KR20240042489A - Nd4 돌연변이에 의해 야기되는 레베르 유전성 시신경병증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Nd4 돌연변이에 의해 야기되는 레베르 유전성 시신경병증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 미토콘드리아 단백질 암호화 서열, 3' UTR 핵산 서열 및 폴리A 신호 서열을 포함하는, 재조합 핵산이 제공된다. 또한 재조합 핵산을 포함하는 약제학적 조성물 및 약제학적 조성물을 이용하여 레베르 유전성 시신경병증(LHON)을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

ND4 돌연변이에 의해 야기되는 레베르 유전성 시신경병증을 치료하기 위한 조성물 및 방법
본 발명은 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 재조합 핵산 및 이와 관련된 약제학적 조성물, 및 레베르 유전성 시신경병증과 같은 안질환을 치료하기 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
레베르 유전성 시신경병증(LHON)은 망막 신경절 세포(retinal ganglion cell: RGC) 및 이의 축삭돌기의 미토콘드리아 유전 변성(모체로부터 자손으로 계대됨)이며, 이는 급성 또는 아급성 중심 시력 손실을 초래한다. 이는 주로 젊은 성인 남성에게 영향을 미친다. LHON은 (핵보다는) 미토콘드리아 게놈에서의 돌연변이에 의해 주로 야기되고 난자만이 배아에 대한 미토콘드리아에 기여하기 때문에, 모체를 통해서만 전달된다. LHON은 보통 병원성 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 3점 돌연변이 중 하나에 의해 야기된다. 해당 돌연변이는 각각 미토콘드리아의 산화적 인산화 사슬의 복합체 I의 NADH 탈수소효소 서브유닛-4 단백질(ND 4), NADH 탈수소효소 서브유닛-1 단백질(ND 1) 및 NADH 탈수소효소 서브유닛-6 단백질(ND 6) 서브유닛 유전자에서 뉴클레오타이드 위치 11778번의 G에서 A로(G11778A), 3460번의 G에서 A로(G3460A) 그리고 14484번의 T에서 C로의(T14484C) 돌연변이이다. 각각의 돌연변이는 영구적인 시력 손실의 상당한 위험을 지니는 것으로 간주된다. LHON은 보통 양안시력이 0.1 미만으로 악화될 때까지 몇 주의 기간에 걸쳐 통증 없이 진행되며, 이는 환자의 삶의 질에 심각하게 영향을 미친다. 두 LHON 돌연변이체, 즉, G3460A 및 T14484C는 환자 혈소판으로부터 단리된 미토콘드리아 NADH 탈수소효소 활성의 80% 감소를 초래한다. 중국 LHON 환자의 90%는 G11778A 돌연변이를 지닌다. G11778A 돌연변이는 ND4 단백질에서 아르기닌을 히스티딘으로 변화시켜, LHON 환자의 기능장애 및 시신경 손상을 초래한다. 따라서, LHON을 치료하기 위한 개선된 형질감염 효율 및 치료 효능을 갖는 조성물 및 방법을 개발할 필요가 있다.
(5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로) 미토콘드리아 표적화 서열 및 미토콘드리아 단백질 암호화 서열을 포함하는 재조합 핵산으로서; 선택적으로, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 ND4 단백질을 암호화하고; 선택적으로, 상기 ND4 단백질은 서열번호 160과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 핵산이 본 명세서에 개시된다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 서열번호 180 및 174 내지 176에 제시된 바와 같은 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 서열번호 180과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 서열번호 180에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 미토콘드리아 표적화 서열의 5' 말단 앞에 위치된 Kozak 서열을 포함하고; 선택적으로, Kozak 서열은 서열번호 171이며; 선택적으로, Kozak 서열과 미토콘드리아 표적화 서열 사이에 여분의 뉴클레오타이드가 존재하지 않는다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 인트론 서열을 포함하되, 선택적으로, 상기 인트론 서열은 상기 미토콘드리아 표적화 서열의 5' 말단 앞에 위치되고; 선택적으로, 상기 인트론 서열은 상기 Kozak 서열의 5' 말단 앞에 위치되고; 선택적으로, 상기 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 프로모터 서열을 포함하되; 선택적으로, 상기 프로모터 서열은 상기 미토콘드리아 표적화 서열, 상기 Kozak 서열 및/또는 상기 인트론 서열의 5' 말단 앞에 위치되고; 선택적으로, 상기 프로모터 서열은 서열번호 169에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 3' UTR 서열을 포함하되, 선택적으로, 상기 3' UTR 서열은 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열의 3' 말단 뒤에 위치되고; 선택적으로, 상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 폴리A 신호 서열을 포함하되; 선택적으로, 상기 폴리A 신호 서열은 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열의 3' 말단 및/또는 상기 3' UTR 서열 뒤에 위치되고; 선택적으로, 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 172 또는 173에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 선택적으로, 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 173에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 3' UTR 서열과 상기 폴리A 신호 서열 사이에 서열번호 185에 제시된 바와 같은 스페이서 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 제1 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR) 서열 및 제2 ITR 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 ITR 서열은 서열번호 178에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 ITR 서열은 서열번호 179에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
(5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로) 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열, 3' UTR 서열 및 폴리A 신호 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본 명세서에 개시되되, 폴리A 신호 서열은 서열번호 173에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산의 전사에 의해 생성된 미토콘드리아 단백질 암호화 서열을 포함하는 mRNA는 폴리A 신호 서열이 없는 대조군 재조합 핵산의 mRNA보다 더 높은 발현 수준을 갖고; 바람직하게는, 대조군 재조합 핵산의 mRNA보다 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200% 또는 적어도 300% 더 높은 발현 수준을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대조군 재조합 핵산은 폴리A 신호 서열의 위치에서 서열번호 172를 포함하는 서열로 치환되고; 바람직하게는, 재조합 핵산의 전사에 의해 생성된 mRNA는 대조군 재조합 핵산에 의해 생성된 mRNA보다 적어도 10%, 적어도 15% 또는 적어도 20% 더 높은 발현 수준을 갖는다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산의 번역에 의해 생성된 미토콘드리아 단백질은 폴리A 신호 서열이 없는 대조군 재조합 핵산의 미토콘드리아 단백질보다 더 높은 발현 수준을 갖고; 바람직하게는, 대조군 재조합 핵산의 미토콘드리아 단백질보다 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200% 또는 적어도 300% 더 높은 발현 수준을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대조군 재조합 핵산은 폴리A 신호 서열의 위치에서 서열번호 172를 포함하는 서열로 치환되고; 바람직하게는, 재조합 핵산의 번역에 의해 생성된 미토콘드리아 단백질은 대조군 재조합 핵산에 의해 생성된 미토콘드리아 단백질보다 적어도 10%, 적어도 15% 또는 적어도 20% 더 높은 발현 수준을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴리A 신호 서열은 122개 이하의 염기쌍, 125개 이하의 염기쌍, 130개 이하의 염기쌍, 140개 이하의 염기쌍, 150개 이하의 염기쌍, 160개 이하의 염기쌍, 170개 이하의 염기쌍, 180개 이하의 염기쌍, 190개 이하의 염기쌍 또는 200개 이하의 염기쌍의 길이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 미토콘드리아 표적화 서열의 5' 말단 앞에 위치된 Kozak 서열을 포함하고; 선택적으로, Kozak 서열은 서열번호 171이며; 선택적으로, Kozak 서열과 미토콘드리아 표적화 서열 사이에 여분의 뉴클레오타이드가 존재하지 않는다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 3' UTR 서열과 상기 폴리A 신호 서열 사이에 서열번호 185에 제시된 바와 같은 스페이서 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
(5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로) Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열 및 3' UTR 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본 명세서에 개시되되, Kozak 서열은 서열번호 171이고; 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; Kozak 서열과 미토콘드리아 표적화 서열 사이에 여분의 뉴클레오타이드가 존재하지 않는다.
일부 실시형태에서, 폴리A 신호 서열을 포함하되, 폴리A 신호 서열은 서열번호 172 또는 173에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 인트론 서열을 포함하고; 선택적으로, 인트론 서열은 Kozak 서열의 5' 말단 앞에 위치되며; 선택적으로, 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 프로모터 서열을 포함하고; 선택적으로 프로모터 서열은 서열번호 169에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터 서열은 상기 인트론 서열의 5' 말단 앞에 위치된다.
(5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로) 프로모터 서열, 인트론 서열, Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열 및 미토콘드리아 단백질 암호화 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본 명세서에 개시되며; 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 선택적으로, 재조합 핵산은 3' UTR 서열을 추가로 포함하며; 선택적으로, 재조합 핵산은 폴리A 신호 서열을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 제1 역위 말단 반복부(ITR) 서열 및 제2 ITR 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 ITR 서열은 서열번호 178에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 ITR 서열은 서열번호 179에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열과 상기 3' UTR 서열 사이에 여분의 뉴클레오타이드가 존재하지 않는다.
일부 실시형태에서, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 미토콘드리아 표적화 서열과 미토콘드리아 단백질 암호화 서열 사이에 여분의 뉴클레오타이드가 존재하지 않는다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로) 제1 ITR 서열, 프로모터 서열, 인트론 서열, Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열, 3' UTR 서열, 폴리A 신호 서열 및 제2 ITR 서열을 포함하고; 바람직하게는, 상기 제1 ITR 서열은 서열번호 178에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 프로모터 서열은 서열번호 169에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; Kozak 서열은 서열번호 171을 포함하며; 상기 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 173에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 그리고 상기 제2 ITR 서열은 서열번호 179에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로) 제1 ITR 서열, 프로모터 서열, 인트론 서열, Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열, 3' UTR 서열, 폴리A 신호 서열 및 제2 ITR 서열을 포함하고; 바람직하게는, 상기 제1 ITR 서열은 서열번호 178에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 프로모터 서열은 서열번호 169에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 Kozak 서열은 서열번호 171이고; 상기 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 173에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 그리고 상기 제2 ITR 서열은 서열번호 179에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로) 제1 ITR 서열, 프로모터 서열, 인트론 서열, Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열, 3' UTR 서열, 폴리A 신호 서열 및 제2 ITR 서열을 포함하고; 바람직하게는, 상기 제1 ITR 서열은 서열번호 178에 제시된 바와 같은 서열을 포함하며; 상기 프로모터 서열은 서열번호 169에 제시된 바와 같은 서열을 포함하고; 상기 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 바와 같은 서열을 포함하며; 상기 Kozak 서열은 서열번호 171이고; 상기 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열을 포함하며; 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하고; 상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하며; 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 173에 제시된 바와 같은 서열을 포함하고; 그리고 상기 제2 ITR 서열은 서열번호 179에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 서열번호 174 내지 176 및 180에 제시된 바와 같은 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 서열번호 180과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 서열번호 180에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 재조합 핵산을 포함하는 바이러스 벡터가 본 명세서에 개시된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 rAAV2 벡터이다.
본 명세서에 기재된 재조합 핵산을 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 개시된다. 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 개시된다. 본 명세서에 기재된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 개시된다.
본 명세서에 기재된 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 개시된다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 아데노-연관 바이러스(AAV)이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 본 명세서에 기재된 재조합 핵산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 이의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 인산염 완충 식염수(PBS), α,α-트레할로스 탈수화물, L-히스티딘 하이드로클로라이드 일수화물, 폴리솔베이트 20, NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, 폴록사머 188 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 인산염 완충 식염수(PBS), α,α-트레할로스 탈수화물, L-히스티딘 하이드로클로라이드 일수화물, 폴리솔베이트 20, NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, 폴록사머 188 및 이들의 임의의 조합물로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 폴록사머 188을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 0.0001% 내지 0.01%의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 0.001%의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 하나 이상의 염을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 염은 NaCl, Na2HPO4 및 KH2PO4를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은, a) 5 내지 15㎎/㎖ 농도의 NaCl; 바람직하게는, 9㎎/㎖ 농도의 NaCl; b) 0.1 내지 0.5㎎/㎖ 농도의 KH2PO4; 바람직하게는, 0.144㎎/㎖ 농도의 KH2PO4; 및/또는 및/또는 c) 0.5 내지 1㎎/㎖ 농도의 Na2HPO4; 바람직하게는, 0.795㎎/㎖ 농도의 Na2HPO4를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 pH가 7.2 내지 7.4이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 pH가 7.3이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 바이러스 역가가 적어도 1.0×1010 vg/㎖, 적어도 3.0×1010 vg/㎖ 또는 적어도 6.0×1010 vg/㎖이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 바이러스 역가가 적어도 9.0×1010 vg/㎖이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 냉동/해동 주기 전의 바이러스 역가에 비해서 5회의 냉동/해동 주기 후에 바이러스 역가의 적어도 60%를 유지한다.
안질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 용도가 본 명세서에 개시된다.
유효량의 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 치료 방법이 본 명세서에 개시된다.
일부 실시형태에서, 안질환은 레베르 유전성 시신경병증(LHON)이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 안구내 또는 유리체내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 유리체내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 0.01 내지 0.1㎖의 약제학적 조성물은 각각의 눈에 투여된다. 일부 실시형태에서, 0.045 내지 0.055㎖의 약제학적 조성물은 각각의 눈에 투여된다. 일부 실시형태에서, 아데노-연관 바이러스는 적어도 1.5×109 vg/눈의 용량으로 투여되고; 바람직하게는, 상기 아데노-연관 바이러스는 적어도 3.0×109 vg/눈의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 아데노-연관 바이러스는 적어도 4.5×109 vg/눈의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 상기 용도 또는 방법은 코르티코스테로이드를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 프레드니손 또는 메틸프레드니솔론을 포함한다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 프레드니손이다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 상기 약제학적 조성물의 투여의 약 2일 전에 시작해서 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 경구 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는 투여를 시작한 후 약 28일 동안 연속 투여된다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 투여를 시작한 후 매일 투여되고, 매주 연속 투여된 후에 감소되는 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 코르티코스테로이드는, 투여 시작 시 1주 동안 매일 40㎎, 이어서, 1주 동안 매일 30㎎, 이어서, 1주 동안 매일 20㎎ 및 마지막에 1주 동안 매일 10㎎의 투약량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 상기 용도 또는 방법은 크레아틴 인산나트륨을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 크레아틴 인산나트륨은 정맥내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 상기 재조합 핵산이 없는 약제학적 조성물의 투여에 비해서 더 높은 평균 시력 회복 수준을 초래한다.
다른 양상에서, 재조합 핵산, 약제학적 조성물 및 LHON의 치료 방법이 본 명세서에 개시된다.
일 양상에서, 미토콘드리아 표적화 서열; 서열번호 7, 8, 10 및 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 미토콘드리아 단백질 암호화 서열; 및 3' UTR 핵산 서열을 포함하는, 재조합 핵산이 본 명세서에 개시된다.
일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 129 내지 159로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 2에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 3에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 4에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 5에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 7 또는 8에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 10에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 12에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 서열번호 111 내지 125로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 서열번호 13 또는 서열번호 14에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 서열번호 17 내지 20, 23 내지 24, 27 내지 28, 31 내지 34, 37 내지 38, 41 내지 42, 45 내지 48, 51 내지 52, 55 내지 56, 59 내지 62, 65 내지 66, 69 내지 70, 73 내지 76, 79 내지 80 및 83 내지 84로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 서열번호 2, 3, 4 및 5로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 미토콘드리아 표적화 서열; 미토콘드리아 단백질 암호화 서열로서, 미토콘드리아 단백질을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열; 및 3' UTR 핵산 서열을 포함하는, 재조합 핵산이 본 명세서에 개시된다.
일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 2에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 3에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 4에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 5에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 NADH 탈수소효소 4(ND4), NADH 탈수소효소 6(ND6), NADH 탈수소효소 1(ND1) 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 NADH 탈수소효소 4(ND4) 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 서열번호 160에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 펩타이드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6, 7 또는 8에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 NADH 탈수소효소 6(ND6) 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 서열번호 161에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 9 또는 10에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 NADH 탈수소효소 1(ND1) 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 서열번호 162에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 11 또는 12에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 미토콘드리아 표적화 서열의 3' 말단에 위치된다. 일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 hsACO2, hsATP5B, hsAK2, hsALDH2, hsCOX10, hsUQCRFS1, hsNDUFV1, hsNDUFV2, hsSOD2, hsCOX6c, hsIRP1, hsMRPS12, hsATP5J2, rnSOD2 및 hsOXA1L로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 서열번호 111 내지 125로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 서열번호 13 또는 서열번호 14에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 3' UTR 핵산 서열의 5' 말단에 위치된다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 미토콘드리아 표적화 서열의 3' 말단에 위치된다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 서열번호 29 내지 84로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 미토콘드리아 표적화 서열; 서열번호 7, 8, 10 및 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 미토콘드리아 단백질 암호화 서열; 및 3' UTR 핵산 서열을 포함하는, 재조합 핵산이 본 명세서에 개시된다.
일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 hsCOX10, hsCOX8, scRPM2, lcSirt5, tbNDUS7, ncQCR2, hsATP5G2, hsLACTB, spilv1, gmCOX2, crATP6, hsOPA1, hsSDHD, hsADCK3, osP0644B06.24-2, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) ATP9 (ncATP9), hsGHITM, hsNDUFAB1, hsATP5G3, crATP6_hsADCK3, ncATP9_ncATP9, zmLOC100282174, ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_ncATP9, zmLOC100282174_hsADCK3_crATP6_hsATP5G3, zmLOC100282174_hsADCK3_hsATP5G3, ncATP9_zmLOC100282174, hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6_hsATP5G3, crATP6_hsADCK3_zmLOC100282174_hsATP5G3, hsADCK3_zmLOC100282174, hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6, ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_GNFP_ncATP9 및 ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_lcSirt5_osP0644B06.24-2_hsATP5G2_ncATP9로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 129 내지 159로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 2 또는 3에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 4에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 5에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 7 또는 8에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 10에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 12에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 미토콘드리아 표적화 서열의 3' 말단에 위치된다. 일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 hsACO2, hsATP5B, hsAK2, hsALDH2, hsCOX10, hsUQCRFS1, hsNDUFV1, hsNDUFV2, hsSOD2, hsCOX6c, hsIRP1, hsMRPS12, hsATP5J2, rnSOD2 및 hsOXA1L로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 서열번호 111 내지 125로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 서열번호 13 또는 서열번호 14에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 3' UTR 핵산 서열의 5' 말단에 위치된다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 미토콘드리아 표적화 서열의 3' 말단에 위치된다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 서열번호 17 내지 20, 23 내지 24, 27 내지 28, 31 내지 34, 37 내지 38, 41 내지 42, 45 내지 48, 51 내지 52, 55 내지 56, 59 내지 62, 65 내지 66, 69 내지 70, 73 내지 76, 79 내지 80 및 83 내지 84로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 서열번호 2, 3 및 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 미토콘드리아 표적화 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본 명세서에 개시된다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 2에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 3에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 4에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 미토콘드리아 단백질 암호화 서열을 더 포함하되, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 미토콘드리아 단백질을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 NADH 탈수소효소 4(ND4), NADH 탈수소효소 6(ND6), NADH 탈수소효소 1(ND1) 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 NADH 탈수소효소 4(ND4) 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 서열번호 160에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 펩타이드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6, 7 또는 8에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 NADH 탈수소효소 6(ND6) 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 서열번호 161에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 9 또는 10에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 NADH 탈수소효소 1(ND1) 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질은 서열번호 162에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 11 또는 12에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 3' UTR 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 미토콘드리아 표적화 서열의 3' 말단에 위치된다. 일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 hsACO2, hsATP5B, hsAK2, hsALDH2, hsCOX10, hsUQCRFS1, hsNDUFV1, hsNDUFV2, hsSOD2, hsCOX6c, hsIRP1, hsMRPS12, hsATP5J2, rnSOD2 및 hsOXA1L로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 서열번호 111 내지 125로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 서열번호 13 또는 서열번호 14에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 3' UTR 핵산 서열의 5' 말단에 위치된다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 미토콘드리아 표적화 서열의 3' 말단에 위치된다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 서열번호 29 내지 70으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본 명세서에 개시되되, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 미토콘드리아 단백질을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하고, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 7, 8, 10 및 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 미토콘드리아 표적화 서열을 더 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 hsCOX10, hsCOX8, scRPM2, lcSirt5, tbNDUS7, ncQCR2, hsATP5G2, hsLACTB, spilv1, gmCOX2, crATP6, hsOPA1, hsSDHD, hsADCK3, osP0644B06.24-2, 뉴로스포라 크라사 ATP9(ncATP9), hsGHITM, hsNDUFAB1, hsATP5G3, crATP6_hsADCK3, ncATP9_ncATP9, zmLOC100282174, ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_ncATP9, zmLOC100282174_hsADCK3_crATP6_hsATP5G3, zmLOC100282174_hsADCK3_hsATP5G3, ncATP9_zmLOC100282174, hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6_hsATP5G3, crATP6_hsADCK3_zmLOC100282174_hsATP5G3, hsADCK3_zmLOC100282174, hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6, ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_GNFP_ncATP9 및 ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_lcSirt5_osP0644B06.24-2_hsATP5G2_ncATP9로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 129 내지 159로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 2에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 3에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 4에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 5에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 7 또는 8에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 10에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 12에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 3' UTR 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 미토콘드리아 표적화 서열의 3' 말단에 위치된다. 일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 hsACO2, hsATP5B, hsAK2, hsALDH2, hsCOX10, hsUQCRFS1, hsNDUFV1, hsNDUFV2, hsSOD2, hsCOX6c, hsIRP1, hsMRPS12, hsATP5J2, rnSOD2 및 hsOXA1L로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 서열번호 111 내지 125로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 3' UTR 핵산 서열은 서열번호 13 또는 서열번호 14에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 3' UTR 핵산 서열의 5' 말단에 위치된다. 일부 경우에, 미토콘드리아 표적화 서열은 미토콘드리아 표적화 서열의 3' 말단에 위치된다.
일부 경우에, 재조합 핵산은 서열번호 17 내지 20, 23 내지 24, 27 내지 28, 31 내지 34, 37 내지 38, 41 내지 42, 45 내지 48, 51 내지 52, 55 내지 56, 59 내지 62, 65 내지 66, 69 내지 70, 73 내지 76, 79 내지 80 및 83 내지 84로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 본 명세서에 개시된 재조합 핵산을 포함하는 바이러스 벡터가 본 명세서에 개시된다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이다. 일부 경우에, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, AAV 벡터는 재조합 AAV(rAAV) 벡터이다. 일부 경우에, rAAV 벡터는 rAAV2 벡터이다.
다른 양상에서, 본 명세서에 개시된 임의의 약제학적 조성물을 안질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 안질환을 치료하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 일부 경우에, 안질환은 레베르 유전성 시신경병증(LHON)이다. 일부 경우에, 상기 방법은 환자의 눈 중 하나 또는 둘 다에 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 약제학적 조성물은 안구내 주사 또는 유리체내 주사에 의해 투여된다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 유리체내 주사에 의해 투여된다. 일부 경우에, 약 0.01 내지 0.1㎖의 약제학적 조성물은 유리체내 주사에 의해 투여된다. 일부 경우에, 약 0.05㎖의 약제학적 조성물은 유리체내 주사에 의해 투여된다.
일부 경우에, 상기 방법은 메틸프레드니솔론을 환자에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 경우에, 메틸프레드니솔론은 약제학적 조성물의 유리체내 주사 전에 투여된다. 일부 경우에, 메틸프레드니솔론은 경구 투여된다. 일부 경우에, 메틸프레드니솔론은 약제학적 조성물의 유리체내 주사 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 동안 매일 투여된다. 일부 경우에, 메틸프레드니솔론은 매일 투여된다. 일부 경우에, 메틸프레드니솔론은 약 32㎎/60㎏의 용량으로 매일 투여된다. 일부 경우에, 메틸프레드니솔론은 약제학적 조성물의 유리체내 주사 후에 투여된다. 일부 경우에, 상기 방법은 크레아틴 인산나트륨을 환자에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 경우에, 크레아틴 인산나트륨은 정맥내로 투여된다. 일부 경우에, 메틸프레드니솔론은 정맥내로 또는 경구로 투여된다. 일부 경우에, 상기 방법은 메틸프레드니솔론을 적어도 1일 동안 정맥내로 투여한 후에, 적어도 1주 동안 경구 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 메틸프레드니솔론을 약 3일 동안 정맥내로 투여한 후에, 적어도 약 6주 동안 경구 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 메틸프레드니솔론은 약 80㎎/60㎏의 용량으로 매일 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 상기 재조합 핵산이 없는 비슷한 약제학적 조성물의 투여보다 더 높은 평균 시력 회복 수준을 초래한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 서열번호 15에 제시된 바와 같은 재조합 핵산을 포함하는 비슷한 약제학적 조성물의 투여보다 더 높은 평균 시력 회복 수준을 초래한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 재조합 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV)를 포함하는 제1 약제학적 조성물로서, 상기 재조합 핵산은 (i) 미토콘드리아 표적화 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; (ii) 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 서열번호 6 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 상기 핵산 서열; 및 (iii) 3' UTR 핵산 서열을 포함하는, 상기 제1 약제학적 조성물; 및 (b) 스테로이드를 포함하는 제2 약제학적 조성물을 안질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 치료 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 160 내지 162로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 미토콘드리아 표적화 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 126 내지 159로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 미토콘드리아 표적화 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 3' UTR 핵산 서열은 서열번호 13, 14 및 111 내지 125로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열(핵산의 서열)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 재조합 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV)를 포함하는 제1 약제학적 조성물로서, 재조합 핵산은 (i) 서열번호 126 내지 159로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열(아미노 서열)을 포함하는 미토콘드리아 표적화 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; (ii) 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) 3' UTR 핵산 서열을 포함하는, 상기 제1 약제학적 조성물; 및 (b) 스테로이드를 포함하는 제2 약제학적 조성물을 안질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 치료 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 미토콘드리아 단백질은 NADH 탈수소효소 4(ND4), NADH 탈수소효소 6(ND6), NADH 탈수소효소 1(ND1) 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 6 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 160 내지 162로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 미토콘드리아 표적화 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 3' UTR 핵산 서열은 서열번호 13, 14 및 111 내지 125로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 재조합 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV)를 포함하는 제1 약제학적 조성물로서, 재조합 핵산은 (i) 서열번호 126 내지 159로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열(아미노 서열)을 포함하는 미토콘드리아 표적화 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; (ii) 서열번호 6 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 및 (iii) 서열번호 13, 14 및 111 내지 125로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 3' UTR 핵산 서열을 포함하는, 상기 제1 약제학적 조성물; 및 (b) 스테로이드를 포함하는 제2 약제학적 조성물을 안질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 안질환의 치료 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 재조합 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV)를 포함하는 제1 약제학적 조성물로서, 재조합 핵산은 (i) 미토콘드리아 표적화 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및 (ii) 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 상기 제1 약제학적 조성물; 및 (b) 스테로이드를 포함하는 제2 약제학적 조성물을 안질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 미토콘드리아 단백질은 NADH 탈수소효소 4(ND4), NADH 탈수소효소 6(ND6), NADH 탈수소효소 1(ND1) 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 3' UTR 핵산 서열은 서열번호 13, 14 및 111 내지 125로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 서열번호 15 내지 84로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 서열번호 15와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 약제학적 조성물은 안구내 주사 또는 유리체내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 0.01 내지 0.1㎖의 제1 약제학적 조성물은 유리체내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 0.05㎖의 제1 약제학적 조성물은 유리체내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 제1 약제학적 조성물은 환자의 눈 중 하나 또는 둘 다에 투여된다.
일부 실시형태에서, 스테로이드는 알클로메타손 다이프로피오네이트, 암시노나이드, 베클로메타손 다이프로피오네이트, 베클로메타손, 베타메타손 벤조에이트, 베타메타손 다이프로피오네이트, 베타메타손 소듐 포스페이트, 베타메타손 소듐 포스페이트 및 소듐 아세테이트, 베타메타손 발레레이트, 클로베타솔 프로피오네이트, 클로코르톨론 피발레이트, 코티솔(하이드로코티손), 코티솔 아세테이트(하이드로코티손), 코티손 뷰티레이트(하이드로코티손), 코티솔 사이피오네이트(하이드로코티손), 코티솔(하이드로코티손) 소듐 포스페이트, 코티솔(하이드로코티손) 소듐 석시네이트, 코티솔 발레레이트(하이드로코티손), 코티손 아세테이트, 데소나이트, 데속시메타손, 덱사메타손, 덱사메타손 아세테이트, 덱사메타손 소듐 포스페이트, 다이플로라손 다이아세테이트, 플루드로코티손 아세테이트, 플루니솔라이드, 플루오시노니드 아세테이트, 플루오시노니드, 플루오로메톨론, 플루란드레놀라이드, 할시노나이드, 메드리손, 메틸프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 메틸프레드니솔론 소듐 석시네이트, 모메타손 퓨로에이트, 파라메타손 아세테이트, 프레드니솔론, 프레드니솔론 아세테이트, 프레드니솔론 소듐 포스페이트, 프레드니솔론 뷰틸아세테이트, 프레드니손, 트라이암시놀론, 트라이암시놀론 아세토나이트, 트라이암시놀론 다이아세테이트, 및 트라이암시놀론 헥사아세토나이트 또는 이들의 합성 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 스테로이드는 글루코코르티코이드이다. 일부 실시형태에서, 글루코코르티코이드는 메틸프레드니솔론 또는 프레드니손이다.
