO：8)；

AAV5 cap GAST mut F：5’-gacggagccagcaccaacgccaacgcctacttt-3’(SEQ IDNO：9)；和

AAV5 cap GAST mut R：5’-gttggtgctggctccgtcgacggagccgcttttgat-3’(SEQ IDNO：10)

对编码AA5衣壳蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)进行点突变PCR。

构建得到的突变载体pRep2/Cap5-GASN和pRep2/Cap5-GAST送至擎科公司(天津)通过Sanger测序鉴定载体序列。

其中，编码AAV5衣壳蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQID NO：4所示。编码AAV5-GASN衣壳蛋白的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO：2和SEQID NO：5。编码AAV5-GAST衣壳蛋白的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：6。

atgtcttttgttgatcaccctccagattggttggaagaagttggtgaaggtcttcgcgagtttttgggccttgaagcgggcccaccgaaaccaaaacccaatcagcagcatcaagatcaagcccgtggtcttgtgctgcctggttataactatctcggacccggaaacggtctcgatcgaggagagcctgtcaacagggcagacgaggtcgcgcgagagcacgacatctcgtacaacgagcagcttgaggcgggagacaacccctacctcaagtacaaccacgcggacgccgagtttcaggagaagctcgccgacgacacatccttcgggggaaacctcggaaaggcagtctttcaggccaagaaaagggttctcgaaccttttggcctggttgaagagggtgctaagacggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctgttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgcagccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaacagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagcgagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctccaccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagagggacgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcacccctctccggccatgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaatatcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtggagatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactacaacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccaccagacctatcggaacccgataccttacccgacccctttaa(SEQ ID NO：1)

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具体操作步骤如下：

PCR扩增体系：

成分	体积(μL)
		DNA模板(pRep2/Cap5)(25ng/μL)	1
正向引物(10μM)	0.625
		反向引物(10μM)	0.625
Q5高保真mix(NEB M0492)	25
		H2O	22.75
总体积	50

PCR扩增程序：

实验结果：

通过定点突变，在pRep2/Cap5(图1B)的Cap序列的基础上在257G位点后引入丙氨酸(Alanine，A)，或者同时在257G位点后引入A和在258S位点引入苏氨酸(Threonine，T)，从而分别构建出载体pRep2/Cap5-GASN(图1C)和pRep2/Cap5-GAST(图1D)。

实施例2：携带hLuc、EGFP和AAV5的AAV载体/rAAV载体包装和鉴定

参照文献(Xiao X,et al.,J Virol.1998；72(3):2224-2232.)，进行AAV载体/rAAV载体的包装鉴定。具体如下：

应用三质粒(pTrans质粒pRep2/Cap5、pHelpe质粒和包含图1B/图1C/图1D所示的载体的质粒)包装系统包装重组AAV，所有AAV分别采用北京因诺惟康医药科技有限公司保存的AAV5、AAV5-GASN和AAV5-GAST载体作为衣壳进行包装。

将HEK 293T细胞接种在100mm的细胞培养皿中，待所述细胞生长到70％～80％的汇合度，用于质粒转染。

用60μL(PEI：质粒＝1：3)聚乙烯亚胺(PEI)将5μg pCis质粒(即pssAAV-ITR-CMV-hluc-P2A-EGFP-3flag-WPRE-SV40_polyA-ITR)，5μg不同种类的pTrans质粒(具体分别为包含AAV5的pTrans质粒、包含实施例1中合成的pRep2/Cap5-GASN的pTrans质粒和包含实施例1中合成的pRep2/Cap5-GAST的pTrans质粒)和10μg pHepler质粒共转染至HEK293T细胞中，转染后72小时收获细胞和上清。

通过低速离心使细胞沉淀，并通过添加终浓度0.5％(w/v)脱氧胆酸钠裂解细胞，添加终浓度50U/mL Benzonase和2mM MgCl₂，37℃孵育2小时消化游离的DNA分子，同时用1:5体积的40％PEG8000，2.5M NaCl溶液在冰上沉淀上清液，将细胞裂解液和上清液混合后离心，取上清，用超速离心纯化方法进行纯化，最终获得rAAV5-hLuc-2A-EGFP,rAAV5.GASN-hLuc-2A-EGFP和rAAV5.GAST-hLuc-2A-EGFP。

