KR20220053575A - 항체 결합 및 중화 항체 억제를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

항체 결합 및 중화 항체 억제를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항체 결합을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 방법은 항체를 단리하고, 과량의 항체와 관련된 장애를 치료하고, 항체를 급성으로 차단하여 자가면역 또는 염증 반응을 정지시키고, 중화 항체를 억제하는데 사용될 수 있다. 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 이종 작용제의 중화를 억제하는 것을 포함하는, 이종 작용제가 대상체에게 투여되는 경우에 이종 작용제에 대한 중화 항체를 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 야생형 단백질 M에 비해 증가된 열안정성을 갖는 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 및 본 발명의 방법에서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

항체 결합 및 중화 항체 억제를 위한 조성물 및 방법
우선권의 진술
본 출원은 2019년 8월 1일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/881,765를 우선권 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 항체 결합을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 방법은 항체를 단리하고, 과량의 항체와 관련된 장애를 치료하고, 항체를 급성으로 차단하여 자가면역 또는 염증 반응을 정지시키고, 중화 항체를 억제하는데 사용될 수 있다. 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 이종 작용제의 중화를 억제하는 것을 포함하는, 이종 작용제가 대상체에게 투여되는 경우에 이종 작용제에 대한 중화 항체를 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 야생형 단백질 M에 비해 증가된 열안정성을 갖는 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 및 본 발명의 방법에서의 그의 용도에 관한 것이다.
미국에서 10명 중 대략 1명은 희귀 유전 질환을 앓고 있으며, 이는 수명, 삶의 질, 독립성 및 경제적 잠재력에 심각하게 영향을 미칠 수 있다. 유전자 요법은 유전성 질환의 교정을 위한 가장 유망한 형태의 치료이다. 유전자 요법 전달 비히클 중에서, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터는 수많은 임상 시험에서 치료 효과를 나타냈다. 최초 FDA 승인된 유전자 요법은 실명 환자에서 사용되었다. AAV 유전자 요법에 대한 임상 시험의 수는, 실질적으로 장기간 치료 유전자 발현을 위해 많은 상이한 유형의 기관을 표적화하는데 있어서의 그의 안전성 및 성공으로 인해 증가하였다. 임상 성공에도 불구하고, AAV 매개된 유전자 전달에 대한 주요 장벽은 표적 조직으로의 벡터 형질도입을 차단하는 중화 항체 (NAb)의 높은 출현율이다. 일반 집단 중 90% 초과가 자연 감염을 통해 AAV에 노출되었고, 50% 초과의 사람은 AAV에 대한 NAb에 대해 혈청 양성이다. 임상 시험 스크리닝 동안 기존 NAb가 특정 한계값을 초과하는 것으로 확인되면 환자는 등록 자격을 잃게 되는데, 이는 NAb가 치료 유효성을 심하게 약화시키고 결과 가변성을 야기하기 때문이다.
AAV NAb를 극복하기 위해, 여러 접근법이 사용되었다: 연속 혈장분리반출술, 면역 억제 약물, 및 면역 에피토프를 제거하기 위한 벡터 캡시드의 변경. 혈장분리반출술은 각각의 세션에 남아있는 NAb의 2-3배를 제거하는 다수의 라운드가 요구되어 비효율적이고, 낮은 역가의 NAb만을 다룰 수 있다. 혈장분리반출술은 또한 시간 소모적이고, 항체의 동시 고갈 및 반복된 정맥내 바늘 노출을 통해 환자를 병원내 감염 전달 위험에 놓이게 한다. B-세포를 사멸시키기 위한 스테로이드 또는 약리학적 면역 억제는 유의한 건강 위험을 보유하고, NAb를 심지어 10배만큼 감소시키기 위해 장기간 요법을 요구한다. AAV 캡시드 조작은 혁신적인 방법이지만, 궁극적으로는 폴리클로날 항-AAV 혈청에 대해 부적절하며, 항체 회피의 보통 10배 증가가 생체내에서 관찰된다. 추가적으로, NAb 인식 에피토프를 변경시키는 캡시드 구조의 변형은, 이러한 변경된 표면 영역이 다중기능적이기 때문에, 전형적으로 덜 강력한 벡터 및 결함 벡터 생산을 초래한다. 현행 접근법 중 임상 시험 배제를 위해 설정된 전형적 한계값을 초과하는 기존 항-AAV NAb를 성공적으로 극복하거나 또는 동일한 AAV 벡터의 반복 투여를 허용하는 접근법은 없다.
미코플라스마 단백질 M은 항체에 비-특이적으로 결합하여 항체의 항원 결합 능력을 차단할 수 있는 것으로 확인되었다 (미국 특허 번호 9,593,150; 미국 공개 번호 2017/0320921).
본 발명은 Nab를 보편적으로 차단하는 벡터 비의존성 단백질 기반 방법 및 항체 결합에 기초한 다른 방법 및 조성물을 제공함으로써 관련 기술분야의 단점을 극복한다.
본 발명은 부분적으로, NAb를 보편적으로 차단하는 벡터 비의존성 단백질 기반 방법의 개발 및 이 방법이 넓은 범위의 기존 NAb 농도에 대해 효과적이라는 입증에 기초한다. 본 발명은 대상체에 대한 이종 작용제의 투여시 NAb에 의한 이종 작용제 (예를 들어, AAV 벡터)의 중화를 방지함으로써 성공적인 유전자 전달을 가능하게 하는, 단백질 M으로 불리는 특유한 미코플라스마-유래 단백질 및 그의 유사체의 용도를 개척한다. 단백질 M은 항체 경쇄 및 중쇄 상의 보존된 영역에 보편적으로 결합하여, CDR 영역을 인식하는 항원에 구조적 간섭을 유발함으로써, 종 및 항원 비의존성 방식으로 포유동물 IgG, IgM 및 IgA 항체 부류를 차단하는 것으로 나타났다. 단백질 M은 나노몰 친화도로 항체에 결합하고, 각종 상이한 시험 이뮤노글로불린/항원 쌍에 대한 항원-항체 연합을 방지한다. 본 발명자들은 단백질 M이 항체의 AAV 인식을 차단하고 항체-매개된 AAV 중화를 방지한다는 것을 발견하였다. NAb로부터의 AAV 벡터 회피의 수준은 NAb 역가 및 부피, 단백질 M의 양 및 AAV의 양에 비례한다는 것이 입증되었다. 단백질 M 매개된 NAb 회피는 인간 혈청 (IVIG) 및 AAV 면역화된 마우스로부터의 혈청을 사용하여 시험관내 및 생체내에서 검증되었다. 단백질 M은 AAV 투여 전에 단독으로 투여되거나 또는 NAb 회피를 위해 AAV와 함께 제제화될 수 있는 것으로 입증되었다. 이러한 접근법의 유효성은 AAV가 중화되기 전에 단백질 M과 이뮤노글로불린의 상호작용에 의존한다. 이러한 접근법은 특이적 유전자 요법 적용을 위한 각각의 작용제의 특유한 또는 유익한 특성을 유지하면서 다수의 이종 작용제 (예를 들어, AAV 벡터 혈청형)에 대한 NAb를 극복하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 자가면역 장애의 치료, 과량의 항체와 연관된 장애의 치료, 항체를 단리하는 방법 및 면역검정을 수행하는 방법을 포함한, 항체의 결합이 유익한 다른 방법에서의 단백질 M의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 생체내 또는 승온에서 본 발명의 방법을 수행하기 위한 증가된 열안정성 및/또는 다른 유리한 특징을 갖는 변형된 단백질 M 단백질에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 야생형 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편에 비해 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편의 열안정성을 증가시키거나 유지하는 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 본 발명의 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그를 포함하는 벡터 또는 형질전환된 세포에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 이종 작용제의 중화를 억제하는 것을 포함하는, 대상체에 대한 이종 작용제의 투여시 중화 항체에 의한 이종 작용제의 중화를 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 대상체에게 (a) 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 코딩하는 핵산 전달 벡터 및 (b) 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 대상체에서 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 발현시키는 것을 포함하는, 대상체에서 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 발현시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 (a) 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 코딩하는 핵산 전달 벡터의 치료 유효량 및 (b) 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 대상체에서 장애를 치료하는 것을 포함하며, 여기서 장애는 대상체에서 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 발현시킴으로써 치료가능한 것인, 상기 대상체에서 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 (a) 유전자 편집 복합체 및 (b) 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 대상체에서 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 발현시키는 것을 포함하는, 대상체에서 유전자를 편집하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 자가면역 질환을 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 과량의 항체와 연관된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 과량의 항체와 연관된 장애를 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 과량의 항체와 연관된 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 항체 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 화합물을 고체 지지체에 부착된 본 발명의 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편과 접촉시킨 다음, 화합물을 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편으로부터 용리시키는 것을 포함하는, 항체 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 화합물을 샘플로부터 단리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 본 발명의 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편을 사용하여 항체 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 화합물에 결합시키는 것을 포함하는, 면역검정을 수행하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 본 발명의 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 이들 및 다른 측면이 하기 발명의 설명에서 보다 상세히 제시된다.
도 1은 인간 IVIG가 AAV 형질도입을 용량-의존성으로 억제하는 AAV 중화 항체를 함유한다는 것을 보여준다. 인간 IVIG의 2배 연속 희석물을 사용하여 AAV2 중화 플롯을 생성하였다. 50 μg으로 시작하여, IVIG를 1 μg 미만으로 단계적으로 희석하고, 각각의 희석물을 2x108개 바이러스 게놈의 AAV2-루시페라제와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 웰에 시딩하였다. AAV2 트랜스진 발현에 의해 생성된 발광 리포터 신호는 AAV 형질도입의 기능적 판독치이고, 배양된 HEK-293 세포를 형질도입하는데 이용가능한 AAV의 양에 비례한다. 이 실험에서, 48-웰 플레이트의 각각의 웰에 1x105개 세포를 시딩하고, 무혈청 배지 중 2,000의 MOI로 형질도입하였다 (조건당 n=3 기술적 반복). 세포 용해 및 루시페린의 첨가 후에 플레이트 판독기 상에서 형질도입 48시간 후 루시페라제 활성의 측정을 수행하였다. 주어진 IVIG 양에 대해 중화된 AAV의 퍼센트 사이의 관계는 등가 부피의 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 함유한 IVIG-부재 대조군과 비교하여 12.5 μg의 IVIG에서 72% (+/- 1.3%) 중화인 것으로 결정되었다. 추가로, 25 μg의 IVIG는 96% (+/- 0.2%)의 AAV2를 중화시킨 반면 50 μg의 IVIG는 99% (+/- 0.17%)의 AAV2를 중화시켰다.
도 2는 단백질 M이 인간 IVIG에 존재하는 중화 항체로부터 AAV를 보호한다는 것을 보여준다. 2x108개 vg의 용량에서 ~70%의 AAV2를 중화시키기 위해 이전 도면에서 확립된 12.5 μg IVIG를 사용하여, 단백질 M의 2배 연속 희석물을 사용한 항체 매개된 중화로부터의 회피를 조사하였다. 이 경우에, 실험은 8개의 단백질 M 분자 대 1개의 IgG 분자의 몰비로 시작하였으며, 이는 1개의 IgG 분자가 완전한 항체 불활성화를 위해 점유되어야 하는 2개의 단백질 M 결합 부위를 갖는다는 것을 고려하면 4배 과량의 단백질 M이다. 각각의 웰에서, IVIG를 먼저 개별 단백질 M 희석물과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, AAV2-루시페라제 (2x108개 vg)를 첨가하고, 4℃에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, HEK-293 세포 (1x105개)를 웰에 첨가하고, 48시간 동안 인큐베이션한 후, 루시페라제 리포터 신호를 측정하였다. IVIG를 함유하지만 단백질 M은 함유하지 않는 웰은 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 함유하는 IVIG-부재 대조군 웰과 비교하여 AAV 신호의 ~68% (+/- 3.3%) 감소를 입증하였다. 그러나, 단백질 M은 AAV의 중화를 용량 의존성으로 차단하여 2:1 초과의 몰비에서 중화를 완전히 방지한 반면 (비-IVIG 대조군의 108%-193%) 1:1 또는 0.5:1의 비는 중화를 단지 부분적으로 차단하였다 (각각 비-IVIG 대조군의 52% 및 40%). 추가적으로, 8:1 및 4:1의 비에서, IVIG-부재 대조군에 비해 AAV 루시페라제 신호의 용량 의존성 증가가 관찰되었다. 48-웰 플레이트에서 모든 웰을 무혈청 배지 중에서 삼중으로 수행하고 (조건당 n=3 기술적 반복), 루시페라제 신호를 형질도입 48시간 후 측정하였다.
도 3은 과량의 단백질 M이 8:1 초과의 몰비에서는 NAb로부터의 추가의 보호를 거의 제공하지 않고, 단백질 M이 AAV 형질도입을 증진시킨다는 것을 보여준다. 중화 항체 조건의 존재 또는 부재 하에 AAV의 형질도입을 보호하거나 증진시키는 단백질 M 몰비의 상한을 확립하기 위한 노력으로, 8:1 또는 20:1의 몰비로 NAb 회피 검정을 반복하였다. 12.5 μg의 IVIG의 첨가는 비-IVIG PBS 대조군 웰과 비교하여 80% (+/- 2.6%)의 AAV2-루시페라제 신호를 중화시켰다. 이전 실험과 유사하게, 단백질 M을 12.5 μg IVIG (8:1 몰비, 33 μg 단백질 M)와 함께 4℃에서 1시간 동안 사전-인큐베이션하고, 이어서 AAV와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 것은, AAV 중화를 방지하고, PBS 함유 IVIG-부재 대조군의 194% (+/- 24%)로 루시페라제 신호를 증진시켰다. NAb 회피에 필요한 단백질 M 양의 10배 (20:1 몰비, 75 μg 단백질 M)에서, PBS 함유 IVIG-부재 대조군에 비해 256% (+/- 44%)로 루시페라제 활성의 보통의 증가가 관찰되었다. IVIG의 존재 하에 20:1 비의 루시페라제 신호는 8:1 비와 통계적으로 상이하지 않았다. 추가로, IVIG 부재 하에, 75 μg 또는 33 μg의 단백질 M을 단독으로 AAV2-루시페라제와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 경우에, 루시페라제 신호의 양에서 유의한 차이가 없었으며 (각각 208% 대 216%), 이는 PBS 대조군 대비 루시페라제 신호의 증가가 단백질 M 기반 증진으로 인한 것임을 확인시켜 준다. 48-웰 플레이트 포맷에서 각각의 웰에 무혈청 배지 중 1x105개 HEK-293 세포를 시딩하고, 2,000의 MOI로 형질도입하였다 (웰 조건당 n=3 기술적 반복).
도 4는 AAV 형질도입의 단백질 M에 의한 증진이 용량 의존성이라는 것을 보여준다. 33 μg으로 시작하는 단백질 M의 2배 연속 희석물은 단백질 M과 AAV2-루시페라제의 인큐베이션이 PBS+AAV 대조군에 비해 루시페라제 신호의 증가를 유발한다는 것을 입증한다. 2x108개 바이러스 게놈에 대해 2 μg 미만의 단백질 M의 농도 또는 40,000개의 단백질 M 분자 대 1개의 게놈 함유 AAV2-루시페라제 입자의 몰비에서 루시페라제 신호의 증진이 제거된다. 증진은 2x108개 벡터 입자에 대해 약 33 μg의 단백질 M에서 또는 1개의 게놈 함유 AAV2-루시페라제 입자에 대해 대략 700,000개의 단백질 M 분자에서 포화되기 시작한다. 단백질 M 희석물을 AAV와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 형질도입하였다. 48-웰 플레이트 포맷에서 각각의 웰에 무혈청 배지 중 1x105개 HEK-293 세포를 시딩하고, 2,000의 MOI로 형질도입하였다 (웰 조건당 n=3 기술적 반복).
도 5는 AAV 형질도입의 단백질 M 기반 증진이 AAV 캡시드와 단백질 M의 직접적 상호작용에 의존성이라는 것을 보여준다. AAV2-루시페라제로 3가지 상이한 조건을 시험하였다: 형질도입 전 1시간 동안 AAV와 함께 단백질 M 사전-인큐베이션 (-1시간), 형질도입-당시 시점에서 AAV에 단백질 M의 첨가 (0시간), 또는 AAV에 의한 형질도입 18시간 후 웰에 단백질 M의 첨가 (18시간). 단백질 M이 없는 2가지 음성 대조군 조건을 사용하였다: AAV를 세포 시딩 및 형질도입 전에 세포 배양 배지에서 단독으로 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하거나 (사전-인큐베이션 및 형질도입-당시 군에서의 조건을 나타냄), 또는 AAV를 PBS 중에 희석하고, 세포 시딩 및 형질도입 시에 세포 배양물에 첨가함 (형질도입-후 군에서의 조건을 나타냄). 형질도입 18시간 후에, 추가의 부피의 PBS를 PBS 대조군에 첨가하여 등가 부피의 단백질 M을 형질도입-후 군에 첨가한 조건을 모방하였다. 단백질 M을 형질도입-당시 또는 형질도입 후에 첨가한 웰에서는 AAV 루시페라제 신호의 증진이 관찰되지 않은 반면, 사전-인큐베이션 군에서는 용량 의존성 증진이 관찰되었으며, 이는 AAV와의 단백질 M 상호작용이 증진 메카니즘에 필요하였다는 것을 나타낸다. 48-웰 플레이트 포맷에서 모든 웰에 1x105개 Huh7 세포를 시딩하고, 각각의 웰에 2x108개 vg의 AAV를 형질도입하였다 (웰 조건당 n=3 기술적 반복).
도 6은 NAb가 캡시드에 결합한 후에는 단백질 M이 AAV 중화를 방지하지 않는다는 것을 보여준다. AAV2-루시페라제를 먼저 IVIG의 상이한 희석물과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 단백질 M을 첨가하고, 4℃에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이중 음성 대조군은 AAV만을 받는 반면, 양성 대조군은 형질도입 전 AAV와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션된 33 μg의 단백질 M을 받았다. 200 μg, 50 μg 또는 12.5 μg을 함유한 IVIG의 3가지 상이한 희석물을 사용하였다. IVIG의 희석물과 함께 인큐베이션된 AAV만을 함유한 단백질 M 음성 대조군과 비교하여, 33 μg의 단백질 M은 99%의 AAV가 이미 50 μg 또는 200 μg의 IVIG에 의해 중화된 경우에는 중화-후 증진 또는 중화 항체로부터의 회피를 가능하게 하지 않는다. 그러나, 12.5 μg의 IVIG를 AAV와 함께 인큐베이션한 경우에, 약 30%의 벡터는 중화되지 않은 채로 남아있었고 (도 1, 2 및 3 참조), 33 μg의 단백질 M은 AAV 및 12.5 μg IVIG를 함유하는 단백질 M 음성 대조군 웰과 비교하여 이 분획의 중화 후 형질도입을 증진시킬 수 있었다. 이전 도면과 달리, 루시페라제 측정을 형질도입 24시간 후에만 수행하였으며, 이는 12.5 μg IVIG 플러스 AAV를 갖는 군으로부터의 루시페라제 신호가 이중 음성 대조군의 30% 미만인 이유를 설명할 수 있다. 48-웰 플레이트 포맷에서 각각의 웰에 무혈청 배지 중 1x105개 HEK-293 세포를 시딩하고, 2,000의 MOI로 형질도입하였다 (웰 조건당 n=3 기술적 반복).
도 7은 AAV와 단백질 M의 사전-인큐베이션이 추후 IVIG에 의한 중화로부터 벡터를 보호한다는 것을 보여준다. 이 중화 검정을 위해, 단백질 M의 양을 동일하게 (8.25 μg) 유지하면서, 다양한 양의 IVIG (50 μg 내지 3.12 μg IVIG)를 사용하여 상이한 몰비를 달성하였다. 단백질 M을 먼저 AAV2-루시페라제와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 IVIG를 4℃에서 1시간 동안 첨가한 후 세포 배양물에 형질도입하였다. 양성 대조군은 AAV 플러스 33 μg, 8.25 μg 또는 1 μg 단백질 M을 함유한 반면, 음성 대조군은 PBS와 함께 인큐베이션된 AAV만을 함유하였다. 단백질 M 매개된 AAV의 비-중화 분획의 2-3배 증진이 관찰될 수 있었다. 48-웰 플레이트 포맷에서 각각의 웰에 무혈청 배지 중 1x105개 HEK-293 세포를 시딩하고, 2,000의 MOI로 형질도입하였다 (웰 조건당 n=3 기술적 반복). 루시페라제 측정을 형질도입 24시간 후에 수행하였다.
도 8은 단백질 M을 AAV와 함께 사전-인큐베이션하는 것이 과량의 배경 혈청 이뮤노글로불린에서 IVIG에 의한 중화로부터 벡터를 보호한다는 것을 보여준다. 이 실험을 위해 25 μg의 IVIG를 사용하였으며, 이는 이전에 2x108개 바이러스 게놈의 용량에서 ~95%의 AAV2-루시페라제를 중화시키는 것으로 나타났다. 25 μg의 인간 IVIG를 10% 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 세포 배양 웰에 첨가하였으며, 여기서 추정 소 IgG 농도는 제조업체에 의해 수행된 ELISA에 의해 결정시 350 μg이었다. 동일한 양의 10% FBS를 함유하는 세포 배양 웰의 또 다른 세트는 IVIG-부재 대조군으로서의 역할을 하였다. 몰비 4:1, 2:1 및 1:1 (소 IgG 함량 기준)의 단백질 M을 AAV와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 각각 10% FBS를 함유하는 IVIG-부재 대조군 웰 또는 25 μg IVIG 함유 웰에 첨가하였다. AAV를 음성 대조군에서 단백질 M 대신 PBS와 함께 인큐베이션하고, 10% FBS를 함유하는 웰 또는 10% FBS와 25 μg의 IVIG를 함유하는 웰에 첨가하였다. 결과는 단백질 M 사전-인큐베이션이 심지어 1개의 단백질 M 분자 대 1개의 소 IgG 분자의 비에서도, 이러한 양의 단백질 M (108 μg)이 인간 IVIG (25 μg)보다 여전히 12배 더 큰 비로 존재하긴 하였지만, AAV2-루시페라제를 IVIG에 의한 중화로부터 보호하였다는 것을 입증한다. 각각의 웰에 1x105개 HEK-293 세포를 시딩하고, 48-웰 플레이트 포맷에서 2,000의 MOI로 형질도입하였다 (웰 조건당 n=3 기술적 반복). 루시페라제 측정을 형질도입 24시간 후에 수행하였다.
도 9는 단백질 M이 AAV8 면역화된 마우스로부터 수집된 풀링된 폴리클로날 혈청에서 발견된 중화 항체로부터 AAV8의 시험관내 회피를 허용한다는 것을 보여준다. 이 실험을 위해, AAV8 면역화된 마우스로부터의 풀링된 폴리클로날 혈청 10 μl를 PBS 중에, 먼저 10배 연속 희석하여 1 μl 및 0.1 μl 혈청 함유 웰을 생성하였다. 이어서, 0.1 μl 혈청 웰을 2배 연속 희석으로 추가로 희석하였다. AAV8-루시페라제 벡터 (웰당 2x108개 바이러스 게놈)를 형질도입 전 중화 혈청의 희석물과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 단백질 M을 동일한 AAV8 중화 마우스 혈청의 10배 연속 희석물에 2개의 단백질 M 분자 대 추정 1개의 이뮤노글로불린 분자의 비로 첨가하였다. 6.5 μg의 단백질 M 대 1 μl의 중화 마우스 혈청 중 추정 10 μg의 이뮤노글로불린으로 시작하여, 각각의 단백질 M 및 혈청 샘플을 개별적으로 상호 희석한 후, 4℃에서 1시간 인큐베이션 동안 합하였다. 이어서, 모든 샘플을 AAV8-루시페라제와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세포에 첨가하였다. 생성된 중화 실험으로부터의 데이터를 AAV8만을 함유하는 무혈청 대조군 웰에 대해 정규화한 다음, 루시페라제 신호를 이중 지수 붕괴 함수로 피팅하여 데이터 포인트 사이의 곡선을 추정하였다. 모델링된 곡선을 사용하여, 폴리클로날 혈청에 의한 AAV8의 50% 중화가 0.0039 μl의 부피에서 1:2,564의 유효 역가로 발생한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 2:1 몰비의 단백질 M과 함께 인큐베이션된 동일한 혈청의 50% 중화는 0.2744 μl의 혈청 부피에서 발생하여 추정 유효 역가가 1:36이었다. 이러한 결과는 단백질 M이 시험관내 혈청 농도의 거의 100배 차이에 걸쳐 AAV를 보호할 수 있다는 것을 입증한다. 96-웰 플레이트 포맷에서 모든 웰에 5x104개 HEK-293 세포를 시딩하고 (MOI 4,000) (웰 조건당 n=3 기술적 반복), 루시페라제를 형질도입 48시간 후에 측정하였다.
도 10은 AAV8에 대한 수동 면역을 갖는 마우스에 대한 단백질 M의 생체내 투여가 중화 항체 회피를 유발한다는 것을 보여준다. 이 실험에서 마우스에게 IV 주사를 통한 수동 전달을 통해 다양한 부피의 폴리클로날 AAV8 혈청 (이전 도면으로부터의 역가 1:2,564)을 제공하고, 이어서 15-20분 이내에 2x1010개 바이러스 게놈의 AAV8-루시페라제의 IV 투여를 제공하였다. 이는 각각의 마우스에 전달된 혈청 부피에 기초하여 중화 곡선을 확립하였다. AAV8-루시페라제 신호의 50% 초과의 중화는 혈청의 수동 전달이 없는 나이브 마우스의 군과 비교하여 1 μl 내지 0.001 μl의 혈청 전달된 군에서 발생한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 추정 2:1 비의 단백질 M (6.3 mg)을 수동 전달 후 AAV 투여 전 마우스에게 전달한 경우에는, 0.3 μl의 전달된 혈청 부피에서 중화 항체로부터의 완전한 회피가 달성되었고, 1 μl는 NAb 농도의 1,000배 변화의 중화 항체로부터의 단백질 M 매개된 회피를 나타냈다. 추가로, 중화로부터의 회피는 0.3 μl 수동 전달된 혈청 군에 대해 용량 의존성이었으며, 이는 NAb 회피가 혈청-부재 대조군과 비교하여 1:1 (3.15 mg) 및 0.5:1 (1.58 mg) 추정 몰비에 대해 감소되었다는 것을 입증한다. 모든 군에 대해, 군 조건당 n=5 마우스 및 간으로부터의 루시페라제 신호를 AAV 투여 24시간 후에 측정하였다.
도 11은 도 10에서의 결과로부터 정량화된 평균 미가공 발광을 보여준다.
도 12는 단백질 M/항체 복합체가 시험관내 형성 후에 안정하다는 것을 보여준다. 이 실험에서 추정 10 μg의 이뮤노글로불린을 함유하는 1 μl의 폴리클로날 혈청 (역가 1:2,564)을 사용하여 AAV8-루시페라제의 첨가 전 다양한 지속기간 동안 단백질 M (2:1 몰비, 6.6 μg)과 함께 인큐베이션하였다. 음성 대조군은 중화 혈청 플러스 배지를 함유한 반면, 양성 대조군은 배지 플러스 PBS 또는 단백질 M 플러스 배지를 함유하였다. 72시간, 48시간, 24시간, 16시간, 4시간, 2시간 및 1시간의 인큐베이션 기간을 모든 군에 적용하였다. 모든 인큐베이션 지속기간은 배지 플러스 PBS 음성 대조군과 비교하여 중화로부터의 단백질 M 매개된 AAV8 보호를 나타냈다. AAV8-루시페라제를 5x104개 HEK-293 세포의 시딩 시 (0시간)에 웰에 첨가하고, 96-웰 플레이트 포맷에서 4,000의 MOI로 형질도입하였다 (웰 조건당 n=3 기술적 반복). 루시페라제 측정을 형질도입 48시간 후에 수행하였다.
도 13은 생체내에서 단백질 M에 의한 중화 항체 회피의 효력이 불안정한다는 것을 보여준다. 도 10 및 11과 동일한 실험을 수행하였지만, 이번에는 NAb 회피의 지속성을 시험하기 위해 단백질 M 투여 5분 후 또는 단백질 M 투여 3시간 후에 AAV8을 첨가하였다. AAV8을 투여하기 위해 3시간 동안 기다린 후 AAV8-루시페라제 신호는 혈청-부재 대조군의 약 1/3인 반면, 단백질 M 후에 AAV8을 투여하기 위해 단지 5분 동안만 기다린 경우 루시페라제 신호는 혈청-부재 대조군과 대략 등가였다. 추정 2:1 비의 단백질 M (6.3 mg)을 수동 전달 후 AAV 투여 전 마우스에 전달하였고, n=3 마우스를 함유한 3시간 기간 군을 제외하고는 군 조건당 n=5 마우스였다. 간으로부터의 루시페라제 신호를 AAV 투여 24시간 후에 측정하였다.
도 14는 엠. 게니탈리움(M. genitalium)으로부터의 말단절단된 단백질 M (MG WT)이 체온에서 불안정하다는 것을 보여준다. 용융 온도 (Tm)를 나노 시차 주사 형광투시법 (나노DSF)으로 결정하였다. 일계 도함수의 변곡점이 Tm을 나타낸다. 단백질을 이. 콜라이(E. coli)에서 재조합적으로 발현시키고, 측정 전 니켈 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 원형 이색성 검정은 MG WT가 가시적 침전물 형성 없이 20℃에서 적어도 2시간 동안 안정하다는 것을 입증하였다. 그러나, 37℃에서 MG WT는 가시적 침전물의 생산과 함께 15분 후에 언폴딩되기 시작하였다. 이는 단백질이 표준 인간 체온 근처에서 불안정하다는 것을 나타낸다. 0-100℃로부터의 온도 경사는 MG WT의 즉각적 언폴딩 및 약 41.2℃의 용융 온도 (Tm)를 나타냈다. 언폴딩은 가시적 침전물의 응집을 동반하였다.
도 15a-15b는 엠. 게니탈리움으로부터의 말단절단된 단백질 M (MG WT) 및 엠. 뉴모니아에(M. pneumoniae)로부터의 말단절단된 단백질 M (MP WT), 뿐만 아니라 MG WT에 비해 용융 온도를 적어도 1도 개선시키거나 (a) 또는 MG WT의 용융 온도를 유지하는 (b) 단백질 M의 유사체의 용융 온도를 보여준다. 이. 콜라이로부터의 소규모 단백질 생산에 의해 생성된 WT 및 돌연변이 단백질 유사체에 대해 시차 주사 형광투시법 (나노DSF)에 의해 용융 온도를 결정하였다. 돌연변이의 수 및 그의 상응하는 아미노산 치환은 우측에 열거되어 있다. 유사체는 다양한 열안정성을 나타내며, 다수의 돌연변이가 용융 온도를 증가시키는 상가적 효과를 유발한다.
도 16은 MG WT 및 MG 29의 용융 온도를 측정하기 위해 시차 주사 형광투시법 (DSF)을 사용한 예시적인 데이터를 보여준다. 용융 온도를 모든 유사체에 대해 결정하였으며, 여기에 MG WT (Tm=41.9℃) 및 MG 29 (Tm=55.2℃)의 결과가 도시되어 있다. 일계 도함수의 변곡점이 용융 온도 (Tm)를 나타낸다. 단백질을 이. 콜라이에서 재조합적으로 발현시키고, 측정 전 니켈 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다.
도 17a-17c는 SDS-PAGE에 의해 결정된 단백질 M 유사체의 가용성 분획 평가를 보여준다. 각각의 단백질의 7개 분취물 (0.4 mg/mL)을 37℃에서 다양한 양의 시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 15,000 x G에서 10분 동안 원심분리하여 침전된 단백질을 펠릿화한 후, 가용성 분획을 SDS-PAGE 겔 상에 전개시켰다. 단백질을 평가 전 0, 1, 4, 24, 48, 72 또는 96시간 동안 가열하였다. 결과는 MG WT (a)가 가열 후 1-4시간 사이에 용액으로부터 침전되기 시작한다는 것을 입증한다. MG 27 (b) 및 MG 29 (a)는 72시간 초과 동안 가용성으로 유지되는 반면, MG 31 (b) 및 MG 40 (c)은 24시간 초과 동안 가용성으로 유지된다.
도 18a-18c는 상이한 단백질 M 유사체가 시험관내 중화 검정 동안 풀링된 인간 정맥내 이뮤노글로불린 감마 (IVIG)를 차단하여 AAV2-루시페라제 벡터 중화를 방지하는 것을 보여준다: 1시간 (a 및 b) 또는 24시간 (c) 인큐베이션 동안 4℃ 대 37℃ 열 챌린지의 비교. 4:1 비의 단백질 M 대 IVIG. 루시페라제 활성에 의해 생성된 상대 광 단위를 96-웰 플레이트 포맷에서 삼중으로 수행된 AAV2-루시페라제 리포터 벡터 (2E8 vg)에 의한 형질도입 24시간 후의 세포 배양물로부터 측정하였다. 결과를 단지 AAV2 및 포스페이트 완충 염수 (PBS)만을 함유하는 웰에 대해 정규화하였다 (백색 막대). IVIG (12 μg)와 함께 1시간 동안 인큐베이션된 AAV2는 AAV의 거의 완전한 중화를 나타냈다. 4℃에서 인큐베이션된 단백질 M 유사체 (16 μg)는 AAV 전 1시간 동안 함께 인큐베이션된 경우에 IVIG에 의한 AAV의 중화를 방지하였다. 이를 IVIG 인큐베이션 없이 4℃에서 인큐베이션된 단백질 M 유사체와 비교하였다 (MG 8 및 MG 24에 대해서는 수행되지 않음). MG WT 및 보다 낮은 용융 온도를 갖는 일부 유사체는 유사체가 IVIG와의 인큐베이션 전에 37℃에서 열적으로 챌린지된 경우에 AAV를 중화로부터 보호하지 않은 반면, 보다 높은 Tm을 갖는 다른 유사체는 AAV를 중화로부터 보호하는 능력을 보유하였다. 대부분의 돌연변이 MG 유사체는 1시간 동안 37℃ 챌린지 후에 중화 항체 차단 능력을 보유하였다. 그러나, MG 27, MG 29 및 MG 46은 24시간 동안 37℃ 챌린지 후에 AAV 중화를 방지하였다.
도 19는 MG WT가 1차 AAV 투여 1개월 후 AAV 재투여 동안 NAb를 차단한다는 것을 보여준다. 야생형 C57BL6 암컷 마우스를 AAV8-GFP (1E9 vg)의 복강내 투여를 통해 면역화시키고, 혈청을 1개월 후에 수집하여 시험관내 AAV 중화 항체 역가를 평가하였다. 이어서, 마우스에게 AAV8-루시페라제 리포터 벡터를 근육내로 투여하였으며 (다리당 1E9 vg), 여기서 AAV를 MG WT (다리당 33 μg)와의 단순 혼합물로서 제제화하여 마우스의 우측 다리에 투여하거나 또는 AAV를 비히클 대조군으로서의 포스페이트 완충 염수와 함께 제제화하여 마우스의 좌측 다리에 투여하였다. AAV8-루시페라제 투여 2주 후에 다리 근육의 발광 영상화를 수행하였다. 1:10의 AAV 중화 항체 역가를 갖는 3마리의 마우스는 염수 제제화 다리에서 AAV 루시페라제 리포터 벡터의 중화를 나타낸 반면, 동일한 마우스의 MG WT 제제화 다리에서는 AAV 루시페라제 리포터 벡터가 중화 항체로부터 보호되었다. 염수 다리에서의 AAV의 중화는 MG WT 제제화 다리의 경우보다 80% 더 적은 평균 루시페라제 신호를 생성하였다. 이러한 결과는 이전 AAV 용량에 의해 도출된 중화 항체의 생성 후에 단백질 M을 사용하여 AAV를 성공적으로 재투여할 수 있다는 것을 입증한다.