일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론은 정맥내 투여용으로 정제 또는 액체로서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 경구로 또는 정맥내로 투여된다.
일부 실시형태에서, 스테로이드는 제1 약제학적 조성물의 투여 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 제1 약제학적 조성물의 투여 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 동안 매일 투여된다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 메틸프레드니솔론이고, 약 30㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏ 또는 약 30㎎ 내지 약 40㎎의 용량으로 매일 투여된다. 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론의 매일의 용량은 약 32㎎/60㎏ 또는 32㎎이다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 프레드니손이고, 약 50㎎/60㎏ 내지 약 70㎎/60㎏의 매일의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 프레드니손의 매일 용량은 약 60㎎/60㎏이다.
일부 실시형태에서, 스테로이드는 제1 약제학적 조성물의 투여 후에 투여된다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 제1 약제학적 조성물의 투여 후 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주, 적어도 6주, 적어도 7주, 적어도 8주, 적어도 9주, 적어도 10주, 적어도 11주, 적어도 12주, 적어도 13주, 적어도 14주, 또는 적어도 15주 동안 매일 투여된다.
일부 실시형태에서, 스테로이드는 메틸프레드니솔론이고, 약 70㎎/60㎏ 내지 90㎎/60㎏ 또는 약 70㎎ 내지 90㎎의 용량이 매일 투여된다. 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론의 매일의 용량은 약 80㎎/60㎏ 또는 80㎎이다. 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론은 제1 약제학적 조성물의 투여 후에 적어도 2일 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론의 후속 용량은 제1 약제학적 조성물의 투여 후 적어도 7주 동안 매일 투여되되, 메틸프레드니솔론의 용량은 주마다 감소된다.
일부 실시형태에서, 스테로이드는 프레드니손이고, 약 50㎎/60㎏ 내지 70㎎/60㎏ 또는 약 50㎎ 내지 약 70㎎의 용량이 매일 투여된다. 일부 실시형태에서, 프레드니손의 매일의 용량은 약 60㎎/60㎏ 또는 60㎎이다. 일부 실시형태에서, 프레드니손은 제1 약제학적 조성물의 투여 후에 적어도 7일 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 7일 후에, 프레드니손은 약 30㎎/60㎏ 내지 약 50㎎/60㎏ 또는 약 30㎎ 내지 50㎎의 매일의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 프레드니손의 매일의 용량은 약 40㎎/60㎏ 또는 40㎎이다. 일부 실시형태에서, 프레드니손의 후속 용량은 적어도 4일 동안 매일 투여되되, 프레드니손의 용량은 매일 감소된다.
일부 실시형태에서, 스테로이드는 제1 약제학적 조성물의 투여 전 및 후에 투여된다.
일부 실시형태에서, 스테로이드는 메틸프레드니솔론이고 제1 약제학적 조성물의 투여 전에 적어도 7일 동안 매일 투여되고, 제1 약제학적 조성물의 투여 후 적어도 7주 동안 매일 투여된다. 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론은 제1 약제학적 조성물의 투여 전에 약 32㎎/60㎏ 또는 32㎎의 매일의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론은 제1 약제학적 조성물의 투여 후 적어도 2일 동안 약 80㎎/60㎏ 또는 80㎎의 매일의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론은 제1 약제학적 조성물의 투여 후 3일에 시작해서 적어도 4일 동안 약 40㎎/60㎏ 또는 40㎎의 매일의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론은 제1 약제학적 조성물의 투여 후 1주에 시작해서 적어도 1주 동안 약 32㎎/60㎏ 또는 32㎎의 매일의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론은 제1 약제학적 조성물의 투여 후 1주에 시작해서 적어도 2주 동안 약 24㎎/60㎏ 또는 24㎎의 매일의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론은 제1 약제학적 조성물의 투여 후 1주에 시작해서 적어도 3주 동안 약 16㎎/60㎏ 또는 16㎎의 매일의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론은 제1 약제학적 조성물의 투여 후 1주에 시작해서 적어도 4주 동안 약 8㎎/60㎏ 또는 8㎎의 매일의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론은 제1 약제학적 조성물의 투여 후 1주에 시작해서 적어도 5주 동안 약 6㎎/60㎏ 또는 6㎎의 매일의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론은 제1 약제학적 조성물의 투여 후 1주에 시작해서 적어도 6주 동안 약 4㎎/60㎏ 또는 4㎎의 매일의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 스테로이드는 프레드니손이고 제1 약제학적 조성물의 투여 전에 적어도 2일 동안 매일 투여되고, 제1 약제학적 조성물의 투여 후 적어도 11일 동안 매일 투여된다. 일부 실시형태에서, 프레드니손은 제1 약제학적 조성물의 투여 전에 약 60㎎/60㎏ 또는 60㎎의 매일의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 프레드니손은 제1 약제학적 조성물의 투여 후 적어도 7일 동안 약 60㎎/60㎏ 또는 60㎎의 매일의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 프레드니손은 제1 약제학적 조성물의 투여 후 적어도 8일 동안 약 40㎎/60㎏ 또는 40㎎의 매일의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 프레드니손은 제1 약제학적 조성물의 투여 후 적어도 9일 동안 약 20㎎/60㎏ 또는 20㎎의 매일의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 프레드니손은 제1 약제학적 조성물의 투여 후 적어도 10일 동안 약 10㎎/60㎏ 또는 10㎎의 매일의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 크레아틴 인산나트륨을 환자에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 크레아틴 인산나트륨은 제1 약제학적 조성물의 투여 전 및/또는 후에 정맥내로 투여된다.
일부 실시형태에서, 제1 약제학적 조성물 및 제2 약제학적 조성물의 투여는 제2 약제학적 조성물 없이 투여한 비슷한 약제학적 조성물보다 더 높은 평균 시력 회복 수준을 초래한다. 일부 실시형태에서, 제1 약제학적 조성물 및 제2 약제학적 조성물의 투여는 제2 약제학적 조성물 없이 투여한 비슷한 약제학적 조성물보다 더 낮은 이상반응의 발생률을 초래한다. 일부 실시형태에서, 이상반응은 전방 염증, 유리체염, 고안압증, 백내장 제거, 각막염, 초자체 출혈, 알레르기성 결막염 및 안구통으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 안질환을 갖는 환자 집단에서 더 높은 평균 시력 회복 수준 및 더 낮은 이상반응의 발생률이 결정된다. 일부 실시형태에서, 환자 집단은 인종별로 매칭된다. 일부 실시형태에서, 환자 집단은 중국인 또는 아르헨티나인이다.
일부 실시형태에서, 안질환은 레베르 유전성 시신경병증(LHON)이다. 일부 실시형태에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AA8, AAV9 및 AAV10으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, AAV는 AAV2이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 환자로부터 혈청 샘플을 얻는 단계; (b) 혈청 샘플의 존재 하에 아데노-연관 바이러스(AAV)를 포함하는 조성물과 함께 표적 세포 집단을 배양시키는 단계로서, AAV는 검출 가능한 마커를 암호화하는 재조합 핵산을 포함하는, 상기 배양시키는 단계; 및 (c) 배양시키는 단계 후에 표적 세포 집단에서 검출 가능한 마커의 발현 수준을 검출하는 단계로서, 표적 세포 집단에서 검출 가능한 마커의 발현 수준이 사전 결정된 역치보다 높은 경우 상기 환자는 치료를 위해 선택되는, 상기 검출하는 단계를 포함하는, 안질환을 갖는 환자를 선별 및 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 환자로부터의 혈청 샘플의 존재 하에 아데노-연관 바이러스(AAV)를 포함하는 조성물과 함께 표적 세포 집단을 배양시키는 단계로서, AAV는 검출 가능한 마커를 암호화하는 재조합 핵산을 포함하는, 상기 배양시키는 단계; 및 (b) 배양시키는 단계 후에 표적 세포 집단에서 검출 가능한 마커의 발현 수준을 검출하는 단계로서, 표적 세포 집단에서 검출 가능한 마커의 발현 수준이 사전 결정된 역치보다 높은 경우 상기 환자는 치료를 위해 선택되는, 상기 검출하는 단계를 포함하는, 안질환을 갖는 환자를 선별 및 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 환자로부터 혈청 샘플을 얻는 단계; (b) 혈청 샘플의 존재 하에 제1 아데노-연관 바이러스(AAV)를 포함하는 조성물과 함께 표적 세포 집단을 배양시키는 단계로서, 제1 AAV는 검출 가능한 마커를 암호화하는 제1 재조합 핵산을 포함하는, 상기 배양시키는 단계; (c) 표적 세포 집단에서 검출 가능한 마커의 발현 수준을 검출하는 단계; 및 (d) 제2 AAV를 포함하는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계로서, 제2 AAV는 제2 재조합 핵산을 포함하되, 표적 세포 집단에서 검출 가능한 마커의 발현 수준은 사전 결정된 역치보다 더 높은, 상기 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 치료를 필요로 하는 환자의 안질환을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 환자로부터의 혈청 샘플의 존재 하에 제1 아데노-연관 바이러스(AAV)를 포함하는 조성물과 함께 표적 세포 집단을 배양시키는 단계로서, 제1 AAV는 검출 가능한 마커를 암호화하는 제1 재조합 핵산을 포함하는, 상기 배양시키는 단계; (b) 표적 세포 집단에서 검출 가능한 마커의 발현 수준을 검출하는 단계; 및 (c) 제2 AAV를 포함하는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계로서, 제2 AAV는 제2 재조합 핵산을 포함하고, 표적 세포 집단에서 검출 가능한 마커의 발현 수준은 사전 결정된 역치보다 더 높은, 상기 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 치료를 필요로 하는 환자의 안질환의 치료 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 검출 가능한 마커는 형광 단백질이다. 일부 실시형태에서, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP)이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 마커는 유세포 분석 또는 qPCR에 의해 검출된다. 일부 실시형태에서, 배양시키는 단계는 적어도 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 이상 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, 검출이 유세포 분석에 의해 수행될 때, 사전 결정된 역치는 검출 가능한 마커를 발현시키는 세포의 약 40%이다. 일부 실시형태에서, 검출이 qPCR에 의해 수행될 때, 사전 결정된 역치는 검출 가능한 마커의 상대 발현 수준의 약 0.6이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 HEK-293 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 치료는 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 AAV이다. 일부 실시형태에서, 미토콘드리아 단백질은 NADH 탈수소효소 4(ND4), NADH 탈수소효소 6(ND6), NADH 탈수소효소 1(ND1) 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 환자는 ND4 유전자의 G11778A, ND1 유전자의 G3460A 및 ND6 유전자의 T14484C로부터 선택되는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 아데노-연관 바이러스(AAV)로서, 검출 가능한 마커를 암호화하는 재조합 핵산을 포함하는, AAV; 표적 세포 집단; 및 검출 가능한 마커를 검출하기 위한 1종 이상의 시약을 포함하는, 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트는 AAV로 표적 세포 집단을 형질감염시키기 위한 형질감염 시약을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 재조합 핵산을 포함하는 제2 AAV를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 마커를 검출하기 위한 1종 이상의 시약은 검출 가능한 마커에 결합하는 항체 및 검출 가능한 마커를 암호화하는 재조합 핵산에 특이적인 하나 이상의 프라이머 올리고뉴클레오타이드로부터 선택된다.
본 발명의 새로운 특징은 특히 첨부되는 청구범위에 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 예시적인 실시형태(이때 본 발명의 원칙이 이용됨)를 열거하는 수반하는 도면을 참조로 하여 더 양호하게 이해될 것이며, 여기서:
도 1은 벡터 pAAV-CMV-ND4-3'플래그-COX10UTR-SV40의 맵을 나타내고;
도 2는 벡터 pAAV-CMV-ND4-3'플래그-COX10UTR-bGH의 맵을 나타내며;
도 3은 벡터 pAAV-CMV-ND4-3'플래그-COX10UTR의 맵을 나타내고;
도 4는 HEK293 세포에서 플라스미드의 발현 효율-mRNA를 나타내며;
도 5는 2 내지 8℃에서 제형의 안정성을 시험하기 위한 실험 결과를 나타내고;
도 6은 제형의 안정성을 시험하기 위한 냉동/해동 실험 결과를 나타내고;
도 7은 ND4 발현 카세트의 설계를 나타내며;
도 8은 스테로이드에 대한 제1 예시적 투약 요법을 나타내고; 그리고
도 9는 스테로이드에 대한 제2 예시적 투약 요법을 나타낸다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 물질이 본 명세서의 제제 또는 단위 용량의 실행 또는 시험 동안 사용될 수 있지만, 일부 방법 및 물질이 이제 기재된다. 달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되거나 상정된 기법은 표준 방법이다. 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것이 아니다.
본 명세서에서 그리고 첨부되는 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수의 형태, "및" 및 "상기"는 달리 분명하게 명시되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "화합물"에 대한 언급은 복수의 이러한 제제를 포함하고, "염"에 대한 언급은 하나 이상의 염에 대한 언급(또는 복수의 염에 대한 언급) 및 당업자에게 알려진 이들의 균등물 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 달리 표시되지 않는 한, 용어 "또는"은 접속사 또는 이접 접속사일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 달리 표시되지 않는 한, 임의의 실시형태는 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서에서 일부 본 발명의 실시형태는 수치적 범위를 고려한다. 범위가 존재하는 경우, 범위는 범위 종점을 포함한다. 추가적으로, 각각의 하위범위 및 범위 내의 값은 분명하게 기재되는 것과 같이 제공된다.
참조값뿐만 아니라 본 명세서에 사용되는 바와 같은 이의 문법적 동의어에 관해 용어 "약" 및 이의 문법적 동의어는 값의 범위에 10%를 더하거나 뺀 것, 예컨대 값의 범위에 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%를 더하거나 뺀 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, "약 10"이라는 양은 9 내지 11의 양을 포함한다.
용어 "포함하는"(및 관련된 용어, 예컨대, "포함하다(comprises)" 또는 "갖는" 또는 "포함하는(including)")은 특정 다른 실시형태(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 물질 구성성분, 조성물, 방법 또는 과정 등의 실시형태)가 기재된 특징으로 "이루어지거나" 또는 "본질적으로 이루어질 수 있다"는 것을 제외하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상체였거나 대상체일 포유류를 지칭한다. 용어 "포유류"는 이의 표준 의미를 갖고, 예를 들어, 인간, 개, 고양이, 양 및 소를 포괄하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 기재된 방법은 인간 치료 및 수의학적 적용에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
용어 "치료"는 이러한 투여를 필요로 하는 포유류 대상체, 특히 인간 대상체에 대한 본 명세서에 개시된 적어도 1종의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 투여를 포괄하고, (i) 암과 같은 질환의 임상 증상 발생의 억제, (ii) 암과 같은 질환의 임상 증상의 퇴행, 및/또는 (iii) 암과 같은 질환의 공격을 방지하기 위한 예방적 치료를 포함한다.
본 명세서에 기재된 화학적 독립체의 "치료적 유효량"이라는 용어는 인간 또는 비인간 대상체에게 투여될 때, 치료적 이점, 예컨대, 증상의 개선, 질환 진행의 늦춤 또는 질환 예방을 제공하기에 효과적인 양을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 달리 표시되지 않는 한, 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호 호환 가능하게 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 달리 표시되지 않는 한, X㎎/60㎏의 약물 용량은 60㎏의 환자 체중당 X㎎의 약물의 사용을 지칭한다. 예를 들어, 100㎎/60㎏의 약물 용량은 체중이 60㎏인 환자가 100㎎의 약물을 복용하는 것이 필요하고, 상응하여, 체중이 30㎏인 다른 환자는 50㎎의 약물을 복용하는 것이 필요하다는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 달리 표시되지 않는 한, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 둘 이상의 서열 사이의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 관심 폴리뉴클레오타이드와 조절 서열(예를 들어, 프로모터) 사이의 작동 가능한 연결은 관심 폴리뉴클레오타이드의 발현을 가능하게 하는 기능적 연결이다. 이런 의미에서, 용어 "작동 가능하게 연결된"은, 조절 영역이 관심의 암호화 서열의 전사 또는 번역을 조절하는 데 효과적이 되도록 전사될 조절 영역 및 암호화 서열의 위치결정을 지칭한다. 본 명세서에 개시된 일부 실시형태에서, 용어 "작동 가능하게 연결된"은, 제어 서열이 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA, 폴리펩타이드 및/또는 기능적 RNA의 발현 또는 세포 국재화를 지시하거나 조절하고, 프로모터가 핵산 서열의 전사를 매개할 수 있다면 이것이 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되도록, 조절 서열은 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA를 암호화하는 서열에 상대적으로 위치되는 입체배치를 지칭한다. 작동 가능하게 연결된 구성요소는 연속적 또는 비연속적일 수 있다. 둘 이상의 DNA 서열을 작동 가능하게 연결하기 위한 기본적 기법은 당업자에게 익숙하며, 이러한 방법은 표준 분자 생물학에 대한 다수의 교재에 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] 참조).
핵산 및 폴리펩타이드 서열
본 명세서의 일 양상에서, 제1 ITR 서열, 프로모터 서열, 인트론 서열, Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열, 3' UTR 서열, 폴리A 신호 서열 및 제2 ITR 서열로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 재조합 핵산이 제공된다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 해당 서열 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로) 제1 ITR 서열, 프로모터 서열, 인트론 서열, Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열, 3' UTR 서열, 폴리A 신호 서열 및 제2 ITR 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다양한 서열은 서로 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 다양한 조절 서열은 미토콘드리아 단백질 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된다.
표 1은 본 명세서에 개시된 핵산 및 폴리펩타이드 서열이다. 첫 번째 열은 각 서열에 대한 서열번호를 나타낸다. 두 번째 열은 핵산 또는 폴리펩타이드 작제물을 기재한다. 예를 들어, 작제물 COX10-ND4-3'UTR(서열번호 15)은 COX10(서열번호 1), ND4(서열번호 6) 및 3'UTR(서열번호 13)의 핵산 서열에 결합하는 핵산이다.
아데노-연관 바이러스(AAV)
아데노-연관 바이러스(AAV)는 인간 및 일부 다른 영장류 종을 감염시키는 소형 바이러스이다. 본 명세서에 개시된 조성물은 아데노-연관 바이러스(AAV) 게놈 또는 이의 유도체를 처음 포함한다.
AAV 게놈은 AAV 바이러스 입자의 생산에 필요한 기능을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 이러한 기능은 AAV 바이러스 입자에 AAV 게놈의 캡슐화를 비롯하여 숙주 세포의 복제 및 패키징에 작용하는 AAV의 기능을 포함한다. 자연 발생적 AAV 바이러스는 복제-결핍이며, 복제 및 패키징 주기를 완료하는 트랜스-제공 헬퍼 기능에 의존한다. 따라서, 본 발명의 벡터의 AAV 게놈은 일반적으로 복제-결핍이다.
AAV 게놈은 양성 센스 또는 음성 센스 단일-가닥 형태이거나, 또는 이중-가닥 형태일 수 있다. 이중-가닥 형태의 사용은 표적 세포에서 DNA 복제 단계를 우회하는 것을 허용하고, 따라서 이식유전자 발현을 가속화시킬 수 있다.
AAV 게놈은 AAV의 임의의 자연 유래 혈청형 또는 단리물 또는 계통군으로부터 유래될 수 있다. 따라서, AAV 게놈은 자연 발생적 AAV 바이러스의 전체 게놈일 수 있다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 자연에서 발생되는 AAV 바이러스는 다양한 생물계에 따라 분류될 수 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 이들의 혈청형에 대해 언급된다. 혈청형은 AAV의 변이체 아종에 상응하고, 변이체 아종은 다른 변이체 아종과 구별을 위해 사용될 수 있는 이들의 캡시드 표면 항원의 발현 프로파일로 인해 독특한 반응성을 갖는다. 전형적으로, 특정 AAV 혈청형을 갖는 바이러스는 임의의 다른 AAV 혈청형에 특이적인 중화 항체와 효율적으로 교차 반응하지 않는다. AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16뿐만 아니라 재조합 혈청형, 예컨대, 최근에 영장류 뇌에서 확인된 Rec2 및 Rec3을 포함한다.
본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 AAV 혈청형은 AAV2이다. 본 발명에서 사용하기 위한 특정 관심의 다른 혈청형은 망막색소상피와 같은 눈의 조직에서 효율적으로 형질도입하는 AAV4, AAV5 및 AAV8을 포함한다. 사용되는 AAV의 혈청형은 AAV4 이외의 AAV 혈청형일 수 있다. AAV 혈청형의 검토는 Choi 등(Curr Gene Ther. 2005; 5(3); 299-310) 및 Wu 등(Molecular Therapy. 2006; 14(3), 316-327)에서 찾을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 AAV 게놈 또는 AAV 게놈의 구성요소의 서열(ITR 서열, rep 또는 cap 유전자 포함)은 AAV 전체 게놈 서열에 대한 다음의 수탁번호로부터 유래될 수 있다: 아데노-연관 바이러스 1 NC_002077, AF063497; 아데노-연관 바이러스 2 NC_001401; 아데노-연관 바이러스 3 NC_001729; 아데노-연관 바이러스 3B NC_001863; 아데노-연관 바이러스 4 NC_001829; 아데노-연관 바이러스 5 Y18065, AF085716; 아데노-연관 바이러스 6 NC_001862; 조류 AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; 조류 AAV 균주DA-1 NC_006263, AY629583; 소 AAV NC_005889, AY388617.
AAV 바이러스는 또한 계통군 또는 클론에 관해 지칭될 수 있다. 이는 자연적으로 유래되는 AAV 바이러스의 계통 발생 관계를 지칭하며, 전형적으로 AAV 바이러스의 계통 발생군을 지칭하는데, 이는 공통 조상으로 다시 거슬러 올라갈 수 있고, 이들의 모든 자손을 포함한다. 추가적으로, AAV 바이러스는 특정 단리물, 즉, 자연에서 발생되는 특정 AAV 바이러스의 유전적 단리물에 관해 지칭될 수 있다. 유전적 단리물이라는 용어는 다른 자연 발생적 AAV 바이러스와의 제한된 유전적 혼합이 가해지고, 이에 의해 확인 가능한 별개의 집단을 유전적 수준에서 정하는 AAV 바이러스의 집단을 설명한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 AAV의 계통군 및 단리물의 예는 하기를 포함한다: 계통군 A: AAV1 NC_002077, AF063497, AAV6 NC_001862, Hu. 48 AY530611, Hu 43 AY530606, Hu 44 AY530607, Hu 46 AY530609; 계통군 B: Hu. 19 AY530584, Hu. 20 AY530586, Hu 23 AY530589, Hu22 AY530588, Hu24 AY530590, Hu21 AY530587, Hu27 AY530592, Hu28 AY530593, Hu 29 AY530594, Hu63 AY530624, Hu64 AY530625, Hu13 AY530578, Hu56 AY530618, Hu57 AY530619, Hu49 AY530612, Hu58 AY530620, Hu34 AY530598, Hu35 AY530599, AAV2 NC_001401, Hu45 AY530608, Hu47 AY530610, Hu51 AY530613, Hu52 AY530614, Hu T41 AY695378, Hu S17 AY695376, Hu T88 AY695375, Hu T71 AY695374, Hu T70 AY695373, Hu T40 AY695372, Hu T32 AY695371, Hu T17 AY695370, Hu LG15 AY695377; 계통군 C: Hu9 AY530629, Hu10 AY530576, Hu11 AY530577, Hu53 AY530615, Hu55 AY530617, Hu54 AY530616, Hu7 AY530628, Hu18 AY530583, Hu15 AY530580, Hu16 AY530581, Hu25 AY530591, Hu60 AY530622, Ch5 AY243021, Hu3 AY530595, Hu1 AY530575, Hu4 AY530602 Hu2, AY530585, Hu61 AY530623; 계통군 D: Rh62 AY530573, Rh48 AY530561, Rh54 AY530567, Rh55 AY530568, Cy2 AY243020, AAV7 AF513851, Rh35 AY243000, Rh37 AY242998, Rh36 AY242999, Cy6 AY243016, Cy4 AY243018, Cy3 AY243019, Cy5 AY243017, Rh13 AY243013; 계통군 E: Rh38 AY530558, Hu66 AY530626, Hu42 AY530605, Hu67 AY530627, Hu40 AY530603, Hu41 AY530604, Hu37 AY530600, Rh40 AY530559, Rh2 AY243007, Bb1 AY243023, Bb2 AY243022, Rh10 AY243015, Hu17 AY530582, Hu6 AY530621, Rh25 AY530557, Pi2 AY530554, Pi1 AY530553, Pi3 AY530555, Rh57 AY530569, Rh50 AY530563, Rh49 AY530562, Hu39 AY530601, Rh58 AY530570, Rh61 AY530572, Rh52 AY530565, Rh53 AY530566, Rh51 AY530564, Rh64 AY530574, Rh43 AY530560, AAV8 AF513852, Rh8 AY242997, Rh1 AY530556; 계통군 F: Hu14 (AAV9) AY530579, Hu31 AY530596, Hu32 AY530597, Clonal Isolate AAV5 Y18065, AF085716, AAV 3 NC_001729, AAV 3B NC_001863, AAV4 NC_001829, Rh34 AY243001, Rh33 AY243002, Rh32 AY243003.
당업자는 이들의 통상적인 일반적 지식에 기반하여 본 발명에서 사용하기 위한 AAV의 적절한 혈청형, 계통군, 클론 또는 단리물을 선택할 수 있다. 예를 들어, AAV5 캡시드는 유전 색각 결함의 성공적인 교정에 의해 입증된 바와 같이, 영장류 원추세포 광수용체를 효율적으로 형질도입하는 것으로 나타났다(Mancuso et al., Nature 2009, 461:784-7).
그러나, 본 발명은 또한 아직 확인되거나 특성규명되지 않았을 수도 있는 다른 혈청형의 AAV 게놈의 사용을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. AAV 혈청형은 AAV 바이러스 감염의 조직 특이성(또는 굴성)을 결정한다. 따라서, 본 발명에 따라 환자에게 투여하기 위해 사용되는 AAV 바이러스의 바람직한 AAV 혈청형은 LHON에서 눈의 표적 세포 감염에 대해 자연적 굴성 또는 높은 효율을 갖는 것이다. 따라서, 환자에게 투여하기 위해 사용되는 AAV 바이러스의 AAV 혈청형은 감각신경 망막 및 망막색소상피를 감염시키는 혈청형일 수 있다.
전형적으로, AAV의 자연적으로 유래되는 혈청형 또는 단리물 또는 계통군의 AAV 게놈은 적어도 하나의 역위 말단 반복부(ITR) 서열을 포함한다. ITR 서열은 기능적 복제기점을 제공하기 위해 시스로 작용하며, 세포 게놈으로부터 벡터의 통합 및 절단을 가능하게 한다. 선택 가능한 ITR 서열은 임의의 AAV 혈청형, 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16뿐만 아니라 재조합 혈청형, 예컨대, Rec2 및 Rec3으로부터 유래될 수 있고, 영장류 뇌, 비영장류 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV 등으로부터 최근에 확인되었다. 바람직한 ITR 서열은 AAV2 및 이의 변이체의 서열이다.
바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 ITR 서열은 ND4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 변이체에 측접된다.
AAV 게놈은 또한 전형적으로 AAV 바이러스 입자에 대한 패키징 기능을 암호화하는 패키징 유전자, 예컨대, rep 및/또는 cap 유전자를 포함한다. rep 유전자는 단백질 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 또는 이들의 변이체 중 하나 이상을 암호화한다. cap 유전자는 하나 이상의 캡시드 단백질, 예컨대, VP1, VP2 및 VP3 또는 이들의 변이체를 암호화한다. 이러한 단백질은 AAV 바이러스 입자의 캡시드를 구성한다. 캡시드 변이체는 아래에서 논의한다.
프로모터는 패키징 유전자의 각각에 작동 가능하게 연결될 것이다. 이러한 프로모터의 구체적인 예는 p5, p19 및 p40 프로모터를 포함한다(Laughlin et al., 1979, PNAS, 76:5567-5571). 예를 들어, p5 및 p19 프로모터는 전형적으로 rep 유전자를 발현시키기 위해 사용되는 반면, p40 프로모터는 전형적으로 cap 유전자를 발현시키기 위해 사용된다.
