JP2022542294A - 抗体に結合して中和抗体を阻害するための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗体に結合するための方法および組成物に関する。当該方法は、抗体を単離するため、過剰抗体と関連する障害を処置するため、自己免疫性または炎症性応答を止めるために抗体を急性的にブロックするため、および中和抗体を阻害するために用いられ得る。実施態様において、本発明は、異種薬剤が対象へ投与されたときの異種薬剤に対する中和抗体を阻害する方法に関し、有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を対象へ投与するステップを含み、それにより、異種薬剤の中和を阻害する。本発明はさらに、野生型プロテインＭと比較して熱安定性が増加した改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント、および本発明の方法におけるそれらの使用に関する。【選択図】 図１

Description

［優先権の陳述］
本出願は、２０１９年８月１日に出願された米国仮出願番号６２／８８１，７６５の利益を主張し、その内容全体は参照により本明細書中に援用される。
［本発明の分野］
本発明は、抗体に結合するための方法および組成物に関する。当該方法は、抗体を単離するため、過剰抗体と関連する障害を処置するため、自己免疫性または炎症性応答を止めるために抗体を急性的にブロックするため、および中和抗体を阻害するために用いられ得る。実施態様において、本発明は、異種薬剤が対象へ投与されたときに異種薬剤に対する中和抗体を阻害する方法に関し、有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を対象へ投与するステップを含み、それにより、異種薬剤の中和を阻害する。本発明はさらに、野生型プロテインＭと比較して熱安定性が増大した改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント、および本発明の方法におけるそれらの使用に関する。
米国内の約１０人に１人が稀な遺伝子疾患を患っており、寿命、生活の質、自立、および経済情勢に重大な影響を及ぼし得る。遺伝子療法は、遺伝性疾患を矯正するための処置の最も有望な形態である。遺伝子療法の中でも、送達ビヒクル、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、非常に多くの臨床試験において治療的効果を示している。最初にＦＤＡが承認した遺伝子療法は盲目患者で用いられている。ＡＡＶ遺伝子療法に関する臨床試験数は、長期の治療的遺伝子発現に関し、その安全性および多くの異なるタイプの臓器の標的化における成功に起因して実質的に増えている。臨床的な成功にもかかわらず、ＡＡＶが介在する遺伝子送達に対する主な障壁は、標的組織のベクター形質導入をブロックする中和抗体（ＮＡｂ）の高い出現率である。一般集団の９０％よりも多くが、自然感染を介してＡＡＶに曝露されており、５０％よりも多くの人が、ＡＡＶに対するＮＡｂに関して血清陽性である。ＮＡｂは治療的有効性を著しく減衰させ、成果の変動性を生じさせるので、臨床試験スクリーニング中の特定の閾値を超える既存のＮＡｂの同定は、患者の登録を不適格にさせる。
ＡＡＶ ＮＡｂを克服するために、いくつかのアプローチ：連続的な血漿交換、免疫抑制薬、および、免疫エピトープを除去するためのベクターキャプシドの変更が採用されている。血漿交換は非効率であり、セッションごとに残存するＮＡｂの２～３倍を取り出す複数回を要し、低力価のＮＡｂしか対処することができない。また、血漿交換は時間がかかり、同時の抗体欠乏および繰り返しの静脈内の針曝露を介して患者を院内感染の伝染リスクに曝す。Ｂ細胞を死滅化させるためのステロイドまたは薬理学的免疫抑制は重大な健康リスクを有しており、ＮＡｂをさらに１０倍減少させるためには長期のレジメンを必要とする。ＡＡＶキャプシド工学は革新的な方法であるが、ポリクローナル抗ＡＡＶ血清に対しては最終的に不十分であり、抗体エスケープのわずか（ｍｏｄｅｓｔ）１０倍の増加がインビボで観察される。さらに、ＮＡｂ認識エピトープを変更するためのキャプシド構造の改変は、これらの変更された表面領域は多機能性であるので、典型的に、強力でないベクターおよび不完全なベクターの産生をもたらす。現在のアプローチは、臨床試験除外に関して設定された典型的な閾値を超える既存の抗－ＡＡＶ ＮＡｂをうまく克服せず、または同じＡＡＶベクターの繰り返し投与を可能にしない。
マイコプラズマ・プロテインＭは、非特異的に抗体に結合し、抗原に抗体が結合する能力をブロックすることが可能であるとして同定されている（米国特許第９，５９３，１５０号；米国公開番号２０１７／０３２０９２１）。
本発明は、Ｎａｂを普遍的にブロックするためのベクター非依存性のタンパク質に基づく方法ならびに抗体結合に基づく他の方法および組成物を提供することにより、当該分野における欠点を克服する。
本発明は、ＮＡｂを普遍的にブロックするためのベクター非依存性のタンパク質に基づく方法の開発および当該方法が広範囲の既存のＮＡｂ濃度に対して効果的であるという実証に部分的に基づく。本発明は、異種薬剤（例えば、ＡＡＶベクター）を対象へ投与した際のＮＡｂによる異種薬剤の中和を防止することにより成功的な遺伝子送達を可能にするために、独特なマイコプラズマ由来タンパク質およびその類似体（プロテインＭと呼ばれる）の使用を開拓する。プロテインＭは、抗体軽鎖および重鎖上の保存領域に普遍的に結合して、抗原認識ＣＤＲ領域と構造干渉を生じさせることにより、種および抗原に依存しない様式で哺乳類のＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ抗体クラスをブロックすることが示された。プロテインＭは、ナノモルの親和性で抗体に結合し、様々な異なる試験された免疫グロブリン／抗原ペアに関して抗原抗体結合を妨げる。本発明者らは、プロテインＭが抗体によるＡＡＶの認識をブロックすること、および抗体が介在するＡＡＶの中和を防止することを見いだした。ＮＡｂからエスケープするＡＡＶベクターのレベルは、ＮＡｂ力価および容量、プロテインＭの量、およびＡＡＶの量に比例することが示された。プロテインＭが介在するＮＡｂエスケープは、ヒト血清（ＩＶＩＧ）およびＡＡＶ免疫化マウス由来の血清を用いてインビトロおよびインビボで確認された。プロテインＭは、ＮＡｂ回避のために、ＡＡＶ投与の前に単独で投与することができ、またはＡＡＶとともに製剤化することができることが示された。このアプローチの有効性は、ＡＡＶが中和される前の免疫グロブリンとプロテインＭの相互作用に依存する。このアプローチは、特有の遺伝子療法適用のための各薬剤の独特または有益な特性を維持しながら、複数の異種薬剤（例えば、ＡＡＶベクター血清型）に対するＮＡｂを克服するために用いることができる。
本発明はさらに、自己免疫障害の処置、過剰抗体と関連する障害の処置、抗体を単離する方法、および免疫測定法を行なう方法を含む、抗体に結合することが有益である他の方法におけるプロテインＭの使用に関する。
本発明はさらに、増大した熱安定性および／または本発明の方法をインビボまたは高温で実施するための他の有利な特徴を有する改変されたプロテインＭタンパク質に関する。
したがって、本発明の一態様は、野生型マイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントと比較して、マイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントの熱安定性を増加または維持する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を有する、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントに関する。
本発明のさらなる一態様は、本発明の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントをコードするポリヌクレオチドおよびそれを含むベクターまたは形質転換された細胞に関する。
本発明の別態様は、対象への異種薬剤の投与の際の中和抗体による異種薬剤の中和を阻害する方法に関し、有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を対象へ投与するステップを含み、それにより異種薬剤の中和を阻害する。
本発明のさらなる一態様は、対象においてポリペプチドまたは機能性核酸を発現する方法に関し、（ａ）ポリペプチドまたは機能性核酸をコードする核酸送達ベクター、および（ｂ）有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を、対象へ投与するステップを含み、それにより、対象においてポリペプチドまたは機能性核酸を発現する。
本発明のさらなる一態様は、それを必要とする対象における障害を処置する方法に関し、障害は、ポリペプチドまたは機能性核酸を対象において発現することによって処置可能であり、（ａ）ポリペプチドまたは機能性核酸をコードする治療的に有効量の核酸送達ベクター、および（ｂ）有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を、対象へ投与するステップを含み、それにより対象における障害を処置する。
本発明の別態様は、対象における遺伝子を編集する方法に関し、（ａ）遺伝子編集複合体、および（ｂ）有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を対象へ投与するステップを含み、それにより、対象においてポリペプチドまたは機能性核酸を発現する。
本発明のさらなる一態様は、それを必要とする対象における自己免疫疾患を処置する方法に関し、有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を対象へ投与するステップを含み、それにより自己免疫疾患を処置する。
本発明のさらなる一態様は、それを必要とする対象における過剰抗体と関連する障害を処置する方法に関し、治療的に有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を対象へ投与するステップを含み、それにより、過剰抗体と関連する障害を処置する。
本発明の別態様は、抗体軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む化合物を試料から単離する方法に関し、当該方法は、固体支持体に付着された本発明の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントと化合物を接触させて、それから、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントから化合物を溶出させるステップを含む。
本発明のさらなる一態様は、免疫測定法を行なう方法に関し、当該方法は、抗体軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む化合物に結合するために本発明の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントを用いるステップを含む。
本発明のさらなる一態様は、本発明の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントを含むキットに関する。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明においてより詳細に示される。
ヒトＩＶＩＧが、用量依存的にＡＡＶ形質導入を阻害するＡＡＶ中和抗体を含むことを示す。ヒトＩＶＩＧの２倍希釈系列を用いてＡＡＶ２中和プロットを作成した。５０μｇで始めて、ＩＶＩＧを１μｇ未満まで段階的に希釈して、各希釈物をＡＡＶ２－ルシフェラーゼの２×１０８ウイルスゲノムと４℃で１時間インキュベートした後に、各ウェルに播種した。ＡＡＶ２導入遺伝子発現によって生じる発光レポーターシグナルは、ＡＡＶ形質導入の関数的リードアウトであり、培養ＨＥＫ－２９３細胞を形質導入するのに利用できたＡＡＶの量に比例する。この実験では、４８ウェルプレートの各ウェルに１×１０５細胞を播種して、血清フリー培地中２，０００のＭＯＩで形質導入した（条件あたりｎ＝３の技術的レプリケート）。ルシフェラーゼ活性の測定を形質導入の４８時間後にプレートリーダー上で細胞溶解およびルシフェリンの添加後に行なった。所定のＩＶＩＧ量に関して中和されたＡＡＶの割合間の関係は、同等の容量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むＩＶＩＧなしコントロールと比較して、１２．５μｇのＩＶＩＧで７２％（＋／－１．３％）の中和であると決定された。さらに、２５μｇのＩＶＩＧは９６％（＋／－０．２％）を中和し、５０μｇのＩＶＩＧは９９％（＋／－０．１７％）のＡＡＶ２を中和した。 プロテインＭが、ヒトＩＶＩＧ内に存在する中和抗体からＡＡＶを保護することを示す。前の図において、２×１０８ｖｇの用量のＡＡＶ２の約７０％を中和することが実証された１２．５μｇ ＩＶＩＧを用いて、抗体が介在する中和からのエスケープを、２倍希釈系列のプロテインＭを用いて研究した。この場合では、１分子のＩｇＧに対して８分子のプロテインＭのモル比で実験を始め、それは、１分子のＩｇＧが、完全な抗体不活性化のために占有されるべきであるプロテインＭ結合部位を２個有することを考慮すると、４倍過剰のプロテインＭである。各ウェルにおいて、ＩＶＩＧを、最初に個々のプロテインＭ希釈とともに４℃で１時間インキュベートして、その後にＡＡＶ２－ルシフェラーゼ（２×１０８ｖｇ）を加えてさらに１時間４℃でインキュベートした。それから、ＨＥＫ－２９３細胞（１×１０５）をウェルに添加して４８時間インキュベートした後に、ルシフェラーゼレポーターシグナルを測定した。ＩＶＩＧを含むがプロテインＭを含まないウェルは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むＩＶＩＧなしコントロールウェルと比較して、ＡＡＶシグナルの約６８％（＋／－３．３％）減少を示した。しかしながら、プロテインＭは、２：１よりも高いモル比で、ＡＡＶの中和を用量依存的にブロックし、中和を完全に防止したが（ＩＶＩＧなしコントロールの１０８％～１９３％）、１：１または０．５：１の比は部分的にのみ中和をブロックした（それぞれＩＶＩＧなしコントロールの５２％および４０％）。さらに、８：１および４：１の比では、ＩＶＩＧなしコントロールに対してＡＡＶルシフェラーゼシグナルの用量依存的な増加が観察された。全てのウェルを、４８ウェルプレート中の血清フリー培地（条件あたりｎ＝３の技術的レプリケート）においてトリプリケートで行ない、ルシフェラーゼシグナルを形質導入の４８時間後に測定した。 過剰プロテインＭが、８：１よりも高いモル比では、ＮＡｂからのさらなる保護をほとんど提供しないこと、および、プロテインＭがＡＡＶ形質導入を高めることを示す。ＡＡＶの形質導入を保護または高めるプロテインＭモル比の上限を確立する試みにおいて、中和抗体の条件とともにまたは伴わずに、ＮＡｂエスケープアッセイを、８：１または２０：１のモル比で繰り返した。１２．５μｇのＩＶＩＧの添加は、ＩＶＩＧなしＰＢＳコントロールウェルと比較して、８０％（＋／－２．６％）のＡＡＶ２－ルシフェラーゼシグナルを中和した。以前の実験と同様に、プロテインＭを、１２．５μｇのＩＶＩＧ（８：１モル比、３３μｇプロテインＭ）とともに４℃で１時間予めインキュベートして、その後に、４℃で１時間ＡＡＶとともにインキュベートすると、ＡＡＶの中和が防止され、ＰＢＳを含むＩＶＩＧなしコントロールの１９４％（＋／－２４％）へと、ルシフェラーゼシグナルが増強した。ＮＡｂエスケープに必要なプロテインＭの量の１０倍では（２０：１モル比、７５μｇプロテインＭ）、ＰＢＳを含むＩＶＩＧなしコントロールに対して２５６％（＋／－４４％）へと、ルシフェラーゼ活性のわずかな（ｍｏｄｅｓｔ）増加が観察された。ＩＶＩＧ存在下で、２０：１比のルシフェラーゼシグナルは、８：１比と統計的に違いがなかった。さらに、ＩＶＩＧなしでは、７５μｇまたは３３μｇのプロテインＭを単独でＡＡＶ２－ルシフェラーゼと４℃で１時間インキュベートした場合、ルシフェラーゼシグナルの量に有意差はなく（それぞれ２０８％対２１６％）、ＰＢＳコントロールと比較したルシフェラーゼシグナルの増加が、プロテインＭに基づく増強に起因することが確認された。各ウェルに血清フリー培地中の１×１０５ＨＥＫ－２９３細胞を播種し、４８ウェルプレートのフォーマットにおいて２，０００のＭＯＩで形質導入した（ウェル条件あたりｎ＝３の技術的レプリケート）。 ＡＡＶ形質導入のプロテインＭ増強が用量依存的であることを示す。３３μｇで始めて、２倍希釈系列のプロテインＭは、プロテインＭとＡＡＶ２－ルシフェラーゼのインキュベーションが、ＰＢＳ＋ＡＡＶコントロールと比較してルシフェラーゼシグナルの増加をもたらすことを示す。ルシフェラーゼシグナルの増強は、２×１０８ウイルスゲノムに関して２μｇ未満のプロテインＭの濃度において、すなわち、ゲノム含有ＡＡＶ２－ルシフェラーゼ１粒子に対して４０，０００分子のプロテインＭのモル比においては消失する。増強は、２×１０８ベクター粒子に関して約３３μｇのプロテインＭ、すなわち、ゲノム含有ＡＡＶ２－ルシフェラーゼ１粒子に対して約７００，０００分子のプロテインＭで飽和し始める。プロテインＭ希釈物を、形質導入前にＡＡＶとともに４℃で１時間インキュベートした。各ウェルに血清フリー培地中の１×１０５ＨＥＫ－２９３細胞を播種し、４８ウェルプレートのフォーマットにおいて２，０００のＭＯＩで形質導入した（ウェル条件あたりｎ＝３の技術的レプリケート）。 プロテインＭに基づくＡＡＶ形質導入の増強が、ＡＡＶキャプシドとプロテインＭの直接的な相互作用に依存することを示す。３つの異なる条件を、ＡＡＶ２－ルシフェラーゼとともに試験した：形質導入前１時間（－１ｈ）のＡＡＶとプロテインＭの事前インキュベーション、形質導入付近（ｐｅｒｉ－ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）の時点（０ｈ）におけるＡＡＶへのプロテインＭの添加、または、ＡＡＶによる形質導入の１８時間後（１８ｈ）のウェルへのプロテインＭの添加。プロテインＭを含まない２つのネガティブコントロール条件を用いた：ＡＡＶを単独で、細胞播種および形質導入の前に細胞培養培地中で４℃にて１時間インキュベートし（事前インキュベーションおよび形質導入付近の群における条件を表わしている）、またはＡＡＶをＰＢＳ中に希釈して、細胞播種および形質導入の時点において細胞培養物へ添加した（形質導入後の群における条件を表わしている）。形質導入の１８時間後に、追加容量のＰＢＳをＰＢＳコントロール群に添加して、同等容量のプロテインＭが形質導入後の群に添加される条件を模擬した。プロテインＭが形質導入付近または形質導入後に添加されたウェルにおいてはＡＡＶルシフェラーゼシグナルの増強は見られなかったが、事前インキュベーションの群において用量依存的な増強が観察され、ＡＡＶとプロテインＭの相互作用が増強メカニズムに必要であることが示された。全てのウェルには１×１０５Ｈｕｈ７細胞が播種され、各ウェルは２×１０８ｖｇのＡＡＶによって形質導入され、４８ウェルプレートのフォーマットにおいてウェル条件あたりｎ＝３の技術的レプリケートであった。 プロテインＭは、ＮＡｂがキャプシドに結合した後にＡＡＶ中和を防止しないことを示す。ＡＡＶ２－ルシフェラーゼを、最初に異なる希釈のＩＶＩＧとともに４℃で１時間インキュベートし、それから、プロテインＭを添加してさらに１時間４℃でインキュベートした。二重のネガティブコントロール群はＡＡＶのみが投与され、ポジティブコントロールは、形質導入前にＡＡＶとともに４℃で１時間インキュベートされた３３μｇのプロテインＭが投与された。２００μｇ、５０μｇ、または１２．５μｇを含む３つの異なる希釈のＩＶＩＧを用いた。ＩＶＩＧの希釈物とともにインキュベートされたＡＡＶのみを含むプロテインＭネガティブコントロール群と比較して、３３μｇのプロテインＭは、５０μｇまたは２００μｇのＩＶＩＧによって９９％のＡＡＶが既に中和されている場合は、中和後の増強または中和抗体からのエスケープを可能にしない。しかしながら、１２．５μｇのＩＶＩＧがＡＡＶとともにインキュベートされる場合は、約３０％のベクターが中和されないままであり（図１、２、および３を参照）、３３μｇのプロテインＭは、ＡＡＶおよび１２．５μｇ ＩＶＩＧを含むプロテインＭネガティブコントロールウェルと比較して、中和後にこの画分の形質導入を高めることができた。以前の図とは異なり、ルシフェラーゼ測定は、形質導入の２４時間後にのみ行ない、このことは、１２．５μｇ ＩＶＩＧ＋ＡＡＶを有する群によるルシフェラーゼシグナルが二重ネガティブコントロールの３０％未満である理由を説明することができる。各ウェルに血清フリー培地中の１×１０５ＨＥＫ－２９３細胞を播種し、４８ウェルプレートのフォーマットにおいて２，０００のＭＯＩで形質導入した（ウェル条件あたりｎ＝３の技術的レプリケート）。 ＡＡＶとプロテインＭの事前インキュベーションが、ＩＶＩＧによるその後の中和からベクターを保護することを示す。この中和アッセイについては、プロテインＭの量を同一（８．２５μｇ）に維持したが、様々な量のＩＶＩＧを用いて異なるモル比を達成した（５０μｇ～３．１２μｇのＩＶＩＧ）。プロテインＭを最初にＡＡＶ２－ルシフェラーゼとともに４℃で１時間インキュベートして、その後にＩＶＩＧを添加して４℃で１時間インキュベート後、細胞培養を形質導入した。ポジティブコントロール群は、ＡＡＶ＋３３μｇ、８．２５μｇ、または１μｇのプロテインＭを含んでおり、ネガティブコントロール群はＰＢＳとともにインキュベートされたＡＡＶのみを含んでいた。プロテインＭが介在することによりＡＡＶの非中和画分が２～３倍増強されることが観察された。各ウェルに血清フリー培地中の１×１０５ＨＥＫ－２９３細胞を播種し、４８ウェルプレートのフォーマットにおいて２，０００のＭＯＩで形質導入した（ウェル条件あたりｎ＝３の技術的レプリケート）。ルシフェラーゼ測定を形質導入の２４時間後に行なった。 ＡＡＶとプロテインＭの事前インキュベーションが、過剰のバックグラウンド血清免疫グロブリンにおいてＩＶＩＧによる中和からベクターを保護することを示す。この実験については、２×１０８ウイルスゲノムの用量のＡＡＶ２－ルシフェラーゼの約９５％を中和することが以前に示された２５μｇのＩＶＩＧを用いた。２５μｇのヒトＩＶＩＧを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む細胞培養ウェルに添加した（製造元によって行なわれたＥＬＩＳＡによって決定される推定ウシＩｇＧ濃度３５０μｇ）。同量の１０％ＦＢＳを含む細胞培養ウェルの別のセットをＩＶＩＧなしコントロールとして用いた。モル比４：１、２：１、および１：１（ウシＩｇＧ含有量に基づく）のプロテインＭを、４℃で１時間、ＡＡＶとともにインキュベートした後に、ＩＶＩＧなしコントロールウェルまたは２５μｇ ＩＶＩＧ含有ウェルにそれぞれ１０％ＦＢＳを添加した。ネガティブコントロール群においてはプロテインＭの代わりにＰＢＳとともにＡＡＶをインキュベートして、１０％ＦＢＳを含むウェルまたは２５μｇのＩＶＩＧとともに１０％ＦＢＳを含むウェルに添加した。結果は、プロテインＭの事前インキュベーションは、１分子のウシＩｇＧに対して１分子のプロテインＭの比でさえもＩＶＩＧによる中和からＡＡＶ２－ルシフェラーゼを保護したことを示すが、この量のプロテインＭ（１０８μｇ）は、ヒトＩＶＩＧ（２５μｇ）よりも実に１２倍高い比（ｓｔｉｌｌ ｉｎ ａ １２－ｆｏｌｄ ｇｒｅａｔｅｒ ｒａｔｉｏ ｔｈａｎ）であった。各ウェルに１×１０５ＨＥＫ－２９３細胞を播種し、４８ウェルプレートのフォーマットにおいて２，０００のＭＯＩで形質導入した（ウェル条件あたりｎ＝３の技術的レプリケート）。ルシフェラーゼ測定を形質導入の２４時間後に行なった。 プロテインＭが、免疫化マウスから回収されたプールされたポリクローナル血清において見られる中和抗体からのＡＡＶ８のインビトロエスケープを可能にすることを示す。この実験については、ＡＡＶ８免疫化マウス由来の１０μｌのプールされたポリクローナル血清をＰＢＳ中に段階希釈して、最初に１０倍希釈して１μｌおよび０．１μｌ血清を含むウェルを作成した。それから、０．１μｌ血清ウェルを２倍希釈系列でさらに希釈した。ＡＡＶ８－ルシフェラーゼベクター（ウェルあたり２×１０８ウイルスゲノム）を中和血清の希釈物とともに４℃で１時間インキュベートした後に形質導入した。プロテインＭを、同一のＡＡＶ８中和マウス血清の１０倍希釈系列に、概算で１分子の免疫グロブリンに対して２分子のプロテインＭの比で添加した。１μｌの中和マウス血清中、概算１０μｇの免疫グロブリンに対して６．５μｇのプロテインＭで始めて、それぞれのプロテインＭおよび血清試料を別個に相互希釈した後、４℃で１時間のインキュベーションのために合わせた。それから、全ての試料をＡＡＶ８－ルシフェラーゼともに４℃で１時間インキュベートした後に細胞へ添加した。得られた中和実験からのデータを、ＡＡＶ８のみを含む血清なしコントロールウェルに対して正規化して、それから、ルシフェラーゼシグナルを二重指数減衰関数によってフィットさせて、データのポイント間の曲線を推測した。モデル曲線を用いて、ポリクローナル血清によるＡＡＶ８の５０％中和が、１：２，５６４の効果的な力価に関して、０．００３９μｌの用量で生じることが分かった。しかしながら、２：１モル比のプロテインＭとともにインキュベートされた同じ血清の５０％中和は、０．２７４４μｌの血清容量で生じ、概算で１：３６の効果的な力価をもたらした。この結果は、プロテインＭが、インビトロで、ほぼ１００倍差の血清濃度にわたり（ｏｖｅｒ ｎｅａｒｌｙ ａ １００－ｆｏｌｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）ＡＡＶを保護することが可能であることを示している。９６ウェルプレートのフォーマットにおいて、全てのウェルに５×１０４ＨＥＫ－２９３細胞を播種し（４，０００のＭＯＩ）、ウェル条件あたりｎ＝３の技術的レプリケートであり、ルシフェラーゼは形質導入の４８時間後に測定された。 ＡＡＶ８に対する受動免疫を有するマウスへのプロテインＭのインビボ投与が、中和抗体エスケープをもたらすことを示す。この実験では、マウスに、ＩＶ注入を介した受動移入によって様々な容量のポリクローナルＡＡＶ８血清（以前の図から、力価１：２，５６４）を与え、その後１５～２０分以内に、２×１０１０ウイルスゲノムのＡＡＶ８－ルシフェラーゼをＩＶ投与した。これにより、各マウスに送達された血清容量に基づく中和曲線が実証された。血清が受動移入されていないナイーブマウス群と比較して、１μｌ～０．００１μｌの移入血清では、ＡＡＶ８－ルシフェラーゼシグナルの５０％を超える中和が生じることが分かった。しかしながら、概算で２：１比のプロテインＭ（６．３ｍｇ）が受動移入後であるがＡＡＶ投与前にマウスに送達された場合、中和抗体からの完全なエスケープが０．３μｌおよび１μｌの移入血清容量で達成され、ＮＡｂ濃度の１，０００倍変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）の中和抗体からのプロテインＭが介在するエスケープを示した。さらに、中和からのエスケープは、０．３μｌの受動移入血清群について用量依存的であり、ＮＡｂエスケープが、血清なしコントロール群と比較して、１：１（３．１５ｍｇ）および０．５：１（１．５８ｍｇ）の概算モル比に関して減少することが示された。全ての群に関して、群の条件あたりｎ＝５匹のマウスであり、肝臓からのルシフェラーゼシグナルをＡＡＶ投与の２４時間後に測定した。 図１０の結果から定量化された平均の生発光（ｒａｗ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を示す。 プロテインＭ／抗体複合体が、インビトロでの形成後に安定していることを示す。この実験において、概算で１０μｇの免疫グロブリンを含む１μｌのポリクローナル血清（力価１：２，５６４）を用いてプロテインＭ（２：１モル比、６．６μｇ）と様々な持続時間でインキュベートした後にＡＡＶ８－ルシフェラーゼを添加した。ネガティブコントロール群は中和血清＋培地を含んでおり、ポジティブコントロール群は培地＋ＰＢＳまたはプロテインＭ＋培地を含んでいた。７２時間、４８時間、２４時間、１６時間、４時間、２時間、および１時間のインキュベーション間隔を全ての群に適用した。全てのインキュベーション持続時間は、培地＋ＰＢＳのネガティブコントロールと比較して、プロテインＭが介在する、中和からのＡＡＶ８の保護を示した。９６ウェルプレートのフォーマットにおいて、５×１０４ＨＥＫ－２９３細胞を播種する時（０ｈ）にＡＡＶ８－ルシフェラーゼをウェルに添加して、４，０００のＭＯＩで形質導入した（ウェル条件あたりｎ＝３の技術的レプリケート）。ルシフェラーゼ測定を形質導入の４８時間後に行なった。 インビボでのプロテインＭによる中和抗体エスケープの効能が不安定であることを示す。図１０および図１１と同一の実験を行なったが、今回は、ＮＡｂエスケープの耐久性を試験するために、プロテインＭ投与の５分後、またはプロテインＭ投与の３時間後にＡＡＶ８を添加した。ＡＡＶ８－ルシフェラーゼシグナルは、ＡＡＶ８を投与するまで３時間待った後は血清なしコントロール群の約１／３であったが、プロテインＭの後にＡＡＶ８を投与するまで５分だけ待った場合は、ルシフェラーゼシグナルは血清なしコントロール群とほぼ同等であった。概算で２：１比のプロテインＭ（６．３ｍｇ）を、受動移入後であるがＡＡＶ投与前にマウスに送達し、ｎ＝３匹のマウスを含む３時間の間隔の群を除いて、群の条件あたりｎ＝５匹のマウスであった。肝臓からのルシフェラーゼシグナルをＡＡＶ投与の２４時間後に測定した。 Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ（ＭＧ ＷＴ）由来のトランケートされたプロテインＭが、体温で不安定であることを示す。融解温度（Ｔｍ）を、ナノ示差走査型蛍光透視法（ＮａｎｏＤＳＦ）を用いて決定した。一次導関数の変曲点はＴｍを示す。タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ内で組換えにより発現して、測定前にニッケルカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。円偏光二色性アッセイにより、ＭＧ ＷＴが２０℃で少なくとも２時間安定であり、目に見える析出物が形成されないことが示された。しかしながら、３７℃では、ＭＧ ＷＴは１５分後にアンフォールディングし始めて、目に見える析出物が生じた。このことは、タンパク質が標準的なヒト体温付近で不安定であることを示す。０～１００℃の温度傾斜により、ＭＧ ＷＴの即時のアンフォールディングおよび融解温度（Ｔｍ）が約４１．２°Ｃであることが示された。アンフォールディングは、目に見える析出物の凝集を伴った。 Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ（ＭＧ ＷＴ）およびＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＭＰ ＷＴ）由来のトランケートされたプロテインＭ、ならびに、ＭＧ ＷＴよりも融解温度が少なくとも１度改善したプロテインＭの類似体（Ａ）またはＭＧ ＷＴの融解温度を維持するプロテインＭの類似体（Ｂ）の融解温度を示す。融解温度を、ＷＴおよびＥ．ｃｏｌｉからの小スケールのタンパク質生産によって生産された突然変異体タンパク質類似体に関して、示差走査型蛍光透視法（ＮａｎｏＤＳＦ）によって決定した。突然変異の数およびそれらの対応するアミノ酸置換を右に列挙する。類似体は様々な熱安定性を示し、多重突然変異は相加効果を生じさせて融解温度を増大させる。 ＭＧ ＷＴおよびＭＧ２９の融解温度を測定するために示差走査型蛍光透視法（ＤＳＦ）を用いたデータの例を示す。全ての類似体について融解温度を決定して、ＭＧ ＷＴ（Ｔｍ＝４１．９℃）およびＭＧ２９（Ｔｍ＝５５．２℃）の結果を示した。一次導関数の変曲点は融解温度（Ｔｍ）を示す。タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ内で組換えにより発現して、測定前にニッケルカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。 ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定されたプロテインＭ類似体の可溶性画分評価を示す。各タンパク質の７個のアリコート（０．４ｍｇ／ｍＬ）を、３７℃で異なる時間インキュベートした。試料を１５，０００×Ｇで１０分間遠心分離することによって析出タンパク質をペレット化した後に可溶性画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに通した。評価の０、１、４、２４、４８、７２、または９６時間前にタンパク質を加熱した。結果は、加熱の１～４時間後にＭＧ ＷＴ（Ａ）が、溶液から析出し始めることを示す。ＭＧ２７（Ｂ）およびＭＧ２９（Ａ）は、７２時間にわたり可溶性のままであり、ＭＧ３１（Ｂ）およびＭＧ４０（Ｃ）は２４時間にわたり可溶性のままである。 異なるプロテインＭ類似体が、インビトロ中和アッセイ中に、プールされたヒト静脈内免疫グロブリンγ（ＩＶＩＧ）をブロックして、ＡＡＶ２－ルシフェラーゼベクターの中和を防止することを示す：１時間（ＡおよびＢ）または２４時間（Ｃ）インキュベーションに関する４℃対３７℃の熱曝露の比較。４：１比のプロテインＭ対ＩＶＩＧ。ルシフェラーゼ活性によって生産された相対発光量を、９６ウェルプレートのフォーマットにおいてトリプリケートで行なわれたＡＡＶ２－ルシフェラーゼレポーターベクター（２Ｅ８ｖｇ）による形質導入の２４時間後に細胞培養物から測定した。結果を、ＡＡＶ２およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のみを含むウェルに対して正規化した（白いバー）。ＩＶＩＧ（１２μｇ）とともに１時間インキュベートしたＡＡＶ２は、ＡＡＶのほぼ完全な中和を示した。４℃でインキュベートしたプロテインＭ類似体（１６μｇ）は、ＡＡＶの前に１時間、一緒にインキュベートした場合、ＩＶＩＧによるＡＡＶの中和を防止した。これを、ＩＶＩＧとインキュベートせずに４℃でインキュベートしたプロテインＭ類似体と比較した（ＭＧ８およびＭＧ２４については行わなかった）。類似体がＩＶＩＧとのインキュベーション前に３７℃で熱曝露された場合、ＭＧ ＷＴおよびより低い融解温度を有する一部の類似体は中和からＡＡＶを保護しなかったが、より高いＴｍを有する他の類似体は、中和からＡＡＶを保護する能力を維持した。大部分の突然変異ＭＧ類似体は、１時間の３７℃曝露後に、中和抗体をブロックする能力を維持した。しかしながら、ＭＧ２７、ＭＧ２９、およびＭＧ４６は、２４時間の３７℃曝露後にＡＡＶの中和を防止した。 一次ＡＡＶ投与の１ヶ月後のＡＡＶ再投与に関して、ＭＧ ＷＴがＮＡｂをブロックすることを示す。野生型Ｃ５７ＢＬ６雌マウスを、ＡＡＶ８－ＧＦＰ（１Ｅ９ｖｇ）の腹腔内投与を介して免疫化して、血清を１ヶ月後に回収してＡＡＶ中和抗体力価をインビトロで評価した。それから、マウスにＡＡＶ８－ルシフェラーゼレポーターベクターを筋肉内投与し（１Ｅ９ｖｇ／脚）、ここで、マウスの右脚に対してはＭＧ ＷＴとの単純な混合としてＡＡＶを製剤化し（３３μｇ／脚）、または、マウスの左脚に対してはビヒクルコントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水を用いてＡＡＶを製剤化した。脚筋の発光イメージングを、ＡＡＶ８－ルシフェラーゼ投与の２週間後に行なった。１：１０のＡＡＶ中和抗体力価を有する３匹のマウスは、生理食塩水で製剤化された脚においてＡＡＶルシフェラーゼレポーターベクターの中和を示したが、ＡＡＶルシフェラーゼレポーターベクターは、同じマウスのＭＧ ＷＴが製剤化された脚において中和抗体から保護された。生理食塩水の脚におけるＡＡＶの中和は、ＭＧ ＷＴが製剤化された脚よりも８０％低い平均ルシフェラーゼシグナルを生じた。この結果は、以前のＡＡＶ投与によって誘発された中和抗体の産生後に、プロテインＭを用いて成功的にＡＡＶを再投与することができることを示している。 ＭＧ２９が、一次ＡＡＶ投与の１ヶ月後のＡＡＶ再投与に関してＮＡｂをブロックすることを示す。野生型Ｃ５７ＢＬ６雌マウスを、ＡＡＶ８－ＧＦＰ（５Ｅ８ｖｇ）の腹腔内投与を介して免疫化して、血清を１ヶ月後に回収してＡＡＶ中和抗体力価をインビトロで評価した。それから、マウスにＡＡＶ８－ルシフェラーゼレポーターベクターを筋肉内投与し（２Ｅ９ｖｇ／脚）、ここで、マウスの右脚に対しては改変類似体ＭＧ２９との単純な混合としてＡＡＶを製剤化し（５００μｇ／脚）、または、マウスの左脚に対してはビヒクルコントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水を用いてＡＡＶを製剤化した。脚筋の発光イメージングを、ＡＡＶ８－ルシフェラーゼ投与の２週間後に行なった。１：１００未満のＡＡＶ中和抗体力価（個々に１：８、１：３２、および１：６４）をそれぞれ有する３匹のマウスは、生理食塩水で製剤化された脚においてＡＡＶルシフェラーゼレポーターベクターの中和を示したが、ＡＡＶルシフェラーゼレポーターベクターは、同じマウスのＭＧ２９が製剤化された脚において中和抗体から保護された。生理食塩水の脚におけるＡＡＶの中和は、ＭＧ ＷＴが製剤化された脚よりも少なくとも９８％低い平均ルシフェラーゼシグナルを生じた。この結果は、以前のＡＡＶ投与によって誘発された中和抗体の産生後に、改変プロテインＭ類似体を用いて成功的にＡＡＶを再投与することができることを示している。 改変プロテインＭ類似体が、ＩｇＧに関して異なる親和性を示すことを示す。特定のプロテインＭ類似体の親和性を、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて測定した。結合定数（ＫＤ）を、１５．６ｎＭ～２５０ｎＭのプロテインＭ濃度範囲にわたる会合速度および解離速度（動態解析）を用いて計算した。結果は、ＭＧ ＷＴと比較した、ＢＬＩプローブに付着されたＩｇＧに対する親和性の増大または低減を示す。 動態解析によって作成されたＢＬＩ親和性データの一例を示す。曲線は、動態学的ＫＤ値を予測するために用いられる。曲線フィットが、収集データ上に重ねられている。 突然変異体の安定化の成功率を示す。ＭＧ ＷＴに関してＲｏｓｅｔｔａによって予測された突然変異が、安定性を増大した（Ｔｍ＋１℃）、低減した（Ｔｍ－１℃）、または、影響がなかった頻度を表わす。「組み合わせの突然変異」は、ＭＧ ＷＴを個々に安定化した突然変異体構築物のマージによって構築された構築物を表わす。 ＭＰ ＷＴ配列の保存を示す。ＭＰ ＷＴのホモロジーモデルを２方向で示し、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスに従ってＭＧ ＷＴ配列に対する保存によって色付けした。残基は、白（同一）～黒（有意に異なる）にわたる保存の程度に従って色付けされている。ホモロジーレベルを、ＰＤＢ ＩＤ：４ＮＺＲをテンプレートとして用いて構築した。 プロテインＭのＤＮＡ配列のコドン最適化によって、製造収率が高くなることを示す。ＭＧ ＷＴタンパク質をコードするＤＮＡプラスミドを、ＭＧ２８１にネイティブの細菌コドン（オリジナルＰＭ）、または細菌およびヒトコドン使用頻度の両方に対して最適化されたコドン（最適化ＰＭ）を用いて生産した。同等濃度のオリジナルＰＭプラスミドまたは最適化ＰＭプラスミドによって形質転換された３つのプールされた細菌コロニーを培養して、同等の一晩の期間、同等の増殖培地容量（１０ｍＬ）中で繁殖させた。細菌をペレット化して、凍結融解および同等容量の溶解バッファー中の溶解によって粗溶解物を生産した。粗溶解物を遠心分離して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上でのタンパク質分離のために上清を回収した。各溶解物からの同等容量をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に流し、ウエスタンブロット上へ移して、それから、ＭＧ ＷＴのアミノ末端に存在する６×ヒスチジンタグに対するマウス抗体を用いてプローブした後に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされたヤギ抗－マウス二次抗体を用いてプローブした。ＭＧ ＷＴタンパク質のバンド強度を、ルミノール化学発光アッセイを用いて測定した。得られたＭＧ ＷＴ収率を、細菌ペレットの重量に対して正規化されたウエスタンブロットのバンド強度に基づいて計算した。最適化ＰＭプラスミドは、オリジナルＰＭプラスミドと比較した場合、ＭＧ ＷＴタンパク質収率がほぼ４倍増加した。 突然変異体の改善されたｐＨ安定性を示す。融解温度（Ｔｍ）を、異なるｐＨ条件でＮａｎｏＤＳＦを用いて決定した。タンパク質をＰＢＳ中でＳＥＣを介して精製して、グリシン（ｐＨ２．５＆３．５）、酢酸（ｐＨ４．５＆５．５）、およびリン酸（ｐＨ６．５および７．５）バッファーにバッファー交換した。 野生型Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭアミノ酸７４～４７９（配列番号３）および改変されたプロテインＭ ＭＧ１（配列番号４）、ＭＧ８（配列番号５）、ＭＧ１３（配列番号６）、ＭＧ１５（配列番号７）、ＭＧ２１（配列番号８）、ＭＧ２２（配列番号９）、ＭＧ２３（配列番号１０）、ＭＧ２４（配列番号１１）、ＭＧ２７（配列番号１２）、ＭＧ２８（配列番号１３）、ＭＧ２９（配列番号１４）、ＭＧ３１（配列番号１５）、ＭＧ３３（配列番号１６）、ＭＧ３８（配列番号１７）、ＭＧ４０（配列番号１８）、ＭＧ４３（配列番号１９）、ＭＧ４４（配列番号２０）、ＭＧ４５（配列番号２１）、およびＭＧ４６（配列番号２２）の配列アライメントを示す。 野生型Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭアミノ酸７４～４７９（配列番号３）およびＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当するフラグメントの配列アライメントを示す。