도 20은 MG 29가 1차 AAV 투여 1개월 후 AAV 재투여 동안 NAb를 차단한다는 것을 보여준다. 야생형 C57BL6 암컷 마우스를 AAV8-GFP (5E8 vg)의 복강내 투여를 통해 면역화시키고, 혈청을 1개월 후에 수집하여 시험관내 AAV 중화 항체 역가를 평가하였다. 이어서, 마우스에게 AAV8-루시페라제 리포터 벡터를 근육내로 투여하였으며 (다리당 2E9 vg), 여기서 AAV를 조작된 유사체 MG 29 (다리당 500 μg)와의 단순 혼합물로서 제제화하여 마우스의 우측 다리에 투여하거나 또는 AAV를 비히클 대조군으로서의 포스페이트 완충 염수와 함께 제제화하여 마우스의 좌측 다리에 투여하였다. AAV8-루시페라제 투여 2주 후에 다리 근육의 발광 영상화를 수행하였다. 각각 1:100 미만의 AAV 중화 항체 역가 (개별적으로 1:8, 1:32 및 1:64)를 갖는 3마리의 마우스는 염수 제제화 다리에서 AAV 루시페라제 리포터 벡터의 중화를 나타낸 반면, 동일한 마우스의 MG 29 제제화 다리에서는 AAV 루시페라제 리포터 벡터가 중화 항체로부터 보호되었다. 염수 다리에서의 AAV의 중화는 MG WT 제제화 다리의 경우보다 적어도 98% 더 적은 평균 루시페라제 신호를 생성하였다. 이러한 결과는 이전 AAV 용량에 의해 도출된 중화 항체의 생성 후에 조작된 단백질 M 유사체를 사용하여 AAV를 성공적으로 재투여할 수 있다는 것을 입증한다.
도 21은 조작된 단백질 M 유사체가 IgG에 대해 상이한 친화도를 나타낸다는 것을 보여준다. 특이적 단백질 M 유사체의 친화도를 생물층 간섭측정법 (BLI)을 사용하여 측정하였다. 결합 상수 (KD)는 15.6 nM - 250 nM의 단백질 M 농도 범위에 걸쳐 회합률 및 해리율 (동역학 분석)을 사용하여 계산한다. 결과는 MG WT와 비교하여 BLI 프로브에 고정된 IgG에 대한 증진된 또는 감소된 친화도를 입증한다.
도 22는 동역학 분석에 의해 생성된 BLI 친화도 데이터의 예를 보여준다. 곡선은 동역학 KD 값을 예측하는데 사용된다. 곡선 피트는 수집된 데이터 상에 오버레이된다.
도 23은 돌연변이체 안정화 성공률을 보여준다. MG WT에 대해 로제타(Rosetta)에 의해 예측된 돌연변이가 증가하였거나 (Tm +1℃), 감소하였거나 (Tm -1℃) 또는 안정성에 대한 효과가 없는 빈도가 제시된다. '조합 돌연변이'는 MG WT를 개별적으로 안정화시킨 돌연변이체 구축물을 병합시킴으로써 제작된 구축물을 나타낸다.
도 24는 MP WT 서열 보존을 보여준다. MP WT의 상동성 모델은 2가지 배향으로 도시되며, BLOSUM62 매트릭스에 따라 MG WT 서열에 대한 보존에 의해 채색된다. 잔기는 보존 정도에 따라 채색되며, 백색 (동일함) 내지 흑색 (유의하게 상이함)의 범위이다. 주형으로서 PDB ID: 4NZR을 사용하여 상동성 모델을 구축하였다.
도 25는 단백질 M DNA 서열의 코돈 최적화가 제조 수율을 증진시킨다는 것을 보여준다. MG WT 단백질을 코딩하는 DNA 플라스미드를 MG281에 천연인 박테리아 코돈 (원래 PM) 또는 박테리아 및 인간 코돈 용법 둘 다에 최적화된 코돈 (최적화된 PM)을 사용하여 생성하였다. 등가 농도의 원래 PM 플라스미드 또는 최적화된 PM 플라스미드에 의해 형질전환된 3개의 풀링된 박테리아 콜로니를 배양하고, 등가의 성장 배지 부피 (10 mL)에서 등가의 밤샘 기간 동안 증식시켰다. 박테리아를 펠릿화하고, 동결 해동 및 등가 부피의 용해 완충제 중에서의 용해에 의해 조 용해물을 생성하였다. 조 용해물을 원심분리하고, SDS-PAGE 겔 상에서의 단백질 분리를 위해 상청액을 수집하였다. 각각의 용해물로부터의 동일 부피를 SDS-PAGE 겔 상에서 전개시키고, 웨스턴 블롯으로 옮긴 다음, MG WT의 아미노 말단에 존재하는 6X 히스티딘 태그에 대한 마우스 항체, 이어서 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 접합된 염소 항-마우스 2차 항체로 프로빙하였다. MG WT 단백질의 밴드 강도를 루미놀 화학발광 검정을 사용하여 측정하였다. 생성된 MG WT 수율을 박테리아 펠릿의 중량에 대해 정규화된 웨스턴 블롯 밴드 강도에 기초하여 계산하였다. 최적화된 PM 플라스미드는 원래 PM 플라스미드와 비교하였을 때 MG WT 단백질 수율의 대략 4배 증가를 생성하였다.
도 26은 돌연변이체의 개선된 pH 안정성을 보여준다. 다양한 pH 조건에서 나노DSF를 사용하여 용융 온도 (Tm)를 결정하였다. 단백질을 SEC를 통해 PBS 중에서 정제하고, 글리신 (pH 2.5 및 3.5), 아세테이트 (pH 4.5 및 5.5) 및 포스페이트 (pH 6.5 및 7.5) 완충제 중으로 완충제-교환하였다.
도 27a-27d는 야생형 엠. 게니탈리움 단백질 M 아미노산 74-479 (서열식별번호: 3) 및 변형된 단백질 M MG1 (서열식별번호: 4), MG8 (서열식별번호: 5), MG13 (서열식별번호: 6), MG15 (서열식별번호: 7), MG21 (서열식별번호: 8), MG22 (서열식별번호: 9), MG23 (서열식별번호: 10), MG24 (서열식별번호: 11), MG27 (서열식별번호: 12), MG28 (서열식별번호: 13), MG29 (서열식별번호: 14), MG31 (서열식별번호: 15), MG33 (서열식별번호: 16), MG38 (서열식별번호: 17), MG40 (서열식별번호: 18), MG43 (서열식별번호: 19), MG44 (서열식별번호: 20), MG45 (서열식별번호: 21) 및 MG46 (서열식별번호: 22)의 서열 정렬을 보여준다.
도 28은 야생형 엠. 게니탈리움 단백질 M 아미노산 74-479 (서열식별번호: 3) 및 엠. 뉴모니아에 단백질 M의 대응 단편 (서열식별번호: 23)의 서열 정렬을 보여준다.
본 발명은 하기에서 보다 상세히 설명된다. 본 설명은 본 발명이 구현될 수 있는 모든 상이한 방식 또는 본 발명에 부가될 수 있는 모든 특색의 세부 카탈로그인 것으로 의도되지는 않는다. 예를 들어, 한 실시양태와 관련하여 예시된 특색은 다른 실시양태에 혼입될 수 있고, 특정한 실시양태와 관련하여 예시된 특색은 그러한 실시양태로부터 삭제될 수도 있다. 추가로, 본 발명에서 벗어나지 않는 본 개시내용에 비추어, 본원에 시사된 다양한 실시양태에 대한 수많은 변형 및 부가가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이다. 따라서, 하기 명세서는 본 발명의 일부 특정한 실시양태를 예시하는 것으로 의도되고, 그의 모든 순열, 조합 및 변형을 철저하게 명시하는 것으로 의도되지는 않는다.
문맥상 달리 나타내지 않는 한, 본원에 기재된 본 발명의 다양한 특색은 임의의 조합으로 사용될 수 있는 것으로 구체적으로 의도된다. 더욱이, 본 발명은 또한 본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 제시된 임의의 특색 또는 특색의 조합이 배제 또는 생략될 수 있다는 것을 고려한다. 예시를 위해, 명세서에서 복합체가 성분 A, B 및 C를 포함하는 것으로 언급된 경우, A, B 또는 C 중 임의의 것 또는 그의 조합은 단독으로 또는 임의의 조합으로 생략 및 비청구될 수 있는 것으로 구체적으로 의도된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 본 발명의 설명에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하려는 목적을 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지는 않는다.
뉴클레오티드 서열은 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 좌측에서 우측으로 5'에서 3' 방향으로 단일 가닥으로만 본원에 제시된다. 뉴클레오티드 및 아미노산은 본원에서 IUPAC-IUB 생화학적 명명 위원회에 의해 권장되는 방식으로 또는 (아미노산의 경우) 1-문자 코드 또는 3-문자 코드로 37 C.F.R. §1.822 및 확립된 용법 둘 다에 따라 나타내어진다.
달리 나타낸 것을 제외하고는, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 방법은 재조합 및 합성 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 생산, 핵산 서열의 조작, 형질전환된 세포의 생산, rAAV 구축물, 변형된 캡시드 단백질, AAV rep 및/또는 cap 서열을 발현하는 패키징 벡터 및 일시적으로 및 안정하게 형질감염된 패키징 세포의 구축에 사용될 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [SAMBROOK et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989); F. M. AUSUBEL et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York)]을 참조한다.
본원에 언급된 모든 공개, 특허 출원, 특허, 뉴클레오티드 서열, 아미노산 서열 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
정의
본 발명의 설명 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "및/또는"은 연관된 열거된 항목 중 1개 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안 ("또는")으로 해석되는 경우에 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
더욱이, 본 발명은 또한 본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 제시된 임의의 특색 또는 특색의 조합이 배제 또는 생략될 수 있다는 것을 고려한다.
추가로, 본 발명의 화합물 또는 작용제의 양, 용량, 시간, 온도 등과 같은 측정가능한 값을 지칭하는 경우에 본원에 사용된 용어 "약"은 명시된 양의 ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5% 또는 심지어 ± 0.1%의 변동을 포괄하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 연결구 "본질적으로 이루어진"은 언급된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "본질적으로 이루어진"은 "포함하는"과 등가인 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 적용된 용어 "로 본질적으로 이루어진" (및 문법적 변형)은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 기능이 실질적으로 변경되지 않도록 언급된 서열 (예를 들어, 서열식별번호) 및 언급된 서열의 5' 및/또는 3' 또는 N-말단 및/또는 C-말단 단부 상의 또는 2개의 단부 사이의 (예를 들어, 도메인 사이의) 총 10개 이하 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 추가의 뉴클레오티드 또는 아미노산 둘 다로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 총 10개 이하의 추가의 뉴클레오티드 또는 아미노산은 함께 부가된 추가의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 총수를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 적용된 용어 "실질적으로 변경된"은 언급된 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 발현 수준과 비교하여 적어도 약 50% 이상의 코딩된 폴리펩티드를 발현하는 능력의 증가 또는 감소를 지칭한다. 본 발명의 폴리펩티드에 적용된 용어 "실질적으로 변경된"은 언급된 서열로 이루어진 폴리펩티드의 활성과 비교하여 적어도 약 50% 이상의 생물학적 활성의 증가 또는 감소를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "파르보바이러스"는 자율-복제 파르보바이러스 및 데펜도바이러스를 포함한 파르보비리다에 과를 포괄한다. 자율 파르보바이러스는 파르보바이러스, 에리트로바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스 및 콘트라바이러스 속의 구성원을 포함한다. 예시적인 자율 파르보바이러스는 마우스의 미세 바이러스, 소 파르보바이러스, 개 파르보바이러스, 닭 파르보바이러스, 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 파르보바이러스, 거위 파르보바이러스, H1 파르보바이러스, 무스코비 오리 파르보바이러스, 뱀 파르보바이러스 및 B19 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 자율 파르보바이러스는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참조한다.
데펜도바이러스 속은 아데노-연관 바이러스 (AAV), 예컨대 비제한적으로 제1형 AAV, 제2형 AAV, 제3형 AAV (제3A형 및 제3B형 포함), 제4형 AAV, 제5형 AAV, 제6형 AAV, 제7형 AAV, 제8형 AAV, 제9형 AAV, 제10형 AAV, 제11형 AAV, 제12형 AAV, 제13형 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 염소 AAV, 뱀 AAV, 말 AAV 및 양 AAV를 함유한다. 예를 들어, 문헌 [FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)] 및 표 1을 참조한다.
본 발명의 문맥에서 용어 "아데노-연관 바이러스" (AAV)는 비제한적으로 제1형 AAV, 제2형 AAV, 제3형 AAV (제3A형 및 제3B형 포함), 제4형 AAV, 제5형 AAV, 제6형 AAV, 제7형 AAV, 제8형 AAV, 제9형 AAV, 제10형 AAV, 제11형 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV 및 양 AAV 및 현재 공지되어 있거나 추후 발견될 임의의 다른 AAV를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참조한다. 다수의 추가의 AAV 혈청형 및 계통군이 확인되었으며 (예를 들어, 문헌 [Gao et al., (2004) J. Virol. 78:6381-6388] 및 표 1 참조), 이는 또한 용어 "AAV"에 포괄된다.
본 발명의 파르보바이러스 입자 및 게놈은 AAV로부터의 것일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 다양한 혈청형의 AAV 및 자율 파르보바이러스의 게놈 서열, 뿐만 아니라 천연 ITR, Rep 단백질 및 캡시드 서브유닛의 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 서열은 문헌 또는 공공 데이터베이스, 예컨대 진뱅크(GenBank)에서 찾아볼 수 있다. 예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 NC_002077, NC_001401, NC_001729, NC_001863, NC_001829, NC_001862, NC_000883, NC_001701, NC_001510, NC_006152, NC_006261, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, AY631966, AX753250, EU285562, NC_001358, NC_001540, AF513851, AF513852 및 AY530579를 참조하며; 이의 개시내용은 파르보바이러스 및 AAV 핵산 및 아미노산 서열 교시에 대해 본원에 참조로 포함된다. 또한, 예를 들어 문헌 [Bantel-Schaal et al., (1999) J. Virol. 73: 939; Chiorini et al., (1997) J. Virol. 71:6823; Chiorini et al., (1999) J. Virol. 73:1309; Gao et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854; Moris et al., (2004) Virol. 33-:375-383; Mori et al., (2004) Virol. 330:375; Muramatsu et al., (1996) Virol. 221:208; Ruffing et al., (1994) J. Gen. Virol. 75:3385; Rutledge et al., (1998) J. Virol. 72:309; Schmidt et al., (2008) J. Virol. 82:8911; Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921; Srivastava et al., (1983) J. Virol. 45:555; Xiao et al., (1999) J. Virol. 73:3994]; 국제 특허 공개 WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; 및 미국 특허 번호 6,156,303을 참조하며; 이의 개시내용은 파르보바이러스 및 AAV 핵산 및 아미노산 서열 교시에 대해 본원에 참조로 포함된다. 또한 표 1을 참조한다. AAV1, AAV2 및 AAV3 ITR 서열의 초기 설명은 문헌 [Xiao, X., (1996), "Characterization of Adeno-associated virus (AAV) DNA replication and integration," Ph.D. Dissertation, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA] (그 전문이 본원에 포함됨)에 제공되어 있다.
"키메라" AAV 핵산 캡시드 코딩 서열 또는 AAV 캡시드 단백질은 2개 이상의 캡시드 서열의 부분을 조합한 것이다. "키메라" AAV 비리온 또는 입자는 키메라 AAV 캡시드 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "향성"은 벡터 (예를 들어, 바이러스 벡터)의 특정 세포 또는 조직 유형(들) 내로의 우선적이지만 반드시 배타적인 것은 아닌 진입 및/또는 특정 세포 또는 조직 유형 내로의 진입을 용이하게 하는 세포 표면과의 우선적이지만 반드시 배타적인 것은 아닌 상호작용, 임의로 및 바람직하게는 세포 내의 벡터 내용물 (예를 들어, 바이러스 게놈)에 의해 보유되는 서열의 발현 (예를 들어, 전사 및 임의로 번역), 예를 들어 재조합 바이러스의 경우에는 이종 뉴클레오티드 서열(들)의 발현을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 예를 들어 유도성 프로모터 또는 달리 조절되는 핵산 서열에 대해, 트랜스-작용 인자의 부재 하에서는 바이러스 게놈으로부터의 이종 핵산 서열의 전사가 개시될 수 없다는 것을 인지할 것이다. rAAV 게놈의 경우에, 바이러스 게놈으로부터의 유전자 발현은 안정하게 통합된 프로바이러스 및/또는 비-통합 에피솜, 뿐만 아니라 바이러스 핵산이 세포 내에서 취할 수 있는 임의의 다른 형태로부터의 것일 수 있다.
용어 "향성 프로파일"은 1개 이상의 표적 세포, 조직 및/또는 기관의 형질도입 패턴을 지칭한다. 키메라 AAV 캡시드의 대표적인 예는 중추 신경계 (CNS) 세포의 효율적인 형질도입과 단지 말초 기관의 낮은 형질도입을 특징으로 하는 향성 프로파일을 갖는다 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,636,370 (McCown et al.) 및 미국 특허 공개 2017/0360960 (Gray et al.) 참조). 특이적 향성 프로파일을 발현하는 벡터 (예를 들어, 바이러스 벡터, 예를 들어 AAV 캡시드)는 그의 향성 프로파일, 예를 들어 신경-향성, 간-향성 등에 대해 "향성"으로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV 벡터)에 의한 세포의 "형질도입"은 바이러스 벡터 내로의 핵산 혼입 및 후속하여 바이러스 벡터를 통한 세포 내 전달에 의한, 세포 내로의 벡터 진입 및 세포 내로의 유전 물질 전달을 의미한다.
표 1
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달리 나타내지 않는 한, "효율적인 형질도입" 또는 "효율적인 향성" 또는 유사한 용어는 적합한 양성 또는 음성 대조군을 참조하여 결정될 수 있다 (예를 들어, 각각 양성 대조군의 형질도입 또는 향성의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과, 또는 각각 음성 대조군의 형질도입 또는 향성의 적어도 약 110%, 120%, 150%, 200%, 300%, 500%, 1000% 또는 그 초과).
유사하게, 적합한 대조군을 참조하여, 바이러스가 표적 조직에 대해 "효율적으로 형질도입하지 않는지" 또는 "효율적인 향성을 갖지 않는지" 또는 유사한 용어가 결정될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 CNS 외부의 조직, 예를 들어 간, 신장, 생식선 및/또는 배세포를 효율적으로 형질도입하지 않는다 (즉, 그에 대한 효율적인 향성을 갖지 않는다). 특정한 실시양태에서, 조직(들) (예를 들어, 간)의 바람직하지 않은 형질도입은 목적하는 표적 조직(들) (예를 들어, CNS 세포)의 형질도입 수준의 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.1% 이하이다.
용어 "5' 부분" 및 "3' 부분"은 2개 이상의 요소 사이의 공간적 관계를 정의하는 상대적 용어이다. 따라서, 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 "3' 부분"은 또 다른 절편의 하류에 있는 폴리뉴클레오티드의 절편을 나타낸다. 용어 "3' 부분"은 절편이 반드시 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 있거나 또는 심지어 반드시 폴리뉴클레오티드의 3' 절반에 있다는 것 (그러할 수 있지만)을 나타내는 것으로 의도되지는 않는다. 마찬가지로, 폴리뉴클레오티드의 "5' 부분"은 또 다른 절편의 상류에 있는 폴리뉴클레오티드의 절편을 나타낸다. 용어 "5' 부분"은 절편이 반드시 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 있거나 또는 심지어 반드시 폴리뉴클레오티드의 5' 절반에 있다는 것 (그러할 수 있지만)을 나타내는 것으로 의도되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 달리 나타내지 않는 한 펩티드 및 단백질 둘 다를 포괄한다.
"폴리뉴클레오티드", "핵산" 또는 "뉴클레오티드 서열"은 RNA, DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드 서열 (자연 발생 및 비-자연 발생 뉴클레오티드 둘 다 포함)일 수 있지만, 바람직하게는 단일 또는 이중 가닥 DNA 서열이다.
용어 "조절 요소"는 핵산 서열의 발현의 일부 측면을 제어하는 유전 요소를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 작동가능하게 연결된 코딩 영역의 전사 개시를 용이하게 하는 조절 요소이다. 다른 조절 요소는 스플라이싱 신호, 폴리아데닐화 신호, 종결 신호 등이다. 1개 이상의 조절 요소가 발견되는 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 내의 영역은 "조절 영역"으로 지칭될 수 있다.
폴리펩티드에 적용된 용어 "단편"은 참조 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 비해 감소된 길이를 가지며, 참조 폴리펩티드 또는 아미노산 서열과 동일한 인접 아미노산의 아미노산 서열을 포함하고/거나, 그로 본질적으로 이루어지고/거나, 그로 이루어진 아미노산 서열을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, 이러한 단편은 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 아미노산 서열의 적어도 약 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200개 또는 그 초과의 연속 아미노산의 길이를 갖는 펩티드를 포함하고/거나, 그로 본질적으로 이루어지고/거나, 그로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 단편은 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 아미노산 서열의 약 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500개 미만의 연속 아미노산의 길이를 갖는 펩티드를 포함하고/거나, 그로 본질적으로 이루어지고/거나, 그로 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 "기능적 단편"은 그 폴리펩티드와 정상적으로 연관된 적어도 1종의 생물학적 활성 (예를 들어, 항체 결합)을 실질적으로 보유하는 것이다. "기능적 단편"은 비변형 폴리펩티드가 갖는 모든 활성을 실질적으로 보유한다. 생물학적 활성을 "실질적으로 보유한다"는 것은, 폴리펩티드가 천연 폴리펩티드의 생물학적 활성의 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과를 보유한다는 것 (및 심지어 천연 폴리펩티드보다 더 높은 수준의 활성을 가질 수 있음)을 의미한다. "비-기능적" 폴리펩티드는 폴리펩티드와 정상적으로 연관된 검출가능한 생물학적 활성을 거의 또는 본질적으로 나타내지 않는 것 (예를 들어, 많아야 단지 유의하지 않은 양, 예를 들어 약 10% 또는 심지어 5% 미만)이다. 생물학적 활성, 예컨대 항체 결합은 관련 기술분야에 널리 공지되고 본원에 기재된 바와 같은 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
핵산과 관련하여 본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 핵산 사이의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 서열은 이종 핵산 서열의 전사를 개시 및/또는 매개하기 때문에 프로모터 서열은 이종 핵산 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 기재될 수 있다. 일부 실시양태에서, 작동가능하게 연결된 핵산 서열은 인접하고/거나 동일한 리딩 프레임 내에 있다.
본원에 사용된 용어 "오픈 리딩 프레임 (ORF)"은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유전자)의 부분을 지칭하고, 폴리펩티드의 전사를 개시하는 개시 출발 부위 (즉, 코작 서열)를 포함한다. 용어 "코딩 영역"은 오픈 리딩 프레임과 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "코돈-최적화된"은 코딩 서열 (예를 들어, 예컨대 단백질 M에 대한 코딩 서열을 포함한 야생형 서열)에 정상적으로 존재하는 1개 이상의 코돈을 동일한 (동의) 아미노산에 대한 코돈으로 치환함으로써 발현을 증가시키도록 최적화된 유전자 코딩 서열을 지칭한다. 이러한 방식으로, 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 동일하지만, 유전자 또는 상응하는 mRNA의 기저 핵염기 서열은 상이하다. 일부 실시양태에서, 최적화는 1개 이상의 희귀 코돈 (즉, 특정한 종으로부터의 세포에서 비교적 드물게 발생하는 tRNA에 대한 코돈)을 보다 빈번하게 발생하는 동의 코돈으로 치환하여 번역 효율을 개선시킨다. 예를 들어, 인간 코돈-최적화에서, 코딩 서열 내의 1개 이상의 코돈이 동일한 아미노산에 대해 인간 세포에서 보다 빈번하게 발생하는 코돈으로 대체된다. 코돈 최적화는 또한 전사 및/또는 번역의 효율을 개선시킬 수 있는 다른 메카니즘을 통해 유전자 발현을 증가시킬 수 있다. 전략은 비제한적으로 총 GC 함량 (즉, 전체 코딩 서열 내의 구아닌 및 시토신의 퍼센트)의 증가, CpG 함량 (즉, 코딩 서열 내의 CG 또는 GC 디뉴클레오티드의 수)의 감소, 잠재 스플라이스 공여자 또는 수용자 부위의 제거, 및/또는 리보솜 진입 및/또는 개시 부위, 예컨대 코작 서열의 부가 또는 제거를 포함한다. 바람직하게는, 코돈-최적화된 유전자는 개선된 단백질 발현을 나타내며, 예를 들어 그에 의해 코딩되는 단백질은 달리 유사한 세포에서 야생형 유전자에 의해 제공되는 단백질의 발현 수준과 비교하여 세포에서 검출가능하게 더 큰 수준으로 발현된다. 코돈-최적화는 또한 시험관내 또는 생체내에서 코돈-최적화된 유전자 및/또는 상응하는 mRNA를 내인성 유전자 및/또는 상응하는 mRNA와 구별하는 능력을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성"은 관련 기술분야에서의 표준 의미를 갖는다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 다수의 상이한 프로그램을 사용하여 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 공지된 서열에 대한 서열 동일성 또는 유사성을 갖는지 여부를 확인할 수 있다. 서열 동일성 또는 유사성은 문헌 [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국부 서열 동일성 알고리즘, 문헌 [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 서열 동일성 정렬 알고리즘, 문헌 [Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현 (위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 내의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 문헌 [Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12:387 (1984)]에 기재된 베스트 피트(Best Fit) 서열 프로그램을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 표준 기술을 사용하여, 바람직하게는 디폴트 설정을 사용하여 또는 검사에 의해 결정될 수 있다.
유용한 알고리즘의 예는 PILEUP이다. PILEUP는 점진적 쌍별 정렬을 사용하여 관련 서열의 군으로부터 다중 서열 정렬을 생성한다. 이는 또한 정렬을 생성하는데 사용된 클러스터링 관계를 나타내는 트리를 플롯팅할 수 있다. PILEUP는 문헌 [Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351 (1987)]의 점진적 정렬 방법의 단순화를 사용하며; 방법은 문헌 [Higgins & Sharp, CABIOS 5:151 (1989)]에 기재된 것과 유사하다.
유용한 알고리즘의 또 다른 예는 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990) 및 Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 (1993)]에 기재된 BLAST 알고리즘이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 문헌 [Altschul et al., Meth. Enzymol., 266:460 (1996)]; blast.wustl/edu/blast/README.html로부터 입수한 WU-BLAST-2 프로그램이다. WU-BLAST-2는, 바람직하게는 디폴드 값으로 설정된 여러 검색 파라미터를 사용한다. 파라미터는 동적 값이고, 특정한 서열의 조성 및 관심 서열이 검색되는 특정한 데이터베이스의 조성에 따라 프로그램 자체에 의해 확립되지만; 값은 감도를 증가시키기 위해 조정될 수 있다.
추가의 유용한 알고리즘은 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389 (1997)]에 보고된 바와 같은 갭 BLAST이다.
백분율 아미노산 서열 동일성 값은 매칭되는 동일한 잔기의 수를 정렬된 영역 내의 "더 긴" 서열의 잔기의 총수로 나눔으로써 결정된다. "더 긴" 서열은 정렬된 영역에서 가장 실제의 잔기를 갖는 것이다 (정렬 점수를 최대화하기 위해 WU-Blast-2에 의해 도입된 갭은 무시됨).
유사한 방식으로, 퍼센트 핵산 서열 동일성은 본원에 구체적으로 개시된 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드 잔기의 백분율로 정의된다.
정렬은 정렬될 서열 내의 갭의 도입을 포함할 수 있다. 추가로, 본원에 구체적으로 개시된 폴리뉴클레오티드보다 더 많거나 또는 더 적은 뉴클레오티드를 함유하는 서열의 경우에, 한 실시양태에서, 서열 동일성의 백분율은 뉴클레오티드의 총수에 대한 동일 뉴클레오티드의 수에 기초하여 결정될 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들어 본원에 구체적으로 개시된 서열보다 더 짧은 서열의 서열 동일성은 한 실시양태에서 더 짧은 서열 내의 뉴클레오티드의 수를 사용하여 결정될 것이다. 퍼센트 동일성 계산에서, 상대적 가중치는 서열 변이의 다양한 징후, 예컨대 삽입, 결실, 치환 등에는 배정되지 않는다.
한 실시양태에서, 단지 동일성만이 양성으로 (+1) 점수화되고, 갭을 포함한 서열 변이의 모든 형태는 "0"의 값으로 배정되며, 이는 서열 유사성 계산에 대해 하기 기재된 바와 같은 가중 척도 또는 파라미터에 대한 필요를 제거한다. 퍼센트 서열 동일성은, 예를 들어 매칭되는 동일한 잔기의 수를 정렬된 영역 내의 "더 짧은" 서열의 잔기의 총수로 나누고 100을 곱함으로써 계산될 수 있다. "더 긴" 서열은 정렬된 영역에서 가장 실제의 잔기를 갖는 것이다.
본원에 사용된 "단리된" 핵산 또는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, "단리된 DNA" 또는 "단리된 RNA")은 자연 발생 유기체 또는 바이러스의 다른 성분, 예를 들어 세포 또는 바이러스 구조적 성분 또는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열과 회합되어 통상적으로 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산 중 적어도 일부로부터 분리되거나 또는 그가 실질적으로 없는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
마찬가지로, "단리된" 폴리펩티드는 자연 발생 유기체 또는 바이러스의 다른 성분, 예를 들어 세포 또는 바이러스 구조적 성분 또는 폴리펩티드와 회합되어 통상적으로 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산 중 적어도 일부로부터 분리되거나 또는 그가 실질적으로 없는 폴리펩티드를 의미한다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 적용된, 본원에 사용된 용어 "변형된"은 1개 이상의 결실, 부가, 치환 또는 그의 임의의 조합으로 인해 야생형 서열과 상이한 서열을 지칭한다.
본원에 사용된, 바이러스 벡터를 "단리하다" (또는 문법적 등가물)는 바이러스 벡터가 출발 물질 내의 다른 성분들 중 적어도 일부로부터 적어도 부분적으로 분리된다는 것을 의미한다.
용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "의 치료" (또는 문법적으로 등가의 용어)는 대상체의 상태의 중증도를 감소시키거나 적어도 부분적으로 개선 또는 호전시키고/거나 적어도 1종의 임상 증상을 완화, 경감 또는 감소시키고/거나 상태의 진행을 지연시키는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "예방하다", "예방한다" 또는 "예방" (및 그의 문법적 등가물)은 질환의 발병을 지연시키거나 억제하는 것을 의미한다. 상기 용어는 질환의 완전한 제거를 요구하는 것으로 의도되지는 않으며, 상태의 발생률을 감소시키거나 상태의 발병을 지연시키기 위한 임의의 유형의 예방적 치료를 포괄한다.
본원에 사용된 "치료 유효량"은 대상체에게 일부 개선 또는 이익을 제공하기에 충분한 양이다. 다르게 말하면, "치료 유효량"은 대상체에서 적어도 1종의 임상 증상의 일부 완화, 경감 또는 안정화를 제공할 양이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 대상체에게 일부 이익이 제공되는 한 치료 효과가 완전하거나 치유적일 필요는 없다는 것을 인지할 것이다.
본원에 사용된 "예방 유효량"은 대상체에서 질환, 장애 및/또는 임상 증상의 발병을 예방 및/또는 지연시키고/거나 본 발명의 방법의 부재 하에 발생할 것에 비해 대상체에서 질환, 장애 및/또는 임상 증상의 발병의 중증도를 감소 및/또는 지연시키기에 충분한 양이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 대상체에게 일부 이익이 제공되는 한 예방 수준이 완전할 필요는 없다는 것을 인지할 것이다.
바이러스와 관련하여 "이종 뉴클레오티드 서열" 또는 "이종 핵산"은 각각 바이러스에서 자연 발생이 아닌 서열 또는 핵산이다. 일반적으로, 이종 핵산 또는 뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드 및/또는 비번역 RNA를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
"벡터"는 외래 유전 물질을 또 다른 세포 내로 운반하는 비히클로서 사용되는 화합물을 지칭하며, 여기서 이는 복제 및/또는 발현될 수 있다. 외래 핵산을 함유하는 클로닝 벡터는 재조합 벡터로 명명된다. 핵산 벡터의 예는 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드, 발현 카세트 및 인공 염색체이다. 재조합 벡터는 전형적으로 복제 기점, 멀티클로닝 부위 및 선택 마커를 함유한다. 핵산 서열은 전형적으로 삽입물 (재조합 핵산 또는 트랜스진) 및 벡터의 "백본"으로서의 역할을 하는 더 큰 서열로 이루어진다. 유전자 정보를 또 다른 세포에 전달하는 벡터의 목적은 전형적으로 표적 세포에서 삽입물을 단리, 증식 또는 발현시키는 것이다. 발현 벡터 (발현 구축물 또는 발현 카세트)는 표적 세포에서의 외인성 유전자의 발현을 위한 것이고, 일반적으로 외인성 유전자/ORF의 발현을 구동하는 프로모터 서열을 갖는다. 바이러스 벡터의 삽입이 종종 형질도입으로 불리지만, 표적 세포 내로의 벡터의 삽입은 박테리아 및 진핵 세포에 대한 형질전환 또는 형질감염으로 지칭된다. 용어 "벡터"는 또한 일반적으로 외래 유전 물질을 또 다른 세포, 예컨대 비제한적으로 형질전환된 세포 또는 나노입자 내로 운반하는 역할을 하는 항목을 기재하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "벡터", "바이러스 벡터", "전달 벡터" (및 유사한 용어)는 구체적 실시양태에서 일반적으로 핵산 전달 비히클로서 기능하고, 비리온 내에 패키징된 바이러스 핵산 (즉, 벡터 게놈)을 포함하는 바이러스 입자를 지칭한다. 본 발명에 따른 바이러스 벡터는 본 발명에 따른 키메라 AAV 캡시드를 포함하고, AAV 또는 rAAV 게놈 또는 바이러스 핵산을 포함한 임의의 다른 핵산을 패키징할 수 있다. 대안적으로, 일부 문맥에서, 용어 "벡터", "바이러스 벡터", "전달 벡터" (및 유사한 용어)는 비리온의 부재 하의 벡터 게놈 (예를 들어, vDNA) 및/또는 캡시드에 테더링되거나 캡시드 내에 패키징된 분자를 전달하기 위한 수송체로서 작용하는 바이러스 캡시드를 지칭하는 것으로 사용될 수 있다.
본 발명의 바이러스 벡터는 추가로 국제 특허 공개 WO 01/92551 (이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 듀플렉스화 파르보바이러스 입자일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이중 가닥 (듀플렉스) 게놈이 패키징될 수 있다.
"재조합 AAV 벡터 게놈" 또는 "rAAV 게놈"은 적어도 1개의 역전된 말단 반복부 (예를 들어, 1, 2 또는 3개의 역전된 말단 반복부) 및 1개 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 게놈 (즉, vDNA)이다. rAAV 벡터는 일반적으로 145개의 염기 말단 반복부(들) (TR(들))를 시스로 보유하여 바이러스를 생성하지만; 부분적으로 또는 완전히 합성인 서열을 포함한 변형된 AAV TR 및 비-AAV TR이 또한 이러한 목적을 제공할 수 있다. 모든 다른 바이러스 서열은 불필요하고, 트랜스로 공급될 수 있다 (Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97). rAAV 벡터는 임의로 2개의 TR (예를 들어, AAV TR)을 포함하며, 이는 일반적으로 이종 뉴클레오티드 서열(들)의 5' 및 3' 말단에 있을 것이지만, 그에 인접할 필요는 없다. TR은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 벡터 게놈은 또한 그의 3' 또는 5' 말단에 단일 ITR을 함유할 수 있다.