위에 논의된 바와 같이, 따라서 본 발명의 벡터를 위해 사용되는 AAV 게놈은 자연 발생적 AAV 바이러스의 전체 게놈일 수 있다. 예를 들어, 전체 AAV 게놈을 포함하는 벡터는 시험관내에서 AAV 바이러스를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 벡터는 원칙적으로 환자에게 투여될 수 있지만, 이는 실제로 드물게 행해질 것이다. 바람직하게는, AAV 게놈은 환자에 대한 투여 목적을 위해 유도체화될 것이다. 이러한 유도체화는 당업계의 표준이며, 본 발명은 AAV 게놈의 임의의 알려진 유도체뿐만 아니라 당업계에 알려진 기법을 적용함으로써 생성될 수 있는 유도체의 사용을 포괄한다. AAV 게놈 및 AAV 캡시드의 유도체화는 Coura 및 Nardi(Virology Journal, 2007, 4:99), 및 문헌[Choi et al. 및 Wu et al]에 의해 위에 인용된 참고문헌에서 검토된다.
AAV 게놈의 유도체는 본 발명의 벡터로부터 ND4 이식유전자의 생체내 발현을 가능하게 하는 AAV 게놈의 임의의 절단된 또는 변형된 형태를 포함한다. 전형적으로, 유의미하게 최소 바이러스 서열을 포함하지만, 위의 기능을 보유하도록 AAV 게놈을 절단할 수 있다. 이는 야생형 바이러스에 의한 벡터의 재조합 위험을 감소시키기 위해, 또한 표적 세포에서 바이러스 유전자 단백질 존재에 의한 세포 면역 반응의 촉발을 피하기 위해 안전성 이유로 바람직하다.
전형적으로, 유도체는 적어도 하나의 역위 말단 반복부(ITR) 서열, 바람직하게는 하나 초과의 ITR, 예컨대, 둘 이상의 ITR을 포함할 것이다. 하나 이상의 ITR은 상이한 혈청형을 갖는 AAV 게놈으로부터 유래될 수 있거나, 또는 키메라 또는 돌연변이체 ITR일 수 있다. 바람직한 돌연변이체 ITR은 trs(말단 분해 부위(terminal resolution site))의 결실을 갖는 것이다. 이런 결실은 암호화 서열과 상보성 서열을 둘 다 포함하는 단일-가닥 게놈, 즉, 자기-상보성 AAV 게놈을 생성하는 게놈의 지속적 복제를 가능하게 한다. 이는 표적 세포에서 DNA 복제의 우회를 가능하게 하며, 따라서 이식유전자 발현을 가속화시키는 것을 가능하게 한다.
하나 이상의 ITR은 바람직하게는 말단 중 하나에서 ND4, ND6, ND1, 또는 이들의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 측접될 것이다. 하나 이상의 ITR의 포함은, 예를 들어, 숙주 세포 DNA 중합효소의 작용에 의해 단일-가닥 벡터 DNA가 이중가닥 DNA로 전환된 후에, 숙주 세포 핵에서 본 발명의 벡터의 콘카타머(concatemer) 형성을 돕는 데 바람직하다. 이러한 에피솜 콘카타머의 형성은 숙주 세포의 생애 동안 벡터 작제물을 보호하여, 생체내 이식유전자의 장기적인 발현을 가능하게 한다.
바람직한 실시형태에서, ITR 구성요소는 유도체에서 본래의 AAV 게놈으로부터 보유된 유일한 서열일 것이다. 따라서, 유도체는 바람직하게는 본래의 게놈의 rep 및/또는 cap 유전자 및 본래 게놈의 임의의 다른 서열을 포함하지 않을 것이다. 이는 위에 기재한 이유로 그리고 또한 벡터가 숙주 세포 게놈에 통합되는 가능성을 감소시키는 것이 바람직하다. 추가적으로, AAV 게놈 크기의 감소는 이식유전자에 추가로 벡터 내에 다른 서열 구성요소(예컨대, 조절 구성요소)를 혼입시킴에 있어서 증가된 가요성을 가능하게 한다.
따라서, AAV2 게놈에 대해, 본 발명의 유도체에서 다음의 부분이 제거될 수 있었다: 하나의 역위 말단 반복부(ITR) 서열, 복제(rep) 및 캡시드(cap) 유전자(NB: 야생형 AAV 게놈에서 rep 유전자는 LHON에서 영향받은 인간 유전자 ND4와 혼동되어서는 안된다). 그러나, 일부 실시형태에서, 시험관내 실시형태를 포함하여, 유도체는 AAV 게놈의 하나 이상의 rep 및/또는 cap 유전자 또는 다른 바이러스 서열을 추가로 포함할 수 있다. 자연 발생적 AAV 바이러스는 인간 염색체 19 상의 특정 부위에서 높은 빈도로 통합되고, 벡터에서 통합 능력의 보유가 치료 상황에서 용인될 수 있도록, 무작위 통합의 무시 가능한 빈도를 나타낸다.
유도체 게놈이 캡시드 단백질, 즉, VP1, VP2 및/또는 VP3을 암호화하는 유전자를 포함하는 경우, 유도체는 하나 이상의 자연 발생적 AAV 바이러스의 키메라, 셔플 또는 캡시드-변형 유도체일 수 있다. 특히, 본 발명은 동일한 벡터 내의 AAV의 상이한 혈청형, 계통군, 클론 또는 단리물, 즉, 위형으로부터의 캡시드 단백질 서열의 제공을 포괄한다.
키메라, 셔플 또는 캡시드-변형 유도체는 전형적으로 바이러스 벡터에 대해 하나 이상의 목적하는 기능성을 제공하도록 선택될 것이다. 따라서, 이러한 유도체는 AAV2 게놈과 같은 자연 발생적 AAV 게놈을 포함하는 AAV 바이러스 벡터에 비해서 특정 세포 유형의 유전자 전달의 증가된 효율, 감소된 면역원성(체액성 또는 세포성), 변경된 굴성 범위 및/또는 개선된 표적화를 나타낼 수 있다. 유전자 전달의 증가된 효율은 세포 표면에서의 개선된 수용체 또는 공동 수용체 결합, 개선된 내재화, 세포 내의 그리고 핵으로의 개선된 전달, 바이러스 입자의 개선된 비코팅 및 단일-가닥 게놈의 이중-가닥 형태로의 개선된 전환에 의해 달성될 수 있다. 증가된 효율은 또한 벡터 용량이 이것이 필요하지 않은 조직에 대한 투여에 의해 희석되지 않도록, 특정 세포 집단의 변경된 굴성 범위 또는 표적화에 관한 것일 수 있다.
키메라 캡시드 단백질은 자연 발생적 AAV 혈청형의 둘 이상의 캡시드 암호화 서열 사이의 재조합에 의해 생성되는 것을 포함한다. 이는, 예를 들어, 하나의 혈청형의 비감염성 캡시드 서열이 상이한 혈청형의 캡시드 서열과 함께 공동 형질감염되고 목적하는 특성을 갖는 캡시드 서열을 선택하기 위해 지시된 선택이 사용되는 마커 구조(rescue) 접근에 의해, 수행될 수 있다. 상이한 혈청형의 캡시드 서열이 세포 내의 상동 재조합에 의해 변경되어 신규한 키메라 캡시드 단백질을 생성할 수 있다.
키메라 캡시드 단백질은 또한 둘 이상의 캡시드 단백질 사이에서(예를 들어, 상이한 혈청형의 둘 이상의 캡시드 단백질 사이에서) 특정 캡시드 단백질 도메인, 표면 루프 또는 특정 아미노산 잔기를 전달하기 위해 캡시드 단백질 서열의 조작에 의해 생성되는 것을 포함한다.
셔플 또는 키메라 캡시드 단백질은 또한 DNA 셔플링에 의해 또는 오류유발 PCR에 의해 생성될 수 있다. 혼성 AAV 캡시드 유전자는 관련된 AAV 유전자의 서열(예를 들어, 다수의 상이한 혈청형의 캡시드 단백질을 암호화하는 것)을 무작위로 단편화하고, 이어서, 후속적으로 서열 상동성 영역에서의 크로스오버(crossover)를 야기할 수 있는 자기-프라이밍 중합효소 반응에서 단편을 조립함으로써 생성될 수 있다. 여러 혈청형의 캡시드 유전자를 셔플링함으로써 이런 방법에서 생성된 혼성 AAV 유전자의 라이브러리는 목적하는 기능성을 갖는 바이러스 클론을 확인하도록 선별될 수 있다. 유사하게, 오류유발 PCR은, 이어서, 목적하는 특성을 위해 선택될 수 있는 변이체의 다양한 라이브러리를 생성하기 위해 AAV 캡시드 유전자를 무작위로 돌연변이시키는 데 사용될 수 있다.
캡시드 유전자의 서열은 또한 천연 야생형 서열에 대해 특정 결실, 치환 또는 삽입을 도입하도록 유전자 변형될 수 있다. 특히, 캡시드 유전자는 캡시드 암호화 서열의 오픈 리딩 프레임 내에서, 또는 캡시드 암호화 서열의 N- 및/또는 C-말단에서 비번역 단백질 또는 펩타이드 서열의 삽입에 의해 변형될 수 있다.
관련없는 단백질 또는 펩타이드는 유리하게는 특정 세포 유형에 대한 리간드로서 작용하고, 이에 의해 표적 세포에 대한 개선된 결합을 부여하거나 또는 특정 세포 집단에 대한 벡터 표적화의 특이성을 개선시키는 것일 수 있다. 예는 망막색소상피에서의 흡수를 차단하고 이에 의해 주변의 망막 조직의 형질도입을 향상시키는 RGD 펩타이드의 사용을 포함할 수 있다(Cronin et al., 2008 ARVO Abstract: D1048). 관련없는 단백질은 또한 생산 과정의 부분으로서 바이러스 입자의 정제를 보조하는 것, 즉, 에피토프 또는 친화도 태그일 수 있다. 삽입 부위는 전형적으로 바이러스 입자의 다른 기능, 예를 들어, 바이러스 입자의 내재화, 전달을 방해하지 않도록 선택될 것이다. 당업자는 이들의 통상적인 일반적 지식에 기반하여 삽입을 위한 적합한 부위를 확인할 수 있다. 위에 언급된 문헌[Choi et al.]에 의해 특정 부위가 개시된다.
본 발명은 추가로 상이한 순서로 AAV 게놈 서열의 제공 및 천연 AAV 게놈에 대한 입체배치를 포괄한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 AAV 서열 또는 유전자가 다른 바이러스로부터의 서열로 또는 하나 초과의 바이러스의 서열로 구성된 키메라 유전자로 대체되는 것을 포괄한다. 이러한 키메라 유전자는 상이한 바이러스 종의 둘 이상의 관련된 바이러스 단백질의 서열로 구성될 수 있다.
본 발명의 벡터는 AAV 게놈 또는 이의 유도체 및 ND4, ND6, ND1 또는 이들의 변이체를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 형태를 취한다.
명확히 하기 위해, 본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 포함하는 AAV 바이러스 입자를 제공한다. 본 발명의 AAV 입자는 캡시드전환된(transcapsidated) 형태를 포함하되, 하나의 혈청형의 ITR을 갖는 AAV 게놈 또는 유도체는 상이한 혈청형의 캡시드에서 패키징된다. 본 발명의 AAV 입자는 또한 모자이크 형태를 포함하되, 둘 이상의 상이한 혈청형으로부터의 비변형 캡시드 단백질의 혼합물은 바이러스 외피를 구성한다. AAV 입자는 또한 캡시드 표면에 흡착된 리간드를 보유하는 화학적 변형 형태를 포함한다. 예를 들어, 이러한 리간드는 특정 세포 표면 수용체를 표적화하기 위해 사용되는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 벡터 또는 AAV 바이러스 입자를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.
재조합 핵산 서열
또한 NADH 탈수소효소 서브유닛-4(ND4), NADH 탈수소효소 서브유닛-1(ND1) 및 NADH 탈수소효소 서브유닛-6(ND6) 폴리펩타이드 또는 이들의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 비롯한 재조합 핵산 서열이 본 명세서에 개시된다.
ND4에 대한 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6에 나타내며, 서열번호 160에 나타낸 단백질을 암호화한다. ND4에 대한 추가 핵산 서열은 서열번호 7 및 8이다.
서열번호 160의 변이체는 이의 절단, 돌연변이체 또는 상동체, 및 기능적 ND4 폴리펩타이드를 암호화하는 이들의 임의의 전사 변이체를 포함할 수 있다. 본 명세서에 언급된 임의의 상동체는 전형적으로 ND4의 관련 영역과 적어도 70%의 동일성을 갖고, 폴리펩타이드 결핍증을 기능적으로 보충할 수 있다.
상동성/동일성은 알려진 방법을 이용해서 측정될 수 있다. 예를 들어, UWGCG 패키지는 (예를 들어, 디폴트 셋팅에 사용되는) 상동성을 계산하기 위해 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다(Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395). PILEUP 및 BLAST 알고리즘은, 예를 들어, 문헌[Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al. (1990) J Mol Biol 215:403-10]에서 상동성을 계산하거나 서열을 (전형적으로 이들의 디폴트 세팅에서) 라인업하기 위해 사용될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물정보센터를 통해 공개적으로 입수 가능하다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
바람직한 실시형태에서, 재조합 핵산 서열은 적어도 20개(바람직하게는 적어도 30개, 예를 들어, 적어도 40, 60, 100, 200, 300, 400개 이상의 연속 아미노산)에 걸쳐, 또는 심지어 재조합 핵산의 전체 서열에 걸쳐 ND4 단백질의 관련 영역(서열번호 160)과 적어도 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상의 바람직하게는 적어도 95%, 97%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 관련 영역은 ND4의 기능적 활성을 제공하는 것일 것이다.
대안적으로, 바람직하게는, 재조합 핵산 서열은 이의 전체 서열에 대해 전장 ND4(서열번호 160)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상, 바람직하게는 적어도 95%, 97%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 전형적으로 재조합 핵산 서열은 ND4(서열번호 160)의 관련 영역과 적어도 또는 2, 5, 10, 20, 40, 50 또는 60개 미만의 돌연변이(이들 각각은 치환, 삽입 또는 결실일 수 있음)만큼 상이하다.
재조합 핵산 ND4 폴리펩타이드는 위에 언급된 서열의 임의의 길이에 걸쳐 임의의 특정 동일성 백분율 값과 동일한 서열번호 160의 특정 영역과 소정의 동일성 백분율을 가질 수 있다(즉, 이는 적어도 70%, 80% 또는 90% 이상, 더 바람직하게는 적어도 95%, 97%, 99%의 동일성을 가질 수 있다).
ND4(서열번호 160)의 변이체는 또한 절단을 포함한다. 변이체가 여전히 기능적이라면 임의의 절단이 또한 사용될 수 있다. 단백질 활성에 필수적이지 않고/않거나 폴딩된 단백질의 입체구조, 특히 활성 부위의 폴딩에 영향을 미치지 않는 서열을 제거하기 위한 절단이 전형적으로 이루어질 것이다. N- 또는 C-말단으로부터의 다양한 길이의 서열의 체계적 절단에 의해 적절한 절단이 일상적으로 확인될 수 있다. 바람직한 절단은 N-말단이고, 촉매적 도메인을 제외한 모든 다른 서열을 제거할 수 있다.
ND4(서열번호 160)의 변이체는 추가로 ND4(서열번호 160)의 특정 영역에 대해 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 40개 이상의 아미노산 삽입, 치환 또는 결실)을 갖는 돌연변이체를 포함한다. 결실 및 삽입은 바람직하게는 아래에 기재되는 바와 같은 촉매 도메인 외부에서 이루어진다. 치환은 또한 전형적으로 프로테아제 활성에 비필수적이고/이거나 폴딩된 단백질의 입체구조에 영향을 미치지 않는 영역에서 이루어진다.
치환은 바람직하게는 아미노산을 유사한 화학 구조, 유사한 화학적 특성 또는 유사한 측쇄 용적의 다른 아미노산으로 대체하는 하나 이상의 보존적 변화를 도입한다. 도입되는 아미노산은 이들이 대체하는 아미노산과 유사한 극성, 친수성, 소수성, 염기도, 산도, 중화성 또는 전하를 가질 수 있다. 대안적으로, 보존적 변화는 기존의 방향족 또는 지방족 아미노산 대신에 다른 방향족 또는 지방족 아미노산을 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 변화는 당업계에 잘 공지되어 있으며, 아미노산의 특성에 따라 선택될 수 있다.
유사하게, ND4(서열번호 6)의 폴리뉴클레오타이드 서열의 바람직한 변이체는 ND4(서열번호 6)의 관련 영역과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직하게는 변이체는 전체 서열에 대한 전장 ND4(서열번호 6)에 대한 이러한 동일성 수준을 나타낸다.
미토콘드리아 표적화 서열(MTS) 및 3' 비번역 영역(3' UTR)은 단백질 또는 mRNA를 미토콘드리아에 표적화하는 데 사용될 수 있다. MTS의 전하, 길이 및 구조는 미토콘드리아에 대한 단백질 이입에 중요할 수 있다. 특정 3' UTR은 미토콘드리아 표면에 대한 mRNA 국재화를 유도하고, 따라서 미토콘드리아에 공동번역 단백질 이입을 촉진시킬 수 있다.
미토콘드리아 표적화 서열에 대한 폴리뉴클레오타이드 서열은 hsCOX10, hsCOX8, scRPM2, lcSirt5, tbNDUS7, ncQCR2, hsATP5G2, hsLACTB, spilv1, gmCOX2, crATP6, hsOPA1, hsSDHD, hsADCK3, osP0644B06.24-2, 뉴로스포라 크라사 ATP9(ncATP9), hsGHITM, hsNDUFAB1, hsATP5G3, crATP6_hsADCK3, ncATP9_ncATP9, zmLOC100282174, ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_ncATP9, zmLOC100282174_hsADCK3_crATP6_hsATP5G3, zmLOC100282174_hsADCK3_hsATP5G3, ncATP9_zmLOC100282174, hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6 _hsATP5G3, crATP6_hsADCK3_zmLOC100282174_hsATP5G3, hsADCK3_zmLOC100282174, hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6, ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_GNFP_ncATP9 및 ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_lcSirt5_osP0644B06.24-2_hsATP5G2_ncATP9로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다(서열번호에 대해 표 1 참조). 일례에서, 폴리뉴클레오타이드 서열, COX10(서열번호 1, 2 또는 3)은 미토콘드리아 표적화 서열, MTS-COX10(서열번호 126)을 암호화할 수 있다. 다른 예에서, 폴리뉴클레오타이드 서열, COX8(서열번호 4)은 미토콘드리아 표적화 서열, MTS-COX8(서열번호 127)을 암호화할 수 있다. 다른 예에서, 폴리뉴클레오타이드 서열, OPA1(서열번호 5)은 미토콘드리아 표적화 서열, MTS-OPA1(서열번호 128)을 암호화할 수 있다.
3' UTR 핵산 서열은 hsACO2(서열번호 111), hsATP5B(서열번호 112), hsAK2(서열번호 113), hsALDH2(서열번호 114), hsCOX10(서열번호 115), hsUQCRFS1(서열번호 116), hsNDUFV1(서열번호 117), hsNDUFV2(서열번호 118), hsSOD2(서열번호 119), hsCOX6c(서열번호 120), hsIRP1(서열번호 121), hsMRPS12(서열번호 122), hsATP5J2(서열번호 123), rnSOD2(서열번호 124) 및 hsOXA1L(서열번호 125)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 3' UTR 핵산 서열은 또한 본 명세서에 열거된 임의의 3' UTR 핵산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 변이체일 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 핵산 서열은 서열번호 13 또는 14일 수 있다.
또한 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열 및 3' UTR 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 서열이 본 명세서에 개시된다. 예를 들어, 재조합 핵산 서열은 서열번호 15 내지 84로부터 선택될 수 있다. 재조합 핵산 서열은 또한 본 명세서에 열거된 임의의 재조합 핵산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 변이체일 수 있다.
프로모터 및 조절 서열
본 발명의 벡터는 또한 시험관내 또는 생체내에서 개시된 이식유전자의 발현을 가능하게 하는 구성요소를 포함한다. 따라서, 벡터는 전형적으로 이식유전자 또는 이의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함한다.
임의의 적합한 프로모터가 사용될 수 있다. 프로모터 서열은 구성적으로 활성일 수 있고, 즉, 임의의 숙주 세포 배경에서 작동적일 수 있거나, 또는 대안적으로 특정 숙주 세포 환경에서만 활성일 수 있으며, 이에 의해 특정 세포 유형에서 이식유전자의 표적화된 발현을 가능하게 한다. 프로모터는 다른 인자, 예를 들어, 숙주 세포에 존재하는 인자의 존재에 반응하는 유도성 발현을 나타낼 수 있다. 임의의 사건에서, 벡터가 요법에 대해 투여되는 경우, 프로모터는 망막 세포 배경에서 기능적이어야 한다.
일부 실시형태에서, 이식유전자가 망막 세포 집단에서만 발현되는 것을 가능하게 하기 위해 프로모터는 망막 세포-특이적 발현을 나타내는 것이 바람직하다. 따라서, 프로모터로부터의 발현은 망막-특이적일 수 있고, 예를 들어, 감각신경 망막 및 망막색소상피의 세포에만 국한된다.
ND4 이식유전자에 대한 바람직한 프로모터는 선택적으로 거대세포바이러스(CME) 인핸서 구성요소와 조합하여 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터를 포함한다. 일부 경우에, ND4 이식유전자에 대한 바람직한 프로모터는 CAG 프로모터를 포함한다. 특히 바람직한 프로모터는 혼성 CBA/CAG 프로모터, 예컨대, rAVE 발현 카세트에서 사용되는 프로모터. 망막-특이적 유전자를 유도하는 인간 서열에 기반한 프로모터의 예는 간상세포 및 추상세포에 대해 로돕신 키나제(Allocca et. al, 2007, J Viol 81: 11372-80), 추상세포 단독에 대해 PR2.1(Mancuso et. al, 2009, Nature), 및/또는 망막색소상피에 대해 RPE65(Bainbridge et. al, 2008, N Eng J Med)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 169에 제시된 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 169에 제시된 바와 같은 서열과 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 169의 서열을 갖는다.
본 발명의 벡터는 또한 전사 전에 또는 전사 후에 작용할 수 있는 하나 이상의 추가 조절 서열을 포함할 수 있다. 조절 서열은 천연 ND4 좌위의 일부일 수 있거나 이종성 조절 서열일 수 있다. 본 발명의 벡터는 천연 ND4 전사로부터의 5' UTR 또는 3' UTR의 여러 부분을 포함할 수 있다.
조절 서열은 이식유전자의 발현을 촉진시키는, 즉, 전사의 발현을 증가시키거나, mRNA의 핵 유출을 개선시키거나 또는 이의 안정성을 향상시키는 작용을 하는 임의의 서열이다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어, 인핸서 구성요소, 조절 후 구성요소 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 본 발명의 벡터와 관련하여, 이러한 조절 서열은 시스-작용성일 것이다. 그러나, 본 발명은 또한 추가 유전자 작제물 상에 위치된 트랜스-작용성 조절 서열을 상정한다.
본 발명의 벡터에서 사용하기 위한 바람직한 조절 후 구성요소는 우드척 간염 바이러스 조절 후 구성요소(WPRE) 또는 이의 변이체이다. 본 발명의 벡터에서 사용될 수 있는 다른 조절 서열은 스캐폴드-부착 영역(SAR)이다.
인트론
스페이서 서열로도 알려진 인트론은 암호화 효과를 갖지 않고 진핵 세포의 DNA에서 개재 서열인 유전자 또는 mRNA 분자의 세그먼트를 지칭한다. 이러한 서열은 전구체 RNA에서 전사되고, 스플라이싱에 의해 제거되어, 궁극적으로 성숙 RNA 분자로부터 제거된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 재조합 핵산은 인트론을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인트론은 프로모터와 Kozak 서열 사이에 위치된다. 일부 실시형태에서, 인트론은 프로모터와 미토콘드리아 표적화 서열 사이에 위치된다. 일부 실시형태에서, 인트론은 프로모터와 미토콘드리아 단백질 암호화 서열 사이에 위치된다.
일부 실시형태에서, 인트론은 서열번호 170에 제시된 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인트론은 서열번호 170에 제시된 바와 같은 서열과 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인트론은 서열번호 170의 서열을 갖는다.
Kozak 서열
Kozak 서열(Kozak 공통 서열(consensus sequence))은 진핵 mRNA에 존재한다. 리보솜은 mRNA 상에서 이 서열을 인식할 수 있고, 이를 번역 개시 부위로서 사용한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 재조합 핵산은 kozak 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, kozak 서열은 서열번호 171이다. 일부 실시형태에서, kozak 서열은 서열번호 171과 최대 1, 2 또는 3개의 뉴클레오타이드만큼 상이하다.
당업계의 일부 기술적 설명에서, kozak 서열은 3' 말단에서 4개 뉴클레오타이드 길이의 번역 개시 서열에 바로 측접하는 서열번호 171에 제시된 바와 같고, 완전한 측접 서열은 뉴클레오타이드 -4 내지 -2를 갖는 GCCACCATGG(서열번호 177)이고, 개시 코돈은 ATG이다. 따라서, 당업자는 kozak 서열이 암호화 서열에 결찰될 때(예를 들어, Kozak 서열이 미토콘드리아 표적화 서열 앞에 위치될 때), 암호화 서열 앞에 있는 Kozak 서열은 이런 4개 뉴클레오타이드의 번역 개시 서열을 포함하지 않는다는 것을 이해할 것이다.
폴리A 꼬리
폴리아데닐산(폴리A) 꼬리는 보통 유전자의 암호화 영역의 하류에 위치되고 전사를 종결시키는 작용을 한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 폴리A 꼬리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리A 꼬리는 150 내지 200개의 아데닐화 잔기를 갖는다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 유인원 액포 바이러스 폴리A 꼬리(SV40 폴리A)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유인원 액포 바이러스 폴리A 꼬리는 서열번호 173에 제시된 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유인원 액포 바이러스 폴리A 꼬리는 서열번호 173에 제시된 바와 같은 서열과 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열이다. 일부 실시형태에서, 유인원 액포 바이러스 폴리A 꼬리는 서열번호 173의 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 소 성장 인자 폴리A 꼬리(bGH 폴리A)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 소 성장 인자 폴리A 꼬리는 서열번호 172에 제시된 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 소 성장 인자 폴리A 꼬리는 서열번호 172에 제시된 바와 같은 서열과 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열이다. 일부 실시형태에서, 소 성장 인자 폴리A 꼬리는 서열번호 172의 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴리A 신호 서열은 122개 이하의 염기쌍(bp), 125개 이하의 염기쌍, 130개 이하의 염기쌍, 140개 이하의 염기쌍, 150개 이하의 염기쌍, 160개 이하의 염기쌍, 170개 이하의 염기쌍, 180개 이하의 염기쌍, 190개 이하의 염기쌍, 200개 이하의 염기쌍, 220개 이하의 염기쌍, 240개 이하의 염기쌍, 260개 이하의 염기쌍, 280개 이하의 염기쌍 또는 300개 이하의 염기쌍 길이이다.
벡터의 제조
본 발명의 벡터는 유전자 요법을 위한 벡터의 제공을 위해 당업계에 알려진 표준 수단에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 잘 확립된 공공 도메인 형질감염, 패키징 및 정제 방법은 적합한 벡터 제조를 제조하는 데 사용될 수 있다.
위에 논의된 바와 같이, 본 발명의 벡터는 ND4 또는 이의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 추가로 자연 발생적 AAV 바이러스의 전체 게놈을 포함할 수 있다. 그러나, 통상적으로 유도체화된 게놈, 예를 들어, 적어도 하나의 역위 말단 반복부(ITR) 서열을 갖지만 가능하게는 임의의 AAV 유전자, 예컨대, rep 또는 cap를 결여하는 유전자가 사용될 것이다.
이러한 실시형태에서, AAV 바이러스 입자에 유도체화된 게놈의 조립을 제공하기 위해, AAV 및/또는 헬퍼 바이러스 기능을 제공하는 추가적인 유전자 작제물은 유도체화된 게놈과 조합하여 숙주 세포에서 제공될 것이다. 이러한 추가적인 작제물은 전형적으로 구조적 AAV 캡시드 단백질, 즉, cap, VP1, VP2, VP3을 암호화하는 유전자, 및 AAV 생활사, 예컨대, rep에 필요한 다른 기능을 암호화하는 유전자를 포함할 것이다. 추가 작제물 상에 제공된 구조적 캡시드 단백질의 선택은 패키지 바이러스 벡터의 혈청형을 결정할 것이다.
본 발명에서 사용하기 위한 특히 바람직한 패키징 바이러스 벡터는 AAV5 또는 AAV8 캡시드 단백질과 조합하여 AAV2의 유도체화된 게놈을 포함한다. 이런 패키징된 바이러스 벡터는 전형적으로 하나 이상의 AAV2 ITR을 포함한다.
위에 언급한 바와 같이, AAV 바이러스는 복제 부적격이고 따라서 헬퍼 바이러스가 기능하며, 바람직하게는 아데노바이러스 헬퍼 기능은 전형적으로 AAV 복제를 가능하게 하기 위해 하나 이상의 추가적인 작제물 상에서 또한 제공될 것이다.