本発明は、以下により詳細に説明される。この説明は、本発明が実施され得る全ての異なる方法または本発明に加えられ得る全ての特徴の詳細なカタログであることを意図しない。例えば、一実施態様に関して説明される特徴は、他の実施態様に組み込まれてよく、特定の実施態様に関して説明される特徴は、その実施態様から削除されてよい。さらに、本明細書において示唆される様々な実施態様に対する非常に多くのバリエーションおよび付加は、本開示に照らして当業者に明らかであり、本発明から逸脱しない。それ故に、以下の明細書は、本発明の一部の特定の実施態様を説明することを意図し、それらの全ての並べ替え、組み合わせ、およびバリエーションを網羅的に特定することを意図しない。
文脈が別段の指示をしない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特徴は、任意の組み合わせで用いられ得ることが明確に意図される。さらに、本発明はまた、本発明の一部の実施態様では、本明細書中に示される任意の特徴または特徴の組み合わせが除外または省略され得ることも検討する。例示すると、複合体は構成要素Ａ、ＢおよびＣを含むと明細書が記述している場合、Ａ、ＢもしくはＣのいずれか、またはそれらの組み合わせが、単独または任意の組み合わせで省略および否定され得ることが明確に意図される。
別段の定義がされない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者の一人によって一般に理解されるのと同一の意味を持つ。本明細書において本発明の説明において用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、本発明の制限を意図しない。
ヌクレオチド配列は、別段の明確な指示がない限り、本明細書において、一本鎖のみによって、５’から３’の方向で、左から右に示される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される様式で、または、（アミノ酸については）一文字コードまたは三文字コードのいずれかによって、どちらも３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２および確立された使用に従って表される。
別段の指示がある場合を除き、当業者に公知の標準的な方法が、組換えおよび合成ポリペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメントの生産、核酸配列の操作、形質転換された細胞の生産、ｒＡＡＶ構築物、改変キャプシドタンパク質、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列を発現するパッケージングベクター、および、一時的および安定的にトランスフェクトされたパッケージング細胞の構築のために用いられ得る。かかる技術は当業者に公知である。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；Ｆ．Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬ ｅｔ ａｌ．ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。
本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列および他の参考文献は、参照によってそれらの全体で援用される。
定義
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形も含むことが意図される。
本明細書において用いられる「および／または」は、関係がある挙げられたアイテムの１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、選択的に解釈される場合（「または」）は、組み合わせの欠失を指し、および包含する。
さらに、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書において示される任意の特徴または特徴の組み合わせが除外または省略され得ることも検討する。
さらに、本明細書において用いられる用語「約」は、本発明の化合物または薬剤の量、用量、時間、温度などの測定可能な値を指す場合、規定の量の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または実に±０．１％の変動を包含することを意味する。
本明細書において用いられる移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、列挙された材料またはステップ、および、特許請求の範囲に記載された発明の基礎的および新規の特徴（単数または複数）に実質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈されるべきである。したがって、本明細書において用いられる用語「から本質的になる」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されるべきでない。
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に加えられる用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」（および文法上の変形）は、列挙された配列（例えば、配列番号）、および、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が実質的に変更されないような、列挙された配列の５’および／または３’またはＮ末端および／またはＣ末端上または２つの末端の間（例えばドメイン間）の、合計で１０個以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸の、両方からなるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。合計で１０個以下のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸は、さらなるヌクレオチドまたはアミノ酸の合計数を合わせて含む。本発明のポリヌクレオチドに加えられる用語「実質的に変更される」は、列挙された配列からなるポリヌクレオチドの発現レベルと比較して少なくとも約５０％以上の、コードされるポリペプチドを発現する能力の増大または低減を指す。本発明のポリペプチドに加えられる用語「実質的に変更される」は、列挙された配列からなるポリペプチドの活性と比較して少なくとも約５０％以上の、生物学的活性の増大または低減を指す。
本明細書において用いられる用語「パルボウイルス」は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーを包含し、自律複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む。自律的パルボウイルスは、パルボウイルス、エリスロウイルス、デンソウイルス、イテラウイルス、および、コントラウイルス（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）属のメンバーを含む。例示的な自律的パルボウイルスは、限定されないが、マウスの微小ウイルス、ウシのパルボウイルス、イヌのパルボウイルス、ニワトリのパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコのパルボウイルス、ガチョウのパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、バリケンのパルボウイルス、ヘビのパルボウイルス、およびＢ１９ウイルスを含む。他の自律的パルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。
ディペンドウイルス属は、制限されないが、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、ＡＡＶタイプ１２、ＡＡＶタイプ１３、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含む、アデノ付随ウイルス（ＡＡＶ）を含む。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）；および表１を参照。
本発明の文脈における用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、制限されずに、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶ、ならびに、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤＮ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。複数のさらなるＡＡＶ血清型およびクレードが同定されており（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１－６３８８および表１を参照）、それらも用語「ＡＡＶ」によって包含される。
本発明のパルボウイルス粒子およびゲノムは、限定されないが、ＡＡＶ由来であってよい。様々な血清型のＡＡＶおよび自律的パルボウイルスのゲノム配列、ならびに、ネイティブＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は、当技術分野で知られている。かかる配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋのような公共データベースに見られ得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＡＹ６３１９６６、ＡＸ７５３２５０、ＥＵ２８５５６２、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２およびＡＹ５３０５７９を参照し；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列の教示のために本明細書中に参照により援用される。また、例えば、Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３９；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３０９；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３－：３７５－３８３；Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３０：３７５；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｖｉｒｏｌ．２２１：２０８；Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３３８５；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０９；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：８９１１；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４；国際特許公報ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；および、米国特許第６，１５６，３０３号も参照し；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列の教示のために本明細書中に参照により援用される。表１も参照。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３ ＩＴＲ配列の初期の説明は、Ｘｉａｏ，Ｘ．，（１９９６）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」Ｐｈ．Ｄ．学位論文、ピッツバーグ大学、ピッツバーグ、ペンシルバニア州によって提供される（その全体で本明細書中に援用される）。
「キメラ」ＡＡＶ核酸キャプシドコード配列またはＡＡＶキャプシドタンパク質は、２以上のキャプシド配列の部分を組み合わせたものである。「キメラ」ＡＡＶビリオンまたは粒子は、キメラＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。
本明細書において用いられる用語「向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）」は、特定の細胞または組織タイプ（単数または複数）へのベクター（例えば、ウイルスベクター）の優先的だが必ずしも排他的でない侵入および／または特定の細胞または組織タイプへの侵入を促進する細胞表面との優先的だが必ずしも排他的でない相互作用を指し、任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）、および好ましくは、細胞における、ベクター内容物（例えばウイルスゲノム）によって保有される配列の発現（例えば転写、翻訳であってもよい）、例えば、組み換えウイルスについては、異種ヌクレオチド配列（単数または複数）の発現が続く。当業者は、ウイルスゲノム由来の異種核酸配列の転写は、例えば、誘導性プロモーターまたは他の方法で調節される核酸配列に関するトランス作用因子が不存在では開始され得ないことを理解している。ｒＡＡＶゲノムの場合は、ウイルスゲノムからの遺伝子発現は、安定的に組み込まれたプロウイルス由来であってよく、および／または、組み込まれていないエピソーム、ならびに、ウイルス核酸が細胞内でとり得る任意の他の形態由来であってよい。
用語「向性プロファイル」は、１つまたは複数の標的細胞、組織および／または臓器の形質導入パターンを指す。キメラＡＡＶキャプシドの代表的な例は、末梢臓器の形質導入がほんの少しである中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞の効率的な形質導入によって特徴付けられる向性プロファイルを有する（例えば米国特許番号９，６３６，３７０（ＭｃＣｏｗｎら）、および米国特許公報２０１７／０３６０９６０（Ｇｒａｙら）を参照）。特異的な向性プロファイルを発現するベクター（例えば、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶキャプシド）は、それらの向性プロファイルについて「向性（ｔｒｏｐｉｃ）」、例えば、神経向性、肝臓向性などと呼ばれ得る。
本明細書において用いられる、ウイルスベクター（例えばＡＡＶベクター）による細胞の「形質導入」は、細胞内へのベクターの侵入およびウイルスベクター内への核酸の取り込みによる細胞内への遺伝物質の移行およびウイルスベクターを介した細胞内へのその後の移行を意味する。


Figure 2022542294000002
別段の指示がない限り、「効率的な形質導入」または「効率的な向性」または同様の用語は、適切なポジティブまたはネガティブコントロールに対する参照によって判定することができる（例えば、ポジティブコントロールの形質導入または向性の、それぞれ少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多い、または、ネガティブコントロールの形質導入または向性の、それぞれ少なくとも約１１０％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、５００％、１０００％またはそれよりも多い）。
同様に、適切なコントロールに対する参照によって、ウイルスが、標的組織に関して「効率的に形質導入しない」または「効率的な向性を有さない」（または同様の用語）か、判定することができる。特定の実施態様では、ウイルスベクターは、ＣＮＳ以外の組織、例えば、肝臓、腎臓、生殖腺および／または生殖細胞を効率的に形質導入しない（すなわち、効率的な向性を有さない）。特定の実施態様では、組織（単数または複数）（例えば、肝臓）の望ましくない形質導入は、望ましい標的組織（単数または複数）（例えば、ＣＮＳ細胞）の形質導入レベルの、２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下である。
用語「５’部分」および「３’部分」は、２以上のエレメント間の空間的関係を定義するための相対的用語である。したがって、例えば、ポリヌクレオチドの「３’部分」は、別のセグメントの下流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「３’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの３’末端にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの３’の半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。同様に、ポリヌクレオチドの「５’部分」は、別のセグメントの上流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「５’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの５’末端にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの５’の半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。
本明細書において用いられる用語「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「ヌクレオチド配列」は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然起源および非天然起源ヌクレオチドの両方を含む）であってよいが、好ましくは一本鎖または二本鎖ＤＮＡ配列のいずれかである。
用語「調節エレメント」は、核酸配列の発現のいくつかの態様を制御する遺伝因子を指す。例えば、プロモーターは、動作可能に連結されたコドン領域の転写の開始を促進する調節エレメントである。他の調節エレメントは、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルなどである。１つまたは複数の調節エレメントが見られる核酸配列またはポリヌクレオチド内の領域は、「調節領域」と呼ばれ得る。
ポリペプチドに適用される用語「フラグメント」は、参照ポリペプチドまたはアミノ酸配列と同一の連続アミノ酸のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、および／またはからなる、参照ポリペプチドまたはアミノ酸配列と比較して減少した長さのアミノ酸配列を意味することが理解される。一部の実施態様では、そのようなフラグメントは、本発明に係るポリペプチドまたはアミノ酸配列の少なくとも約４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００個、またはそれよりも多くの長さの連続するアミノ酸を有するペプチドを含むことができ、から本質的になることができ、および／または、からなることができる。一部の実施態様では、そのようなフラグメントは、本発明に係るポリペプチドまたはアミノ酸配列の約４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００個未満の長さの連続するアミノ酸を有するペプチドを含むことができ、から本質的になることができ、および／または、からなることができる。
本明細書において用いられる「機能性フラグメント」は、そのポリペプチドと通常関連する少なくとも１つの生物学的活性（例えば、抗体結合）を実質的に維持するものを指す。「機能性フラグメント」は、改変されていないポリペプチドが有する活性の全てを実質的に維持する。生物学的活性を「実質的に維持する」とは、ポリペプチドが、ネイティブのポリペプチドの生物学的活性の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも多くを維持する（および、ネイティブのポリペプチドよりも高い活性レベルを有することもできる）ことを意味する。「非機能性」ポリペプチドとは、そのポリペプチドと通常関連する検出可能な生物学的活性をほとんど示さないか、または本質的に示さないものを指す（例えば、せいぜい、ほんの僅かな量、例えば約１０％未満または実に５％）。抗体結合のような生物学的活性は、当技術分野でよく知られており本明細書中に記載されるアッセイを用いて測定することができる。
核酸に関して本明細書において用いられる用語「動作可能に連結される」とは、２以上の核酸の間の機能的な連結を指す。例えば、プロモーター配列は、プロモーター配列が異種核酸配列の転写を開始および／または仲介するという理由で、異種核酸配列に「動作可能に連結される」と説明され得る。一部の実施態様では、動作可能に連結された核酸配列は、連続しており、および／または、同一のリーディングフレーム内にある。
本明細書において用いられる用語「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば遺伝子）の部分を指し、ポリペプチドの転写を開始する開始スタート部位（すなわち、コザック配列）を含む。用語「コード領域」は、オープンリーディングフレームと相互交換可能に用いられ得る。
本明細書において用いられる用語「コドン最適化」は、コード配列（例えば、野生型配列、例えばプロテインＭに関するコード配列を含む）内に通常存在する１つまたは複数のコドンを、同一（同義）アミノ酸に関するコドンで置換することによって、発現を増大させるように最適化されている遺伝子コード配列を指す。この様式において、遺伝子によってコードされるタンパク質は同一であるが、根底となる遺伝子の核酸塩基配列または対応するｍＲＮＡは異なる。一部の実施態様では、最適化は、１つまたは複数のレアコドン（すなわち、特定の種由来の細胞において相対的に稀に生じるｔＲＮＡに関するコドン）を、翻訳の効率を改善するために、より頻繁に生じる同義コドンによって置換する。例えば、ヒトコドン最適化では、コード配列内の１つまたは複数のコドンは、同一アミノ酸に関してヒト細胞においてより頻繁に生じるコドンによって置換される。コドン最適化は、転写および／または翻訳の効率を改善し得る他のメカニズムを通して遺伝子発現を増大することもできる。ストラテジーは、制限されずに、合計ＧＣ含有量（すなわち、コード配列全体におけるグアニンおよびシトシンのパーセント）の増大、ＣｐＧ含有量（すなわち、コード配列におけるＣＧまたはＧＣジヌクレオチドの数）の低減、潜在的スプライスのドナーまたはアクセプター部位の除去、および／または、コザック配列のようなリボソームエントリーおよび／または開始部位の付加または除去を含む。望ましくは、コドン最適化遺伝子は、改善されたタンパク質発現を示し、例えば、それによってコードされるタンパク質は、他の点で同様の細胞において野生型遺伝子によって提供されるタンパク質の発現レベルと比較して、細胞において、検出可能により大きなレベルで発現される。コドン最適化はまた、インビトロまたはインビボで、内因性遺伝子および／または対応するｍＲＮＡからコドン最適化遺伝子および／または対応するｍＲＮＡを区別する能力を提供する。
本明細書において用いられる用語「配列同一性」は、当技術分野における標準的な意味を有する。当技術分野で知られているように、多くの異なるプログラムを用いて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが公知配列と配列同一性または類似性を有するかどうか同定することができる。配列同一性または類似性は、制限されないが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズムを含む当技術分野で知られている標準的な技術を用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の配列同一性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター化された実行によって、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４）により記載されるＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、好ましくはデフォルト設定を用いて、または調査によって、判定され得る。
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ・ペアワイズアライメントを用いて、関連のある配列のグループから複数の配列アライメントを作る。また、アライメントを作るために用いられるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１（１９８７）のプログレッシブ・アライメント法の簡易化を用いて；その方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１（１９８９）により記載される方法に似ている。
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３（１９９３）に記載の、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０（１９９６）；ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから取得されたものである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメーターを用いて、それらは好ましくは、デフォルト値に設定されている。パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の構成、および、目的の配列が検索されている特定のデータベースの構成に応じて、プログラム自体によって確立されるが；感度を増大させるために値を調節してよい。
さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９（１９９７）により報告されるｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴである。
アミノ酸配列同一性の値のパーセンテージは、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より長い」配列の残基の合計数で割って決定される。「より長い」配列は、並べられた領域内の実際の残基が最も多いものである（アライメントスコアを最大化するためにＷＵ－Ｂｌａｓｔ－２により導入されるギャップは無視する）。
同様の様式で、核酸配列同一性パーセントは、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチド内のヌクレオチドと同一である候補配列内のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。
アライメントは、並べられる配列内のギャップの導入を含んでよい。さらに、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチドよりも多いまたは少ないヌクレオチドを含む配列に関して、一実施態様では、配列同一性のパーセンテージは、ヌクレオチドの合計数に対する、同一のヌクレオチドの数に基づいて決定されることが理解される。したがって、例えば、本明細書に具体的に開示される配列よりも短い配列の配列同一性は、一実施態様では、より短い配列におけるヌクレオチドの数を用いて決定される。同一性のパーセントの計算においては、相対的重みづけは、配列バリエーション、例えば挿入、欠失、置換などの様々な出現に割り当てられない。
一実施態様では、同一性のみが正にスコアされて（＋１）、ギャップを含む全ての形態の配列バリエーションは「０」の値に割り当てられて、配列類似性計算に関して以下に記載される重みづけスケールまたはパラメーターの必要性を取り除く。配列同一性パーセントは、例えば、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より短い」配列の残基の合計数で割って、１００を掛けることにより、計算され得る。「より長い」配列は、並べられた領域内の実際の残基が最も多いものである。
本明細書において用いられる「単離された」核酸またはヌクレオチド配列（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素または核酸またはヌクレオチド配列と関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、核酸またはヌクレオチド配列を意味する。
同様に、「単離された」ポリペプチドは、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素またはポリペプチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、ポリペプチドを意味する。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に加えられる、本明細書において用いられる用語「改変された」は、１つまたは複数の欠失、付加、置換、またはそれらの任意の組み合わせに起因して、野生型配列とは異なる配列を指す。
本明細書において用いられる、ウイルスベクターを「単離する」（または文法上の同等物）によって、ウイルスベクターが、出発原料中の他の構成要素の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されることを意味する。
用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「の処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ）」（または文法上の同等の用語）によって、対象の状態の重症度を減少させること、または、少なくとも部分的に改善または改良すること、および／または、少なくとも１つの臨床症候を緩和、軽減または低減させること、および／または、症状の進行を遅延させることを意味する。
本明細書において用いられる用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｓ）」、または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（およびその文法上の同等物）は、疾患の発症を遅延または阻害することを意味する。その用語は、疾患の完全な消滅を必要とすることを意味せず、症状の発生率を減少させるため、または症状の発症を遅らせるための、任意のタイプの予防的処置を包含する。
本明細書において用いられる「処置効果的な（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」量は、対象に対して何らかの改善または利益を与えるのに十分な量である。別の言い方をすると、「処置効果的な」量は、対象における少なくとも１つの臨床症候の何らかの緩和、軽減、低減または安定化を提供する量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り治療的効果は完全または治癒的である必要はないことを理解している。
本明細書において用いられる「予防効果的な」量は、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症を予防および／または遅延させるのに十分な量、および／または、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症の重症度を、本発明の方法が存在しない場合に生じるであろうものと比較して減少および／または遅延させる量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り予防のレベルは完全である必要はないことを理解している。
ウイルスに関する、「異種ヌクレオチド配列」または「異種核酸」は、それぞれ、ウイルスにおいて天然起源でない配列または核酸である。一般に、異種核酸またはヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームおよび／または非翻訳ＲＮＡを含む。
「ベクター」は、外来遺伝物質を別の細胞（そこで複製および／または発現されることができる）へ運ぶためのビヒクルとして用いられる化合物を指す。外来核酸を含むクローニングベクターは、組み換えベクターと呼ばれる。核酸ベクターの例は、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、発現カセット、および人工染色体である。組み換えベクターは典型的に、複製起点、マルチクローニング部位、および選択可能マーカーを含む。核酸配列は典型的に、挿入物（組み換え核酸または導入遺伝子）およびベクターの「主鎖」として働くより大きな配列からなる。遺伝情報を別の細胞へ移行させるベクターの目的は典型的に、標的細胞において、挿入物を単離、増殖、または発現させることである。発現ベクター（発現構築物または発現カセット）は、標的細胞における外因性遺伝子の発現のためのものであり、一般に、外因性遺伝子／ＯＲＦの発現を駆動するプロモーター配列を有する。標的細胞へのベクターの挿入は、細菌および真核生物細胞については形質転換またはトランスフェクションと呼ばれるが、ウイルスベクターの挿入は、しばしば形質導入と呼ばれる。また、用語「ベクター」は一般に、外来遺伝物質を別の細胞、例えば制限されないが、形質転換される細胞またはナノ粒子へ運ぶ働きをするためのアイテムを説明するために用いられてもよい。
本明細書において用いられる用語「ベクター」、「ウイルスベクター」、「送達ベクター」（および同様の用語）は、特定の実施態様では、一般に、核酸送達ビヒクルとして機能するウイルス粒子を指し、ビリオン内にパッケージされたウイルス核酸（すなわち、ベクターゲノム）を含む。本発明に係るウイルスベクターは、本発明に係るキメラＡＡＶキャプシドを含み、ＡＡＶまたはｒＡＡＶゲノムまたは任意の他の核酸（ウイルス核酸を含む）をパッケージすることができる。あるいは、一部の文脈においては、用語「ベクター」、「ウイルスベクター」、「送達ベクター」（および同様の用語）は、ビリオンが不存在のベクターゲノム（例えば、ｖＤＮＡ）、および／または、キャプシドにつながれた、またはキャプシド内にパッケージされた分子を送達するための輸送体として作用するウイルスキャプシドを指すために用いられ得る。
本発明のウイルスベクターはさらに、国際特許公報ＷＯ０１／９２５５１に記載される二重パルボウイルス粒子であってよい（その開示は参照によりその全体で本明細書中に援用される）。したがって、一部の実施態様では、二本鎖（二重）ゲノムがパッケージされ得る。
「組み換えＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、少なくとも１つの逆位末端配列（例えば、１つ、２つ、または３つの逆位末端配列）および１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む、ＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは一般に、ウイルスを産生するためにシスで１４５塩基の末端反復（単数または複数）（ＴＲ（ｓ））を保持しているが、部分的または完全に合成の配列を含む改変ＡＡＶ ＴＲｓおよび非ＡＡＶ ＴＲｓも、この目的を果たすことができる。全ての他のウイルス配列は必ずしも必要でなく、トランスで供給されてよい（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。ｒＡＡＶベクターは、２つのＴＲ（例えば、ＡＡＶ ＴＲｓ）を含んでもよく、それらは一般に、異種ヌクレオチド配列（単数または複数）の５’および３’末端にあるが、それに連続している必要はない。ＴＲｓは、互いに同一または異なってよい。ベクターゲノムは、単一のＩＴＲをその３’または５’末端に含んでもよい。
用語「末端反復」または「ＴＲ」は、ヘアピン構造を形成して逆位末端配列（ＩＴＲ）として機能する（すなわち、複製、ウイルスパッケージング、インテグレーションおよび／またはプロウイルス・レスキューなどの所望の機能を仲介する）、任意のウイルス末端反復または合成配列を含む。ＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲまたは非ＡＡＶ ＴＲであってよい。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ－１９）のもののような非ＡＡＶ ＴＲ配列、または、ＳＶ４０複製起源として作用するＳＶ４０ヘアピンを、ＴＲとして用いることができ、それは、トランケーション、置換、欠失、挿入および／または付加によってさらに改変されてよい。さらに、ＴＲは、部分的または完全に合成の、例えば、米国特許番号５，４７８，７４５（Ｓａｍｕｌｓｋｉら）に記載の「ダブル－Ｄ配列」であってよい。
パルボウイルスゲノムは、回文構造の配列をその５’および３’両末端に有する。配列の回文構造の性質は、相補塩基対の間の水素結合の形成によって安定化されるヘアピン構造の形成を生じさせる。このヘアピン構造は、「Ｙ」または「Ｔ」形状をとると考えられている。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９＆７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。
「ＡＡＶ逆位末端反復」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、制限されないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む任意のＡＡＶ由来であってよい（例えば、表１を参照）。ＩＴＲが、例えば、複製、ウイルスパッケージング、インテグレーション、および／またはプロウイルス・レスキューなどの所望の機能を仲介する限り、ＡＡＶ ＩＴＲは、ネイティブのＩＴＲ配列を有する必要はない（例えば、ネイティブのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更されてよい）。
用語「ｒＡＡＶ粒子」および「ｒＡＡＶビリオン」は、本明細書において相互交換可能に用いられる。「ｒＡＡＶ粒子」または「ｒＡＡＶビリオン」は、ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたｒＡＡＶベクターゲノムを含む。
本発明のウイルスベクターはさらに、国際特許公報ＷＯ００／２８００４およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９に記載される「標的化」ウイルスベクター（例えば、方向付けられた向性を有する）および／または「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスのＩＴＲｓおよびウイルスのキャプシドが異なるパルボウイルス由来である）であってよい。