용어 "말단 반복부" 또는 "TR"은 헤어핀 구조를 형성하고 역전된 말단 반복부 (ITR)로서 기능하는 (즉, 목적하는 기능, 예컨대 복제, 바이러스 패키징, 통합 및/또는 프로바이러스 구제 등을 매개하는) 임의의 바이러스 말단 반복부 또는 합성 서열을 포함한다. TR은 AAV ITR 또는 비-AAV TR일 수 있다. 예를 들어, 비-AAV TR 서열, 예컨대 다른 파르보바이러스 (예를 들어, 개 파르보바이러스 (CPV), 마우스 파르보바이러스 (MVM), 인간 파르보바이러스 B-19)의 것 또는 SV40 복제 기점으로서의 역할을 하는 SV40 헤어핀이 TR로서 사용될 수 있으며, 이는 말단절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가에 의해 추가로 변형될 수 있다. 추가로, TR은 미국 특허 번호 5,478,745 (Samulski et al.)에 기재된 바와 같은 "이중-D 서열"과 같이 부분적으로 또는 완전히 합성일 수 있다.
파르보바이러스 게놈은 그의 5' 및 3' 말단 둘 다에 회문식 서열을 갖는다. 서열의 회문식 성질은 상보적 염기 쌍 사이의 수소 결합의 형성에 의해 안정화된 헤어핀 구조의 형성으로 이어진다. 이러한 헤어핀 구조는 "Y" 또는 "T" 형상을 채택하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참조한다.
"AAV 역전된 말단 반복부" 또는 "AAV ITR"은 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 또는 현재 공지되어 있거나 추후 발견될 임의의 다른 AAV를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 AAV로부터의 것일 수 있다 (예를 들어, 표 1 참조). AAV ITR은, ITR이 목적하는 기능, 예를 들어 복제, 바이러스 패키징, 통합 및/또는 프로바이러스 구제 등을 매개하는 한, 천연 ITR 서열을 가질 필요가 없다 (예를 들어, 천연 AAV ITR 서열은 삽입, 결실, 말단절단 및/또는 미스센스 돌연변이에 의해 변경될 수 있음).
용어 "rAAV 입자" 및 "rAAV 비리온"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. "rAAV 입자" 또는 "rAAV 비리온"은 AAV 캡시드 내에 패키징된 rAAV 벡터 게놈을 포함한다.
본 발명의 바이러스 벡터는 추가로 국제 특허 공개 WO 00/28004 및 문헌 [Chao et al., (2000) Mol. Therapy 2:619]에 기재된 바와 같은 "표적화된" 바이러스 벡터 (예를 들어, 지시된 향성을 가짐) 및/또는 "하이브리드" 파르보바이러스 (즉, 바이러스 ITR 및 바이러스 캡시드가 상이한 파르보바이러스로부터의 것임)일 수 있다.
추가로, 바이러스 캡시드 또는 게놈 요소는 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함한 다른 변형을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "아미노산"은 임의의 자연 발생 아미노산, 그의 변형된 형태 및 비-자연 발생 아미노산을 포함한 합성 아미노산을 포괄한다.
자연 발생, 좌선성 (L-) 아미노산은 표 2에 제시된다.
표 2
Figure pct00002
대안적으로, 아미노산은 변형된 아미노산 잔기일 수 있거나 (비제한적 예가 표 3에 제시됨) 또는 번역후 변형 (예를 들어, 아세틸화, 아미드화, 포르밀화, 히드록실화, 메틸화, 인산화 또는 황산화)에 의해 변형된 아미노산일 수 있다.
표 3: 아미노산 잔기 유도체
Figure pct00003
추가로, 비-자연 발생 아미노산은 문헌 [Wang et al., (2006) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35:225-49]에 기재된 바와 같은 "비천연" 아미노산일 수 있다. 이들 비천연 아미노산은 유리하게는 관심 분자를 AAV 캡시드 단백질에 화학적으로 연결하는데 사용될 수 있다.
보존적 아미노산 치환은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 특정한 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환은 하기 군 중 1종 이상 내에서의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및/또는 페닐알라닌, 티로신.
용어 "주형" 또는 "기질"은 파르보바이러스 바이러스 DNA를 생산하도록 복제될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭하는 것으로 본원에 사용된다. 벡터 생산의 목적을 위해, 주형은 전형적으로 플라스미드, 네이키드 DNA 벡터, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC) 또는 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, AAV, 바큘로바이러스, 레트로바이러스 벡터 등)를 포함하나 이에 제한되지 않는, 더 큰 뉴클레오티드 서열 또는 구축물 내로 포매될 것이다. 대안적으로, 주형은 패키징 세포의 염색체 내로 안정하게 혼입될 수 있다.
본원에 사용된, 파르보바이러스 또는 AAV "Rep 코딩 서열"은 바이러스 복제 및 새로운 바이러스 입자의 생산을 매개하는 파르보바이러스 또는 AAV 비-구조 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 파르보바이러스 및 AAV 복제 유전자 및 단백질은, 예를 들어 문헌 [Fields et al., Virology, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]에 기재되었다.
"Rep 코딩 서열"은 모든 파르보바이러스 또는 AAV Rep 단백질을 코딩할 필요는 없다. 예를 들어, AAV와 관련하여, Rep 코딩 서열은 모든 4종의 AAV Rep 단백질 (Rep78, Rep 68, Rep52 및 Rep40)을 코딩할 필요는 없으며, 실제로, AAV5는 단지 스플라이싱된 Rep68 및 Rep40 단백질만을 발현하는 것으로 여겨진다. 대표적인 실시양태에서, Rep 코딩 서열은 적어도 바이러스 게놈 복제 및 새로운 비리온 내로의 패키징에 필요한 복제 단백질을 코딩한다. Rep 코딩 서열은 일반적으로 적어도 1종의 대형 Rep 단백질 (즉, Rep78/68) 및 1종의 소형 Rep 단백질 (즉, Rep52/40)을 코딩할 것이다. 특정한 실시양태에서, Rep 코딩 서열은 AAV Rep78 단백질 및 AAV Rep52 및/또는 Rep40 단백질을 코딩한다. 다른 실시양태에서, Rep 코딩 서열은 Rep68 및 Rep52 및/또는 Rep40 단백질을 코딩한다. 추가 실시양태에서, Rep 코딩 서열은 Rep68 및 Rep52 단백질, Rep68 및 Rep40 단백질, Rep78 및 Rep52 단백질 또는 Rep78 및 Rep40 단백질을 코딩한다.
본원에 사용된 용어 "대형 Rep 단백질"은 Rep68 및/또는 Rep78을 지칭한다. 청구된 발명의 대형 Rep 단백질은 야생형 또는 합성일 수 있다. 야생형 대형 Rep 단백질은 혈청형 1, 2, 3a, 3b, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 13 또는 현재 공지되어 있거나 추후 발견될 임의의 다른 AAV를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 파르보바이러스 또는 AAV로부터의 것일 수 있다 (예를 들어, 표 1 참조). 합성 대형 Rep 단백질은 삽입, 결실, 말단절단 및/또는 미스센스 돌연변이에 의해 변경될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 복제 단백질이 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 필요가 없다는 것을 추가로 인지할 것이다. 예를 들어, MVM의 경우, NS-1 및 NS-2 단백질 (스플라이스 변이체임)은 서로 독립적으로 발현될 수 있다. 마찬가지로, AAV의 경우, p19 프로모터는 불활성화될 수 있고, 대형 Rep 단백질(들)은 하나의 폴리뉴클레오티드로부터 발현되고 소형 Rep 단백질(들)은 상이한 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있다. 그러나, 전형적으로, 단일 구축물로부터 복제 단백질을 발현시키는 것이 보다 편리할 것이다. 일부 시스템에서, 바이러스 프로모터 (예를 들어, AAV p19 프로모터)는 세포에 의해 인식되지 않을 수 있고, 따라서 별개의 발현 카세트로부터 대형 및 소형 Rep 단백질을 발현시킬 필요가 있다. 다른 경우에, 대형 Rep 및 소형 Rep 단백질을 개별적으로, 즉 개별 전사 및/또는 번역 제어 요소의 제어 하에 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 대형 대 소형 Rep 단백질의 비를 감소시키도록 대형 Rep 단백질의 발현을 제어하는 것이 바람직할 수 있다. 곤충 세포의 경우에, 세포에 대한 독성을 피하기 위해 대형 Rep 단백질 (예를 들어, Rep78/68)의 발현을 하향-조절하는 것이 유리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Urabe et al., (2002) Human Gene Therapy 13:1935] 참조).
본원에 사용된 파르보바이러스 또는 AAV "cap 코딩 서열"은 기능적 파르보바이러스 또는 AAV 캡시드를 형성하는 (즉, DNA를 패키징하고 표적 세포를 감염시킬 수 있는) 구조 단백질을 코딩한다. 전형적으로, cap 코딩 서열은 모든 파르보바이러스 또는 AAV 캡시드 서브유닛을 코딩할 것이지만, 기능적 캡시드가 생산되는 한 모두보다 적은 캡시드 서브유닛이 코딩될 수 있다. 반드시는 아니지만 전형적으로, cap 코딩 서열은 단일 핵산 분자 상에 존재할 것이다.
자율 파르보바이러스 및 AAV의 캡시드 구조는 문헌 [BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]에 보다 상세히 기재되어 있다.
특성을 "실질적으로 보유한다"는 것은, 특성 (예를 들어, 활성 또는 다른 측정가능한 특징)의 적어도 약 75%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 보유한다는 것을 의미한다.
항체에 결합하는 단백질 M 및 그의 유도체의 사용 방법
본 발명의 한 측면은 대상체에게 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 이종 작용제의 중화를 억제하는 것을 포함하는, 대상체에 대한 이종 작용제의 투여시 중화 항체에 의한 이종 작용제의 중화를 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 (a) 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 코딩하는 핵산 전달 벡터 및 (b) 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 대상체에서 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 발현시키는 것을 포함하는, 대상체에서 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 발현시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 대상체에게 (a) 유전자 편집 복합체 및 (b) 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 대상체에서 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 발현시키는 것을 포함하는, 대상체에서 유전자를 편집하는 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "이종 작용제"는 작용제가 투여될 대상체에서 자연적으로 발견되지 않는 작용제를 지칭한다. 상기 용어는 또한 대상체에서 자연적으로 발견되는 작용제의 재조합 또는 합성 버전을 포함한다. 이종 작용제는 이종 작용제의 투여 전 대상체에 그에 대한 중화 항체가 존재하는 것 또는 대상체에 대한 투여시 중화 항체를 생성할 가능성이 있는 것일 수 있다. 이종 작용제는 대상체에게 결코 투여되지 않은 것일 수 있다. 이종 작용제는 대상체에게 이전에 투여된 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "중화 항체"는 이종 작용제가 대상체에게 투여된 후에 이종 작용제에 특이적으로 결합하여 그의 1종 이상의 생물학적 활성을 억제하는 항체를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 이종 작용제는 핵산 전달 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 알파바이러스, 바큘로바이러스, 백시니아 바이러스, 헤르페스 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 또는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 비-바이러스 벡터는 플라스미드, 리포솜, 전기적으로 하전된 지질, 핵산-단백질 복합체 또는 생체중합체이다.
일부 실시양태에서, 이종 작용제는 유전자 편집 복합체, 예를 들어 CRISPR 복합체이다.
일부 실시양태에서, 이종 작용제는 단백질 또는 핵산이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 효소, 조절 단백질 또는 구조 단백질, 예를 들어 대상체 내 누락 또는 결함 단백질을 대체할 수 있는 것이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 기능적 핵산, 예를 들어 안티센스 핵산 또는 억제 RNA이다.
단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 유효량은 중화 항체에 의한 이종 작용제의 억제를 적어도 부분적으로 차단하는 양이다. 일부 실시양태에서, 단백질 M의 유효량은 중화를 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, 99.5% 또는 99.9%만큼 억제하기에 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 유효량은 대상체에서 몰 기준으로 약 0.5:1 내지 약 8:1 또는 그 안의 임의의 범위, 예를 들어 약 0.5:1, 1:1, 1.5:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5.5:1, 6:1, 6.5:1, 7:1, 7.5:1 또는 8:1 또는 그 안의 임의의 범위의 단백질 M 대 총 이뮤노글로불린의 비를 생성하기에 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 비는 약 0.5:1 내지 약 6:1, 약 0.5:1 내지 약 4:1, 약 0.5:1 내지 약 2.5:1, 약 0.5:1 내지 약 2:1, 약 1:1 내지 약 8:1, 약 1.5:1 내지 약 8:1, 또는 약 2:1 내지 약 8:1이다. 한 실시양태에서, 비는 약 1:1 내지 약 3:1, 예를 들어 약 2:1이다. 총 이뮤노글로불린은 총 혈청 이뮤노글로불린일 수 있다 (예를 들어, 단백질 M의 전신 투여의 경우). 총 이뮤노글로불린은 국부 유체 또는 조직 내의 총 수준일 수 있다 (예를 들어, 눈, 귀, 폐, 뇌, 근육, 관절 등으로의 특이적 전달의 경우). 총 이뮤노글로불린은 관련 기술분야에 공지된 기술에 의해, 예컨대 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 결합하는 항체를 사용하여 또는 이뮤노글로불린에 결합하는 단백질 A 또는 G를 사용하여 혈청에 대한 ELISA를 수행함으로써 측정될 수 있다. 추가적으로, 마우스의 경우, 그의 혈청은 5 mg/ml 내지 10 mg/ml 이뮤노글로불린을 함유하는 것으로 공지되어 있다. 인간에서 혈청 이뮤노글로불린에 대한 정상 범위는 8-10 mg/ml이다. 생체내 추정을 위해, 10 mg/ml의 상한을 사용하여 비를 계산할 수 있다. 국부 이뮤노글로불린 함량은 조직 중량 (1 kg 중량당 40 mL의 혈청) 또는 특정 체액 중 Ig의 농도 및 그 기관에서의 체액 부피가 혈청보다 더 적은 경우 (예를 들어, 눈, 뇌척수액) 그 부피에 기초하여 추정될 수 있다.
단백질 M은 중화 항체에 의한 이종 작용제의 억제를 차단하는데 효과적인 것으로 밝혀진 임의의 스케줄에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 이종 작용제의 투여 전, 예를 들어 이종 작용제의 투여 적어도 약 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50분 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18 또는 24시간 전에 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 이종 작용제의 투여와 공동으로 대상체에게 투여된다. 본원에 사용된 용어 "공동으로"는 조합된 효과를 생성하기에 충분히 가까운 것을 의미한다 (즉, 공동으로는 동시에일 수 있거나 또는 2개 이상의 사건이 서로의 전 또는 후 짧은 기간 내에 발생하는 것일 수 있음).
일부 실시양태에서, 이종 작용제는 대상체에 대한 투여 전에 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체와 조합되며, 예를 들어 2종의 성분은 단일 조성물로의 투여 전에 함께 혼합된다. 이종 작용제는 대상체에 대한 투여 적어도 약 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50분 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18 또는 24시간 전에 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체와 조합될 수 있다. 다른 실시양태에서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체 및 이종 작용제는 개별 조성물로 투여된다.
일부 실시양태에서, 치료 효과 또는 달리 유익한 효과를 제공하기 위해 대상체에게 이종 작용제 및/또는 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 1회 초과로 투여하는 것이 필요할 수 있다. 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는, 예를 들어 1, 2, 3, 4회 또는 그 초과로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 이종 작용제가 대상체에게 투여될 때마다 매회, 예를 들어 상기 기재된 바와 동일한 방식으로, 예를 들어 이종 작용제 전에 또는 이종 작용제와 공동으로 대상체에게 투여된다. 이종 작용제의 각각의 투여와 함께 단백질 M의 사용은 이종 작용제에 대한 NAb의 효과를 억제할 수 있으며, 이는 종종 재투여시에 문제가 된다. 일부 실시양태에서, 동일한 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체가 매회 투여된다. 다른 실시양태에서, 상이한 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체, 예를 들어 하기에 추가로 기재된 바와 같은 상이한 변형된 단백질 M이 매회 투여된다. 이론에 얽매이지는 않지만, 각각의 투여에서 상이한 단백질 M 유도체의 사용은 동일한 단백질의 재투여로 발생할 수 있는 단백질 M에 대한 억제 항체의 효과를 제한할 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 포화 용량의 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 투여는 단백질 M에 대한 임의의 억제 항체를 능가하고 항원 인식을 방지할 것으로 생각된다.
항체에 비-특이적으로 결합하는 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 능력은 유리하게는 항원에 대한 항체 결합을 억제하는 것이 유익한 경우, 예를 들어 면역억제가 바람직한 경우 또는 과량의 항체가 존재하는 경우인 다른 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 자가면역 질환을 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "자가면역 질환"은 자가면역 반응과 연관된 임의의 장애를 지칭한다. 예는 비제한적으로 다발성 경화증, 크론병, 궤양성 결장염, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 염증성 장 증후군, 과민성 장 증후군, 포도막염, 인슐린-의존성 당뇨병, 용혈성 빈혈, 류마티스성 열, 굿패스쳐 증후군, 길랑-바레 증후군, 건선, 갑상선염, 그레이브스병, 중증 근무력증, 사구체신염 및 자가면역 간염을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 과량의 항체와 연관된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 과량의 항체와 연관된 장애를 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 과량의 항체와 연관된 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "과량의 항체와 연관된 장애"는 장애의 원인 또는 적어도 1종의 증상이 혈액 내 또는 신체 내 다른 곳에서의 항체의 평균 수준 초과로 인한 것인 임의의 장애를 지칭한다. 예는 비제한적으로 다발성 골수종, 의미 불명의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS) 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 포함한다. 방법은 또한 자가면역 사건, 예컨대 시토카인 방출 증후군 또는 급성 자가면역 발작, 예컨대 돌연 발병하는 중증 자가면역 혈관염을 신속하게 정지시키거나 또는 항체 매개된 면역 복합체 형성에 의해 유발된 이식 조직에 대한 손상을 방지하기 위한 모든 항체의 급성 차단에 유용할 수 있다.
본 발명의 임의의 방법에 대해, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 효과적인 것으로 밝혀진 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 가장 적합한 경로는 치료될 대상체 및 치료될 장애 또는 상태에 좌우될 것이다. 일부 실시양태에서, 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입 (예를 들어, 에어로졸을 통해), 협측 (예를 들어, 설하), 질, 척수강내, 안내, 유리체내, 와우내, 경피, 내피내, 자궁내 (또는 난소내), 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 두개내, 근육내 [골격근, 횡경막 근육 및/또는 심장 근육으로의 투여 포함], 흉막내, 뇌내 및 관절내), 국소 (예를 들어, 기도 표면을 포함한 피부 및 점막 표면 둘 다로의 투여 및 경피 투여), 림프내 등, 뿐만 아니라 직접 조직 또는 기관 주사 (예를 들어, 간, 눈, 골격근, 심장 근육, 횡경막 근육 또는 뇌로의 주사)로부터 선택된 경로에 의해 대상체에게 투여된다.
단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 대상체의 임의의 조직 또는 기관에 전달 또는 표적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는, 예를 들어 골격근, 평활근, 심장, 횡경막, 기도 상피, 간, 신장, 비장, 췌장, 피부, 폐, 귀 및 눈에 투여된다. 일부 실시양태에서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 이환 조직 또는 기관, 예를 들어 종양에 투여된다.
일부 실시양태에서, 이종 작용제 및 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 동일한 경로에 의해 투여된다. 다른 실시양태에서, 이종 작용제 및 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 상이한 경로에 의해 투여되며, 예를 들어 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 정맥내로 투여되고, 이종 작용제는 표적 조직 또는 기관에 국부로 투여된다.
임의의 상기 방법은 대상체에게 대상체 내 항체 농도를 감소시키거나 항체 기능을 억제하기 위한 추가의 치료를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 치료는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법일 수 있고 비제한적으로 혈장분리반출술, 항체 소화 효소, 예컨대 IdeS 또는 IdeZ의 투여, 비장절제술, 면역억제 약물 (예를 들어, 코르티코스테로이드 (예를 들어, 프레드니손, 부데소니드, 프레드니솔론), 야누스 키나제 억제제 (예를 들어, 토파시티닙), 칼시뉴린 억제제 (예를 들어, 시클로스포린, 타크롤리무스), mTOR 억제제 (예를 들어, 시롤리무스, 에베롤리무스), IMDH 억제제 (예를 들어, 아자티오프린, 레플루노미드, 미코페놀레이트) 또는 생물제제 (예를 들어, 아바타셉트, 아달리무맙, 아나킨라, 세르톨리주맙, 에타네르셉트, 골리무맙, 인플릭시맙, 익세키주맙, 나탈리주맙, 리툭시맙, 세쿠키누맙, 토실리주맙, 우스테키누맙, 베돌리주맙, 바실릭시맙, 다클리주맙)의 투여, 또는 B 세포를 억제 또는 파괴하도록 설계된 치료 (예를 들어, 화학요법, 면역요법, 방사선 요법)를 포함한다. 추가의 치료는 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 투여 전에, 그 동안 및/또는 그 후에 투여될 수 있다.
항체에 비-특이적으로 결합하는 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 능력은 유리하게는 정제 방법에 사용될 수 있다. 항체의 정제는 종종 항체의 Fc 영역에 결합하는 작용제 (예컨대 단백질 A 및 단백질 G)에 의존하지만, 단백질 M은 항체의 가변 영역에 비-특이적으로 결합한다. 따라서, 단백질 M은 Fc 영역을 함유하지 않는 항체 단편 및 항체 유도체 (예컨대, 단일 쇄 가변 단편) 및 항체 가변 영역을 포함하는 다른 분자를 단리하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 항체 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 화합물을 고체 지지체에 부착된 본 발명의 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편과 접촉시킨 다음, 화합물을 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편으로부터 용리시키는 것을 포함하는, 항체 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 화합물을 샘플로부터 단리하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 항체 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 화합물은 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 화합물은 항체 유도체, 이뮤노글로불린 스캐폴드 등이다. 본 발명의 변형된 단백질 M 또는 그의 기능적 단편은 증가된 열안정성으로 인해 야생형 단백질 M보다 유리하다. 이는 단백질 M이 다중 정제를 위해 재사용가능하도록 하고, 야생형 단백질 M을 탈안정화시킬 용리 조건의 사용을 허용한다.
방법은 친화도 정제 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 고체 지지체는 친화도 크로마토그래피 또는 배치 정제에 적합한 임의의 물질일 수 있다. 적합한 물질은 비제한적으로 아가로스, 폴리아크릴아미드, 덱스트란, 셀룰로스, 폴리사카라이드, 니트로셀룰로스, 실리카, 알루미나, 산화알루미늄, 티타니아, 산화티타늄, 지르코니아, 스티렌, 폴리비닐디플루오라이드 나일론, 스티렌과 디비닐벤젠의 공중합체, 폴리메타크릴레이트 에스테르, 유도체화 아즐락톤 중합체 또는 공중합체, 유리 또는 셀룰로스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 수지이다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 비드 또는 입자이다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는, 예를 들어 플레이트, 바이알 또는 칼럼의 표면이다.
접촉 단계는 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어 칼럼에서 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 위로 화합물을 포함하는 샘플을 통과시키거나 또는 용기 또는 플레이트의 웰에서 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편과 함께 화합물을 포함하는 조성물을 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 접촉 단계는 화합물이 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편에 결합하도록 하기에 충분한 양의 시간 동안 수행될 수 있다. 샘플 중 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편에 결합된 화합물을 다른 성분으로부터 세척하거나, 원심분리하거나 또는 다른 형태의 분리를 수행한 후에, 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편으로부터 화합물이 용리된다. 용리는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 이온 농도, 온도 등의 변화에 의해 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 용리는 pH의 변화에 의해 수행된다. 본 발명의 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편은 유리하게는 야생형 단백질 M보다 더 폭넓은 범위의 pH에 걸쳐 안정하다. 이는 변형된 단백질 M이 화합물의 용리를 허용하는 더 낮은 pH에서 안정하게 유지되도록 한다.
일부 실시양태에서, 접촉 단계는 결합 완충제 (예를 들어, 중성 pH) 중에서 수행되고, 용리는 저 pH 완충제 (예를 들어, 0.1 M 글리신 pH 2-3.5 또는 0.1 M 아세테이트 pH 3.5-4.5)를 사용하여 중화 완충제 (예를 들어, 고-이온 강도 알칼리성 완충제, 예컨대 pH 8-9의 1 M 포스페이트 또는 1 M 트리스) 중으로 수행된다.
본 발명의 추가 측면은 상기 기재된 바와 같은 고체 지지체에 부착된 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편에 관한 것이다. 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있으며, 예를 들어 링커 분자를 사용하여, 예를 들어 공유 연결될 수 있다.
항체에 비-특이적으로 결합하는 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 능력은 유리하게는 항체 또는 그의 단편 또는 유도체에 결합시키는 단계를 수반하는 임의의 면역검정에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 본 발명의 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편을 사용하여 항체 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 화합물에 결합시키는 것을 포함하는, 면역검정을 수행하는 방법에 관한 것이다.
변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편은 임의의 일반적 또는 특이적 항체 결합 분자, 예를 들어 단백질 A, 단백질 G 또는 2차 항체를 대체할 수 있다. 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편은 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 예를 들어 방사성, 화학발광 또는 효소적 검출을 위해 표지될 수 있다.
면역검정의 예는 비제한적으로 방사선-면역검정 (RIA), 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA) 검정, 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 검정, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 검정, 응집 검정, 면역형광 검정, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 검정, 면역조직화학 검정, 단백질 A 면역검정, 단백질 G 면역검정, 단백질 L 면역검정, 비오틴/아비딘 검정, 비오틴/스트렙타비딘 검정, 면역전기영동 검정, 침전/응집 반응, 이뮤노블롯 (웨스턴 블롯; 도트/슬롯 블롯); 면역확산 검정; 리포솜 면역검정, 화학발광 검정, 라이브러리 스크린, 발현 어레이, 면역침전, 경쟁적 결합 검정 및 면역조직화학적 염색을 포함한다.
단백질 M 및 그의 유도체
본 발명의 방법에 사용되는 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 항체에 결합하는 단백질 M을 생산하는 임의의 미코박테리아 종으로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 미코플라스마 게니탈리움(Mycoplasma genitalium), 미코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae) 또는 미코플라스마 페네트란스(Mycoplasma penetrans)로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 PCT 공개 번호 WO 2014/014897 및 미국 공개 번호 2017/0320921 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 단백질 M 서열 중 임의의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 엠. 게니탈리움 단백질 M (MG281, 서열식별번호: 1) 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체 (예를 들어, 서열식별번호: 3에 제시된 단편 또는 그의 유도체)이다. 일부 실시양태에서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (MPN400, 서열식별번호: 23) 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체 (예를 들어, 서열식별번호: 24에 제시된 단편 또는 그의 유도체)이다. 일부 실시양태에서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 단백질 M 단편 또는 단편의 유도체, 예를 들어 막횡단 도메인을 함유하지 않고/거나 C-말단을 함유하지 않는 단편, 예를 들어 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 대략 아미노산 잔기 17-537, 37-556, 37-482, 37-468, 37-442, 74-468, 74-479, 74-482, 74-468, 74-442 또는 74-556 또는 또 다른 단백질 M으로부터의 대응 잔기를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진 기능적 단편이다. 열거된 단편 각각의 말단에 적용된 용어 "대략"은 말단 잔기 중 하나 또는 둘 다가 언급된 잔기의 어느 한 측면에서 작은 정도로, 예를 들어 약 5, 4, 3 또는 2개 아미노산만큼 달라질 수 있다는 것을 의미한다. 또 다른 단백질 M으로부터의 대응 잔기는 엠. 게니탈리움 단백질 M과 다른 단백질 M 사이의 서열 정렬을 수행함으로써 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 도 27은 야생형 엠. 게니탈리움 단백질 M 아미노산 74-479 (서열식별번호: 3) 및 엠. 뉴모니아에 단백질 M의 대응 단편 (서열식별번호: 24)의 서열 정렬을 보여준다. 일부 실시양태에서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 N-말단 6-His 태그에 이어서 트롬빈 절단 부위를 갖는 가용성 형태의 단백질 M (서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 37-556)인 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진다.
본원에 사용된 용어 "유도체"는 자연 발생 폴리펩티드에 대한 부차적 변형에 의해 자연 발생 단백질 M 또는 단백질 M 기능적 단편과 상이하지만, 단백질 M의 생물학적 활성을 유의하게 보유하는 폴리펩티드를 지칭하는 것으로 사용된다. 부차적 변형은 비제한적으로 1개 또는 소수의 아미노산 측쇄에서의 변화, 1개 또는 소수의 아미노산에 대한 변화 (결실, 삽입 및/또는 치환 포함), 1개 또는 소수의 원자의 입체화학에서의 변화 (예를 들어, D-아미노산), 및 부차적 유도체화, 예컨대 비제한적으로 메틸화, 글리코실화, 인산화, 아세틸화, 미리스토일화, 프레닐화, 팔미테이트화, 아미드화 및 글리코실포스파티딜 이노시톨의 부가를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "실질적으로 보유하다"는 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 다른 변이체가 자연 발생 폴리펩티드의 활성 (예를 들어, 항체 결합)의 적어도 약 20%, 예를 들어 약 30%, 40%, 50% 또는 그 초과를 보유하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단백질 M 또는 단백질 M 기능적 단편의 유도체는 20개 이하의 아미노산 잔기의 돌연변이 (임의의 조합으로 결실, 삽입 및/또는 치환), 예를 들어 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 돌연변이를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단백질 M 유도체는 엠. 뉴모니아에 단백질 M의 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열 또는 또 다른 미코플라스마 단백질 M의 야생형 서열 또는 그의 기능적 단편에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 단부에 차단제를 부가하여 생체내 관련 폴리펩티드의 생존을 용이하게 함으로써 생체내 사용을 위해 변형될 수 있다. 이는 펩티드 말단이 프로테아제에 의해 분해되는 경향이 있는 상황에서 유용할 수 있다. 이러한 차단제는 비제한적으로 투여될 단백질의 아미노 및/또는 카르복실 말단 잔기에 부착될 수 있는 추가의 관련 또는 비관련 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 이는 단백질의 합성 동안 화학적으로 또는 재조합 DNA 기술에 의해 평균의 기술을 가진 통상의 기술자에게 친숙한 방법에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 차단제, 예컨대 피로글루탐산 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 분자가 아미노 및/또는 카르복실 말단 잔기에 부착될 수 있거나, 또는 아미노 말단에서의 아미노 기 또는 카르복실 말단에서의 카르복실 기가 상이한 모이어티로 대체될 수 있다. 마찬가지로, 단백질은 투여 전에 제약상 허용되는 "담체" 단백질에 공유 또는 비공유 커플링될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 단백질 M 유도체는 단백질 M의 열안정성을 증가시키거나 적어도 유지하는 돌연변이를 포함하는 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편이다. 이들 변형된 단백질 M 유도체는 생체내 방법 및 야생형 단백질 M이 변성될 수 있는 승온 (예를 들어, 약 37℃)을 요구하는 다른 방법에서 사용하기에 증가된 적합성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 단백질 M 유도체는 야생형 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편에 비해 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편의 열안정성을 증가시키거나 유지하는 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편이다. 일부 실시양태에서, 변형된 단백질 M 또는 그의 기능적 단편은 야생형 단백질 M 또는 그의 기능적 단편의 Tm보다 적어도 0.5℃, 예를 들어 0.5℃, 1.0℃, 1.5℃, 2.0℃, 2.5℃, 3.0℃, 3.5℃, 4.0℃, 4.5℃, 5.0℃, 5.5℃, 6.0℃, 6.5℃, 7.0℃, 7.5℃, 8.0℃, 8.5℃, 9.0℃, 9.5℃, 10.0℃, 11.0℃, 12.0℃, 13.0℃, 14.0℃, 15.0℃, 16.0℃, 17.0℃, 18.0℃, 19.0℃, 20.0℃ 또는 그 초과 더 높은 증가된 용융 온도 (Tm)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 단백질 M 또는 그의 기능적 단편은 야생형 단백질 M 또는 그의 기능적 단편의 Tm에 비해 유지되는 (즉, 0.5℃ 이내인) Tm을 갖는다. Tm은 시차 주사 형광투시법 또는 임의의 다른 적합한 기술에 의해 측정될 수 있다. 야생형 미코플라스마 게니탈리움 단백질 M의 Tm은 약 41.9℃이고, 야생형 미코플라스마 뉴모니아에 단백질 M의 Tm은 약 44.1℃이다.
일부 실시양태에서, 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 또는 그 초과의 돌연변이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편은 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2개 또는 그 미만의 돌연변이를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편은 미코플라스마 게니탈리움 또는 미코플라스마 뉴모니아에의 단백질 M으로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편은 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 3)의 대략 잔기 74 (예를 들어, 잔기 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79) 내지 대략 잔기 479 (예를 들어, 잔기 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484) 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 24)의 대응 잔기의 단편이다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 열안정성에 영향을 미치는 것으로 공지된 단백질 M의 부분에 위치한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 단백질 M의 생물학적 활성에서 다른 역할을 갖는 것으로 공지된 단백질 M의 부분에는 위치하지 않는다. 한 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 단백질 M의 항체-결합 부위의 5 Å 이내의 잔기 (즉, 잔기 95, 99, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 114, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 158, 160, 161, 162, 163, 177, 178, 179, 180, 181, 186, 187, 188, 191, 321, 338, 340, 341, 345, 381, 384, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 426, 427, 429, 436, 438, 439, 440, 441, 442, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 452, 453, 455, 456, 457, 462, 466) 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재하지 않는다. 한 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 단백질 M의 항체-결합 부위의 5 Å 이내의 잔기 (즉, 잔기 100, 104, 107, 108, 110, 111, 112, 114, 115, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 149, 163, 165, 166, 167, 168, 182, 183, 184, 185, 186, 192, 193, 196, 337, 338, 354, 356, 357, 399, 402, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 442, 443, 445, 454, 455, 456, 457, 458, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 468, 469, 472, 473, 478)에 존재하지 않는다. 한 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기 469-479 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기 중 임의의 것에 존재하지 않는다.
본 발명자들은 컴퓨터 분석을 사용하여, 돌연변이된 경우 단백질의 Tm을 증가시키거나 유지할 것으로 예측되는 단백질 M 내의 잔기를 확인하였다. 따라서, 일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기 78, 81, 83, 84, 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 96, 97, 100, 101, 108, 111, 112, 113, 122, 123, 125, 126, 127, 128, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 139, 141, 142, 146, 147, 148, 149, 150, 153, 154, 155, 156, 164, 167, 170, 175, 176, 184, 185, 189, 192, 193, 196, 198, 201, 202, 204, 205, 206, 207, 209, 211, 215, 218, 220, 224, 225, 226, 227, 231, 232, 234, 235, 236, 237, 239, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 264, 269, 270, 272, 274, 275, 276, 279, 282, 284, 286, 287, 288, 291, 297, 299, 300, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 313, 317, 318, 319, 320, 322, 326, 327, 329, 331, 332, 333, 335, 337, 342, 343, 347, 348, 351, 354, 355, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 367, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 378, 385, 399, 400, 401, 402, 405, 406, 407, 408, 409, 411, 413, 414, 417, 418, 419, 424, 428, 434, 435, 443, 450, 459, 460, 463, 464, 465, 468 또는 그의 임의의 조합 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 표 4에 열거된 돌연변이 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 잔기 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 109, 113, 116, 117, 118, 120, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 164, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 187, 188, 189, 190, 191, 194, 195, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 355, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 400, 401, 403, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 444, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 459, 466, 467, 470, 471, 474, 475, 476, 477, 479, 480, 481, 482, 483, 484 또는 그의 임의의 조합에 존재한다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기 83, 90, 92, 94, 137, 142, 147, 150, 156, 184, 196, 198, 205, 211, 215, 225, 231, 232, 234, 235, 236, 237, 239, 243, 245, 250, 255, 256, 259, 264, 272, 274, 275, 276, 279, 282, 297, 300, 302, 310, 320, 326, 331, 332, 335, 342, 343, 347, 348, 355, 357, 361, 371, 374, 378, 385, 401, 402, 409, 413, 424, 460, 463, 464, 468 또는 그의 임의의 조합 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 표 5에 열거된 돌연변이 또는 그의 임의의 조합이다.