모든 위의 추가적인 작제물은 숙주 세포에서 플라스미드 또는 다른 에피손 구성요소로서 제공될 수 있거나, 또는 대안적으로 하나 이상의 작제물은 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다.
이러한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 벡터의 생성 방법을 제공한다. 상기 방법은 아데노-연관 바이러스(AAV) 게놈 또는 이들의 유도체 및 숙주 세포에서 ND4 또는 이의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 단계, 및 벡터의 복제 및 조립을 위한 수단을 AAV 바이러스 입자에 제공하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 방법은 AAV 및/또는 헬퍼 바이러스 기능을 암호화하는 하나 이상의 추가적인 유전자 작제물과 함께 AAV 게놈의 유도체 및 ND4 또는 이의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 단계를 포함한다. 전형적으로, AAV 게놈의 유도체는 적어도 하나의 ITR을 포함한다. 선택적으로, 상기 방법은 조립된 바이러스 입자를 정제하는 단계를 더 포함한다. 추가적으로, 상기 방법은 치료적 용도를 위해 바이러스 입자를 제형화하는 단계를 포함할 수 있다.
요법의 방법 및 의학적 용도
위에 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 벡터가 LHON의 기저를 이루는 세포 기능장애를 처리하기 위해 사용될 수 있다는 것을 입증하였다. 특히, 이들은 벡터의 사용이 LHON과 연관된 결함을 수정할 수 있다는 것을 나타냈다. 이는 질환의 퇴행 과정이 치료, 저지, 완화 또는 예방될 수 있는 수단을 제공한다.
따라서 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 벡터의 치료적 유효량을 직접 망막, 망막하 또는 유리체내 주사에 의해 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, LHON의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서, LHON을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 벡터를 투여하기 전에, 투여하는 동안에 그리고/또는 투여한 후에 스테로이드를 투여하는 단계를 더 포함한다. 따라서, 이에 의해 LHON은 환자에서 치료 또는 예방된다.
본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 벡터는 본 명세서에 기재된 벡터, 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 동등한 벡터, 및 이들의 바이오시밀러(biosimilar)를 포함한다. 본 발명에 따른 방법에서 사용하기에 적합한 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 동등한 벡터는 당업계에 기재된 것, 예컨대, Guy 등의 문헌[Ophthalmology 2017; 124:1621-1634] 및 Vignal 등의 문헌[Ophthalmology 2018; 6:945-947]에 기재된 것을 포함하며, 이들 각각은 본 명세서에 이들의 전문이 참조에 의해 원용된다. 바이오시밀러는 기존의 FDA-승인 참조 제품("RP")과 매우 유사하고 임상적으로 의미있는 차이를 갖지 않는 생물학적 제품이다. "고도로 유사한" 제품은 참조 제품과 유사한 순도, 화학적 특성 및 생물학적 활성을 갖는 제품이다. 그러나, 참조 제품과 제안된 바이오시밀러 제품의 임상적으로 비활성인 구성성분 사이의 약간의 차이는 허용 가능하다. 예를 들어, 이들은 참조 제품에서 사용되는 안정제 또는 완충제에 비해서 안정제 또는 완충체에 약간의 차이를 포함할 수 있으며, 생산 과정 동안에 약간의 차이(즉, 허용 가능한 제품내 변동)는 예상된다. FDA는 제안된 바이오시밀러 제품과 참조 제품 사이의 임의의 차이를 주의해서 평가하여 바이오시밀러가 높은 FDA 승인 표준을 충족시킨다는 것을 보장할 것이다. "임상적으로 의미있는 차이 없음"은, 전형적으로 인간 약물동태학(노출) 및 약력학(반응) 연구, 임상 면역원성 평가, 필요한 경우, 추가 임상 연구에 의해 입증되는 바와 같이, 바이오시밀러 제품이 참조 제품으로부터의 안전성, 순도 및 효력(안전성 및 효능)에서 임상적으로 의미있는 차이를 갖지 않는다는 것을 의미한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법에 따른 치료를 필요로 하는 환자는 하나 이상의 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 점 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 환자는 미토콘드리아의 산화적 인산화 사슬에서 복합체 I의 단백질을 암호화하는 유전자에서 점 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, 환자는 NADH 탈수소효소 서브유닛-4 단백질(ND4)을 암호화하는 MT-ND4 유전자(ND4로도 알려짐, NCBI 유전자 ID: 4538)에서 하나 이상의 점 돌연변이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 ND4 유전자의 뉴클레오타이드 위치 11778에서 점 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 점 돌연변이는 ND4 유전자에서의 G11778A이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법에 따른 치료를 필요로 하는 환자는 ND4 유전자에서 G11778A 점 돌연변이를 갖고 중국인 및/또는 아르헨티나인 자손이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법에 따른 치료를 필요로 하는 환자는 ND4 유전자에서 G11778A 점 돌연변이를 갖고 아르헨티나인 자손이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법에 따른 치료를 필요로 하는 환자는 ND4 유전자에서 G11778A 점 돌연변이를 갖고 중국인 자손이다.
관련된 양상에서, 본 발명은 벡터를 직접 망막, 망막하 또는 유리체내 주사에 의해 환자에게 투여함으로써 LHON을 치료 또는 예방하는 방법에서의 본 발명의 벡터의 용도를 제공한다. 추가적으로, 본 발명은 직접 망막, 망막하 또는 유리체내 주사에 의해 LHON을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 벡터의 용도를 제공한다.
모든 이러한 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 LHON의 하나 이상의 증상의 발병을 예방하기 위해 투여될 수 있다. 환자는 무증상일 수 있다. 대상체는 질환에 대한 소인을 가질 수 있다. 상기 방법 또는 용도는 대상체가 LHON이 발생될 위험에 있거나 이를 갖는지의 여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 예방적 유효량의 벡터가 이러한 대상체에게 투여된다. 예방적 유효량은 질환의 하나 이상의 증상의 발병을 예방하는 양이다.
대안적으로, 벡터는, 일단 발병된 대상체에서 질환의 증상이 나타나면, 즉, 질환의 기존의 증상을 치유하기 위해 투여될 수 있다. 예방적 유효량의 길항제가 이러한 대상체에게 투여된다. 치료적 유효량은 질환의 하나 이상의 증상을 개선시키는 데 효과적인 양이다. 이러한 양은 또한 LHON과 연관된 주변시의 일부 손실을 저지하거나, 늦추거나 또는 반전시킬 수 있다. 이러한 양은 또한 LHON의 발병은 저지하거나, 늦추거나 또는 반전시킬 수 있다.
전형적인 단일 용량은 형질도입을 필요로 하는 남아있는 망막 조직의 양에 따라서 1010 내지 1012개의 게놈 입자이다. 게놈 입자는 실시간 PCR과 같은 서열-특이적 방법을 이용하여 정량화될 수 있는 단일-가닥 DNA 분자를 포함하는 AAV 캡시드로서 본 명세서에서 정의된다. 해당 용량은 단일 용량으로서 제공될 수 있지만, 반측 눈에 대해, 또는 어떤 이유로(예를 들어, 수술 합병증) 벡터가 망막의 정확한 영역을 표적화하지 않을 수 있는 경우에 반복될 수 있다. 치료는 바람직하게는 각 눈에 대한 단일 영구적 치료이지만, 예를 들어, 향후 몇 년간 및/또는 다른 AAV 혈청형에 대한 반복 주사가 고려될 수 있다.
본 발명은 또한 직접 망막, 망막하 또는 유리체내 주사에 의한 본 발명의 AAV 벡터의 투여 후 상기 환자로부터 얻은 망막 세포에서 생체 외 활성을 측정하는 단계를 포함하는 환자의 LHON의 치료 또는 예방을 모니터링하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 투여될 치료의 효능을 가능하게 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 벡터 및 스테로이드를 투여하는 단계를 포함하는, 안장애(예를 들어, LHON)를 치료하는 방법을 제공한다. 예시적인 스테로이드는 알클로메타손 다이프로피오네이트, 암시노나이드, 베클로메타손 다이프로피오네이트, 베타메타손, 베타메타손 벤조에이트, 베타메타손 다이프로피오네이트, 베타메타손 소듐 포스페이트, 베타메타손 소듐 포스페이트 및 소듐 아세테이트, 베타메타손 발레레이트, 클로베타솔 프로피오네이트, 클로코르톨론 피발레이트, 코티솔(하이드로코티손), 코티솔 아세테이트(하이드로코티손), 코티손 뷰티레이트(하이드로코티손), 코티솔 사이피오네이트(하이드로코티손), 코티솔(하이드로코티손) 소듐 포스페이트, 코티솔(하이드로코티손) 소듐 석시네이트, 코티솔 발레레이트(하이드로코티손), 코티손 아세테이트, 데소나이트, 데속시메타손, 덱사메타손, 덱사메타손 아세테이트, 덱사메타손 소듐 포스페이트, 다이플로라손 다이아세테이트, 플루드로코티손 아세테이트, 플루니솔라이드, 플루오시노니드, 플루오시놀론 아세토나이트 아세테이트, 플루오로메톨론, 플루란드레놀라이드, 할시노나이드, 메드리손, 메틸프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 메틸프레드니솔론 소듐 석시네이트, 모메타손 퓨로에이트, 파라메타손 아세테이트, 프레드니솔론, 프레드니솔론 아세테이트, 프레드니솔론 소듐 포스페이트, 프레드니솔론 뷰틸아세테이트, 프레드니손, 트라이암시놀론, 트라이암시놀론 아세토나이트, 트라이암시놀론 다이아세테이트, 및 트라이암시놀론 헥사아세토나이트, 또는 이들의 합성 유사체, 또는 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 글루코코르티코이드이다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 프레드니손, 메틸프레드니솔론 및 메틸프레드니솔론 소듐 석시네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 스테로이드는 메틸프레드니솔론이다. 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론은 경구 투여용으로 정제, 예를 들어, MEDROL® 정제로서 제형화된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론은 1종 이상의 비활성 성분, 예컨대, 스테아르산칼슘, 옥수수 전분, 에리트로신나트륨, 락토스, 광유, 솔브산, 수크로스 또는 FD&C 황색 6호와 함께 정제로서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론은 주사에 의한 투여를 위한 액체, 예를 들어, SOLU-MEDROL®로서 제형화된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 메틸프레드니솔론 소듐 석시네이트는 무수 아인산이수소나트륨, 무수 인산수소이나트륨, 또는 수소화된 락토스와 같은 1종 이상의 비활성 성분과 함께, 선택적으로 벤질 알코올과 같은 보존제와 함께 제형화된다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 MEDROL® 또는 SOLU-MEDROL®(이의 일반 형태를 포함)이다.
일부 실시형태에서, 환자는 약 1㎎/60㎏ 내지 약 100㎎/60㎏, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 80㎎/60㎏, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 60㎎/60㎏, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 100㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 80㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 60㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏ 내지 약 100㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏ 내지 약 80㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏ 내지 약 60㎎/60㎏, 약 60㎎/60㎏ 내지 약 100㎎/60㎏, 약 60㎎/60㎏ 내지 약 80㎎/60㎏, 또는 약 80㎎/60㎏ 내지 약 100㎎/60㎏ 범위의 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 4㎎/60㎏, 6㎎/60㎏, 8㎎/60㎏, 10㎎/60㎏, 16㎎/60㎏, 20㎎/60㎏, 24㎎/60㎏, 32㎎/60㎏, 40㎎/60㎏, 48㎎/60㎏, 60㎎/60㎏, 또는 80㎎/60㎏의 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 1㎎ 내지 약 96㎎ 범위의 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 적어도 약 1㎎의 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 최대 약 96㎎의 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 1㎎ 내지 약 2㎎, 약 1㎎ 내지 약 4㎎, 약 1㎎ 내지 약 8㎎, 약 1㎎ 내지 약 16㎎, 약 1㎎ 내지 약 32㎎, 약 1㎎ 내지 약 64㎎, 약 1㎎ 내지 약 96㎎, 약 2㎎ 내지 약 4㎎, 약 2㎎ 내지 약 8㎎, 약 2㎎ 내지 약 16㎎, 약 2㎎ 내지 약 32㎎, 약 2㎎ 내지 약 64㎎, 약 2㎎ 내지 약 96㎎, 약 4㎎ 내지 약 8㎎, 약 4㎎ 내지 약 16㎎, 약 4㎎ 내지 약 32㎎, 약 4㎎ 내지 약 64㎎, 약 4㎎ 내지 약 96㎎, 약 8㎎ 내지 약 16㎎, 약 8㎎ 내지 약 32㎎, 약 8㎎ 내지 약 64㎎, 약 8㎎ 내지 약 96㎎, 약 16㎎ 내지 약 32㎎, 약 16㎎ 내지 약 64㎎, 약 16㎎ 내지 약 96㎎, 약 32㎎ 내지 약 64㎎, 약 32㎎ 내지 약 96㎎, 또는 약 64㎎ 내지 약 96㎎ 범위의 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 1㎎, 약 2㎎, 약 4㎎, 약 8㎎, 약 16㎎, 약 32㎎, 약 64㎎, 또는 약 96㎎의 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)이다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 프레드니손이다.
일부 실시형태에서, 스테로이드의 1회 이상의 용량(즉, 수술 전 스테로이드의 1회 이상의 용량)은 치료 벡터의 투여 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 스테로이드의 1일 용량은 치료 벡터의 투여 전 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 1㎎/60㎏ 내지 약 100㎎/60㎏, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 80㎎/60㎏, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 60㎎/60㎏, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 100㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 80㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 60㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏ 내지 약 100㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏ 내지 약 80㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏ 내지 약 60㎎/60㎏, 약 60㎎/60㎏ 내지 약 100㎎/60㎏, 약 60㎎/60㎏ 내지 약 80㎎/60㎏, 또는 약 80㎎/60㎏ 내지 약 100㎎/60㎏ 범위의 수술 전 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 4㎎/60㎏, 6㎎/60㎏, 8㎎/60㎏, 10㎎/60㎏, 16㎎/60㎏, 20㎎/60㎏, 24㎎/60㎏, 32㎎/60㎏, 40㎎/60㎏, 48㎎/60㎏, 60㎎/60㎏, 또는 80㎎/60㎏의 수술 전 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 1㎎ 내지 약 96㎎ 범위의 수술 전 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 적어도 약 1㎎의 수술 전 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 최대 약 96㎎의 수술 전 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 1㎎ 내지 약 2㎎, 약 1㎎ 내지 약 4㎎, 약 1㎎ 내지 약 8㎎, 약 1㎎ 내지 약 16㎎, 약 1㎎ 내지 약 32㎎, 약 1㎎ 내지 약 64㎎, 약 1㎎ 내지 약 96㎎, 약 2㎎ 내지 약 4㎎, 약 2㎎ 내지 약 8㎎, 약 2㎎ 내지 약 16㎎, 약 2㎎ 내지 약 32㎎, 약 2㎎ 내지 약 64㎎, 약 2㎎ 내지 약 96㎎, 약 4㎎ 내지 약 8㎎, 약 4㎎ 내지 약 16㎎, 약 4㎎ 내지 약 32㎎, 약 4㎎ 내지 약 64㎎, 약 4㎎ 내지 약 96㎎, 약 8㎎ 내지 약 16㎎, 약 8㎎ 내지 약 32㎎, 약 8㎎ 내지 약 64㎎, 약 8㎎ 내지 약 96㎎, 약 16㎎ 내지 약 32㎎, 약 16㎎ 내지 약 64㎎, 약 16㎎ 내지 약 96㎎, 약 32㎎ 내지 약 64㎎, 약 32㎎ 내지 약 96㎎, 또는 약 64㎎ 내지 약 96㎎ 범위의 수술 전 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 1㎎, 약 2㎎, 약 4㎎, 약 8㎎, 약 16㎎, 약 32㎎, 약 64㎎, 또는 약 96㎎의 수술 전 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)이다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 프레드니손이다.
일부 실시형태에서, 환자는 약 20㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏, 약 25㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏, 약 30㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏, 약 35㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏, 약 25㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏, 약 30㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏, 약 35㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 35㎎/60㎏, 약 25㎎/60㎏ 내지 약 35㎎/60㎏, 약 30㎎/60㎏ 내지 약 35㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 30㎎/60㎏, 약 25㎎/60㎏ 내지 약 30㎎/60㎏ 또는 약 20㎎/60㎏ 내지 약 25㎎/60㎏ 범위의 수술 전 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 25㎎/60㎏, 약 26㎎/60㎏, 약 27㎎/60㎏, 약 28㎎/60㎏, 약 29㎎/60㎏, 약 30㎎/60㎏, 약 31㎎/60㎏, 약 32㎎/60㎏, 약 33㎎/60㎏, 약 34㎎/60㎏, 또는 약 35㎎/60㎏의 수술 전 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)이다. 일부 실시형태에서, 25㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏ 범위의 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)의 1일 용량은 치료 벡터의 투여 전 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 약 32㎎/60㎏의 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)의 1일 용량은 치료 벡터의 투여 전 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다.
일부 실시형태에서, 환자는 약 50㎎/60㎏ 내지 약 70㎎/60㎏, 약 55㎎/60㎏ 내지 약 70㎎/60㎏, 약 60㎎/60㎏ 내지 약 70㎎/60㎏, 약 65㎎/60㎏ 내지 약 70㎎/60㎏, 약 50㎎/60㎏ 내지 약 65㎎/60㎏, 약 55㎎/60㎏ 내지 약 65㎎/60㎏, 약 60㎎/60㎏ 내지 약 65㎎/60㎏, 약 50㎎/60㎏ 내지 약 60㎎/60㎏, 약 55㎎/60㎏ 내지 약 60㎎/60㎏, 또는 약 50㎎/60㎏ 내지 약 55㎎/60㎏ 범위의 수술 전 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 55㎎/60㎏, 약 56㎎/60㎏, 약 57㎎/60㎏, 약 58㎎/60㎏, 약 59㎎/60㎏, 약 60㎎/k, 약 61㎎/60㎏, 약 62㎎/60㎏, 약 63㎎/60㎏, 약 64㎎/60㎏, 또는 약 65㎎/60㎏의 1회 이상의 수술 전 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 프레드니손이다. 일부 실시형태에서, 약 50㎎/60㎏ 내지 약 70㎎/60㎏ 범위의 프레드니손의 1일 용량은 치료 벡터의 투여 전 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 약 60㎎/60㎏의 프레드니손의 1일 용량은 치료 벡터의 투여 전 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다.
일부 실시형태에서, 스테로이드의 1회 이상의 용량(즉, 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량)은 치료 벡터의 투여 후에 투여된다. 일부 실시형태에서, 스테로이드의 1일 용량은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 스테로이드의 1일 용량은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 5일, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주 또는 적어도 15주 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 1㎎/60㎏ 내지 약 100㎎/60㎏, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 80㎎/60㎏, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 60㎎/60㎏, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 100㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 80㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 60㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏ 내지 약 100㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏ 내지 약 80㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏ 내지 약 60㎎/60㎏, 약 60㎎/60㎏ 내지 약 100㎎/60㎏, 약 60㎎/60㎏ 내지 약 80㎎/60㎏, 및 약 80㎎/60㎏ 내지 약 100㎎/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 1㎎ 내지 약 96㎎의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 적어도 약 1㎎의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 최대 약 96㎎의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 1㎎ 내지 약 2㎎, 약 1㎎ 내지 약 4㎎, 약 1㎎ 내지 약 8㎎, 약 1㎎ 내지 약 16㎎, 약 1㎎ 내지 약 32㎎, 약 1㎎ 내지 약 64㎎, 약 1㎎ 내지 약 96㎎, 약 2㎎ 내지 약 4㎎, 약 2㎎ 내지 약 8㎎, 약 2㎎ 내지 약 16㎎, 약 2㎎ 내지 약 32㎎, 약 2㎎ 내지 약 64㎎, 약 2㎎ 내지 약 96㎎, 약 4㎎ 내지 약 8㎎, 약 4㎎ 내지 약 16㎎, 약 4㎎ 내지 약 32㎎, 약 4㎎ 내지 약 64㎎, 약 4㎎ 내지 약 96㎎, 약 8㎎ 내지 약 16㎎, 약 8㎎ 내지 약 32㎎, 약 8㎎ 내지 약 64㎎, 약 8㎎ 내지 약 96㎎, 약 16㎎ 내지 약 32㎎, 약 16㎎ 내지 약 64㎎, 약 16㎎ 내지 약 96㎎, 약 32㎎ 내지 약 64㎎, 약 32㎎ 내지 약 96㎎, 또는 약 64㎎ 내지 약 96㎎ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 1㎎, 약 2㎎, 약 4㎎, 약 8㎎, 약 16㎎, 약 32㎎, 약 64㎎, 또는 약 96㎎의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)이다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 프레드니손이다.
일부 실시형태에서, 환자는 약 70㎎/60㎏ 내지 약 90㎎/60㎏, 75㎎/60㎏ 내지 약 90㎎/60㎏, 약 80㎎/60㎏ 내지 약 90㎎/60㎏, 약 85㎎/60㎏ 내지 약 90㎎/60㎏, 약 70㎎/60㎏ 내지 약 85㎎/60㎏, 약 75㎎/60㎏ 내지 약 85㎎/60㎏, 약 80㎎/60㎏ 내지 약 85㎎/60㎏, 약 70㎎/60㎏ 내지 약 80㎎/60㎏, 약 75㎎/60㎏ 내지 약 80㎎/60㎏ 또는 약 70㎎/60㎏ 내지 약 75㎎/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 75㎎/60㎏, 약 76㎎/60㎏, 약 77㎎/60㎏, 약 78㎎/60㎏, 약 79㎎/60㎏, 약 80㎎/60㎏, 약 81㎎/60㎏, 약 82㎎/60㎏, 약 83㎎/60㎏, 약 84㎎/60㎏, 또는 약 85㎎/60㎏의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 메틸프레드니솔론 소듐 석시네이트(예를 들어, SOLU-MEDROL®)이다. 일부 실시형태에서, 약 70㎎ 내지 약 90㎎/60㎏ 범위의 메틸프레드니솔론 소듐 석시네이트(예를 들어, SOLU-MEDROL®)의 1일 용량은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 약 80㎎/60㎏의 메틸프레드니솔론 소듐 석시네이트(예를 들어, SOLU-MEDROL®)의 1일 용량은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다.
일부 실시형태에서, 환자는 약 30㎎/60㎏ 내지 약 50㎎/60㎏, 35㎎/60㎏ 내지 약 50㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏ 내지 약 50㎎/60㎏, 약 45㎎/60㎏ 내지 약 50㎎/60㎏, 약 30㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏, 약 35㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏, 약 30㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏, 약 35㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏ 또는 약 30㎎/60㎏ 내지 약 35㎎/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 35㎎/60㎏, 약 36㎎/60㎏, 약 37㎎/60㎏, 약 38㎎/60㎏, 약 39㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏, 약 41㎎/60㎏, 약 42㎎/60㎏, 약 43㎎/60㎏, 약 44㎎/60㎏, 또는 약 45㎎/60㎏의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)이다. 일부 실시형태에서, 30㎎/60㎏ 내지 약 50㎎/60㎏ 범위의 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)의 1일 용량은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 약 40㎎/60㎏의 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)의 1일 용량은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다.
일부 실시형태에서, 환자는 약 20㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏, 25㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏, 약 30㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏, 약 35㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏, 약 25㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏, 약 30㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏, 약 35㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 35㎎/60㎏, 약 25㎎/60㎏ 내지 약 35㎎/60㎏, 약 30㎎/60㎏ 내지 약 35㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 30㎎/60㎏, 약 25㎎/60㎏ 내지 약 30㎎/60㎏ 또는 약 20㎎/60㎏ 내지 약 25㎎/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 25㎎/60㎏, 약 26㎎/60㎏, 약 27㎎/60㎏, 약 28㎎/60㎏, 약 29㎎/60㎏, 약 30㎎/60㎏, 약 31㎎/60㎏, 약 32㎎/60㎏, 약 33㎎/60㎏, 약 34㎎/60㎏, 또는 약 35㎎/60㎏의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)이다. 일부 실시형태에서, 20㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏ 범위의 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)의 1일 용량은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 약 32㎎/60㎏의 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)의 1일 용량은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다.
일부 실시형태에서, 환자는 약 15㎎/60㎏ 내지 약 35㎎/60㎏, 20㎎/60㎏ 내지 약 35㎎/60㎏, 약 25㎎/60㎏ 내지 약 35㎎/60㎏, 약 30㎎/60㎏ 내지 약 35㎎/60㎏, 약 15㎎/60㎏ 내지 약 30㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 30㎎/60㎏, 약 25㎎/60㎏ 내지 약 30㎎/60㎏, 약 15㎎/60㎏ 내지 약 25㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 25㎎/60㎏ 또는 약 15㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 20㎎/60㎏, 약 21㎎/60㎏, 약 22㎎/60㎏, 약 23㎎/60㎏, 약 24㎎/60㎏, 약 25㎎/60㎏, 약 26㎎/60㎏, 약 27㎎/60㎏, 약 28㎎/60㎏, 약 29㎎/60㎏ 또는 약 30㎎/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)이다. 일부 실시형태에서, 약 15㎎/60㎏ 내지 약 35㎎/60㎏의 1일 용량에 의한 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 약 24㎎/60㎏의 1일 용량에 의한 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다.
일부 실시형태에서, 환자는 약 5㎎/60㎏ 내지 약 25㎎/60㎏, 10㎎/60㎏ 내지 약 25㎎/60㎏, 약 15㎎/60㎏ 내지 약 25㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 25㎎/60㎏, 약 5㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏, 약 10㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏, 약 15㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏, 약 5㎎/60㎏ 내지 약 15㎎/60㎏, 약 10㎎/60㎏ 내지 약 15㎎/60㎏ 또는 약 5㎎/60㎏ 내지 약 10㎎/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 10㎎/60㎏, 약 11㎎/60㎏, 약 12㎎/60㎏, 약 13㎎/60㎏, 약 14㎎/60㎏, 약 15㎎/60㎏, 약 16㎎/60㎏, 약 17㎎/60㎏, 약 18㎎/60㎏, 약 19㎎/60㎏ 또는 약 20㎎/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)이다. 일부 실시형태에서, 약 5㎎/60㎏ 내지 약 25㎎/60㎏의 1일 용량에 의한 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 약 16㎎/60㎏의 1일 용량에 의한 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다.
일부 실시형태에서, 환자는 약 1㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏, 5㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏, 약 10㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏, 약 15㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 15㎎/60㎏, 약 5㎎/60㎏ 내지 약 15㎎/60㎏, 약 10㎎/60㎏ 내지 약 15㎎/60㎏, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 10㎎/60㎏, 약 5㎎/60㎏ 내지 약 10㎎/60㎏ 또는 약 1㎎/60㎏ 내지 약 5㎎/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 1㎎/60㎏, 약 2㎎/60㎏, 약 3㎎/60㎏, 약 4㎎/60㎏, 약 5㎎/60㎏, 약 6㎎/60㎏, 약 7㎎/60㎏, 약 8㎎/60㎏, 약 9㎎/60㎏, 약 10㎎/60㎏, 약 11㎎/60㎏, 약 12㎎/60㎏, 약 13㎎/60㎏, 약 14㎎/60㎏, 또는 약 15㎎/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)이다. 일부 실시형태에서, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏의 1일 용량에 의한 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 약 8㎎/60㎏의 1일 용량에 의한 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 약 6㎎/60㎏의 1일 용량에 의한 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 약 4㎎/60㎏의 1일 용량에 의한 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®)은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다.
일부 실시형태에서, 환자는 약 30㎎/60㎏ 내지 약 50㎎/60㎏, 35㎎/60㎏ 내지 약 50㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏ 내지 약 50㎎/60㎏, 약 45㎎/60㎏ 내지 약 50㎎/60㎏, 약 30㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏, 약 35㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏ 내지 약 45㎎/60㎏, 약 30㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏, 약 35㎎/60㎏ 내지 약 40㎎/60㎏ 또는 약 30㎎/60㎏ 내지 약 35㎎/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 35㎎/60㎏, 약 36㎎/60㎏, 약 37㎎/60㎏, 약 38㎎/60㎏, 약 39㎎/60㎏, 약 40㎎/60㎏, 약 41㎎/60㎏, 약 42㎎/60㎏, 약 43㎎/60㎏, 약 44㎎/60㎏, 또는 약 45㎎/60㎏의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 프레드니손이다. 일부 실시형태에서, 약 30㎎/60㎏ 내지 약 50㎎/60㎏의 1일 용량에 의한 프레드니손은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 약 40㎎/60㎏의 1일 용량에 의한 프레드니손은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다.