さらに、ウイルスキャプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む他の改変を含むことができる。
本明細書において用いられる用語「アミノ酸」は、任意の天然起源アミノ酸、それらの改変された形態、および合成アミノ酸を包含し、非天然起源アミノ酸を含む。
天然起源、左旋性（Ｌ－）アミノ酸を表２に示す。


Figure 2022542294000003
あるいは、アミノ酸は、改変されたアミノ酸残基（非限定的な例を表３に示す）であってよく、または、翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化または硫酸化）によって改変されたアミノ酸であってよい。


Figure 2022542294000004
さらに、非天然起源アミノ酸は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５－４９によって記載される「非天然」アミノ酸であってよい。これらの非天然アミノ酸は、目的分子をＡＡＶキャプシドタンパク質に化学的に連結させるために有利に用いることができる。
保存的アミノ酸置換は、当技術分野で知られている。特定の実施態様では、保存的アミノ酸置換は、以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；および／またはフェニルアラニン、チロシンの１つまたは複数における置換を含む。
用語「テンプレート」または「基質」は、本明細書において、パルボウイルスのウイルスＤＮＡを生産するために複製され得るポリヌクレオチド配列を指すために用いられる。ベクター生産の目的のために、テンプレートは、典型的に、制限されないが、プラスミド、ネイキッドＤＮＡベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＡＡＶ、バキュロウイルス、レトロウイルスベクターなど）を含む、より大きなヌクレオチド配列または構築物内に埋め込まれる。あるいは、テンプレートは、パッケージング細胞の染色体内に安定的に組み込まれ得る。
本明細書において用いられる、パルボウイルスまたはＡＡＶ「Ｒｅｐコード配列」は、ウイルス複製および新たなウイルス粒子の生産を仲介するパルボウイルスまたはＡＡＶの非構造的タンパク質をコードする核酸配列を示す。パルボウイルスおよびＡＡＶ複製遺伝子およびタンパク質は、例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９＆７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。
「Ｒｅｐコード配列」は、パルボウイルスまたはＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の全てをコードする必要はない。例えば、ＡＡＶに関しては、Ｒｅｐコード配列は、４つのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）の全てをコードする必要はなく、実際に、ＡＡＶ５は、スプライスされたＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質のみを発現すると考えられている。代表的な実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、少なくとも、ウイルスゲノム複製および新たなビリオン中へのパッケージングに必要な、複製タンパク質をコードする。Ｒｅｐコード配列は、一般に、少なくとも１つの大きなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８／６８）および１つの小さなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ５２／４０）をコードする。特定の実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質およびＡＡＶ Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。他の実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。さらに、さらなる実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２タンパク質、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質、または、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ４０タンパク質をコードする。
本明細書において用いられる用語「大きなＲｅｐタンパク質」は、Ｒｅｐ６８および／またはＲｅｐ７８を指す。特許請求の範囲に記載される発明の大きなＲｅｐタンパク質は、野生型または合成のいずれかであってよい。野生型の大きなＲｅｐタンパク質は、制限されないが、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１３を含む任意のパルボウイルスまたはＡＡＶ、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶ由来であってよい（例えば、表１を参照）。合成の大きなＲｅｐタンパク質は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更され得る。
当業者は、複製タンパク質は同一のポリヌクレオチドによってコードされる必要はないことをさらに理解する。例えば、ＭＶＭに関しては、ＮＳ－１およびＮＳ－２タンパク質（スプライス変異体）は、互いに独立に発現され得る。同様に、ＡＡＶに関しては、ｐ１９プロモーターは不活化され得て、大きなＲｅｐタンパク質（単数または複数）は１つのポリヌクレオチドから発現され得て、小さなＲｅｐタンパク質（単数または複数）は異なるポリヌクレオチドから発現され得る。しかしながら典型的に、単一の構築物から複製タンパク質を発現することがより便利である。一部のシステムでは、ウイルスプロモーター（例えば、ＡＡＶ ｐ１９プロモーター）は、細胞によって認識されなくてよく、したがって、別個の発現カセットから大きなＲｅｐタンパク質および小さなＲｅｐタンパク質を発現する必要がある。他の例では、大きなＲｅｐタンパク質および小さなＲｅｐタンパク質を、別個に、すなわち、別個の転写および／または翻訳制御エレメントの制御下で発現することが望ましくあり得る。例えば、小さなＲｅｐタンパク質に対する大きな方の比を低減させるように、大きなＲｅｐタンパク質の発現を制御することが望ましくあり得る。昆虫細胞の場合は、細胞に対する毒性を避けるために、大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８／６８）の発現を下方調節することが有利であり得る（例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５を参照）。
本明細書において用いられる、パルボウイルスまたはＡＡＶ「ｃａｐコード配列」は、機能性パルボウイルスまたはＡＡＶキャプシドを形成する構造タンパク質をコードする（すなわち、ＤＮＡをパッケージすること、および標的細胞に感染することができる）。典型的に、ｃａｐコード配列は、パルボウイルスまたはＡＡＶキャプシドサブユニットの全てをコードするが、機能性キャプシドが生産される限り、全てよりも少ないキャプシドサブユニットがコードされてよい。典型的に、必ずしもではないが、ｃａｐコード配列は、単一の核酸分子上に存在する。
自律的パルボウイルスおよびＡＡＶのキャプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤＮ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９＆７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）により詳細に記載される。
特性を「実質的に維持する」によって、特性（例えば、活性または他の測定可能な特徴）の少なくとも約７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％が維持されることを意味する。
抗体に結合するためのプロテインＭおよびその誘導体を使用する方法
本発明の一態様は、対象への異種薬剤の投与の際の中和抗体による異種薬剤の中和を阻害する方法に関し、有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を対象へ投与するステップを含み、それにより、異種薬剤の中和を阻害する。
本発明の別態様は、対象においてポリペプチドまたは機能性核酸を発現する方法に関し、（ａ）ポリペプチドまたは機能性核酸をコードする核酸送達ベクター、および（ｂ）有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を、対象へ投与するステップを含み、それにより、対象においてポリペプチドまたは機能性核酸を発現する。
本発明のさらなる一態様は、対象における遺伝子を編集する方法に関し、（ａ）遺伝子編集複合体、および（ｂ）有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を、対象へ投与するステップを含み、それにより、対象においてポリペプチドまたは機能性核酸を発現する。
本明細書において用いられる用語「異種薬剤」は、その薬剤が投与される対象において天然に見られない薬剤を指す。その用語はまた、対象において天然に見られる薬剤の組み換えまたは合成バージョンも含む。異種薬剤は、それに対する中和抗体が異種薬剤の投与前に対象内に存在するものであってよく、または、対象への投与の際に中和抗体を産生する可能性があるものであってよい。異種薬剤は、対象へ投与されたことが一度もないものであってよい。異種薬剤は、以前に対象へ投与されたことがあるものであってよい。
本明細書において用いられる用語「中和抗体」は、対象へ投与された後に、異種薬剤に特異的に結合して、異種薬剤の１つまたは複数の生物学的活性を阻害する抗体を指す。
一部の実施態様では、異種薬剤は、核酸送達ベクター、例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであってよい。一部の実施態様では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、またはアデノウイルスベクターである。一部の実施態様では、非ウイルスベクターは、プラスミド、リポソーム、荷電脂質、核酸タンパク質複合体、または生体高分子である。
一部の実施態様では、異種薬剤は、遺伝子編集複合体、例えばＣＲＩＳＰＲ複合体である。
一部の実施態様では、異種薬剤は、タンパク質または核酸である。一部の実施態様では、タンパク質は、酵素、調節タンパク質、または構造タンパク質、例えば、対象における欠失または欠陥タンパク質の代わりに用いることができるものである。一部の実施態様では、核酸は、機能性核酸、例えば、アンチセンス核酸または阻害性ＲＮＡである。
有効量のプロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、中和抗体による異種薬剤の阻害を少なくとも部分的にブロックする量である。一部の実施態様では、有効量のプロテインＭは、中和を少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、、９９．５％、または９９．９％阻害するのに十分な量である。一部の実施態様では、有効量のプロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、モル基準で約０．５：１～約８：１またはその中の任意の範囲、例えば、約０．５：１、１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、または８：１またはその中の任意の範囲の、対象における総免疫グロブリンに対するプロテインＭの比を生じさせるのに十分な量である。一部の実施態様では、比は、約０．５：１～約６：１、約０．５：１～約４：１、約０．５：１～約２．５：１、約０．５：１～約２：１、約１：１～約８：１、約１．５：１～約８：１、または約２：１～約８：１である。一実施態様では、比は、約１：１～約３：１、例えば、約２：１である。総免疫グロブリンは、総血清免疫グロブリンであってよい（例えばプロテインＭの全身投与について）。総免疫グロブリンは、局在化された流体または組織における合計レベルであってよい（例えば、眼、耳、肺、脳、筋肉、関節などへの特異的な送達について）。総免疫グロブリンは、当技術分野で知られている技術によって、例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する抗体を用いた血清に対するＥＬＩＳＡを行なうことによって、または免疫グロブリンに結合するプロテインＡまたはＧを用いることによって、測定され得る。さらに、マウスについては、それらの血清は５ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリンを含むことが知られている。ヒトにおける血清免疫グロブリンに関する正常範囲は８～１０ｍｇ／ｍｌである。インビボでの概算については、１０ｍｇ／ｍｌの最上位（ｈｉｇｈ ｅｎｄ）を用いて比を計算することができる。局所的な免疫グロブリン含有量は、組織重量（４０ｍＬの血清／１ｋｇ体重）、または特定の体液中のＩｇの濃度、および血液血清よりも少ない場合はその臓器内の体液容量（例えば、眼、脳脊髄液）に基づいて概算することができる。
プロテインＭは、中和抗体による異種薬剤の阻害をブロックするのに効果的であることが見いだされた任意のスケジュールによって対象へ投与され得る。一部の実施態様では、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、異種薬剤の投与前に、例えば、異種薬剤の投与の少なくとも約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、または５０分または少なくとも約１、２、３、４、５、６、１２、１８、または２４時間前に、対象へ投与される。一部の実施態様では、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、異種薬剤の投与と同時に対象へ投与される。本明細書において用いられる用語「同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）」は、組み合わせた効果を生じるのに十分に近い時間を意味する（すなわち、「同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）」とは、「一緒に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）」であってよく、または、短期間内に互いに前後して生じる２以上のイベントであってよい）。
一部の実施態様では、異種薬剤は、対象への投与の前にプロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体と組み合わされ、例えば、２つの構成要素は投与前に単一の組成物内に一緒に混合される。異種薬剤は、対象への投与の少なくとも約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、または５０分または少なくとも約１、２、３、４、５、６、１２、１８、または２４時間前に、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体と組み合わせてよい。他の実施態様では、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体および異種薬剤は、別個の組成物において投与される。
一部の実施態様では、異種薬剤および／またはプロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を、治療的または他の方法で有益な効果を与えるために対象へ１回よりも多く投与することが必要であり得る。プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、例えば、１回、２回、３回、４回またはそれよりも多くの回数、投与され得る。一部の実施態様では、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、異種薬剤が対象へ投与される都度、例えば、上述と同様の様式で、例えば、異種薬剤の前または現在（ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）に、対象へ投与される。異種薬剤の各投与に伴うプロテインＭの使用は、再投与の際にしばしば問題となる異種薬剤に対するＮＡｂの効果が存在（ｉｎｈａｂｉｔ）し得る。一部の実施態様では、同一のプロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体がその都度、投与される。他の実施態様では、異なるプロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体がその都度、投与される（例えば、以下にさらに説明されるような異なる改変されたプロテインＭ）。理論によって拘束されずに、各投与で異なるプロテインＭ誘導体を使用することは、同一タンパク質の再投与によって生じ得るプロテインＭに対する阻害抗体の効果を制限し得ると考えられる。また、飽和用量のプロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体の投与は、プロテインＭに対する任意の阻害抗体を打ち負かし、抗原認識を妨げると考えられる。
プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体が有利に抗体に非特異的に結合する能力は、抗体が抗原に結合するのを阻害することが有利な他の方法、例えば免疫抑制が望ましいか、または過剰抗体が存在する場合において用いられ得る。
本発明のさらなる一態様は、それを必要とする対象における自己免疫疾患を処置する方法に関し、治療的に有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を対象へ投与するステップを含み、それにより自己免疫疾患を処置する。
本明細書において用いられる用語「自己免疫疾患」は、自己免疫反応と関連する任意の障害を指す。例としては、限定されないが、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、過敏性腸症候群、過敏性腸症候群、ブドウ膜炎、インスリン依存性糖尿病、溶血性貧血、リウマチ熱、グッドパスチャー症候群、ギランバレー症候群、乾癬、甲状腺炎、グレーブス病、重症筋無力症、糸球体腎炎、および自己免疫性肝炎が含まれる。
本発明の別態様は、それを必要とする対象における過剰抗体と関連する障害を処置する方法に関し、治療的に有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を対象へ投与するステップを含み、それにより、過剰抗体と関連する障害を処置する。本明細書において用いられる用語「過剰抗体と関連する障害」は、障害の原因または少なくとも１つの症候が、血中または体内の他の場所における、平均よりも高い抗体レベルに起因する任意の障害を指す。例としては、限定されないが、多発性骨髄腫、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）、およびワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症が含まれる。また、その方法は、自己免疫性イベント、例えば、サイトカイン放出症候群または急性自己免疫性発作、例えば、突然発症する重度の自己免疫性血管炎を急速に止めるための全抗体の急性的なブロック、または、抗体が介在する免疫複合体の形成によって引き起こされる移植組織に対する損傷の防止に有用であり得る。
本発明の任意の方法に関して、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、効果的であることが見いだされた任意の投与経路によって対象へ投与され得る。最も適切な経路は、処置される対象および処置される障害または状態に依存する。一部の実施態様では、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えばエアロゾルを介して）、口腔（例えば舌下）、膣、髄腔内、眼球内、硝子体内、蝸牛内、経皮、内皮内、子宮内（または胚内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内［骨格筋、横隔膜および／または心筋への投与を含む］、胸膜内、脳内、および関節内）、局所（例えば、皮膚および粘膜表面（気道表面を含む）の両方、および経皮投与）、リンパ内など、ならびに直接的な組織または臓器注入（例えば、肝臓、眼、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳）から選択される経路によって対象へ投与される。
プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、対象内の任意の組織または臓器へ送達または標的化され得る。一部の実施態様では、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、例えば、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、肺、耳、および眼へ投与される。一部の実施態様では、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、病変組織または臓器、例えば腫瘍へ投与される。
一部の実施態様では、異種薬剤およびプロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、同一経路によって投与される。他の実施態様では、異種薬剤およびプロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、異なる経路によって投与され、例えば、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は静脈内に投与され、異種薬剤は標的組織または臓器へ局所的に投与される。
任意の上記方法は、抗体濃度を減少させるため、または対象における抗体機能を阻害するための、追加の処置を対象へ投与するステップをさらに含んでよい。追加の処置は、当技術分野で知られている任意の方法であってよく、限定されずに、血漿交換、ＩｄｅＳもしくはＩｄｅＺのような抗体消化酵素の投与、脾摘出術、免疫抑制剤薬物（例えば、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、ブデソニド、プレドニゾロン）、Ｊａｎｕｓキナーゼ阻害剤（例えば、トファシチニブ）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス、エベロリムス）、ＩＭＤＨ阻害剤（例えば、アザチオプリン、レフルノミド、ミコフェノール酸）、または生物製剤（例えば、アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イキセキズマブ、ナタリズマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、またはＢ細胞を阻害または破壊するために設計された処置（例えば、化学療法、免疫療法、放射線療法）の投与を含む。追加の処置は、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体の投与前、投与中、および／または投与後に投与されてよい、
プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体が有利に抗体に非特異的に結合する能力は、精製方法において用いられ得る。抗体の精製は、抗体のＦｃ領域に結合する薬剤に依拠することが多いが（例えばプロテインＡおよびプロテインＧ）、プロテインＭは、抗体の可変領域に非特異的に結合する。したがって、プロテインＭを用いて、Ｆｃ領域を含まない抗体フラグメントおよび抗体誘導体（例えば単鎖可変フラグメント）および抗体可変領域を取り込んだ他の分子を単離することができる。
したがって、本発明の一態様は、抗体軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む化合物を試料から単離する方法に関し、当該方法は、化合物を、固体支持体に付着された本発明の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントと接触させて、それから、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントから化合物を溶出させるステップを含む。一部の実施態様では、抗体軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。一部の実施態様では、抗体軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む化合物は、抗体誘導体、免疫グロブリン足場などである。本発明の改変されたプロテインＭまたはその機能性フラグメントは、増大した熱安定性のため、野生型プロテインＭよりも利点がある。このことは、プロテインＭを複数の精製に関して再利用可能にさせ、野生型プロテインＭであれば不安定化させる溶出条件の使用を可能にする。
当該方法は、親和性精製の分野でよく知られている技術を用いて行なわれ得る。固体支持体は、アフィニティークロマトグラフィーまたはバッチ精製に適切な任意の材料であってよい。適切な材料は、限定されないが、アガロース、ポリアクリルアミド、デキストラン、セルロース、多糖類、ニトロセルロース、シリカ、アルミナ、酸化アルミニウム、チタニア、酸化チタン、ジルコニア、スチレン、ポリビニルジフルオリドナイロン、スチレンおよびジビニルベンゼンの共重合体、ポリメタクリレートエステル、誘導体化アズラクトンポリマーもしくは共重合体、ガラス、またはセルロースを含む。一部の実施態様では、固体支持体は樹脂である。一部の実施態様では、固体支持体はビーズまたは粒子である。一部の実施態様では、固体支持体は、例えばプレート、バイアル、またはカラムの表面である。
接触させるステップは、任意の適切な方法により、例えば、化合物を含む試料をカラム内の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント上に通過させることにより、または、容器内またはプレートのウェル内で、化合物を含む組成物を、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントとインキュベートすることにより、行われ得る。接触させるステップは、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントに化合物が結合するのを可能にするのに十分な時間行われ得る。洗浄、遠心分離、または、試料内の他の構成要素からの改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントに結合した化合物の他の形態の分離の後に、化合物は、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントから溶出される。溶出は、当技術分野で知られている任意の方法、例えばイオン濃度、温度などの変化によって行なわれ得る。一実施態様では、溶出は、ｐＨ変化によって行なわれる。本発明の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントは有利に、野生型プロテインＭよりも広い範囲のｐＨにわたって安定である。このことは、化合物の溶出を可能にする、より低いｐＨにおいて、改変されたプロテインＭが安定なままであるのを可能にする。
一部の実施態様では、接触させるステップは、結合バッファー（例えば、中性ｐＨ）において行なわれ、溶出は、低ｐＨバッファー（例えば、０．１ＭグリシンｐＨ２～３．５または０．１Ｍ酢酸ｐＨ３．５～４．５）を用いて、中和バッファー（例えば、高イオン強度アルカリ性バッファー、例えば１Ｍリン酸または１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８～９））中へ行なわれる。
本発明のさらなる一態様は、上述の固体支持体に付着された改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントに関する。改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントは、当技術分野で知られている任意の手段、例えば共有結合によって、例えばリンカー分子を用いて、固体支持体に付着され得る。
プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体が有利に抗体に非特異的に結合する能力は、抗体またはそのフラグメントまたは誘導体に結合するステップを含む任意の免疫測定法において用いられ得る。
したがって、本発明の一態様は、免疫測定法を行なう方法に関し、その方法は、抗体軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む化合物に結合するために、本発明の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントを用いるステップを含む。
改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントは、任意の包括的または特異的な抗体結合分子、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、または二次抗体の代わりに用いることができる。改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントは、当技術分野でよく知られているように、例えば、放射性、化学発光、または酵素検出のために標識されてよい。
免疫測定法の例としては、限定されずに、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）アッセイ、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチアッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、免疫蛍光アッセイ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）アッセイ、免疫組織化学アッセイ、プロテインＡ免疫測定法、プロテインＧ免疫測定法、プロテインＬ免疫測定法、ビオチン／アビジンアッセイ、ビオチン／ストレプトアビジンアッセイ、免疫電気泳動アッセイ、沈殿／フロキュレーション反応、免疫ブロット（ウエスタンブロット；ドット／スロット・ブロット）；免疫拡散アッセイ；リポソーム免疫測定法、化学発光アッセイ、ライブラリースクリーニング、発現アレイ、免疫沈降、競合結合アッセイ、および免疫組織化学染色が含まれる。
プロテインＭおよびその誘導体
本発明の使用において用いられるプロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、抗体に結合するプロテインＭを産生する任意のマイコバクテリア種由来であり得る。一部の実施態様では、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、またはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ由来である。
一部の実施態様では、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／０１４８９７および米国公開番号２０１７／０３２０９２１に記載される任意のプロテインＭ配列であってよく、それらの全体で参照により本明細書中に援用される。一部の実施態様では、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（ＭＧ２８１、配列番号１）またはその機能性フラグメントまたは誘導体（例えば、配列番号３に示されるフラグメントまたはその誘導体）である。一部の実施態様では、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（ＭＰＮ４００、配列番号２３）またはその機能性フラグメントまたは誘導体（例えば、配列番号２４に示されるフラグメントまたはその誘導体）である。一部の実施態様では、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、プロテインＭフラグメントまたはフラグメントの誘導体、例えば、膜貫通ドメインを含まないフラグメントおよび／またはＣ末端を含まないフラグメントであり、例えば、機能性フラグメントは、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の約アミノ酸残基１７～５３７、３７～５５６、３７～４８２、３７～４６８、３７～４４２、７４～４６８、７４～４７９、７４～４８２、７４～４６８、７４～４４２、もしくは７４～５５６、または、別のプロテインＭ由来の相当する残基を含む、から本質的になる、またはからなる。挙げられたフラグメントのそれぞれの末端に適用される用語「約」は、末端残基の一方または両方が、小程度、例えば、列挙された残基のいずれか側の約５、４、３、または２アミノ酸によって、異なってよいことを意味する。別のプロテインＭ由来の相当する残基は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭと他のプロテインＭとの間で配列アライメントを行なうことによって当業者によって容易に決定され得る。例えば、図２７は、野生型Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭアミノ酸７４～４７９（配列番号３）およびＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭの相当するフラグメント（配列番号２４）の配列アライメントを示している。一部の実施態様では、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、Ｎ末端６－Ｈｉｓタグの後にトロンビン切断部位を有するプロテインＭの可溶型（配列番号１のアミノ酸残基３７～５５６）である配列番号２のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
本明細書において用いられる用語「誘導体」は、天然起源ポリペプチドに対する小さな改変によって、天然起源のプロテインＭまたはプロテインＭ機能性フラグメントとは異なるが、プロテインＭの生物学的活性を大いに維持しているポリペプチドを指すために用いられる。小さな改変は、限定されずに、１個または数個のアミノ酸側鎖の変更、１個または数個のアミノ酸の変更（欠失、挿入、および／または置換を含む）、１個または数個の原子の立体化学の変更（例えば、Ｄ－アミノ酸）、および、限定されないが以下を含む小さな誘導体化：メチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミテート化（ｐａｌｍｉｔａｔｉｏｎ）、アミド化、およびグリコシルホスファチジルイノシトールの付加を含む。本明細書において用いられる用語「実質的に維持する」は、天然起源ポリペプチドの活性（例えば、抗体結合）の少なくとも約２０％、例えば、約３０％、４０％、５０％またはそれよりも多くを維持する、ポリペプチドのフラグメント、誘導体、または他の変異体を指す。一部の実施態様では、プロテインＭまたはプロテインＭ機能性フラグメントの誘導体は、２０以下のアミノ酸残基の突然変異（任意の組み合わせでの欠失、挿入、および／または置換）、例えば、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２またはそれよりも少ない突然変異を含む。一部の実施態様では、プロテインＭ誘導体は、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭの配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列または別のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントの野生型配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施態様では、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、関連のあるポリペプチドのインビボでの生存を促進するために、ブロッキング薬剤のアミノ末端および／またはカルボキシル末端における付加によって、インビボ用途のために改変することができる。このことは、ペプチド末端がプロテアーゼによって分解される傾向にある状況において有用であり得る。そのようなブロッキング薬剤は、限定されずに、投与されるタンパク質のアミノおよび／またはカルボキシル末端残基に付着させることのできる、追加の関係があるまたは関係のないペプチド配列を含むことができる。これは、タンパク質の合成中に化学的に、または、平均的な技術の当業者に馴染みのある方法による組み換えＤＮＡ技術によって、行なうことができる。あるいは、ブロッキング薬剤、例えばピログルタミン酸または当技術分野で知られている他の分子を、アミノおよび／またはカルボキシル末端残基に付着させることができ、または、アミノ末端のアミノ基またはカルボキシル末端のカルボキシル基を異なる部分で置換することができる。同様に、タンパク質は、投与前に、薬学的に許容できる「担体」タンパク質に共有結合または非共有結合させることができる。
本発明の一態様では、プロテインＭ誘導体は、プロテインＭの熱安定性を増大又は少なくとも維持する突然変異を含んでいる改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントである。これらの改変されたプロテインＭ誘導体は、インビボ方法および野生型プロテインＭが変性し得る高温（例えば約３７℃）を必要とする他の方法における使用に関する適合性が高い。
一部の実施態様では、プロテインＭ誘導体は、野生型マイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントと比較して、マイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントの熱安定性を増加または維持する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を有する、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントである。一部の実施態様では、改変されたプロテインＭまたはその機能性フラグメントは、野生型プロテインＭまたはその機能性フラグメントのＴｍよりも少なくとも０．５℃、例えば、０．５℃、１．０℃、１．５℃、２．０℃、２．５℃、３．０℃、３．５℃、４．０℃、４．５℃、５．０℃、５．５℃、６．０℃、６．５℃、７．０℃、７．５℃、８．０℃、８．５℃、９．０℃、９．５℃、１０．０℃、１１．０℃、１２．０℃、１３．０℃、１４．０℃、１５．０℃、１６．０℃、１７．０℃、１８．０℃、１９．０℃、２０．０℃、またはそれよりも多く増大した融解温度（Ｔｍ）を有する。一部の実施態様では、改変されたプロテインＭまたはその機能性フラグメントは、野生型プロテインＭまたはその機能性フラグメントのＴｍと比較して維持されたＴｍを有する（すなわち０．５℃以内）。Ｔｍは、示差走査型蛍光透視法または任意の他の適切な技術によって測定され得る。野生型Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭのＴｍは約４１．９℃であり、野生型Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭのＴｍは約４４．１℃である。
一部の実施態様では、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個、またはそれよりも多くの突然変異を有してよい。一部の実施態様では、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２個、またはそれよりも少ない突然変異を有してよい。