본 발명자들은 예측된 잔기 목록으로부터의 수많은 돌연변이를 단독으로 또는 높은 성공률의 증가된 열안정성 (안정화 돌연변이) 또는 적어도 유지되는 열안정성 (중성 돌연변이)과 조합하여 제조하고 시험하였다. 시험된 점 돌연변이의 79%가 안정화 또는 중성이라는 것을 보여주는 도 23을 참조한다. 데이터는 Tm을 증가시키는 점 돌연변이의 조합이 훨씬 더 높은 Tm을 갖는 변형된 단백질 M을 생산하는 경향이 있다는 것을 추가로 보여준다 (도 15a 참조).
따라서, 일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 단독으로 또는 다른 돌연변이와 조합되어 Tm을 증가시키는 것으로 입증된 잔기에 존재하며, 예를 들어 여기서 1개 이상의 돌연변이는 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기 150, 196, 198, 201, 205, 224, 232, 237, 274, 282, 342, 355, 373, 400, 402, 407, 409, 413, 135 또는 그의 임의의 조합 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재한다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 하기 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기:
a) 237 (MG1);
b) 232 (MG8);
c) 282 (MG13);
d) 150, 196, 198, 400, 402, 407, 409 (MG15);
e) 413, 435 (MG21);
f) 373, 400 (MG22);
g) 402, 407, 409, 413 (MG23);
h) 342 (MG24);
i) 150, 196, 198, 232, 237, 282, 342, 373, 400, 402, 407, 409, 413, 435 (MG27);
j) 274 (MG28);
k) 150, 196, 198, 232, 237, 342, 400, 402, 407, 409 (MG29);
l) 373, 413, 435 (MG31);
m) 205 (MG33);
n) 355 (MG38, MG40);
o) 150, 196, 198, 342, 373, 400, 402, 407, 409 (MG43);
p) 150, 196, 198, 232, 237, 342, 373, 400, 402, 407, 409 (MG44);
q) 201, 224 (MG45);
r) 150, 196, 198, 201, 224, 232, 237, 342, 400, 402, 407, 409 (MG46);
s) 150, 196, 198, 232, 237, 342, 390, 400, 402, 407, 409, 444 (MG47);
t) 150, 196, 198, 201, 205, 224, 232, 237, 274, 342, 355, 400, 402, 407, 409 (MG48); 또는
u) 150, 196, 198, 232, 237, 342, 391, 400, 402, 407, 409 (MG49)
로부터 선택된 잔기 또는 잔기의 조합 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재한다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 하기 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기:
a) F237T (MG1);
b) S232Q (MG8);
c) Q282D (MG13);
d) S150E, S196R, S198P, V400I, N402I, K407P, S409V (MG15);
e) L413I, T435I (MG21);
f) V373I, V400I (MG22);
g) N402L, K407P, S409V, L413I (MG23);
h) A342V (MG24);
i) S150E, S196R, S198P, S232Q, F237T, Q282D, A342V, V373I, V400I, N402I, K407P, S409V, L413I, T435I (MG27);
j) N274D (MG28);
k) S150E, S196R, S198P, S232Q, F237T, A342V, V400I, N402I, K407P, S409V (MG29);
l) V373I, L413I, T435I (MG31)
m) A205P (MG33);
n) T355D (MG38);
o) T355P (MG40);
p) S150E, S196R, S198P, A342V, V373I, V400I, N402I, K407P, S409V (MG43);
q) 150, 196, 198, 232, 237, 342, 373, 400, 402, 407, 409 (MG44);
r) S201C, A224C (MG45);
s) S150E, S196R, S198P, S201C, A224C, S232Q, F237T, A342V, V400I, N402I, K407P, S409V (MG46);
t) S150E, S196R, S198P, S232Q, F237T, A342V, F390E, V400I, N402I, K407P, S409V Y444K (MG47);
u) S150E, S196R, S198P, S201C, A205P, A224C, S232Q, F237T, N274D, A342V, T355P, V400I, N402I, K407P, S409V (MG48); 또는
v) S150E, S196R, S198P, S232Q, F237T, A342V, A391P, V400I, N402I, K407P, S409V (MG49)
또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 단독으로 또는 다른 돌연변이와 조합되어 Tm을 유지하는 것으로 입증된 잔기에 존재하며, 예를 들어 여기서 1개 이상의 돌연변이는 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기 147, 150, 156, 225, 232, 245, 272, 276, 277, 279, 300, 310, 355, 378, 468 또는 그의 임의의 조합 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재한다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 하기 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기:
a) 468 (MG2);
b) 150 (MG4);
c) 147 (MG5);
d) 272 (MG10);
e) 355 (MG12);
f) 276, 277, 279 (MG17);
g) 300 (MG18);
h) 378 (MG20);
i) 156 (MG32);
j) 232 (MG34);
k) 245 (MG35);
l) 276 (MG36);
m) 225 (MG41); 또는
n) 310 (MG42)
로부터 선택된 잔기 또는 잔기의 조합 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재한다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 하기 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기:
a) R468Q (MG2);
b) S150E (MG4);
c) H147F (MG5);
d) S272G (MG10);
e) T355G (MG12);
f) S276E, Q277L, N279R (MG17);
g) N300Q (MG18);
h) N378Y (MG20);
i) S156K (MG32);
j) S232L (MG34);
k) A245Q (MG35);
l) S276D (MG36)
m) K225P (MG41); 또는
n) V310E (MG42)
또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 잔기 155, 203, 243, 248 및 358에 존재한다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 A155E, K203R, H243T, V248Q 및 A358V이다.
변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편은 아미노산 서열에서 돌연변이를 넘어 추가의 변형을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 M 서열 내의 1개 이상의 글리코실화 부위, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 글리코실화 부위가 제거된다. NGlycPred 서버를 사용한 서열 및 구조 분석 둘 다에 기초하여 엠. 게니탈리움 단백질 M에서 3개의 N-글리코실화 부위가 예측된다. 이들은 N177, N213 및 N274를 포함한다. NetOGlyc 4.0 서버를 사용한 구조 분석에 기초하여 엠. 게니탈리움 단백질 M에서 2개의 O-글리코실화 부위가 예측된다. 이들은 T110 및 T206을 포함한다. 적합한 돌연변이는 비제한적으로 N177D, T215Y, N274D, S112I 및 T206Y를 임의의 조합으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 글리코실화 부위가 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편에 부가된다. 글리코실화 패턴의 변화는 단백질의 열안정성에 부가되고/거나 항체 인식을 차단함으로써 단백질의 면역원성을 변경시킬 수 있다.
발현 및 정제 목적을 위해, 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 기능적 단편은, 예를 들어 N-말단에 분비 펩티드를 포함할 수 있어, 발현된 단백질이 그것이 발현되는 세포로부터 분비되어 배양 배지로부터 수집되도록 할 수 있다. 적합한 분비 펩티드는 비제한적으로 포유동물 세포의 경우 인간 혈청 알부민, 인터류킨-2, CD5, 이뮤노글로불린 카파 경쇄, 트립시노겐 또는 프로락틴으로부터의 것 및 박테리아 세포의 경우 Sec 또는 Tat로부터의 것을 포함한다. 분비 펩티드는 본 발명의 방법에 사용되기 전에 단백질 M으로부터 제거될 수 있거나 제거되지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 기능적 단편은 단백질의 1종 이상의 생물학적 기능 또는 물리적 특징을 변경시키는 1개 이상의 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 기능적 단편은 항체에 대한 단백질의 친화도를 변경시키는 1개 이상의 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명자들은 컴퓨터 분석을 사용하여, 돌연변이된 경우 항체에 대한 단백질의 친화도를 증가시킬 것으로 예측되는 단백질 M 내의 잔기를 확인하였다. 따라서, 일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기 95, 102, 103, 106, 107, 114, 116, 160, 161, 162, 163, 181, 186, 321, 381, 384, 389, 390, 391, 396, 397, 426, 429, 436, 438, 439, 441, 442, 447, 448, 449, 452, 453, 455, 456, 462 또는 466 또는 그의 임의의 조합 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 표 6에 열거된 돌연변이 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 잔기 100, 104, 107, 108, 110, 111, 112, 114, 115, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 149, 163, 165, 166, 167, 168, 182, 183, 184, 185, 186, 192, 193, 196, 337, 338, 354, 356, 357, 399, 402, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 442, 443, 445, 454, 455, 456, 457, 458, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 468, 469, 472, 473, 478 또는 그의 임의의 조합에 존재한다.
일부 실시양태에서, 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 기능적 단편은 단백질의 pH 감수성을 변형시킴으로써 항체에 대한 단백질의 친화도를 변경시키는 1개 이상의 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명자들은 컴퓨터 분석을 사용하여, 돌연변이된 경우 pH 감수성을 변형시킴으로써 항체에 대한 친화도를 증가시킬 것으로 예측되는 단백질 M 내의 잔기를 확인하였다. 이들 돌연변이체는 용리를 위해 pH의 변화를 사용하는 능력으로 인해 항체 단리에 특히 유용할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기 95, 103, 116, 186, 321, 389, 429, 442 또는 466 또는 그의 임의의 조합 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 표 7에 열거된 돌연변이 또는 그의 임의의 조합이다.
일부 실시양태에서, 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 기능적 단편은 항체에 대한 친화도를 감소시키거나 제거하는 1개 이상의 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예는 비제한적으로 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기 390 및 444에서의 돌연변이, 예를 들어 390E 및 Y444K 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에서의 돌연변이를 포함한다.
본 발명에 따른 단백질 M 단백질은 관련 기술분야에 널리 공지되고 본원에 기재된 바와 같은 방법, 예컨대 재조합 발현에 의해 생산되고 특징화된다.
본 발명의 추가의 측면은 본 발명의 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 생산하기 위한 발현 카세트를 제공한다.
폴리뉴클레오티드는 조절 요소에 작동가능하게 연결되어 단백질의 발현을 보조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 박테리아 프로모터 (예를 들어, 이. 콜라이에서 작동가능함) 또는 포유동물 프로모터 (예를 들어, 인간 프로모터)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 단백질의 발현을 증진시키기 위해 코돈 최적화될 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 예컨대 이. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 한 예는 인간 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈인 서열식별번호: 26의 서열 또는 그에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 서열이다. 추가 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 예컨대 이. 콜라이 및 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포 둘 다에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 한 예는 이. 콜라이 및 인간 세포 둘 다에서의 발현을 위해 최적화된 코돈인 서열식별번호: 25의 서열 또는 그에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 서열이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예를 들어 발현 벡터이다. 벡터는 비제한적으로 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 유형의 벡터일 수 있다. 벡터는, 예를 들어 박테리아 벡터 (예를 들어, 이. 콜라이 벡터) 또는 포유동물 세포 벡터 (예를 들어, 인간 세포 벡터)일 수 있다.
본 발명의 추가 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 포함하는 세포 (예를 들어, 단리된 세포, 형질전환된 세포, 재조합 세포 등)에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 다양한 실시양태는 벡터 (예를 들어, 발현 카세트)를 함유하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 이러한 세포는 단리된 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 세포의 게놈 내로 안정하게 혼입된다. 일부 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이 또는 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포일 수 있다.
본 발명의 추가 측면은 본 발명의 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및/또는 형질전환된 세포를 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 본원에 기재된 방법 중 하나를 수행하기 위한 추가의 시약을 포함할 수 있다. 시약은 적합한 패키지 또는 용기에 포함될 수 있다. 추가의 시약은 비제한적으로 완충제, 표지, 효소, 검출 시약 등을 포함한다.
키트가 공급되는 경우에, 상이한 성분이 별개의 용기에 패키징되어 사용 직전에 혼합될 수 있다. 이러한 성분의 패키징은 개별적으로 활성 성분의 기능을 상실하지 않으면서 장기간 저장을 허용할 수 있다. 키트는 또한 지침서와 함께 공급될 수 있다. 지침서는 종이 또는 다른 기재 상에 인쇄될 수 있고/거나, 전자-판독가능한 매체로서 공급될 수 있다.
이종 작용제
상기 기재된 바와 같이, 이종 작용제는 이종 작용제의 투여 전 대상체에 그에 대한 중화 항체가 존재하는 것 또는 대상체에 대한 투여시 중화 항체를 생성할 가능성이 있는 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종 작용제는 핵산 전달 벡터 (예를 들어, 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터), 유전자 편집 복합체 (예를 들어, CRISPR 복합체), 단백질 또는 핵산일 수 있다.
임의의 관심 핵산 서열(들)이 본 발명의 핵산 전달 벡터로 전달될 수 있다. 관심 핵산은 치료 폴리펩티드 (예를 들어, 의학적 또는 수의학적 용도를 위함), 면역원성 폴리펩티드 (예를 들어, 백신을 위함) 또는 진단 폴리펩티드를 포함한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다.
치료 폴리펩티드는 낭성 섬유증 막횡단 조절 단백질 (CFTR), 디스트로핀 (미니- 및 마이크로-디스트로핀 포함 (예를 들어, 문헌 [Vincent et al., (1993) Nature Genetics 5:130]; 미국 특허 공개 번호 2003/017131; 국제 공개 WO/2008/088895; 문헌 [Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13714-13719 (2000); 및 Gregorevic et al., Mol. Ther. 16:657-64 (2008)] 참조)), 미오스타틴 프로펩티드, 폴리스타틴, 액티빈 유형 II 가용성 수용체, IGF-1, 항염증 폴리펩티드, 예컨대 I카파 B 우성 돌연변이체, 사르코스판, 유트로핀 (Tinsley et al., (1996) Nature 384:349), 미니-유트로핀, 응고 인자 (예를 들어, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X 등), 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 카탈라제, 티로신 히드록실라제, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 렙틴, LDL 수용체, 지단백질 리파제, 오르니틴 트랜스카르브아밀라제, β-글로빈, α-글로빈, 스펙트린, α1-항트립신, 아데노신 데아미나제, 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, β-글루코세레브로시다제, 스핑고미엘리나제, 리소솜 헥소사미니다제 A, 분지쇄 케토산 데히드로게나제, RP65 단백질, 시토카인 (예를 들어, α-인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터류킨-2, 인터류킨-4, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 림프독소 등), 펩티드 성장 인자, 신경영양 인자 및 호르몬 (예를 들어, 소마토트로핀, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 1 및 2, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 신경영양 인자-3 및 -4, 뇌-유래 신경영양 인자, 골 형태발생 단백질 [RANKL 및 VEGF 포함], 신경교 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자-α 및 -β 등), 리소솜 산 α-글루코시다제, α-갈락토시다제 A, 수용체 (예를 들어, 종양 괴사 성장 인자α 가용성 수용체), S100A1, 파르브알부민, 아데닐릴 시클라제 유형 6, G-단백질 커플링된 수용체 키나제 유형 2 녹다운을 일으키는 분자, 예컨대 말단절단된 구성적으로 활성인 bARKct, 항염증 인자, 예컨대 IRAP, 항-미오스타틴 단백질, 아스파르토아실라제, 및 모노클로날 항체 (단일 쇄 모노클로날 항체 포함; 예시적인 Mab는 헤르셉틴(Herceptin)® Mab임)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 예시적인 이종 핵산 서열은 자살 유전자 산물 (예를 들어, 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 디프테리아 독소 및 종양 괴사 인자), 암 요법에 사용되는 약물에 대한 내성을 부여하는 단백질, 종양 억제 유전자 산물 (예를 들어, p53, Rb, Wt-1), TRAIL, FAS-리간드 및 그를 필요로 하는 대상체에서 치료 효과를 갖는 임의의 다른 폴리펩티드를 코딩한다. 파르보바이러스 벡터는 또한 모노클로날 항체 및 항체 단편, 예를 들어 미오스타틴에 대해 지시된 항체 또는 항체 단편을 전달하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Fang et al., Nature Biotechnol. 23:584-590 (2005)] 참조).
폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 리포터 폴리펩티드 (예를 들어, 효소)를 코딩하는 것을 포함한다. 리포터 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 녹색 형광 단백질, β-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제, 루시페라제 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
대안적으로, 본 발명의 특정한 실시양태에서, 핵산은 기능적 핵산, 즉 단백질로 번역되지 않으면서 기능하는 핵산, 예를 들어 안티센스 핵산, 리보자임 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,877,022에 기재된 바와 같음), 스플라이세오솜-매개된 트랜스-스플라이싱에 영향을 미치는 RNA (문헌 [Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech. 17:246]; 미국 특허 번호 6,013,487; 미국 특허 번호 6,083,702 참조), 유전자 침묵을 매개하는 siRNA, shRNA 또는 miRNA를 포함한 간섭 RNA (RNAi) (문헌 [Sharp et al., (2000) Science 287:2431] 참조), 및 다른 비-번역 RNA, 예컨대 "가이드" RNA (문헌 [Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929]; 미국 특허 번호 5,869,248 (Yuan et al.)) 등을 코딩할 수 있다. 예시적인 비번역 RNA는 다중 약물 내성 (MDR) 유전자 산물에 대한 RNAi (예를 들어, 종양을 치료 및/또는 예방하고/거나 심장에 투여하여 화학요법에 의한 손상을 예방하기 위함), 미오스타틴에 대한 RNAi (예를 들어, 뒤시엔느 근육 이영양증을 위함), VEGF에 대한 RNAi (예를 들어, 종양을 치료 및/또는 예방하기 위함), 포스포람반에 대한 RNAi (예를 들어, 심혈관 질환을 치료하기 위함, 예를 들어 문헌 [Andino et al., J. Gene Med. 10:132-142 (2008) 및 Li et al., Acta Pharmacol Sin. 26:51-55 (2005)] 참조); 포스포람반 억제 또는 우성-음성 분자, 예컨대 포스포람반 S16E (예를 들어, 심혈관 질환을 치료하기 위함, 예를 들어 문헌 [Hoshijima et al. Nat. Med. 8:864-871 (2002)] 참조), 아데노신 키나제에 대한 RNAi (예를 들어, 간질을 위함), 사르코글리칸 [예를 들어, α, β, γ]에 대한 RNAi, 미오스타틴, 미오스타틴 프로펩티드, 폴리스타틴 또는 액티빈 유형 II 가용성 수용체에 대한 RNAi, 항염증 폴리펩티드, 예컨대 I카파 B 우성 돌연변이체에 대한 RNAi, 및 병원성 유기체 및 바이러스 (예를 들어, B형 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, CMV, 단순 포진 바이러스, 인간 유두종 바이러스 등)에 대한 RNAi를 포함한다.
대안적으로, 본 발명의 특정한 실시양태에서, 핵산은 단백질 포스파타제 억제제 I (I-1), serca2a, 포스포람반 유전자를 조절하는 아연 핑거 단백질, Barkct, β2-아드레날린성 수용체, β2-아드레날린성 수용체 키나제 (BARK), 포스포이노시티드-3 키나제 (PI3 키나제), G-단백질 커플링된 수용체 키나제 유형 2 녹다운을 일으키는 분자, 예컨대 말단절단된 구성적으로 활성인 bARKct; 칼사르신, 포스포람반에 대한 RNAi; 포스포람반 억제 또는 우성-음성 분자, 예컨대 포스포람반 S16E, enos, inos 또는 골 형태발생 단백질 (BNP 2, 7 등, RANKL 및/또는 VEGF 포함)을 코딩할 수 있다.
핵산 전달 벡터는 또한 숙주 염색체 상의 유전자좌와 상동성을 공유하고 그와 재조합하는 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 접근법은, 예를 들어 숙주 세포에서의 유전적 결함을 교정하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 예를 들어 백신접종을 위한 면역원성 폴리펩티드를 발현하는 핵산 전달 벡터를 제공한다. 핵산은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV), 인플루엔자 바이러스, HIV 또는 SIV gag 단백질, 종양 항원, 암 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원 등으로부터의 면역원을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 임의의 관심 면역원을 코딩할 수 있다.
백신 벡터로서의 파르보바이러스의 용도는 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Miyamura et al., (1994) Proc. Nat. Acad. Sci USA 91:8507]; 미국 특허 번호 5,916,563 (Young et al.); 미국 특허 번호 5,905,040 (Mazzara et al.); 미국 특허 번호 5,882,652, 미국 특허 번호 5,863,541 (Samulski et al.) 참조). 항원은 파르보바이러스 캡시드에 제시될 수 있다. 대안적으로, 항원은 재조합 벡터 게놈 내로 도입된 핵산으로부터 발현될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같고/거나 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 임의의 관심 면역원은 핵산 전달 벡터에 의해 제공될 수 있다.
면역원성 폴리펩티드는 미생물, 박테리아, 원충, 기생충, 진균 및/또는 바이러스 감염 및 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는 감염 및/또는 질환에 대해 면역 반응을 도출하고/거나 대상체를 보호하는데 적합한 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 면역원성 폴리펩티드는 오르토믹소바이러스 면역원 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스 면역원, 예컨대 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 표면 단백질 또는 인플루엔자 바이러스 핵단백질 또는 말 인플루엔자 바이러스 면역원) 또는 렌티바이러스 면역원 (예를 들어, 말 감염성 빈혈 바이러스 면역원, 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV) 면역원 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 면역원, 예컨대 HIV 또는 SIV 외피 GP160 단백질, HIV 또는 SIV 매트릭스/캡시드 단백질 및 HIV 또는 SIV gag, pol 및 env 유전자 산물)일 수 있다. 면역원성 폴리펩티드는 또한 아레나바이러스 면역원 (예를 들어, 라사 열 바이러스 면역원, 예컨대 라사 열 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 및 라사 열 외피 당단백질), 폭스바이러스 면역원 (예를 들어, 백시니아 바이러스 면역원, 예컨대 백시니아 L1 또는 L8 유전자 산물), 플라비바이러스 면역원 (예를 들어, 황열 바이러스 면역원 또는 일본 뇌염 바이러스 면역원), 필로바이러스 면역원 (예를 들어, 에볼라 바이러스 면역원 또는 마르부르크 바이러스 면역원, 예컨대 NP 및 GP 유전자 산물), 분야바이러스 면역원 (예를 들어, RVFV, CCHF 및/또는 SFS 바이러스 면역원) 또는 코로나바이러스 면역원 (예를 들어, 감염성 인간 코로나바이러스 면역원, 예컨대 인간 코로나바이러스 외피 당단백질 또는 돼지 전염성 위장염 바이러스 면역원 또는 조류 감염성 기관지염 바이러스 면역원)일 수 있다. 면역원성 폴리펩티드는 추가로 소아마비 면역원, 포진 면역원 (예를 들어, CMV, EBV, HSV 면역원), 볼거리 면역원, 홍역 면역원, 풍진 면역원, 디프테리아 독소 또는 다른 디프테리아 면역원, 백일해 항원, 간염 (예를 들어, A형 간염, B형 간염, C형 간염 등) 면역원 및/또는 관련 기술분야에 현재 공지되어 있거나 추후 면역원으로서 확인될 임의의 다른 백신 면역원일 수 있다.
대안적으로, 면역원성 폴리펩티드는 임의의 종양 또는 암 세포 항원일 수 있다. 임의로, 종양 또는 암 항원은 암 세포의 표면 상에 발현된다. 예시적인 암 및 종양 세포 항원은 문헌 [S.A. Rosenberg (Immunity 10:281 (1991))]에 기재되어 있다. 다른 예시적인 암 및 종양 항원은 BRCA1 유전자 산물, BRCA2 유전자 산물, gp100, 티로시나제, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, LAGE, NY-ESO-1, CDK-4, β-카테닌, MUM-1, 카스파제-8, KIAA0205, HPVE, SART-1, PRAME, p15, 흑색종 종양 항원 (Kawakami et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515; Kawakami et al., (1994) J. Exp. Med., 180:347; Kawakami et al., (1994) Cancer Res. 54:3124), MART-1, gp100 MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, CEA, TRP-1, TRP-2, P-15, 티로시나제 (Brichard et al., (1993) J. Exp. Med. 178:489); HER-2/neu 유전자 산물 (미국 특허 번호 4,968,603), CA 125, LK26, FB5 (엔도시알린), TAG 72, AFP, CA19-9, NSE, DU-PAN-2, CA50, SPan-1, CA72-4, HCG, STN (시알릴 Tn 항원), c-erbB-2 단백질, PSA, L-CanAg, 에스트로겐 수용체, 유지방 글로불린, p53 종양 억제 단백질 (Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623); 뮤신 항원 (국제 특허 공개 번호 WO 90/05142); 텔로머라제; 핵 매트릭스 단백질; 전립선 산 포스파타제; 유두종 바이러스 항원; 및/또는 하기 암: 흑색종, 선암종, 흉선종, 림프종 (예를 들어, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종), 육종, 폐암, 간암, 결장암, 백혈병, 자궁암, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 췌장암, 뇌암 및 현재 공지되어 있거나 추후 확인될 임의의 다른 암 또는 악성 상태와 연관된 것으로 현재 공지되어 있거나 추후 발견될 항원 (예를 들어, 문헌 [Rosenberg, (1996) Ann. Rev. Med. 47:481-91] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
관심 핵산(들)이 적절한 제어 서열과 작동가능하게 회합될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 이종 핵산은 발현 제어 요소, 예컨대 전사/번역 제어 신호, 복제 기점, 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 프로모터 및/또는 인핸서 등과 작동가능하게 회합될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 목적하는 수준 및 조직-특이적 발현에 따라 다양한 프로모터/인핸서 요소가 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 프로모터/인핸서는 목적하는 발현 패턴에 따라 구성적 또는 유도성일 수 있다. 프로모터/인핸서는 천연 또는 외래일 수 있고, 천연 또는 합성 서열일 수 있다. 외래란, 전사 개시 영역이 도입되는 야생형 숙주에서는 전사 개시 영역이 발견되지 않는 것으로 의도된다.
특정한 실시양태에서, 프로모터/인핸서 요소는 표적 세포 또는 치료될 대상체에 대해 천연일 수 있다. 대표적인 실시양태에서, 프로모터/인핸서 요소는 핵산 서열에 대해 천연일 수 있다. 프로모터/인핸서 요소는 일반적으로 관심 표적 세포(들)에서 기능하도록 선택된다. 추가로, 특정한 실시양태에서, 프로모터/인핸서 요소는 포유동물 프로모터/인핸서 요소이다. 프로모터/인핸서 요소는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
유도성 발현 제어 요소는 전형적으로 핵산 서열(들)의 발현에 대한 조절을 제공하는 것이 바람직한 적용에서 유리하다. 유전자 전달을 위한 유도성 프로모터/인핸서 요소는 조직-특이적 또는 -선호 프로모터/인핸서 요소일 수 있고, 근육 특이적 또는 선호 (심장 근육, 골격근 및/또는 평활근 특이적 또는 선호 포함), 신경 조직 특이적 또는 선호 (뇌-특이적 또는 선호 포함), 눈 특이적 또는 선호 (망막-특이적 및 각막-특이적 포함), 간 특이적 또는 선호, 골수 특이적 또는 선호, 췌장 특이적 또는 선호, 비장 특이적 또는 선호, 및 폐 특이적 또는 선호 프로모터/인핸서 요소를 포함한다. 다른 유도성 프로모터/인핸서 요소는 호르몬-유도성 및 금속-유도성 요소를 포함한다. 예시적인 유도성 프로모터/인핸서 요소는 Tet 온/오프 요소, RU486-유도성 프로모터, 엑디손-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
핵산 서열(들)이 표적 세포에서 전사된 다음 번역되는 실시양태에서, 삽입된 단백질 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특이적 개시 신호가 일반적으로 포함된다. ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함할 수 있는 이들 외인성 번역 제어 서열은 천연 및 합성 둘 다의 다양한 기원의 것일 수 있다.
핵산 전달 벡터는 핵산을 분열 및 비분열 세포를 포함한 넓은 범위의 세포 내로 전달하기 위한 수단을 제공한다. 핵산 전달 벡터는, 예를 들어 생체외 유전자 요법을 위해 시험관내에서 관심 핵산을 세포에 전달하는데 사용될 수 있다. 핵산 전달 벡터는 추가적으로, 예를 들어 면역원성 또는 치료 폴리펩티드 또는 기능적 RNA를 발현하기 위해, 핵산을 그를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 방법에 유용하다. 이러한 방식으로, 폴리펩티드 또는 기능적 RNA는 대상체에서 생체내 생산될 수 있다. 대상체는 폴리펩티드의 결핍을 갖기 때문에 대상체는 폴리펩티드를 필요로 할 수 있다. 추가로, 상기 방법은 대상체에서의 폴리펩티드 또는 기능적 RNA의 생산이 일부 유익한 효과를 부여할 수 있기 때문에 실시될 수 있다.
핵산 전달 벡터는 또한 대상체에서 관심 폴리펩티드 또는 기능적 RNA를 생산하는데 (예를 들어 폴리펩티드를 생산하기 위한 생물반응기로서 대상체를 사용하거나 또는 예를 들어 스크리닝 방법과 관련하여 대상체에 대한 기능적 핵산의 효과를 관찰하는데) 사용될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 핵산 전달 벡터는 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 코딩하는 핵산을 전달하여 치료 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 전달하는 것이 유익한 임의의 질환 상태를 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 예시적인 질환 상태는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 낭성 섬유증 (낭성 섬유증 막횡단 조절 단백질) 및 폐의 다른 질환, A형 혈우병 (인자 VIII), B형 혈우병 (인자 IX), 지중해빈혈 (β-글로빈), 빈혈 (에리트로포이에틴) 및 다른 혈액 장애, 알츠하이머병 (GDF; 네프릴리신), 다발성 경화증 (β-인터페론), 파킨슨병 (신경교-세포주 유래 신경영양 인자 [GDNF]), 헌팅톤병 (반복부를 제거하기 위한 RNAi), 근위축성 측삭 경화증, 간질 (갈라닌, 신경영양 인자), 및 다른 신경계 장애, 암 (엔도스타틴, 안지오스타틴, TRAIL, FAS-리간드, 시토카인, 예컨대 인터페론; RNAi, 예컨대 VEGF 또는 다중 약물 내성 유전자 산물에 대한 RNAi), 당뇨병 (인슐린), 근육 이영양증, 예컨대 뒤시엔느 (디스트로핀, 미니-디스트로핀, 인슐린-유사 성장 인자 I, 사르코글리칸 [예를 들어, α, β, γ], 미오스타틴에 대한 RNAi, 미오스타틴 프로펩티드, 폴리스타틴, 액티빈 유형 II 가용성 수용체, 항염증 폴리펩티드, 예컨대 I카파 B 우성 돌연변이체, 사르코스판, 유트로핀, 미니-유트로핀, 엑손 스킵핑을 유도하는 디스트로핀 유전자에서의 스플라이스 접합부에 대한 RNAi [예를 들어, WO/2003/095647 참조], 엑손 스킵핑을 유도하는 U7 snRNA에 대한 안티센스 [예를 들어, WO/2006/021724 참조] 및 미오스타틴 또는 미오스타틴 프로펩티드에 대한 항체 또는 항체 단편) 및 베커, 고셔병 (글루코세레브로시다제), 후를러병 (α-L-이두로니다제), 아데노신 데아미나제 결핍 (아데노신 데아미나제), 글리코겐 축적 질환 (예를 들어, 파브리병 [α-갈락토시다제] 및 폼페병 [리소솜 산 α-글루코시다제]) 및 다른 대사 결함, 선천성 기종 (α1-항트립신), 레쉬-니한 증후군 (하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제), 니만-픽병 (스핑고미엘리나제), 테이 삭스병 (리소솜 헥소사미니다제 A), 메이플 시럽뇨 질환 (분지쇄 케토산 데히드로게나제), 망막 변성 질환 (및 눈 및 망막의 다른 질환; 예를 들어 황반 변성을 위한 PDGF), 실질 기관의 질환, 예컨대 뇌 (파킨슨병 [GDNF], 성상세포종 [엔도스타틴, 안지오스타틴 및/또는 VEGF에 대한 RNAi] 포함), 교모세포종 [엔도스타틴, 안지오스타틴 및/또는 VEGF에 대한 RNAi]), 간, 신장, 심장, 예컨대 울혈성 심부전 또는 말초 동맥 질환 (PAD) (예를 들어, 단백질 포스파타제 억제제 I (I-1), serca2a, 포스포람반 유전자를 조절하는 아연 핑거 단백질, Barkct, β2-아드레날린성 수용체, β2-아드레날린성 수용체 키나제 (BARK), 포스포이노시티드-3 키나제 (PI3 키나제), S100A1, 파르브알부민, 아데닐릴 시클라제 유형 6, G-단백질 커플링된 수용체 키나제 유형 2 녹다운을 일으키는 분자, 예컨대 말단절단된 구성적으로 활성인 bARKct; 칼사르신, 포스포람반에 대한 RNAi; 포스포람반 억제 또는 우성-음성 분자, 예컨대 포스포람반 S16E 등을 전달함으로써), 관절염 (인슐린-유사 성장 인자), 관절 장애 (인슐린-유사 성장 인자 1 및/또는 2), 내막 증식증 (예를 들어, enos, inos를 전달함으로써), 심장 이식의 생존 개선 (슈퍼옥시드 디스뮤타제), AIDS (가용성 CD4), 근육 소모 (인슐린-유사 성장 인자 I), 신장 결핍 (에리트로포이에틴), 빈혈 (에리트로포이에틴), 관절염 (항염증 인자, 예컨대 IRAP 및 TNFα 가용성 수용체), 간염 (α-인터페론), LDL 수용체 결핍 (LDL 수용체), 고암모니아혈증 (오르니틴 트랜스카르브아밀라제), 크라베병 (갈락토세레브로시다제), 배튼병, SCA1, SCA2 및 SCA3을 포함한 척수 뇌 운동실조, 페닐케톤뇨 (페닐알라닌 히드록실라제), 자가면역 질환 등. 본 발명은 추가로 기관 이식 후에 사용되어 이식의 성공을 증가시키고/거나 기관 이식 또는 보조 요법의 부정적 부작용을 감소시킬 수 있다 (예를 들어, 면역억제제 또는 억제 핵산을 투여하여 시토카인 생산을 차단함으로써). 또 다른 예로서, 골 형태발생 단백질 (BNP 2, 7 등, RANKL 및/또는 VEGF 포함)은, 예를 들어 암 환자에서의 파괴 또는 외과적 제거 후에 골 동종이식편과 함께 투여될 수 있다.
유전자 전달은 질환 상태에 대한 요법을 이해하고 제공하기 위한 실질적인 잠재적 용도를 갖는다. 결함 유전자가 공지되어 있고 클로닝된 다수의 유전성 질환이 존재한다. 일반적으로, 상기 질환 상태는 하기 2가지 부류에 속한다: 일반적으로 열성 방식으로 유전되는, 통상적으로 효소의 결핍 상태, 및 조절 또는 구조 단백질을 수반할 수 있고 전형적으로 우성 방식으로 유전되는 불균형 상태. 결핍 상태 질환의 경우, 유전자 전달은 정상 유전자를 대체 요법을 위한 이환 조직 내로 가져오는데, 뿐만 아니라 안티센스 돌연변이를 사용하여 질환에 대한 동물 모델을 생성하는데 사용될 수 있다. 불균형 질환 상태의 경우, 유전자 전달은 모델 시스템에서 질환 상태를 생성하는데 사용될 수 있으며, 이는 이어서 질환 상태를 상쇄시키기 위한 노력에 사용될 수 있다. 따라서, 핵산 전달 벡터는 유전 질환의 치료 및/또는 예방을 허용한다.
핵산 전달 벡터는 또한 시험관내 또는 생체내 세포에 기능적 핵산을 제공하는데 사용될 수 있다. 세포에서의 기능적 핵산의 발현은, 예를 들어 세포에 의한 특정한 표적 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다. 따라서, 기능적 핵산은 그를 필요로 하는 대상체에서 특정한 단백질의 발현을 감소시키기 위해 투여될 수 있다.