일부 실시형태에서, 환자는 약 10㎎/60㎏ 내지 약 30㎎/60㎏, 15㎎/60㎏ 내지 약 30㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 30㎎/60㎏, 약 25㎎/60㎏ 내지 약 30㎎/60㎏, 약 10㎎/60㎏ 내지 약 25㎎/60㎏, 약 15㎎/60㎏ 내지 약 25㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏ 내지 약 25㎎/60㎏, 약 10㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏, 약 15㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏ 또는 약 10㎎/60㎏ 내지 약 15㎎/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 15㎎/60㎏, 약 16㎎/60㎏, 약 17㎎/60㎏, 약 18㎎/60㎏, 약 19㎎/60㎏, 약 20㎎/60㎏, 약 21㎎/60㎏, 약 22㎎/60㎏, 약 23㎎/60㎏, 약 24㎎/60㎏ 또는 약 25㎎/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 프레드니손이다. 일부 실시형태에서, 약 10㎎/60㎏ 내지 약 30㎎/60㎏의 1일 용량에 의한 프레드니손은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 약 20㎎/60㎏의 1일 용량에 의한 프레드니손은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다.
일부 실시형태에서, 환자는 약 1㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏, 5㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏, 약 10㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏, 약 15㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 15㎎/60㎏, 약 5㎎/60㎏ 내지 약 15㎎/60㎏, 약 10㎎/60㎏ 내지 약 15㎎/60㎏, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 10㎎/60㎏, 약 5㎎/60㎏ 내지 약 10㎎/60㎏ 또는 약 1㎎/60㎏ 내지 약 5㎎/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 1㎎/60㎏, 약 2㎎/60㎏, 약 3㎎/60㎏, 약 4㎎/60㎏, 약 5㎎/60㎏, 약 6㎎/60㎏, 약 7㎎/60㎏, 약 8㎎/60㎏, 약 9㎎/60㎏, 약 10㎎/60㎏, 약 11㎎/60㎏, 약 12㎎/60㎏, 약 13㎎/60㎏, 약 14㎎/60㎏, 또는 약 15㎎/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 프레드니손이다. 일부 실시형태에서, 약 1㎎/60㎏ 내지 약 20㎎/60㎏의 1일 용량에 의한 프레드니손은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 약 10㎎/60㎏의 1일 용량에 의한 프레드니손은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다.
일부 실시형태에서, 환자는 약 1g/60㎏ 내지 약 15g/60㎏, 약 5g/60㎏ 내지 약 15g/60㎏, 약 10g/60㎏ 내지 약 15g/60㎏, 약 1g/60㎏ 내지 약 10g/60㎏, 약 5g/60㎏ 내지 약 10g/60㎏ 또는 약 1g/60㎏ 내지 약 5g/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 1g/60㎏, 약 2g/60㎏, 약 3g/60㎏, 약 4g/60㎏, 약 5g/60㎏, 약 6g/60㎏, 약 7g/60㎏, 약 8g/60㎏, 약 9g/60㎏, 약 10g/60㎏, 약 11g/60㎏, 약 12g/60㎏, 약 13g/60㎏, 약 14g/60㎏ 또는 약 15g/60㎏ 범위의 수술 후 스테로이드의 1회 이상의 용량을 투여받는다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 크레아틴 인산나트륨이다. 일부 실시형태에서, 약 1g/60㎏ 내지 약 15g/60㎏의 1일 용량에 의한 크레아틴 인산나트륨은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다. 일부 실시형태에서, 약 2g/60㎏의 1일 용량에 의한 크레아틴 인산나트륨은 치료 벡터의 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 적어도 10일 동안 전달된다.
일부 실시형태에서, 환자는 치료적 AAV 벡터가 투여되는 날에 크레아틴 인산나트륨(2g/60㎏)의 정맥내 용량 및 메틸프레드니솔론 소듐 석시네이트(예를 들어, SOL-MEDROL®, 80㎎/60㎏)의 정맥내 용량을 투여받고, 치료적 AAV 벡터의 투여 후 연속 3일 동안 매일 위의 약물을 둘 다 투여받는다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 제3일에, 40㎎/60㎏의 용량으로 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®) 정제는 연속 4일 동안 환자에게 투여된다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 제7일에, 32㎎/60㎏의 용량으로 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®) 정제는 연속 7일 동안 환자에게 투여된다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 제14일에, 24㎎/60㎏의 용량으로 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®) 정제는 연속 7일 동안 환자에게 투여된다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 제21일에, 16㎎/60㎏의 용량으로 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®) 정제는 연속 7일 동안 환자에게 투여된다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 제28일에, 8㎎/60㎏의 용량으로 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®) 정제는 연속 7일 동안 환자에게 투여된다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 제35일에, 6㎎/60㎏의 용량으로 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®) 정제는 연속 7일 동안 환자에게 투여된다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 제42일에, 4㎎/60㎏의 용량으로 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®) 정제는 연속 7일 동안 환자에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 치료적 AAV 벡터의 투여 7일 전에, 환자는 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®) 정제를 32㎎/60㎏의 용량으로 투여받는다. 치료적 AAV 벡터가 투여되는 날에, 환자는 연속 3일 동안 매일 메틸프레드니솔론 소듐 석시네이트(예를 들어, SOL-MEDROL®, 80㎎/60㎏)의 정맥내 용량을 투여받는다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 제3일에, 40㎎/60㎏의 용량으로 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®) 정제는 연속 4일 동안 환자에게 투여된다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 제7일에, 32㎎/60㎏의 용량으로 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®) 정제는 연속 7일 동안 환자에게 투여된다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 제14일에, 24㎎/60㎏의 용량으로 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®) 정제는 연속 7일 동안 환자에게 투여된다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 제21일에, 16㎎/60㎏의 용량으로 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®) 정제는 연속 7일 동안 환자에게 투여된다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 제28일에, 8㎎/60㎏의 용량으로 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®) 정제는 연속 7일 동안 환자에게 투여된다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 제35일에, 6㎎/60㎏의 용량으로 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®) 정제는 연속 7일 동안 환자에게 투여된다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 제42일에, 4㎎/60㎏의 용량으로 메틸프레드니솔론(예를 들어, MEDROL®) 정제는 연속 7일 동안 환자에게 투여된다. LHON 유전자 요법의 치료 요법의 예시적인 개략적 다이어그램을 도 8에 나타낸다.
일부 실시형태에서, 환자는 치료적 AAV 벡터의 투여 전 60㎎/60㎏의 용량으로 프레드니손 정제를 투여받고, 치료적 AAV 벡터의 투여 후 연속 7일 동안 매일 프레드니손 정제를 투여받는다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 8일에, 40㎎/㎏의 용량으로 프레드니손 정제는 1일 동안 환자에게 투여된다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 9일에, 20㎎/㎏의 용량으로 프레드니손 정제는 1일 동안 환자에게 투여된다. 치료적 AAV 벡터의 투여 후 10일에, 10㎎/㎏의 용량으로 프레드니손 정제는 1일 동안 환자에게 투여된다. LHON 유전자 요법의 치료 요법의 예시적인 개략적 다이어그램을 도 9에 나타낸다.
용량 및 간격은 치료적 효과를 유지하는 데 충분하게 개별적으로 조정될 수 있다. 당업자는 과도한 실험 없이 유효 국소 용량을 최적화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 치료적 AAV 벡터의 투여 전, 투여 동안 그리고/또는 투여 후 스테로이드의 투여는 스테로이드의 동등한 치료적 AAV 벡터 무함유 투여에 비해서, 예를 들어, 적어도 10명의 환자의 집단에서 더 높은 평균 시력 회복을 초래한다. 일부 실시형태에서, 치료적 AAV 벡터의 투여 전, 투여 동안 그리고/또는 투여 후 스테로이드의 투여는 스테로이드의 동등한 치료적 AAV 벡터 무함유 투여에 비해서, 예를 들어, 적어도 10명의 환자 집단에서 더 낮은 이상반응의 발생률을 초래한다. 일부 실시형태에서, 이상반응은 전방 염증, 유리체염, 고안압증, 백내장 제거, 각막염, 초자체 출혈, 알레르기성 결막염 및 안구통으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 달성된 더 높은 평균 시력 회복 및 더 낮은 이상반응의 발생률은 치료적 AAV 벡터의 투여 전, 투여 동안 그리고/또는 투여 후 치료적 AAV 벡터 무함유를 이용함으로써 치료되는 안장애를 갖는 환자 집단과의 비교에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법에 따라 치료되는 환자의 집단 및 동등한 치료적 AAV 벡터를 이용함으로써 치료되는 환자의 집단은 인종에 따라 매칭된다. 일부 실시형태에서, 환자의 집단은 중국인 또는 아르헨티나인이다.
진단 방법 및 키트
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 안장애의 치료를 위한 환자를 선별하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 실시형태에서, 상기 방법은 환자로부터 얻은 혈청 샘플의 존재 하에 AAV를 포함하는 조성물과 함께 표적 세포 집단을 배양시키는 단계로서, AAV는 검출 가능한 마커를 암호화하는 재조합 핵산 서열을 포함하는, 상기 배양시키는 단계; 및 배양 후에 표적 세포에서 검출 가능한 마커의 발현 수준을 검출하는 단계를 포함하되, 표적 세포에서 검출 가능한 마커의 발현 수준이 사전 결정된 역치보다 더 높은 경우에 환자가 치료를 위해 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 AAV를 포함하는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 더 포함하되, AAV는 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 재조합 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 안장애의 치료를 위해 환자를 선별하는 방법은 환자로부터 얻은 혈청 샘플을 이용해서 치료적 단백질의 전달을 위한 재조합 바이러스 벡터에 대해 특정 환자의 면역 반응을 평가하는 것이다. 환자의 혈청에 존재하는 가용성 인자(예를 들어, 항체)는 표적 세포의 바이러스 감염을 방지하여, 치료적 단백질의 전달을 감소시키고/시키거나 약제학적 조성물의 효능을 감소시킬 수 있다. 본 개시내용의 방법은, 표적 세포의 감염도 수준이 마커를 검출함으로써 측정될 수 있도록, 검출 가능한 마커를 암호화하는 AAV를 이용한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 AAV 조성물에 대해 낮은 면역반응성을 나타내는 환자를 확인하는 단계 및 본 명세서에 기재된 치료적 AAV 벡터를 이용하여 치료를 위한 이러한 환자를 선택하는 단계를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 AAV 조성물에 대해 높은 면역반응성을 나타내는 환자를 확인하는 단계 및 본 명세서에 기재된 치료적 AAV 벡터를 이용하여 장래의 치료로부터 이러한 환자를 제외하는 단계를 제공한다.
일부 실시형태에서, 표적 세포에서 검출 가능한 마커의 발현 수준은 AAV 벡터에 대한 환자의 면역 반응과 상관관계가 있다. 예를 들어, AAV에 대해 높은 면역 반응성을 나타내는 환자로부터의 혈청은 검출 가능한 마커를 암호화하는 AAV가 표적 세포를 감염시키는 것을 방지하고 표적 세포에서 검출 가능한 마커의 발현을 방지하는 가용성 인자를 함유한다. 이러한 경우에, 환자 혈청에서 배양되는 표적 세포에서 검출 가능한 마커의 발현 수준은 환자 혈청이 존재하지 않을 때 배양된 표적 세포에서의 검출 가능한 마커의 발현 수준에 비해서 감소된다. 대안적으로, AAV에 대해 낮은 면역원성을 나타내는 환자로부터의 혈청은 검출 가능한 마커를 암호화하는 AAV가 표적 세포를 감염시키는 것을 방지하는 가용성 인자를 적게 함유하거나 함유하지 않는다. 이러한 경우에, 환자 혈청에서 배양되는 표적 세포에서 검출 가능한 마커의 발현 수준은 환자 혈청이 존재하지 않을 때 배양된 표적 세포에서의 검출 가능한 마커의 발현 수준과 동일하거나 이에 비해서 유의미하게 감소되지 않는다.
검출 가능한 마커는 표적 세포 및/또는 AAV 벡터에 의해 내인성으로 발현되지 않는 임의의 단백질 또는 핵산 분자일 수 있다. 검출 가능한 마커의 예는 FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그(예를 들어, 6xHis), SNAP 태그, Halo 태그, cMyc 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그, 아비딘, 효소, 형광 단백질, 발광 단백질, 화학발광 단백질, 생물발광 단백질 및 인광 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 형광 단백질은 청색/UV 단백질(예를 들어, BFP, TagBFP, mTagBFP2, Azurite, EBFP2, mKalama1, Sirius, Sapphire 및 T-Sapphire); 시안 단백질(예를 들어, CFP, eCFP, Cerulean, SCFP3A, mTurquoise, mTurquoise2, 단량체 Midorisishi-Cyan, TagCFP 및 mTFP1); 녹색 단백질(예를 들어, GFP, eGFP, meGFP (A208K 돌연변이), Emerald, Superfolder GFP, 단량체 Azami Green, TagGFP2, mUKG, mWasabi, Clover 및 mNeon Green); 황색 단백질(예컨대, YFP, eYFP, Citrine, Venus, SYFP2 및 TagYFP); 오렌지색 단백질(예를 들어, 단량체 Kusabira-Orange, mKO κ, mKO2, mOrange 및 mOrange2); 적색 단백질(예를 들어, RFP, mRaspberry, mCherry, mStrawberry, mTangerine, tdTomato, TagRFP, TagRFP-T, mApple, mRuby 및 mRuby2); 원적외선 단백질(예를 들어, mPlum, HcRed-Tandem, mKate2, mNeptune 및 NirFP); 근적외선 단백질(예를 들어, TagRFP657, IFP1.4 및 iRFP); 긴 스토크 이동(long stokes shift) 단백질(예를 들어, mKeima Red, LSS-mKate1, LSS-mKate2 및 mBeRFP); 광 활성화 가능 단백질(예를 들어, PA-GFP, PAmCherry1 및 PATagRFP); 광전환 가능 단백질(예를 들어, Kaede(녹색), Kaede(적색), KikGR1(녹색), KikGR1(적색), PS-CFP2, PS-CFP2, mEos2(녹색), mEos2(적색), mEos3.2(녹색), mEos3.2(적색), PSmOrange 및 PSmOrange); 및 광스위칭(photoswitching) 단백질(예컨대, Dronpa)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 마커는 AmCyan, AsRed, DsRed2, DsRed Express, E2-Crimson, HcRed, ZsGreen, ZsYellow, mCherry, mStrawberry, mOrange, mBanana, mPlum, mRasberry, tdTomato, DsRed 단량체 및/또는 AcGFP로부터 선택될 수 있고, 이들 모두는 Clontech로부터 입수 가능하다. 특정 실시형태에서, 검출 가능한 마커는 GFP이다.
검출 가능한 마커는 유세포 분석, qPCR, 웨스턴 블롯, ELISA 및 면역조직화학을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 일반적으로 알려진 방법에 의해 검출될 수 있다. 특정 실시형태에서, 복수의 환자 샘플이 동시에 분석될 수 있도록, 검출 방법은 고속대량 검출 방법, 예컨대, 유세포 분석 또는 qPCR이다. 일부 실시형태에서, 검출 방법은 유세포 분석이다. 일부 실시형태에서, 검출 방법은 qPCR이다.
일부 실시형태에서, 검출 가능한 마커의 발현 수준의 사전 결정된 역치는 안장애의 치료를 위해 환자를 선별하도록 설정된다. 일부 실시형태에서, 이런 역치를 충족시키거나 초과하는 환자는 본 명세서에 기재된 치료적 AAV 벡터에 의한 치료를 위해 선택된다. 일부 실시형태에서, 이 역치를 충족시키지 않는 환자는 본 명세서에 기재된 치료적 AAV 벡터에 의한 장래의 치료로부터 제외되거나, 또는 본 명세서에 기재된 치료적 AAV 벡터에 의한 치료를 시작하기 전에 면역억제 요법을 투여받아야 한다.
일부 실시형태에서, 사전 결정된 역치는 시험 샘플에서 검출 가능한 마커의 절대 발현 수준으로서 표현될 수 있다. 절대 발현 수준보다 더 높은 발현 수준을 갖는 환자는 유전자 요법에 적합한 것으로 특성규명되고/되거나, 절대 발현 수준보다 더 낮은 발현 수준을 갖는 환자는 유전자 요법에 부적합한 것으로 특성규명된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 검출 가능한 마커가 qPCR에 의해 검출되는 경우, 사전 결정된 역치는 0.2 이상의 절대 발현 수준이다. 이러한 실시형태에서, 환자는, 검출 가능한 마커의 절대 발현 수준이 0.2 이상인 경우 유전자 요법에 적합한 것으로 특성규명되고, 검출 가능한 마커의 절대 발현 수준이 0.2 미만인 경우 유전자 요법에 부적합한 것으로 특성규명된다. 일부 실시형태에서, 사전 결정된 역치는 0.6 이상의 절대 발현 수준이다. 이러한 실시형태에서, 환자는, 검출 가능한 마커의 절대 발현 수준이 0.6 이상인 경우 유전자 요법에 적합한 것으로 특성규명되고, 검출 가능한 마커의 절대 발현 수준이 0.6 미만인 경우 유전자 요법에 부적합한 것으로 특성규명된다.
일부 실시형태에서 검출 가능한 마커가 유세포 분석에 의해 검출되는 경우, 사전 결정된 역치는 시험 샘플에서 20% 이상의 마커-양성 표적 세포의 절대 발현 수준(예를 들어, GFP + 세포% ≥ 20%)이다. 이러한 실시형태에서, 환자는, 검출 가능한 마커의 절대 발현 수준이 20% 이상인 마커-양성 표적 세포의 절대-발현 수준인 경우 유전자 요법에 적합한 것으로 특성규명되고, 환자는, 검출 가능한 마커의 절대 발현 수준이 20% 미만의 마커-양성 표적 세포의 절대 발현 수준인 경우, 유전자 요법에 부적합 것으로 특성규명된다. 일부 실시형태에서, 사전 결정된 역치는 시험 샘플에서 40% 이상의 마커-양성 표적 세포의 마커-양성 표적 세포의 절대 발현 수준(예를 들어, GFP + 세포% ≥ 40%)이다. 이러한 실시형태에서, 환자는, 검출 가능한 마커의 절대 발현 수준이 40% 이상인 마커-양성 표적 세포의 절대-발현 수준인 경우 유전자 요법에 적합한 것으로 특성규명되고, 환자는, 검출 가능한 마커의 절대 발현 수준이 40% 미만의 마커-양성 표적 세포의 절대 발현 수준인 경우, 유전자 요법에 부적합 것으로 특성규명된다.
일부 실시형태에서, 사전 결정된 역치는 시험 샘플에서 검출 가능한 마커의 상대 발현 수준으로서 표현될 수 있다(즉, 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서의 검출 가능한 마커의 발현을 검출함). 상대 발현 수준보다 더 높은 발현 수준을 갖는 환자는 유전자 요법에 적합한 것으로 특성규명되고/되거나, 상대 발현 수준보다 더 낮은 발현 수준을 갖는 환자는 유전자 요법에 부적합한 것으로 특성규명된다. 일부 실시형태에서 검출 가능한 마커가 유세포 분석에 의해 검출되는 경우, 사전 결정된 역치는 시험 샘플에서 40% 이상의 마커-양성 표적 세포의 상대 발현 수준(예를 들어, GFP + 세포% ≥ 40%)이다. 이러한 실시형태에서, 환자는, 검출 가능한 마커의 절대 발현 수준이 40% 이상인 마커-양성 표적 세포의 절대-발현 수준인 경우 유전자 요법에 적합한 것으로 특성규명되고, 환자는, 검출 가능한 마커의 절대 발현 수준이 40% 미만의 마커-양성 표적 세포의 절대 발현 수준인 경우, 유전자 요법에 부적합 것으로 특성규명된다. 일부 실시형태에서 검출 가능한 마커가 유세포 분석에 의해 검출되는 경우, 사전 결정된 역치는 시험 샘플에서 80% 이상의 마커-양성 표적 세포의 상대 발현 수준(예를 들어, GFP + 세포% ≥ 80%)이다. 이러한 실시형태에서, 환자는, 검출 가능한 마커의 절대 발현 수준이 80% 이상인 마커-양성 표적 세포의 절대-발현 수준인 경우 유전자 요법에 적합한 것으로 특성규명되고, 환자는, 검출 가능한 마커의 절대 발현 수준이 80% 미만의 마커-양성 표적 세포의 절대 발현 수준인 경우, 유전자 요법에 부적합 것으로 특성규명된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따른 치료를 위해 선별 및/또는 선택된 환자는 하나 이상의 mtDNA 점 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 환자는 미토콘드리아의 산화적 인산화 사슬에서 복합체 I의 단백질을 암호화하는 유전자에서 점 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, 환자는 ND4 유전자에 하나 이상의 점 돌연변이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 ND4 유전자의 뉴클레오타이드 위치 11778에서 점 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 점 돌연변이는 ND4 유전자에서의 G11778A이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따른 치료를 위해 선별 및/또는 선택된 환자는 ND4 유전자에 G11778A 점 돌연변이를 갖고, 중국인 및/또는 아르헨티나인 자손이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따른 치료를 위해 선별 및/또는 선택된 환자는 ND4 유전자에 G11778A 점 돌연변이를 갖고, 아르헨티나인 자손이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따른 치료를 위해 선별 및/또는 선택된 환자는 ND4 유전자에 G11778A 점 돌연변이를 갖고, 중국인 자손이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 안장애의 치료를 위한 환자를 선별하고/하거나 안장애의 치료를 위한 환자를 선택하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 실시형태에서, 키트는 검출 가능한 마커를 암호화하는 재조합 핵산을 포함하는 AAV, 및 검출 가능한 마커를 검출하기 위한 1종 이상의 시약을 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 마커를 검출하기 위한 1종 이상의 시약은 검출 가능한 마커에 결합하는 항체 및 검출 가능한 마커를 암호화하는 재조합 핵산에 특이적인 하나 이상의 프라이머 올리고뉴클레오타이드로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 키트는 AAV 벡터를 재구성 및/또는 희석시키고/시키거나 시약 구성성분을 검출하기 위한 1종 이상의 시약을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 세포에 AAV 벡터를 도입하기 위해 1종 이상의 추가 시약, 예컨대, 완충제, 세척 완충제 및/또는 세포 배양 배지를 더 포함한다. 키트의 구성성분은 별도의 용기에 위치될 수 있거나, 또는 단일 용기에서 합쳐질 수 있다.
위에 언급한 구성성분에 추가로, 일부 실시형태에서, 키트는 본 개시내용의 방법을 실행하기 위해 키트의 구성성분을 이용하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 상기 방법을 실행하기 위한 설명서는 일반적으로 적합한 기록 매체 상에 기록된다. 예를 들어, 설명서는 종이 또는 플라스틱과 같은 기재(substrate) 상에 인쇄될 수 있다. 이렇게 해서, 설명서는 키트에 포장 삽입물로서, 또는 키트의 라벨에서(즉, 패키지 또는 하부 패키지와 관련) 또는 키트 구성성분의 용기에 존재할 수 있다. 다른 실시형태에서, 설명서는 적합한 컴퓨터 판독 가능 저장 매체(예를 들어, CD-ROM, 자기 디스크 및 플래시 드라이브) 상에서 전자적으로 저장된 데이터 파일로서 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 실제 설명서는 키트에 존재하지 않지만, 원거리 공급원으로부터, 예를 들어, 인터넷을 통해 설명서를 얻기 위한 수단이 제공된다. 본 실시형태의 예는 설명서가 검토되고/되거나 다운로드될 수 있는 웹사이트를 포함하는 키트이다. 설명서에 따라, 설명서를 얻기 위한 수단은 적합한 기재 상에 기록된다.
약제학적 조성물 및 부형제
본 발명의 벡터는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 벡터에 추가로, 이러한 조성물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정제 또는 당업자에게 잘 알려진 다른 물질을 함유할 수 있다. 이러한 물질은 비독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 투여 경로(즉, 이 경우에, 직접 망막, 망막하 또는 유리체내 주사)에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다.
약제학적 조성물은 전형적으로 액체 형태이다. 액체 약제학적 조성물은 전형적으로 액체 담체, 예컨대, 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성유를 포함한다. 생리 식염수 용액, 염화마그네슘, 글루코스 또는 다른 당 용액, 또는 글리콜, 예컨대, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다. 일부 경우에, 계면활성제, 예컨대, 플루론산(폴록사머 188로도 알려진 PF68)이 사용될 수 있다.
아픈 부위에 주사될 때, 활성 성분은 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 무발열원 수용액의 형태일 것이다. 당업자는 적합한 용액을 제조하기 위해, 예를 들어, 염화나트륨 주사, 링거 주사 및 락트산 링거 주사와 같은 등장성 비히클을 충분히 사용할 수 있다. 필요한 경우 보존제, 안정제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 포함될 수 있다.
지연 방출을 위해, 벡터는 서방출을 위해 제형화된 약제학적 조성물에, 예컨대, 당업계에 알려진 방법에 따라 생체적합성 중합체로 형성된 마이크로캡슐에 또는 리포솜 담체 시스템에 포함될 수 있다.
다른 양상에서, 아데노-연관 바이러스(AAV)를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 개시되되, 아데노-연관 바이러스는 본 명세서에 개시된 임의의 재조합 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 이의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함한다.
일부 경우에, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 인산염 완충 식염수(PBS), α,α-트레할로스 탈수화물, L-히스티딘 모노하이드로클로라이드 일수화물, 폴리솔베이트 20, NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, 폴록사머 188 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 경우에, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 인산염 완충 식염수(PBS), α,α-트레할로스 탈수화물, L-히스티딘 모노하이드로클로라이드 일수화물, 폴리솔베이트 20, NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, 폴록사머 188 또는 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 경우에, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 폴록사머 188을 포함한다. 폴록사머 188은 에틸렌 옥사이드-폴리옥시프로필렌 글리콜 공중합체이다. 계면활성제로서, 폴록사머 188은 분산, 안정화 및 유화 작용을 갖는다. 일부 경우에, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 0.0001% 내지 0.01%의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 경우에, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 0.0005% 내지 0.005%의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 경우에, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 0.0007% 내지 0.002%의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 경우에, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 0.0008% 내지 0.0012%의 폴록사머 188을 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 0.0009% 내지 0.0011%의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 경우에, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 0.001%(0.01㎎/㎖)의 폴록사머 188을 포함한다.
일부 경우에, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 하나 이상의 염을 더 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 염은 NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4 및 KH2PO4를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 염은 80mM NaCl, 5mM NaH2PO4, 40mM Na2HPO4 및 5mM KH2PO4를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 염은 NaCl, Na2HPO4 및 KH2PO4를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 염은 154mM NaCl, 5.6mM Na2HPO4 및 8.4mM KH2PO4를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 염은 NaCl, Na2HPO4 및 KH2PO4를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 염은 NaCl, Na2HPO4 및 KH2PO4이다. 일부 경우에, NaCl은 5 내지 15㎎/㎖의 농도를 갖는다. 일부 경우에, NaCl은 9㎎/㎖의 농도를 갖는다. 일부 경우에, KH2PO4는 0.1 내지 0.5㎎/㎖의 농도를 갖는다. 일부 경우에, KH2PO4는 0.144㎎/㎖의 농도를 갖는다. 일부 경우에, Na2HPO4는 0.5 내지 1㎎/㎖의 농도를 갖는다. 일부 경우에, Na2HPO4는 0.795㎎/㎖의 농도를 갖는다.
일부 경우에, 약제학적 조성물은 pH가 6 내지 8이다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 pH가 7.2 내지 7.4이다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 pH가 7.3이다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 바이러스 역가가 적어도 1.0×1010 vg/㎖이다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 바이러스 역가가 적어도 5.0×1010 vg/㎖이다.
일부 경우에, 약제학적 조성물은 5회의 냉동/해동 주기로 처리되고, 5회의 냉동/해동 주기 전의 바이러스 역가에 비해서 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90%의 바이러스 역가를 유지한다. 일부 경우에, 레베르 유전성 시신경병증을 갖는 환자에게 투여될 때, 약제학적 조성물은 재조합 핵산이 없는 비슷한 약제학적 조성물보다 더 높은 평균 시력 회복을 초래한다.
일부 경우에, 약제학적 조성물은 특정 물질의 용기에 저장된다. 일부 예에서, 용기는 사이클로올레핀 중합체로 제조된다.