一部の実施態様では、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍまたはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのプロテインＭに由来する。
一部の実施態様では、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントは、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭの残基約７４（例えば、残基６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９）～残基約４７９（例えば、残基４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４）のフラグメント（配列番号３）またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭの相当する残基（配列番号２４）である。
一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、熱安定性に影響を与えることが知られているプロテインＭの部分に位置している。一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、プロテインＭの生物学的活性における他の役割を有することが知られているプロテインＭのタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）には位置していない。一実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）のプロテインＭの抗体結合部位の５Å以内の残基（すなわち、残基９５、９９、１０２、１０３、１０５、１０６、１０７、１０９、１１０、１１４、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１４４、１５８、１６０、１６１、１６２、１６３、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８６、１８７、１８８、１９１、３２１、３３８、３４０、３４１、３４５、３８１、３８４、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、４２６、４２７、４２９、４３６、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５２、４５３、４５５、４５６、４５７、４６２、４６６）またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にはない。一実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）のプロテインＭの抗体結合部位の５Å以内の残基（すなわち、残基１００、１０４、１０７、１０８、１１０、１１１、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１４９、１６３、１６５、１６６、１６７、１６８、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１９２、１９３、１９６、３３７、３３８、３５４、３５６、３５７、３９９、４０２、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４４２、４４３、４４５、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６８、４６９、４７２、４７３、４７８）にはない。一実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の残基４６９～４７９のいずれかまたはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にはない。
本発明者らは、コンピューター分析を用いて、突然変異した場合にタンパク質のＴｍを増大または維持することが予測されるプロテインＭ内の残基を同定した。その結果、一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の、残基７８、８１、８３、８４、８５、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０８、１１１、１１２、１１３、１２２、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４２、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５３、１５４、１５５、１５６、１６４、１６７、１７０、１７５、１７６、１８４、１８５、１８９、１９２、１９３、１９６、１９８、２０１、２０２、２０４、２０５、２０６、２０７、２０９、２１１、２１５、２１８、２２０、２２４、２２５、２２６、２２７、２３１、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２４１、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４９、２５０、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６４、２６９、２７０、２７２、２７４、２７５、２７６、２７９、２８２、２８４、２８６、２８７、２８８、２９１、２９７、２９９、３００、３０２、３０３、３０４、３０５、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１３、３１７、３１８、３１９、３２０、３２２、３２６、３２７、３２９、３３１、３３２、３３３、３３５、３３７、３４２、３４３、３４７、３４８、３５１、３５４、３５５、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６７、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７８、３８５、３９９、４００、４０１、４０２、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１１、４１３、４１４、４１７、４１８、４１９、４２４、４２８、４３４、４３５、４４３、４５０、４５９、４６０、４６３、４６４、４６５、４６８、またはそれらの任意の組み合わせ、またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にある。一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、表４に挙げられた突然変異またはそれらの任意の組み合わせである。一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の残基８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０５、１０６、１０９、１１３、１１６、１１７、１１８、１２０、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６４、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９４、１９５、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５５、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、４００、４０１、４０３、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４４、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５９、４６６、４６７、４７０、４７１、４７４、４７５、４７６、４７７、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、またはそれらの任意の組み合わせにある。
一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の残基８３、９０、９２、９４、１３７、１４２、１４７、１５０、１５６、１８４、１９６、１９８、２０５、２１１、２１５、２２５、２３１、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２４３、２４５、２５０、２５５、２５６、２５９、２６４、２７２、２７４、２７５、２７６、２７９、２８２、２９７、３００、３０２、３１０、３２０、３２６、３３１、３３２、３３５、３４２、３４３、３４７、３４８、３５５、３５７、３６１、３７１、３７４、３７８、３８５、４０１、４０２、４０９、４１３、４２４、４６０、４６３、４６４、４６８、またはそれらの任意の組み合わせ、またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にある。一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、表５に挙げられた突然変異またはそれらの任意の組み合わせである。
本発明者らは、予測される残基リストからの非常に多くの突然変異を、単独で、または成功率の高い熱安定性増大（安定化突然変異）もしくは少なくとも熱安定性維持（中立突然変異）と組み合わせて、調製および試験した。試験された点突然変異の７９％が安定化または中立であったことを示している図２３を参照のこと。データはさらに、Ｔｍを増大させる点突然変異の組み合わせが、さらにより高いＴｍを有する改変されたプロテインＭを生じさせる傾向があることを示す（図１５Ａを参照）。
したがって、一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、単独または他の突然変異と組み合わせてＴｍを増大させることが示された残基にあり、例えば、１つまたは複数の突然変異は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の残基１５０、１９６、１９８、２０１、２０５、２２４、２３２、２３７、２７４、２８２、３４２、３５５、３７３、４００、４０２、４０７、４０９、４１３、１３５、もしくはそれらの任意の組み合わせ、またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にある。
一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、以下の残基または残基の組み合わせから選択される残基にある：
Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の、
ａ）２３７（ＭＧ１）；
ｂ）２３２（ＭＧ８）；
ｃ）２８２（ＭＧ１３）；
ｄ）１５０、１９６、１９８、４００、４０２、４０７、４０９（ＭＧ１５）；
ｅ）４１３、４３５（ＭＧ２１）；
ｆ）３７３、４００（ＭＧ２２）；
ｇ）４０２、４０７、４０９、４１３（ＭＧ２３）；
ｈ）３４２（ＭＧ２４）；
ｉ）１５０、１９６、１９８、２３２、２３７、２８２、３４２、３７３、４００、４０２、４０７、４０９、４１３、４３５（ＭＧ２７）；
ｊ）２７４（ＭＧ２８）；
ｋ）１５０、１９６、１９８、２３２、２３７、３４２、４００、４０２、４０７、４０９（ＭＧ２９）；
ｌ）３７３、４１３、４３５（ＭＧ３１）
ｍ）２０５（ＭＧ３３）；
ｎ）３５５（ＭＧ３８、ＭＧ４０）；
ｏ）１５０、１９６、１９８、３４２、３７３、４００、４０２、４０７、４０９（ＭＧ４３）；
ｐ）１５０、１９６、１９８、２３２、２３７、３４２、３７３、４００、４０２、４０７、４０９（ＭＧ４４）；
ｑ）２０１、２２４（ＭＧ４５）；
ｒ）１５０、１９６、１９８、２０１、２２４、２３２、２３７、３４２、４００、４０２、４０７、４０９（ＭＧ４６）；
ｓ）１５０、１９６、１９８、２３２、２３７、３４２、３９０、４００、４０２、４０７、４０９、４４４（ＭＧ４７）；
ｔ）１５０、１９６、１９８、２０１、２０５、２２４、２３２、２３７、２７４、３４２、３５５、４００、４０２、４０７、４０９（ＭＧ４８）；または
ｕ）１５０、１９６、１９８、２３２、２３７、３４２、３９１、４００、４０２、４０７、４０９（ＭＧ４９）
またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基。
一部の実施態様では、１つまたは突然変異は、以下から選択される：
Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の、
ａ）Ｆ２３７Ｔ（ＭＧ１）；
ｂ）Ｓ２３２Ｑ（ＭＧ８）；
ｃ）Ｑ２８２Ｄ（ＭＧ１３）；
ｄ）Ｓ１５０Ｅ、Ｓ１９６Ｒ、Ｓ１９８Ｐ、Ｖ４００Ｉ、Ｎ４０２Ｉ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ（ＭＧ１５）；
ｅ）Ｌ４１３Ｉ、Ｔ４３５Ｉ（ＭＧ２１）；
ｆ）Ｖ３７３Ｉ、Ｖ４００Ｉ（ＭＧ２２）；
ｇ）Ｎ４０２Ｌ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ、Ｌ４１３Ｉ（ＭＧ２３）；
ｈ）Ａ３４２Ｖ（ＭＧ２４）；
ｉ）Ｓ１５０Ｅ、Ｓ１９６Ｒ、Ｓ１９８Ｐ、Ｓ２３２Ｑ、Ｆ２３７Ｔ、Ｑ２８２Ｄ、Ａ３４２Ｖ、Ｖ３７３Ｉ、Ｖ４００Ｉ、Ｎ４０２Ｉ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ、Ｌ４１３Ｉ、Ｔ４３５Ｉ（ＭＧ２７）；
ｊ）Ｎ２７４Ｄ（ＭＧ２８）；
ｋ）Ｓ１５０Ｅ、Ｓ１９６Ｒ、Ｓ１９８Ｐ、Ｓ２３２Ｑ、Ｆ２３７Ｔ、Ａ３４２Ｖ、Ｖ４００Ｉ、Ｎ４０２Ｉ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ（ＭＧ２９）；
ｌ）Ｖ３７３Ｉ、Ｌ４１３Ｉ、Ｔ４３５Ｉ（ＭＧ３１）
ｍ）Ａ２０５Ｐ（ＭＧ３３）；
ｎ）Ｔ３５５Ｄ（ＭＧ３８）；
ｏ）Ｔ３５５Ｐ（ＭＧ４０）；
ｐ）Ｓ１５０Ｅ、Ｓ１９６Ｒ、Ｓ１９８Ｐ、Ａ３４２Ｖ、Ｖ３７３Ｉ、Ｖ４００Ｉ、Ｎ４０２Ｉ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ（ＭＧ４３）；
ｑ）１５０、１９６、１９８、２３２、２３７、３４２、３７３、４００、４０２、４０７、４０９（ＭＧ４４）；
ｒ）Ｓ２０１Ｃ、Ａ２２４Ｃ（ＭＧ４５）；
ｓ）Ｓ１５０Ｅ、Ｓ１９６Ｒ、Ｓ１９８Ｐ、Ｓ２０１Ｃ、Ａ２２４Ｃ、Ｓ２３２Ｑ、Ｆ２３７Ｔ、Ａ３４２Ｖ、Ｖ４００Ｉ、Ｎ４０２Ｉ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ（ＭＧ４６）
ｔ）Ｓ１５０Ｅ、Ｓ１９６Ｒ、Ｓ１９８Ｐ、Ｓ２３２Ｑ、Ｆ２３７Ｔ、Ａ３４２Ｖ、Ｆ３９０Ｅ、Ｖ４００Ｉ、Ｎ４０２Ｉ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ Ｙ４４４Ｋ（ＭＧ４７）；
ｕ）Ｓ１５０Ｅ、Ｓ１９６Ｒ、Ｓ１９８Ｐ、Ｓ２０１Ｃ、Ａ２０５Ｐ、Ａ２２４Ｃ、Ｓ２３２Ｑ、Ｆ２３７Ｔ、Ｎ２７４Ｄ、Ａ３４２Ｖ、Ｔ３５５Ｐ、Ｖ４００Ｉ、Ｎ４０２Ｉ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ（ＭＧ４８）；または
ｖ）Ｓ１５０Ｅ、Ｓ１９６Ｒ、Ｓ１９８Ｐ、Ｓ２３２Ｑ、Ｆ２３７Ｔ、Ａ３４２Ｖ、Ａ３９１Ｐ、Ｖ４００Ｉ、Ｎ４０２Ｉ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ（ＭＧ４９）
またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基。
一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、単独または他の突然変異と組み合わせて、Ｔｍを維持することが示された残基にあり、例えば、１つまたは複数の突然変異は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の残基１４７、１５０、１５６、２２５、２３２、２４５、２７２、２７６、２７７、２７９、３００、３１０、３５５、３７８、４６８、もしくはそれらの任意の組み合わせ、またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にある。
一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、以下の残基または残基の組み合わせから選択される残基にある：
Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の、
ａ）４６８（ＭＧ２）；
ｂ）１５０（ＭＧ４）；
ｃ）１４７（ＭＧ５）；
ｄ）２７２（ＭＧ１０）；
ｅ）３５５（ＭＧ１２）；
ｆ）２７６、２７７、２７９（ＭＧ１７）；
ｇ）３００（ＭＧ１８）；
ｈ）３７８（ＭＧ２０）；
ｉ）１５６（ＭＧ３２）；
ｊ）２３２（ＭＧ３４）；
ｋ）２４５（ＭＧ３５）；
ｌ）２７６（ＭＧ３６）
ｍ）２２５（ＭＧ４１）；または
ｎ）３１０（ＭＧ４２）
またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基。
一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、以下から選択される：
Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の、
ａ）Ｒ４６８Ｑ（ＭＧ２）；
ｂ）Ｓ１５０Ｅ（ＭＧ４）；
ｃ）Ｈ１４７Ｆ（ＭＧ５）；
ｄ）Ｓ２７２Ｇ（ＭＧ１０）；
ｅ）Ｔ３５５Ｇ（ＭＧ１２）；
ｆ）Ｓ２７６Ｅ、Ｑ２７７Ｌ、Ｎ２７９Ｒ（ＭＧ１７）；
ｇ）Ｎ３００Ｑ（ＭＧ１８）；
ｈ）Ｎ３７８Ｙ（ＭＧ２０）；
ｉ）Ｓ１５６Ｋ（ＭＧ３２）；
ｊ）Ｓ２３２Ｌ（ＭＧ３４）；
ｋ）Ａ２４５Ｑ（ＭＧ３５）；
ｌ）Ｓ２７６Ｄ（ＭＧ３６）
ｍ）Ｋ２２５Ｐ（ＭＧ４１）；または
ｎ）Ｖ３１０Ｅ（ＭＧ４２）
またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基。
一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の残基１５５、２０３、２４３、２４８、および３５８にある。
一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）のＡ１５５Ｅ、Ｋ２０３Ｒ、Ｈ２４３Ｔ、Ｖ２４８Ｑ、およびＡ３５８Ｖである。
改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントは、アミノ酸配列内の突然変異以外のさらなる改変を含んでよい。一部の実施態様では、プロテインＭ配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位、例えば、１、２、または３グリコシル化部位が除去される。３つのＮ－グリコシル化部位は、ＮＧｌｙｃＰｒｅｄサーバーを用いた配列および構造の両方の分析に基づき、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭにおいて予測される。これらは、Ｎ１７７、Ｎ２１３、およびＮ２７４を含む。２つのＯ－グリコシル化部位は、ＮｅｔＯＧｌｙｃ ４．０サーバーを用いた構造分析に基づきＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭにおいて予測される。これらはＴ１１０およびＴ２０６を含む。適切な突然変異は、限定されずに、Ｎ１７７Ｄ、Ｔ２１５Ｙ、Ｎ２７４Ｄ、Ｓ１１２Ｉ、およびＴ２０６Ｙを任意の組み合わせで含む。一部の実施態様では、１つまたは複数のグリコシル化部位が、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントに付加される。グリコシル化パターンの変更は、タンパク質の熱安定性を追加し得て、および／または、抗体認識をブロックすることによりタンパク質の免疫原性を変更させ得る。
発現および精製目的のために、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたは機能性フラグメントは、分泌ペプチドを、例えばＮ末端に含んでよく、それにより、発現されるタンパク質は、それが発現される細胞から分泌され得て、培養培地から回収され得る。適切な分泌ペプチドは、限定されずに、ヒト血清アルブミン由来のもの、インターロイキン－２、ＣＤ５、免疫グロブリンκ軽鎖、トリプシノーゲン、またはプロラクチン（哺乳類細胞について）、およびＳｅｃまたはＴａｔ（細菌細胞について）を含む。分泌ペプチドは、プロテインＭから、本発明の方法において用いられる前に除去されてよく、または除去されなくてよい。
一部の実施態様では、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたは機能性フラグメントは、タンパク質の１つまたは複数の生物学的機能または物理的特徴を変更する１つまたは複数のさらなる突然変異を含んでよい。一部の実施態様では、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたは機能性フラグメントは、抗体に関するタンパク質の親和性を変更する１つまたは複数のさらなる突然変異を含んでよい。本発明者らは、コンピューター分析を用いて、突然変異した場合に抗体に関するタンパク質の親和性を増大させることが予測されるプロテインＭ内の残基を同定した。その結果、一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の残基９５、１０２、１０３、１０６、１０７、１１４、１１６、１６０、１６１、１６２、１６３、１８１、１８６、３２１、３８１、３８４、３８９、３９０、３９１、３９６、３９７、４２６、４２９、４３６、４３８、４３９、４４１、４４２、４４７、４４８、４４９、４５２、４５３、４５５、４５６、４６２、または４６６、もしくはそれらの任意の組み合わせ、またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にある。一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、表６に挙げられた突然変異またはそれらの任意の組み合わせである。一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の残基１００、１０４、１０７、１０８、１１０、１１１、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１４９、１６３、１６５、１６６、１６７、１６８、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１９２、１９３、１９６、３３７、３３８、３５４、３５６、３５７、３９９、４０２、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４４２、４４３、４４５、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６８、４６９、４７２、４７３、４７８、もしくはそれらの任意の組み合わせにある。
一部の実施態様では、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたは機能性フラグメントは、タンパク質のｐＨ感受性を改変することにより抗体に関するタンパク質の親和性を変更する１つまたは複数のさらなる突然変異を含んでよい。本発明者らは、コンピューター分析を用いて、突然変異した場合にｐＨ感受性を改変することにより抗体に関する親和性を増大させることが予測されるプロテインＭ内の残基を同定した。これらの突然変異体は、溶出のためのｐＨ変化を用いる能力に起因して、抗体単離に特に有用であり得る。したがって、一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の残基９５、１０３、１１６、１８６、３２１、３８９、４２９、４４２、もしくは４６６、またはそれらの任意の組み合わせ、またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にある。一部の実施態様では、１つまたは複数の突然変異は、表７に挙げられた突然変異またはそれらの任意の組み合わせである。
一部の実施態様では、改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたは機能性フラグメントは、抗体に関する親和性を減少または除去する１つまたは複数のさらなる突然変異を含んでよい。例としては、限定されずに、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の残基３９０および４４４における突然変異、例えば、３９０ＥおよびＹ４４４Ｋ、またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基が含まれる。
本発明に係るプロテインＭタンパク質は、当技術分野でよく知られており本明細書中に記載される方法、例えば組み換え発現によって、生産および特徴付けられる。
本発明のさらなる態様は、本発明のプロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチドおよびプロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を産生するための発現カセットを提供する。
ポリヌクレオチドは、タンパク質の発現を助けるための調節エレメントに動作可能に連結されてよい。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、プロモーターに動作可能に連結される。プロモーターは、細菌プロモーター（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて動作可能）または哺乳類プロモーター（例えばヒトプロモーター）であってよい。
一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるタンパク質の発現を高めるためにコドン最適化されてよい。一実施態様では、ポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌における発現のためにコドン最適化される。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、ヒト細胞などの哺乳類細胞における発現のためにコドン最適化される。１つの例は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化された配列番号２６の配列、またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一の配列である。さらなる一実施態様では、ポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌およびヒト細胞などの哺乳類細胞の両方における発現のためにコドン最適化される。１つの例は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびヒト細胞の両方における発現のためにコドン最適化された配列番号２５の配列、またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一の配列である。
本発明の別態様は、本発明のポリヌクレオチドを含む、ベクター、例えば発現ベクターである。ベクターは、限定されずに、プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含む、当技術分野で知られている任意のタイプのベクターであってよい。ベクターは、例えば、細菌ベクター（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉベクター）または哺乳類細胞ベクター（例えば、ヒト細胞ベクター）であってよい。
本発明のさらなる一態様は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む細胞（例えば、単離された細胞、形質転換された細胞、組み換え細胞など）に関する。したがって、本発明の様々な実施態様は、ベクター（例えば、発現カセット）を含んでいる組み換え宿主細胞に関する。そのような細胞は、単離された細胞であり得る。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、細胞のゲノム内に安定的に取り込まれる。一部の実施態様では、細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、または、ヒト細胞などの哺乳類細胞であってよい。
本発明のさらなる一態様は、本発明の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または形質転換された細胞を含むキットに関する。キットは、本明細書中に記載される方法のうちの１つを行なうためのさらなる試薬を含んでよい。試薬は、適切なパッケージまたはコンテナー内に含まれてよい。さらなる試薬は、限定されずに、バッファー、標識、酵素、検出試薬などを含む。
キットが供給される場合、異なる構成要素が別個のコンテナー内にパッケージされて、使用の直前に混合されてよい。構成要素をそのように別個にパッケージすることは、活性成分の機能を失わずに長期保存を可能にし得る。キットには、指示材料が供給されてもよい。指示は、紙または別の基材上に印刷されてよく、および／または、電子可読媒体として供給されてよい。
異種薬剤
上述のように、異種薬剤は、異種薬剤の投与前に、それに対する中和抗体が対象内に存在するものであってよく、または、対象への投与の際に中和抗体が産生される可能性があるものであってよい。一部の実施態様では、異種薬剤は、核酸送達ベクター（例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター）、遺伝子編集複合体（例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体）、タンパク質、または核酸であってよい。
任意の目的の核酸配列（単数または複数）は、本発明の核酸送達ベクターにおいて送達され得る。目的の核酸は、治療的（例えば、医薬または獣医学用途）、免疫原性（例えばワクチンのため）、または診断ポリペプチドを含む、ポリペプチドをコードする核酸を含む。
治療的ポリペプチドは、限定されないが、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン（ミニ－およびマイクロ－ジストロフィンを含む（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１３０；米国特許公開番号２００３／０１７１３１；ＷＯ／２００８／０８８８９５、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３７１４－１３７１９（２０００）；およびＧｒｅｇｏｒｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：６５７－６４（２００８）を参照）、ミオスタチンプロペプチド、ホリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、抗－炎症性ポリペプチド、例えば、ＩｋａｐｐａＢドミナント突然変異体、サルコスパン、ユートロフィン（Ｔｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３４９）、ミニ－ユートロフィン、凝固因子（例えば、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子など）、エリスロポエチン、アンギオスタシン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α１－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、ペプチド成長因子、神経栄養因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１および２、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、神経栄養因子－３および－４、脳由来神経栄養因子、骨形態形成タンパク質［ＲＡＮＫＬおよびＶＥＧＦを含む］、グリア由来増殖因子、形質転換増殖因子－αおよび－βなど）、リソソーム酸α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼＡ、受容体（例えば、腫瘍壊死増殖因子α可溶性受容体）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ２型ノックダウンを生じさせる分子、例えば、トランケートされた構成的に活性のｂＡＲＫｃｔ、抗－炎症性因子、例えばＩＲＡＰ、抗－ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、およびモノクローナル抗体（単鎖モノクローナル抗体を含む；例示的なＭａｂはハーセプチン（登録商標）Ｍａｂである）を含む。他の例示的な異種核酸配列は、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、および腫瘍壊死因子）、がん療法において用いられる薬物に対して耐性を与えるタンパク質、腫瘍抑制依遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ－リガンド、およびそれを必要とする対象における治療的効果を有する任意の他のポリペプチドをコードする。パルボウイルスベクターはまた、モノクローナル抗体および抗体フラグメント、例えば、ミオスタチンに対して向けられる抗体または抗体フラグメントを送達するために用いることもできる（例えば、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５８４－５９０（２００５）を参照）。
ポリペプチドをコードする核酸配列は、レポーターポリペプチド（例えば酵素）をコードするものを含む。レポーターポリペプチドは当技術分野で知られており、限定されないが、グリーン蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。
あるいは、本発明の特定の実施態様では、核酸は、機能性核酸、すなわち、タンパク質に翻訳されずに機能する核酸、例えばアンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載）、スプライセオソームが介在するトランス－スプライシングを生じさせるＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号を参照）、遺伝子サイレンシングを仲介するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１を参照）、および他の非翻訳ＲＮＡ、例えば「ガイド」ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：４９２９；米国特許第５，８６９，２４８号（Ｙｕａｎら））などをコードしてよい。例示的な非翻訳ＲＮＡは、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を処置および／または予防するため、および／または、化学療法による損傷を防止するために心臓へ投与するため）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのため）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を処置および／または予防するため）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、心血管系疾患を処置するため、例えば、Ａｎｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：１３２－１４２（２００８）およびＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．２６：５１－５５（２００５）を参照）；ホスホランバン阻害またはドミナント－ネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅ（例えば心血管系疾患を処置するため、例えばＨｏｓｈｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８６４－８７１（２００２）を参照）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、てんかんのため）、サルコグリカンに対するＲＮＡｉ［例えば、α、β、γ］、ミオスタチン、ミオスタチンプロペプチド、ホリスタチン、またはアクチビンＩＩ型可溶性受容体に対するＲＮＡｉ、抗－炎症性ポリペプチドに対するＲＮＡｉ、例えば、ＩｋａｐｐａＢドミナント突然変異体、および、病原生物およびウイルスに対して向けられるＲＮＡｉ（例えば、肝炎Ｂウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒト乳頭腫ウイルスなど）を含む。
あるいは、本発明の特定の実施態様では、核酸は、タンパク質ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ－１）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、β２－アドレナリン受容体、β２－アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド－３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ２型ノックダウンを生じさせる分子、例えば、トランケートされた構成的に活性のｂＡＲＫｃｔ；カルサルシン（ｃａｌｓａｒｃｉｎ）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバン阻害またはドミナント－ネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅ、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓ、または骨形態形成タンパク質（ＢＮＰ２、７など、ＲＡＮＫＬおよび／またはＶＥＧＦを含む）をコードしてよい。
核酸送達ベクターは、宿主染色体上の遺伝子座とホモロジーを共有しておりそれと組み換える核酸を含んでもよい。この手法は、例えば、宿主細胞における遺伝的欠陥を修正するために使用することができる。
本発明はまた、例えばワクチン接種のための、免疫原性ポリペプチドを発現する核酸送達ベクターを提供する。核酸は、当技術分野で知られている任意の目的の免疫原をコードしてよく、制限されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、ＨＩＶまたはＳＩＶ ｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、がん抗原、細菌抗原、ウイルス抗原など由来の免疫原を含む。
ワクチンベクターとしてのパルボウイルスの使用は当技術分野で知られている（例えば、Ｍｉｙａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：８５０７；米国特許番号５，９１６，５６３（Ｙｏｕｎｇら）、米国特許番号５，９０５，０４０（Ｍａｚｚａｒａら）、米国特許番号５，８８２，６５２、米国特許番号５，８６３，５４１（Ｓａｍｕｌｓｋｉら）を参照）。抗原は、パルボウイルスキャプシド内に存在し得る。あるいは、抗原は、組み換えベクターゲノム内に導入された核酸によって発現され得る。本明細書中に記載および／または当技術分野で知られている任意の目的の免疫原は、核酸送達ベクターによって提供することができる。