随后使用擎科公司合成的以下EGFP引物和探针：

GFP-F：5'-CCGACAACCACTACCTGAG-3'(SEQ ID NO：11)；,

GFP-R：5'-CCATGCCGAGAGTGATCC-3'(SEQ ID NO：12)；，

GFP-P：5'-6-FAM-caatggtggctctgtacaacgctg-BHQ1-3'(SEQ ID NO：13)；

用ddPCR(思纳福DQ24数字PCR仪)测定纯化的AAV的滴度，并储存在﹣80℃冰箱。

ddPCR具体过程：选择GFP-F和GFP-R为引物、GFP-P为探针。探针5’端用FAM荧光蛋白标记，探针3’端连接BHQ1淬灭基团。引物和探针由擎科公司(天津)合成。

以GFP-F和GFP-R为引物特异性地扩增EGFP序列中长度为114bp片段，采用TaqMan探针结合法，使用数字定量PCR仪(型号：思纳福DQ24数字PCR仪)检测病毒基因组物理滴度。操作过程参见所用试剂的说明书。病毒处理方法参见文献(Aurnhammer C,et al.Hum GeneTher Methods.2012；23(1):18-28.)。

成分	体积(μL)
		DNA模板(最终稀释倍数：4.4E+7)	5
正向引物(10μM)	1
		反向引物(10μM)	1
探针(FAM，10μM)	0.5
		2×ddPCR mix	11
H2O	3.5
		总体积	22

实验结果：

各包装病毒的滴度如图2所示，相对于母本(parental)AAV5而言，AAV5-GASN的病毒产量略有降低，而AAV5-GAST的病毒产量升高接近3倍。因此，AAV5衣壳引入的插入突变并不实质上损坏AAV的产量。

实施例3检测AAV5/rAAV5体外转导能力的比较

为检测携带hLuc-2A-EGFP基因在3种不同AAV5/rAAV的体外转导能力，进行以下试验：

选择AAV5、AAV5-GASN和AAV5-GAST(MOI＝5.0E+5)分别感染以下四种不同的细胞：(1)人肝癌细胞系Huh7细胞、(2)人肝癌细胞系HepG2细胞、(3)人心肌细胞AC16和(4)人骨骼肌细胞HSMC。48h小时后通过流式细胞术(FACS)检测EGFP表达阳性细胞数。(NC:negativecontrol(未加入病毒对照))。

实验结果：

AAV5、AAV5-GASN和AAV5-GAST(MOI＝5.0E+5)感染人肝癌细胞系Huh7细胞，48h小时后通过流式细胞术(FACS)检测EGFP表达阳性细胞数。相比AAV5，AAV5-GASN和AAV5-GAST的转导效率下降约50％左右(AAV5-GASN：23.92％→13.06％；AAV5-GAST：23.92％→10.25％)(图3A)。

同样，AAV5、AAV5-GASN和AAV5-GAST(MOI＝5.0E+5)感染人肝癌细胞系HepG2细胞48小时后，相比AAV5，AAV5-GASN和AAV5-GAST的转导效率下降大于50％(AAV5-GASN:4.10％→1.64％；AAV5-GAST：4.10％→1.32％)(图3B)。

但是，AAV5、AAV5-GASN和AAV5-GAST(MOI＝5.0E+5)感染人心肌细胞AC16 48小时后，相比AAV5，AAV5-GASN和AAV5-GAST的转导效率仅有不到20％的降低(AAV5-GASN：93.62％→84.54％；AAV5-GAST：96.32％→77.54％)(图3C)。

同样，AAV5、AAV5-GASN和AAV5-GAST(MOI＝5.0E+5)感染人骨骼肌细胞HSMC 48小时后，相比AAV5，AAV5-GASN和AAV5-GAST的转导效率仅有不到15％的降低(AAV5-GASN：69.19％→58.56％；AAV5-GAST：69.19％→60.01％)(图3D)。

基于上述结果可以看出，体外转导实验显示AAV5-GASN和AAV5-GAST选择性显著降低对肝脏细胞的转导能力(图3E)。

实施例4检测AAV5/rAAV5在小鼠不同组织中的表达

为检测携带hLuc-2A-EGFP基因在3种不同AAV5衣壳携带病毒的表达，将15只6-8周龄的野生型c57小鼠，随机分成3组，每组5只。

每组分别以5.0×10¹¹vg的剂量，于尾静脉注射rAAV5-hLuc-2A-EGFP(称为AAV5组)或者rAAV5.GASN-hLuc-2A-EGFP(称为AAV5-GASN组)或者rAAV5.GAST-hLuc-2A-EGFP(称为AAV5-GAST组)或者250μL PBS(PBS组3只小鼠，称为PBS组)。在注射3周后，取5只或者3只小鼠进行小鼠活体成像，通过小鼠活体成像系统检测荧光强度(即小鼠全身荧光素酶基因的表达水平)。