핵산 전달 벡터는 관심 핵산을 트랜스제닉 동물 모델에서 일시적으로 또는 안정하게 발현시키는 진단 및 스크리닝 방법에 사용된다.
핵산 전달 벡터는 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 유전자 표적화, 클리어런스, 전사, 번역 등을 평가하기 위한 프로토콜에서의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 비-치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 핵산 전달 벡터는 또한 안전성 (확산, 독성, 면역원성 등)을 평가하기 위한 목적을 위해 사용될 수 있다. 이러한 데이터는, 예를 들어 임상 효능의 평가 전 규제 승인 과정의 일부로서 미국 식품 의약품국에 의해 고려된다.
추가 측면으로서, 본 발명의 핵산 전달 벡터는 대상체에서 면역 반응을 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에 따르면, 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 전달 벡터가 대상체에게 투여될 수 있고, 면역원성 폴리펩티드에 대한 능동 면역 반응이 대상체에 의해 시작된다. 면역원성 폴리펩티드는 본원 상기에 기재된 바와 같다. 일부 실시양태에서, 보호 면역 반응이 도출된다.
대안적으로, 핵산 전달 벡터는 생체외 세포에 투여될 수 있고, 변경된 세포가 대상체에게 투여된다. 핵산을 포함하는 핵산 전달 벡터가 세포 내로 도입되고, 세포가 대상체에게 투여되며, 여기서 면역원을 코딩하는 핵산이 발현되어 대상체에서 면역원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 세포는 항원-제시 세포 (예를 들어, 수지상 세포)이다.
"능동 면역 반응" 또는 "능동 면역"은 다음을 특징으로 한다: "면역원과 마주친 후 숙주 조직 및 세포의 참여를 특징으로 한다. 이는 림프세망 조직에서의 면역적격 세포의 분화 및 증식을 수반하며, 이는 항체의 합성 또는 세포-매개된 반응성의 발생 또는 둘 다를 유도한다" (문헌 [Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation, in IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985)]). 다르게 말하면, 능동 면역 반응은 감염에 의한 또는 백신접종에 의한 면역원에의 노출 후 숙주에 의해 시작된다. 능동 면역은 "능동 면역화된 숙주로부터 비-면역 숙주로의 사전형성된 물질 (항체, 전달 인자, 흉선 이식편, 인터류킨-2)의 전달"을 통해 획득된 수동 면역과 대조될 수 있다 (상기 문헌).
본원에 사용된 "보호" 면역 반응 또는 "보호" 면역은 면역 반응이 질환을 예방하거나 그의 발생률 감소시킨다는 점에서 대상체에게 일부 이익을 부여한다는 것을 나타낸다. 대안적으로, 보호 면역 반응 또는 보호 면역은 질환, 특히 암 또는 종양의 치료 및/또는 예방에 유용할 수 있다 (예를 들어, 암 또는 종양 형성을 예방함으로써, 암 또는 종양의 퇴행을 유발함으로써 및/또는 전이를 예방함으로써 및/또는 전이성 결절의 성장을 예방함으로써). 보호 효과는 치료의 이익이 그의 임의의 단점을 능가하는 한 완전하거나 부분적일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 핵산을 포함하는 핵산 전달 벡터 또는 세포는 하기 기재된 바와 같이 면역원성 유효량으로 투여될 수 있다.
핵산 전달 벡터는 또한 1개 이상의 암 세포 항원 (또는 면역학적으로 유사한 분자) 또는 암 세포에 대한 면역 반응을 생성하는 임의의 다른 면역원을 발현하는 핵산 전달 벡터의 투여에 의해 암 면역요법을 위해 투여될 수 있다. 예시하자면, 예를 들어 암을 갖는 환자를 치료하고/거나 대상체에서 암이 발생하는 것을 예방하기 위해, 암 세포 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 전달 벡터를 투여함으로써 대상체에서 암 세포 항원에 대한 면역 반응이 생성될 수 있다. 핵산 전달 벡터는 본원에 기재된 바와 같이, 생체내에서 또는 생체외 방법을 사용함으로써 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 암 항원은 핵산 전달 벡터의 일부로서 발현될 수 있다.
또 다른 대안으로서, 암을 치료 및/또는 예방하기 위해 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 치료 핵산 (예를 들어, RNAi) 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 시토카인)가 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "암"은 종양-형성 암을 포괄한다. 마찬가지로, 용어 "암성 조직"은 종양을 포괄한다. "암 세포 항원"은 종양 항원을 포괄한다.
용어 "암"은 관련 기술분야에서의 그의 이해되는 의미, 예를 들어 신체의 원위 부위로 확산 (즉, 전이)될 잠재력을 갖는 조직의 비제어된 성장을 갖는다. 예시적인 암은 흑색종, 선암종, 흉선종, 림프종 (예를 들어, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종), 육종, 폐암, 간암, 결장암, 백혈병, 자궁암, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 췌장암, 뇌암 및 현재 공지되어 있거나 추후 확인될 임의의 다른 암 또는 악성 상태를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 대표적인 실시양태에서, 본 발명은 종양-형성 암을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
용어 "종양"은 또한 관련 기술분야에서, 예를 들어 다세포 유기체 내의 미분화 세포의 비정상적 덩어리로서 이해된다. 종양은 악성 또는 양성일 수 있다. 대표적인 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 악성 종양을 예방 및 치료하는데 사용된다.
용어 "암을 치료하는", "암의 치료" 및 등가 용어는, 암의 중증도가 감소 또는 적어도 부분적으로 제거되고/거나 질환의 진행이 느려지고/거나 제어되고/거나 질환이 안정화되는 것으로 의도된다. 특정한 실시양태에서, 이들 용어는 암의 전이가 예방 또는 감소 또는 적어도 부분적으로 제거되고/거나 전이성 결절의 성장이 예방 또는 감소 또는 적어도 부분적으로 제거되는 것을 나타낸다.
용어 "암의 예방" 또는 "암을 예방하는" 및 등가 용어는, 방법이 암의 발병의 발생률 및/또는 중증도를 적어도 부분적으로 제거 또는 감소시키고/거나 지연시키는 것으로 의도된다. 다르게 말하면, 대상체에서 암의 발병은 가능성 또는 확률이 감소되고/거나 지연될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 세포는 암을 갖는 대상체로부터 제거되고, 핵산 전달 벡터와 접촉될 수 있다. 이어서, 변형된 세포는 대상체에게 투여되고, 이에 의해 암 세포 항원에 대한 면역 반응이 도출된다. 이러한 방법은 생체내에서 충분한 면역 반응을 시작할 수 없는 (즉, 충분한 양으로 증진 항체를 생산할 수 없는) 면역손상된 대상체에 유리하게 사용될 수 있다.
면역 반응은 면역조정 시토카인 (예를 들어, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, ω-인터페론, τ-인터페론, 인터류킨-1α, 인터류킨-1β, 인터류킨-2, 인터류킨-3, 인터류킨-4, 인터류킨 5, 인터류킨-6, 인터류킨-7, 인터류킨-8, 인터류킨-9, 인터류킨-10, 인터류킨-11, 인터류킨 12, 인터류킨-13, 인터류킨-14, 인터류킨-18, B 세포 성장 인자, CD40 리간드, 종양 괴사 인자-α, 종양 괴사 인자-β, 단핵구 화학유인물질 단백질-1, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 및 림프독소)에 의해 증진될 수 있는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 면역조정 시토카인 (바람직하게는, CTL 유도성 시토카인)은 바이러스 벡터와 함께 대상체에게 투여될 수 있다.
시토카인은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 외인성 시토카인이 대상체에게 투여될 수 있거나, 또는 대안적으로, 시토카인을 코딩하는 핵산이 적합한 벡터를 사용하여 대상체에게 전달되어 시토카인이 생체내에서 생산될 수 있다.
대상체, 제약 제제 및 투여 방식
본 발명의 방법은 수의학적 및 의학적 적용 둘 다에서 사용된다. 적합한 대상체는 조류, 파충류, 양서류, 어류 및 포유동물을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "포유동물"은 인간, 영장류, 비-인간 영장류 (예를 들어, 원숭이 및 개코원숭이), 소, 양, 염소, 돼지, 말, 고양이, 개, 토끼, 설치류 (예를 들어, 래트, 마우스, 햄스터 등) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 인간 대상체는 신생아, 영유아, 소아 및 성인을 포함한다. 임의로, 대상체는 본 발명의 방법을 "필요로 하는"데, 이는 예를 들어 대상체가 본원에 기재된 것을 포함한 장애 또는 본원에 기재된 것을 포함한 폴리뉴클레오티드의 전달로부터 이익을 얻을 장애를 갖거나 또는 그의 위험이 있는 것으로 여겨지기 때문이다. 추가 옵션으로서, 대상체는 실험실 동물 및/또는 질환의 동물 모델일 수 있다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
특정 실시양태에서, 이종 작용제 및 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 그를 필요로 하는 대상체에게 대상체의 생애에서 가능한 한 일찍, 예를 들어 대상체가 질환 또는 장애로 진단되자마자 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 신생아 대상체에 대해, 예를 들어 신생아 스크리닝으로 질환 또는 장애를 확인한 후에 수행된다. 일부 실시양태에서, 방법은 10세 전, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10세 전 대상체에 대해 수행된다. 일부 실시양태에서, 방법은 10세 후 소아 또는 성인 대상체에 대해 수행된다. 일부 실시양태에서, 방법은 자궁내 태아에 대해, 예를 들어 출생전 스크리닝으로 질환 또는 장애를 확인한 후에 수행된다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에서 질환 또는 장애와 연관된 증상이 발생하자마자 대상체에 대해 수행된다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에서 질환 또는 장애와 연관된 증상이 발생하기 전 대상체에 대해, 예를 들어 질환 또는 장애를 갖는 것으로 의심되거나 진단되지만 증상을 나타내기 시작하지 않은 대상체에 대해 수행된다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체 및 임의로 다른 의약 작용제, 제약 작용제, 안정화제, 완충제, 담체, 아주반트, 희석제 등 중에 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 단독으로 또는 이종 작용제와 함께 포함하는 1종 이상의 제약 조성물을 제공한다. 주사를 위해, 담체는 전형적으로 액체일 것이다. 다른 투여 방법의 경우, 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 흡입 투여의 경우, 담체는 호흡성일 것이고, 임의로 고체 또는 액체 미립자 형태일 수 있다.
"제약상 허용되는"은 독성이 아니거나 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 물질을 의미하며, 즉 물질은 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않으면서 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 한 측면은, 예를 들어 생체외 방법의 일부로서, 시험관내에서 핵산을 세포에 전달하는 방법이다. 이종 작용제 (예를 들어, 핵산 전달 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터)는 특정한 표적 세포에 적합한 표준 형질도입 방법에 따라 적절한 양, 예를 들어 감염 다중도로 세포 내로 도입될 수 있다. 투여할 바이러스 벡터의 역가는 표적 세포 유형 및 수 및 특정한 바이러스 벡터에 따라 달라질 수 있고, 과도한 실험 없이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 대표적인 실시양태에서, 적어도 약 103 감염 단위, 보다 바람직하게는 적어도 약 105 감염 단위가 세포에 도입된다.
핵산 전달 벡터가 도입되는 세포(들)는 신경 세포 (말초 및 중추 신경계의 세포, 특히 뇌 세포, 예컨대 뉴런 및 핍지교세포 포함), 폐 세포, 눈의 세포 (망막 세포, 망막 색소 상피 및 각막 세포 포함), 혈관 세포 (예를 들어, 내피 세포, 내막 세포), 상피 세포 (예를 들어, 장 및 호흡기 상피 세포), 근육 세포 (예를 들어, 골격근 세포, 심장 근육 세포, 평활근 세포 및/또는 횡경막 근육 세포), 수지상 세포, 췌장 세포 (도세포 포함), 간 세포, 신장 세포, 심근 세포, 골 세포 (예를 들어, 골수 줄기 세포), 조혈 줄기 세포, 비장 세포, 각질세포, 섬유모세포, 내피 세포, 전립선 세포, 배세포 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 유형일 수 있다. 대표적인 실시양태에서, 세포는 임의의 전구 세포일 수 있다. 추가 가능성으로서, 세포는 줄기 세포 (예를 들어, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포)일 수 있다. 또 다른 추가 대안으로서, 세포는 암 또는 종양 세포일 수 있다. 더욱이, 세포는 상기 나타낸 바와 같이 임의의 기원 종으로부터의 것일 수 있다.
핵산 전달 벡터는 대상체에게 변형된 세포를 투여할 목적으로 시험관내에서 세포 내로 도입될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 세포가 대상체로부터 제거되었고, 핵산 전달 벡터가 그 안에 도입된 다음, 세포가 대상체 내로 다시 투여된다. 생체외 조작을 위해 세포를 대상체로부터 제거하고, 이어서 대상체 내로 다시 도입하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,399,346 참조). 대안적으로, 핵산 전달 벡터는 공여자 대상체로부터의 세포 내로, 배양된 세포 내로 또는 임의의 다른 적합한 공급원으로부터의 세포 내로 도입될 수 있고, 세포는 그를 필요로 하는 대상체 (즉, "수용자" 대상체)에게 투여된다.
생체외 유전자 전달에 적합한 세포는 상기 기재된 바와 같다. 대상체에게 투여하는 세포의 투여량은 대상체의 연령, 상태 및 종, 세포의 유형, 세포에 의해 발현되는 핵산, 투여 방식 등에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 용량당 적어도 약 102 내지 약 108개 세포 또는 적어도 약 103 내지 약 106개 세포가 제약상 허용되는 담체 중에서 투여될 것이다. 특정한 실시양태에서, 핵산 전달 벡터에 의해 형질도입되는 세포는 치료 유효량 또는 예방 유효량으로 제약 담체와 조합되어 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 핵산 전달 벡터는 세포 내로 도입되고, 세포는 대상체에게 투여되어 전달된 폴리펩티드 (예를 들어, 트랜스진으로서 또는 캡시드로 발현됨)에 대한 면역원성 반응을 도출할 수 있다. 전형적으로, 면역원성 유효량의 폴리펩티드를 발현하는 소정량의 세포가 제약상 허용되는 담체와 조합되어 투여된다. "면역원성 유효량"은 제약 제제가 투여되는 대상체에서 폴리펩티드에 대한 능동 면역 반응을 유발하기에 충분한 발현되는 폴리펩티드의 양이다. 특정한 실시양태에서, 투여량은 보호 면역 반응 (상기 정의된 바와 같음)을 생성하기에 충분하다. 면역원성 폴리펩티드 투여의 이익이 그의 임의의 단점을 능가하는 한, 부여되는 보호의 정도는 완전하거나 영구적일 필요는 없다.
본 발명의 추가 측면은 이종 작용제 (예를 들어, 핵산 전달 벡터)를 대상체에게 투여하는 방법이다. 핵산 전달 벡터를 그를 필요로 하는 인간 대상체 또는 동물에게 투여하는 것은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의한 것일 수 있다. 임의로, 핵산 전달 벡터는 제약상 허용되는 담체 중에서 치료 유효 또는 예방 유효 용량으로 전달된다.
핵산 전달 벡터는 면역원성 반응을 도출하기 위해 (예를 들어, 백신으로서) 추가로 투여될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역원성 유효량의 핵산 전달 벡터를 제약상 허용되는 담체와 조합하여 포함한다. 임의로, 투여량은 보호 면역 반응 (상기 정의된 바와 같음)을 생성하기에 충분하다. 면역원성 폴리펩티드 투여의 이익이 그의 임의의 단점을 능가하는 한, 부여되는 보호의 정도는 완전하거나 영구적일 필요는 없다. 대상체 및 면역원은 상기 기재된 바와 같다.
대상체에게 투여될 핵산 전달 벡터 (예를 들어, 바이러스 벡터)의 투여량은 투여 방식, 치료 및/또는 예방될 질환 또는 상태, 개별 대상체의 상태, 특정한 핵산 전달 벡터 및 전달될 핵산 등에 좌우되고, 상용 방식으로 결정될 수 있다. 치료 효과를 달성하기 위한 예시적인 용량은 적어도 약 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015 형질도입 단위, 임의로 약 108 - 1013 형질도입 단위의 역가이다.
특정한 실시양태에서, 1회 초과의 투여 (예를 들어, 2, 3, 4회 또는 그 초과의 투여)가 다양한 간격의 기간에 걸쳐, 예를 들어 매일, 매주, 매월, 매년 등에 걸쳐 유전자 발현의 목적하는 수준을 달성하는데 사용될 수 있다.
예시적인 투여 방식은 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입 (예를 들어, 에어로졸을 통해), 협측 (예를 들어, 설하), 질, 척수강내, 안내, 경피, 내피내, 자궁내 (또는 난소내), 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 두개내, 근육내 [골격근, 횡경막 근육 및/또는 심장 근육으로의 투여 포함], 흉막내, 뇌내 및 관절내), 국소 (예를 들어, 기도 표면을 포함한 피부 및 점막 표면 둘 다로의 투여 및 경피 투여), 림프내 등, 뿐만 아니라 직접 조직 또는 기관 주사 (예를 들어, 간, 눈, 골격근, 심장 근육, 횡경막 근육 또는 뇌로의 주사)를 포함한다.
투여는 뇌, 골격근, 평활근, 심장, 횡경막, 기도 상피, 간, 신장, 비장, 췌장, 피부 및 눈으로 이루어진 군으로부터 선택된 부위를 비제한적으로 포함한, 대상체 내의 임의의 부위에 대한 것일 수 있다.
투여는 또한 종양 (예를 들어, 종양 또는 림프절 내 또는 근처)에 대한 것일 수 있다. 임의의 주어진 경우에 가장 적합한 경로는 치료 및/또는 예방될 상태의 성질 및 중증도 및 사용될 특정한 벡터의 성질에 좌우될 것이다.
본 발명에 따른 골격근으로의 투여는 사지 (예를 들어, 상완, 하완, 윗 다리 및/또는 아랫 다리), 등, 목, 머리 (예를 들어, 혀), 흉곽, 복부, 골반/회음 및/또는 발가락의 골격근으로의 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 골격근은 소지외전근 (손), 소지외전근 (발), 무지외전근, 5번중족골벌림근, 단무지외전근, 장무지외전근, 단내전근, 무지내전근, 장수내전근, 대내전근, 모지내전근, 주근, 전사각근, 슬관절근, 상완이두근, 대퇴이두근, 상완근, 상완요골근, 협근, 오훼완근, 추미근, 삼각근, 구각하제근, 하순하제근, 이복근, 배측골간근 (손), 배측골간근 (발), 단요측수근신근, 장요측수근신근, 척측수근신근, 소지신근, 지신근, 단지신근, 장지신근, 단무지신근, 장무지신근, 시지신근, 단모지신근, 장모지신근, 요측수근굴근, 척측수근굴근, 단소지굴근 (손), 단소지굴근 (발), 단지굴근, 장지굴근, 심수지굴근, 표재지굴근, 단무지굴근, 장무지굴근, 단모지굴근, 장모지굴근, 전두근, 비복근, 이설골근, 대둔근, 중둔근, 소둔근, 박근, 경장늑근, 요장늑근, 흉장늑근, 장골근, 하쌍자근, 하사근, 하직근, 극하근, 가시사이근, 횡돌기간근, 외측 익상근, 외측 직근, 광배근, 구각거근, 상순거근, 상순비익거근, 상안검거근, 견갑거근, 장회전근, 두최장근, 경최장근, 흉최장근, 두장근, 경장근, 충양근 (손), 충양근 (발), 교근, 내측 익상근, 내측직근, 중사각근, 다열근, 악설골근, 하두사근, 상두사근, 외폐쇄근, 내폐쇄근, 후두근, 견갑설골근, 소지대립근, 모지대립근, 안륜근, 구륜근, 장측골간근, 단수장근, 장수장근, 치골근, 대흉근, 소흉근, 단비골근, 장비골근, 제삼비골근, 이상근, 저측골간근, 족저근, 활경근, 슬와근, 후사각근, 방형회내근, 원형회내근, 대요근, 대퇴방형근, 족저방형근, 전두직근, 외측두직근, 대후두직근, 소후두직근, 대퇴직근, 대능형근, 소능형근, 소근, 사르토리우스, 최소사각근, 반막양근, 두반극근, 경반극근, 흉반극근, 반건양근, 전거근, 단회전근, 가자미근, 두극근, 경극근, 흉극근, 두판상근 , 경판상근, 흉쇄유돌근, 흉골설골근, 흉골갑상근, 경돌설골근, 쇄골하근, 견갑하근, 상쌍자근, 상사근, 상직근, 회외근, 극상근, 측두근, 대퇴근막장근, 대원근, 소원근, 흉근, 갑상설골근, 전경골근, 후경골근, 승모근, 상완삼두근, 중광근, 외측광근, 내측광근, 대관골근 및 소관골근, 및 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 임의의 다른 적합한 골격근을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
이종 작용제는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 사지 관류 (임의로, 다리 및/또는 팔의 고립성 사지 관류; 예를 들어 문헌 [Arruda et al., (2005) Blood 105:3458-3464] 참조) 및/또는 직접 근육내 주사에 의해 골격근에 전달될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 이종 작용제는 사지 관류에 의해, 임의로 고립성 사지 관류에 의해 (예를 들어, 정맥내 또는 관절내 투여에 의해) 대상체 (예를 들어, 근육 이영양증, 예컨대 DMD를 갖는 대상체)의 사지 (팔 및/또는 다리)에 투여된다. 본 발명의 실시양태에서, 이종 작용제는 유리하게는 "유체역학적" 기술을 사용하지 않고 투여될 수 있다. 선행 기술 벡터의 조직 전달 (예를 들어, 근육으로의 전달)은 종종 유체역학적 기술 (예를 들어, 큰 부피로의 정맥내/정맥내 투여)에 의해 증진되며, 이는 혈관계 내의 압력을 증가시키고 내피 세포 장벽을 가로지르는 작용제의 능력을 용이하게 한다. 특정한 실시양태에서, 이종 작용제는 유체역학적 기술, 예컨대 고부피 주입 및/또는 상승된 혈관내 압력 (예를 들어, 정상 수축기 압력 초과, 예를 들어 정상 수축기 압력에 비해 혈관내 압력의 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 이하의 증가)의 부재 하에 투여될 수 있다. 이러한 방법은 유체역학적 기술과 연관된 부작용, 예컨대 부종, 신경 손상 및/또는 구획 증후군을 감소시키거나 피할 수 있다.
심장 근육으로의 투여는 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실 및/또는 중격으로의 투여를 포함한다. 이종 작용제는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 예컨대 대동맥내 투여, 직접 심장 주사 (예를 들어, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실 내로) 및/또는 관상 동맥 관류에 의해 심장 근육에 전달될 수 있다.
횡경막 근육으로의 투여는 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복강내 투여를 포함한 임의의 적합한 방법에 의한 것일 수 있다.
평활근으로의 투여는 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복강내 투여를 포함한 임의의 적합한 방법에 의한 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 투여는 평활근 내에, 그 근처에 및/또는 그 상에 존재하는 내피 세포에 대한 것일 수 있다.
표적 조직으로의 전달은 또한 이종 작용제를 포함하는 데포를 전달함으로써 달성될 수 있다. 대표적인 실시양태에서, 이종 작용제를 포함하는 데포는 골격근, 평활근, 심장 근육 및/또는 횡경막 근육 조직 내로 이식되거나, 또는 조직이 이종 작용제를 포함하는 필름 또는 다른 매트릭스와 접촉될 수 있다. 이러한 이식가능한 매트릭스 또는 기재는 미국 특허 번호 7,201,898에 기재되어 있다.
특정한 실시양태에서, 이종 작용제는 (예를 들어, 근육 이영양증 또는 심장 질환 [예를 들어, PAD 또는 울혈성 심부전]을 치료 및/또는 예방하기 위해) 골격근, 횡경막 근육 및/또는 심장 근육에 투여된다.
대표적인 실시양태에서, 본 발명은 골격근, 심장 근육 및/또는 횡경막 근육의 장애를 치료 및/또는 예방하는데 사용된다.
대표적인 실시양태에서, 본 발명은 근육 이영양증의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 근육 이영양증을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 포유동물 대상체에게 치료 또는 예방 유효량의 이종 작용제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 이종 작용제는 디스트로핀, 미니-디스트로핀, 마이크로-디스트로핀, 미오스타틴 프로펩티드, 폴리스타틴, 액티빈 유형 II 가용성 수용체, IGF-1, 항염증 폴리펩티드, 예컨대 I카파 B 우성 돌연변이체, 사르코스판, 유트로핀, 마이크로-디스트로핀, 라미닌-α2, α-사르코글리칸, β-사르코글리칸, γ-사르코글리칸, δ-사르코글리칸, IGF-1, 미오스타틴 또는 미오스타틴 프로펩티드에 대한 항체 또는 항체 단편 및/또는 미오스타틴에 대한 RNAi를 코딩하는 핵산을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 이종 작용제는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 골격근, 횡경막 근육 및/또는 심장 근육에 투여될 수 있다.
대안적으로, 본 발명은 핵산을 골격근, 심장 근육 또는 횡경막 근육에 전달하기 위해 실시될 수 있으며, 이는 장애 (예를 들어, 대사 장애, 예컨대 당뇨병 (예를 들어, 인슐린), 혈우병 (예를 들어, 인자 IX 또는 인자 VIII), 뮤코폴리사카라이드 장애 (예를 들어, 슬라이 증후군, 후를러 증후군, 샤이에 증후군, 후를러-샤이에 증후군, 헌터 증후군, 산필리포 증후군 A, B, C, D, 모르키오 증후군, 마로토-라미 증후군 등) 또는 리소솜 축적 장애 (예컨대 고셔병 [글루코세레브로시다제], 폼페병 [리소솜 산 α-글루코시다제] 또는 파브리병 [α-갈락토시다제 A]) 또는 글리코겐 축적 장애 (예컨대 폼페병 [리소솜 산 α 글루코시다제])를 치료 및/또는 예방하기 위해 혈액에서 정상적으로 순환하는 폴리펩티드 (예를 들어, 효소) 또는 기능적 핵산 (예를 들어, 기능적 RNA, 예를 들어 RNAi, 마이크로RNA, 안티센스 RNA)의 생산을 위한 또는 다른 조직으로의 전신 전달을 위한 플랫폼으로서 사용된다. 대사 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 다른 적합한 단백질은 상기 기재되어 있다. 관심 핵산을 발현시키기 위한 플랫폼으로서의 근육의 사용은 미국 특허 공개 번호 2002/0192189에 기재되어 있다.
따라서, 한 측면으로서, 본 발명은 대사 장애의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 대사 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법을 추가로 포괄하며, 이러한 방법은 대상체에게 (예를 들어, 대상체의 골격근에) 치료 또는 예방 유효량의 이종 작용제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 이종 작용제는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하고, 대사 장애는 폴리펩티드에서의 결핍 및/또는 결함의 결과이다. 예시적인 대사 장애 및 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 본원에 기재된다. 임의로, 폴리펩티드는 분비된다 (예를 들어, 그의 천연 상태의 분비된 폴리펩티드이거나 또는 예를 들어 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 분비 신호 서열과의 작동가능한 회합에 의해 분비되도록 조작된 폴리펩티드). 본 발명의 임의의 특정한 이론에 의해 제한되지 않으면서, 이러한 실시양태에 따르면, 골격근에 대한 투여는 폴리펩티드의 체순환 내로의 분비 및 표적 조직(들)으로의 전달을 가져올 수 있다. 이종 작용제를 골격근에 전달하는 방법은 본원에 보다 상세히 기재되어 있다.
본 발명은 또한 전신 전달을 위한 안티센스 RNA, RNAi 또는 다른 기능적 RNA (예를 들어, 리보자임)를 생산하기 위해 실시될 수 있다.
본 발명은 또한 선천성 심부전 또는 PAD의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 선천성 심부전 또는 PAD를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 포유동물 대상체에게 치료 또는 예방 유효량의 본 발명의 이종 작용제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 이종 작용제는, 예를 들어 근형질 내부세망 Ca2+-ATPase (SERCA2a), 혈관신생 인자, 포스파타제 억제제 I (I-1), 포스포람반에 대한 RNAi; 포스포람반 억제 또는 우성-음성 분자, 예컨대 포스포람반 S16E, 포스포람반 유전자를 조절하는 아연 핑거 단백질, β2-아드레날린성 수용체, β2-아드레날린성 수용체 키나제 (BARK), PI3 키나제, 칼사르칸, β-아드레날린성 수용체 키나제 억제제 (βARKct), 단백질 포스파타제 1의 억제제 1, S100A1, 파르브알부민, 아데닐릴 시클라제 유형 6, G-단백질 커플링된 수용체 키나제 유형 2 녹다운을 일으키는 분자, 예컨대 말단절단된 구성적으로 활성인 bARKct, Pim-1, PGC-1α, SOD-1, SOD-2, EC-SOD, 칼리크레인, HIF, 티모신-β4, mir-1, mir-133, mir-206 및/또는 mir-208을 코딩하는 핵산을 포함한다.
주사제는 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전 액체 중의 용해 또는 현탁에 적합한 고체 형태 또는 에멀젼으로서 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 대안적으로, 이종 작용제를 전신 방식보다는 국부 방식으로, 예를 들어 데포 또는 지속-방출 제제로 투여할 수 있다. 추가로, 이종 작용제는 외과적으로 이식가능한 매트릭스에 부착되어 전달될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2004-0013645에 기재된 바와 같음).
본원에 개시된 이종 작용제는 임의의 적합한 수단에 의해, 임의로 대상체가 흡입하는 이종 작용제로 구성된 호흡가능한 입자의 에어로졸 현탁액을 투여함으로써 대상체의 폐에 투여될 수 있다. 호흡가능한 입자는 액체 또는 고체일 수 있다. 이종 작용제를 포함하는 액체 입자의 에어로졸은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 임의의 적합한 수단, 예컨대 압력-구동 에어로졸 네뷸라이저 또는 초음파 네뷸라이저에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,501,729를 참조한다. 이종 작용제를 포함하는 고체 입자의 에어로졸은 마찬가지로 제약 기술분야에 공지된 기술에 의해 임의의 고체 미립자 의약 에어로졸 발생기를 사용하여 생성될 수 있다.
이종 작용제는 CNS의 조직 (예를 들어, 뇌, 눈)에 투여될 수 있고, 유리하게는 본 발명의 부재 하에 관찰될 것보다 더 넓은 이종 작용제 분포를 유발할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 이종 작용제는 유전 장애, 신경변성 장애, 정신 장애 및 종양을 포함한 CNS의 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있다. CNS의 예시적인 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 카나반병, 라이병, 레프숨병, 투렛 증후군, 원발성 측삭 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 진행성 근육 위축, 픽병, 근육 이영양증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 빈스방거병, 척수 또는 두부 손상으로 인한 외상, 테이 삭스병, 레쉬-니한병, 간질, 뇌 경색, 기분 장애 (예를 들어, 우울증, 양극성 정동 장애, 지속성 정동 장애, 속발성 기분 장애)를 포함한 정신 장애, 정신분열증, 약물 의존 (예를 들어, 알콜중독 및 다른 물질 의존), 신경증 (예를 들어, 불안, 강박 장애, 신체형 장애, 해리성 장애, 애도, 산후 우울증), 정신병 (예를 들어, 환각 및 망상), 치매, 편집증, 주의력 결핍 장애, 정신성성적 장애, 수면 장애, 통증 장애, 섭식 또는 체중 장애 (예를 들어, 비만, 악액질, 신경성 식욕부진 및 폭식증) 및 CNS의 암 및 종양 (예를 들어, 뇌하수체 종양)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
CNS의 장애는 망막, 후방관 및 시신경을 수반하는 안과 장애 (예를 들어, 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증 및 다른 망막 변성 질환, 포도막염, 연령-관련 황반 변성, 녹내장)를 포함한다.
모두는 아니지만 대부분의 안과 질환 및 장애는 3가지 유형의 적응증: (1) 혈관신생, (2) 염증 및 (3) 변성 중 하나 이상과 연관된다. 본 발명의 이종 작용제는 항혈관신생 인자; 항염증 인자; 세포 변성을 지체시키거나 세포 보존을 촉진하거나 또는 세포 성장을 촉진하는 인자 및 상기의 조합을 전달하는데 사용될 수 있다.
당뇨병성 망막병증은, 예를 들어 혈관신생을 특징으로 한다. 당뇨병성 망막병증은 1종 이상의 항혈관신생 인자를 안내로 (예를 들어, 유리체에) 또는 안구주위로 (예를 들어, 테논낭하 영역에) 전달함으로써 치료될 수 있다. 1종 이상의 신경영양 인자는 또한 안내로 (예를 들어, 유리체내로) 또는 안구주위로 공동-전달될 수 있다.
포도막염은 염증을 수반한다. 1종 이상의 항염증 인자는 본 발명의 전달 벡터의 안내 (예를 들어, 유리체 또는 전방) 투여에 의해 투여될 수 있다.
비교하면, 색소성 망막염은 망막 변성을 특징으로 한다. 대표적인 실시양태에서, 색소성 망막염은 1종 이상의 신경영양 인자를 코딩하는 이종 작용제의 안내 투여 (예를 들어, 유리체 투여)에 의해 치료될 수 있다.
연령-관련 황반 변성은 혈관신생 및 망막 변성 둘 다를 수반한다. 이 장애는 1종 이상의 신경영양 인자를 코딩하는 이종 작용제를 안내로 (예를 들어, 유리체에) 및/또는 1종 이상의 항혈관신생 인자를 코딩하는 이종 작용제를 안내로 또는 안구주위로 (예를 들어, 테논낭하 영역에) 투여함으로써 치료될 수 있다.
녹내장은 증가된 안압 및 망막 신경절 세포의 상실을 특징으로 한다. 녹내장에 대한 치료는 이종 작용제를 사용하여 흥분독성 손상으로부터 세포를 보호하는 1종 이상의 신경보호제의 투여를 포함한다. 이러한 작용제는 N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA) 길항제, 시토카인 및 신경영양 인자를 포함하며, 안내로, 임의로 유리체내로 전달된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 발작을 치료하는데, 예를 들어 발작의 발병, 발생률 또는 중증도를 감소시키는데 사용될 수 있다. 발작에 대한 치유적 치료의 효능은 행동 (예를 들어, 진전, 눈 또는 입의 틱) 및/또는 전기사진 수단 (대부분의 발작은 시그니쳐 전기사진 이상을 가짐)에 의해 평가될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 시간 경과에 따른 다발성 발작으로 표시되는 간질을 치료하는데 사용될 수 있다.
한 대표적인 실시양태에서, 소마토스타틴 (또는 그의 활성 단편)은 뇌하수체 종양을 치료하기 위해 본 발명의 이종 작용제를 사용하여 뇌에 투여된다. 이러한 실시양태에 따르면, 소마토스타틴 (또는 그의 활성 단편)을 코딩하는 이종 작용제는 뇌하수체 내로의 미세주입에 의해 투여된다. 마찬가지로, 이러한 치료는 선단비대증 (뇌하수체로부터의 비정상적 성장 호르몬 분비)을 치료하는데 사용될 수 있다. 핵산 (예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 J00306) 및 아미노산 (예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 P01166; 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 소마토스타틴의 프로세싱된 활성 펩티드 소마토스타틴-28 및 소마토스타틴-14) 서열을 함유한다.
특정한 실시양태에서, 이종 작용제는 미국 특허 번호 7,071,172에 기재된 바와 같은 분비 신호를 포함할 수 있다.
본 발명의 대표적인 실시양태에서, 이종 작용제는 CNS (예를 들어, 뇌 또는 눈)에 투여된다. 이종 작용제는 척수, 뇌간 (연수, 교뇌), 중뇌 (시상하부, 시상, 시상상부, 뇌하수체, 흑색질, 송과선), 소뇌, 종뇌 (선조체, 후두엽, 측두엽, 두정엽 및 전두엽을 포함한 대뇌, 피질, 기저 신경절, 해마 및 편도체문맥), 변연계, 신피질, 선조체, 대뇌 및 하구 내로 도입될 수 있다. 이종 작용제는 또한 눈의 상이한 영역, 예컨대 망막, 각막 및/또는 시신경에 투여될 수 있다.