免疫原性ポリペプチドは、制限されないが、微生物、細菌性、原生動物、寄生性、真菌および／またはウイルス性の感染および疾患を含む感染および／または疾患に対して、免疫応答を引き起こすおよび／または対象を保護するのに適切な任意のポリペプチドであることができる。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルソミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルス免疫原、例えばインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）表面タンパク質またはインフルエンザウイルス核タンパク質、またはウマインフルエンザウイルス免疫原）またはレンチウイルス免疫原（例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫原、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原、例えば、ＨＩＶまたはＳＩＶエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶまたはＳＩＶマトリックス／キャプシドタンパク質、およびＨＩＶまたはＳＩＶ ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子産物）であることができる。免疫原性ポリペプチドはまた、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルス免疫原、例えばラッサ熱ウイルスヌクレオカプシドタンパク質およびラッサ熱エンベロープ糖タンパク質）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアウイルス免疫原、例えばワクシニアＬ１またはＬ８遺伝子産物）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、エボラウイルス免疫原、またはマールブルグウイルス免疫原、例えばＮＰおよびＧＰ遺伝子産物）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣＨＦ、および／またはＳＦＳウイルス免疫原）、またはコロナウイルス免疫原（例えば、感染性ヒトコロナウイルス免疫原、例えばヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質、またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原、またはトリ伝染性気管支炎ウイルス免疫原）であることもできる。免疫原性ポリペプチドはさらに、ポリオ免疫原、ヘルペス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ免疫原）流行性耳下腺炎免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫原、ジフテリア毒素または他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）免疫原、および／または、現在当技術分野で知られている、または後に免疫原として同定される任意の他のワクチン免疫原であることもできる。
あるいは、免疫原性ポリペプチドは、任意の腫瘍またはがん細胞抗原であることができる。腫瘍またはがん抗原は、がん細胞の表面上に発現されてもよい。例示的ながんおよび腫瘍細胞抗原は、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１（１９９１））に記載されている。他の例示的ながんおよび腫瘍抗原は、限定されないが：ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ－１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤＫ－４、β－カテニン、ＭＵＭ－１、カスパーゼ－８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ－１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、メラノーマ腫瘍抗原（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４７；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３１２４）、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００ ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＣＥＡ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、Ｐ－１５、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９）；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許代４，９６８，６０３号）、ＣＡ１２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９－９、ＮＳＥ、ＤＵ－ＰＡＮ－２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ－１、ＣＡ７２－４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ－ｅｒｂＢ－２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ－ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ，（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３）；ムチン抗原（国際特許公開番号ＷＯ９０／０５１４２）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；乳頭腫ウイルス抗原；および／または、以下のがんと関連することが現在知られている、または後に発見される、抗原：メラノーマ、腺がん、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、膵がん、脳腫瘍および任意の他のがん、または、現在知られている、または後に同定される悪性状態（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１－９１を参照）を含む。
目的の核酸（単数または複数）は、適切な制御配列と動作可能に関連することができることが当業者によって理解されるであろう。例えば、異種核酸は、発現制御エレメント、例えば転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、および／またはエンハンサーなどと、動作可能に関連することができる。
当業者は、様々なプロモーター／エンハンサーエレメントを、所望のレベルおよび組織特異的発現に応じて用いることができることを理解している。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて、構成的または誘導性であることができる。プロモーター／エンハンサーは、ネイティブまたは外来であってよく、天然または合成の配列であることができる。外来とは、転写開始領域が導入される野生型宿主において、その転写開始領域が見られないことを意図する。
特定の実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、処置される標的細胞または対象にとってネイティブであることができる。代表的な実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、異種核酸配列にとってネイティブであることができる。プロモーター／エンハンサーエレメントは一般に、目的の標的細胞（単数または複数）内で機能するように選択される。さらに、特定の実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳類のプロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的または誘導性であってよい。
誘導性の発現制御エレメントは、核酸配列（単数または複数）の発現に対して調節を提供することが望ましい適用において典型的に有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または好適プロモーター／エンハンサーエレメントであってよく、筋肉特異的または好適（心筋、骨格筋および／または平滑筋特異的または好適を含む）、神経組織特異的または好適（脳特異的または好適を含む）、眼特異的または好適（網膜特異的および角膜特異的を含む）、肝臓特異的または好適、骨髄特異的または好適、膵臓特異的または好適、脾臓特異的または好適、および肺特異的または好適プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントを含む。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、限定されないが、Ｔｅｔ ｏｎ／ｏｆｆエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターを含む。
核酸配列（単数または複数）が、標的細胞において、転写されて、それから翻訳される実施態様では、特異的な開始シグナルが一般に、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために含まれる。これらの外因的な転写制御配列は、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含んでよく、天然および合成の両方の様々な起源であってよい。
核酸送達ベクターは、分裂細胞および非分裂細胞を含む広範な細胞へ核酸を送達するための手段を提供する。核酸送達ベクターは、例えばエクスビボでの遺伝子療法のために、目的の核酸を細胞にインビトロで送達するために用いることができる。核酸送達ベクターは、例えば、免疫原性または治療的ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを発現するために、それを必要とする対象へ核酸を送達する方法においてさらに有用である。この様式において、ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡは、対象においてインビボで生産され得る。対象はポリペプチドが不足しているため、そのポリペプチドを必要とし得る。さらに、対象におけるポリペプチドまたは機能性ＲＮＡの産生が何らかの有益な効果を与え得るため、当該方法が実施され得る。
核酸送達ベクターはまた、対象において目的のポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを産生するために用いることもできる（例えば、ポリペプチドを産生するため、または、例えばスクリーニング方法と組み合わせて対象に対する機能性核酸の効果を観察するため、バイオリアクターとして対象を用いる）。
一般に、本発明の核酸送達ベクターを用いて、治療的ポリペプチドまたは機能性核酸を送達することが有益である任意の病態を処置および／または予防するために、ポリペプチドまたは機能性核酸をコードする核酸を送達することができる。例示的な病態は、限定されないが：嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質）および肺の他の疾患、血友病Ａ（ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（ＩＸ因子）、サラセミア（β－グロビン）、貧血（エリスロポエチン）および他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（β－インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（リピートを除去するためのＲＮＡｉ）、筋萎縮性側索硬化症、てんかん（ガラニン、神経栄養因子）、および他の神経障害、がん（エンドスタチン、アンギオスタシン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ－リガンド、インターフェロンを含むサイトカイン；ＶＥＧＦまたは多剤耐性遺伝子産物に対するＲＮＡｉを含むＲＮＡｉ）、糖尿病（インスリン）、Ｄｕｃｈｅｎｎｅを含む筋ジストロフィー（ジストロフィン、ミニ－ジストロフィン、インスリン様増殖因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、α、β、γ］、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ、ミオスタチンプロペプチド、ホリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、抗－炎症性ポリペプチド、例えば、ＩｋａｐｐａＢドミナント突然変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミニ－ユートロフィン、エクソンスキッピングを誘導するジストロフィン遺伝子内のスプライス部位に対するＲＮＡｉ［例えば、ＷＯ／２００３／０９５６４７を参照］、エクソンスキッピングを誘導するＵ７ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス［例えば、ＷＯ／２００６／０２１７２４を参照］、および、ミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体フラグメント）およびＢｅｃｋｅｒ、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（α－Ｌ－イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠乏（アデノシンデアミナーゼ）、グリコーゲン蓄積症（例えば、ファブリ―病［α－ガラクトシダーゼ］およびポンぺ病［リソソーム酸α－グルコシダーゼ］）および他の代謝欠陥、先天性気腫（α１－アンチトリプシン）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ・サックス病（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ）、網膜変性疾患（および、眼および網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性症に関するＰＤＧＦ）、脳などの固形臓器の疾患（以下を含む：パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンギオスタシンおよび／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、グリア芽腫［エンドスタチン、アンギオスタシンおよび／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］）、肝臓、腎臓、心臓：鬱血性心不全または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を含む（例えば、以下を送達することによる：タンパク質ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ－１）、ｓｅｒｃａ２ａ、ジンクフィンガータンパク質（ホスホランバン遺伝子を調節する）、Ｂａｒｋｃｔ、β２－アドレナリン受容体、β２－アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド－３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ２型ノックダウンを生じさせる分子、例えば、トランケートされた構成的に活性のｂＡＲＫｃｔ；カルサルシン（ｃａｌｓａｒｃｉｎ）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバン阻害またはドミナント－ネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅなど）、関節炎（インスリン様増殖因子）、関節障害（インスリン様増殖因子１および／または２）、内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓを送達することによる）、心臓移植の生存率を改善する（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様増殖因子Ｉ）、腎臓欠陥（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（抗－炎症性因子、例えば、ＩＲＡＰおよびＴＮＦα可溶性受容体）、肝炎（α－インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠陥（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２およびＳＣＡ３を含む脳脊髄失調症、フェニールケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患などを含む。本発明はさらに、臓器移植後に、移植の成功を増大させるため、および／または、臓器移植の負の副作用を減少させるために、または、補助療法を、用いることができる（例えば、サイトカイン生産をブロックするための免疫抑制剤または阻害核酸を投与することにより）。別の例として、例えば、がん患者における骨折または外科的除去後に、骨形態形成タンパク質（ＢＮＰ２、７など、ＲＡＮＫＬおよび／またはＶＥＧＦを含む）を、骨の同種移植片とともに投与することができる。
遺伝子導入は、病態について理解して療法を提供するための実質的な潜在的用途を有している。血管遺伝子が既知でありクローニングされている複数の遺伝性疾患が存在する。一般に、上記病態は２つのクラス：一般に劣性遺伝性である、欠乏状態（通常は酵素）、および、調節または構造タンパク質が関与し得て、典型的に優勢遺伝性である、不均衡状態に分類される。欠乏状態の疾患については、遺伝子導入は、正常遺伝子を補充療法のために影響を受けた組織へ運ぶため、および、アンチセンス突然変異を用いて疾患に関する動物モデルを作製するために、用いることができる。不均衡病態については、遺伝子導入は、モデル系における病態を作製するために用いることができ、それから、病態に対抗する試みにおいて用いることができる。したがって、核酸送達ベクターは、遺伝子疾患の処置および／または予防を可能にする。
核酸送達ベクターはまた、インビトロまたはインビボで細胞に機能性核酸を提供するためにも用いられ得る。細胞における機能性核酸の発現は、例えば、細胞による特定の標的タンパク質の発現を減らすことができる。したがって、機能性核酸は、特定のタンパク質の発現を低減させるために、それを必要とする対象において投与することができる。
核酸送達ベクターは、診断およびスクリーニング方法における用途を見いだし、それにより、目的の核酸が、トランスジェニック動物モデルにおいて一時的または安定して発現される。
核酸送達ベクターはまた、当業者に明らかであるように、制限されないが、遺伝子ターゲッティング、クリアランス、転写、翻訳などを評価するためのプロトコルにおける使用を含む、様々な非治療的目的のために用いることもできる。核酸送達ベクターはまた、安全性（蔓延、毒性、免疫原性など）を評価する目的のために用いることもできる。そのようなデータは、例えば、臨床有効性の評価前の規制上の承認プロセスの一部として米国食品医薬品局によって考慮される。
さらなる一態様として、本発明の核酸送達ベクターは、対象における免疫応答を産生するために用いられ得る。この実施態様によれば、免疫原性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸送達ベクターを対象へ投与することができ、能動免疫応答が、免疫原性ポリペプチドに対して対象によって開始される。免疫原性ポリペプチドは上記に説明したとおりである。一部の実施態様では、防御免疫応答が引き起こされる。
あるいは、核酸送達ベクターは、エクスビボで細胞へ投与されてよく、変更された細胞が対象へ投与される。核酸を含む核酸送達ベクターが細胞内に導入されて、その細胞が対象へ投与されて、ここで、免疫原をコードする核酸が発現され得て、免疫原に対する対象における免疫応答を誘導する。特定の実施態様では、細胞は抗原提示細胞（例えば樹状細胞）である。
「能動免疫応答」または「能動免疫」は、免疫原と遭遇した後の、宿主組織および細胞の「関与によって特徴付けられる。それは、リンパ細網組織内の免疫担当細胞の分化および増殖を含み、抗体の合成もしくは細胞が介在する反応度の発達、または両方を生じさせる。」Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｂ．Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｉｎ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＢＡＳＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ １１７（Ｊｏｓｅｐｈ Ａ．Ｂｅｌｌａｎｔｉ ｅｄ．，１９８５）。別の言い方をすると、能動免疫応答は、感染またはワクチン接種によって免疫原に曝露された後に宿主によって開始される。能動免疫は、「能動的に免疫化された宿主から非免疫宿主への、予め形成された物質（抗体、伝達因子、胸腺移植組織（ｔｈｙｍｉｃ ｇｒａｆｔ）、インターロイキン－２）の移行」によって獲得される受動免疫と対比することができる。同文献（Ｉｄ．）
本明細書において用いられる「防御」免疫応答または「防御」免疫は、免疫応答が、疾患の発生を防止または減少させるという点で何らかの利益を対象に与えることを示す。あるいは、防御免疫応答または防御免疫は、疾患、特にがんまたは腫瘍の処置および／または予防において、（例えば、がんまたは腫瘍の形成を防止することにより、がんまたは腫瘍の回帰を生じさせることにより、および／または、転移を防止することにより、および／または、転移小結節の増殖を防止することにより）有用であり得る。防御効果は、処置の利益がその任意の不利な点に勝る限り、完全または部分的であってよい。
特定の実施態様では、核酸を含んでいる核酸送達ベクターまたは細胞を、以下に説明される免疫原的有効量で投与することができる。
核酸送達ベクターはまた、１つまたは複数のがん細胞抗原（または免疫学的に似ている分子）またはがん細胞に対して免疫応答を産生する任意の他の免疫原を発現する核酸送達ベクターの投与によって、がん免疫療法のために投与することもできる。説明すると、例えば、がんを有する患者を処置するため、および／または、がんが対象において発生するのを防止するために、がん細胞抗原をコードする核酸を含む核酸送達ベクターを投与することにより、免疫応答が対象においてがん細胞抗原に対して産生され得る。核酸送達ベクターは、本明細書中に記載のように、インビボで、またはエクスビボの方法を用いることにより、対象へ投与され得る。あるいは、がん抗原は、核酸送達ベクターの一部として発現され得る。
別の代替としては、当技術分野で知られている任意の他の治療的核酸（例えば、ＲＮＡｉ）またはポリペプチド（例えば、サイトカイン）を投与して、がんを処置および／または予防することができる。
本明細書において用いられる用語「がん」は、腫瘍形成がんを包含する。同様に、用語「がん性組織」は、腫瘍を包含する。「がん細胞抗原」は、腫瘍抗原を包含する。
用語「がん」は、当該分野におけるその理解された意味を有し、例えば、体の離れた部位へ広がる（すなわち、転移する）潜在性を有する細胞の無制御な増殖である。例示的ながんとしては、限定されないが、黒色腫、腺がん、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、膵がん、脳腫瘍および任意の他のがん、または、現在既知または後に同定される悪性状態が含まれる。代表的な実施態様では、本発明は、腫瘍形成がんを処置および／または予防する方法を提供する。
用語「腫瘍」はまた、例えば、多細胞生物内の未分化細胞の異常な塊として、当該分野において理解される。腫瘍は、悪性または良性であってよい。代表的な実施態様では、本明細書中に開示される方法は、悪性腫瘍を予防および処置するために用いられる。
用語「がんを処置する」、「がんの処置」および同等の用語により、がんの重症度が減少または少なくとも部分的に除去されること、および／または、疾患の進行が遅延および／または制御されること、および／または、疾患が安定することが意図される。特定の実施態様では、これらの用語は、がんの転移が防止または減少または少なくとも部分的に除去されること、および／または、転移小結節の増殖が防止または減少または少なくとも部分的に除去されることを示す。
用語「がんの予防」または「がんを予防する」および同等の用語により、当該方法が、がんの発症の発生率および／または重症度を少なくとも部分的に除去または減少および／または遅延させることが意図される。別の言い方をすると、対象におけるがんの発症は、可能性（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）または確率（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）が減少し、および／または遅延される。
特定の実施態様では、細胞が、がんを有する対象から取りされて、核酸送達ベクターと接触され得る。それから、改変された細胞が対象へ投与されて、それにより、がん細胞抗原に対する免疫応答が引き起こされる。この方法は、インビボで十分な免疫応答を開始することができない（すなわち、増強抗体を十分な量で産生することができない）免疫不全の対象で有利に用いることができる。
免疫応答は、免疫調節性サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、γ－インターフェロン、ω－インターフェロン、τ－インターフェロン、インターロイキン－１α、インターロイキン－１β、インターロイキン－２、インターロイキン－３、インターロイキン－４、インターロイキン５、インターロイキン－６、インターロイキン－７、インターロイキン－８、インターロイキン－９、インターロイキン－１０、インターロイキン－１１、インターロイキン１２、インターロイキン－１３、インターロイキン－１４、インターロイキン－１８、Ｂ細胞増殖因子、ＣＤ４０リガンド、腫瘍壊死因子－α、腫瘍壊死因子－β、単球走化性タンパク質－１、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、およびリンホトキシン）によって増強され得ることが当技術分野で知られている。したがって、免疫調節性サイトカイン（好ましくは、ＣＴＬ誘導性サイトカイン）が、ウイルスベクターとともに対象へ投与され得る。
サイトカインは、当技術分野で知られている任意の方法によって投与され得る。外因性のサイトカインが対象へ投与されてよく、またはあるいは、サイトカインをコードする核酸が適切なベクターを用いて対象へ送達されてよく、サイトカインがインビボで産生される。
対象、医薬製剤、および投与モード
本発明の方法は、獣医学および医療用途の両方での使用を見いだす。適切な対象は、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および哺乳類を含む。本明細書において用いられる用語「哺乳類」は、制限されないが、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類（例えば、サルおよびヒヒ）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、齧歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター等）などを含む。ヒト対象は、新生児、幼児、青少年、および成人を含む。任意に（Ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）、対象は、例えば、本明細書中に記載のものを含む障害を対象が有するまたはそのリスクがあると考えられ、または、本明細書中に記載のものを含むポリヌクレオチドの送達によって恩恵を受けるので、本発明の方法「を必要とする」。さらなる選択肢として、対象は、実験動物および／または疾患の動物モデルであってよい。好ましくは、対象はヒトである。
特定の実施態様では、異種薬剤およびプロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、対象の人生においてできるだけ早く、例えば、対象が疾患または障害であると診断されたらすぐに、それを必要とする対象へ投与される。一部の実施態様では、当該方法は、新生児対象に対して、例えば新生児スクリーニングによって疾患または障害が同定された後に行なわれる。一部の実施態様では、当該方法は、１０才よりも前、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０才よりも前の対象に対して行われる。一部の実施態様では、当該方法は、１０才よりも後の若年または成人対象に対して行われる。一部の実施態様では、当該方法は、子宮内の胎児に対して、例えば出生前スクリーニングによって疾患または障害が同定された後に行なわれる。一部の実施態様では、当該方法は、対象が疾患または障害と関連する症候を発症したらすぐに、対象に対して行われる。一部の実施態様では、当該方法は、対象が疾患または障害と関連する症候を発症する前に、例えば、疾患または障害を有している疑いがあり、又はそのように診断されるが症候を示し始めていない対象に対して行われる。
特定の実施態様では、本発明は、プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を、単独または異種薬剤と組み合わせて、薬学的に許容できる担体内に含む１つまたは複数の医薬組成物を提供し、他の薬用剤、医薬品、安定化剤、バッファー、担体、アジュバント、希釈剤などを含んでもよい。注入については、担体は典型的に液体である。他の投与方法については、担体は固体または液体のいずれかであってよい。吸入投与については、担体は吸入可能であり、固体または液体の微粒子形態であってもよい。
「薬学的に許容できる」によって、毒性または他の方法で望ましくないようなものでない材料を意味し、すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに対象に投与され得る。
本発明の一態様は、インビトロで、例えばエクスビボ方法の一部として、核酸を細胞へ移行させる方法である。異種薬剤（例えば、核酸送達ベクター、例えば、ウイルスベクター）は、適切な量で、例えば、特定の標的細胞に適切な標準的形質導入方法に従った感染多重度で、細胞へ導入され得る。投与すべきウイルスベクターの力価は、標的細胞のタイプおよび数、および特定のウイルスベクターによって変化し得て、過度の実験を伴わずに当業者によって決定され得る。代表的な実施態様では、少なくとも約１０３感染単位、より好ましくは少なくとも約１０５感染単位が細胞へ導入される。
核酸送達ベクターが導入される細胞（単数または複数）は任意のタイプであることができ、制限されないが、神経系細胞（末梢および中枢神経系の細胞、特に、脳細胞、例えばニューロンおよびオリゴデンドロサイトを含む）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、および角膜細胞を含む）、血管細胞（例えば、内皮細胞、内膜細胞）、上皮細胞（例えば、消化管および呼吸器上皮細胞）、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞および／または横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵臓細胞（膵島細胞を含む）、肝細胞、腎細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞などを含む。代表的な実施態様では、細胞は、任意の前駆細胞であることができる。さらなる可能性としては、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）であることができる。さらなる代替としては、細胞は、がんまたは腫瘍細胞であることができる。さらに、細胞は、上記に記載したような任意の起源の種由来であることができる。
核酸送達ベクターは、改変された細胞を対象へ投与する目的のために、インビトロで細胞内に導入することができる。特定の実施態様では、細胞が対象から取り出されて、核酸送達ベクターがその中に導入されて、それから、細胞が元の対象へ投与される。エクスビボでの操作のために細胞を対象から取り出して、その後に元の対象へ導入する方法は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照）。あるいは、核酸送達ベクターを、ドナー対象由来の細胞へ、培養細胞へ、または、任意の他の適切な起源由来の細胞へ導入することができ、細胞が、それを必要とする対象（すなわち、「レシピエント」対象）へ投与される。
エクスビボでの遺伝子送達に適切な細胞は上述のとおりである。対象へ投与する細胞の投薬量は、対象の年齢、状態および種類、細胞のタイプ、細胞によって発現される核酸、投与モードなどによって異なる。典型的に、少なくとも約１０２～約１０８細胞または少なくとも約１０３～約１０６細胞が、薬学的に許容できる担体において用量あたり投与される。特定の実施態様では、核酸送達ベクターを用いた細胞形質導入が、処置効果的または予防有効量で、製剤担体と組み合わせて対象へ投与される。
一部の実施態様では、核酸送達ベクターが細胞内に導入されて、細胞が対象へ投与されて、送達されたポリペプチドに対する免疫原性応答を引き起こすことができる（例えば、導入遺伝子として、またはキャプシド内に発現される）。典型的に、免疫原的有効量のポリペプチドを発現するある量の細胞が、薬学的に許容できる担体と組み合わせて投与される。「免疫原的有効量」は、医薬製剤が投与される対象において、ポリペプチドに対する能動免疫応答を起こすのに十分な、発現されるポリペプチドの量である。特定の実施態様では、投薬量は、防御免疫応答（上記に定義）を生じるのに十分である。与えられる防御の程度は、免疫原性ポリペプチドを投与する利益がその任意の不利な点に勝る限り、完全または永久である必要はない。
本発明のさらなる一態様は、異種薬剤（例えば、核酸送達ベクター）を対象へ投与する方法である。核酸送達ベクターの、それを必要とするヒト対象または動物への投与は、当技術分野で知られている任意の手段によることができる。核酸送達ベクターは、処置効果的または予防効果的な用量で、薬学的に許容できる担体において送達されてもよい。
核酸送達ベクターはさらに、免疫原性応答を引き起こすために投与することができる（例えば、ワクチンとして）。典型的に、本発明の免疫原性組成物は、免疫原的有効量の核酸送達ベクターを、薬学的に許容できる担体と組み合わせて含む。投薬量は、防御免疫応答（上記に定義）を生じるのに十分であってもよい。与えられる防御の程度は、免疫原性ポリペプチドを投与する利益がその任意の不利な点に勝る限り、完全または永久である必要はない。対象および免疫原は上述のとおりである。
対象へ投与される核酸送達ベクター（例えば、ウイルスベクター）の投薬量は、投与モード、処置および／または予防される疾患または状態、個々の対象の状態、特定の核酸送達ベクター、および送達される核酸などに依存し、ルーチンで決定することができる。治療的効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５形質導入単位の力価であり、約１０８～１０１３形質導入単位であってもよい。
特定の実施態様では、様々な間隔、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年などの期間にわたって、１回を超える投与（例えば、２回、３回、４回、またはそれよりも多くの投与）を用いて、所望のレベルの遺伝子発現が達成され得る。
例示的な投与モードには、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えばエアロゾルを介する）、口腔（例えば舌下）、膣、髄腔内、眼球内、経皮、内皮内、子宮内（または胚内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内［骨格筋、横隔膜および／または心筋への投与を含む］、胸膜内、脳内、および関節内）、局所（例えば、皮膚および粘膜表面（気道表面を含む）の両方、および経皮投与）、リンパ内など、ならびに直接的な組織または臓器注入（例えば、肝臓、眼、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳）が含まれる。
投与は、対象における任意の部位であることができ、限定されずに、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、および眼からなる群より選択される部位を含む。
投与は、腫瘍（例えば、腫瘍またはリンパ節内、またはその付近）に対するものであってもよい。任意の所定の場合における最も適切な経路は、処置および／または予防される症状の性質および重症度、ならびに、用いられる特定のベクターの性質に依存する。
本発明による骨格筋への投与は、制限されないが、四肢（例えば、上腕、前腕、上腿、および／または下腿）、背中、首、頭部（例えば、舌）、胸部、腹部、骨盤／会陰、および／または指における骨格筋への投与を含む。適切な骨格筋は、限定されないが、小指外転筋小指外転筋（手）、小指外転筋小指外転筋（足）、母指外転筋、第五中足骨外転筋、短母指外転筋、長母指外転筋、短内転筋、母趾内転、長内転筋、大内転筋、母指内転筋、肘筋、前斜角筋、膝関節筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、烏口腕筋、皺眉筋、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、二腹筋、背側骨間筋（手）、背側骨間筋（足）、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋、指伸筋、短指伸筋、長指伸筋、短母指伸筋、長母趾伸筋、示指伸筋、短母指伸筋、長母指伸筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小指屈筋（手）、短小指屈筋（足）、短趾屈筋、長趾屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋、長母指屈筋、前頭筋、腓腹筋、オトガイ舌骨筋、大殿筋、中殿筋、小殿筋、薄筋、頚腸肋筋、腰腸肋筋、胸腸肋筋、腸骨筋、下双子筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、棘間筋、横突間筋、外側翼突筋、外側直筋、広背筋、口角挙筋、眼窩下筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、長回旋筋、頭最長筋、頸最長筋、胸最長筋、頭長筋、頸長筋、虫様筋（手）、虫様筋（足）、咬筋、内側翼突筋、内側直筋、中斜角筋、多裂筋、顎舌骨筋、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉鎖筋、内閉鎖筋、後頭筋、肩甲舌骨筋、小指対立筋、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、掌側骨間筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第３腓骨筋、梨状筋、底側骨間筋、足底筋、広頸筋、膝窩筋、後斜角筋、方形回内筋、円回内筋、大腰筋、大腿方形筋、足底方形筋、前頭直筋、外側頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、縫工筋、最小斜角筋、半膜様筋、頭半棘筋、頚半棘筋、胸半棘筋、半腱様筋、前鋸筋、短回旋筋、ヒラメ筋、頭棘筋、頚棘筋、胸棘筋、頭板状筋、頚板状筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、茎突舌骨筋、鎖骨下筋、肩甲下筋、上双子筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋、大腿筋膜張筋、大円筋、小円筋、胸郭、甲状舌骨、前脛骨筋、後脛骨筋、僧帽筋、上腕三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋および小頬骨筋、ならびに当技術分野で知られている任意の他の適切な骨格筋を含む。