小鼠活体和组织成像具体过程：

a.活体成像：首先配制浓度为30mg/ml的荧光显影液。称量0.15g D-Luciferinpotassium(购自大连美伦生物技术公司)并加入Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline(DPBS)(购自北京海诚远宏科技有限公司；货号：SH0021)至5ml。振荡15s溶解，全程保持避光。每只小鼠注射体积为150μL。5只小鼠为一组，全部注射完成后，放入气体麻醉容器中并开始计时。

全部麻醉后将小鼠按照顺序放入活体检测仪器(型号：博鹭腾Aniview600多模式动物活体成像系统)中并拍照，从计时开始到拍照总时长为5min。

b.组织成像：首先配制浓度为30mg/ml的荧光显影液，和26mg/ml的麻醉剂(由三溴乙醇和叔戊醇配制而成，该试剂均购自上海麦克林公司)。

每只小鼠荧光显影液注射体积为150μL。麻药注射体积为20μL/g。首先注射荧光显影液150μL并开始计时，2min后开始注射麻药，麻药注射体积随小鼠体重的改变而改变，比例为30μL/g。然后开始解剖灌流，灌流结束后开始取材，其中AAV5组和AAV5-GASN组的取材顺序第一行从左至右分别为心脏、肝脏、肺脏；第二行从左至右分别为后肢右侧的大腿外侧肌群(股内侧肌)、后肢右侧的大腿内侧肌群(长收肌)和右侧的小腿腓肠肌；第三行从左至右分别为后肢左侧的大腿外侧肌群(股内侧肌)、后肢左侧的大腿内侧肌群(长收肌)和左侧的小腿腓肠肌(具体请参见图4C中的最后1张图)。PBS组的取材顺序第一行从左至右分别为心脏、肝脏、肺脏；第二行从左至右分别为后肢右侧的大腿外侧肌群(股内侧肌)、后肢右侧的大腿内侧肌群(长收肌)和右侧的小腿腓肠肌(由于PBS组未进行感染，因此仅针对后肢右侧的股内侧肌、长收肌和腓肠肌进行取材，而未针对后肢左侧的股内侧肌、长收肌和腓肠肌进行取材)。

放置在干净培养皿中进入活体检测仪检测。整个过程在10-15min，保证显影液不淬灭。

试验结果：

根据活体成像结果可以看出：AAV5-GASN相比于AAV5，不仅显著降低了在小鼠肝脏区域的富集，同时也显著增强了AAV5在骨骼肌区域的转导能力(图4A)。Luminescence定量分析也显示了AAV5-GASN也总体荧光值升高约100倍(图4B)。

根据组织成像结果可以看出：AAV5-GASN相比于AAV5，不仅显著降低了在小鼠肝脏区域的富集，同时也显著增强了AAV5在骨骼肌区域的转导能力。同时在心脏和肺部组织也没有出现明显的转导信号(图4C)。各组织Luminescence定量分析也显示了AAV5-GASN在骨骼肌肌群，包括股内侧肌、长收肌和腓肠肌，相对AAV5转基因表达升高50～100倍。而在肝脏组织下降约3倍左右。在心脏和肺脏AAV5和AAV5-GASN的转导效率并没有显著变化(图4D)。

实施例5小鼠各组织转基因mRNA表达水平鉴定

为了进一步定量分析AAV5和AAV5-GASN转基因表达水平，我们提取了小鼠大腿外侧肌群(股内侧肌)，大腿内侧肌群(长收肌)和肝脏组织，通过TRIzol试剂盒(赛默飞；货号：15596018)分别提取小鼠各组织总RNA。

通过IV One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(购自北京全式金生物公司；货号AW311-02)，利用oligo dT引物捕获总mRNA。随后使用擎科公司合成的EGFP引物和探针：

GFP-F：5'-CCGACAACCACTACCTGAG-3'(SEQ ID NO：11),

GFP-R：5'-CCATGCCGAGAGTGATCC-3'(SEQ ID NO：12)和

GFP-Probe：5'-6-FAM-caatggtggctctgtacaacgctg-BHQ1-3'(SEQ ID NO：13)