샘플
본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기에 적합한 샘플은 대상체로부터의 핵산 샘플일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "핵산 샘플"은 RNA 또는 DNA 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, "폴리펩타이드 샘플"(예를 들어, 펩타이드 또는 단백질 또는 이들로부터 유래된 단편)은 유전자 변이체로 인해 아미노산이 변화된 정보를 결정하는 데 사용될 수 있다. 핵산 및 폴리펩타이드는 혈액, 타액, 소변, 구강 내벽의 점막 스크레이핑, 거담, 혈청, 눈물, 피부, 조직 또는 모발을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 샘플로부터 추출될 수 있다. 핵산 샘플에 대해 핵산 정보 분석이 수행될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "핵산 정보"는 핵산 서열 그 자체, 핵산 서열의 유전자 변이의 존재/부재, 핵산 서열에 따라 다른 물리적 특성(예를 들어, Tm) 및 핵산(예를 들어, mRNA 복제 수)의 양을 포함한다. "핵산"은 DNA, RNA, 인공 뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 또는 인공 뉴클레오타이드를 포함하는 RNA 중 어느 하나를 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "정제된 핵산"은 cDNA, 게놈 핵산의 단편, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용해서 생성된 핵산, 게놈 핵산의 제한 효소 처리에 의해 형성된 핵산, 재조합 핵산 및 화학적으로 합성된 핵산 분자를 포함한다. "재조합" 핵산 분자는 다른 방법으로 분리되는 두 서열 세그먼트, 예를 들어, 화학적 합성에 의해 또는 유전자 조작 기법에 의해 분리되는 핵산 단편을 인공적으로 조합함으로써 형성되는 핵산 분자를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "폴리펩타이드"는 천연 공급원으로부터 단리되거나, 재조합 기법에 의해 생성되거나 또는 화학적으로 합성되는 단백질, 단백질 단편 및 펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드는 하나 이상의 변형, 예컨대, 번역 후 변형(예를 들어, 글리코실화 및 인산화) 또는 임의의 다른 변형(예를 들어, 페길화)을 가질 수 있다. 폴리펩타이드는 하나 이상의 비-자연 발생적 아미노산(예를 들어, 측쇄 변형을 갖는 아미노산)을 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대, 세포주를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 핵산이 얻어질 수 있는 예시적인 세포 유형은 다음을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 혈액 세포, 예컨대, B 림프구, T 림프구, 백혈구, 적혈구, 대식세포 또는 호중구; 근세포, 예컨대, 골격 세포, 평활근세포 또는 심장근세포; 생식 세포, 예컨대, 정자 또는 난자; 상피 세포; 결합 조직 세포, 예컨대, 지방세포 및 연골 세포; 섬유아세포 또는 골아세포; 뉴런; 성상교세포; 기질 세포; 기관-특이적 세포, 예컨대, 신장 세포, 췌장 세포, 간 세포 또는 각질세포; 줄기 세포; 또는 이로부터 개발된 임의의 세포. 핵산이 얻어질 수 있는 세포는 혈액 세포 또는, 예를 들어, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포로부터 생성된 세포, 예컨대, 적혈구, B 림프구, T 림프구, 자연 살해 세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단핵구, 대식세포 또는 혈소판을 포함하는 특정 유형의 혈액 세포일 수 있다. 일반적으로, 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포 또는 전분화능 줄기 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 유형의 줄기 세포가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산 샘플은 RNA 또는 DNA 단리를 위해 처리될 수 있다. 예를 들어, 세포 또는 조직 샘플에서 RNA 또는 DNA는 핵산 샘플의 다른 구성성분으로부터 단리될 수 있다. 표준 기법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 샘플을 원심분리시키고, 펠릿화된 샘플을, 예를 들어, 완충제 용액(예를 들어, 인산염 완충 식염수(PBS))에서 현탁시킴으로써, 세포는 핵산 샘플로부터 채취될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 펠릿을 얻기 위해 세포 현탁액을 원심분리시킨 후에, 세포를 용해시켜 DNA를 추출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 샘플은 농축될 수 있고/있거나 정제되어 DNA를 단리시킬 수 있다. 대상체로부터 유래되고 임의의 종류의 추가 처리를 가한 핵산 샘플을 포함하는 모든 핵산 샘플은 대상체로부터 유래되는 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 당업계에 알려진 표준 기법 및 키트는 RNA 또는 DNA를 핵산 샘플로부터 추출하기 위해 사용될 수 있고, 예를 들어, 페놀 추출, QIAAMP® 조직 키트(Qiagen, 캘리포니아주 채츠워스 소재), WIZARD® 게놈 DNA 정제 키트(Promega) 또는 Puregene 화학을 이용하는 Qiagen Autopure 방법을 포함하며, 기록보존에 적절한 고도로 안정적인 DNA를 정제할 수 있다.
일부 실시형태에서, 대립유전자의 동일성을 결정하거나 복제수를 결정하는 것은 대상체로부터 RNA 및/또는 DNA를 포함하는 핵산 샘플을 얻는 것, 및/또는 핵산 샘플로부터 유래된 게놈 DNA(즉, 대상체의 게놈) 내에서 하나 이상의 유전자 변이의 동일성, 복제수, 존재 또는 부재 및 이들의 염색체 위치를 평가하는 것을 포함할 수 있지만, 필요로 하는 것은 아니다.
분석이 가해지는 개체 또는 조직은 대상체로부터의 핵산 샘플에 대해 물리적 분석을 실제로 수행할 필요는 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 제3자가 핵산 샘플을 분석함으로써 얻어진 정보를 이용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 위치에서 수행되는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 샘플은 대상체로부터 첫 번째 위치에서, 예컨대, 건강관리시설에서 또는 자가검사키트의 경우에 대상체의 집에서 대상체로부터 얻을 수 있다. 핵산 샘플은 동일한 현장에서 또는 두 번째 현장(예컨대, 연구실 또는 다른 검사 현장)에서 분석될 수 있다.
핵산
본 명세서에 기재된 핵산 및 폴리펩타이드는 본 개시내용의 방법 및 키트에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 핵산 및 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머는 본 개시내용의 방법 및 키트에서 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 핵산은 데옥시리보뉴클레오타이드(DNA) 또는 리보뉴클레오타이드(RNA)(데옥시리보뉴클레오타이드(DNA) 또는 리보뉴클레오타이드(RNA)가 단일 또는 중합체인지, 자연 발생적 또는 비-자연 발생적인지, 이중 가닥 또는 단일-가닥인지, 암호화(예를 들어, 번역된 유전자) 또는 비암호화(예를 들어, 조절 영역)인지 여부), 또는 이들의 임의의 단편, 유도체, 시뮬런트(simulant) 또는 이들의 보체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 핵산 서열, 게놈 서열, 상보적 DNA(cDNA), 안티센스 핵산, DNA 영역, 프로브, 프라이머, 유전자, 조절 영역, 인트론, 엑손, 오픈 리딩 프레임, 결합 부위, 표적 핵산 및 대립유전자-특이적 핵산을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "프로브"는 핵산의 상보성에 기반한 혼성화 반응을 이용함으로써 샘플의 핵산을 시험하는 데 사용되는 핵산 단편을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "혼성체"는 위에 기재된 것과 동일한 유형의 핵산 내에서 또는 DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA 등을 포함하는 상이한 유형의 핵산이 걸쳐 형성된 이중 가닥을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단리된" 핵산은 (예를 들어, 게놈 서열에서) 보통 유전자 또는 뉴클레오타이드 서열에 측접된 핵산으로부터 단리되고/되거나 (예를 들어, RNA 라이브러리에서) 다른 전사된 서열로부터 완전히 또는 부분적으로 정제된 것이다. 예를 들어, 본 개시내용의 단리된 핵산은 자연 발생적 핵산이 존재하는 복잡한 세포 환경, 핵산이 재조합 기법에 의해 생산될 때 사용되는 배양 배지 또는 핵산이 화학적으로 합성될 때 사용되는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질에 대해 실질적으로 단리될 수 있다. 일부 경우에, 단리된 물질은 다른 물질을 함유하는 조질의 추출물, 완충제 시스템 또는 시약 혼합물과 같은 조성물의 일부를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 물질은 당업계에 알려진 방법을 이용함으로써, 예를 들어, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법(PAGE) 또는 칼럼 크로마토그래피(예를 들어, HPLC)에 의해 실질적으로 동질이 되도록 정제될 수 있다. 게놈 DNA(gDNA)에 대해, 용어 "단리된"은 또한 게놈 DNA가 자연적으로 연관된 염색체로부터 단리된 핵산을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 단리된 핵산 분자는 약 250kb, 200kb, 150kb, 100kb, 75kb, 50kb, 25kb, 10kb, 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0.5kb 또는 0.1kb 미만의 뉴클레오타이드를 함유할 수 있고, 뉴클레오타이드는 핵산 분자가 유래된 세포의 gDNA에서 핵산 분자에 측접된다.
핵산은 다른 암호화 또는 조절 서열에 융합될 수 있고, 단리된 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 벡터에 포함된 재조합 DNA는 본 명세서에서 사용되는 "단리된"의 정의에 포함된다. 일부 실시형태에서, 단리된 핵산은 이종 숙주 세포 또는 이종 유기체에서 재조합 DNA 분자 및 용액 중에 부분적 또는 실질적으로 정제된 DNA 분자를 포함할 수 있다. 단리된 핵산은 또한 본 개시내용의 DNA 분자의 생체내 및 시험관내 RNA 전사체를 포괄한다. 단리된 핵산 분자 또는 뉴클레오타이드 서열은 화학적으로 합성되거나 또는 재조합에 의해 합성될 수 있다. 이러한 단리된 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, (예를 들어, 다른 포유류 종으로부터) 상동성 서열을 단리시키기 위해, (예를 들어, 염색체와의 인시츄 혼성화에 의한) 유전자 맵핑을 위해, 또는 예를 들어, 노던 블롯 분석 또는 본 명세서에 개시된 다른 혼성화 기법에 의해 조직(예를 들어, 인간 조직)에서의 유전자 발현을 검출하기 위해 프로브로서의 암호화된 폴리펩타이드의 제조에서 사용될 수 있다. 본 개시내용은 또한, 예를 들어, 선택적 혼성화를 위한 고도로 엄격한 조건 하에서, 본 명세서에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 혼성화되는 핵산 서열에 관한 것이다. 이러한 핵산 서열은 (예를 들어, 고도로 엄격한 조건 하에서) 대립유전자-특이적 또는 서열-특이적 혼성화에 의해 검출되고/되거나 단리될 수 있다. 핵산 혼성화를 위한 엄격한 조건 및 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al, John Wiley & Sons, (1998) 및 Kraus, M. and Aaronson, S., Methods Enzymol., 200:546-556 (1991)] 참조).
둘 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 "동일성" 또는 "동일성 백분율"의 계산은 최적의 비교 목적을 위해 서열을 정렬함으로써 결정될 수 있다(예를 들어, 갭은 첫 번째 서열의 서열에 도입될 수 있다). 이어서, 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드는 비교되고, 두 서열 사이의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치 수의 함수이다(즉, 동일성% = 동일한 위치의 수/위치의 총 수×100). 예를 들어, 첫 번째 서열의 위치는 두 번째 서열의 상응하는 위치와 동일한 위치에서 뉴클레오타이드에 의해 점유되고, 이어서, 분자는 이 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치 수의 함수이며, 두 서열의 최적의 정렬에 도입될 필요가 있는 갭의 수, 갭의 수 및 각 갭의 길이를 참작한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 서열 동일성 정도를 기재하는 데 사용될 때 "동일한" 및 "동일성"이라는 용어는, 달리 표시되지 않는 한, 동의어인 것으로 의도된다. 예를 들어, 특정 서열과 적어도 99% 동일한은 서열과 적어도 99%의 동일성을 갖는 것을 의미한다.
일부 실시형태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%이다. 두 서열의 실제 비교는 잘 알려진 방법에 의해, 예를 들어, 수학 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 이러한 수학 알고리즘의 비제한적 예는 문헌[Karlin, S. and Altschul, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877 (1993)]에 기재되어 있다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul, S. et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)]에 기재된 바와 같이, NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)에 혼입된다. BLAST 및 갭핑된 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램(예를 들어, NBLAST)의 임의의 관련 파라미터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교를 위한 파라미터는 점수= 100, 단어 길이= 12로 설정될 수 있거나, 또는 달라질 수 있다(예를 들어, W=5 또는 W=20). 다른 예는 문헌[Myers and Miller, CABIOS (1989)], ADVANCE, ADAM, BLAT 및 FASTA의 알고리즘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은, 예를 들어, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램(Accelrys, 영국 캠브리지 소재)을 이용해서 달성될 수 있다.
"프로브" 또는 "프라이머"는 핵산 분자의 상보적 가닥과 염기-특이적 방식으로 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 프로브는 표적 서열의 증폭을 위해 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 리가제 연쇄 반응(LCR)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 방법을 이용해서 주형-유도 DNA 합성의 개시 지점으로서 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 프로브일 수 있는 프라이머를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드는 핵산 서열의 세그먼트 또는 단편 또는 이들의 보체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, DNA 세그먼트는 5 내지 10,000개의 연속 염기일 수 있고, 5, 10, 12, 15, 20 또는 25개의 뉴클레오타이드 내지 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 또는 10,000개의 뉴클레오타이드의 범위일 수 있다. DNA 및 RNA에 추가로, 프로브 및 프라이머는 문헌[Nielsen, P. et al., Science 254: 1497-1500 (1991)]에 기재된 바와 같이, 폴리펩타이드 핵산(PNA)를 추가로 포함할 수 있다. 프로브 또는 프라이머는 핵산 분자의 적어도 약 15개, 일반적으로 약 20 내지 25개, 특정 실시형태에서, 약 40, 50, 60 또는 75개의 연속 뉴클레오타이드에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열의 영역을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 핵산에 선택적으로 혼성화할 수 있는 단편 또는 일부를 포함하는 단리된 핵산, 예를 들어, 프로브 또는 프라이머를 추가로 제공하되, 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서에 기재된 유전자 변이 또는 동일한 위치에 위치된 야생형 뉴클레오타이드, 또는 이의 보체에 포함된 적어도 하나의 다형성 또는 다형성 대립유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로브 또는 프라이머는 연속 뉴클레오타이드 서열과 또는 연속 뉴클레오타이드 서열의 보체와 적어도 70%의 동일성, 적어도 80%의 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성 또는 적어도 95%의 동일성을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산 프로브는 본 명세서에 기재된 유전자 변이를 포함하는 병태(예를 들어, LHON)와 관련된 유전자의 상보성 영역과 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 본 개시내용의 핵산 단편은 본 명세서에 기재된 것과 같은 분석에서 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다.
본 개시내용의 핵산, 예컨대, 위에 기재된 것은 당업자에게 잘 알려진 표준 분자 생물학 기법을 이용해서 확인되고 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, DNA는 증폭될 수 있고/있거나 표지(예를 들어, 방사성표지, 형광 표지)될 수 있고, 선별, 예를 들어, 유기체로부터 유래된 cDNA 라이브러리를 위한 프로브로서 사용될 수 있다. cDNA는 mRNA로부터 유래될 수 있고, 적합한 벡터에 함유될 수 있다. 예를 들어, 상응하는 클론은 단리될 수 있고, DNA는 생체외 절단 후에 얻어질 수 있으며, 클로닝된 삽입물은 적절한 분자량을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 정확한 판독틀을 확인하기 위한 당업계의 인식되는 방법에 의해 한 방향 또는 양방향으로 서열분석될 수 있다. 이들 또는 유사한 방법을 이용해서, 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA는 단리되고, 서열분석되고, 추가로 특성규명될 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 다형성, 변이, 또는 돌연변이, 예를 들어, 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP), 단일 뉴클레오타이드 변이(SNV), 복제수 변이(CNV), 예를 들어, 삽입, 결실, 역위 및 전좌를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 유사체, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 카이랄메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸-리보뉴클레오사이드, 또는 변형된 핵산, 예를 들어, 변형된 골격 잔기 또는 연결, 또는 탄수화물, 지질, 폴리펩타이드 또는 다른 물질과 조합된 핵산, 또는 펩타이드 핵산(PNA), 예를 들어, 염색질, 리보솜 및 전사체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 다양한 구조, 예를 들어, A DNA, B DNA, Z-형태 DNA, siRNA, tRNA, 및 리보자임에서 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은, 예를 들어, 참조 서열과 비교할 때 하나 이상의 서열 차이, 예를 들어, 첨가, 결실 및/또는 치환을 갖는, 자연적 또는 비자연적 다형체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 참조 서열은 공개적으로 입수 가능한 정보, 예를 들어, U.C. Santa Cruz Human Genome Browser Gateway (genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway) 또는 NCBI 웹사이트(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 기반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 참조 서열은 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여, 예를 들어, 참조 핵산의 서열분석에 의해, 본 개시내용의 실행자가 결정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 프로브는 본 명세서에 기재된 바와 가은 대립유전자, SNP, SNV 또는 CNV에 혼성화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로브는 본 명세서에 기재된 바와 같은 LHON과 연관된 다른 마커 서열에 결합할 수 있다.
당업자는 시험 핵산 샘플로부터의 게놈 샘플에 특정 대립유전자가 존재하는 경우에만 서열 특이적 혼성화가 일어날 수 있도록 프로브를 설계하는 방법을 알 것이다. 본 개시내용은 또한 특정 유전자 변이를 지노타이핑(genotyping)하기 위한 상업적으로 입수 가능한 기법 및 방법을 비롯한, 임의의 편리한 지노타이핑 방법을 이용해서 실행하도록 단순화될 수 있다.
대조군 프로브, 예를 들어, 덜 가변적인 서열에 결합하는 프로브가 또한 사용될 수 있고, 예를 들어, 염색체의 동원체와 연관된 반복 DNA는 대조군으로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로브는 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로브는, 예를 들어, 화학적으로 또는 시험관내에서 합성되거나, 표준 기법을 통해 염색체 또는 게놈 DNA로부터 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 사용될 수 있는 DNA의 공급원은 게놈 DNA, 클로닝된 DNA 서열, 및 숙주의 정상 염색체 보체와 함께 인간 염색체 중 하나 또는 일부를 포함하는 체세포 혼성체, 및 유세포 분석 또는 현미해부에 의해 정제되는 염색체를 포함한다. 관심 영역은 클로닝을 통해 또는 PCR을 이용하여 부위-특이적 증폭에 의해 단리될 수 있다.
하나 이상의 핵산, 예를 들어, 프로브 또는 프라이머는 또한, 예를 들어, 직접 표지에 의해 표지되어, 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 검출 가능한 표지는 물리적, 화학적 또는 생물학적 방법에 의해 검출될 수 있는 임의의 표지, 예를 들어, 방사성 표지, 예컨대, 32P 또는 3H, 형광 표지, 예컨대, FITC, 발색단 표지, 친화도-리간드 표지, 효소 표지, 예컨대, 알칼리성 포스파타제, 겨자무과산화효소, 또는 I2 갈락토시다제, 효소 보조인자 표지, 합텐 접합체 표지, 예컨대, 디곡시게닌 또는 다이나이트로페닐, 라만 신호 생성 표지, 자기 표지, 스핀 표지, 에피토프 표지, 예컨대, FLAG 또는 HA 에피토프, 발광 표지, 중원자 표지, 나노입자 표지, 전기화학적 표지, 광산란 표지, 구형 셸 표지, 반도체 나노결정 표지, 예컨대, 퀀텀닷(미국 특허 제6,207,392호에 기재) 및 당업자에게 알려진 임의의 다른 신호 생성 표지로 표지된 프로브를 포함할 수 있되, 표지는 2차 검출 분자 유무와 상관없이 프로브가 시각화될 수 있게 한다. 뉴클레오타이드는 표준 기법, 예를 들어, 틈 번역, 무작위 프라이밍 및 PCR 표지를 이용하여 프로브에 직접 혼입될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "신호"는 형광, 방사능, 화학발광 등을 포함하는 적절한 수단에 의해 적절하게 검출되고 측정된 신호를 포함한다.
검출을 위한 표지 부분의 비제한적 예는 적합한 효소, 예컨대, 겨자무과산화효소, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제; 스트렙타비딘/바이오틴, 아비딘/바이오틴 또는 항원/항체 복합체(예를 들어, 토끼 IgG 및 항-토끼 IgG를 포함)와 같은 복합체를 형성할 수 있는 결합쌍의 구성원; 형광단, 예컨대, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민, 테트라메틸 로다민, 에오신, 녹색 형광 단백질, 에리트로신, 쿠마린, 메틸 쿠마린, 파이렌, 말라카이트 녹색, 스틸벤, 루시퍼 옐로, 캐스케이드 블루, 텍사스 레드, 다이클로로트라이아진일아민 플루오레세인, 단실 클로라이드, 피코에리트린, 형광 란타나이드 복합체, 예컨대, 유로피움 및 터비움을 포함하는 것, 사이아닌 염료 패밀리 구성원, 예컨대, Cy3 및 Cy5, 분자 비콘 및 이의 형광 유도체 뿐만 아니라, 예를 들어, 문헌[Principles of Fluorescence Spectroscopy, Joseph R. Lakowicz (Editor), Plenum Pub Corp, 2nd edition (July 1999) 및 6th Edition of the Molecular Probes Handbook by Richard P. Hoagland]에 기재된 것과 같은 당업계에 알려진 것; 발광 물질, 예컨대, 루미놀; 광산란 또는 플라스몬 공명 물질, 예컨대, 금 또는 은 입자 퀀텀닷; 또는 14C, 123I, 124I, 125I, Tc99m, 32P, 33P, 35S 또는 3H를 포함하는 방사성 물질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
기타 표지는 또한 본 개시내용은, 예를 들어, 골격 표지의 방법에서 사용될 수 있다. 골격 표지는 서열 독립적 방식으로 핵산에 결합하는 핵산 염료를 포함한다. 비제한적 예는 끼워넣기 염료(intercalating dyes), 예컨대, 페난트리딘 및 아크리딘(예를 들어, 브로민화 에티듐, 아이오딘화 프로피듐, 아이오딘화 헥시듐, 다이하이드로에티듐, 에티듐 동형이량체-1 및 -2, 에티듐 모노아자이드 및 ACMA); 일부 소홈(minor groove) 결합제, 예컨대, 인돌 및 이미다졸(예를 들어, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580 및 DAPI); 및 여러가지 핵산 염료, 예컨대, 아크리딘 오렌지(끼어들기할 수 있음), 7-AAD, 악티노마이신 D, LDS751 및 하이드록시스틸바미딘을 포함한다. 앞서 언급한 핵산 염료 모두는 Molecular Probes, Inc.와 같은 공급업자로부터 상업적으로 입수 가능하다. 핵산 염료의 또 다른 예는 Molecular Probes로부터의 다음의 염료를 포함한다: 사이아닌 염료, 예컨대, SYTOX Blue, SYTOX Green, SYTOX Orange, POPO-1, POPO-3, YOYO-1, YOYO-3, TOTO-1, TOTO-3, JOJO-1, LOLO-1, BOBO-1, BOBO-3, PO-PRO-1, PO-PRO-3, BO-PRO-1, BO-PRO-3, TO-PRO-1, TO-PRO-3, TO-PRO-5, JO-PRO-1, LO-PRO-1, YO-PRO-1, YO-PRO-3, PicoGreen, OliGreen, RiboGreen, SYBR Gold, SYBR Green I, SYBR Green II, SYBR DX, SYTO-40, -41, -42, -43, -44, -45(청색), SYTO-13, -16, -24, -21, -23, -12, -11, -20, -22, -15, -14, -25(녹색), SYTO-81, -80, -82, -83, -84, -85(오렌지), SYTO-64, -17, -59, -61, -62, -60 및 -63(적색).
일부 실시형태에서, 상이한 색의 형광단은, 예를 들어, 7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세트산(AMCA), 5-(및 -6)-카복시-X-로다민, 리사민 로다민 B, 5-(및-6)-카복시플루오레세인, 플루오레세인-5-아이소티오사이아네이트(FITC), 7-다이에틸아미노쿠마린-3-카복실산, 테트라메틸로다민-5-(및-6)-아이소티오사이아네이트, 5-(및-6)-카복시테트라메틸로다민, 7-하이드록시쿠마린-3-카복실산, 6-[플루오레세인 5-(및-6)-카복스아미도]헥산산, N-(4,4-다이플루오로-5,7-다이메틸-4-보라-3a,4a 다이아자-3-인다센)프로피온산, 에오신-5-아이소티오사이아네이트, 에리트로신-5-아이소티오사이아네이트, TRITC, 로다민, 테트라메틸로다민, R-피코에리트린, Cy-3, Cy-5, Cy-7, Texas Red, Phar-Red, 알로피코사이아닌(APC) 및 CASCADETM 블루 아세틸아자이드로부터 선택될 수 있으므로, 세트에 포함되거나 포함되지 않은 각 프로브를 명확하게 시각화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 형광 표지된 프로브는 각 형광단에 대해 형광 현미경 및 적절한 필터를 이용하여, 또는 다중 형광단을 관찰하기 위해 이중 또는 삼중 밴드-패스 필터를 이용함으로써 관찰될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유세포 분석과 같은 기법은 프로브의 혼성화 패턴을 시험하는 데 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 프로브는, 예를 들어, 바이오틴 또는 디곡시게닌으로 간접적으로 표지되거나, 또는 32P 및/또는 3H와 같은 방사성 동위원소로 표지될 수 있다. 비제한적 예로서, 바이오틴으로 간접적으로 표지된 프로브는 검출 가능한 마커에 접합된 아비딘에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 아비딘은 알칼리성 포스파타제 또는 겨자무과산화효소와 같은 효소 마커에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 효소 마커는 효소에 대한 기질 및/또는 촉매를 이용하는 비색 반응을 이용하여 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 알칼리성 포스파타제에 대한 촉매, 예컨대, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 및 나이트로 블루 테트라졸리움이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 촉매는 겨자무과산화효소, 예를 들어, 다이아미노벤조에이트에 대해 사용될 수 있다.
제형, 투여 경로 및 유효 용량
본 개시내용의 또 다른 양상은 본 개시내용의 제제 또는 제제의 조합물을 포함하는 약제학적 조성물의 제형, 투여 경로 및 유효 용량에 관한 것이다. 이러한 약제학적 조성물은 위에 기재된 바와 같은 병태(예를 들어, LHON)를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용의 화합물은 경구(협측 및 설하 포함), 직장, 비강, 국소, 경피 패치, 폐, 질, 좌약 또는 비경구(안구내, 유리체내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 진피내, 복강내, 피하 및 정맥내 포함) 투여에 적합한 것 또는 에어로졸화, 흡입 또는 통기에 의한 투여에 적합한 형태를 포함하는 약제학적 제형으로서 투여될 수 있다. 약물 전달 시스템에 대한 일반 정보는 문헌[Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore Md. (1999)]에서 찾을 수 있다.
다양한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 담체 및 부형제(완충제, 탄수화물, 만니톨, 폴리펩타이드, 아미노산, 항산화제, 정균제, 킬레이트제, 현탁제, 증점제 및/또는 보존제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음), 물, 오일(석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 광유 및 참깨유를 포함), 식염수 용액, 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액, 향미제, 착색제, 점착제거제 및 기타 허용 가능한 첨가제, 아쥬반트 또는 결합제, 및 생리적 조건에 근접하는 기타 약제학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예컨대, pH 완충제, 긴장성 조절제, 유화제 및 습윤제를 포함한다. 부형제의 예는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리셀로, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 보존제가 실질적으로 없다. 다른 실시형태에서, 약제학적 제제는 적어도 1종의 보존제를 함유할 수 있다. 약제학적 투약 형태에 대한 일반 방법은 문헌[Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott, Williams, & Wilkins, Baltimore Md. (1999))]에서 발견된다. 본 개시내용의 조성물은 당업자에게 알려진 임의의 적합한 담체에 의해 투여될 수 있지만, 담체의 유형은 투여 방식에 따라 다를 수 있다는 것이 인식될 수 있다.
화합물은 또한 잘 알려진 기법을 이용해서 리포솜 내에 캡슐화될 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물에 대한 담체로서 생분해성 마이크로스피어가 또한 사용될 수 있다. 적합한 생분해성 마이크로스피어는, 예를 들어, 미국 특허 제4,897,268호, 제5,075,109호, 제5,928,647호, 제5,811,128호, 제5,820,883호, 제5,853,763호, 제5,814,344호 및 제5,942,252호에 개시되어 있다.
화합물은 리포솜 또는 마이크로스피어(또는 마이크로입자)의 형태로 투여될 수 있다. 대상체에게 투여하기 위한 리포솜 및 마이크로스피어의 제조 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 리포솜에서 생물학적 물질을 캡슐화하기 위한 방법은 미국 특허 제4,789,734호(이의 전문은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 기재되어 있다. 기본적으로, 물질은 수용액 중에 용해되고, 적절한 인지질 및 지질이 필요하다면 계면활성제와 함께 첨가되며, 물질은 투석되거나 필요한 경우 초음파 처리된다. 알려진 방법의 검토는 문헌[G. Gregoriadis, Chapter 14, "Liposomes," Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 2.sup.87-341 (Academic Press, 1979)]에 의해 제공된다.
중합체 또는 폴리펩타이드로 형성된 마이크로스피어는 당업자에게 잘 알려져 있고, 위장관을 통해 혈류에 직접 유입되기 전에 맞춤될 수 있다. 대안적으로, 화합물이 혼입될 수 있고, 마이크로스피어 또는 마이크로스피어의 복합체가 며칠 내지 몇달 범위의 기간에 걸쳐 느린 방출을 위해 이식된다. 예를 들어, 미국 특허 제4,906,474호, 제4,925,673호 및 제3,625,214호, 및 문헌[Jein, TIPS 19:155-157 (1998)]을 참조하며, 이의 내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
약물의 농도 및 완충된 용액의 pH는 조정될 수 있고, 등장성은 안구내 또는 유리체내 주사와 양립 가능하게 되도록 조정된다.