異種薬剤は、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流（足および／または腕の分離式四肢灌流であってもよい；例えばＡｒｒｕｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：３４５８－３４６４を参照）、および／または、直接的な筋肉内注入によって、骨格筋に送達することができる。特定の実施態様では、異種薬剤は、分離式四肢灌流であってもよい四肢灌流により（例えば、静脈内または関節内投与により）、対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを有する対象）の四肢（腕および／または足）へ投与される。本発明の実施態様では、異種薬剤は、「流体力学」技術を用いずに有利に投与することができる。従来技術ベクターの（例えば筋肉への）組織送達は、血管系内の圧力を増大させて薬剤が内皮細胞バリアを横切る能力を促進する流体力学技術（例えば、大容量での静脈内／静脈内投与）によってしばしば高められる。特定の実施態様では、異種薬剤は、大容量インフュージョンおよび／または脈管内圧の上昇（例えば正常の収縮期圧よりも高い、例えば、正常の収縮期圧よりも、脈管内圧が５％、１０％、１５％、２０％、２５％以下の増加）などの流体力学技術の不存在下で投与することができる。そのような方法は、浮腫、神経損傷および／またはコンパートメント症候群のような、流体力学技術と関連する副作用を減少または回避し得る。
心筋への投与は、左心房、右心房、左心室、右心室および／または隔膜への投与を含む。異種薬剤は、静脈内投与、動脈内投与、例えば、大動脈内投与、直接的な心臓注入（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室へ）、および／または冠動脈灌流によって、心筋へ送達され得る。
横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹膜内投与を含む任意の適切な方法によることができる。
平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹膜内投与を含む任意の適切な方法によることができる。一実施態様では、平滑筋内、平滑筋付近、および／または平滑筋上に存在する内皮細胞へ投与することができる。
標的組織への送達は、異種薬剤を含んでいるデポーを送達することによっても達成することができる。代表的な実施態様では、異種薬剤を含んでいるデポーが、骨格筋、平滑筋、心筋および／または横隔膜筋組織へ埋め込まれ、または、異種薬剤を含んでいるフィルムまたは他のマトリックスと組織を接触させることができる。そのような埋め込み可能なマトリックスまたは基材は、米国特許第７，２０１，８９８号に記載されている。
特定の実施態様では、異種薬剤は、骨格筋、横隔膜筋および／または心筋へ投与される（例えば、筋ジストロフィーまたは心疾患［例えば、ＰＡＤまたは鬱血性心不全］を処置および／または予防するため）。
代表的な実施態様では、本発明は、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋の障害を処置および／または予防するために用いられる。
代表的な実施態様では、本発明は、それを必要とする対象における筋ジストロフィーを処置および／または予防する方法を提供し、当該方法は、処置または予防有効量の異種薬剤を哺乳類の対象へ投与するステップを含み、ここで異種薬剤は、ジストロフィン、ミニ－ジストロフィン、マイクロ－ジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、ホリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、抗－炎症性ポリペプチド、例えばＩｋａｐｐａＢドミナント突然変異体、サルコスパン、ユートロフィン、マイクロ－ジストロフィン、ラミニン－α２、α－サルコグリカン、β－サルコグリカン、γ－サルコグリカン、δ－サルコグリカン、ＩＧＦ－１、ミオスタチンもしくはミオスタチンプロペプチドに対する抗体もしくは抗体フラグメント、および／または、ミオスタチンに対するＲＮＡｉをコードする核酸を含む。特定の実施態様では、異種薬剤は、本明細書中の他の場所で説明したように、骨格筋、横隔膜筋および／または心筋へ投与することができる。
あるいは、血中または他の組織への全身性送達のために通常循環するポリペプチド（例えば、酵素）または機能性核酸（例えば、機能性ＲＮＡ、例えば、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の産生のためのプラットフォームとして用いられる骨格筋、心筋または横隔膜筋へ核酸を送達するために本発明を実施して、障害を処置および／または予防することができる（例えば代謝障害、例えば糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、ＩＸ因子またはＶＩＩＩ因子）、ムコ多糖障害（例えば、スライ症候群、ハーラー症候群、シャイエ症候群、ハーラー－シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、Ｍａｒｏｔｅａｕｘ－Ｌａｍｙ症候群など）またはリソソーム蓄積症（例えばゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］、ポンぺ病［リソソーム酸α－グルコシダーゼ］またはファブリ―病［α－ガラクトシダーゼＡ］）または糖原病（例えばポンぺ病［リソソーム酸αグルコシダーゼ］）。代謝障害を処置および／または予防するための他の適切なタンパク質は上述のとおりである。目的の核酸を発現するためのプラットフォームとしての筋肉の使用は、米国特許公開番号２００２／０１９２１８９に記載されている。
したがって、一態様として、本発明は、それを必要とする対象における代謝障害を処置および／または予防する方法をさらに包含し、当該方法は、処理または予防有効量の異種薬剤を対象へ（例えば、対象の骨格筋へ）投与するステップを含み、ここで異種薬剤は、ポリペプチドをコードする核酸を含み、ここで代謝障害は、ポリペプチドの欠乏および／または欠陥の結果である。例示的な代謝障害およびポリペプチドをコードする核酸は本明細書中に記載されている。ポリペプチドは分泌されてもよい（例えば、その本来の状態で、分泌されるポリペプチドであるポリペプチド、または、例えば、当技術分野で知られている分泌型シグナル配列との動作可能な関連性によって、分泌されるように改変されているポリペプチド）。本発明のいかなる特定の理論にも制限されずに、本実施態様によれば、骨格筋への投与は、体循環へのポリペプチドの分泌および標的組織（単数または複数）への送達をもたらすことができる。異種薬剤を骨格筋へ送達する方法は、本明細書中により詳細に記載されている。
また、本発明を実施して、全身性送達のためにアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉまたは他の機能性ＲＮＡ（例えば、リボザイム）を産生することもできる。
本発明はまた、それを必要とする対象における先天性心不全またはＰＡＤを処置および／または予防する方法を提供し、当該方法は、処置または予防有効量の本発明の異種薬剤を哺乳類の対象へ投与するステップを含み、ここで異種薬剤は、例えば、筋小胞体（ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｎｄｏｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、血管新生因子、ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ－１）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバン阻害またはドミナント－ネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、β２－アドレナリン受容体、β２－アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ＰＩ３キナーゼ、カルサルカン（ｃａｌｓａｒｃａｎ）、β－アドレナリン受容体キナーゼ阻害剤（βＡＲＫｃｔ）、タンパク質ホスファターゼ１の阻害剤１、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ２型ノックダウンを生じさせる分子、例えば、トランケートされた構成的に活性のｂＡＲＫｃｔ、Ｐｉｍ－１、ＰＧＣ－１α、ＳＯＤ－１、ＳＯＤ－２、ＥＣ－ＳＯＤ、カリクレイン、ＨＩＦ、チモシン－β４、ｍｉｒ－１、ｍｉｒ－１３３、ｍｉｒ－２０６および／またはｍｉｒ－２０８をコードする核酸を含む。
注入剤は、液体の溶液または懸濁液、注入前の液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態、またはエマルションとして、従来の形態で調製することができる。あるいは、全身ではなく局所的な様式で、例えばデポーまたは徐放性製剤において、異種薬剤を投与してよい。さらに、異種薬剤は、外科的に埋め込み可能なマトリックスに付着させて送達することができる（例えば、米国特許公開番号２００４－００１３６４５に記載される）。
本明細書中に開示される異種薬剤は、任意の適切な手段によって、対象の肺へ投与することができる（対象が吸入する異種薬剤からなる呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液の投与であってもよい）。呼吸用粒子は、液体または固体であってよい。異種薬剤を含んでいる液体粒子のエアロゾルは、当業者に公知のように、任意の適切な手段によって、例えば、圧力駆動型のエアロゾル噴霧器または超音波噴霧器を用いて産生され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照。異種薬剤を含んでいる固体粒子のエアロゾルは、調剤分野で公知の技術により、任意の固体微粒子薬物エアロゾル発生器を用いて同様に産生され得る。
異種薬剤は、ＣＮＳの組織（例えば、脳、眼）へ投与することができ、本発明が存在しない場合に観察されるものよりも広範な分配の異種薬剤を有利にもたらし得る。
特定の実施態様では、異種薬剤は、遺伝性障害、神経変性障害、精神障害および腫瘍を含むＣＮＳの疾患を処置するために投与され得る。ＣＮＳの例示的な疾患は、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥレット症候群、原発性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊髄または頭部の傷害に起因する外傷、テイ・サックス病、Ｌｅｓｃｈ－Ｎｙａｎ疾患、てんかん、脳梗塞、気分障害を含む精神障害（例えば、鬱病、双極性感情障害、持続的な情動障害、二次気分障害）、神経分裂症、薬物依存症（例えば、アルコール中毒および他の物質依存症）、ノイローゼ（例えば、不安、強迫観念的（ｏｂｓｅｓｓｉｏｎａｌ）障害、身体表現性障害、解離性障害、悲嘆、産後鬱病）、精神病（例えば、幻覚および妄想）、認知症、偏執病、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛性障害、摂食または体重障害（例えば、肥満、カヘキシー、神経性食欲不振、および過食症）ならびにＣＮＳのがんおよび腫瘍（例えば、下垂体腫瘍）を含む。
ＣＮＳの障害は、網膜、後方路（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｔｒａｃｔ）、および視神経が関与する眼の障害（例えば、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症および他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢黄斑変性、緑内障）を含む。
すべてではないとしても大部分の眼の疾患および障害は、３つのタイプの示度：（１）血管新生、（２）炎症、および（３）変性の、１つまたは複数と関連する。本発明の異種薬剤を用いて、抗－血管新生因子；抗－炎症性因子；細胞変性を遅延させ、細胞温存（ｓｐａｒｉｎｇ）を促進し、または、細胞増殖を促進する因子、および前述の組み合わせを送達することができる。
糖尿病性網膜症は、例えば、血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、１つまたは複数の抗－血管新生因子を、眼内（例えば硝子体内）または眼周囲（ｐｅｒｉｏｃｕｌａｒｌｙ）（例えば、テノン下（ｓｕｂ－Ｔｅｎｏｎ’ｓ）領域）に送達することによって処置され得る。１つまたは複数の神経栄養因子を、眼内（例えば硝子体内（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌｌｙ））または眼周囲に、共送達してもよい。
ブドウ膜炎は炎症を含む。１つまたは複数の抗－炎症性因子が、本発明の送達ベクターの眼球内（例えば、硝子体または前房）投与によって投与され得る。
網膜色素変性症は、比較によって、網膜変性によって特徴づけられる。代表的な実施態様では、網膜色素変性症は、１つまたは複数の神経栄養因子をコードする異種薬剤の眼球内（例えば、硝子体投与）によって処置され得る。
加齢黄斑変性は、血管新生および網膜変性の両方を含む。この障害は、１つまたは複数の神経栄養因子をコードする異種薬剤を眼内（例えば、硝子体）に、および／または、１つまたは複数の抗－血管新生因子を眼内または眼周囲（例えば、テノン下領域）に、投与することによって処置され得る。
緑内障は、眼圧の増大および網膜神経節細胞の喪失によって特徴付けられる。緑内障のための処置は、異種薬剤を用いて、興奮毒性ダメージから細胞を保護する１つまたは複数の神経保護剤を投与するステップを含む。かかる薬剤は、眼内（硝子体内であってもよい）に送達されるＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）拮抗薬、サイトカイン、および神経栄養因子を含む。
他の実施態様では、本発明を用いて、発作を処置、例えば、発作の発症、発生率または重症度を減少させ得る。発作のための治療的な処置の効能は、行動的手段（例えば、眼または口の震え、チック（ｔｉｃｋｓ））および／または電気記録手段（ほとんどの発作は、署名電気記録的（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｅｌｅｃｔｒｏｇｒａｐｈｉｃ）異常を有する）によって評価され得る。したがって、本発明は、経時的な複数の発作を特徴とするてんかんを処置するためにも用いられ得る。
１つの代表的な実施態様では、ソマトスタチン（またはその活性フラグメント）を、本発明の異種薬剤を用いて脳へ投与して下垂体腫瘍を処置する。この実施態様によれば、ソマトスタチン（またはその活性フラグメント）をコードする異種薬剤は、微量注入によって下垂体へ投与される。同様に、かかる処置を用いて、先端巨大症（下垂体からの異常な成長ホルモン分泌）を処置することができる。ソマトスタチンの核酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＪ００３０６）およびアミノ酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＰ０１１６６；プロセッシングされた活性ペプチドソマトスタチン－２８およびソマトスタチン－１４を含む）配列は、当技術分野で知られている。
特定の実施態様では、異種薬剤は、米国特許第７，０７１，１７２号に記載の分泌型シグナルを含むことができる。
本発明の代表的な実施態様では、異種薬剤は、ＣＮＳ（例えば、脳または眼）へ投与される。異種薬剤は、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、大脳、以下を含む：後頭、側頭、頭頂および前頭葉．皮質、基底核、海馬および扁桃体（ｐｏｒｔａａｍｙｇｄａｌａ））、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、および下丘へ導入され得る。異種薬剤はまた、眼の異なる領域、例えば網膜、角膜および／または視神経へ投与され得る。
異種薬剤は、異種薬剤のより分散した投与のために、脳脊髄液へ（例えば腰椎穿刺によって）送達され得る。異種薬剤はさらに、血液脳関門が撹乱した状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）において、ＣＮＳへ血管内投与され得る。
異種薬剤は、制限されないが、髄腔内、眼内、脳内、心室内、静脈内（例えばマンニトールなどの糖存在下で）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）および眼周囲（例えば、テノン下領域）送達、ならびに、運動ニューロンへの逆行性（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ）送達による筋肉内送達を含む、当技術分野で知られている任意の経路によって、ＣＮＳの所望の領域（単数または複数）へ投与することができる。
特定の実施態様では、異種薬剤は、液体製剤において、直接注入（例えば定位的注入）によって、ＣＮＳ内の所望の領域または区画へ投与される。他の実施態様では、異種薬剤は、所望の領域への局所適用によって、またはエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の局所適用によるものであってよい。さらなる代替としては、異種薬剤は、固体の徐放製剤として投与され得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照）。
さらなる実施態様では、異種薬剤を逆行性輸送のために用いて、運動ニューロンが関与する疾患および障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）など）を処置および／または予防することができる。例えば、異種薬剤を筋組織へ送達することができ、そこからニューロンへと移行することができる。
プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、異種薬剤に関して上述した任意の経路またはスケジュールによって投与され得る。プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体は、異種薬剤とは異なる経路またはスケジュールによって投与され得る。
本発明を説明したので、同様のことを、以下の実施例においてより詳細に説明するが、それらは例示目的だけのために本明細書中に含まれており、本発明に対する限定を意図しない。
実施例１：方法
ＡＡＶウイルス産生：ＡＡＶベクターを、ＨＥＫ２９３細胞における３プラスミドトランスフェクションによる標準的な手法を用いて生産した。簡潔には、ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドｐＴＲ－ＣＢＡ－Ｌｕｃを、ＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐヘルパープラスミド（ｐＸＲ２またはｐＸＲ８）およびアデノウイルスヘルパープラスミドｐＸＸ６－８０で共トランスフェクトした。７２時間後、細胞培養物を回収して、凍結融解および超音波処理によって溶解させた。浄化した細胞溶解物をＤＮＡｓｅ処理して、１５％／２５％／４０％／６０％イオジキサノールステップ勾配中で超遠心分離して、陰イオン交換Ｑ－カラムによって精製した。精製されたＡＡＶベクターを、パッケージされたＡＡＶ導入遺伝子のセグメントを増幅することを目的とするプライマーを用いたｑＰＣＲによって滴定した。
タンパク質産生：プロテインＭ（膜貫通ドメインが欠失しているトランケートされたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭＧ２８１（アミノ酸７４～４７９））をコードしておりＮ末端Ｈｉｓ－Ｔａｇおよびトロンビン切断部位を有するプラスミドｐＥＴ－２８ｂ（＋）は、Ｒａｊｅｓｈによって提供された。プラスミドをエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞中で増殖させて、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｍａｘｉ－Ｐｒｅｐキットを用いて精製した。ｐＥＴ－２８ｂ（＋）プラスミドを、一晩のスターター培養を用いてＢＬ２１／ＤＥ３細胞内に一時的にトランスフェクトした。自己誘導培地（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＭａｇｉｃ培地）にスターター培養物を播種して、１Ｌ～４Ｌ培養容量で、１８℃で３日間増殖させた。それから、培養物を遠心分離によってペレット化して、－８０℃で凍結させた。
タンパク質精製：凍結した細菌細胞培養物ペレットを解凍して、超音波処理によって溶解させて、ＤＮＡｓｅ処理して、遠心分離によって浄化した。浄化した細菌溶解物をニッケル結合バッファー（２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム）中ヘ透析して、ＦＰＬＣを用いてニッケルＨｉｓ－ｔｒａｐ ＦＦカラムに通した。それから、ニッケルカラムに結合したプロテインＭを、５００ｍＭイミダゾールを含んでいるが同一バッファーベースによって溶出させた。それから、プロテインＭを、Ｓ－１００サイズ排除カラムに通して、２％グリセロールを含むリン酸緩衝生理食塩水中ヘ透析して、分光光度法を用いて定量化した。プロテインＭの同一性をタンパク質分離のためのＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質ゲル電気泳動を用いて確認して、その後にクーマシーブルーのタンパク質染色を行ない、４８ｋＤａのプロテインＭバンドを正しく同定した。
ウエスタンブロット：８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルでのタンパク質分離後に、タンパク質をＰＶＤＦメンブレン上に移した。免疫ブロット法を５％脱脂乳中で抗－Ｈｉｓ一次抗体１：１０００希釈（１０μｇ／ｍｌ）を用いて行なった。二次ヤギ抗－ヒトＩｇＧ抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした（１：１０，０００希釈）。
細胞培養：ＨＥＫ－２９３細胞およびＨｕｈ７細胞を、それぞれ、全てのインビトロＡＡＶ中和実験および形質導入の増強に用いた。細胞を、１０％ウシ胎仔血清およびペニシリン－ストレプトマイシンで補充されたダルベッコ改変イーグル培地を用いて５％ＣＯ２中３７℃で維持した。
ヒトＩＶＩＧおよび免疫化マウス血清：１０％ヒトＩＶＩＧ（Ｇａｍｕｎｅｘ）をＧｒｉｆｏｌｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ，ＵＳＡ）から購入した。１２匹の異なるマウス（５０％雄、５０％雌）からの血清を、３×１０１０ウイルスゲノムのＡＡＶ８－ＦＶＩＩＩのＩＰ投与の後に同一ベクターを２週間後にブースト投与して、１回目の投与の６週間後に２回目のブーストをした後に回収してプールした。ヒトＩＶＩＧおよびマウス血清を分取して、その後の使用のために－８０℃で保管した。
インビトロＡＡＶ中和アッセイ：ＮＡｂ分析を、以前に説明されているものをわずかに改変して行なった。細胞を遠心分離によってペレット化して、血清フリーのＸ－Ｖｉｖｏ １０培地中に再懸濁し、それから、４８ウェルまたは９６ウェルプレートのいずれかのフォーマットでプレーティングした。ヒトＩＶＩＧまたは血清を２倍または１０倍で段階希釈した。ＡＡＶ－ＬｕｃをヒトＩＶＩＧまたはマウス血清とともに４℃で１時間インキュベートした後にＡＡＶを添加して、さらに１時間４℃でインキュベートした。それから、ＡＡＶ＋血清インキュベーションを、プレーティング時に、血清フリー培地中に懸濁された細胞と混合した。プロテインＭを用いた中和実験において、３つの異なるインキュベーションのシナリオを、４℃で１時間、各ステップで試験した：中和血清を最初にプロテインＭとインキュベートした後にＡＡＶとインキュベートする、ＡＡＶを最初に中和血清とインキュベートした後にプロテインＭとインキュベートする、および、ＡＡＶを最初にプロテインＭとインキュベートした後に中和血清とインキュベートする。細胞を、２００μｌ培地中の４８ウェルプレート、または１００μｌ培地中の９６ウェルプレートに播種した。形質導入後、細胞を３７℃で２４～４８時間培養して、ＡＡＶ－ルシフェラーゼ導入遺伝子を発現させた。Ｌｕｃ活性を測定するために、細胞をパッシブ（ｐａｓｓｉｖｅ）溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）で溶解させて、ルシフェラーゼシグナルを、Ｗａｌｌａｃ １４２０ Ｖｉｃｔｏｒ ２自動化プレートリーダーを用いて測定した。ＮＡｂ力価を、ルシフェラーゼ活性が血清フリーコントロールよりも５０％低い最大希釈として定義した。
ＮＡｂ血清のインビボＡＡＶ中和および受動移入：ＡＡＶ ＮＡｂを含んでいる異なる量の血清をＣ５７ＢＬ／６マウスの後眼窩静脈内に注入して、２０分後にＡＡＶを注入した。ＡＡＶ投与の前にプロテインＭ処置を受けるマウスについては、プロテインＭ（２：１比については６．３ｍｇ、１：１比については３．１５ｍｇ、または、０．５：１比については１．５８ｍｇ）を、後眼窩静脈によって、血清注入の５～１５分後に送達した。ＡＡＶを、２×１０１２粒子／ｋｇのＡＡＶ－Ｌｕｃベクターの全身性注入によって５分後に投与した。イメージングをＡＡＶ投与の１日後ならびに注入後の１週間および９日の時点で行なった。
実施例２：プロテインＭは、ＡＡＶ形質導入に対するＩＶＩＧの阻害活性を妨げる（ａｂｌａｔｅｓ）
プロテインＭが抗体をブロックする機能を試験するために、ヒト静脈内免疫グロブリンγ（ＩＶＩＧ）によるＡＡＶのインビトロ中和アッセイを設定した。ＩＶＩＧの段階希釈を用いてＡＡＶ中和アッセイを行ない、所定量のＡＡＶ２を中和するＩＶＩＧの量を決定した。ＡＡＶ－ルシフェラーゼベクターを用いた細胞形質導入により生産されたルシフェラーゼ活性は、遺伝子発現の関数的（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リードアウトとしての役割を果たした。中和を、ＩＶＩＧなしコントロールに対して正規化されたルシフェラーゼ活性のパーセントとして決定した。１２．５μｇのＩＶＩＧは７５％（＋／－５％）のＡＡＶ２を中和することが分かり（図１）、この量のＩＶＩＧを、実験デザインを進めるのに選択して、ＡＡＶ中和に関してＩＶＩＧをブロックするプロテインＭを試験した。次に、トロンビン切断によってＨｉｓタグを除去することによって回収したプロテインＭ（配列番号２）の用量希釈系列を行ない、１２．５μｇのＩＶＩＧをブロックするその能力を調べ（図２）、ここで、プロテインＭをＩＶＩＧとともに１時間インキュベートし、その後にＡＡＶ２と１時間４℃でインキュベートした後に、細胞培養物の形質導入を行なった。１分子のＩｇＧに対する２分子のプロテインＭのモル比は、ＩＶＩＧなしコントロールと同等レベルまで中和を防止するのに十分であることが分かった。さらに、ＩＶＩＧに対するプロテインＭのより高いモル比は、ＩＶＩＧなしコントロールよりも高いレベルまでルシフェラーゼシグナルを増強させることが分かった（図２）。１分子のＩｇＧに対する８分子のプロテインＭは、ルシフェラーゼ発現を２倍増大させた。より高いモル比によって増強がさらに増大するかどうかを見るために、８：１および２０：１比のプロテインＭ対ＩＶＩＧを同じ実験条件において試験した。プロテインＭ用量を２．５倍（８：１から２０：１比に）増大させても、対応するシグナルは８：１比に対して０．２５倍増しにしかならないので（図３）、さらなる増強はほとんどないことが分かった。さらに、プロテインＭが免疫グロブリンをブロックする活性は、Ｎ末端Ｈｉｓタグの切断に依存しないことが分かり、したがって、Ｈｉｓタグを切断していないプロテインＭを次の実験に用いた。
実施例３：ＡＡＶベクタービリオンとプロテインＭの相互作用は、ＡＡＶ形質導入を増強する
本発明者らによる以前に研究により、ＡＡＶビリオンと血清タンパク質の相互作用はＡＡＶ形質導入を増強させることができることが示されている。ＡＡＶ形質導入に対するプロテインＭの増強機能をさらに特性化するために、ＩＶＩＧを用いずに２倍段階希釈のプロテインＭを細胞培養物の形質導入の前にＡＡＶとともに１時間インキュベートして、用量応答アッセイを行なった。図４では、以前の実験による８：１比（３３μｇプロテインＭ）のプロテインＭは、ＩＶＩＧの不存在下でＡＡＶ形質導入を用量依存的に増強することができること、および、その増強は、２×１０８ウイルス粒子に関して２μｇ未満のプロテインＭの希釈で失われることが分かった。増強が失われるプロテインＭ分子対ＡＡＶ粒子の等価モル比は４０，０００：１未満であった。次に、プロテインＭによる形質導入の増強は、ＡＡＶとプロテインＭのインキュベーションに依存することが示された。図５では、細胞培養物の形質導入アッセイを行なっており、ここで、プロテインＭは、細胞に添加する１時間前にＡＡＶに添加されたか（事前インキュベーション、－１ｈ時点）、事前インキュベーションせずに、形質導入の時点で添加されたか（形質導入付近、０ｈ時点）、または、ＡＡＶを細胞に添加した１８時間後に添加された（形質導入後、１８ｈ時点）。用量依存的増強が、図４と同様に事前インキュベーション群において見られるが、プロテインＭおよびＡＡＶ２がアッセイの前に一緒にインキュベートされない他の２群では見られないことが分かった。さらに、この結果は、形質導入の時にプロテインＭを細胞に添加することはルシフェラーゼシグナルに対して影響を与えなかったので、プロテインＭ増強のメカニズムが、ベクターキャプシドとの相互作用を含んでおり、細胞に対するプロテインＭの生物学的効果は含まないことも示している。最後に、プロテインＭは、ＩＶＩＧが最初にＡＡＶ２と１時間事前インキュベートされて、その後にプロテインＭと１時間インキュベーションした場合、中和をブロックすることができないこと、および、プロテインＭによるＡＡＶ２ルシフェラーゼシグナルの増強は、ＡＡＶ２がＩＶＩＧによって完全に中和されていない場合にのみ生じることが示された。このアッセイについては、１２．５μｇのＩＶＩＧ（７５～８０％のＡＡＶ２を中和する）、５０μｇのＩＶＩＧ（９９％のＡＡＶ２を中和する、図１）、または２００μｇのＩＶＩＧ（１００％のＡＡＶ２を中和する）を用いた。図６では、９９～１００％のＡＡＶ２がＩＶＩＧ（５０μｇおよび２００μｇ）によって中和された場合、プロテインＭは中和をブロックすることができず、形質導入の増強を与えることができないことが観察された。図２および図３のデータと合わせて、この結果は、免疫グロブリンに対する結合後の過剰量のプロテインＭは、ＡＡＶビリオンと相互作用することが可能であり、形質導入の増強をもたらすことを示唆している。
実施例４：ＡＡＶベクタービリオンとプロテインＭの事前インキュベーションは、ＩＶＩＧのＡＡＶ中和を保護する
次に、プロテインＭを最初にＩＶＩＧと相互作用させる代わりに、プロテインＭを最初にＡＡＶと事前インキュベーションして、その後にＩＶＩＧとインキュベーションする効果を試験することにした。プロテインＭをＡＡＶ２とともに１時間インキュベートした後にＩＶＩＧを添加して、さらに１時間４℃でインキュベートした後に細胞形質導入を行なった場合の、プロテインＭが中和をブロックする能力を試験した。図７では、プロテインＭ濃度を変化させず維持して（８．２５μｇ）、ＩＶＩＧの用量を５０μｇから３．１２μｇまで段階希釈した場合（１：２～８：１モル比のプロテインＭ対ＩＶＩＧ）、中和からのベクターの保護が２：１以上の比で達成されることが分かった。これは、プロテインＭがＡＡＶ添加の前にＩＶＩＧとともにインキュベートされた場合の以前の結果と似ている。ＩｇＧの他に他のタイプのタンパク質が血清中に存在するインビボ状況により近い環境をシミュレートする試みにおいて、同様のインビトロ中和試験を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で行なった。ウシ血清に関する製造元のＩｇＧ定量化に従って、培地容量は、ウェルあたり約３５０μｇのウシＩｇＧを含むと概算された。それから、ウェルの半分において２５μｇのＩＶＩＧまたは血清フリー培地をスパイクして、ＡＡＶを中和し、または中和活性なしのコントロールとして用いた。図８では、プロテインＭが形質導入前にＡＡＶとともに１時間インキュベートされて、総ＩｇＧ（ヒトおよびウシ）が異なるモル比４：１、２：１、および１：１（プロテインＭ対ＩｇＧ）で添加された場合、中和からの保護が１：１比でさえも観察された。これらの結果は、プロテインＭが、他の血清タンパク質が存在している場合であっても、免疫グロブリンに結合してブロックすることが可能であることを示す。
実施例５：インビトロでの、ＡＡＶに対するミューリン血清の中和活性に対する、プロテインＭの効率的なブロック機能
ＩＶＩＧによる知見を実際の状況に移すために、インビトロでの中和実験を、最初に、ＡＡＶ８キャプシドベクターで免疫化されたマウス由来の血清を用いてＡＡＶ８－ルシフェラーゼベクターで行なった。免疫化マウス由来の血清およびプロテインＭの両方を段階希釈して２：１のモル比を維持した場合、結果を血清のみのコントロールと比較すると、プロテインＭは、概算で約１００倍の希釈の１：２，５６４の力価の中和血清に対して、中和からエスケープさせることが分かった（５０％中和が、０．００３９μｌの血清であるのに対し、プロテインＭ存在下では０．２７４４μｌの血清、図９）。
実施例６：インビボでの、ＡＡＶに対するミューリン血清の中和活性に対する、プロテインＭの効率的なブロック機能
次に、インビボ実験を行ない、異なる容量の中和血清を、後眼窩注入を介してナイーブマウスに受動移入した。マウスに５～１５分間、血清灌流させた後、プロテインＭを、同じく後眼窩注入を介してマウスに全身投与して、５分後にＡＡＶ８－Ｌｕｃ（２×１０１０ウイルスゲノム）を投与した。図１０は、マウス内の総免疫グロブリンに対して概算のモル比２：１（６．３ｍｇ）のプロテインＭは、１μｌのＡＡＶ８－ＮＡｂ血清（力価１：２，５６４）によるＡＡＶ８の中和を防止することができることを示す。このことは、５０％よりも多くのＡＡＶ８－Ｌｕｃが１μｌ～０．００１μｌの血清容量で中和されて１，０００倍差の濃度にわたる（ｏｖｅｒ ａ １，０００－ｆｏｌｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）ＡＡＶ ＮＡｂエスケープを表わす、段階希釈された抗－ＡＡＶ８血清のインビボ中和アッセイと対比される（図１１）。
実施例７：プロテインＭ／免疫グロブリン複合体の安定性
免疫グロブリンとプロテインＭの複合体がどのくらい安定であるか試験するために、アッセイを最初にインビトロで行なった。プロテインＭをマウス血清と２：１の分子比で、１時間～７２時間の異なる持続時間、３７℃で事前インキュベートして、それから、中和分析のために４℃でさらに１時間、ＡＡＶ８ベクターを添加した。図１２に示すように、マウス血清中の抗－ＡＡＶ８免疫グロブリンとプロテインＭとの間で事前に形成された複合体は、細胞培養物に添加される前に３７℃でインキュベートした場合、中和血清を含むがプロテインＭを含まないコントロールまたはＰＢＳもしくは培地のみを含むコントロールと比較すると、７２時間以上安定であった。この結果は、プロテインＭと免疫グロブリンとで形成された複合体は、インビトロで非常に安定であることを示唆している。
次に、プロテインＭのインビボ安定性を、０．３μｌのＡＡＶ８中和血清の受動移入後に試験した。プロテインＭが投与されて５分ではなく３時間待った場合は、プロテインＭが抗体をブロックする機能は、３．５×１０５から１×１０５光子／秒／ｃｍ２／自発率（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒａｔｅ）に約７０％減少することが分かった（図１３）。この結果は、プロテインＭのＮＡｂブロック効果がインビボで短期間であることを示す。
ＡＡＶベクターを用いた遺伝子療法は、臨床試験において成功している。しかしながら、ヒト集団におけるＡＡＶ中和抗体の高い出現率は、より多くの患者がこの効果的な遺伝子送達から利益を受けるのを妨げている。本研究では、マイコプラズマ由来のプロテインＭが、ＮＡｂと相互作用してＡＡＶ形質導入を増強することが可能であることが見いだされた。ＮＡｂ活性をブロックするために必要なプロテインＭの最小用量は免疫グロブリンの２倍の分子（２ ｆｏｌｄ ｍｏｒｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｎ）であった。ＡＡＶビリオンとプロテインＭの直接的な相互作用もまた、ＡＡＶ形質導入を増大させた。中和抗体アッセイは、インビトロでＡＡＶ免疫化マウス血清をプロテインＭとともにインキュベートした場合に、ＮＡｂ活性が約１００倍低減し、プロテインＭが適用された場合に、ＮＡｂ陽性血清を養子移入したマウスにおいて１０００倍にわたる（ｏｖｅｒ １０００ ｆｏｌｄ）保護が観察されることを示した。免疫グロブリンとプロテインＭの複合体はインビトロで経時的に（ｏｖｅｒ ｔｉｍｅ）安定であったが、プロテインＭは、インビボで、免疫グロブリンの中和からの、その保護機能を徐々に失う。
ＡＡＶ ＮＡｂを克服するために、複数のストラテジーが研究室において利用されている。１つのアプローチは、コーティングのためのポリマーまたはエキソソームを用いて、Ｎａｂ認識をブロックするためにＡＡＶ表面をマスクすることである。このアプローチは有望ではあるが、ＡＡＶ形質導入プロファイルを変更し得る。２つめのアプローチは、ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲまたはＤＮＡシャッフリングを用いてＡＡＶキャプシド変異のライブラリーを産生し、ＮＡｂ存在下でＮＡｂエスケープ突然変異体をインビトロおよびインビボで選択することである。このアプローチは、新規のキャプシドを産生したが、これらの突然変異体は動物組織から単離されて動物組織において試験され、動物試験によるデータは常にヒトに移されるわけではなく、ヒト組織におけるＡＡＶ形質導入を予測するために利用できる信頼性のある（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）システムは存在しないので、ヒトにおける形質導入効率が未知であるキャプシドを生産する潜在的制限を抱えている。３つめのアプローチは、ＮＡｂ交差反応性が低いかまたは存在しない、ＡＡＶの代替の血清型を使用することである。このポピュラーな（ｐｏｐｕｌａｒ）ストラテジーは、論理的かつ動物モデルにおいて成功的であるが、動物では予測され得ない、大部分のヒトにおける交差反応性の存在について懸念が残る。最後の実験アプローチは、ＡＡＶキャプシド表面上のＮＡｂ結合ドメインを合理的に改変してＮＡｂ結合部位を除去することである。このストラテジーは、モノクローナル抗体エピトープと、ＡＡＶビリオンの構造に関する情報を必要とし、ヒト血清由来のＮＡｂはポリクローナルであるという事実に起因して本質的に制限され、全ての生産されたＮＡｂを表わすヒト由来のｍＡｂを得ることは不可能である。いくつかの臨床関連のアプローチも研究されている：１つの例は、ベクター送達の前に血漿交換を行なうことである。しかしながら、各回のアフェレーシスの相対的非効率性および低力価のＮＡｂ（＜１：５）でさえＡＡＶ形質導入を抑制することができるという事実に起因して、このストラテジーは、ＡＡＶ ＮＡｂの開始力価がより低い患者にのみ適切であり、複数セッションのアフェレーシスを必要とする。同様に、抗－ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）の使用は、Ｂ細胞の枯渇を達成することができるが、長い時間がかかり（約６～９ヶ月）、少数の対象においてＡＡＶ ＮＡｂを減少させるのに効果的なだけである。最後の臨床アプローチは、過剰な空ＡＡＶキャプシドをＮＡｂに関するデコイとして使用することである。空の粒子の添加は、ＡＡＶキャプシドの負荷（ｌｏａｄ）を増大させ、それにより、キャプシド特異的な細胞傷害性免疫応答が介在するＡＡＶ形質導入細胞の除去が潜在的に増大し、おそらく、効果的な形質導入に関して完全なＡＡＶ粒子と競合するという懸念が残る。さらに、空のキャプシドは、完全なＡＡＶベクターよりも大きな肝臓炎症を誘導し得る。ＮＡｂ保護の低効率または上記アプローチの複雑性と比較して、本研究では、中和抗体活性をブロックするための、より大きな潜在性を有するストラテジーが、免疫グロブリン結合プロテインＭを用いて示された。ＮＡｂ回避能力は、プロテインＭを用いた場合、インビトロで１００倍（ｆｏｒ １００ ｆｏｌｄ）、インビボでは１０００倍にわたり（ｏｖｅｒ １０００ ｆｏｌｄ）達成された。