用qPCR(ABI quantstudio5实时荧光定量PCR仪)测定转基因EGFP mRNA表达水平。

同时使用擎科公司合成的小鼠GAPDH引物：

GAPDH-F：5'-AGAAGCGCACAGCCCACAAT-3'(SEQ ID NO：14)和GAPDH-R：5'-GCAAGACAGCAGATTTATTCAG-3'(SEQ ID NO：15)测定小鼠内参基因GAPDH mRNA表达水平。操作过程参见所用试剂的说明书。

试验结果：根据图5所示的结果可以看出，相对AAV5,AAV5-GASN在肝脏EGFP mRNA表达水平下降了约240倍(0.96→0.004)。相反，相对AAV5,AAV5-GASN在长收肌EGFP mRNA表达水平升高了约1500倍(13886→2.4)。类似的，相对AAV5,AAV5-GASN在股内侧肌EGFP mRNA表达水平升高了约40倍(33.7→0.9)(图5)。因此，和Luminescence定量分析结果一致，AAV5-GASN不仅显著降低了转基因在肝脏的mRNA表达水平，同时也显著地增加了转基因在骨骼肌的mRNA表达水平。

Claims (17)

1.一种腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其特征在于，所述腺相关病毒衣壳蛋白包含：(i)与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少80％相同并且在SEQ ID NO：4的G257位置后具有插入突变的序列，或者(ii)与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少80％相同并且在SEQ ID NO：4的G257位置和S258的位置后均具有插入突变的序列。

2.根据权利要求1所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其中(i)中所插入突变为在SEQ ID NO：4的G257位置后具有丙氨酸的插入突变。

3.根据权利要求1所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其中，(ii)中所插入突变为在SEQ IDNO：4的G257位置后具有丙氨酸的插入突变，并且在SEQ ID NO：4的S258位置后具有苏氨酸的插入突变。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％相同的序列。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其氨基酸序列分别如SEQID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其中，腺相关病毒选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、rh.10、rh.39、rh.43和rh.74中的一种或多种；

优选地，AAV包括AAV5。

7.一种多核苷酸，其编码权利要求1～6中任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白；

优选地，所述多核苷酸的序列分别如SEQ ID：2和SEQ ID NO：3所示。

8.一种腺相关病毒，其包含权利要求1～6中任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白；

优选地，所述腺相关病毒具有靶向肝脏嗜性降低并且靶向骨骼肌嗜性增强的特性；

更优选地，所述骨骼肌为长收肌或股内侧肌。

9.一种转基因递送载体，其包括如权利要求8所述的腺相关病毒。

10.一种药物组合物，其包含：

(a)如权利要求8所述的腺相关病毒、或如权利要求9所述的转基因递送载体；以及，

可选的，

(b)药学上可接受的载体。

11.如权利要求8所述的腺相关病毒、如权利要求9所述的转基因递送载体、或如权利要求10所述的药物组合物在制备用于递送转基因至细胞的试剂中的用途。

12.根据权利要求11所述的用途，其中，所述细胞来自受试者；

优选地，所述受试者是哺乳动物受试者；

更优选地，所述受试者是人。

13.根据权利要求11或12所述的用途，其中，所述细胞来自骨骼肌。

14.根据权利要求12或13所述的用途，其中，所述受试者患有骨骼肌疾病；

优选地，所述骨骼肌疾病选自由肌肉疼痛、肌肉强直、肌肉无力、肌肉萎缩、肌肉肥大、肌张力低下、肌肉痉挛及肌肉挛缩组成的组中的任一种。

15.根据权利要求11～14任一项中所述的用途，其中，所述腺相关病毒、所述转基因递送载体、或所述药物组合物通过肌肉注射来施用至受试者。

16.如权利要求8所述的腺相关病毒、如权利要求9所述的转基因递送载体、或如权利要求10所述的药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途；

优选地，所述疾病包括骨骼肌疾病；

更优选地，所述骨骼肌疾病选自由肌肉疼痛、肌肉强直、肌肉无力、肌肉萎缩、肌肉肥大、肌张力低下、肌肉痉挛及肌肉挛缩组成的组中的任一种。

17.一种疾病治疗方法，其包括将如权利要求8所述的腺相关病毒、如权利要求9所述的转基因递送载体、或如权利要求10所述的药物组合物施用至受试者的步骤；

优选地，所述的疾病包括骨骼肌疾病；

更优选地，所述骨骼肌疾病选自由肌肉疼痛、肌肉强直、肌肉无力、肌肉萎缩、肌肉肥大、肌张力低下、肌肉痉挛及肌肉挛缩组成的组中的任一种。