이종 작용제는 이종 작용제의 보다 분산된 투여를 위해 뇌척수액 내로 (예를 들어, 요추 천자에 의해) 전달될 수 있다. 이종 작용제는 추가로 혈액-뇌 장벽이 교란된 상황 (예를 들어, 뇌 종양 또는 뇌 경색)에서 CNS에 혈관내로 투여될 수 있다.
이종 작용제는 척수강내, 안내, 뇌내, 뇌실내, 정맥내 (예를 들어, 만니톨과 같은 당의 존재 하에), 비강내, 이내, 안내 (예를 들어, 유리체내, 망막하, 전방) 및 안구주위 (예를 들어, 테논낭하 영역) 전달, 뿐만 아니라 운동 뉴런으로의 역행성 전달과 함께 근육내 전달을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 임의의 경로에 의해 CNS의 목적하는 영역(들)에 투여될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 이종 작용제는 CNS 내의 목적하는 영역 또는 구획으로의 직접 주사 (예를 들어, 정위 주사)에 의해 액체 제제로 투여된다. 다른 실시양태에서, 이종 작용제는 목적하는 영역에 대한 국소 적용에 의해 또는 에어로졸 제제의 비강내 투여에 의해 제공될 수 있다. 눈에 대한 투여는 액체 액적의 국소 적용에 의한 것일 수 있다. 추가 대안으로서, 이종 작용제는 고체의 느린-방출 제제로서 투여될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,201,898 참조).
추가의 실시양태에서, 이종 작용제는 운동 뉴런을 수반하는 질환 및 장애 (예를 들어, 근위축성 측삭 경화증 (ALS); 척수성 근육 위축 (SMA) 등)를 치료 및/또는 예방하기 위한 역행성 수송에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이종 작용제는 근육 조직으로 전달될 수 있으며, 이로부터 뉴런으로 이동할 수 있다.
단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 이종 작용제에 대해 상기 기재된 임의의 경로 또는 스케줄에 의해 투여될 수 있다. 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 이종 작용제와 상이한 경로 또는 스케줄에 의해 투여될 수 있다.
본 발명을 기재하였지만, 이는 하기 실시예에서 보다 상세히 설명될 것이며, 이는 단지 예시 목적을 위해 본원에 포함되고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지는 않는다.
실시예
실시예 1: 방법
AAV 바이러스 생산: HEK293 세포에서 3-플라스미드 형질감염에 의한 표준 접근법을 사용하여 AAV 벡터를 생산하였다. 간략하게, AAV 트랜스진 플라스미드 pTR-CBA-Luc를 AAV Rep/Cap 헬퍼 플라스미드 (pXR2 또는 pXR8) 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 pXX6-80과 함께 공동-형질감염시켰다. 72시간 후에, 세포 배양물을 수거하고, 동결 해동 및 초음파처리에 의해 용해시켰다. 정화된 세포 용해물을 DNAse 처리하고, 15%/25%/40%/60% 아이오딕사놀 단계 구배로 초원심분리하고, 음이온 교환 Q-칼럼에 의해 정제하였다. 정제된 AAV 벡터를 패키징된 AAV 트랜스진의 절편을 증폭시키도록 지시된 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 적정하였다.
단백질 생산: 막횡단 도메인이 결여된 말단절단된 엠. 게니탈리움 단백질 MG281 (아미노산 74 내지 479)인 단백질 M을 코딩하고 N-말단 His-태그 및 트롬빈 절단 부위를 보유하는 플라스미드 pET-28b(+)가 라제쉬(Rajesh)에 의해 넉넉하게 제공되었다. 플라스미드를 전기-적격 DH10B 세포에서 증식시키고, 인비트로젠(Invitrogen)으로부터의 퓨어링크 맥시-프렙 키트를 사용하여 정제하였다. pET-28b(+) 플라스미드를 밤샘 출발 배양물을 사용하여 BL21/DE3 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 자가-유도 배지 (인비트로젠으로부터의 매직 배지)에 출발 배양물을 시딩하고, 18℃에서 3일 동안 1 L 내지 4 L 배양 부피로 성장시켰다. 이어서, 배양물을 원심분리에 의해 펠릿화하고, -80℃에서 동결시켰다.
단백질 정제: 동결된 박테리아 세포 배양 펠릿을 해동시키고, 초음파처리에 의해 용해시키고, DNAse 처리하고, 원심분리에 의해 정화하였다. 정화된 박테리아 용해물을 니켈-결합 완충제 (20 mM 이미다졸, 50 mM 인산나트륨 pH 7.4, 500 mM NaCl, 0.02% 아지드화나트륨) 중으로 투석하고, FPLC를 사용하여 니켈 His-트랩 FF 칼럼에 통과시켰다. 이어서, 니켈 칼럼에 의해 결합된 단백질 M을 500 mM 이미다졸을 함유하는 것외에 동일한 완충제 베이스에 의해 용리시켰다. 이어서, 단백질 M을 S-100 크기 배제 칼럼을 통해 전개시키고, 2% 글리세롤을 함유하는 포스페이트 완충 염수 중으로 투석하고, 분광광도측정법을 사용하여 정량화하였다. 단백질 분리를 위한 SDS-PAGE 단백질 겔 전기영동, 이어서 48 kDa 단백질 M 밴드를 정확하게 확인하기 위한 쿠마시 블루 단백질 염색을 사용하여 단백질 M 정체를 확인하였다.
웨스턴 블롯: 8% SDS-PAGE 겔 상에서의 단백질 분리 후, 단백질을 PVDF 막 상으로 옮겼다. 항-His 1차 항체 1:1000 희석물 (10 μg/ml)을 사용하여 5% 탈지유에서 이뮤노블롯팅을 수행하였다. 2차 염소 항-인간 IgG 항체를 양고추냉이 퍼옥시다제에 접합시켰다 (1:10,000 희석).
세포 배양: HEK-293 세포 및 Huh7 세포를 각각 모든 시험관내 AAV 중화 실험 및 형질도입의 증진에 사용하였다. 세포를 10% 소 송아지 혈청 및 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지에서 5% CO2 하에 37℃에서 유지하였다.
인간 IVIG 및 면역화된 마우스 혈청: 10% 인간 IVIG (가무넥스(Gamunex))를 그리폴스 테라퓨틱스 인크.(Grifols Therapeutics Inc.) (미국 노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크)로부터 구입하였다. 3x1010개 바이러스 게놈의 AAV8-FVIII의 IP 투여에 이어서 2주 후 동일한 벡터의 부스트 투여 및 제1 투여 6주 후 제2 부스트를 수행한 후 12마리의 상이한 마우스 (50% 수컷, 50% 암컷)로부터 혈청을 수집하고 풀링하였다. 인간 IVIG 및 마우스 혈청을 분취하고, 향후 사용을 위해 -80℃에서 저장하였다.
시험관내 AAV 중화 검정: NAb 분석을 약간 변형하여 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 무혈청 X-비보 10 배지 중에 재현탁시킨 다음, 48-웰 또는 96-웰 플레이트 포맷에 플레이팅하였다. 인간 IVIG 또는 혈청을 2배 또는 10배 연속 희석하였다. AAV-Luc를 인간 IVIG 또는 마우스 혈청과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, AAV를 첨가하고, 4℃에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, AAV+혈청 인큐베이션물을 플레이팅 시 무혈청 배지 중에 현탁된 세포와 혼합하였다. 단백질 M을 사용하는 중화 실험에서, 다음 3가지 상이한 인큐베이션 시나리오를 4℃에서 1시간 동안 각각의 단계로 시험하였다: 중화 혈청을 먼저 단백질 M과 인큐베이션한 후, 이어서 AAV와 인큐베이션, AAV를 먼저 중화 혈청과 인큐베이션한 후, 이어서 단백질 M과 인큐베이션, 및 AAV를 먼저 단백질 M과 인큐베이션한 후, 이어서 중화 혈청과 인큐베이션. 세포를 48-웰 플레이트에 200 μl 배지 중에 또는 96-웰 플레이트에 100 μl 배지 중에 시딩하였다. 형질도입 후, 세포를 37℃에서 24-48시간 동안 배양하여 AAV-루시페라제 트랜스진이 발현되도록 하였다. Luc 활성을 측정하기 위해, 세포를 수동 용해 완충제 (프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨)로 용해시키고, 루시페라제 신호를 왈락1420 빅터 2 자동화 플레이트 판독기로 측정하였다. NAb 역가는 루시페라제 활성이 무혈청 대조군보다 50% 더 낮은 최고 희석률로 정의하였다.
NAb 혈청의 생체내 AAV 중화 및 수동 전달: AAV NAb를 함유하는 상이한 양의 혈청을 C57BL/6 마우스의 안와후 정맥 내로 주사하고, 20분 후에 AAV를 주사하였다. AAV 투여 전에 단백질 M 처리를 받은 마우스의 경우, 단백질 M (2:1 비에 대해 6.3 mg, 1:1 비에 대해 3.15 mg, 또는 0.5:1 비에 대해 1.58 mg)을 혈청 주사 5-15분 후 안와후 정맥에 의해 전달하였다. AAV를 5분 후 AAV-Luc 벡터 kg당 2x1012개 입자의 전신 주사에 의해 투여하였다. AAV 투여 1일 후, 뿐만 아니라 주사 후 1주 및 9일 시점에 영상화를 수행하였다.
실시예 2: 단백질 M은 AAV 형질도입에 대한 IVIG의 억제 활성을 제거한다
단백질 M의 항체 차단 기능을 연구하기 위해, 인간 정맥내 이뮤노글로불린 감마 (IVIG)에 의한 AAV의 시험관내 중화 검정을 설정하였다. IVIG의 연속 희석물을 사용하여 AAV 중화 검정을 수행함으로써 주어진 양의 AAV2를 중화시킬 IVIG의 양을 결정하였다. AAV-루시페라제 벡터를 사용한 세포 형질도입에 의해 생성된 루시페라제 활성은 유전자 발현의 기능적 판독치로서의 역할을 하였다. 중화는 IVIG 부재 대조군에 대해 정규화된 루시페라제 활성의 퍼센트로서 결정하였다. 12.5 μg의 IVIG는 75% (+/-5%)의 AAV2를 중화시키는 것으로 밝혀졌고 (도 1), 이러한 양의 IVIG를 선택하여 단백질 M에 의한 IVIG의 AAV 중화 차단을 시험하는 실험 설계로 진행하였다. 다음으로, 트롬빈 절단에 의해 His-태그를 제거하고 12.5 μg의 IVIG를 차단하는 능력을 제거함으로써 수집된 단백질 M (서열식별번호: 2)의 용량 연속 희석을 수행하였으며 (도 2), 여기서 단백질 M을 세포 배양 형질도입 전 4℃에서 IVIG와 함께 1시간 동안, 이어서 AAV2와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 2개의 단백질 M 분자 대 1개의 IgG 분자의 몰비는 IVIG 부재 대조군과 등가 수준으로 중화를 방지하는데 충분한 것으로 밝혀졌다. 추가로, 단백질 M 대 IVIG의 보다 높은 몰비는 루시페라제 신호를 IVIG 부재 대조군보다 더 큰 수준으로 증진시키는 것으로 밝혀졌다 (도 2). 8개의 단백질 M 분자 대 1개의 IgG는 루시페라제 발현을 2배 증가시켰다. 보다 큰 몰비에 의해 증진이 추가로 증가하는지를 알아보기 위해, 8:1 및 20:1 비의 단백질 M 대 IVIG를 동일한 실험 조건에서 시험하였다. 단백질 M 용량을 2.5배 (8:1에서 20:1 비로) 증가시키는 것은, 상응하는 신호가 8:1 비에 비해 단지 0.25배만 증가하였기 때문에 추가 증진을 거의 제공하지 않는 것으로 밝혀졌다 (도 3). 추가적으로, 단백질 M에 의한 이뮤노글로불린 차단 활성은 N-말단 His 태그의 절단에 의존하지 않는 것으로 밝혀졌고, 따라서 His 태그의 절단이 없는 단백질 M을 다음 실험에 사용하였다.
실시예 3: 단백질 M과 AAV 벡터 비리온의 상호작용은 AAV 형질도입을 증진시킨다
본 발명자들로부터의 이전 연구는 혈청 단백질과 AAV 비리온의 상호작용이 AAV 형질도입을 증진시킬 수 있다는 것을 입증하였다. AAV 형질도입에 대한 단백질 M의 증진 기능을 추가로 특징화하기 위해, 용량-반응 검정을 IVIG 없이 수행하였으며, 여기서 연속 2배 희석의 단백질 M을 세포 배양 형질도입 전 1시간 동안 AAV와 함께 인큐베이션하였다. 도 4에서, 이전 실험으로부터의 단백질 M의 8:1 비 (33 μg 단백질 M)가 IVIG의 부재 하에 AAV 형질도입을 용량 의존성으로 증진시킬 수 있고, 2x108개 바이러스 입자에 대해 2 μg 미만의 단백질 M의 희석물에서 증진이 상실된 것으로 밝혀졌다. 증진이 상실된 단백질 M 분자 대 AAV 입자의 당량 몰비는 40,000:1 미만이었다. 다음으로, 단백질 M에 의한 형질도입 증진이 단백질 M과 AAV의 인큐베이션에 의존성이라는 것이 입증되었다. 도 5에서, 세포 배양 형질도입 검정을 수행하였으며, 여기서 단백질 M을 세포에 첨가하기 1시간 전에 AAV에 첨가하거나 (사전-인큐베이션, -1시간 시점), 사전-인큐베이션 없이 형질도입 시에 첨가하거나 (형질도입-당시, 0시간 시점) 또는 AAV를 세포에 첨가한지 18시간 후에 첨가하였다 (형질도입-후, 18시간 시점). 용량-의존성 증진은 도 4에서의 경우와 유사하게 사전-인큐베이션 군에서 나타났지만, 단백질 M 및 AAV2가 검정 전 함께 인큐베이션되지 않은 다른 2개의 군에서는 나타나지 않은 것으로 발견되었다. 추가로, 이러한 결과는 또한 단백질 M 증진의 메카니즘이 벡터 캡시드와의 상호작용을 수반하고, 형질도입 시에 세포에 단백질 M을 첨가하는 것이 루시페라제 신호에 영향을 미치지 않았기 때문에 세포에 대한 단백질 M의 생물학적 효과는 수반하지 않는다는 것을 주장한다. 마지막으로, 단백질 M은 IVIG가 먼저 AAV2와 함께 1시간 동안 사전-인큐베이션된 후, 이어서 단백질 M과 함께 1시간 인큐베이션되는 경우에는 중화를 차단할 수 없고, 단백질 M에 의한 AAV2 루시페라제 신호의 증진은 단지 AAV2가 IVIG에 의해 완전히 중화되지 않은 경우에만 존재하는 것으로 입증되었다. 이 검정을 위해, 12.5 μg의 IVIG (이는 75-80%의 AAV2를 중화시킴), 50 μg의 IVIG (이는 99%의 AAV2를 중화시킴, 도 1) 또는 200 μg의 IVIG (이는 100%의 AAV2를 중화시킴)를 사용하였다. 도 6에서, 99-100%의 AAV2가 IVIG (50 μg 및 200 μg)에 의해 중화된 경우에는, 단백질 M이 중화를 차단할 수 없고, 형질도입 증진을 제공할 수 없는 것으로 관찰되었다. 도 2 및 3에서의 데이터와 조합되어, 이러한 결과는 과량의 단백질 M이 이뮤노글로불린에 결합한 후 AAV 비리온과 상호작용할 수 있고 증진된 형질도입을 유발한다는 것을 암시한다.
실시예 4: 단백질 M과 AAV 벡터 비리온의 사전-인큐베이션은 IVIG의 AAV 중화를 보호한다
다음에, 단백질 M이 먼저 IVIG와 상호작용하도록 하는 것 대신에 단백질 M을 먼저 AAV와 함께 사전-인큐베이션한 다음에 IVIG와 인큐베이션하는 것의 효과를 조사하기로 결정하였다. 단백질 M을 AAV2와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후, 이어서 IVIG를 첨가하고, 세포 형질도입 전 4℃에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션한 경우에, 단백질 M의 중화 차단 능력을 조사하였다. 도 7에서, 단백질 M 농도가 정적 (8.25 μg)으로 유지되고, IVIG의 용량이 50 μg에서 3.12 μg (1:2에서 8:1 몰비의 단백질 M 대 IVIG)으로 연속 희석되는 경우에, 벡터의 중화로부터의 보호가 2:1 비 이상에서 달성되며, 이는 단백질 M을 AAV 첨가 전 IVIG와 함께 인큐베이션한 경우의 이전 결과와 유사한 것으로 밝혀졌다. IgG 이외의 다른 유형의 단백질이 혈청에 존재하는 생체내 상황에 보다 가까운 환경을 시뮬레이션하기 위한 노력으로, 유사한 시험관내 중화 시험을 10% 태아 소 혈청 (FBS)의 존재 하에 수행하였다. 소 혈청에 대한 제조업체의 IgG 정량화에 따라, 배지 부피는 웰당 ~350 μg의 소 IgG를 함유하는 것으로 추정되었다. 이어서, 25 μg IVIG 또는 무혈청 배지를 웰의 절반에 스파이킹하여 AAV를 중화시키거나 또는 중화 활성이 없는 대조군으로서의 역할을 하도록 하였다. 도 8에서, 단백질 M을 형질도입 전 1시간 동안 AAV와 함께 인큐베이션하고, 총 IgG를 4:1, 2:1 및 1:1 (단백질 M 대 IgG)의 상이한 몰비로 첨가하였을 때 (인간 및 소), 심지어 1:1 비에서도 중화로부터의 보호가 관찰되었다. 이들 결과는 단백질 M이 심지어 다른 혈청 단백질의 존재 하에서도 이뮤노글로불린에 결합하여 이를 차단할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5: 시험관내에서 AAV에 대한 뮤린 혈청의 중화 활성에 대한 단백질 M의 효율적인 차단 기능
IVIG로부터의 발견을 실제 상황에 해석 적용하기 위해, 먼저 AAV8 캡시드 벡터로 면역화된 마우스로부터의 혈청을 사용하여 AAV8-루시페라제 벡터로 시험관내 중화 실험을 수행하였다. 면역화된 마우스로부터의 혈청 및 단백질 M을 둘 다 혈청 단독 대조군과 비교하여 2:1의 몰비의 결과를 유지하도록 연속 희석한 경우에, 단백질 M은 1:2,564의 역가에서 중화 혈청의 추정 ~100배 희석에 걸쳐 중화로부터의 회피를 허용하는 것으로 밝혀졌다 (단백질 M의 존재 하에 0.2744 μl의 혈청 대 0.0039 μl의 혈청에서의 50% 중화, 도 9).
실시예 6: 생체내에서 AAV에 대한 뮤린 혈청의 중화 활성에 대한 단백질 M의 효율적인 차단 기능
다음으로, 상이한 부피의 중화 혈청을 안와후 주사를 통해 나이브 마우스 내로 수동 전달하는 생체내 실험을 수행하였다. 혈청을 마우스에 5-15분 동안 관류시킨 후에, 단백질 M을 또한 안와후 주사를 통해 마우스에게 전신 투여하고, 이어서 5분 후에 AAV8-Luc (2x1010개 바이러스 게놈)를 투여하였다. 도 10은 단백질 M이, 마우스에서 총 이뮤노글로불린에 대한 2:1 (6.3 mg)의 추정 몰비에서, 1 μl의 AAV8-NAb 혈청에 의한 AAV8의 중화를 방지할 수 있다는 것을 보여준다 (역가 1:2,564). 이는 50% 초과의 AAV8-Luc가 1 μl 내지 0.001 μl의 혈청 부피에서 중화되어 1,000배의 농도 차이에 걸친 AAV NAb 회피를 나타내는 연속 희석된 항-AAV8 혈청의 생체내 중화 검정과 비교된다 (도 11).
실시예 7: 단백질 M/이뮤노글로불린 복합체의 안정성
단백질 M과 이뮤노글로불린의 복합체가 얼마나 안정한지를 연구하기 위해, 먼저 시험관내에서 검정을 수행하였다. 단백질 M을 마우스 혈청과 함께 2:1의 분자 비로 37℃에서 1시간 내지 72시간의 상이한 지속기간 동안 사전-인큐베이션한 다음, 중화 분석을 위해 AAV8 벡터를 4℃에서 1시간 초과 동안 첨가하였다. 도 12에 제시된 바와 같이, 마우스 혈청 내의 항-AAV8 이뮤노글로불린과 단백질 M 사이의 사전-형성된 복합체는, 단백질 M 없이 중화 혈청을 함유하거나 또는 단지 PBS 또는 배지만을 함유하는 대조군과 비교하여, 세포 배양물에 첨가 전 37℃에서 인큐베이션된 경우에 72시간 초과 동안 안정하였다. 이러한 결과는 단백질 M과 이뮤노글로불린 사이에 형성된 복합체가 시험관내에서 고도로 안정하다는 것을 시사한다.
다음으로, 단백질 M의 생체내 안정성을 0.3 μl의 AAV8 중화 혈청의 수동 전달 후에 조사하였다. 단백질 M을 투여하고, 5분 대신 3시간 기다린 경우에는, 단백질 M의 항체 차단 기능이 3.5x105에서 1x105 광자/초/cm2/자발적 비율로 ~70% 감소되는 것으로 밝혀졌다 (도 13). 이러한 결과는 단백질 M의 NAb 차단 효과가 생체내에서 짧게 생존한다는 것을 나타낸다.
AAV 벡터를 사용한 유전자 요법은 임상 시험에서 성공적이었다. 그러나, 인간 집단에서의 AAV 중화 항체의 높은 출현율은 보다 많은 환자가 이러한 효과적인 유전자 전달로부터 이익을 얻지 못하게 한다. 이 연구에서, 미코플라스마로부터 유래된 단백질 M은 NAb와 상호작용하고 AAV 형질도입을 증진시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. NAb 활성을 차단하는데 필요한 단백질 M의 최소 용량은 이뮤노글로불린보다 2배 더 많은 분자였다. 단백질 M과 AAV 비리온의 직접적 상호작용도 또한 AAV 형질도입을 증가시켰다. 중화 항체 검정은 AAV 면역화된 마우스 혈청을 시험관내에서 단백질 M과 함께 인큐베이션한 경우에 대략 100배의 NAb 활성이 감소되었고, NAb 양성 혈청이 입양 전달된 마우스에서 단백질 M을 적용한 경우에 1000배 초과의 보호가 관찰되었다는 것을 보여주었다. 단백질 M과 이뮤노글로불린의 복합체는 시간 경과에 따라 시험관내에서 안정하였지만, 단백질 M은 생체내 이뮤노글로불린의 중화로부터의 그의 보호 기능을 점차 상실한다.
AAV NAb를 극복하기 위해, 다수의 전략이 실험실에서 이용되었다. 하나의 접근법은 코팅을 위한 중합체 또는 엑소솜을 사용하여 Nab 인식을 차단하기 위해 AAV 표면을 차폐하는 것이다. 이러한 접근법은 유망하지만, AAV 형질도입 프로파일을 변화시킬 수 있다. 제2 접근법은 오류-유발 PCR 또는 DNA 셔플링을 사용하여 AAV 캡시드 변이체의 라이브러리를 생성하고, 시험관내 및 생체내 NAb의 존재 하에 NAb 회피 돌연변이체를 선택하는 것이다. 이러한 접근법은 신규 캡시드를 생성하였으나; 이는 인간에서 미지의 형질도입 효율을 갖는 캡시드를 생성한다는 잠재적 한계를 갖는데, 이들 돌연변이체가 동물 조직으로부터 단리되고 동물 조직에서 시험되며, 동물 연구로부터의 데이터가 항상 인간에 해석 적용되지는 않을 뿐만 아니라 인간 조직에서의 AAV 형질도입을 예측하는데 이용가능한 진정한 시스템이 없기 때문이다. 제3 접근법은 낮은 NAb 교차-반응성을 나타내거나 또는 이러한 반응성이 부재하는 대안적 혈청형의 AAV를 사용하는 것이었다. 이러한 대중적인 전략은 동물 모델에서 논리적이고 성공적이지만, 동물에서 예측될 수 없는 대부분의 인간에서의 교차-반응성의 존재에 관한 우려가 남아있다. 최종 실험실 접근법은 AAV 캡시드 표면 상의 NAb 결합 도메인을 합리적으로 조작하여 NAb 결합 부위를 제거하는 것이다. 이러한 전략은 모노클로날 항체 에피토프 및 AAV 비리온의 구조에 관한 정보를 요구하며, 인간 혈청으로부터의 NAb가 폴리클로날이고, 모든 생성된 NAb를 나타내는 mAb를 인간으로부터 수득하는 것이 불가능하다는 사실로 인해 본질적으로 제한된다. 여러 임상 관련 접근법이 또한 연구되었다: 한 예는 벡터 전달 전에 혈장분리반출술을 수행하는 것이다. 그러나, 분리반출술의 각각의 라운드의 상대적 비효율성 및 심지어 낮은 역가의 NAb (<1:5)가 AAV 형질도입을 제거할 수 있다는 사실로 인해, 이 전략은 단지 더 낮은 출발 역가의 AAV NAb를 갖는 환자에 대해서만 적합하고, 다수 세션의 분리반출술을 요구한다. 유사하게, 항-CD20 항체 (리툭시맙)의 사용은 B 세포 고갈을 달성할 수 있지만, 장시간 (약 6-9개월)이 걸리고, 소수의 대상체에서 AAV NAb를 감소시키는데만 효과적이다. 최종 임상 접근법은 과다한 비어있는 AAV 캡시드를 NAb에 대한 디코이로서 사용하는 것이다. 비어있는 입자의 첨가가 AAV 캡시드 로드를 증가시키며, 이는 잠재적으로 AAV 형질도입된 세포의 제거를 매개하는 캡시드 특이적 세포독성 면역 반응을 증가시키고, 아마도 효과적인 형질도입을 위해 완전한 AAV 입자와 경쟁할 것이라는 우려가 남아있다. 추가적으로로, 비어있는 캡시드는 완전한 AAV 벡터보다 더 큰 간 염증을 유도할 수 있다. 상기 접근법에서의 낮은 효율의 NAb로부터의 보호 또는 합병증과 비교하여, 이 연구에서 이뮤노글로불린 결합 단백질 M을 사용하여 중화 항체 활성을 차단하는 보다 큰 잠재력을 갖는 전략이 입증되었다. 단백질 M을 사용한 경우에 NAb 회피 능력은 시험관내에서 100배 및 생체내에서 1000배 초과로 달성되었다.
단백질 M은 항체 경쇄 및 중쇄 상의 보존된 영역에 보편적으로 결합하여 항원 인식 또는 CDR 영역에 대한 구조적 간섭을 유발함으로써 포유동물 IgG, IgM 및 IgA 항체 부류를 차단하는 보편적 항체 결합 단백질로서 기능한다. 단백질 M은 항체에 결합하여 항원-항체 연합을 방지하지만, 이전에 형성된 항원-항체 복합체는 파괴하지 않는다. 단백질 M과 항체의 상호작용은 웨스턴 블롯, ELISA, X선 결정학, 전자 현미경검사 및 생물층 간섭측정법에 의해 검증되었다. 단백질 M은 벡터와 독립적으로 사용될 수 있기 때문에, 이전에 FDA 승인된 유전자 요법을 포함하는 치료 요법에 혼입될 수 있다. 이는 캡시드 기반 면역 회피에 비해 유리한데, 캡시드 기반 면역 회피는 각각의 개별 캡시드가 각각의 질환 표적에 대해 그 자체의 임상 시험을 거쳐야 하기 때문이다. 단백질 M의 특성에 기초하여, 이 단백질은 임의의 바이러스 벡터 매개된 유전자 전달에 적용될 수 있을 뿐만 아니라 체액성 면역 반응 매개된 클리어런스를 피하기 위한 경우에 CRISPR/cas9와 같은 일시적 단백질 요법에 적용될 수 있다. 또한, 단백질 M은 자가항체로부터 유발된 자가면역 장애를 치료하는 잠재력을 갖는다.
본 연구에서, 적어도 2개 이상의 단백질 M 분자가 1개의 이뮤노글로불린 분자를 차단하는데 요구되며, 전신 투여 후 NAb 회피를 위해 혈액 중의 모든 이뮤노글로불린과 상호작용하는 다량의 단백질 M이 필요할 수 있는 것으로 입증되었다. 고용량의 재조합 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민 및 이뮤노글로불린이 임상 시험에 사용되어 왔지만, 고용량의 단백질 M의 잠재적 합병증으로부터의 우려는 임상 시험 전에 대형 동물에서 해결될 필요가 있다. 단백질 M이 AAV 투여에 국부 사용되는 경우에는 주요 문제가 아닐 수 있다.
시험관내 연구는 단백질 M/이뮤노글로불린의 복합체가 비교적 긴 시간 동안 안정한 반면, 생체내 실험은 AAV 벡터가 단백질 M 적용 후 매우 늦게 투여되었을 때 단백질 M 기능의 점진적 상실을 나타냈다. 혈액 중 단백질 M/이뮤노글로불린 복합체의 역학 및 동역학을 이해하는 것은 중요하며; 이러한 정보는 단백질 M의 투여 후 AAV 주사를 위한 기간 범위에 관한 가치있는 정보를 제공할 것이다.
다른 우려는 반복 투여에 대한 단백질 M의 면역원성이다. 단백질 M은 외래 단백질이기 때문에, 체액성 면역 반응을 도출하여 항체를 생산할 것이다. 단백질 M은 모든 이뮤노글로불린에 결합함으로써 그의 보호 기능을 실행하고, 단백질 M에 대한 특이적 Ig의 양은 모든 Ig 중 단지 매우 적은 부분만을 차지하며, 따라서 고용량의 단백질 M이 AAV NAb를 차단하는 목적을 위해 사용되는 경우에, 단백질 M 특이적 Ig의 양은 단지 매우 적은 양의 단백질 M만을 중화시킬 것이고, 이어서 AAV NAb로부터 AAV를 보호하기 위해 투여된 단백질 M의 기능에 영향을 미칠 수 없다. 단백질 M은 B 세포 표면에 결합할 수 있고, B 세포 증식을 자극하는 잠재력을 갖는다. 이전 연구는 무손상 단백질 M이 B 세포 증식을 유도할 수 있지만, 말단절단된 단백질 M은 이러한 기능을 상실한다는 것을 입증하였다. 장기간 추적이 단백질 M 투여 후 생체내에서 수행될 것이다.
결론적으로, 본 결과는 단백질 M이 1개의 IgG 분자에 대해 2개 이상의 분자 비로 존재하는 경우에 단백질 M이 이뮤노글로불린의 AAV 중화를 방지한다는 것을 입증한다. AAV 벡터의 보호는 이뮤노글로불린의 AAV 중화 전에 이뮤노글로불린과 상호작용하는 단백질 M에 의존한다. 단백질 M은 생체내에서 1,000배 범위의 NAb 역가에 걸친 중화로부터 AAV를 보호할 수 있다. 이 연구는 NAb를 갖는 환자에서의 향후 AAV 임상 시험에서 NAb 활성으로부터 AAV 벡터 비리온의 보호를 위해 또는 재투여를 위해 단백질 M을 사용하기 위한 중요한 통찰을 제공하였다.
실시예 8: 증진된 특성을 갖는 조작된 단백질 M 변이체
상기 실시예는 유전자 요법 벡터에 대한 중화 항체를 회피하기 위한 항체 차단 단백질로서의 미코플라스마 단백질 M의 용도를 기재한다. 상이한 미코플라스마 종으로부터의 자연 발생 단백질 M 상동체는 대부분의 포유동물 항체 부류에 나노몰 친화도로 결합하지만 (Grover et al., Science 343:656 (2014)), 자연 발생 단백질의 많은 특색은 치료제로서 사용하기에 부적합하다. 천연 단백질 M은 가용성이 아니라, 박테리아 형질 막에 그를 고정시키는 N-말단 막횡단 도메인에 의해 막 결합되어 있다. 추가적으로, 천연 단백질은 약물-유사 분자로서 예측불가능하게 거동할 수 있는 무질서한 C-말단을 갖는다. N-말단 막횡단 도메인 및 무질서한 C-말단 절편이 결여된 천연 단백질 M의 말단절단된 버전 (문헌 [Grover et al., Science 343:656 (2014)]으로부터의 단백질 M TD)을 치료 항체-차단 분자로서 사용하여 조사가 이루어졌지만, 이 단백질이 체온 (37℃)에서 인큐베이션되는 경우 구조적 안정성이 결여된다는 주요 발견이 이루어졌다.
말단절단된 단백질 M (서열식별번호: 3)을 단순 시험관내 완충제 현탁액 중에서 37℃에 노출시키는 것은 단기간의 시간 (15분 내지 1시간) 이내에 가시적 침전 및 응집이 발생하도록 하였다. 원형 이색성을 사용한 분석시에, 37℃로의 단백질의 가열은 1시간 이내에 특유의 단백질 언폴딩 사건과 연관되었고, 단백질의 즉각적 용융은 41.2℃에서 발생한 반면, 2시간에 걸쳐 지속되는 20℃ 인큐베이션에서는 언폴딩 사건이 발생하지 않은 것으로 발견되었다 (도 14). 단백질의 언폴딩은 또한 웨스턴 블롯에 의해 평가된 용액 중 측정된 가용성 분획의 감소와 상관관계가 있었다. 불안정한 단백질을 사용하는 것의 치료적 한계를 극복하기 위해, 엠. 게니탈리움 (MG281) 및 엠. 뉴모니아에 (MPN400)로부터의 돌연변이 상동체를 포함한, 말단절단된 단백질 M의 돌연변이 유사체를 생성시키는 합리적 설계 접근법을 사용하였다. 이러한 접근법은 로제타로 불리는 단백질 모델링 및 조작 소프트웨어 내로의 입력으로서 단백질 M (PDB ID: 4NZR 및 4NZT)의 결정 구조 및 아미노산 서열을 사용하였다. 자유 에너지 계산 및 3D 모델링을 사용하여 어느 아미노산 서열 변화가 3차 구조의 안정화를 유발할 것인지를 예측함으로써, 850+개 초과의 아미노산 치환의 목록을 출력하였다. 개별 돌연변이체 및 조합된 다중 돌연변이체의 DNA 합성을 통해, 합리적으로 설계된 변이체 라이브러리를 사용하여 돌연변이 단백질을 생산하였다. 표 4는 열안정성에 대해 야생형 단백질보다 더 우수하게 점수화된 885개의 컴퓨터 확인된 점 돌연변이를 열거한다. 표 5는 열안정성에 대해 야생형 단백질보다 실질적으로 더 우수하게 점수화된 (-3.0 델타 초과의 점수) 165개의 컴퓨터 확인된 점 돌연변이를 열거한다.
상이한 단백질 M 돌연변이체를 시차 주사 형광투시법을 사용하여 검증하여 단백질 용융 온도를 계산하였다 (도 15, 16). 이어서, 돌연변이체를 다양한 기간 동안 37℃에서 온도 챌린지하여 용해도를 측정하고 (도 17a-17c), 시험관내 중화 검정에서 풀링된 인간 정맥내 IgG (IVIG)에 의한 AAV 중화를 방지하는 능력을 측정하였다 (18a-18c). 엠. 게니탈리움으로부터 유래된 단백질 M의 유사체를 시험하는 것에 추가로, 엠. 뉴모니아에로부터 유래된 유사체를 또한 생산하였다. 이어서, 일부 돌연변이체를 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 시험하여 마우스 IgG에 대한 돌연변이 단백질의 친화도를 결정하고, 이뮤노글로불린 기질에 대한 돌연변이체의 친화도를 변경시키는 돌연변이체의 능력을 입증하였다 (도 21, 22). 돌연변이체는 또한 야생형 단백질 M보다 더 넓은 pH 범위에 걸친 안정성에 의해 입증되는 바와 같이 증가된 안정성을 보여주었다 (도 26). 37℃에서의 증가된 안정성 및 IgG에 대한 나노몰 친화도의 유지를 갖는 선두 유사체 중 하나인 MG 29를 사용하여 AAV 캡시드에 대한 마우스의 직접적 면역화 후에 생체내 AAV 중화 항체의 차단을 시험하였다. 포스페이트 완충 염수와 함께 제제화된 AAV를 한 다리에, 그리고 MG 29와 함께 제제화된 AAV를 다른 다리에 근육내 주사한 결과는 MG 29가 AAV 면역화된 마우스에서 AAV 중화 항체를 차단하여 AAV의 효과적인 유전자 전달 및 재투여를 가능하게 한다는 것을 입증하였다 (도 19, 20).