본 개시내용의 화합물은 멸균 용액 또는 현탁액으로서 적합한 비히클에서 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물은 통상적인, 잘 알려진 멸균 기법에 의해 멸균될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 얻어진 수용액은 있는 그대로 사용하기 위해 패키징될 수 있거나, 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액과 조합된다. 적합한 제형 및 추가적인 담체는 문헌[Remington "The Science and Practice of Pharmacy" (20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore MD)]에 기재되어 있다.
제제 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 단독으로 또는 1종 이상의 다른 제제와 조합하여 또는 하나 이상의 다른 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 제형은 각 제제의 상대 효력 및 의도되는 적응증에 따라서 특정 비율로 1종 이상의 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 두 상이한 숙주 표적을 표적화하기 위한 조성물에서 그리고 효력이 유사한 경우에, 제제의 약 1:1 비가 사용될 수 있다. 두 형태는 동일한 투약 단위로, 예를 들어, 1종의 크림, 좌약, 정제, 캡슐, 에어로졸 스프레이 또는 음료에 용해될 분말의 패킷으로 함께 제형화될 수 있거나; 또는 두 형태는 별개의 단위, 예를 들어, 2종의 크림, 2종의 좌약, 2종의 정제, 2종의 캡슐, 정제 및 정제를 용해시키기 위한 액체, 2종의 에어로졸 스프레이 또는 분말 패킷 및 분말을 용해시키기 위한 액체로 제형화될 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 본 개시내용에서 사용되는 제제의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않지 않은 해당 염을 의미한다.
전형적인 염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 이온 등과 같은 무기 이온의 염이다. 이러한 염은 무기 또는 유기산, 예컨대, 염산, 브로민화수소산, 인산, 질산, 황산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 아세트산, 퓨마르산, 석신산, 락트산, 만델산, 말산, 시트르산, 타르타르산 또는 말레산에 의해 형성되는 것을 포함한다. 더 나아가, 제제가 카복실 또는 다른 산성기를 포함하는 경우에, 이는 무기 또는 유기 염기를 이용해서 약제학적으로 허용 가능한 첨가염으로 전환될 수 있다. 적합한 염기의 예는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아, 사이클로헥실아민, 다이사이클로헥실아민, 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트라이에탄올아민 등을 포함한다.
약제학적으로 허용 가능한 에스터 또는 아마이드는 본 개시내용에서 사용되는 제제의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않지 않은 것을 지칭한다. 전형적인 에스터는 에틸 에스터, 메틸 에스터, 아이소뷰틸 에스터, 에틸렌 글리콜 에스터 등을 포함한다. 전형적인 아마이드는 비치환 아마이드, 알킬 아마이드, 다이알킬 아마이드 등을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제제는 1종 이상의 다른 화합물, 형태 및/또는 제제, 예컨대, 위에 기재한 것과 병용하여 투여될 수 있다. 1종 이상의 다른 활성제를 함유하는 약제학적 조성물은 특정 몰비를 함유하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 제1 활성제 대 다른 활성제의 몰비는 약 99:1 내지 약 1:99일 수 있다. 실시형태의 일부 서브세트에서, 제1 활성제 대 다른 활성제의 몰비는 약 80:20 내지 약 20:80; 약 75:25 내지 약 25:75, 약 70:30 내지 약 30:70, 약 66:33 내지 약 33:66, 약 60:40 내지 약 40:60; 약 50:50; 또는 약 90:10 내지 약 10:90의 범위이다. 제1 활성제 대 다른 활성제의 몰비는 약 1:9일 수 있고, 일부 실시형태에서, 약 1:1일 수 있다. 두 제제, 형태 및/또는 화합물은 동일한 투약 단위로, 예를 들어, 1종의 크림, 좌약, 정제, 캡슐 또는 음료에 용해될 분말의 패킷으로 함께 제형화될 수 있고; 대안적으로, 두 제제, 형태 및/또는 화합물은 별개의 단위, 예컨대, 2종의 크림, 좌약, 정제, 2종의 캡슐, 정제 및 정제를 용해시키기 위한 액체, 에어로졸 스프레이, 분말의 패킷 및 분말을 용해시키기 위한 액체 등으로 제형화될 수 있다.
제제 및/또는 제제의 조합물은 필요하거나 원한다면 다른 제제와 함께 추가로 투여될 수 있다. 본 개시내용의 제제 및/또는 제제의 조합물과 공동 투여될 수 있는 제제의 선택은, 적어도 부분적으로, 치료 중인 병태에 따를 것이다.
제제(또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 에스터 또는 아마이드)는 단독으로 또는 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있으며, 활성제는 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체와 배합 또는 혼합된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 약제학적 조성물은 대상체에 투여하기 위해 제조된 임의의 조성물일 수 있다. 본 개시내용에 따라 사용되는 약제학적 조성물은, 예를 들어, 활성제가 투여 가능한 제형으로 가공되는 것을 촉진시키는 부형제, 희석제 및/또는 아쥬반트를 포함하는 1종 이상의 생리적으로 허용 가능한 담체를 이용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은, 적어도 부분적으로, 선택된 투여 경로에 따를 것이다. 본 개시내용에서 사용되는 제제 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 에스터, 또는 아마이드는 경구, 협측, 국소, 직장, 경피내, 경점막, 피하, 정맥내, 안구내, 유리체내 및 근육내 투여뿐만 아니라 흡입을 포함하는 다양한 투여 경로 또는 방식을 이용해서 대상체에게 전달될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제제는, 예를 들어, 대형 친유성 모이어티의 존재로 인해, 오일 또는 비수성 용매를 이용하여 용액에 포함될 수 있다. 대안적으로, 에멀션, 현탁액 또는 다른 제형, 예컨대, 리포솜 제형이 사용될 수 있다. 리포솜 제형에 관해, 병태를 치료하기 위해 리포솜을 제조하는 데 임의의 알려진 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Bangham et al, J. Mol. Biol. 23: 238-252 (1965) 및 Szoka et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA 75: 4194-4198 (1978)]을 참조한다. 리간드는 또한 이러한 조성물을 특정 작용 부위에 보내기 위해 리포솜에 부착될 수 있다. 본 개시내용의 제제는 또한 식품 제품, 예컨대, 크림 치즈, 버터, 샐러드 드레싱 또는 아이스크림에 혼입되어, 대상체의 특정 집단에서 가용화, 투여 및/또는 순응도를 촉진시킬 수 있다.
본 개시내용의 화합물은 (예를 들어, 안구내 또는 유리체내 주사와 같은 주사에 의해) 비경구 투여용으로 제형화될 수 있고, 앰플, 사전 충전 주사기, 소용적 주입의 단위 투약 형태로 또는 보존제가 첨가된 다회-용량 용기에 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀션, 예를 들어, 수성 폴리에틸렌 글리콜 중의 용액으로서 이러한 형태를 취할 수 있다.
주사 가능한 제형의 경우, 비히클은 수용액 또는 유성 현탁액 또는 에멀션뿐만 아니라 참깨유, 옥수수유, 면실유 또는 땅콩유, 및 엘릭서, 만니톨, 덱스트로스 또는 멸균 수용액 및 유사한 약제학적 비히클을 포함하는, 당업계에 적합한 것으로 알려진 것으로부터 선택될 수 있다. 제형은 또한 폴리(락트산-코-글리콜산)과 같은 생체 적합 생분해성 중합체를 포함할 수 있다. 이러한 물질은 마이크로스피어 또는 나노스피어로 만들어지고, 약물을 로딩하고, 추가로 코팅되거나 또는 우수한 지속-방출 성능을 제공하도록 유도될 수 있다. 안주위 또는 안구내 주사에 적합한 비히클은, 예를 들어, 친유성 물질에 적합한 주사 등급수, 리포솜 및 비히클에서 치료적 제제의 현탁액을 포함한다. 안주위 또는 안구내 주사를 위한 다른 비히클은 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 통상적인 절차에 따라 인간에게 정맥내 투여하기에 적합한 약제학적 조성물로 제형화된다. 전형적으로, 정맥내 투여를 위한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 주사 부위에서 통증을 감소시키기 위해 가용화제 및 국소 마취제, 예컨대, 리도카인을 포함할 수 있다. 전형적으로, 성분은 개별적으로 또는 혼합물로서, 예를 들어, 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 활성제의 양을 표시하는 앰플 또는 사쉐와 같은 밀폐 용기에 단위 투약 형태로 제공된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우에, 이는 멸균 약제학적 등급수 또는 식염수를 함유하는 주입 보틀에 제공될 수 있다. 조성물을 주사에 의해 투여하는 경우에, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 양이 제공될 수 있다.
주사에 의해 투여될 때, 활성 화합물은 수성 용액 중에, 특히 생리적으로 양립 가능한 완충제, 예컨대, 행크스 용액, 링거액 또는 생리 식염수 완충제로 제형화될 수 있다. 용액은 제형화제, 예컨대, 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 화합물은 분말 형태일 수 있고, 사용 전에 적합한 비히클, 예컨대 멸균 무발열원수를 이용해서 재구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 펩타이드에 의해 자극되는 면역 반응을 향상시키기 위해 첨가되는 아쥬반트 또는 임의의 다른 물질을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 펩타이드에 대한 면역 반응을 저해하는 물질을 포함한다. 제형화 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, Mack Publishing Co., Easton P]에 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, 안과 용액, 현탁액, 연고 또는 본 개시내용의 제제 또는 제제의 조합물을 함유하는 삽입물은 안장애를 효과적으로 치료하기 위해 사용될 수 있다. 안과 용액은 활성 성분을 멸균 수용액, 예컨대, 생리 식염수, 완충제 용액 등에 용해시킴으로써, 또는 사용 전에 분말 조성물을 용해되도록 합함으로써 제조될 수 있다. 균형염 용액, 식염수 용액, 수용성 폴리에터, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 화합물, 예컨대, 폴리비닐 알코올 및 포비돈, 셀룰로스 유도체, 예컨대, 메틸 셀룰로스 및 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, 석유 유도체, 예컨대, 광유 및 백색 페트로라텀, 동물성 지방, 예컨대, 라놀린, 아크릴산의 중합체, 예컨대, 카복시폴리메틸렌 겔, 식물성 지방, 예컨대, 땅콩유 및 다당류, 예컨대, 덱스트란, 및 글리코사미노글리칸, 예컨대, 하이알루론산나트륨을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 당업계에 알려진 다른 비히클이 선택될 수 있다. 필요한 경우, 안과 용액에서 통상적으로 사용되는 첨가제가 첨가될 수 있다. 이러한 첨가제는 등장화제(예를 들어, 염화나트륨 등), 완충제(예를 들어, 보론산, 인산일수소나트륨, 아인산이수소나트륨 등), 보존제(예를 들어, 염화벤즈알코, 염화벤즈에토늄, 클로로부탄올 등), 증점제(예를 들어, 당, 예컨대, 락토스, 만니톨, 말토스 등, 예를 들어, 하이알루론산 또는 이의 염, 예컨대, 하이알루론산나트륨, 하이알루론산칼륨 등, 예를 들어, 뮤코다당, 예컨대, 황산콘드로이틴, 예를 들어, 폴리아크릴산나트륨, 카복시비닐 중합체, 가교된 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 카복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 또는 당업자에게 알려진 다른 제제)를 포함한다.
본 발명의 조성물의 구성성분의 용해도는 조성물에서 계면활성제 또는 다른 적합한 공용매에 의해 향상될 수 있다. 이러한 공용매는 폴리솔베이트 20, 60 및 80; Pluronic F68, F-84 및 P-103; 사이클로덱스트린 또는 당업자에게 알려진 다른 제제를 포함한다. 이러한 공용매의 사용 수준은 약 0.01중량% 내지 2중량%일 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 다회 용량 형태로 패키징될 수 있다. 보존제는 바람직하게는 사용 동안에 미생물 오염을 방지할 수 있다. 적합한 보존제는 염화벤즈알코늄, 티메로살, 클로로부탄올, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 펜에틸 알코올, 에데테이트 이나트륨, 솔브산, Onamer M, 또는 당업자에게 알려진 다른 제제를 포함한다. 선행 기술의 안과용 제품에서, 이러한 보존제의 사용 수준은 0.004% 내지 0.02%일 수 있다. 본 출원의 조성물에서, 보존제, 바람직하게는 염화벤즈알코늄은 0.001중량% 내지 0.01중량% 미만(예를 들어, 0.001중량% 내지 0.008중량%, 바람직하게는 약 0.005중량%)의 수준으로 사용될 수 있다. 0.005% 농도의 염화벤즈알코늄이 본 개시내용의 조성물을 미생물 공격으로부터 보호하기에 충분할 수 있다는 것이 발견되었다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 제제는 작용 부위에 더 빠르고 정량적인 흡수를 가능하게 하기 위해 현탁액 형태보다는 가용성으로 전달된다. 일반적으로, 겔, 크림, 로션, 좌약 및 연고와 같은 제형은 본 개시내용의 제제에 더 긴 노출 면적을 제공할 수 있는 반면, 용액 형태의 제형, 예컨대, 스프레이는 더 즉각적인 단기간 노출을 제공한다.
본 개시내용의 화합물이 지속-방출 제형에서 사용하기 위한 방출 가능한 방식으로 생체 적합 중합체에 부착될 수 있고, 국소, 안구내, 안주위 또는 전신 투여를 위해 삽입물에 부착될 수 있다는 것이 추가로 예상된다. 생체적합 중합체로부터의 제어 방출은 또한 주입 가능한 제형을 형성하기 위해 수용성 중합체와 함께 이용될 수 있다. PLGA 마이크로스피어 또는 나노스피어와 같은 생체적합 중합체로부터의 제어 방출은 지속 방출 투여를 위해 안구내 이식 또는 주사에 적합한 제형에서 사용될 수 있고, 임의의 적합한 생분해성 및 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다.
추가 넘버링된 실시형태
본 발명의 추가 실시형태는 다음의 넘버링된 항목으로 제공된다:
항목 1: (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로) 미토콘드리아 표적화 서열 및 미토콘드리아 단백질 암호화 서열을 포함하는 재조합 핵산으로서, 선택적으로, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 ND4 단백질을 암호화하고; 선택적으로, 상기 ND4 단백질은 서열번호 160과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 2: 항목 1에 있어서, 서열번호 180 및 174 내지 176에 제시된 바와 같은 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 3: 항목 1 또는 2에 있어서, 서열번호 180과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 4: 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 180에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 5: 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 미토콘드리아 표적화 서열의 5' 말단 앞에 위치된 Kozak 서열을 포함하되, 선택적으로, 상기 Kozak 서열은 서열번호 171이고; 선택적으로, 상기 Kozak 서열과 상기 미토콘드리아 표적화 서열 사이에 여분의 뉴클레오타이드가 존재하지 않는, 재조합 핵산.
항목 6: 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 인트론 서열을 포함하되, 선택적으로, 상기 인트론 서열은 상기 미토콘드리아 표적화 서열의 5' 말단 앞에 위치되고; 선택적으로, 상기 인트론 서열은 상기 Kozak 서열의 5' 말단 앞에 위치되고; 선택적으로, 상기 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 7: 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 프로모터 서열을 포함하되, 선택적으로, 상기 프로모터 서열은 상기 미토콘드리아 표적화 서열, 상기 Kozak 서열 및/또는 상기 인트론 서열의 5' 말단 앞에 위치되고; 선택적으로, 상기 프로모터 서열은 서열번호 169에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 8: 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 3' UTR 서열을 포함하되, 선택적으로, 상기 3' UTR 서열은 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열의 3' 말단 뒤에 위치되고; 선택적으로, 상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 9: 항목 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 폴리A 신호 서열을 포함하되, 선택적으로, 상기 폴리A 신호 서열은 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열의 3' 말단 및/또는 상기 3' UTR 서열 뒤에 위치되고; 선택적으로, 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 172 또는 173에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 선택적으로, 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 173에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 10: 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 3' UTR 서열과 상기 폴리A 신호 서열 사이에 서열번호 185에 제시된 바와 같은 스페이서 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 11: 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서,
상기 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 그리고/또는
상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 12: 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 제1 역위 말단 반복부(ITR) 서열 및 제2 ITR 서열을 더 포함하되, 선택적으로, 제1 ITR 서열은 서열번호 178에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR 서열은 서열번호 179에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 13: 재조합 핵산으로서, (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로)
미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열, 3' UTR 서열 및 폴리A 신호 서열을 포함하되,
상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 173에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 14: 항목 13에 있어서, 상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 15: 항목 9 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 재조합 핵산의 전사에 의해 생성된 미토콘드리아 단백질 암호화 서열을 포함하는 mRNA는 폴리A 신호 서열이 없는 대조군 재조합 핵산의 mRNA보다 더 높은 발현 수준을 갖고; 바람직하게는, 대조군 재조합 핵산의 mRNA보다 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200% 또는 적어도 300% 더 높은 발현 수준을 갖는, 재조합 핵산.
항목 16: 항목 15에 있어서, 대조군 재조합 핵산은 폴리A 신호 서열의 위치에서 서열번호 172를 포함하는 서열로 치환되고; 바람직하게는, 재조합 핵산의 전사에 의해 생성된 mRNA는 대조군 재조합 핵산에 의해 생성된 mRNA보다 적어도 10%, 적어도 15% 또는 적어도 20% 더 높은 발현 수준을 갖는, 재조합 핵산.
항목 17: 항목 9 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 재조합 핵산의 번역에 의해 생성된 미토콘드리아 단백질은 폴리A 신호 서열이 없는 대조군 재조합 핵산의 미토콘드리아 단백질보다 더 높은 발현 수준을 갖고; 바람직하게는, 대조군 재조합 핵산의 미토콘드리아 단백질보다 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200% 또는 적어도 300% 더 높은 발현 수준을 갖는, 재조합 핵산.
항목 18: 항목 17에 있어서, 상기 대조군 재조합 핵산은 폴리A 신호 서열의 위치에서 서열번호 172를 포함하는 서열로 치환되고; 바람직하게는, 재조합 핵산의 번역에 의해 생성된 미토콘드리아 단백질은 대조군 재조합 핵산에 의해 생성된 미토콘드리아 단백질보다 적어도 10%, 적어도 15% 또는 적어도 20% 더 높은 발현 수준을 갖는, 재조합 핵산.
항목 19: 항목 9 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 폴리A 신호 서열은 122개 이하의 염기쌍, 125개 이하의 염기쌍, 130개 이하의 염기쌍, 140개 이하의 염기쌍, 150개 이하의 염기쌍, 160개 이하의 염기쌍, 170개 이하의 염기쌍, 180개 이하의 염기쌍, 190개 이하의 염기쌍 또는 200개 이하의 염기쌍의 길이를 갖는, 재조합 핵산.
항목 20: 항목 13 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 미토콘드리아 표적화 서열의 5' 말단 앞에 위치된 Kozak 서열을 더 포함하되, 선택적으로, 상기 Kozak 서열은 서열번호 171이고; 선택적으로, 상기 Kozak 서열과 상기 미토콘드리아 표적화 서열 사이에 여분의 뉴클레오타이드가 존재하지 않는, 재조합 핵산.
항목 21: 항목 13 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 3' UTR 서열과 상기 폴리A 신호 서열 사이에 서열번호 185에 제시된 바와 같은 스페이서 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 22: 재조합 핵산으로서, (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로)
Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열 및 3' UTR 서열을 포함하되,
상기 Kozak 서열은 서열번호 171이고;
상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 그리고
상기 Kozak 서열과 상기 미토콘드리아 표적화 서열 사이에 여분의 뉴클레오타이드가 존재하지 않는, 재조합 핵산.
항목 23: 항목 22에 있어서, 폴리A 신호 서열을 더 포함하되, 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 172 또는 173에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 24: 항목 13 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 인트론 서열을 더 포함하되, 선택적으로, 상기 인트론 서열은 상기 Kozak 서열의 5' 말단 앞에 위치되고; 선택적으로, 상기 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 25: 항목 13 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 프로모터 서열을 더 포함하되, 선택적으로, 상기 프로모터 서열은 서열번호 169에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 26: 항목 25에 있어서, 상기 프로모터 서열은 상기 인트론 서열의 5' 말단 앞에 위치되는, 재조합 핵산.
항목 27: 재조합 핵산으로서, (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로)
프로모터 서열, 인트론 서열, Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열 및 미토콘드리아 단백질 암호화 서열을 포함하되,
상기 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하되;
선택적으로, 상기 재조합 핵산은 3' UTR 서열을 더 포함하고; 선택적으로, 상기 재조합 핵산은 폴리A 신호 서열을 더 포함하는, 재조합 핵산.
항목 28: 항목 13 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 제1 역위 말단 반복부(ITR) 서열 및 제2 ITR 서열을 더 포함하되, 선택적으로, 제1 ITR 서열은 서열번호 178에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR 서열은 서열번호 179에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 29: 항목 13 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열과 상기 3' UTR 서열 사이에 여분의 뉴클레오타이드가 존재하지 않는, 재조합 핵산.
항목 30: 항목 13 내지 29 중 어느 하나에 있어서,
상기 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 그리고/또는
상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 31: 항목 13 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 미토콘드리아 표적화 서열과 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열 사이에 여분의 뉴클레오타이드가 존재하지 않는, 재조합 핵산.
항목 32: 항목 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로) 제1 ITR 서열, 프로모터 서열, 인트론 서열, Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열, 3' UTR 서열, 폴리A 신호 서열 및 제2 ITR 서열을 포함하되,
바람직하게는, 상기 제1 ITR 서열은 서열번호 178에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 프로모터 서열은 서열번호 169에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 Kozak 서열은 서열번호 171이며; 상기 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 173에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 제2 ITR 서열은 서열번호 179에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 33: 항목 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로) 제1 ITR 서열, 프로모터 서열, 인트론 서열, Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열, 3' UTR 서열, 폴리A 신호 서열 및 제2 ITR 서열을 포함하되,
바람직하게는, 상기 제1 ITR 서열은 서열번호 178에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 프로모터 서열은 서열번호 169에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 Kozak 서열은 서열번호 171이고; 상기 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 173에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 그리고 상기 제2 ITR 서열은 서열번호 179에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 34: 항목 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로) 제1 ITR 서열, 프로모터 서열, 인트론 서열, Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열, 3' UTR 서열, 폴리A 신호 서열 및 제2 ITR 서열을 포함하되,
바람직하게는, 상기 제1 ITR 서열은 서열번호 178에 제시된 바와 같은 서열을 포함하며; 상기 프로모터 서열은 서열번호 169에 제시된 바와 같은 서열을 포함하고; 상기 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 바와 같은 서열을 포함하며; 상기 Kozak 서열은 서열번호 171이고; 상기 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열을 포함하며; 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하고; 상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하며; 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 173에 제시된 바와 같은 서열을 포함하고; 그리고 상기 제2 ITR 서열은 서열번호 179에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 35: 항목 13 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 174 내지 176 및 180에 제시된 바와 같은 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 36: 항목 13 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 180에 제시된 서열, 바람직하게는, 서열번호 180과 동일한 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
항목 37: 항목 1 내지 36 중 어느 하나에 따른 재조합 핵산을 포함하는, 바이러스 벡터.
항목 38: 항목 37에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터인, 바이러스 벡터.
항목 39: 항목 38에 있어서, 상기 rAAV 벡터는 rAAV2 벡터인, 바이러스 벡터.
항목 40: 항목 1 내지 36 중 어느 하나에 따른 재조합 핵산을 포함하는, 약제학적 조성물.
항목 41: 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 바이러스 벡터는 항목 1 내지 36 중 어느 하나에 따른 재조합 핵산을 포함하는, 약제학적 조성물.
항목 42: 항목 41에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 약제학적 조성물.
항목 43: 항목 40 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 이의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
항목 44: 항목 43에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 인산염 완충 식염수(PBS), α,α-트레할로스 탈수화물, L-히스티딘 하이드로클로라이드 일수화물, 폴리솔베이트 20, NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, 폴록사머 188 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 약제학적 조성물.
항목 45: 항목 43에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 인산염 완충 식염수(PBS), α,α-트레할로스 탈수화물, L-히스티딘 하이드로클로라이드 일수화물, 폴리솔베이트 20, NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, 폴록사머 188 및 이들의 임의의 조합물로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
항목 46: 항목 43 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 폴록사머 188을 포함하는, 약제학적 조성물.
항목 47: 항목 46에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 0.0001% 내지 0.01%의 폴록사머 188을 포함하는, 약제학적 조성물.
항목 48: 항목 46에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 0.001%의 폴록사머 188을 포함하는, 약제학적 조성물.
항목 49: 항목 46 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 하나 이상의 염을 더 포함하는, 약제학적 조성물.
항목 50: 항목 49에 있어서, 상기 하나 이상의 염은 NaCl, Na2HPO4 및 KH2PO4를 포함하는, 약제학적 조성물.
항목 51: 항목 50에 있어서,
a) 5 내지 15㎎/㎖ 농도의 NaCl; 바람직하게는, 9㎎/㎖ 농도의 NaCl;
b) 0.1 내지 0.5㎎/㎖ 농도의 KH2PO4; 바람직하게는, 0.144㎎/㎖ 농도의 KH2PO4; 및/또는
c) 0.5 내지 1㎎/㎖ 농도의 Na2HPO4; 바람직하게는, 0.795㎎/㎖ 농도의 Na2HPO4
를 포함하는, 약제학적 조성물.
항목 52: 항목 40 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 pH가 7.2 내지 7.4인, 약제학적 조성물.
항목 53: 항목 52에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 pH가 7.3인, 약제학적 조성물.
항목 54: 항목 40 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 바이러스 역가가 적어도 1.0×1010 vg/㎖, 적어도 3.0×1010 vg/㎖ 또는 적어도 6.0×1010 vg/㎖인, 약제학적 조성물.
항목 55: 항목 54에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 바이러스 역가가 적어도 9.0×1010 vg/㎖인, 약제학적 조성물.
항목 56: 항목 40 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 5회의 냉동/해동 주기 전의 바이러스 역가에 비해서 5회의 냉동/해동 주기 후에 바이러스 역가의 적어도 60%를 유지하는, 약제학적 조성물.
항목 57: 안질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 항목 40 내지 56 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물의 용도.
항목 58: 안질환의 치료 방법으로서, 유효 용량의 항목 40 내지 56 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
항목 59: 항목 57 또는 항목 58에 있어서, 상기 안질환은 레베르 유전성 시신경병증(LHON)인, 용도 또는 방법.
항목 60: 항목 57 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 안구내 또는 유리체내 주사에 의해 투여되는, 용도 또는 방법.
항목 61: 항목 60에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 유리체내 주사에 의해 투여되는, 용도 또는 방법.
항목 62: 항목 57 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 각 눈에 0.01 내지 0.1㎖의 약제학적 조성물이 투여되는, 용도 또는 방법.
항목 63: 항목 62에 있어서, 각 눈에 0.045 내지 0.055㎖의 약제학적 조성물이 투여되는, 용도 또는 방법.
항목 64: 항목 57 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노-연관 바이러스는 각 눈에 적어도 1.5×109 vg의 용량으로 투여되고; 바람직하게는, 상기 아데노-연관 바이러스는 적어도 3.0×109 vg의 용량으로 투여되는, 용도 또는 방법.
항목 65: 항목 57 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노-연관 바이러스는 각 눈에 적어도 4.5×109 vg의 용량으로 투여되는, 용도 또는 방법.
항목 66: 항목 57 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 코르티코스테로이드를 상기 환자에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 용도 또는 방법.
항목 67: 항목 66에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 프레드니손 또는 메틸프레드니솔론을 포함하는, 용도 또는 방법.
항목 68: 항목 67에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 프레드니손인, 용도 또는 방법.
항목 69: 항목 66 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 상기 약제학적 조성물의 투여 약 2일 전에 시작해서 투여되는, 용도 또는 방법.
항목 70: 항목 66 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 경구 투여되는, 용도 또는 방법.
항목 71: 항목 66 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 투여를 시작한 후 약 28일 동안 연속 투여되는, 용도 또는 방법.
항목 72: 항목 66 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 상기 투여를 시작한 후 매일 투여되고, 매주 연속 투여된 후에 감소되는 용량으로 투여되는, 용도 또는 방법.
항목 73: 항목 66 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는: 투여 시작 시 1주 동안 매일 40㎎, 이어서, 1주 동안 매일 30㎎, 이어서, 1주 동안 매일 20㎎ 및 마지막에 1주 동안 매일 10㎎의 투약량으로 투여되는, 용도 또는 방법.
항목 74: 항목 57 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 크레아틴 인산나트륨을 상기 환자에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 용도 또는 방법.
항목 75: 항목 74에 있어서, 상기 크레아틴 인산나트륨은 정맥내 주사에 의해 투여되는, 용도 또는 방법.