プロテインＭは、抗体軽鎖および重鎖上の保存領域に普遍的に結合して、抗原認識またはＣＤＲ領域との構造的干渉を生じさせることによって哺乳類のＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ抗体クラスをブロックする普遍的な抗体結合タンパク質として機能する。プロテインＭは、抗体に結合して、抗原抗体結合を妨げるが、以前に形成された抗原抗体複合体を破壊しない。抗体とプロテインＭの相互作用は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ｘ線結晶学、電子顕微鏡、およびバイオレイヤー干渉法によって検証されている。プロテインＭは、ベクターとは独立に用いることができるので、以前にＦＤＡによって承認された遺伝子療法を含む処置レジメンに取り込むことができる。このことは、キャプシドに基づく免疫回避よりも有利である。なぜならば、それぞれの個々のキャプシドは、それぞれの疾患標的についてその独自の臨床試験を経なければならないからである。プロテインＭの特性に基づき、このタンパク質は、任意のウイルスベクターが介在する遺伝子送達に適用することができるだけでなく、体液性免疫応答が介在するクリアランスを回避するためのＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９のような一過性のタンパク質療法にも適用することができる。また、プロテインＭは、自己抗体により生じる自己免疫障害を処置する潜在性も有する。
本研究では、少なくとも２分子またはそれよりも多くのプロテインＭが、１分子の免疫グロブリンをブロックするために必要であり、全身投与後のＮＡｂ回避のために血中の全ての免疫グロブリンと相互作用するためには多くの量のプロテインＭが必要となり得ることが示された。高用量の組み換えタンパク質、例えばヒト血清アルブミンおよび免疫グロブリンが臨床試験において用いられているが、高用量のプロテインＭの潜在的な合併症による懸念は、臨床試験前に大きな動物において対処される必要がある。プロテインＭがＡＡＶ投与のために局所的に用いられる場合は大きな問題ではないだろう。
インビトロ試験は、プロテインＭ／免疫グロブリンの複合体が相対的に長期間安定であることを示したが、インビボ実験では、ＡＡＶベクターが、プロテインＭ適用のずっと後に投与された場合、プロテインＭ機能の喪失が徐々に表れた。血中でのプロテインＭ／免疫グロブリン複合体の動力学および動態学を理解することが重要であり；この情報は、プロテインＭの投与後のＡＡＶ注入に関するウインドウに関する価値のある情報を提供する。
他の懸念は、繰り返し投与に関するプロテインＭの免疫原性である。プロテインＭは外来タンパク質であるので、体液性免疫応答を誘発して抗体が産生される。プロテインＭは、全ての免疫グロブリンに結合することによってその保護機能を発揮し、プロテインＭに対する特異的なＩｇの量は、全てのＩｇの非常に小さな部分であり、したがって、高用量のプロテインＭがＡＡＶ ＮＡｂをブロックする目的のために用いられる場合、プロテインＭ特異的なＩｇの量は、非常に少量のプロテインＭを中和するだけであり、したがって、投与されるプロテインＭは、ＡＡＶ ＮＡｂからＡＡＶを保護する機能に影響し得ない。プロテインＭは、Ｂ細胞表面に結合することができ、Ｂ細胞の増殖を刺激する潜在性を有する。以前の研究により、無傷のプロテインＭはＢ細胞の増殖を誘導することが可能であるが、トランケートされたプロテインＭは、この機能を失うことが示されている。プロテインＭ投与後のインビボでの長期のフォローアップが行われるべきである。
結論として、この結果は、１分子のＩｇＧに対してプロテインＭが２分子以上の分子比で存在する場合に、プロテインＭは、免疫グロブリンがＡＡＶを中和するのを防止することを示している。ＡＡＶベクターの保護は、ＡＡＶの免疫グロブリン中和前にプロテインＭが免疫グロブリンと相互作用することに依存している。プロテインＭは、インビボで、１，０００倍範囲のＮＡｂ力価にわたってＡＡＶを中和から保護することができる。この研究は、ＮＡｂを有する患者における将来のＡＡＶ臨床試験において、または再投与のために、ＮＡｂ活性からのＡＡＶベクタービリオンの保護のためのプロテインＭの使用に対して重要な知見を提供した。
実施例８：増強された特性を有する改変されたプロテインＭ変異体
上記の実施例は、遺伝子療法ベクターに対する中和抗体を回避するための、抗体をブロックするタンパク質としてのマイコプラズマ・プロテインＭの使用を説明している。異なるマイコプラズマ種由来の天然起源プロテインＭホモログは、大部分の哺乳類抗体クラスにナノモルの親和性で結合するが（Ｇｒｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３：６５６（２０１４））、天然起源タンパク質の多くの特徴は、治療薬としての使用に不適切である。ネイティブのプロテインＭは可溶性でないが、細菌細胞膜内にそれを固定するＮ末端膜貫通ドメインによって膜結合されている。さらに、ネイティブのタンパク質は、薬物様分子として予想外に挙動し得る無秩序な（ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ）Ｃ末端を有する。Ｎ末端膜貫通ドメインおよび無秩序なＣ末端セグメントが欠失している、ネイティブのプロテインＭトランケート型（Ｇｒｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３：６５６（２０１４）によるプロテインＭ ＴＤ）を、治療用抗体ブロッキング分子として用いた検証が行われたが、このタンパク質は、体温（３７℃）でインキュベートした場合に構造的安定性がないという重要な知見がなされた。
トランケートされたプロテインＭ（配列番号３）を、単純なインビトロでのバッファー懸濁液中で３７℃に曝露すると、目に見える析出および凝集が短時間（１５分～１時間）で生じた。円偏光二色性を用いた分析において、タンパク質を３７℃に加熱することは、１時間以内の明瞭なタンパク質アンフォールディングのイベントと関連し、タンパク質の即時的な融解が４１．２℃で生じるが、２時間にわたって続く２０℃インキュベーションでは、アンフォールディングのイベントは生じないことが判明した（図１４）。タンパク質のアンフォールディングは、ウエスタンブロットによって評価される溶液中の可溶性画分の測定される低減とも相関する。不安定なタンパク質を用いることの治療的制限を克服するために、合理的な設計アプローチを用いて、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ（ＭＧ２８１）およびＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＭＰＮ４００）由来の突然変異体ホモログを含むトランケートされたプロテインＭの突然変異類似体を産生した。このアプローチは、タンパク質モデリングへの入力としてプロテインＭの結晶構造およびアミノ酸配列（ＰＤＢ ＩＤ：４ＮＺＲおよび４ＮＺＴ）、ならびに、Ｒｏｓｅｔｔａと呼ばれるエンジニアリング・ソフトウェアを用いた。自由エネルギー計算および３Ｄモデルを用いて、どのアミノ酸配列変化が三次構造の安定化をもたらすか予測し、８５０＋を超えるアミノ酸置換のリストを出力した。個々の突然変異体および組み合わせた複数の突然変異体のＤＮＡ合成により、合理的に設計された変異ライブラリーを用いて突然変異体タンパク質を産生した。表４は、熱安定性に関して野生型タンパク質よりも良いスコアを有していた８８５個のコンピューターによって同定された点突然変異をリスト化している。表５は、熱安定性に関して野生型タンパク質よりも実質的に良い（－３．０デルタスコアよりも良い）スコアを有していた１６５個のコンピューターによって同定された点突然変異をリスト化している。
示差走査型蛍光透視法を用いて、異なるプロテインＭ突然変異体を検証して、タンパク質融解温度を計算した（図１５、図１６）、それから、突然変異体を異なる時間、３７℃の温度曝露に供して、溶解度（図１７Ａ～１７Ｃ）およびインビトロ中和アッセイにおけるプールしたヒト静脈内ＩｇＧ（ＩＶＩＧ）によるＡＡＶ中和を防止する能力（１８Ａ～１８Ｃ）を測定した。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ由来のプロテインＭの類似体を試験するのに加えて、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａに由来する類似体も生産した。それから、いくつかの突然変異体をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって試験して、マウスＩｇＧに対する突然変異体タンパク質の親和性を決定し、突然変異体が、免疫グロブリン基質に関する突然変異体の親和性を変化させることができることが示された（図２１、２２）。突然変異体はまた、安定性野生型プロテインＭよりも広いｐＨ範囲にわたる安定性によって証明されるように安定性の増大も示した（図２６）。ＭＧ２９は、３７℃で増大した安定性を有しておりＩｇＧに関するナノモル親和性を維持している、リード類似体の１つであり、ＡＡＶキャプシドに対するマウスの直接免疫化後のインビボでのＡＡＶ中和抗体のブロックを試験するために用いた。一方の脚にリン酸緩衝生理食塩水で製剤化したＡＡＶを筋肉内注入し、他方の脚にＭＧ２９で製剤化したＡＡＶを筋肉内注入した結果により、ＭＧ２９が、ＡＡＶ免疫化マウスにおいてＡＡＶ中和抗体をブロックし、効果的な遺伝子送達およびＡＡＶの再投与を可能することが示された（図１９、２０）。
Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェアを用いた合理的なエンジニアリング・ストラテジーの第２ラウンドは、親和性および結合を増強または減少させる突然変異体プロテインＭ類似体の結合部位の改変を予測するための、平均モデルの多くのヒト免疫グロブリン構造を用いた突然変異体タンパク質の親和性の変更を含んでいた。さらに、合理的な設計ストラテジーの第３ラウンドは、Ｒｏｓｅｔｔａモデルおよび異なるマイコプラズマ種由来の天然起源プロテインＭ配列の多様性の両方の使用を組み入れて、天然には存在しない抗原的に別個の類似体を作製した。これらの類似体は、全タンパク質または個々エピトープの、キメラ、モザイク、またはデノボの合理的に変更されたアミノ酸突然変異体であることができる。同一または異なる類似体は、プロテインＭ類似体に対して生産された阻害抗体の存在下でさえ、複数ラウンドの再投与のためにＡＡＶとともに用いることができる。これは、プロテインＭ類似体が、抗体結合および抗原認識（さらには阻害抗体によるそれ自身の認識）のブロックに関して直接的に競合するからである。飽和用量のプロテインＭ類似体は、初回の免疫曝露後にプロテインＭ類似体に対して産生される少量の免疫グロブリンに対して過剰である（ｉｎ ｅｘｃｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ）。さらに、エピトープ多様性が増大したプロテインＭ類似体の作製は、プロテインＭ阻害抗体からの免疫回避のさらなる層を提供することができる。リスト化されたエンジニアリング・ストラテジーのそれぞれを組み合わせて、または互いの上に重ねて、複数の異なる特性を有するプロテインＭ類似体を作製することができると考えられる。
最後に、タンパク質産物収率が増強されたプロテインＭのＤＮＡコドン最適化バージョンを生産した（図２５）。親トランケート型プロテインＭ配列の２つのコドン最適化バージョンが生産された：一方の配列は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＨ．ｓａｐｉｅｎｓコドン使用頻度の両方について最適化され、他方はＨ．ｓａｐｉｅｎｓコドン使用頻度についてのみ最適化された。デュアルのＥ．ｃｏｌｉおよびＨ．ｓａｐｉｅｎｓコドン構築物を用いてＥ．ｃｏｌｉにおいてタンパク質を生産し、親である非最適化プラスミドと比較してタンパク質収率が４倍増加した。Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのみ最適化された構築物は、ＩＬ－２分泌ペプチドまたはアルブミン分泌ペプチド配列を含んでおり、培養培地からのプロテインＭ類似体の回収のために哺乳類細胞株からのタンパク質の分泌を可能にする。プロテインＭ突然変異類似体は、両方のタイプの最適化ＤＮＡ配列にクローニングまたは合成されて、増強されたタンパク質生産のために用いられる。３７℃で安定なプロテインＭ類似体は、分泌後、タンパク質アンフォールディングの影響を受けずにヒト細胞内で培養することができる。さらに、プロテインＭ類似体のグリコシル化部位は、結合部位のグリコシル化を除去するため、または外側表面にグリコシル化を追加するために置換されている（類似体ＭＧ２８（Ｎ２７４Ｄ）など）。外側表面へのグリコシル化部位の追加は、プロテインＭ類似体の免疫回避を増強させるため、および、プロテインＭ類似体の複数回投与に関するプロテインＭ阻害抗体の認識を減少させるための、別のメカニズムである。最後に、プロテインＭ類似体のＤＮＡ配列は、３７℃で安定であってグリコシル化部位が除去または新たに追加された分泌タンパク質を生産するために、哺乳類細胞株に安定的に組み込まれる。
方法
ＡＡＶウイルス産生：ＡＡＶベクターを、ＨＥＫ２９３細胞における３プラスミドトランスフェクションによる標準的な手法を用いて生産した。簡潔には、ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドｐＴＲ－ＣＢＡ－Ｌｕｃを、ＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐヘルパープラスミド（ｐＸＲ２またはｐＸＲ８）およびアデノウイルスヘルパープラスミドｐＸＸ６－８０で共トランスフェクトした。７２時間後、細胞培養物を回収して、凍結融解および超音波処理によって溶解させた。浄化した細胞溶解物をＤＮＡｓｅ処理して、１５％／２５％／４０％／６０％イオジキサノールステップ勾配中で超遠心分離して、陰イオン交換Ｑ－カラムによって精製した。精製されたＡＡＶベクターを、パッケージされたＡＡＶ導入遺伝子のセグメントを増幅することを目的とするプライマーを用いたｑＰＣＲによって滴定した。
タンパク質産生：プラスミドｐＥＴ－２８ｂ（＋）は、プロテインＭ類似体（膜貫通ドメインが欠失しているＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍまたはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ由来のトランケートされたタンパク質）をコードし、Ｎ末端Ｈｉｓ－Ｔａｇおよびトロンビン切断部位を有する。プラスミドをエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞中で増殖させて、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｍａｘｉ－Ｐｒｅｐキットを用いて精製した。ｐＥＴ－２８ｂ（＋）プラスミドを、一晩のスターター培養を用いてＢＬ２１／ＤＥ３細胞内に一時的にトランスフェクトした。自己誘導培地（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＭａｇｉｃ培地）にスターター培養物を播種して、１８℃で３日間増殖させた。それから、培養物を遠心分離によってペレット化して、－８０℃で凍結させた。
タンパク質精製：凍結した細菌細胞培養物ペレットを解凍して、超音波処理によって溶解させて、ＤＮＡｓｅ処理して、遠心分離によって浄化した。浄化した細菌溶解物をニッケル結合バッファー（２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム）中に透析して、ＦＰＬＣを用いてニッケルＨｉｓ－ｔｒａｐ ＦＦカラムに通した。それから、ニッケルカラムに結合したプロテインＭを、５００ｍＭイミダゾールを含んでいるが同一バッファーベースによって溶出させた。それから、プロテインＭを、Ｓ－１００サイズ排除カラムに通して、２％グリセロールを含むリン酸緩衝生理食塩水中へ透析して、分光光度法を用いて定量化した。プロテインＭの同一性をタンパク質分離のためのＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質ゲル電気泳動を用いて確認して、その後にクーマシーブルーのタンパク質染色を行ない、４５ｋＤａ～４８ｋＤａのプロテインＭバンドを正しく同定した。
一部のタンパク質の生産のために、２つのストラテジーのいずれかを実施して、プロテインＭ変異体を精製した。第１のプロトコル（Ｎｉ－Ｐｕｒｉｔｙ）は、ＮａｎｏＤＳＦのための小スケール生産に関するものであった。細胞ペレットを、２．５ｍｇ／ｍＬリゾチーム、２５％Ｂ－ＰＥＲ、７５％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４、およびプロテアーゼ阻害剤（ＰＭＳＦ、ベスタチン、およびペプスタチン）からなるバッファーと混合することによって溶解させた。室温での３０分の混合後、粗溶解物を１５，０００ｒｃｆで２０分間遠心分離して、上清をＮｉ樹脂とともに１時間４℃でインキュベートした。それから、樹脂を洗浄して（ＰＢＳ＋２０ｍＭイミダゾール）、タンパク質を（ＰＢＳ＋５００ｍＭイミダゾール）で溶出させた。溶出したタンパク質を、Ｚｅｂａ脱塩カラムを用いてＰＢＳ ｐＨ７．４中に交換した後、安定性アッセイを行なった。第２のプロトコル（ＳＥＣ－Ｐｕｒｉｔｙ）は、大スケールの生産に関するものであり、タンパク質試料からさらなる汚染物質／凝集体を除去した。超音波処理を介して細胞を溶解させ、ニッケル樹脂を用いて精製し（第１のプロトコルと同一のバッファー）、最後にＰＢＳ＋２％グリセロール中へサイズ排除クロマトグラフィーを行なった後、試料を凍結させた。
ウエスタンブロット：８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルでのタンパク質分離後に、タンパク質をＰＶＤＦメンブレン上に移した。免疫ブロット法を５％脱脂乳中で抗－Ｈｉｓ一次抗体１：１０００希釈（１０μｇ／ｍｌ）を用いて行なった。ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされた二次ヤギ抗－ヒトＩｇＧ抗体（１：１０，０００希釈）。
タンパク質の融解温度およびアンフォールディングの決定：融解温度（Ｔｍ）を、ナノ示差走査型蛍光定量法（ＮａｎｏＤＳＦ）を用いて決定し、タンパク質のアンフォールディングを、円偏光二色性アッセイを用いて異なる温度で決定した。一次導関数の変曲点は、Ｔｍまたはアンフォールディングを示す。タンパク質を、プロトコル１（Ｎｉ－Ｐｕｒｉｔｙ）に従って精製した。
溶解度アッセイ：熱安定性経時変化を、それぞれのＳＥＣ精製タンパク質（０．４ｍｇ／ｍＬ）の７個のアリコートを３７℃で異なる時間インキュベートすることによって行なった。析出したタンパク質を、試料を１５，０００×Ｇで１０分間遠心分離することによってペレット化させてから、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのためにゲルをローディングした。タンパク質を、プロトコル２（ＳＥＣ－Ｐｕｒｉｔｙ）に従って精製した。
バイオレイヤー干渉法による親和性評価：バイオレイヤー干渉法を３７℃で行なって、プロテインＭ構築物の親和性を評価した。タンパク質を、プロトコル２（ＳＥＣ－Ｐｕｒｉｔｙ）に従って精製した。１０００ｎＭ～１５．６ｎＭの範囲の２倍希釈系列の各Ｍ構築物は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｋｉｎｅｔｉｃｓバッファー（ＰＢＳ＋洗浄剤）を用いて行なわれた。抗－マウスＩｇＧ Ｆｃ Ｃａｐｔｕｒｅバイオセンサーに対する結合を評価した。各プロトコルは、ベースライン、会合、および解離ステップを、それぞれ１０分、５分、および５分含んでいた。データは、バッファー中の会合ステップと並行して実行された参照センサーから差し引かれた。親和性データを、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ｖ９．０ソフトウェア内の１：１曲線フィットに基づいて計算した。報告された安定状態の結合定数を、各濃度（ｎ＝７）における最大応答に基づいて計算した。Ｘ２を最小限にするために、反応速度データは、２５０～１５．６ｎＭ希釈範囲（ｎ＝５）に関するデータのみ含めた。
構造モデルおよび合理的なタンパク質エンジニアリング：プロテインＭ（ＰＭ）の類似体の熱安定性の最適化を、免疫グロブリンに結合したＰＭの既存の結晶構造（４ＮＺＴおよび４ＮＺＲ）に基づき、インシリコの合理的なタンパク質エンジニアリング・アプローチを用いて達成した。Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェア・パッケージを用いて、ＰＭペプチドを安定化させる突然変異を同定した。第１のプロトコルは、部位飽和突然変異誘発をインシリコで行ない、隣のアミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ）を突然変異残基付近に再充填（ｒｅｐａｃｋ）させた。第２のプロトコルは、結晶構造内の充填不足（ｕｎｄｅｒ－ｐａｃｋｅｄ）の領域においてコンビナトリアル突然変異を生じさせた。突然変異体を、野生型アミノ酸と置換の間のスコアの違いに従ってランク分けした。さらなる目視検査を行なって、好ましい突然変異体を同定した。突然変異体を、ｐＥＴ－２８ｂ＋ベクター内にＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによってクローニングして合成した。結合部位の親和性の変更および別個の抗原性を有するＰＭ類似体の作製のためのさらなる設計ストラテジーを行なった。
ＭＰ ＷＴのホモロジーモデルを、Ｓｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌウェブサーバを用いて構築した（図２４）。ＭＧとＭＰ ＷＴアイソフォームの間の保存スコアを、ＢＬＯＳＵＭ９０マトリックスに従って計算した。画像をＰｙＭｏｌで表した（ｒｅｎｄｅｒｅｄ ｉｎ）。
細胞培養：ＨＥＫ－２９３細胞またはＨｕｈ７細胞を、全てのインビトロＡＡＶ中和実験に用いた。細胞を１５ｃｍ組織培養プレート上で増殖させ、１０％ウシ胎仔血清およびペニシリン－ストレプトマイシンで補充されたダルベッコ改変イーグル培地を用いて５％ＣＯ２中３７℃で維持した。
インビトロ中和実験のためのヒトＩＶＩＧ：１０％ヒトＩＶＩＧのストック（Ｇａｍｕｎｅｘ）を、Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ，ＵＳＡ）から購入した。個々のアリコートをリン酸緩衝生理食塩水中１ｍｇ／ｍＬに希釈して、後の使用のために－８０℃で保管した。１２匹の異なるマウス（５０％雄、５０％雌）に、３×１０１０ウイルスゲノムのＡＡＶ８－ＦＶＩＩＩのＩＰ投与の後、２週間後に同一ベクターのブースト投与、および１回目の投与の６週間後に２回目のブーストをした後、血清を回収してプールした。マウス血清を分取して、後の使用のために－８０℃で保管した。
インビトロＡＡＶ中和アッセイ：Ｎａｂ分析を、わずかな改変をして以前に記載されるとおりに行なった（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：９８４（２０１５））。細胞を遠心分離によってペレット化して、血清フリーＸ－Ｖｉｖｏ１０培地中に再懸濁させ、それから、４８ウェルまたは９６ウェルプレートのフォーマットでプレーティングした。ヒトＩＶＩＧまたは血清を、２倍または１０倍で段階希釈した。ＡＡＶ－Ｌｕｃを、ヒトＩＶＩＧまたはマウス血清とともに１時間４℃でインキュベートした後にＡＡＶを添加して、さらに１時間４℃でインキュベートした。それから、ＡＡＶ＋血清インキュベーションを、血清フリー培地中に懸濁された細胞と、プレーティング時に混合した。プロテインＭを用いた中和実験では、３つの異なるインキュベーションのシナリオを試験した（各ステップは４℃で１時間）：中和血清を最初にプロテインＭとインキュベートした後にＡＡＶとインキュベート、ＡＡＶを最初に中和血清とインキュベートした後にプロテインＭとインキュベート、および、ＡＡＶを最初にプロテインＭとインキュベートした後に中和血清とインキュベート。細胞を、２００μｌ培地中の４８ウェルプレート、または１００μｌ培地中の９６ウェルプレートに播種した。形質導入後、細胞を２４～４８時間３７℃で培養して、ＡＡＶ－ルシフェラーゼ導入遺伝子を発現させた。Ｌｕｃ活性を測定するために、細胞をパッシブ溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）で溶解させて、ルシフェラーゼシグナルをＷａｌｌａｃ１４２０ Ｖｉｃｔｏｒ ２自動化プレートリーダーで測定した。Ｎａｂ力価を、ルシフェラーゼ活性が血清フリーのコントロールよりも５０％低い最大希釈として定義した。
ＡＡＶ免疫化マウスにおけるインビボでのＡＡＶ再投与：Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、８Ｅ５ｖｇまたは１Ｅ９ｖｇのＡＡＶ８－ＧＦＰのＩ．Ｐ．注入によって免疫化した。およそ１ヶ月後に、ＡＡＶ８インビトロ中和アッセイによる滴定のためにマウスから血清を回収した。１日後、Ｉ．Ｍ．注入を行ない、それぞれの脚は、等用量の１Ｅ９ｖｇまたは２Ｅ９ｖｇ ＡＡＶ８－ルシフェラーゼを含み、ここで、一方の脚はリン酸緩衝生理食塩水で製剤化されたＡＡＶが投与され、他方の脚はプロテインＭ類似体で製剤化されたＡＡＶが注入の直前の単純な混合で投与された。合計容量２００μｌが、脚あたり注入された。Ｄ－ルシフェリン基質をＩ．Ｐ．投与した後に、ＡＡＶ－Ｌｕｃ投与の２週間後に発光イメージングを行なった。
前述の実験は本発明の例示であり、その限定と解釈されるべきでない。本発明は、好ましい実施態様に関して詳細に説明されているが、以下の特許請求の範囲において記載および定義されるように、バリエーションおよび改変が本発明の範囲および主旨内に存在する。

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Figure 2022542294000022

表７：抗体へのＭＧ ＷＴの親和性を改善すると予測された１７個の点突然変異体。デルタスコアは、突然変異体のスコア－ＷＴ残基のスコアを指す。このリストは、ＰＤＢ ＩＤ：４ＮＺＲ内の抗体界面の５Å以内の７０残基を検討した。
Figure 2022542294000023
配列
配列番号１：野生型Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ
Figure 2022542294000024
Figure 2022542294000025
配列番号２：Ｎ末端６－Ｈｉｓタグの後にトロンビン切断部位を有するＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１のアミノ酸残基３７～５５６）の可溶型
Figure 2022542294000026
Figure 2022542294000027
配列番号３：野生型Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭフラグメント７４～４７９
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配列番号４：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ１
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配列番号５：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ８
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配列番号６：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ１３
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配列番号７：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ１５
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配列番号８：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ２１
ＳＬＳＬＮＤＧＳＹＱＳＥＩＤＬＳＧＧＡＮＦＲＥＫＦＲＮＦＡＮＥＬＳＥＡＩＴＮＳＰＫＧＬＤＲＰＶＰＫＴＥＩＳＧＬＩＫＴＧＤＮＦＩＴＰＳＦＫＡＧＹＹＤＨＶＡＳＤＧＳＬＬＳＹＹＱＳＴＥＹＦＮＮＲＶＬＭＰＩＬＱＴＴＮＧＴＬＭＡＮＮＲＧＹＤＤＶＦＲＱＶＰＳＦＳＧＷＳＮＴＫＡＴＴＶＳＴＳＮＮＬＴＹＤＫＷＴＹＦＡＡＫＧＳＰＬＹＤＳＹＰＮＨＦＦＥＤＶＫＴＬＡＩＤＡＫＤＩＳＡＬＫＴＴＩＤＳＥＫＰＴＹＬＩＩＲＧＬＳＧＮＧＳＱＬＮＥＬＱＬＰＥＳＶＫＫＶＳＬＹＧＤＹＴＧＶＮＶＡＫＱＩＦＡＮＶＶＥＬＥＦＹＳＴＳＫＡＮＳＦＧＦＮＰＬＶＬＧＳＫＴＮＶＩＮＤＬＦＡＳＫＰＦＴＨＩＤＬＴＱＶＴＬＱＮＳＤＮＳＡＩＤＡＮＫＬＫＱＡＶＧＤＩＹＮＹＲＲＦＥＲＱＦＱＧＹＦＡＧＧＹＩＤＫＹＬＩＫＩＶＮＴＮＰＤＶＤＤＤＩＶＹＲＳＬＫＥＬＮＬＨＬＥＥＡＹＲＥＧＤＮＩＹＹＲＶＮＥＮＹＹＰＧＡＳＩＹＥＮＥＲＡＳＲＤＳＥＦＱＮＥＩＬＫＲＡＥＱＮＧＶＴＦＤＥＮ
配列番号９：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ２２
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配列番号１０：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ２３
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配列番号１１：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ２４
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配列番号１２：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ２７
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配列番号１３：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ２８
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配列番号１４：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ２９
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配列番号１５：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ３１
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配列番号１６：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ３３
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配列番号１７：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ３８
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配列番号１８：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ４０
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配列番号１９：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ４３
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配列番号２０：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ４４
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配列番号２１：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ４５
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配列番号２２：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ４６
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配列番号２３：野生型Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ
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配列番号２４：野生型Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭフラグメント
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配列番号２５：細菌およびヒト発現の両方のためにコドン最適化されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭをコードするポリヌクレオチド
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配列番号２６：ヒト発現のためにコドン最適化されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭをコードするポリヌクレオチド
ＡＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＣＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＧＡＡＡＣＴＴＣＧＣＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡＴＣＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＣＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＡＣＣＣＧＴＧＣＣＴＡＡＧＡＣＡＧＡＧＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＧＡＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴＡＧＣＴＴＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＧＡＴＣＡＣＧＴＧＧＣＣＴＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＡＣＴＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＧＡＧＴＡＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＣＧＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＡＣＡＡＣＡＧＡＧＧＣＴＡＣＧＡＣＧＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＡＣＡＧＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＴＴＡＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＣＡＡＴＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＴＧＧＡＣＣＴＡＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＴＣＴＧＴＡＣＧＡＣＡＧＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＧＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＣＧＧＣＧＡＴＴＡＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＡＡＣＧＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＣＣＡＡＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＡＧＣＴＴＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＡＡＣＧＡＣＣＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＣＡＣＡＴＣＧＡＴＣＴＧＡＣＣＣＡＡＧＴＧＡＣＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＧＣＧＡＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣＣＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＡＣＡＧＧＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＴＣＧＡＧＣＧＧＣＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＴＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＧＡＣＡＡＧＴＡＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＡＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＧＡＧＴＧＡＡＣＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＡＣＣＣＡＧＧＣＧＣＣＡＧＣＡＴＣＴＡＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＴＧＧＣＧＴＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＣＴＧＡＴＧＡ
配列番号２７：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ４７
ＳＬＳＬＮＤＧＳＹＱＳＥＩＤＬＳＧＧＡＮＦＲＥＫＦＲＮＦＡＮＥＬＳＥＡＩＴＮＳＰＫＧＬＤＲＰＶＰＫＴＥＩＳＧＬＩＫＴＧＤＮＦＩＴＰＳＦＫＡＧＹＹＤＨＶＡＥＤＧＳＬＬＳＹＹＱＳＴＥＹＦＮＮＲＶＬＭＰＩＬＱＴＴＮＧＴＬＭＡＮＮＲＧＹＤＤＶＦＲＱＶＰＲＦＰＧＷＳＮＴＫＡＴＴＶＳＴＳＮＮＬＴＹＤＫＷＴＹＦＡＡＫＧＳＰＬＹＤＱＹＰＮＨＴＦＥＤＶＫＴＬＡＩＤＡＫＤＩＳＡＬＫＴＴＩＤＳＥＫＰＴＹＬＩＩＲＧＬＳＧＮＧＳＱＬＮＥＬＱＬＰＥＳＶＫＫＶＳＬＹＧＤＹＴＧＶＮＶＡＫＱＩＦＡＮＶＶＥＬＥＦＹＳＴＳＫＡＮＳＦＧＦＮＰＬＶＬＧＳＫＴＮＶＩＮＤＬＦＶＳＫＰＦＴＨＩＤＬＴＱＶＴＬＱＮＳＤＮＳＡＩＤＡＮＫＬＫＱＡＶＧＤＩＹＮＹＲＲＦＥＲＱＦＱＧＹＥＡＧＧＹＩＤＫＹＬＶＫＮＶＮＴＮＫＤＳＤＤＤＬＶＹＲＳＬＫＥＬＮＬＨＬＥＥＡＹＲＥＧＤＮＴＹＹＲＶＮＥＮＹＫＰＧＡＳＩＹＥＮＥＲＡＳＲＤＳＥＦＱＮＥＩＬＫＲＡＥＱＮＧＶＴＦＤＥＮ
配列番号２８：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ４８
ＳＬＳＬＮＤＧＳＹＱＳＥＩＤＬＳＧＧＡＮＦＲＥＫＦＲＮＦＡＮＥＬＳＥＡＩＴＮＳＰＫＧＬＤＲＰＶＰＫＴＥＩＳＧＬＩＫＴＧＤＮＦＩＴＰＳＦＫＡＧＹＹＤＨＶＡＥＤＧＳＬＬＳＹＹＱＳＴＥＹＦＮＮＲＶＬＭＰＩＬＱＴＴＮＧＴＬＭＡＮＮＲＧＹＤＤＶＦＲＱＶＰＲＦＰＧＷＣＮＴＫＰＴＴＶＳＴＳＮＮＬＴＹＤＫＷＴＹＦＡＣＫＧＳＰＬＹＤＱＹＰＮＨＴＦＥＤＶＫＴＬＡＩＤＡＫＤＩＳＡＬＫＴＴＩＤＳＥＫＰＴＹＬＩＩＲＧＬＳＧＤＧＳＱＬＮＥＬＱＬＰＥＳＶＫＫＶＳＬＹＧＤＹＴＧＶＮＶＡＫＱＩＦＡＮＶＶＥＬＥＦＹＳＴＳＫＡＮＳＦＧＦＮＰＬＶＬＧＳＫＴＮＶＩＮＤＬＦＶＳＫＰＦＴＨＩＤＬＴＱＶＰＬＱＮＳＤＮＳＡＩＤＡＮＫＬＫＱＡＶＧＤＩＹＮＹＲＲＦＥＲＱＦＱＧＹＦＡＧＧＹＩＤＫＹＬＶＫＮＶＮＴＮＫＤＳＤＤＤＬＶＹＲＳＬＫＥＬＮＬＨＬＥＥＡＹＲＥＧＤＮＴＹＹＲＶＮＥＮＹＹＰＧＡＳＩＹＥＮＥＲＡＳＲＤＳＥＦＱＮＥＩＬＫＲＡＥＱＮＧＶＴＦＤＥＮ
配列番号２９：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＧ４９