로제타 소프트웨어를 사용하는 제2 라운드의 합리적 조작 전략은 친화도 및 결합을 증진시키거나 감소시키는 돌연변이 단백질 M 유사체의 결합 부위의 변형을 예측하기 위해 많은 인간 이뮤노글로불린 구조의 평균화된 모델을 사용하는 돌연변이 단백질 친화도의 변경을 포함하였다. 추가로, 합리적 설계 전략의 제3 라운드는 자연에 존재하지 않는 항원적으로 특유한 다른 유사체를 생성하기 위해 상이한 미코플라스마 종으로부터의 다양한 자연 발생 단백질 M 서열 및 로제타 모델링 둘 다의 사용을 포함하였다. 이들 유사체는 전체 단백질 또는 개별 에피토프의 키메라, 모자이크 또는 신생의 합리적으로 변경된 아미노산 돌연변이체일 수 있다. 이어서, 동일하거나 상이한 유사체를 심지어 단백질 M 유사체에 대해 생성된 억제 항체의 존재 하에서도, 다수 라운드의 재투여를 위해 AAV와 함께 사용할 수 있다. 이는 단백질 M 유사체가 항체 결합 및 항원 인식의 차단, 심지어 억제 항체에 의한 그 자체의 인식에 대해 직접적으로 경쟁하기 때문이다. 단백질 M 유사체의 포화 용량은 초기 면역 노출 후 단백질 M 유사체에 대해 생성된 적은 부분의 이뮤노글로불린보다 과량일 것이다. 추가적으로, 증가된 에피토프 다양성을 갖는 단백질 M 유사체의 생성은 단백질 M 억제 항체로부터의 면역 회피의 추가의 층을 제공할 수 있다. 각각의 열거된 조작 전략은 다수의 상이한 특성을 갖는 단백질 M 유사체를 생성하기 위해 서로 조합되거나 위에 오버레이될 수 있는 것으로 여겨진다.
마지막으로, 단백질 산물 수율을 증진시키는 단백질 M의 DNA 코돈 최적화된 버전을 생산하였다 (도 25). 모 말단절단된 단백질 M 서열의 2종의 코돈 최적화된 버전이 생성되었다: 하나의 서열은 이. 콜라이 및 에이치. 사피엔스 코돈 용법 둘 다에 대해 최적화되고, 다른 서열은 에이치. 사피엔스 코돈 용법에 대해서만 최적화된다. 이중 이. 콜라이 및 에이치. 사피엔스 코돈 구축물을 사용하여 이. 콜라이에서 단백질을 생산하였으며, 이는 모 비최적화 플라스미드와 비교하여 단백질 수율의 ~4배 증가를 입증한다. 에이치. 사피엔스만 최적화된 구축물은 배양 배지로부터의 단백질 M 유사체 수거를 위한 포유동물 세포주로부터의 단백질의 분비를 가능하게 하는 IL-2 분비 펩티드 또는 알부민 분비 펩티드 서열을 함유한다. 단백질 M 돌연변이 유사체는 두 유형의 최적화된 DNA 서열 내로 클로닝 또는 합성되고, 증진된 단백질 생산을 위해 사용된다. 37℃에서 안정한 단백질 M 유사체는 분비 후 단백질 언폴딩에 대한 감수성 없이 인간 세포에서 성장될 수 있다. 추가적으로, 단백질 M 유사체의 글리코실화 부위를 치환하여 결합 부위에서 글리코실화를 제거하거나 또는 외부 표면에 글리코실화를 부가한다 (예컨대, 유사체 MG 28 (N274D)). 외부 표면에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 단백질 M 유사체의 면역 회피를 증진시키고 단백질 M 유사체의 다중 투여를 위한 단백질 M 억제 항체 인식을 감소시키는 또 다른 메카니즘이다. 마지막으로, 단백질 M 유사체의 DNA 서열은 37℃에서 안정하고 글리코실화 부위가 제거되거나 새로운 글리코실화 부위가 부가된 분비된 단백질을 생산하기 위해 포유동물 세포주 내로 안정하게 통합될 것이다.
방법
AAV 바이러스 생산: HEK293 세포에서 3-플라스미드 형질감염에 의한 표준 접근법을 사용하여 AAV 벡터를 생산하였다. 간략하게, AAV 트랜스진 플라스미드 pTR-CBA-Luc를 AAV Rep/Cap 헬퍼 플라스미드 (pXR2 또는 pXR8) 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 pXX6-80과 함께 공동-형질감염시켰다. 72시간 후, 세포 배양물을 수거하고, 동결 해동 및 초음파처리에 의해 용해시켰다. 정화된 세포 용해물을 DNAse 처리하고, 15%/25%/40%/60% 아이오딕사놀 단계 구배로 초원심분리하고, 음이온 교환 Q-칼럼에 의해 정제하였다. 정제된 AAV 벡터를 패키징된 AAV 트랜스진의 절편을 증폭시키도록 지시된 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 적정하였다.
단백질 생산: 플라스미드 pET-28b(+)는 막횡단 도메인이 결여된, 엠. 게니탈리움 또는 엠. 뉴모니아에로부터 유래된 말단절단된 단백질인 단백질 M 유사체를 코딩하고, N-말단 His-태그 및 트롬빈 절단 부위를 보유한다. 플라스미드를 전기-적격 DH10B 세포에서 증식시키고, 인비트로젠으로부터의 퓨어링크 맥시-프렙 키트를 사용하여 정제하였다. pET-28b(+) 플라스미드를 밤샘 출발 배양물을 사용하여 BL21/DE3 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 자가-유도 배지 (인비트로젠으로부터의 매직 배지)에 출발 배양물을 시딩하고, 18℃에서 3일 동안 성장시켰다. 이어서, 배양물을 원심분리에 의해 펠릿화하고, -80℃에서 동결시켰다.
단백질 정제: 동결된 박테리아 세포 배양 펠릿을 해동시키고, 초음파처리에 의해 용해시키고, DNAse 처리하고, 원심분리에 의해 정화하였다. 정화된 박테리아 용해물을 니켈-결합 완충제 (20 mM 이미다졸, 50 mM 인산나트륨 pH 7.4, 500 mM NaCl, 0.02% 아지드화나트륨) 중으로 투석하고, FPLC를 사용하여 니켈 His-트랩 FF 칼럼에 통과시켰다. 이어서, 니켈 칼럼에 의해 결합된 단백질 M을 500 mM 이미다졸을 함유하는 것외에 동일한 완충제 베이스에 의해 용리시켰다. 이어서, 단백질 M을 S-100 크기 배제 칼럼을 통해 전개시키고, 2% 글리세롤을 함유하는 포스페이트 완충 염수 중으로 투석하고, 분광광도측정법을 사용하여 정량화하였다. 단백질 분리를 위한 SDS-PAGE 단백질 겔 전기영동, 이어서 45kDa - 48kDa 단백질 M 밴드를 정확하게 확인하기 위한 쿠마시 블루 단백질 염색을 사용하여 단백질 M 정체를 확인하였다.
일부 단백질 생산을 위해, 2가지 전략 중 하나를 실행하여 단백질 M 변이체를 정제하였다. 제1 프로토콜 (Ni-순도)은 나노DSF에 대한 소규모 생산을 위한 것이었다. 세포 펠릿을 2.5 mg/mL 리소자임, 25% B-PER, 75% 포스페이트 완충 염수 (PBS) pH 7.4 및 프로테아제 억제제 (PMSF, 베스타틴 및 펩스타틴)로 이루어진 완충제와 혼합함으로써 용해를 수행하였다. 실온에서 30분 혼합한 후, 조 용해물을 15,000 rcf에서 20분 동안 원심분리하고, 상청액을 Ni 수지와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 수지를 세척하고 (PBS + 20 mM 이미다졸), 단백질을 (PBS + 500 mM 이미다졸)로 용리시켰다. 용리된 단백질을 제바 탈염 칼럼을 사용하여 PBS pH 7.4 중으로 교환한 후, 안정성 검정을 수행하였다. 제2 프로토콜 (SEC-순도)은 대규모 생산을 위한 것이고, 단백질 샘플로부터 추가의 오염물/응집체를 제거하였다. 세포를 초음파처리를 통해 용해시키고, 니켈 수지 (제1 프로토콜과 동일한 완충제)로 정제하고, PBS + 2% 글리세롤 중으로의 크기-배제 크로마토그래피에 의해 마무리한 후, 샘플을 동결시켰다.
웨스턴 블롯: 8% SDS-PAGE 겔 상에서의 단백질 분리 후, 단백질을 PVDF 막 상으로 옮겼다. 항-His 1차 항체 1:1000 희석물 (10 μg/ml)을 사용하여 5% 탈지유에서 이뮤노블롯팅을 수행하였다. 2차 염소 항-인간 IgG 항체를 양고추냉이 퍼옥시다제에 접합시켰다 (1:10,000 희석).
단백질 용융 온도 및 언폴딩의 결정: 나노 시차 주사 형광측정법 (나노DSF)에 의해 용융 온도 (Tm)를 결정하고, 원형 이색성 검정을 사용하여 상이한 온도에서 단백질 언폴딩을 결정하였다. 일계 도함수의 변곡점이 Tm 또는 언폴딩을 나타낸다. 단백질을 프로토콜 1 (Ni-순도)에 따라 정제하였다.
용해도 검정: 각각의 SEC-정제된 단백질의 7개 분취물 (0.4 mg/mL)을 37℃에서 다양한 양의 시간 동안 인큐베이션함으로써 열안정성 시간-경과 검정을 수행하였다. 샘플을 15,000 x G에서 10분 동안 원심분리함으로써 침전된 단백질을 펠릿화한 후에 SDS-PAGE를 위한 겔을 로딩하였다. 단백질을 프로토콜 2 (SEC-순도)에 따라 정제하였다.
생물층 간섭측정법에 의한 친화도 평가: 생물층 간섭측정법을 37℃에서 수행하여 단백질 M 구축물의 친화도를 평가하였다. 단백질을 프로토콜 2 (SEC-순도)에 따라 정제하였다. 1000 nM 내지 15.6 nM 범위의 각각의 M 구축물의 2배 연속 희석을 포르테바이오 키네틱스 완충제 (PBS + 세제)로 수행하였다. 항-마우스 IgG Fc 포획 바이오센서에 대한 결합을 평가하였다. 각각의 프로토콜은 각각 10분, 5분 및 5분 동안의 기준선, 회합 및 해리 단계를 포함하였다. 완충제 중에서의 회합 단계와 병행하여 실행된 참조 센서로부터 데이터를 차감하였다. 포르테바이오 데이터 분석 v9.0 소프트웨어 내의 1:1 곡선 피트에 기초하여 친화도 데이터를 계산하였다. 보고된 정상-상태 결합 상수는 각각의 농도에서의 최대 반응에 기초하여 계산되었다 (n=7). X2를 최소화하기 위해, 동역학적 데이터는 250-15.6 nM 희석 범위에 대한 데이터만을 포함하였다 (n=5).
구조적 모델링 및 합리적 단백질 조작: 단백질 M (PM)의 유사체의 열 안정성 최적화를 이뮤노글로불린에 결합된 PM의 기존 결정 구조 (4NZT 및 4NZR)에 기초한 인 실리코 합리적 단백질 조작 접근법을 사용하여 달성하였다. 로제타 소프트웨어 패키지를 사용하여 PM 펩티드를 안정화시키는 돌연변이를 확인하였다. 제1 프로토콜은 인 실리코 부위 포화 돌연변이유발을 수행하여, 아미노산 이웃이 돌연변이된 잔기 주위를 재패킹하도록 하였다. 제2 프로토콜은 결정 구조 내에 과소-패킹된 영역에서 조합 돌연변이를 생성하였다. 돌연변이체를 야생형 아미노산과 치환 사이의 점수 차이에 따라 순위화하였다. 추가의 육안 검사를 수행하여 바람직한 돌연변이체를 확인하였다. 트위스트 바이오사이언시스(Twist Biosciences)에 의해 돌연변이를 pET-28b+ 벡터 내로 클로닝하고, 합성하였다. 결합 부위 친화도의 변경 및 특유의 항원성을 갖는 PM 유사체의 생성을 위한 추가의 설계 전략을 사용하였다.
MP WT의 상동성 모델을 스위스-모델 웹서버로 구축하였다 (도 24). MG와 MP WT 이소형 사이의 보존 점수를 BLOSUM90 매트릭스에 따라 계산하였다. PyMol로 영상을 만들었다.
세포 배양: HEK-293 세포 또는 Huh7 세포를 모든 시험관내 AAV 중화 실험에 사용하였다. 세포를 15 cm 조직 배양 플레이트 상에서 성장시키고, 10% 소 송아지 혈청 및 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지를 사용하여 5% CO2 하에 37℃에서 유지하였다.
시험관내 중화 실험을 위한 인간 IVIG: 10% 인간 IVIG (가무넥스)의 원액을 그리폴스 테라퓨틱스 인크. (미국 노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크)로부터 구입하였다. 개별 분취물을 포스페이트 완충 염수 중에 1 mg/mL로 희석하고, 향후 사용을 위해 -80℃에서 저장하였다. 3x1010개 바이러스 게놈의 AAV8-FVIII의 IP 투여에 이어서 2주 후 동일한 벡터의 부스트 투여 및 제1 투여 6주 후 제2 부스트를 수행한 후 12마리의 상이한 마우스 (50% 수컷, 50% 암컷)로부터 혈청을 수집하고 풀링하였다. 마우스 혈청을 분취하고, 향후 사용을 위해 -80℃에서 저장하였다.
시험관내 AAV 중화 검정: Nab 분석을 약간 변형하여 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Wang et al., Gene Ther. 22:984 (2015)). 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 무혈청 X-비보 10 배지 중에 재현탁시킨 다음, 48-웰 또는 96-웰 플레이트 포맷에 플레이팅하였다. 인간 IVIG 또는 혈청을 2배 또는 10배 연속 희석하였다. AAV-Luc를 인간 IVIG 또는 마우스 혈청과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, AAV를 첨가하고, 4℃에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, AAV+혈청 인큐베이션물을 플레이팅 시 무혈청 배지 중에 현탁된 세포와 혼합하였다. 단백질 M을 사용하는 중화 실험에서, 다음 3가지 상이한 인큐베이션 시나리오를 4℃에서 1시간 동안 각각의 단계로 시험하였다: 중화 혈청을 먼저 단백질 M과 인큐베이션한 후, 이어서 AAV와 인큐베이션, AAV를 먼저 중화 혈청과 인큐베이션한 후, 이어서 단백질 M과 인큐베이션, 및 AAV를 먼저 단백질 M과 인큐베이션한 후, 이어서 중화 혈청과 인큐베이션. 세포를 48-웰 플레이트에 200 μl 배지 중에 또는 96-웰 플레이트에 100 μl 배지 중에 시딩하였다. 형질도입 후, 세포를 37℃에서 24-48시간 동안 배양하여 AAV-루시페라제 트랜스진이 발현되도록 하였다. Luc 활성을 측정하기 위해, 세포를 수동 용해 완충제 (프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨)로 용해시키고, 루시페라제 신호를 왈락1420 빅터 2 자동화 플레이트 판독기로 측정하였다. Nab 역가는 루시페라제 활성이 무혈청 대조군보다 50% 더 낮은 최고 희석률로 정의하였다.
AAV 면역화된 마우스에서의 생체내 AAV 재투여: C57BL/6 마우스를 8E5vg 또는 1E9vg AAV8-GFP의 I.P. 주사에 의해 면역화시켰다. 대략 1개월 후에 AAV8 시험관내 중화 검정에 의한 적정을 위해 마우스로부터 혈청을 수집하였다. 1일 후, 동일한 용량의 1E9vg 또는 2E9vg AAV8-루시페라제를 함유하는 각각의 다리에 I.M. 주사를 수행하였으며, 여기서 하나의 다리에는 포스페이트 완충 염수와 함께 제제화된 AAV를 투여하였고, 다른 다리에는 주사 직전에 단순 혼합으로 단백질 M 유사체와 함께 제제화된 AAV를 투여하였다. 다리당 200 μl의 총 부피를 주사하였다. D-루시페린 기질의 I.P. 투여 후에 AAV-Luc 투여 2주 후 발광 영상화를 수행하였다.
상기 실시예는 본 발명의 예시이며, 그를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명이 바람직한 실시양태를 참조하여 상세히 기재되었지만, 하기 청구범위에 기재되고 정의된 바와 같은 본 발명의 범주 및 취지 내에 변경 및 변형이 존재한다.
표 4: MG WT의 안정성을 개선시키는 것으로 예측된 885개의 점 돌연변이. 델타 점수는 돌연변이체의 점수 - WT 잔기의 점수를 지칭한다. 이 목록은 PDB ID: 4NZR 내의 항체 계면의 5 Å 내에 있는 잔기를 제외한 잔기 78-468을 고려하였다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
표 5: MG WT의 안정성을 개선시키는 것으로 예측된 165개의 점 돌연변이. 델타 점수는 돌연변이체의 점수 - WT 잔기의 점수를 지칭한다. 이 목록은 PDB ID: 4NZR 내의 항체 계면의 5 Å 내에 있는 잔기를 제외한 잔기 78-468을 고려하였다.
Figure pct00014
Figure pct00015
표 6: 항체에 대한 MG WT의 친화도를 개선시킬 것으로 예측되는 128개의 점 돌연변이. 델타 점수는 돌연변이체의 점수 - WT 잔기의 점수를 지칭한다. 이 목록은 PDB ID: 4NZR 내의 항체 계면의 5 Å 내에 있는 70개의 잔기를 고려하였다.
Figure pct00016
Figure pct00017
표 7: 항체에 대한 MG WT의 친화도를 개선시킬 것으로 예측되는 17개의 점 돌연변이. 델타 점수는 돌연변이체의 점수 - wt 잔기의 점수를 지칭한다. 이 목록은 PDB ID: 4NZR 내의 항체 계면의 5 Å 내에 있는 70개의 잔기를 고려하였다.
Figure pct00018
서열
서열식별번호: 1: 야생형 엠. 게니탈리움 단백질 M
Figure pct00019
Figure pct00020
서열식별번호: 2: N-말단 6-His 태그에 이어서 트롬빈 절단 부위를 갖는 가용성 형태의 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 37-556)
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
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Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
SEQUENCE LISTING <110> The University of North Carolina at Chapel Hill Li, Chengwen Askew, Charles Kuhlman, Brian Thieker, David Forrest <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR BINDING ANTIBODIES AND INHIBITING NEUTRALIZING ANTIBODIES <130> 5470-869WO <150> US 62/881,765 <151> 2019-08-01 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 556 <212> PRT <213> Mycoplasma genitalium <400> 1 Met Gln Phe Lys Lys His Lys Asn Ser Val Lys Phe Lys Arg Lys Leu 1 5 10 15 Phe Trp Thr Ile Gly Val Leu Gly Ala Gly Ala Leu Thr Thr Phe Ser 20 25 30 Ala Val Met Ile Thr Asn Leu Val Asn Gln Ser Gly Tyr Ala Leu Val 35 40 45 Ala Ser Gly Arg Ser Gly Asn Leu Gly Phe Lys Leu Phe Ser Thr Gln 50 55 60 Ser Pro Ser Ala Glu Val Lys Leu Lys Ser Leu Ser Leu Asn Asp Gly 65 70 75 80 Ser Tyr Gln Ser Glu Ile Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asn Phe Arg Glu 85 90 95 Lys Phe Arg Asn Phe Ala Asn Glu Leu Ser Glu Ala Ile Thr Asn Ser 100 105 110 Pro Lys Gly Leu Asp Arg Pro Val Pro Lys Thr Glu Ile Ser Gly Leu 115 120 125 Ile Lys Thr Gly Asp Asn Phe Ile Thr Pro Ser Phe Lys Ala Gly Tyr 130 135 140 Tyr Asp His Val Ala Ser Asp Gly Ser Leu Leu Ser Tyr Tyr Gln Ser 145 150 155 160 Thr Glu Tyr Phe Asn Asn Arg Val Leu Met Pro Ile Leu Gln Thr Thr 165 170 175 Asn Gly Thr Leu Met Ala Asn Asn Arg Gly Tyr Asp Asp Val Phe Arg 180 185 190 Gln Val Pro Ser Phe Ser Gly Trp Ser Asn Thr Lys Ala Thr Thr Val 195 200 205 Ser Thr Ser Asn Asn Leu Thr Tyr Asp Lys Trp Thr Tyr Phe Ala Ala 210 215 220 Lys Gly Ser Pro Leu Tyr Asp Ser Tyr Pro Asn His Phe Phe Glu Asp 225 230 235 240 Val Lys Thr Leu Ala Ile Asp Ala Lys Asp Ile Ser Ala Leu Lys Thr 245 250 255 Thr Ile Asp Ser Glu Lys Pro Thr Tyr Leu Ile Ile Arg Gly Leu Ser 260 265 270 Gly Asn Gly Ser Gln Leu Asn Glu Leu Gln Leu Pro Glu Ser Val Lys 275 280 285 Lys Val Ser Leu Tyr Gly Asp Tyr Thr Gly Val Asn Val Ala Lys Gln 290 295 300 Ile Phe Ala Asn Val Val Glu Leu Glu Phe Tyr Ser Thr Ser Lys Ala 305 310 315 320 Asn Ser Phe Gly Phe Asn Pro Leu Val Leu Gly Ser Lys Thr Asn Val 325 330 335 Ile Tyr Asp Leu Phe Ala Ser Lys Pro Phe Thr His Ile Asp Leu Thr 340 345 350 Gln Val Thr Leu Gln Asn Ser Asp Asn Ser Ala Ile Asp Ala Asn Lys 355 360 365 Leu Lys Gln Ala Val Gly Asp Ile Tyr Asn Tyr Arg Arg Phe Glu Arg 370 375 380 Gln Phe Gln Gly Tyr Phe Ala Gly Gly Tyr Ile Asp Lys Tyr Leu Val 385 390 395 400 Lys Asn Val Asn Thr Asn Lys Asp Ser Asp Asp Asp Leu Val Tyr Arg 405 410 415 Ser Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Leu Glu Glu Ala Tyr Arg Glu Gly 420 425 430 Asp Asn Thr Tyr Tyr Arg Val Asn Glu Asn Tyr Tyr Pro Gly Ala Ser 435 440 445 Ile Tyr Glu Asn Glu Arg Ala Ser Arg Asp Ser Glu Phe Gln Asn Glu 450 455 460 Ile Leu Lys Arg Ala Glu Gln Asn Gly Val Thr Phe Asp Glu Asn Ile 465 470 475 480 Lys Arg Ile Thr Ala Ser Gly Lys Tyr Ser Val Gln Phe Gln Lys Leu 485 490 495 Glu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Leu Glu Arg Met Thr Lys Ala Val Glu 500 505 510 Gly Leu Val Thr Val Ile Gly Glu Glu Lys Phe Glu Thr Val Asp Ile 515 520 525 Thr Gly Val Ser Ser Asp Thr Asn Glu Val Lys Ser Leu Ala Lys Glu 530 535 540 Leu Lys Thr Asn Ala Leu Gly Val Lys Leu Lys Leu 545 550 555 <210> 2 <211> 538 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> modified protein M <400> 2 His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His 1 5 10 15 Met Thr Asn Leu Val Asn Gln Ser Gly Tyr Ala Leu Val Ala Ser Gly 20 25 30 Arg Ser Gly Asn Leu Gly Phe Lys Leu Phe Ser Thr Gln Ser Pro Ser 35 40 45 Ala Glu Val Lys Leu Lys Ser Leu Ser Leu Asn Asp Gly Ser Tyr Gln 50 55 60 Ser Glu Ile Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asn Phe Arg Glu Lys Phe Arg 65 70 75 80 Asn Phe Ala Asn Glu Leu Ser Glu Ala Ile Thr Asn Ser Pro Lys Gly 85 90 95 Leu Asp Arg Pro Val Pro Lys Thr Glu Ile Ser Gly Leu Ile Lys Thr 100 105 110 Gly Asp Asn Phe Ile Thr Pro Ser Phe Lys Ala Gly Tyr Tyr Asp His 115 120 125 Val Ala Ser Asp Gly Ser Leu Leu Ser Tyr Tyr Gln Ser Thr Glu Tyr 130 135 140 Phe Asn Asn Arg Val Leu Met Pro Ile Leu Gln Thr Thr Asn Gly Thr 145 150 155 160 Leu Met Ala Asn Asn Arg Gly Tyr Asp Asp Val Phe Arg Gln Val Pro 165 170 175 Ser Phe Ser Gly Trp Ser Asn Thr Lys Ala Thr Thr Val Ser Thr Ser 180 185 190 Asn Asn Leu Thr Tyr Asp Lys Trp Thr Tyr Phe Ala Ala Lys Gly Ala 195 200 205 Ser Pro Leu Tyr Asp Ser Tyr Pro Asn His Phe Phe Glu Asp Val Lys 210 215 220 Thr Leu Ala Ile Asp Ala Lys Asp Ile Ser Ala Leu Lys Thr Thr Ile 225 230 235 240 Asp Ser Glu Lys Pro Thr Tyr Leu Ile Ile Arg Gly Leu Ser Gly Asn 245 250 255 Gly Ser Gln Leu Asn Glu Leu Gln Leu Pro Glu Ser Val Lys Lys Val 260 265 270 Ser Leu Tyr Gly Asp Tyr Thr Gly Val Asn Val Ala Lys Gln Ile Phe 275 280 285 Ala Asn Val Val Glu Leu Glu Phe Tyr Ser Thr Ser Lys Ala Asn Ser 290 295 300 Glu Gly Phe Asn Pro Leu Val Leu Gly Ser Lys Thr Asn Val Ile Tyr 305 310 315 320 Asp Leu Phe Ala Ser Lys Pro Phe Thr His Ile Asp Leu Thr Gln Val 325 330 335 Thr Leu Gln Asn Ser Asp Asn Ser Ala Ile Asp Ala Asn Lys Leu Lys 340 345 350 Gln Ala Val Gly Asp Ile Tyr Asn Tyr Arg Arg Phe Glu Arg Gln Phe 355 360 365 Gln Gly Tyr Phe Ala Gly Gly Tyr Ile Asp Lys Tyr Leu Val Lys Asn 370 375 380 Val Asn Thr Asn Lys Asp Ser Asp Asp Asp Leu Val Tyr Arg Ser Leu 385 390 395 400 Lys Glu Leu Asn Leu His Leu Glu Glu Ala Tyr Arg Glu Gly Asp Asn 405 410 415 Thr Tyr Tyr Arg Val Asn Glu Asn Tyr Tyr Pro Gly Ala Ser Ile Tyr 420 425 430 Glu Asn Glu Arg Ala Ser Arg Asp Ser Glu Phe Gln Asn Glu Ile Leu 435 440 445 Lys Arg Ala Glu Gln Asn Gly Val Thr Phe Asp Glu Asn Ile Lys Arg 450 455 460 Ile Thr Ala Ser Gly Lys Tyr Ser Val Gln Phe Gln Lys Leu Glu Asn 465 470 475 480 Asp Thr Asp Ser Ser Leu Glu Arg Met Thr Lys Ala Val Glu Gly Leu 485 490 495 Val Thr Val Ile Gly Glu Glu Lys Phe Glu Thr Val Asp Ile Thr Gly 500 505 510 Val Ser Ser Asp Thr Asn Glu Val Lys Ser Leu Ala Lys Glu Leu Lys 515 520 525 Thr Asn Ala Leu Gly Val Lys Leu Lys Leu 530 535 <210> 3 <211> 406 <212> PRT <213> Mycoplasma genitalium <400> 3 Ser Leu Ser Leu Asn Asp Gly Ser Tyr Gln Ser Glu Ile Asp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ala Asn Phe Arg Glu Lys Phe Arg Asn Phe Ala Asn Glu Leu 20 25 30 Ser Glu Ala Ile Thr Asn Ser Pro Lys Gly Leu Asp Arg Pro Val Pro 35 40 45 Lys Thr Glu Ile Ser Gly Leu Ile 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<210> 23 <211> 582 <212> PRT <213> Mycoplasma pneumoniae <400> 23 Met Lys Leu Asn Phe Lys Ile Lys Asp Lys Lys Thr Leu Lys Arg Leu 1 5 10 15 Lys Lys Gly Gly Phe Trp Ala Leu Gly Leu Phe Gly Ala Ala Ile Asn 20 25 30 Ala Phe Ser Ala Val Leu Ile Val Asn Glu Val Leu Arg Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Glu Thr Leu Ile Ala Ser Gly Arg Ser Gly Asn Leu Ser Phe Gln 50 55 60 Leu Tyr Ser Lys Val Asn Gln Asn Ala Lys Ser Lys Leu Asn Ser Ile 65 70 75 80 Ser Leu Thr Asp Gly Gly Tyr Arg Ser Glu Ile Asp Leu Gly Asp Gly 85 90 95 Ser Asn Phe Arg Glu Asp Phe Arg Asn Phe Ala Asn Asn Leu Ser Glu 100 105 110 Ala Ile Thr Asp Ala Pro Lys Asp Leu Leu Arg Pro Val Pro Lys Val 115 120 125 Glu Val Ser Gly Leu Ile Lys Thr Ser Ser Thr Phe Ile Thr Pro Asn 130 135 140 Phe Lys Ala Gly Tyr Tyr Asp Gln Val Ala Ala Asp Gly Lys Thr Leu 145 150 155 160 Lys Tyr Tyr Gln Ser Thr Glu Tyr Phe Asn Asn Arg Val Val Met Pro 165 170 175 Ile Leu Gln Thr Thr Asn Gly Thr Leu Thr Ala Asn Asn Arg Ala Tyr 180 185 190 Asp Asp Ile Phe Val Asp Gln Gly Val Pro Lys Phe Pro Gly Trp Phe 195 200 205 His Asp Val Asp Lys Ala Tyr Tyr Ala Gly Ser Asn Gly Gln Ser Glu 210 215 220 Tyr Leu Phe Lys Glu Trp Asn Tyr Tyr Val Ala Asn Gly Ser Pro Leu 225 230 235 240 Tyr Asn Val Tyr Pro Asn His His Phe Lys Gln Ile Lys Thr Ile Ala 245 250 255 Phe Asp Ala Pro Arg Ile Lys Gln Gly Asn Thr Asp Gly Ile Asn Leu 260 265 270 Asn Leu Lys Gln Arg Asn Pro Asp Tyr Val Ile Ile Asn Gly Leu Thr 275 280 285 Gly Asp Gly Ser Thr Leu Lys Asp Leu Glu Leu Pro Glu Ser Val Lys 290 295 300 Lys Val Ser Ile Tyr Gly Asp Tyr His Ser Ile Asn Val Ala Lys Gln 305 310 315 320 Ile Phe Lys Asn Val Leu Glu Leu Glu Phe Tyr Ser Thr Asn Gln Asp 325 330 335 Asn Asn Phe Gly Phe Asn Pro Leu Val Leu Gly Asp His Thr Asn Ile 340 345 350 Ile Tyr Asp Leu Phe Ala Ser Lys Pro Phe Asn Tyr Ile Asp Leu Thr 355 360 365 Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asn Gln Asp Asn Ile Asp Ala Ser Lys Leu 370 375 380 Lys Arg Ala Val Ser Asp Ile Tyr Ile Arg Arg Arg Phe Glu Arg Gln 385 390 395 400 Met Gln Gly Tyr Trp Ala Gly Gly Tyr Ile Asp Arg Tyr Leu Val Lys 405 410 415 Asn Thr Asn Glu Lys Asn Val Asn Lys Asp Asn Asp Thr Val Tyr Ala 420 425 430 Ala Leu Lys Asp Ile Asn Leu His Leu Glu Glu Thr Tyr Thr His Gly 435 440 445 Gly Asn Thr Met Tyr Arg Val Asn Glu Asn Tyr Tyr Pro Gly Ala Ser 450 455 460 Ala Tyr Glu Ala Glu Arg Ala Thr Arg Asp Ser Glu Phe Gln Lys Glu 465 470 475 480 Ile Val Gln Arg Ala Glu Leu Ile Gly Val Val Phe Glu Tyr Gly Val 485 490 495 Lys Asn Leu Arg Pro Gly Leu Lys Tyr Thr Val Lys Phe Glu Ser Pro 500 505 510 Gln Glu Gln Val Ala Leu Lys Ser Thr Asp Lys Phe Gln Pro Val Ile 515 520 525 Gly Ser Val Thr Asp Met Ser Lys Ser Val Thr Asp Leu Ile Gly Val 530 535 540 Leu Arg Asp Asn Ala Glu Ile Leu Asn Ile Thr Asn Val Ser Lys Asp 545 550 555 560 Glu Thr Val Val Ala Glu Leu Lys Glu Lys Leu Asp Arg Glu Asn Val 565 570 575 Phe Gln Glu Ile Arg Thr 580 <210> 24 <211> 415 <212> PRT <213> Mycoplasma pneumoniae <400> 24 Ser Ile Ser Leu Thr Asp Gly Gly Tyr Arg Ser Glu Ile Asp Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gly Ser Asn Phe Arg Glu Asp Phe Arg Asn Phe Ala Asn Asn Leu 20 25 30 Ser Glu Ala Ile Thr Asp Ala Pro Lys Asp Leu Leu Arg Pro Val Pro 35 40 45 Lys Val Glu Val Ser Gly Leu Ile Lys Thr Ser Ser Thr Phe Ile Thr 50 55 60 Pro Asn Phe Lys Ala Gly Tyr Tyr Asp Gln Val Ala Ala Asp Gly Lys 65 70 75 80 Thr Leu Lys Tyr Tyr Gln Ser Thr Glu Tyr Phe Asn Asn Arg Val Val 85 90 95 Met Pro Ile Leu Gln Thr Thr Asn Gly Thr Leu Thr Ala Asn Asn Arg 100 105 110 Ala Tyr Asp Asp Ile Phe Val Asp Gln Gly Val Pro Lys Phe Pro Gly 115 120 125 Trp Phe His Asp Val Asp Lys Ala Tyr Tyr Ala Gly Ser Asn Gly Gln 130 135 140 Ser Glu Tyr Leu Phe Lys Glu Trp Asn Tyr Tyr Val Ala Asn Gly Ser 145 150 155 160 Pro Leu Tyr Asn Val Tyr Pro Asn His His Phe Lys Gln Ile Lys Thr 165 170 175 Ile Ala Phe Asp Ala Pro Arg Ile Lys Gln Gly Asn Thr Asp Gly Ile 180 185 190 Asn Leu Asn Leu Lys Gln Arg Asn Pro Asp Tyr Val Ile Ile Asn Gly 195 200 205 Leu Thr Gly Asp Gly Ser Thr Leu Lys Asp Leu Glu Leu Pro Glu Ser 210 215 220 Val Lys Lys Val Ser Ile Tyr Gly Asp Tyr His Ser Ile Asn Val Ala 225 230 235 240 Lys Gln Ile Phe Lys Asn Val Leu Glu Leu Glu Phe Tyr Ser Thr Asn 245 250 255 Gln Asp Asn Asn Phe Gly Phe Asn Pro Leu Val Leu Gly Asp His Thr 260 265 270 Asn Ile Ile Tyr Asp Leu Phe Ala Ser Lys Pro Phe Asn Tyr Ile Asp 275 280 285 Leu Thr Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asn Gln Asp Asn Ile Asp Ala Ser 290 295 300 Lys Leu Lys Arg Ala Val Ser Asp Ile Tyr Ile Arg Arg Arg Phe Glu 305 310 315 320 Arg Gln Met Gln Gly Tyr Trp Ala Gly Gly Tyr Ile Asp Arg Tyr Leu 325 330 335 Val Lys Asn Thr Asn Glu Lys Asn Val Asn Lys Asp Asn Asp Thr Val 340 345 350 Tyr Ala Ala Leu Lys Asp Ile Asn Leu His Leu Glu Glu Thr Tyr Thr 355 360 365 His Gly Gly Asn Thr Met Tyr Arg Val Asn Glu Asn Tyr Tyr Pro Gly 370 375 380 Ala Ser Ala Tyr Glu Ala Glu Arg Ala Thr Arg Asp Ser Glu Phe Gln 385 390 395 400 Lys Glu Ile Val Gln Arg Ala Glu Leu Ile Gly Val Val Phe Glu 405 410 415 <210> 25 <211> 1287 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> codon-optimized polynucleotide <400> 25 atgggcagca gccatcacca tcatcatcac agcagcggtc tggtgccgcg tggtagccac 60 atgagcctga gcctgaacga tggtagctac cagagcgaga tcgacctgag cggcggtgcc 120 aacttccgtg aaaaattccg caactttgct aacgagctga gcgaagccat taccaatagc 180 ccaaagggcc tggatcgtcc agtgccgaaa accgagatca gcggcctgat taagaccggt 240 gacaacttta tcaccccgag cttcaaggcg ggctactatg atcacgtggc tgaggacggt 300 agcctgctga gctactatca gagcaccgag tactttaaca accgtgtgct gatgccgatt 360 ctgcagacca ccaacggcac cctgatggcc aacaaccgtg gttatgacga cgtgttccgt 420 caggtgccgc gtttcccggg ctggagcaac accaaagcga ccaccgtgag caccagcaac 480 aacctgacct acgacaagtg gacctatttc gccgcgaaag gtagcccgct gtacgatcag 540 tatccgaacc acacctttga ggacgtgaaa accctggcta tcgatgccaa ggacattagc 600 gcgctgaaaa ccaccatcga tagcgaaaag ccgacctacc tgatcattcg cggtctgagc 660 ggcaacggta gccagctgaa cgagctgcag ctgccggaaa gcgtgaagaa agtgagcctg 720 tacggcgact ataccggtgt gaacgtggcc aaacagattt ttgcgaacgt ggtggagctg 780 gaattctata gcaccagcaa ggcgaacagc ttcggcttta acccgctggt gctgggtagc 840 aaaaccaacg tgatcaacga cctgttcgtg agcaagccgt tcacccacat tgacctgacc 900 caggtgaccc tgcagaacag cgataacagc gcgatcgacg ctaacaagct gaaacaggct 960 gtgggcgata tctacaacta tcgtcgcttc gagcgtcagt ttcagggtta cttcgccggc 1020 ggttacatcg ataagtatct ggtgaaaaac gtgaacacca acaaagacag cgacgatgac 1080 ctggtgtacc gcagcctgaa ggaactgaac ctgcacctgg aggaagctta tcgtgagggc 1140 gacaacacct actatcgcgt gaacgaaaac tactatccgg gtgccagcat ctacgagaac 1200 gaacgtgcga gccgcgatag cgagtttcag aacgaaattc tgaagcgtgc ggagcagaac 1260 ggcgtgacct tcgacgaaaa ctaataa 1287 <210> 26 <211> 1227 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> codon-optimized polynucleotide <400> 26 atgagcctga gcctgaacga tggcagctac cagagcgaga tcgacctgtc tggcggagcc 60 aacttcagag agaagttcag aaacttcgcc aacgagctga gcgaggccat cacaaacagc 120 cccaaaggcc tggacagacc cgtgcctaag acagagatca gcggcctgat caagaccggc 180 gacaacttca tcacccctag cttcaaggcc ggctactacg atcacgtggc ctctgatggc 240 agcctgctga gctactacca gtccaccgag tacttcaaca accgggtgct gatgcccatc 300 ctccagacca ccaatggcac cctgatggcc aacaacagag gctacgacga cgtgttcaga 360 caggtgccca gctttagcgg ctggtccaat accaaggcca ccaccgtgtc caccagcaac 420 aacctgacct acgacaagtg gacctacttc gccgccaagg gcagccctct gtacgacagc 480 taccccaacc acttcttcga ggacgtgaaa accctggcca tcgacgccaa ggatatcagc 540 gccctgaaaa ccaccatcga cagcgagaag cccacctacc tgatcatcag aggactgagc 600 ggcaacggca gccagctgaa tgaactccag ctgcctgaga gcgtgaagaa ggtgtccctg 660 tacggcgatt acaccggcgt gaacgtggcc aagcagatct tcgccaatgt ggtggaactg 720 gaattctaca gcaccagcaa ggccaacagc ttcggcttca accctctggt gctgggcagc 780 aagaccaacg tgatcaacga cctgttcgcc agcaagccct tcacacacat cgatctgacc 840 caagtgaccc tccagaacag cgacaacagc gccattgatg ccaacaagct gaaacaggcc 900 gtgggcgaca tctacaacta cagaagattc gagcggcagt tccagggcta cttcgctggc 960 ggctacatcg acaagtacct ggtcaagaac gtgaacacca acaaggacag cgacgacgac 1020 ctggtgtaca gaagcctgaa agagctgaac ctgcacctgg aagaggccta cagagagggc 1080 gacaacacct actacagagt gaacgagaac tactacccag gcgccagcat ctacgagaac 1140 gagagagcca gcagagacag cgagttccag aacgagatcc tgaagcgggc cgagcagaat 1200 ggcgtgacct tcgacgagaa ctgatga 1227 <210> 27 <211> 406 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> modified protein M <400> 27 Ser Leu Ser Leu Asn Asp Gly Ser Tyr Gln Ser Glu Ile Asp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ala Asn Phe Arg Glu Lys Phe Arg Asn Phe Ala Asn Glu Leu 20 25 30 Ser Glu Ala Ile Thr Asn Ser Pro Lys Gly Leu Asp Arg Pro Val Pro 35 40 45 Lys Thr Glu Ile Ser Gly Leu Ile Lys Thr Gly Asp Asn Phe Ile Thr 50 55 60 Pro Ser Phe Lys Ala Gly Tyr Tyr Asp His Val Ala Glu Asp Gly Ser 65 70 75 80 Leu Leu Ser Tyr Tyr Gln Ser Thr Glu Tyr Phe Asn Asn Arg Val Leu 85 90 95 Met Pro Ile Leu Gln Thr Thr Asn Gly Thr Leu Met Ala Asn Asn Arg 100 105 110 Gly Tyr Asp Asp Val Phe Arg Gln Val Pro Arg Phe Pro Gly Trp Ser 115 120 125 Asn Thr Lys Ala Thr Thr Val Ser Thr Ser Asn Asn Leu Thr Tyr Asp 130 135 140 Lys Trp Thr Tyr Phe Ala Ala Lys Gly Ser Pro Leu Tyr Asp Gln Tyr 145 150 155 160 Pro Asn His Thr Phe Glu Asp Val Lys Thr Leu Ala Ile Asp Ala Lys 165 170 175 Asp Ile Ser Ala Leu Lys Thr Thr Ile Asp Ser Glu Lys Pro Thr Tyr 180 185 190 Leu Ile Ile Arg Gly Leu Ser Gly Asn Gly Ser Gln Leu Asn Glu Leu 195 200 205 Gln Leu Pro Glu Ser Val Lys Lys Val Ser Leu Tyr Gly Asp Tyr Thr 210 215 220 Gly Val Asn Val Ala Lys Gln Ile Phe Ala Asn Val Val Glu Leu Glu 225 230 235 240 Phe Tyr Ser Thr Ser Lys Ala Asn Ser Phe Gly Phe Asn Pro Leu Val 245 250 255 Leu Gly Ser Lys Thr Asn Val Ile Asn Asp Leu Phe Val Ser Lys Pro 260 265 270 Phe Thr His Ile Asp Leu Thr Gln Val Thr Leu Gln Asn Ser Asp Asn 275 280 285 Ser Ala Ile Asp Ala Asn Lys