ＳＬＳＬＮＤＧＳＹＱＳＥＩＤＬＳＧＧＡＮＦＲＥＫＦＲＮＦＡＮＥＬＳＥＡＩＴＮＳＰＫＧＬＤＲＰＶＰＫＴＥＩＳＧＬＩＫＴＧＤＮＦＩＴＰＳＦＫＡＧＹＹＤＨＶＡＥＤＧＳＬＬＳＹＹＱＳＴＥＹＦＮＮＲＶＬＭＰＩＬＱＴＴＮＧＴＬＭＡＮＮＲＧＹＤＤＶＦＲＱＶＰＲＦＰＧＷＳＮＴＫＡＴＴＶＳＴＳＮＮＬＴＹＤＫＷＴＹＦＡＡＫＧＳＰＬＹＤＱＹＰＮＨＴＦＥＤＶＫＴＬＡＩＤＡＫＤＩＳＡＬＫＴＴＩＤＳＥＫＰＴＹＬＩＩＲＧＬＳＧＮＧＳＱＬＮＥＬＱＬＰＥＳＶＫＫＶＳＬＹＧＤＹＴＧＶＮＶＡＫＱＩＦＡＮＶＶＥＬＥＦＹＳＴＳＫＡＮＳＦＧＦＮＰＬＶＬＧＳＫＴＮＶＩＮＤＬＦＶＳＫＰＦＴＨＩＤＬＴＱＶＴＬＱＮＳＤＮＳＡＩＤＡＮＫＬＫＱＡＶＧＤＩＹＮＹＲＲＦＥＲＱＦＱＧＹＦＰＧＧＹＩＤＫＹＬＶＫＮＶＮＴＮＫＤＳＤＤＤＬＶＹＲＳＬＫＥＬＮＬＨＬＥＥＡＹＲＥＧＤＮＴＹＹＲＶＮＥＮＹＹＰＧＡＳＩＹＥＮＥＲＡＳＲＤＳＥＦＱＮＥＩＬＫＲＡＥＱＮＧＶＴＦＤＥＮ
配列番号３０：改変されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ ＭＰ２９
ＳＩＳＬＴＤＧＧＹＲＳＥＩＤＬＧＤＧＳＮＦＲＥＤＦＲＮＦＡＮＮＬＳＥＡＩＴＤＡＰＫＤＬＬＲＰＶＰＫＶＥＶＳＧＬＩＫＴＳＳＴＦＩＴＰＮＦＫＡＧＹＹＤＱＶＡＥＤＧＫＴＬＫＹＹＱＳＴＥＹＦＮＮＲＶＶＭＰＩＬＱＴＴＮＧＴＬＴＡＮＮＲＡＹＤＤＩＦＶＤＱＧＶＰＲＦＰＧＷＦＨＤＶＤＫＡＹＹＡＧＳＮＧＱＳＥＹＬＦＫＥＷＮＹＹＶＡＮＧＳＰＬＹＮＱＹＰＮＨＴＦＫＱＩＫＴＩＡＦＤＡＰＲＩＫＱＧＮＴＤＧＩＮＬＮＬＫＱＲＮＰＤＹＶＩＩＮＧＬＴＧＤＧＳＴＬＫＤＬＥＬＰＥＳＶＫＫＶＳＩＹＧＤＹＨＳＩＮＶＡＫＱＩＦＫＮＶＬＥＬＥＦＹＳＴＮＱＤＮＮＦＧＦＮＰＬＶＬＧＤＨＴＮＩＩＹＤＬＦＶＳＫＰＦＮＹＩＤＬＴＳＬＥＬＫＤＮＱＤＮＩＤＡＳＫＬＫＲＡＶＳＤＩＹＩＲＲＲＦＥＲＱＭＱＧＹＷＡＧＧＹＩＤＲＹＬＶＫＮＴＮＥＫＮＶＮＫＤＮＤＴＶＹＡＡＬＫＤＩＮＬＨＬＥＥＴＹＴＨＧＧＮＴＭＹＲＶＮＥＮＹＹＰＧＡＳＡＹＥＡＥＲＡＴＲＤＳＥＦＱＫＥＩＶＱＲ

Claims (90)

  1. 改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントであって、
    野生型マイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントと比較して、マイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントの熱安定性を増加または維持する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を有する、
    改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  2. 請求項１に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントであって、
    野生型マイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントと比較して、マイコプラズマ・プロテインＭまたは機能性フラグメントの熱安定性を増加させる１つまたは複数のアミノ酸突然変異を有する、
    改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  3. 請求項１または２に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントであって、
    Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍまたはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのプロテインＭに由来する、
    改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  4. 請求項１から３のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントであって、
    Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭの残基約７４～残基約４７９（配列番号３）またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基のフラグメントである、
    改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  5. 前記１つまたは複数の突然変異が、プロテインＭの抗体結合部位の５Å以内の残基（残基９５、９９、１０２、１０３、１０５、１０６、１０７、１０９、１１０、１１４、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１４４、１５８、１６０、１６１、１６２、１６３、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８６、１８７、１８８、１９１、３２１、３３８、３４０、３４１、３４５、３８１、３８４、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、４２６、４２７、４２９、４３６、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５２、４５３、４５５、４５６、４５７、４６２、４６６）にはない、またはＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の残基４６９～４７９のいずれかにはない、またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にはない、
    請求項１から４のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  6. 前記１つまたは複数の突然変異が、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の残基７８、８１、８３、８４、８５、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０８、１１１、１１２、１１３、１２２、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４２、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５３、１５４、１５５、１５６、１６４、１６７、１７０、１７５、１７６、１８４、１８５、１８９、１９２、１９３、１９６、１９８、２０１、２０２、２０４、２０５、２０６、２０７、２０９、２１１、２１５、２１８、２２０、２２４、２２５、２２６、２２７、２３１、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２４１、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４９、２５０、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６４、２６９、２７０、２７２、２７４、２７５、２７６、２７９、２８２、２８４、２８６、２８７、２８８、２９１、２９７、２９９、３００、３０２、３０３、３０４、３０５、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１３、３１７、３１８、３１９、３２０、３２２、３２６、３２７、３２９、３３１、３３２、３３３、３３５、３３７、３４２、３４３、３４７、３４８、３５１、３５４、３５５、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６７、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７８、３８５、３９９、４００、４０１、４０２、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１１、４１３、４１４、４１７、４１８、４１９、４２４、４２８、４３４、４３５、４４３、４５０、４５９、４６０、４６３、４６４、４６５、４６８、もしくはそれらの任意の組み合わせ、またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にある、
    請求項１から５のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  7. 前記１つまたは複数の突然変異が、表４に挙げられた突然変異またはそれらの任意の組み合わせである、請求項６に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  8. 前記１つまたは複数の突然変異が、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の残基８３、９０、９２、９４、１３７、１４２、１４７、１５０、１５６、１８４、１９６、１９８、２０５、２１１、２１５、２２５、２３１、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２４３、２４５、２５０、２５５、２５６、２５９、２６４、２７２、２７４、２７５、２７６、２７９、２８２、２９７、３００、３０２、３１０、３２０、３２６、３３１、３３２、３３５、３４２、３４３、３４７、３４８、３５５、３５７、３６１、３７１、３７４、３７８、３８５、４０１、４０２、４０９、４１３、４２４、４６０、４６３、４６４、４６８、もしくはそれらの任意の組み合わせ、またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にある、請求項１から５のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  9. 前記１つまたは複数の突然変異が、表５に挙げられた突然変異またはそれらの任意の組み合わせである、請求項８に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  10. 前記１つまたは複数の突然変異が、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の残基１５０、１９６、１９８、２０１、２０５、２２４、２３２、２３７、２７４、２８２、３４２、３５５、３７３、４００、４０２、４０７、４０９、４１３、１３５、もしくはそれらの任意の組み合わせ、またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にある、請求項１から５のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  11. 前記１つまたは複数の突然変異が、
    Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の、
    ａ）２３７；
    ｂ）２３２；
    ｃ）２８２；
    ｄ）１５０、１９６、１９８、４００、４０２、４０７、４０９；
    ｅ）４１３、４３５；
    ｆ）３７３、４００；
    ｇ）４０２、４０７、４０９、４１３；
    ｈ）３４２；
    ｉ）１５０、１９６、１９８、２３２、２３７、２８２、３４２、３７３、４００、４０２、４０７、４０９、４１３、４３５；
    ｊ）２７４；
    ｋ）１５０、１９６、１９８、２３２、２３７、３４２、４００、４０２、４０７、４０９；
    ｌ）３７３、４１３、４３５；
    ｍ）２０５；
    ｎ）３５５；
    ｏ）１５０、１９６、１９８、３４２、３７３、４００、４０２、４０７、４０９；
    ｐ）１５０、１９６、１９８、２３２、２３７、３４２、３７３、４００、４０２、４０７、４０９；
    ｑ）２０１、２２４；
    ｒ）１５０、１９６、１９８、２０１、２２４、２３２、２３７、３４２、４００、４０２、４０７、４０９；
    ｓ）１５０、１９６、１９８、２３２、２３７、３４２、３９０、４００、４０２、４０７、４０９、４４４；
    ｔ）１５０、１９６、１９８、２０１、２０５、２２４、２３２、２３７、２７４、３４２、３５５、４００、４０２、４０７、４０９；または
    ｕ）１５０、１９６、１９８、２３２、２３７、３４２、３９１、４００、４０２、４０７、４０９
    から選択される残基、
    またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にある、
    請求項１０に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント
  12. 前記１つまたは複数の突然変異が、
    Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の、
    ａ）Ｆ２３７Ｔ；
    ｂ）Ｓ２３２Ｑ；
    ｃ）Ｑ２８２Ｄ；
    ｄ）Ｓ１５０Ｅ、Ｓ１９６Ｒ、Ｓ１９８Ｐ、Ｖ４００Ｉ、Ｎ４０２Ｉ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ；
    ｅ）Ｌ４１３Ｉ、Ｔ４３５Ｉ；
    ｆ）Ｖ３７３Ｉ、Ｖ４００Ｉ；
    ｇ）Ｎ４０２Ｌ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ、Ｌ４１３Ｉ；
    ｈ）Ａ３４２Ｖ；
    ｉ）Ｓ１５０Ｅ、Ｓ１９６Ｒ、Ｓ１９８Ｐ、Ｓ２３２Ｑ、Ｆ２３７Ｔ、Ｑ２８２Ｄ、Ａ３４２Ｖ、Ｖ３７３Ｉ、Ｖ４００Ｉ、Ｎ４０２Ｉ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ、Ｌ４１３Ｉ、Ｔ４３５Ｉ；
    ｊ）Ｎ２７４Ｄ；
    ｋ）Ｓ１５０Ｅ、Ｓ１９６Ｒ、Ｓ１９８Ｐ、Ｓ２３２Ｑ、Ｆ２３７Ｔ、Ａ３４２Ｖ、Ｖ４００Ｉ、Ｎ４０２Ｉ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ；
    ｌ）Ｖ３７３Ｉ、Ｌ４１３Ｉ、Ｔ４３５Ｉ；
    ｍ）Ａ２０５Ｐ；
    ｎ）Ｔ３５５Ｄ；
    ｏ）Ｔ３５５Ｐ；
    ｐ）Ｓ１５０Ｅ、Ｓ１９６Ｒ、Ｓ１９８Ｐ、Ａ３４２Ｖ、Ｖ３７３Ｉ、Ｖ４００Ｉ、Ｎ４０２Ｉ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ；
    ｑ）１５０、１９６、１９８、２３２、２３７、３４２、３７３、４００、４０２、４０７、４０９；
    ｒ）Ｓ２０１Ｃ、Ａ２２４Ｃ；
    ｓ）Ｓ１５０Ｅ、Ｓ１９６Ｒ、Ｓ１９８Ｐ、Ｓ２０１Ｃ、Ａ２２４Ｃ、Ｓ２３２Ｑ、Ｆ２３７Ｔ、Ａ３４２Ｖ、Ｖ４００Ｉ、Ｎ４０２Ｉ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ；
    ｔ）Ｓ１５０Ｅ、Ｓ１９６Ｒ、Ｓ１９８Ｐ、Ｓ２３２Ｑ、Ｆ２３７Ｔ、Ａ３４２Ｖ、Ｆ３９０Ｅ、Ｖ４００Ｉ、Ｎ４０２Ｉ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ Ｙ４４４Ｋ；
    ｕ）Ｓ１５０Ｅ、Ｓ１９６Ｒ、Ｓ１９８Ｐ、Ｓ２０１Ｃ、Ａ２０５Ｐ、Ａ２２４Ｃ、Ｓ２３２Ｑ、Ｆ２３７Ｔ、Ｎ２７４Ｄ、Ａ３４２Ｖ、Ｔ３５５Ｐ、Ｖ４００Ｉ、Ｎ４０２Ｉ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ；または
    ｖ）Ｓ１５０Ｅ、Ｓ１９６Ｒ、Ｓ１９８Ｐ、Ｓ２３２Ｑ、Ｆ２３７Ｔ、Ａ３４２Ｖ、Ａ３９１Ｐ、Ｖ４００Ｉ、Ｎ４０２Ｉ、Ｋ４０７Ｐ、Ｓ４０９Ｖ
    またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基
    から選択される、請求項１１に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  13. 前記１つまたは複数の突然変異が、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の残基１５５、２０３、２４３、２４８、および３５８にある、請求項１から５のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  14. 前記１つまたは複数の突然変異が、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）のＡ１５５Ｅ、Ｋ２０３Ｒ、Ｈ２４３Ｔ、Ｖ２４８Ｑ、およびＡ３５８Ｖである、請求項１３に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  15. 前記１つまたは複数の突然変異が、
    Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の、
    ａ）４６８；
    ｂ）１５０；
    ｃ）１４７；
    ｄ）２７２；
    ｅ）３５５；
    ｆ）２７６、２７７、２７９；
    ｇ）３００；
    ｈ）３７８；
    ｉ）１５６；
    ｊ）２３２；
    ｋ）２４５；
    ｌ）２７６；
    ｍ）２２５；または
    ｎ）３１０
    から選択される残基、
    またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にある、請求項１から５のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  16. 前記１つまたは複数の突然変異が、
    Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の、
    ａ）Ｒ４６８Ｑ；
    ｂ）Ｓ１５０Ｅ；
    ｃ）Ｈ１４７Ｆ；
    ｄ）Ｓ２７２Ｇ；
    ｅ）Ｔ３５５Ｇ；
    ｆ）Ｓ２７６Ｅ、Ｑ２７７Ｌ、Ｎ２７９Ｒ；
    ｇ）Ｎ３００Ｑ；
    ｈ）Ｎ３７８Ｙ；
    ｉ）Ｓ１５６Ｋ；
    ｊ）Ｓ２３２Ｌ；
    ｋ）Ａ２４５Ｑ；
    ｌ）Ｓ２７６Ｄ；
    ｍ）Ｋ２２５Ｐ；または
    ｎ）Ｖ３１０Ｅ
    またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基
    から選択される、請求項１５に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  17. 前記改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントが、さらに改変されて１つまたは複数のグリコシル化部位が除去されている、請求項１から１６のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  18. 前記改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントが、さらに改変されて１つまたは複数のグリコシル化部位が付加されている、請求項１から１６のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  19. 前記改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントの、抗体に対する親和性を高める１つまたは複数の突然変異をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  20. 前記１つまたは複数の突然変異が、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の残基９５、１０２、１０３、１０６、１０７、１１４、１１６、１６０、１６１、１６２、１６３、１８１、１８６、３２１、３８１、３８４、３８９、３９０、３９１、３９６、３９７、４２６、４２９、４３６、４３８、４３９、４４１、４４２、４４７、４４８、４４９、４５２、４５３、４５５、４５６、４６２、もしくは４６６、またはそれらの任意の組み合わせ、または、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にある、請求項１９に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  21. 前記１つまたは複数の突然変異が、表６に挙げられた突然変異またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２０に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  22. 前記１つまたは複数の突然変異が、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の残基９５、１０３、１１６、１８６、３２１、３８９、４２９、４４２、もしくは４６６、またはそれらの任意の組み合わせ、またはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にある、請求項１９に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  23. 前記１つまたは複数の突然変異が、表７に挙げられた突然変異またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２２に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  24. 前記改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントの、抗体に対する親和性を減少させる１つまたは複数の突然変異をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  25. 前記１つまたは複数の突然変異が、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）の残基３９０および／または４４４、または、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプロテインＭ（配列番号２３）の相当する残基にある、請求項１９に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  26. 前記１つまたは複数の突然変異が３９０Ｅおよび／またはＹ４４４Ｋである、請求項２５に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  27. Ｎ末端に分泌ペプチドをさらに含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  28. 請求項１から２７のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
  29. プロモーターに動作可能に連結された、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
  30. 前記プロモーターが細菌プロモーターである、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
  31. 前記プロモーターが哺乳類プロモーターである、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
  32. 前記ポリヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌における発現のためにコドン最適化されている、請求項２８から３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  33. 前記ポリヌクレオチドが、ヒト細胞などの哺乳類細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項２８から３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  34. 前記ポリヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌およびヒト細胞などの哺乳類細胞の両方における発現のためにコドン最適化されている、請求項２８から３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  35. 請求項２８から３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  36. 前記ベクターが細菌ベクターである、請求項３５に記載のベクター。
  37. 前記ベクターが哺乳類ベクターである、請求項３５に記載のベクター。
  38. 請求項２８から３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項３５から３７のいずれか一項に記載のベクターを含む、形質転換された細胞。
  39. Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞である、請求項３８に記載の形質転換された細胞。
  40. ヒト細胞などの哺乳類細胞である、請求項３８に記載の形質転換された細胞。
  41. 請求項３８から４０のいずれか一項に記載の形質転換された細胞であって、前記ポリヌクレオチドが前記細胞のゲノムに安定的に組み込まれている、形質転換された細胞。
  42. 異種薬剤を対象へ投与した際の中和抗体による前記異種薬剤の中和を阻害する方法であって、
    前記対象へ有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を投与するステップを含み、それにより前記異種薬剤の中和を阻害する、
    方法。
  43. 前記異種薬剤が核酸送達ベクターである、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記核酸送達ベクターがウイルスベクターである、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、またはアデノウイルスベクターである、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記核酸送達ベクターが非ウイルスベクターである、請求項４３に記載の方法。
  47. 前記非ウイルスベクターが、プラスミド、リポソーム、荷電脂質、核酸－タンパク質複合体、または生体高分子である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記異種薬剤が遺伝子編集複合体である、請求項４２に記載の方法。
  49. 前記遺伝子編集複合体がＣＲＩＳＰＲ複合体である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記異種薬剤がタンパク質または核酸である、請求項４２に記載の方法。
  51. 前記タンパク質が酵素である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記核酸がアンチセンス核酸または阻害性ＲＮＡである、請求項５０に記載の方法。
  53. 請求項４２から５２のいずれか一項に記載の方法であって、
    プロテインＭの前記有効量は、中和を少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、９９．５％、または９９．９％阻害するのに十分な量である、
    方法。
  54. 請求項４２から５３のいずれか一項に記載の方法であって、
    プロテインＭの前記有効量は、前記対象における総免疫グロブリンに対するプロテインＭの比が、モル基準で約０．５：１～約８：１、例えば約２：１となるのに十分な量である、
    方法。
  55. 前記プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体が、前記異種薬剤の投与前に前記対象へ投与される、請求項４２から５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体が、前記異種薬剤の投与と同時に前記対象へ投与される、請求項４２から５４のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記異種薬剤が、前記対象への投与前に、前記プロテインＭまたはそのフラグメントまたは誘導体と組み合わされる、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体が、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、またはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ由来である、請求項４２から５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体が、プロテインＭフラグメントである、請求項４２から５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記プロテインＭの機能性フラグメントが、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプロテインＭ（配列番号１）のアミノ酸残基１７～５３７、３７～５５６、３７～４８２、３７～４６８、３７～４４２、７４～４６８、７４～４７９、７４～４８２、７４～４６８、７４～４４２、または７４～５５６、または、別のプロテインＭ由来の相当する残基を含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体が、請求項１から２４のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントである、請求項４２から６０のいずれか一項に記載の方法
  62. 前記プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体が、前記対象へ１回よりも多く投与される、請求項４２から６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記異種薬剤が前記対象へ投与される都度（ｅａｃｈ ｔｉｍｅ）、前記プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体が前記対象へ投与される、請求項６２に記載の方法。
  64. 同一のプロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体がその都度（ｅａｃｈ ｔｉｍｅ）投与される、請求項６２または６３に記載の方法。
  65. 異なるプロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体がその都度投与される、請求項６２または６３に記載の方法。
  66. 前記対象における抗体濃度を減少させるための追加の処置を前記対象へ施すステップをさらに含む、請求項４２から６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記追加の処置が、血漿交換法、ＩｄｅＳもしくはＩｄｅＺのような抗体消化酵素の投与、脾摘出術、化学療法、免疫療法、または放射線療法である、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記追加の処置が、前記プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体の投与前、投与中、および／または投与後に施される、請求項６６または６７に記載の方法。
  69. 対象においてポリペプチドまたは機能性核酸を発現する方法であって、
    前記対象に、（ａ）前記ポリペプチドまたは機能性核酸をコードする核酸送達ベクター、および（ｂ）有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を投与するステップを含み、
    それにより、前記対象において前記ポリペプチドまたは機能性核酸を発現する。
    方法。
  70. それを必要とする対象における障害を処置する方法であって、
    前記障害が、前記対象においてポリペプチドまたは機能性核酸を発現することによって処置可能であり、
    前記対象に、（ａ）前記ポリペプチドまたは機能性核酸をコードする、治療的に有効量の核酸送達ベクター、および（ｂ）有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を投与するステップを含み、
    それにより前記対象における前記障害を処置する、
    方法。
  71. 対象における遺伝子を編集する方法であって、
    前記対象に、（ａ）有効量の遺伝子編集複合体、および（ｂ）有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を投与するステップを含み、
    それにより、前記対象においてポリペプチドまたは機能性核酸を発現する、
    方法。
  72. それを必要とする対象における自己免疫疾患を処置する方法であって、
    治療的に有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を前記対象へ投与するステップを含み、
    それにより前記自己免疫疾患を処置する、
    方法。
  73. それを必要とする対象における過剰抗体と関連する障害を処置する方法であって、治療的に有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を前記対象へ投与するステップを含み、それにより過剰抗体と関連する前記障害を処置する、
    方法。
  74. 過剰抗体と関連する前記障害が、多発性骨髄腫、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）、またはワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症である、請求項７３に記載の方法。
  75. それを必要とする対象において抗体を急性的に阻害する方法であって、
    治療的に有効量のマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体を前記対象へ投与するステップを含み、
    それにより抗体を急性的に阻害する、
    方法。
  76. 前記対象が、サイトカイン放出症候群または急性自己免疫性発作、例えば、突然発症する重度の自己免疫性血管炎を有する、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体が、請求項１から２７のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントである、請求項６９から７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記マイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体が、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入、口腔（例えば舌下）、膣、髄腔内、眼球内、硝子体内、蝸牛内、経皮、内皮内、子宮内（または胚内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内［骨格筋、横隔膜および／または心筋への投与を含む］、胸膜内、脳内、および関節内）、局所（例えば、皮膚および粘膜表面（気道表面を含む）の両方、および経皮投与）、リンパ内など、ならびに直接的な組織または臓器注入（例えば、肝臓、眼、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳）から選択される経路によって、前記対象へ投与される、請求項４２から７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記マイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体が、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、肺、眼、または耳へ投与される、請求項４２から７７のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記マイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントまたは誘導体が、病変組織または臓器へ投与される、請求項４２から７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記対象がヒトである、請求項４２から８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 試料から、抗体軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む化合物を単離する方法であって、
    前記化合物を、固体支持体に付着された請求項１から２７のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントと接触させて、それから、前記化合物を前記改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントから溶出させるステップを含む、
    方法。
  83. 抗体軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む前記化合物が、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記固体支持体がビーズまたは粒子である、請求項８２または８３に記載の方法。
  85. 前記固体支持体が、アガロース、ポリアクリルアミド、デキストラン、セルロース、多糖類、ニトロセルロース、シリカ、アルミナ、酸化アルミニウム、チタニア、酸化チタン、ジルコニア、スチレン、ポリビニルジフルオリドナイロン、スチレンおよびジビニルベンゼンの共重合体、ポリメタクリレートエステル、誘導体化アズラクトンポリマーもしくは共重合体、ガラス、またはセルロースを含む、請求項８２から８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記化合物がｐＨの変化によって溶出する、請求項８２から８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 固体支持体に付着された、請求項１から２７のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメント。
  88. 免疫測定法を行なう方法であって、
    請求項１から２７のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントを用いて、抗体軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む化合物を結合するステップを含む、
    方法。
  89. 前記免疫測定法が、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）アッセイ、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチアッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、免疫蛍光アッセイ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）アッセイ、免疫組織化学アッセイ、プロテインＡ免疫測定法、プロテインＧ免疫測定法、プロテインＬ免疫測定法、ビオチン／アビジンアッセイ、ビオチン／ストレプトアビジンアッセイ、免疫電気泳動アッセイ、沈殿／フロキュレーション反応、免疫ブロット（ウエスタンブロット；ドット／スロット・ブロット）；免疫拡散アッセイ；リポソーム免疫測定法、化学発光アッセイ、ライブラリースクリーニング、発現アレイ、免疫沈降、競合結合アッセイ、および免疫組織化学染色から選択される、請求項８８に記載の方法。
  90. 請求項１から２７または８７のいずれか一項に記載の改変されたマイコプラズマ・プロテインＭまたはその機能性フラグメントを含む、キット。
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