Leu Lys Gln Ala Val Gly Asp Ile Tyr 290 295 300 Asn Tyr Arg Arg Phe Glu Arg Gln Phe Gln Gly Tyr Glu Ala Gly Gly 305 310 315 320 Tyr Ile Asp Lys Tyr Leu Val Lys Asn Val Asn Thr Asn Lys Asp Ser 325 330 335 Asp Asp Asp Leu Val Tyr Arg Ser Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Leu 340 345 350 Glu Glu Ala Tyr Arg Glu Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Arg Val Asn Glu 355 360 365 Asn Tyr Lys Pro Gly Ala Ser Ile Tyr Glu Asn Glu Arg Ala Ser Arg 370 375 380 Asp Ser Glu Phe Gln Asn Glu Ile Leu Lys Arg Ala Glu Gln Asn Gly 385 390 395 400 Val Thr Phe Asp Glu Asn 405 <210> 28 <211> 406 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> modified protein M <400> 28 Ser Leu Ser Leu Asn Asp Gly Ser Tyr Gln Ser Glu Ile Asp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ala Asn Phe Arg Glu Lys Phe Arg Asn Phe Ala Asn Glu Leu 20 25 30 Ser Glu Ala Ile Thr Asn Ser Pro Lys Gly Leu Asp Arg Pro Val Pro 35 40 45 Lys Thr Glu Ile Ser Gly Leu Ile Lys Thr Gly Asp Asn Phe Ile Thr 50 55 60 Pro Ser Phe Lys Ala Gly Tyr Tyr Asp His Val Ala Glu Asp Gly Ser 65 70 75 80 Leu Leu Ser Tyr Tyr Gln Ser Thr Glu Tyr Phe Asn Asn Arg Val Leu 85 90 95 Met Pro Ile Leu Gln Thr Thr Asn Gly Thr Leu Met Ala Asn Asn Arg 100 105 110 Gly Tyr Asp Asp Val Phe Arg Gln Val Pro Arg Phe Pro Gly Trp Cys 115 120 125 Asn Thr Lys Pro Thr Thr Val Ser Thr Ser Asn Asn Leu Thr Tyr Asp 130 135 140 Lys Trp Thr Tyr Phe Ala Cys Lys Gly Ser Pro Leu Tyr Asp Gln Tyr 145 150 155 160 Pro Asn His Thr Phe Glu Asp Val Lys Thr Leu Ala Ile Asp Ala Lys 165 170 175 Asp Ile Ser Ala Leu Lys Thr Thr Ile Asp Ser Glu Lys Pro Thr Tyr 180 185 190 Leu Ile Ile Arg Gly Leu Ser Gly Asp Gly Ser Gln Leu Asn Glu Leu 195 200 205 Gln Leu Pro Glu Ser Val Lys Lys Val Ser Leu Tyr Gly Asp Tyr Thr 210 215 220 Gly Val Asn Val Ala Lys Gln Ile Phe Ala Asn Val Val Glu Leu Glu 225 230 235 240 Phe Tyr Ser Thr Ser Lys Ala Asn Ser Phe Gly Phe Asn Pro Leu Val 245 250 255 Leu Gly Ser Lys Thr Asn Val Ile Asn Asp Leu Phe Val Ser Lys Pro 260 265 270 Phe Thr His Ile Asp Leu Thr Gln Val Pro Leu Gln Asn Ser Asp Asn 275 280 285 Ser Ala Ile Asp Ala Asn Lys Leu Lys Gln Ala Val Gly Asp Ile Tyr 290 295 300 Asn Tyr Arg Arg Phe Glu Arg Gln Phe Gln Gly Tyr Phe Ala Gly Gly 305 310 315 320 Tyr Ile Asp Lys Tyr Leu Val Lys Asn Val Asn Thr Asn Lys Asp Ser 325 330 335 Asp Asp Asp Leu Val Tyr Arg Ser Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Leu 340 345 350 Glu Glu Ala Tyr Arg Glu Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Arg Val Asn Glu 355 360 365 Asn Tyr Tyr Pro Gly Ala Ser Ile Tyr Glu Asn Glu Arg Ala Ser Arg 370 375 380 Asp Ser Glu Phe Gln Asn Glu Ile Leu Lys Arg Ala Glu Gln Asn Gly 385 390 395 400 Val Thr Phe Asp Glu Asn 405 <210> 29 <211> 406 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> modified protein M <400> 29 Ser Leu Ser Leu Asn Asp Gly Ser Tyr Gln Ser Glu Ile Asp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ala Asn Phe Arg Glu Lys Phe Arg Asn Phe Ala Asn Glu Leu 20 25 30 Ser Glu Ala Ile Thr Asn Ser Pro Lys Gly Leu Asp Arg Pro Val Pro 35 40 45 Lys Thr Glu Ile Ser Gly Leu Ile Lys Thr Gly Asp Asn Phe Ile Thr 50 55 60 Pro Ser Phe Lys Ala Gly Tyr Tyr Asp His Val Ala Glu Asp Gly Ser 65 70 75 80 Leu Leu Ser Tyr Tyr Gln Ser Thr Glu Tyr Phe Asn Asn Arg Val Leu 85 90 95 Met Pro Ile Leu Gln Thr Thr Asn Gly Thr Leu Met Ala Asn Asn Arg 100 105 110 Gly Tyr Asp Asp Val Phe Arg Gln Val Pro Arg Phe Pro Gly Trp Ser 115 120 125 Asn Thr Lys Ala Thr Thr Val Ser Thr Ser Asn Asn Leu Thr Tyr Asp 130 135 140 Lys Trp Thr Tyr Phe Ala Ala Lys Gly Ser Pro Leu Tyr Asp Gln Tyr 145 150 155 160 Pro Asn His Thr Phe Glu Asp Val Lys Thr Leu Ala Ile Asp Ala Lys 165 170 175 Asp Ile Ser Ala Leu Lys Thr Thr Ile Asp Ser Glu Lys Pro Thr Tyr 180 185 190 Leu Ile Ile Arg Gly Leu Ser Gly Asn Gly Ser Gln Leu Asn Glu Leu 195 200 205 Gln Leu Pro Glu Ser Val Lys Lys Val Ser Leu Tyr Gly Asp Tyr Thr 210 215 220 Gly Val Asn Val Ala Lys Gln Ile Phe Ala Asn Val Val Glu Leu Glu 225 230 235 240 Phe Tyr Ser Thr Ser Lys Ala Asn Ser Phe Gly Phe Asn Pro Leu Val 245 250 255 Leu Gly Ser Lys Thr Asn Val Ile Asn Asp Leu Phe Val Ser Lys Pro 260 265 270 Phe Thr His Ile Asp Leu Thr Gln Val Thr Leu Gln Asn Ser Asp Asn 275 280 285 Ser Ala Ile Asp Ala Asn Lys Leu Lys Gln Ala Val Gly Asp Ile Tyr 290 295 300 Asn Tyr Arg Arg Phe Glu Arg Gln Phe Gln Gly Tyr Phe Pro Gly Gly 305 310 315 320 Tyr Ile Asp Lys Tyr Leu Val Lys Asn Val Asn Thr Asn Lys Asp Ser 325 330 335 Asp Asp Asp Leu Val Tyr Arg Ser Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Leu 340 345 350 Glu Glu Ala Tyr Arg Glu Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Arg Val Asn Glu 355 360 365 Asn Tyr Tyr Pro Gly Ala Ser Ile Tyr Glu Asn Glu Arg Ala Ser Arg 370 375 380 Asp Ser Glu Phe Gln Asn Glu Ile Leu Lys Arg Ala Glu Gln Asn Gly 385 390 395 400 Val Thr Phe Asp Glu Asn 405 <210> 30 <211> 406 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> modified protein M <400> 30 Ser Ile Ser Leu Thr Asp Gly Gly Tyr Arg Ser Glu Ile Asp Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gly Ser Asn Phe Arg Glu Asp Phe Arg Asn Phe Ala Asn Asn Leu 20 25 30 Ser Glu Ala Ile Thr Asp Ala Pro Lys Asp Leu Leu Arg Pro Val Pro 35 40 45 Lys Val Glu Val Ser Gly Leu Ile Lys Thr Ser Ser Thr Phe Ile Thr 50 55 60 Pro Asn Phe Lys Ala Gly Tyr Tyr Asp Gln Val Ala Glu Asp Gly Lys 65 70 75 80 Thr Leu Lys Tyr Tyr Gln Ser Thr Glu Tyr Phe Asn Asn Arg Val Val 85 90 95 Met Pro Ile Leu Gln Thr Thr Asn Gly Thr Leu Thr Ala Asn Asn Arg 100 105 110 Ala Tyr Asp Asp Ile Phe Val Asp Gln Gly Val Pro Arg Phe Pro Gly 115 120 125 Trp Phe His Asp Val Asp Lys Ala Tyr Tyr Ala Gly Ser Asn Gly Gln 130 135 140 Ser Glu Tyr Leu Phe Lys Glu Trp Asn Tyr Tyr Val Ala Asn Gly Ser 145 150 155 160 Pro Leu Tyr Asn Gln Tyr Pro Asn His Thr Phe Lys Gln Ile Lys Thr 165 170 175 Ile Ala Phe Asp Ala Pro Arg Ile Lys Gln Gly Asn Thr Asp Gly Ile 180 185 190 Asn Leu Asn Leu Lys Gln Arg Asn Pro Asp Tyr Val Ile Ile Asn Gly 195 200 205 Leu Thr Gly Asp Gly Ser Thr Leu Lys Asp Leu Glu Leu Pro Glu Ser 210 215 220 Val Lys Lys Val Ser Ile Tyr Gly Asp Tyr His Ser Ile Asn Val Ala 225 230 235 240 Lys Gln Ile Phe Lys Asn Val Leu Glu Leu Glu Phe Tyr Ser Thr Asn 245 250 255 Gln Asp Asn Asn Phe Gly Phe Asn Pro Leu Val Leu Gly Asp His Thr 260 265 270 Asn Ile Ile Tyr Asp Leu Phe Val Ser Lys Pro Phe Asn Tyr Ile Asp 275 280 285 Leu Thr Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asn Gln Asp Asn Ile Asp Ala Ser 290 295 300 Lys Leu Lys Arg Ala Val Ser Asp Ile Tyr Ile Arg Arg Arg Phe Glu 305 310 315 320 Arg Gln Met Gln Gly Tyr Trp Ala Gly Gly Tyr Ile Asp Arg Tyr Leu 325 330 335 Val Lys Asn Thr Asn Glu Lys Asn Val Asn Lys Asp Asn Asp Thr Val 340 345 350 Tyr Ala Ala Leu Lys Asp Ile Asn Leu His Leu Glu Glu Thr Tyr Thr 355 360 365 His Gly Gly Asn Thr Met Tyr Arg Val Asn Glu Asn Tyr Tyr Pro Gly 370 375 380 Ala Ser Ala Tyr Glu Ala Glu Arg Ala Thr Arg Asp Ser Glu Phe Gln 385 390 395 400 Lys Glu Ile Val Gln Arg 405

Claims (90)

  1. 야생형 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편에 비해 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편의 열안정성을 증가시키거나 유지하는 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  2. 제1항에 있어서, 야생형 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편에 비해 미코플라스마 단백질 M 또는 기능적 단편의 열안정성을 증가시키는 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미코플라스마 게니탈리움(Mycoplasma genitalium) 또는 미코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)의 단백질 M으로부터 유래된 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 3)의 대략 잔기 74 내지 대략 잔기 479 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기의 단편인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 단백질 M의 항체-결합 부위의 5 Å 이내의 잔기 (잔기 95, 99, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 114, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 158, 160, 161, 162, 163, 177, 178, 179, 180, 181, 186, 187, 188, 191, 321, 338, 340, 341, 345, 381, 384, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 426, 427, 429, 436, 438, 439, 440, 441, 442, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 452, 453, 455, 456, 457, 462, 466) 또는 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기 469-479 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기 중 임의의 것에 존재하지 않는 것인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기 78, 81, 83, 84, 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 96, 97, 100, 101, 108, 111, 112, 113, 122, 123, 125, 126, 127, 128, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 139, 141, 142, 146, 147, 148, 149, 150, 153, 154, 155, 156, 164, 167, 170, 175, 176, 184, 185, 189, 192, 193, 196, 198, 201, 202, 204, 205, 206, 207, 209, 211, 215, 218, 220, 224, 225, 226, 227, 231, 232, 234, 235, 236, 237, 239, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 264, 269, 270, 272, 274, 275, 276, 279, 282, 284, 286, 287, 288, 291, 297, 299, 300, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 313, 317, 318, 319, 320, 322, 326, 327, 329, 331, 332, 333, 335, 337, 342, 343, 347, 348, 351, 354, 355, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 367, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 378, 385, 399, 400, 401, 402, 405, 406, 407, 408, 409, 411, 413, 414, 417, 418, 419, 424, 428, 434, 435, 443, 450, 459, 460, 463, 464, 465, 468 또는 그의 임의의 조합 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재하는 것인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  7. 제6항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 표 4에 열거된 돌연변이 또는 그의 임의의 조합인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기 83, 90, 92, 94, 137, 142, 147, 150, 156, 184, 196, 198, 205, 211, 215, 225, 231, 232, 234, 235, 236, 237, 239, 243, 245, 250, 255, 256, 259, 264, 272, 274, 275, 276, 279, 282, 297, 300, 302, 310, 320, 326, 331, 332, 335, 342, 343, 347, 348, 355, 357, 361, 371, 374, 378, 385, 401, 402, 409, 413, 424, 460, 463, 464, 468 또는 그의 임의의 조합 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재하는 것인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  9. 제8항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 표 5에 열거된 돌연변이 또는 그의 임의의 조합인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기 150, 196, 198, 201, 205, 224, 232, 237, 274, 282, 342, 355, 373, 400, 402, 407, 409, 413, 135 또는 그의 임의의 조합 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재하는 것인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  11. 제10항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의
    a) 237;
    b) 232;
    c) 282;
    d) 150, 196, 198, 400, 402, 407, 409;
    e) 413, 435;
    f) 373, 400;
    g) 402, 407, 409, 413;
    h) 342;
    i) 150, 196, 198, 232, 237, 282, 342, 373, 400, 402, 407, 409, 413, 435;
    j) 274;
    k) 150, 196, 198, 232, 237, 342, 400, 402, 407, 409;
    l) 373, 413, 435;
    m) 205;
    n) 355;
    o) 150, 196, 198, 342, 373, 400, 402, 407, 409;
    p) 150, 196, 198, 232, 237, 342, 373, 400, 402, 407, 409;
    q) 201, 224;
    r) 150, 196, 198, 201, 224, 232, 237, 342, 400, 402, 407, 409;
    s) 150, 196, 198, 232, 237, 342, 390, 400, 402, 407, 409, 444;
    t) 150, 196, 198, 201, 205, 224, 232, 237, 274, 342, 355, 400, 402, 407, 409; 또는
    u) 150, 196, 198, 232, 237, 342, 391, 400, 402, 407, 409
    로부터 선택된 잔기 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재하는 것인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  12. 제11항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의
    a) F237T;
    b) S232Q;
    c) Q282D;
    d) S150E, S196R, S198P, V400I, N402I, K407P, S409V;
    e) L413I, T435I;
    f) V373I, V400I;
    g) N402L, K407P, S409V, L413I;
    h) A342V;
    i) S150E, S196R, S198P, S232Q, F237T, Q282D, A342V, V373I, V400I, N402I, K407P, S409V, L413I, T435I;
    j) N274D;
    k) S150E, S196R, S198P, S232Q, F237T, A342V, V400I, N402I, K407P, S409V;
    l) V373I, L413I, T435I;
    m) A205P;
    n) T355D;
    o) T355P;
    p) S150E, S196R, S198P, A342V, V373I, V400I, N402I, K407P, S409V;
    q) 150, 196, 198, 232, 237, 342, 373, 400, 402, 407, 409;
    r) S201C, A224C;
    s) S150E, S196R, S198P, S201C, A224C, S232Q, F237T, A342V, V400I, N402I, K407P, S409V;
    t) S150E, S196R, S198P, S232Q, F237T, A342V, F390E, V400I, N402I, K407P, S409V Y444K;
    u) S150E, S196R, S198P, S201C, A205P, A224C, S232Q, F237T, N274D, A342V, T355P, V400I, N402I, K407P, S409V; 또는
    v) S150E, S196R, S198P, S232Q, F237T, A342V, A391P, V400I, N402I, K407P, S409V
    또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기로부터 선택된 것인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 잔기 155, 203, 243, 248 및 358에 존재하는 것인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  14. 제13항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 A155E, K203R, H243T, V248Q 및 A358V인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의
    a) 468;
    b) 150;
    c) 147;
    d) 272;
    e) 355;
    f) 276, 277, 279;
    g) 300;
    h) 378;
    i) 156;
    j) 232;
    k) 245;
    l) 276;
    m) 225; 또는
    n) 310
    로부터 선택된 잔기 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재하는 것인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  16. 제15항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의
    a) R468Q;
    b) S150E;
    c) H147F;
    d) S272G;
    e) T355G;
    f) S276E, Q277L, N279R;
    g) N300Q;
    h) N378Y;
    i) S156K;
    j) S232L;
    k) A245Q;
    l) S276D;
    m) K225P; 또는
    n) V310E
    또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기로부터 선택된 것인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 글리코실화 부위를 제거하도록 추가로 변형된, 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 글리코실화 부위를 부가하도록 추가로 변형된, 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체에 대한 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편의 친화도를 증진시키는 1개 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  20. 제19항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기 95, 102, 103, 106, 107, 114, 116, 160, 161, 162, 163, 181, 186, 321, 381, 384, 389, 390, 391, 396, 397, 426, 429, 436, 438, 439, 441, 442, 447, 448, 449, 452, 453, 455, 456, 462 또는 466 또는 그의 임의의 조합 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재하는 것인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  21. 제20항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 표 6에 열거된 돌연변이 또는 그의 임의의 조합인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  22. 제19항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기 95, 103, 116, 186, 321, 389, 429, 442 또는 466 또는 그의 임의의 조합 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재하는 것인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  23. 제22항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 표 7에 열거된 돌연변이 또는 그의 임의의 조합인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  24. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체에 대한 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편의 친화도를 감소시키는 1개 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  25. 제19항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 잔기 390 및/또는 444 또는 엠. 뉴모니아에 단백질 M (서열식별번호: 23)의 대응 잔기에 존재하는 것인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  26. 제25항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 390E 및/또는 Y444K인 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단에 분비 펩티드를 추가로 포함하는 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  29. 제28항에 있어서, 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드.
  30. 제29항에 있어서, 프로모터가 박테리아 프로모터인 폴리뉴클레오티드.
  31. 제29항에 있어서, 프로모터가 포유동물 프로모터인 폴리뉴클레오티드.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아, 예컨대 이. 콜라이(E. coli)에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드.
  33. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드.
  34. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아, 예컨대 이. 콜라이 및 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포 둘 다에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  36. 제35항에 있어서, 박테리아 벡터인 벡터.
  37. 제35항에 있어서, 포유동물 벡터인 벡터.
  38. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 및/또는 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 형질전환된 세포.
  39. 제38항에 있어서, 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이인 형질전환된 세포.
  40. 제38항에 있어서, 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포인 형질전환된 세포.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 세포의 게놈 내로 안정하게 혼입된 것인 형질전환된 세포.
  42. 대상체에게 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 이종 작용제의 중화를 억제하는 것을 포함하는, 대상체에 대한 이종 작용제의 투여시 중화 항체에 의한 이종 작용제의 중화를 억제하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 이종 작용제가 핵산 전달 벡터인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 핵산 전달 벡터가 바이러스 벡터인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 알파바이러스, 바큘로바이러스, 백시니아 바이러스, 헤르페스 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 또는 아데노바이러스 벡터인 방법.
  46. 제43항에 있어서, 핵산 전달 벡터가 비-바이러스 벡터인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 비-바이러스 벡터가 플라스미드, 리포솜, 전기적으로 하전된 지질, 핵산-단백질 복합체 또는 생체중합체인 방법.
  48. 제42항에 있어서, 이종 작용제가 유전자 편집 복합체인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 유전자 편집 복합체가 CRISPR 복합체인 방법.
  50. 제42항에 있어서, 이종 작용제가 단백질 또는 핵산인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 단백질이 효소인 방법.
  52. 제50항에 있어서, 핵산이 안티센스 핵산 또는 억제 RNA인 방법.
  53. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 M의 유효량이 중화를 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, 99.5% 또는 99.9%만큼 억제하기에 충분한 양인 방법.
  54. 제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 M의 유효량이 대상체에서 몰 기준으로 약 0.5:1 내지 약 8:1, 예를 들어 약 2:1의 단백질 M 대 총 이뮤노글로불린의 비를 생성하기에 충분한 양인 방법.
  55. 제42항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체가 이종 작용제의 투여 전에 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  56. 제42항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체가 이종 작용제의 투여와 공동으로 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 이종 작용제가 대상체에 대한 투여 전에 단백질 M 또는 그의 단편 또는 유도체와 조합되는 것인 방법.
  58. 제42항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체가 미코플라스마 게니탈리움, 미코플라스마 뉴모니아에 또는 미코플라스마 페네트란스로부터의 것인 방법.
  59. 제42항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체가 단백질 M 단편인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 단백질 M 기능적 단편이 엠. 게니탈리움 단백질 M (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 17-537, 37-556, 37-482, 37-468, 37-442, 74-468, 74-479, 74-482, 74-468, 74-442 또는 74-556 또는 또 다른 단백질 M으로부터의 대응 잔기를 포함하는 것인 방법.
  61. 제42항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체가 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편인 방법.
  62. 제42항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체가 대상체에게 1회 초과로 투여되는 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 대상체에게 이종 작용제가 투여될 때마다 매회 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체가 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 동일한 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체가 매회 투여되는 것인 방법.
  65. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상이한 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체가 매회 투여되는 것인 방법.
  66. 제42항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 대상체 내 항체 농도를 감소시키기 위한 추가의 치료를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 추가의 치료가 혈장분리반출술, 항체 소화 효소, 예컨대 IdeS 또는 IdeZ의 투여, 비장절제술, 화학요법, 면역요법 또는 방사선 요법인 방법.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 추가의 치료가 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 투여 전에, 그 동안 및/또는 그 후에 투여되는 것인 방법.
  69. 대상체에게 (a) 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 코딩하는 핵산 전달 벡터 및 (b) 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 대상체에서 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 발현시키는 것을 포함하는, 대상체에서 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 발현시키는 방법.
  70. 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 (a) 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 코딩하는 핵산 전달 벡터의 치료 유효량 및 (b) 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 대상체에서 장애를 치료하는 것을 포함하며, 여기서 장애는 대상체에서 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 발현시킴으로써 치료가능한 것인, 상기 대상체에서 장애를 치료하는 방법.
  71. 대상체에게 (a) 유효량의 유전자 편집 복합체 및 (b) 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 대상체에서 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 발현시키는 것을 포함하는, 대상체에서 유전자를 편집하는 방법.
  72. 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 자가면역 질환을 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 방법.
  73. 과량의 항체와 연관된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 과량의 항체와 연관된 장애를 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 과량의 항체와 연관된 장애를 치료하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 과량의 항체와 연관된 장애가 다발성 골수종, 의미 불명의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS) 또는 발덴스트롬 마크로글로불린혈증인 방법.
  75. 항체의 급성 억제를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 투여함으로써 항체를 급성으로 억제하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 항체를 급성으로 억제하는 방법.
  76. 제75항에 있어서, 대상체가 시토카인 방출 증후군 또는 급성 자가면역 발작, 예컨대 돌연 발병하는 중증 자가면역 혈관염을 갖는 것인 방법.
  77. 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체가 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편인 방법.
  78. 제42항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체가 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입, 협측 (예를 들어, 설하), 질, 척수강내, 안내, 유리체내, 와우내, 경피, 내피내, 자궁내 (또는 난소내), 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 두개내, 근육내 [골격근, 횡경막 근육 및/또는 심장 근육으로의 투여 포함], 흉막내, 뇌내 및 관절내), 국소 (예를 들어, 기도 표면을 포함한 피부 및 점막 표면 둘 다로의 투여 및 경피 투여), 림프내 등, 뿐만 아니라 직접 조직 또는 기관 주사 (예를 들어, 간, 눈, 골격근, 심장 근육, 횡경막 근육 또는 뇌로의 주사)로부터 선택된 경로에 의해 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  79. 제42항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체가 골격근, 평활근, 심장, 횡경막, 기도 상피, 간, 신장, 비장, 췌장, 피부, 폐, 귀 또는 눈에 투여되는 것인 방법.
  80. 제42항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체가 이환 조직 또는 기관에 투여되는 것인 방법.
  81. 제42항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  82. 항체 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 화합물을 고체 지지체에 부착된 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편과 접촉시킨 다음, 화합물을 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편으로부터 용리시키는 것을 포함하는, 항체 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 화합물을 샘플로부터 단리하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 항체 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 화합물이 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 방법.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 고체 지지체가 비드 또는 입자인 방법.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체가 아가로스, 폴리아크릴아미드, 덱스트란, 셀룰로스, 폴리사카라이드, 니트로셀룰로스, 실리카, 알루미나, 산화알루미늄, 티타니아, 산화티타늄, 지르코니아, 스티렌, 폴리비닐디플루오라이드 나일론, 스티렌과 디비닐벤젠의 공중합체, 폴리메타크릴레이트 에스테르, 유도체화 아즐락톤 중합체 또는 공중합체, 유리 또는 셀룰로스를 포함하는 것인 방법.
  86. 제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 pH의 변화에 의해 용리되는 것인 방법.
  87. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체에 부착된 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편.
  88. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편을 사용하여 항체 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 화합물에 결합시키는 것을 포함하는, 면역검정을 수행하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 면역검정이 방사선-면역검정 (RIA), 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA) 검정, 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 검정, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 검정, 응집 검정, 면역형광 검정, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 검정, 면역조직화학 검정, 단백질 A 면역검정, 단백질 G 면역검정, 단백질 L 면역검정, 비오틴/아비딘 검정, 비오틴/스트렙타비딘 검정, 면역전기영동 검정, 침전/응집 반응, 이뮤노블롯 (웨스턴 블롯; 도트/슬롯 블롯); 면역확산 검정; 리포솜 면역검정, 화학발광 검정, 라이브러리 스크린, 발현 어레이, 면역침전, 경쟁적 결합 검정 및 면역조직화학적 염색으로부터 선택된 것인 방법.
  90. 제1항 내지 제27항 및 제87항 중 어느 한 항의 변형된 미코플라스마 단백질 M 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 키트.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5804183A (en) * 1997-01-31 1998-09-08 Enzon, Inc. Arginine deminase derived from mycoplasma arthritidis and polymer conjugates containing the same
EP3539568A1 (en) * 2011-11-22 2019-09-18 The Children's Hospital of Philadelphia Virus vectors for highly efficient transgene delivery
AU2013204555A1 (en) * 2012-04-30 2013-11-14 Oncolytics Biotech Inc. Protecting modified viruses from neutralizing antibodies using the reovirus sigma 1 protein
US9593150B2 (en) * 2012-07-16 2017-03-14 The Scripps Research Institute Immunoglobulin-binding human mycoplasma antigens and methods of use thereof
US20170320921A1 (en) * 2014-01-31 2017-11-09 Rajesh Grover Protein m related immunoglobulin-binding polypeptides
EP3204503A1 (en) * 2014-10-06 2017-08-16 Arthrogen BV Aav-based gene therapy
CN108884160B (zh) * 2015-10-30 2023-02-03 恩比伊治疗股份公司 抗ror1抗体
DE102016123859B3 (de) * 2016-12-08 2018-03-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Neue T-Zellrezeptoren und deren Verwendung in Immuntherapie

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