항목 76: 항목 57 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 상기 투여는 상기 재조합 핵산이 없는 약제학적 조성물의 투여에 비해서 더 높은 평균 시력 회복 수준을 초래하는, 용도 또는 방법.
실시예
본 발명은 다음의 예시적인 실시예와 함께 아래에 추가로 기재한다. 이러한 실시예는 본 발명의 범주를 제한하기보다는 단지 본 발명을 예시하는 것으로 의도된다는 것이 이해되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 예를 들어, 문헌[sambrook et al., molecular cloning: a laboratory manual (New York: cold spring harbor laboratory press, 1989)]에 기새된 방법 및 병태, 또는 제조업자에 의해 권장되는 병태가 다음의 실시예에서 사용될 수 있다.
실시예 1. ND4 플라스미드의 작제 및 최적화
I. 플라스미드의 작제 및 제조
미토콘드리아 표적화 서열(MTS) COX10(서열번호 1)을 인간 ND4 암호화 서열(서열번호 6) 및 3' UTR 서열(서열번호 13)에 연결하였고, FLAG-표지 펩타이드를 종결자 앞에 부가하고, CMV 프로모터(서열번호 169) 및 키메라 인트론(서열번호 170)을 5' 말단에 부가하고, bGH(서열번호 172) 또는 SV40(서열번호 173) 폴리A 꼬리를 3' 말단에 연결하고(또는 연결하지 않고), AAV2 플라스미드 골격을 삽입하여: pAAV-CMV-ND4-3' 플래그-COX10UTR 플라스미드 A(도 3; 서열번호 174), pAAV-CMV-ND4-3' 플래그-COX10UTR-bGH 플라스미드 B(도 2; 서열번호 175) 및 pAAV-CMV-ND4-3' 플래그-COX10UTR-SV40 플라스미드 C(도 1; 서열번호 176)를 얻었다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에 결찰 산물을 형질전환하고, 효소 분해 검증 및 서열분석 검증을 위해 단일 콜로니를 선택하였다.
II. 플라스미드를 이용하는 세포 형질감염
1. 형질감염 1일 전에, HEK293T 세포를 트립신처리하고, 계수하고, 이어서, 형질감염일에 70% 내지 80%의 수렴도를 갖도록 플레이트 상에서 확산시켰다.
2. 세포의 각 웰에 대해, 2.0㎍의 플라스미드 DNA를 125㎕의 무혈청 DMEM 배양 배지로 희석시키고; 6㎕의 PEI 시약(1㎍/㎕)을 125㎕의 DMEM 배양 배지로 희석시켰다.
3. 희석된 DNA와 PEI를 혼합하고, 20분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다.
4. 위에서 얻은 화합물을 각 웰에 직접 첨가하였고, 잘 혼합하기 위해 배양 플레이트를 부드럽게 진탕시켰다.
5. 세포를 37℃에서 5%의 CO2에서 48시간 동안 배양시켰다.
6. 배양 배지를 제거한 후에, 세포를 PBS로 세척하고 나서, 트립신 처리하고, 원심분리시키고, 이어서, 이후의 사용을 위해 수집하였다.
III. qPCR을 이용한 mRNA의 함량의 결정
1. 총 RNA의 추출(키트에 의한 추출)
1) 1㎖의 용해 용액 RZ를 10㎠의 배양 플레이트마다 첨가하여 세포를 용해시키고, 용액이 투명하게 될 때까지 세포를 샘플러로 여러 번 두드리고 나서, 용액을 15 내지 30℃에서 5분 동안 두어서 핵산-단백질 화합물을 완전히 분리시켰다.
2) 200㎕의 클로로폼을 첨가하고, 튜브 커버로 덮고 나서, 15초 동안 격렬히 진탕시키고, 3분 동안 실온에 두고, 이어서, 12,000rpm(약 13,400×g)에서 10분 동안 4℃에서 원심분리시켜 샘플을 얻었고, 이를 노란 오렌지색 상, 중간층 및 무색의 수성상을 포함하는 3개의 층으로 분리시켰다. 수성상은 주로 RNA를 포함하였고, 용리 용액이 약 50% 용적을 가졌고, RZ 시약을 사용하였다. 다음 단계에서의 작업을 위해 수성상을 새로운 관에 옮겼다.
3) 0.5배 용적의 고순도 에탄올을 제대로 혼합하기 위해 서서히 첨가하였다(이 경우에, 침전물이 존재할 수 있음). 얻어진 용액 및 침전물을 흡착 칼럼 CR3에 옮기고 나서, 12,000rpm(약 13,400×g)에서 30초 동안 4℃에서 원심분리시켰다. 용액 및 혼합물을 흡착 칼럼 CR3에 한 번에 완전히 첨가할 수 없었을 때, 용액 및 침전물을 흡착 칼럼 CR3에 두 부분으로 옮기고, 12,000rpm(약 13,400×g)에서 30초 동안 4℃에서 원심분리시키고, 이어서, 수집관의 폐액을 버렸다.
4) 500㎕의 탈단백질화된 액체 RD를 흡착 칼럼 CR3에 첨가하였고, 12,000rpm(약 13,400×g)에서 30초 동안 4℃에서 원심분리시키고, 폐액을 버리고 나서, CR3을 수집관에 넣었다.
5) 500㎕의 린스 용액 RW를 흡착 칼럼 CR3에 첨가하였고, 실온에서 2분 동안 두었고, 12,000rpm(약 13,400×g)에서 30초 동안 4℃에서 원심분리시키고 나서, 폐액을 버리고, 작업을 1회 반복하였다.
6) 흡착 칼럼을 2㎖ 수집관에 넣고 나서, 12,000rpm(약 13,400×g)에서 2분 동안 4℃에서 원심분리시켜 잔여 액체를 제거하였다.
7) 흡착 칼럼 CR3을 새로운 1.5㎖ 원심분리관에 옮기고, 30 내지 100㎕의 RNase 무함유 ddH2O를 첨가하였고, 얻어진 혼합물을 실온에서 2분 동안 두고, 12,000rpm(약 13,400×g)에서 2분 동안 4℃에서 원심분리시켰다.
8) 초-마이크로 자외선 분광광도계를 이용함으로써 RNA의 농도를 측정하였다.
2. 역전사
1) 2㎍의 RNA, 및 4㎕의 5×FastKing-RT SuperMix를 함유하는 용액을 PCR 관에 첨가하고, 이어서, 리보뉴클레아제 무함유 탈이온수를 20㎕에 첨가하였다.
2) 42℃에서 15분 동안 PCR 기기 상에서 관을 인큐베이션시키고, 이어서, 95℃에서 3분 동안 인큐베이션시켜 역방향 전사효소를 비활성화시켰다.
3. 정량적 PCR
1) 0.2㎖ PCR 관을 사용하여 다음의 반응 시스템을 준비하고, 각 역방향 전사 산물을 3개의 관에서 제조하였다. 10㎕의 2×qPCR 혼합물, 0.4㎕의 Rox, 1㎕의 10μM 유전자 프라이머, 2.0㎕의 역방향 전사 산물 및 5.6㎕의 ddH2O를 사용하였다.
표적 유전자 플래그의 증폭 프라이머:
정방향 프라이머 5'-AGACCATGACGGTGAT-3'(서열번호 181), 및
역방향 프라이머 5'-CTTGTCATCGTCATCCT-3'(서열번호 182).
내부 참조 유전자 액틴의 증폭 프라이머:
정방향 프라이머 5'-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3'(서열번호 183), 및
역방향 프라이머 5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3'(서열번호 184).
2) PCR 증폭
변성 전: 95℃, 30 s,
40 주기: 95℃, 5 s → 55℃, 30 s→ 72℃, 30 s,
용해 곡선: 55℃ → 95℃, 0.5℃/10 s의 속도.
3) 결과를 가공하기 위한 ΔΔCT 방법은 다음과 같았다: A = CT(표적 유전자, 시험할 샘플) - CT(내부 표준 유전자, 시험할 샘플); B = CT (표적 유전자, 대조군 샘플) - CT (내부 표준 유전자, 대조군 샘플); K = A - B; 및 발현 다중도 = 2 - K.
IV. 실험 결과 및 논의
ND4의 발현을 mRNA 수준에서 검출하였고, 결과는 pAAV2-CMV-rND4-COX10UTR 플라스미드 A에 비해서, pAAV2-CMV-rND4-COX10UTR-bGH폴리A 플라스미드 B 및 pAAV2-CMV-rND4-COX10UTR-SV40 플라스미드 C(도 4)가 HEK293 세포에서의 ND4 mRNA의 존재비를 크게 개선시켰고, 플라스미드 C가 플라스미드 B보다 양호하였다는 것을 나타냈다. 위의 결과는 더 많은 ND4 단백질이 코돈 최적화 및 전사 후 조절 구성요소의 상이한 조합의 첨가에 의해 세포에서 발현될 수 있고, SV40 폴리A가 폴리A 꼬리로서 사용될 때 더 양호한 효과가 달성된다는 것을 나타낸다.
실시예 2. 바이러스 패키징 및 생산
1. HEK293T 세포는 90% 초과의 수렴도에서 배양 디스크에서 1:3의 비로 계대하였다.
2. 플라스미드 형질전환의 약 1 내지 2시간 전에 혈청을 무혈청 배양 배지로 바꾸었고, 형질감염 시약을 이용해서 표적 유전자 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드를 HEK293T 세포에 옮겼다.
3. 플라스미드 형질전환의 24시간 후에, 무혈청 배양 배지를 새롭게 하였다.
4. 형질감염의 72시간 후에, 바이러스 수집을 수행하였다. 세포를 배양 배지로 피펫팅하고, 원심분리하고; 이어서, 배양 배지 상청액 및 세포 침전물을 별개로 수집하였다. 배양 배지 상청액의 바이러스를 밤새 PEG8000으로 침전시켰고, 이어서, 바이러스 침전물을 수집하였다.
5. 이오딕사놀을 이용하는 밀도 구배 원심분리에 의해 바이러스 혼합물을 정제하였고, 이어서, 초미세여과관에서 농축시켰다.
실시예 3. 제형 개발
3.1 주요 구성성분의 안전성에 대한 연구
주사는 다음의 아쥬반트를 포함한다: 무수 인산이수소칼륨, 무수 인산수소이나트륨, 염화나트륨, 주사용수 및 폴록사머 188. 이 중에서, 무수 인산이수소칼륨, 무수 인산수소이나트륨, 염화나트륨 및 주사용수는 전통적인 안과 주사 용액 제형에서 PBS의 구성성분으로서 이들의 실용도 및 안전성이 증명되었다.
데이터는 AAV2 바이러스 입자가 제한된 용해도를 갖고 고농도 및 반복된 냉동/해동 조건 하에 응집될 가능성이 있다는 것을 나타낸다. 또한, AAV 바이러스 입자는 용기 표면 상에 강한 흡착 효과를 갖는다. 따라서, 본 출원인은 주사를 상대적으로 안정적인 상태로 유지하기 위해 폴록사머 188을 주사에 첨가하였다.
다음의 샘플을 준비하였다: PBS + 0.01% 폴록사머 188 + 10㎎/㎖ 이오딕사놀; PBS + 0.01% 폴록사머 188; PBS + 10㎎/㎖ 이오딕사놀; PBS + 0.001% 폴록사머 188 + 1㎎/㎖ 이오딕사놀; 및 PBS + 0.001% 폴록사머 188. 샘플을 뉴질랜드 토끼의 눈에 유리체내로 주사하였다. 그룹화 결과를 다음의 표 2에 나타낸다.
임상 관찰, 안구내 압력 측정 및 일반적 안과용 시험을 주사한 뉴질랜드 토끼에 대해 수행하였고, 실험 제22일에 실험 뉴질랜드 토끼에 대해 안락사, 육안 해부학, 및 조직병리학적 관찰을 수행하였다.
(1) 임상 관찰 결과: 실험 동안, 모든 동물은 안구 증상을 제외하고 전신 비정상적 임상 징후를 나타내지 않았다.
(2) 안압: 실험의 제22일에, 주사 작업 그룹에 비해서, 시험 그룹(PBS + 10㎎/㎖ 이오딕사놀)에서 암컷 동물의 왼쪽 눈의 안구내 압력은 유의미하게 감소되었고(p≤0.05), 다른 시점에, 모든 시험 샘플 그룹은 동일한 성별에서 동물의 동일한 눈의 안압에서 주사 작업 그룹과 통계학적 차이가 없었다. 차이는 분명한 시간-반응 관계가 없는 우연성(contingency)이었고, 따라서 시험 샘플과 상관없었다.
(3) 일반적 안과 시험:
결막:
치료 후 제1일에, 대부분의 동물은 왼쪽 눈에서 안구 결막 충혈이 발생되었고, 제8일에 완전히 회복되었다. 주사 작업 그룹은 안구 결막 충혈이 있을 수 있고, 이는 샘플과 용량 관련이 없었다. 따라서, 안구 결막 충혈이 주사 작업과 관련되고 시험 샘플과 관련 없는 것으로 간주하였다.
그룹 2, 3 및 6의 암컷 동물이 눈의 1/3의 발생률로 왼쪽 눈에서 약한 결막 부종이 있고, 제4일에 완전히 회복된 것이 관찰되었다. 결막 부종은 낮은 발생률을 갖고 분명한 용량-반응 관계가 없었으며, 따라서 시험 샘플과 관련이 없었다.
수정체 및 유리액:
그룹 4의 수컷 동물은 제8일 내지 제22일에 왼쪽 눈의 전방 유리액에서 균일한 크기의 회백색 도트 입자를 가졌고, 그룹 5의 암컷 동물은 제8일 내지 제22일에 왼쪽 눈의 전방 수정체낭에서 회백색의 도트 입자 침착물 및 전방 유리액에서 균일한 크기의 회백색 도트 입자를 가졌고, 이들 둘 다 약하였다는 것이 관찰되었다. 위의 이상은 낮은 발생률을 갖고 분명한 시간/용량-반응 관계가 없었으며, 따라서 시험 샘플과 관련이 없었다.
(4) 육안 해부학 및 조직병리학
실험의 제22일에, 안락사를 수행하였다. 주사 작업 그룹의 여러 동물 및 모든 시험 샘플 그룹은 왼쪽 및/또는 오른쪽 안구에서 각막 윤부의 경증의 분산성(scattered) 염증 세포 침윤을 가졌다. 이 병변은 또한 주사 작업 그룹의 동물에서 그리고 치료된 적이 없는 여러 동물의 오른쪽 안구에서 관찰되었기 때문에, 이 병변은 시험 동물의 배경 또는 자발적 병변일 수 있고, 따라서 제공된 시험 샘플과 관련되지 않은 것으로 간주하였다.
현미경 하에서, 모든 동물은 안구에 다른 유의미한 비정상적 병리학적 변화가 없었다는 것이 관찰되었다.
결론: 뉴질랜드 토끼에 시험 샘플 PBS + 0.01% 폴록사머 188 + 10㎎/㎖ 이오딕사놀, PBS + 0.01% 폴록사머 188, PBS + 10㎎/㎖ 이오딕사놀, PBS + 0.001% 폴록사머 188 + 1㎎/㎖ 이오딕사놀, 및 PBS + 0.001% 폴록사머 188(50㎕/눈)의 단일 유리체내 주사 후에, 동물은 시험 샘플과 관련된 안구 독성 반응을 나타내지 않았다.
이는 안구내 주사 용액에서 사용되는 아쥬반트로서 0.01% 폴록사머 188의 안전성을 입증한다.
3.2 제형의 안전성에 대한 연구
특정 제형 설계를 표 3에 나타낸다.
위의 제형에 따라 제품을 생산하고, 안정성에 대해 시험하였다. 제형의 안정성을 시험하기 위한 실험 계획을 표 4 및 표 5에 나타낸다.
제형 1 및 2에서 바이러스 게놈의 역가를 제0일, 제1일 및 제5일에 개별적으로 결정하여 제형의 안정성을 비교하였다.
제형 1 및 2에서 바이러스 게놈의 역가를 0, 1, 2, 3, 4 및 5회의 냉동/해동 주기 후에 개별적으로 결정하여 제형의 안정성을 비교하였다.
제형의 안정성에 대한 연구를 위의 두 계획에 따라 수행하였다. 결과를 도 5 (2 내지 8℃에서 제형의 안정성을 시험하기 위한 실험 결과) 및 도 6(제형의 안정성을 시험하기 위한 냉동/해동 실험의 결과)에 나타낸다.
표 6에 나타낸 바와 같이, 2 내지 8℃에서 저장한 제형의 안정성을 시험하기 위한 실험에서, 제형 1의 바이러스 게놈의 역가는 유의미하게 감소되었고, 제형 2의 바이러스 게놈의 역가는 유의미하게 변하지 않았다. 또한, 제형 1의 바이러스 게놈의 역가는 RSD가 153.67%였고, 제형 2의 바이러스 게놈의 역가는 RSD가 14.39%였다. 따라서, 제형 2는 제형 1보다 더 안정적이다.
표 7에 나타낸 바와 같이, 냉동/해동 실험에서, 제형 1의 바이러스 게놈의 역가는 유의미하게 감소되었고, 제형 2의 바이러스 게놈의 역가는 유의미하게 변하지 않았다. 또한, 제형 1의 바이러스 게놈의 역가는 RSD가 113.25%였고, 제형 2의 바이러스 게놈의 역가는 RSD가 10.53%였다. 따라서, 제형 2는 제형 1보다 더 안정적이다.
결론적으로, 폴록사머 188이 있는 제형은 폴록사머 188이 없는 제형보다 더 안정적이다.
실시예 4. ND4 돌연변이-연관 레베르 유전성 시신경병증(LHON)의 유전자 요법의 안전성 및 효능을 평가하기 위한 I/II/III 상, 단일-아암, 다기관 및 2-단계 임상 연구
연구는 ND4 돌연변이-연관 LHON을 갖는 대상체의 NR082 안구 주입의 안전성 및 효능을 평가하기 위한 I/II/III상, 단일-아암, 다기관 및 2단계 임상 연구이다. 입원 후에, 포함 기준을 충족시키는 모든 대상체는 28일의 치료 기간 동안 연구 약물 요법 및 전신 면역조절 요법, 즉, 처방된 용량의 코르티코스테로이드(프레드니손)의 경구 투여를 받아서, NR082 안구 반응의 IVT 주사와 관련된 안구 염증 및 가능한 면역 반응을 방지하거나 감소시킨다. 프레드니손에 대한 구체적 투약 요법은 다음과 같았다: 대상체의 주사 치료 전 2일부터 시작해서 1주 동안 매일 40㎎, 이어서, 1주 동안 매일 30㎎, 이어서, 1주 동안 매일 20㎎, 이어서, 1주 동안 매일 10㎎ 및 마지막에 중단.
각 대상체에 대한 연구 지속기간은 선별 기간, 52(±4)주 동안의 추적기간 및 4년 동안의 장기간 안전성 추적기간을 포함하였다. 연구는 다음의 방문을 포함하였다:
선별 기간(제-42일 내지 제-2일),
입원: 그룹화(제-2일),
입원: 치료(제1일),
입원: 안전성 관찰(제2일 내지 제8일),
방문 1 내지 6: 추적기간(제2주(제15일) 내지 제52주), 및
방문 7 내지 14: 장기간 추적기간 및 연구의 종료(4년 동안 6개월마다 1회).
처리군 및 지속기간은 다음과 같았다:
각 대상체에 대한 가장 긴 연구 지속기간은 선별 기간을 포함하여, 52(±4)주 및 4년의 장기간 추적기간이다.
사용한 용량은 다음과 같았다:
1.5×109 vg, 0.05㎖ 눈/용량(저용량), 및
4.5×109 vg, 0.05㎖ 눈/용량(고용량).
1차 효능 분석
1차 효능 종점은 치료 후 기준선 52(± 4)주와 비교할 때 주사한 눈의 BCVA에서 0.3 LogMAR 이상의 개선을 갖는 대상체의 비율이었다.
2차 효능 분석
기준선에 비해서 주사한 눈의 BCVA에서 0.3 LogMAR 이상의 개선을 갖는 대상체의 비율(%)을 (적용 가능한 경우) 치료 용량 그룹 및 방문에 따라 범주 변수의 기술 통계로(대상체 계수 및 연관된 백분율) 요약하였다. 위의 반응 변수의 정확한 Cloner-Pearson 95% CI를 (적용 가능한 경우) 방문에 따라 계산하거나 또는 (적용 가능한 경우) 정상 근사치 방법에 기반하여 계산하였다.
전체 분석 세트(FAS)의 대상체 수를 분모로서 백분율을 계산하였다.
Clopper-Pearson 방법에 의해 95% 신뢰구간을 추정하였다.
n: 사례의 수; 및 95% CI: 95% 신뢰구간.
표 8에 나타내는 바와 같이, 기준선에 비해서 최대교정시력(BCVA)에서 0.3 LogMAR 이상의 개선을 갖는 대상체는, 저용량 그룹에서 제2주, 제6주 및 제12주에 각각 1건(16.7%), 1건(16.7%) 및 2건(33.3%), 그리고 고용량 그룹에서 제2주, 제6주 및 제12주에 각각 4건(66.7%), 4건(66.7%) 및 4건(66.7%)을 포함하였다.
기준선에 비해서 주사한 눈의 BCVA(LogMAR)의 변화 및 최소값에 비해서 주사한 눈의 BCVA의 개선은 (적용 가능한 경우) 처리 용량 그룹 및 방문에 따라 연속변수의 기술통계(관찰 수[n], 평균, 표준편차[SD], 중앙값, 최소값[min] 및 최대값[max] 포함); 및 기준선에 비해 주사한 눈 및 주사하지 않은 눈의 시야 파라미터(시야 지수, 시야의 평균 결함 및 패턴 표준 편차값 포함), 대비 민감도 파라미터 및 시각유발전위(visual evoked potential: VEP) 파형 파라미터의 변화를 요약한다.
표 9에 나타낸 바와 같이, 기준선에 비해서 BCVA의 평균은, 저용량 그룹에서 제2주, 제6주 및 제12주에 각각 0.080 LogMAR, 0.103 LogMAR 및 0.245 LogMAR, 그리고 고용량 그룹에서 제2주, 제6주 및 제12주에 각각 0.367 LogMAR, 0.338 LogMAR 및 0.408 LogMAR만큼 증가되었다.
표 10에 나타낸 바와 같이, 기준선에 비해서 시야 지수의 평균은, 저용량 그룹에서 제2주, 제6주 및 제12주에 각각 6.2%, 4.2% 및 6.7%만큼, 그리고 고용량 그룹에서 제2주, 제6주 및 제12주에 각각 1.0%, 12.2% 및 13.5%만큼 증가되었다.
표 11에 나타낸 바와 같이, 기준선에 비해서 시야의 평균 결함의 평균은, 저용량 그룹에서 제2주, 제6주 및 제12주에 각각 2.373㏈, 1.507㏈ 및 2.450㏈만큼, 그리고 고용량 그룹에서 제2주, 제6주 및 제12주에 각각 0.688㏈, 4.413㏈ 및 5.130㏈만큼 증가되었다.
본 발명의 바람직한 실시형태를 본 명세서에 나타내고 기재하였지만, 이러한 실시형태가 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 분명하다. 수많은 변형, 변화 및 대체가 본 발명으로부터 벗어나는 일 없이 당업자에 의해 일어날 것이다. 본 발명을 실행함에 있어서 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태가 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 다음의 청구범위는 본 발명의 범주를 정하는 것으로 의도되며, 청구범위 및 이의 균등물의 범주 내의 방법 및 구조가 이에 의해 포괄된다.
참조에 의한 원용
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌, 논문, 간행물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 전문이 참조에 의해 원용된다. 그러나, 본 명세서에 인용된 임의의 참고문헌, 논문, 간행물, 특허 공개 또는 특허 출원에 관한 언급은 이들이 세계 어느 국가에서의 유효한 선행기술 또는 통상의 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 인정 또는 임의의 제안 형태가 아니며, 이러한 것으로 취해져서도 안 된다.

Claims (68)

  1. (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로) 미토콘드리아 표적화 서열 및 미토콘드리아 단백질 암호화 서열을 포함하는 재조합 핵산으로서, 선택적으로, 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 ND4 단백질을 암호화하고; 선택적으로, 상기 ND4 단백질은 서열번호 160과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 180 및 174 내지 176에 제시된 바와 같은 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 180과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 180에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표적화 서열의 5' 말단 앞에 위치된 Kozak 서열을 포함하되, 선택적으로, 상기 Kozak 서열은 서열번호 171이고; 선택적으로, 상기 Kozak 서열과 상기 미토콘드리아 표적화 서열 사이에 여분의 뉴클레오타이드가 존재하지 않는, 재조합 핵산.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인트론 서열을 포함하되, 선택적으로, 상기 인트론 서열은 상기 미토콘드리아 표적화 서열의 5' 말단 앞에 위치되고; 선택적으로, 상기 인트론 서열은 상기 Kozak 서열의 5' 말단 앞에 위치되고; 선택적으로, 상기 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터 서열을 포함하되, 선택적으로, 상기 프로모터 서열은 상기 미토콘드리아 표적화 서열, 상기 Kozak 서열 및/또는 상기 인트론 서열의 5' 말단 앞에 위치되고; 선택적으로, 상기 프로모터 서열은 서열번호 169에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 3' UTR 서열을 포함하되, 선택적으로, 상기 3' UTR 서열은 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열의 3' 말단 뒤에 위치되고; 선택적으로, 상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리A 신호 서열을 포함하되, 선택적으로, 상기 폴리A 신호 서열은 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열의 3' 말단 및/또는 상기 3' UTR 서열 뒤에 위치되고; 선택적으로, 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 172 또는 173에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 선택적으로, 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 173에 제시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' UTR 서열과 상기 폴리A 신호 서열 사이에 서열번호 185에 제시된 바와 같은 스페이서 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 그리고/또는
    상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR) 서열 및 제2 ITR 서열을 더 포함하되, 선택적으로, 상기 제1 ITR 서열은 서열번호 178에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR 서열은 서열번호 179에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  13. 재조합 핵산으로서, (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로)
    미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열, 3' UTR 서열 및 폴리A 신호 서열을 포함하되,
    상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 173에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  14. 제13항에 있어서, 상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표적화 서열의 5' 말단 앞에 위치된 Kozak 서열을 더 포함하되, 선택적으로, 상기 Kozak 서열은 서열번호 171이고; 선택적으로, 상기 Kozak 서열과 상기 미토콘드리아 표적화 서열 사이에 여분의 뉴클레오타이드가 존재하지 않는, 재조합 핵산.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' UTR 서열과 상기 폴리A 신호 서열 사이에 서열번호 185에 제시된 바와 같은 스페이서 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  17. 재조합 핵산으로서, (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로)
    Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열 및 3' UTR 서열을 포함하되,
    상기 Kozak 서열은 서열번호 171이고;
    상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 그리고
    상기 Kozak 서열과 상기 미토콘드리아 표적화 서열 사이에 여분의 뉴클레오타이드가 존재하지 않는, 재조합 핵산.
  18. 제17항에 있어서, 폴리A 신호 서열을 더 포함하되, 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 172 또는 173에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 인트론 서열을 더 포함하되, 선택적으로, 상기 인트론 서열은 상기 Kozak 서열의 5' 말단 앞에 위치되고; 선택적으로, 상기 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터 서열을 더 포함하되, 선택적으로, 상기 프로모터 서열은 서열번호 169에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  21. 제20항에 있어서, 상기 프로모터 서열은 상기 인트론 서열의 5' 말단 앞에 위치되는, 재조합 핵산.
  22. 재조합 핵산으로서, (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로)
    프로모터 서열, 인트론 서열, Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열 및 미토콘드리아 단백질 암호화 서열을 포함하되,
    상기 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고;
    선택적으로, 상기 재조합 핵산은 3' UTR 서열을 더 포함하고; 선택적으로, 상기 재조합 핵산은 폴리A 신호 서열을 더 포함하는, 재조합 핵산.
  23. 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 역위 말단 반복부(ITR) 서열 및 제2 ITR 서열을 더 포함하되, 선택적으로, 상기 제1 ITR 서열은 서열번호 178에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR 서열은 서열번호 179에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  24. 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열과 상기 3' UTR 서열 사이에 여분의 뉴클레오타이드가 존재하지 않는, 재조합 핵산.
  25. 제13항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 그리고/또는
    상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  26. 제13항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표적화 서열과 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열 사이에 여분의 뉴클레오타이드가 존재하지 않는, 재조합 핵산.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로) 제1 ITR 서열, 프로모터 서열, 인트론 서열, Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열, 3' UTR 서열, 폴리A 신호 서열 및 제2 ITR 서열을 포함하되,
    바람직하게는, 상기 제1 ITR 서열은 서열번호 178에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 프로모터 서열은 서열번호 169에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 Kozak 서열은 서열번호 171이며; 상기 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 173에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 제2 ITR 서열은 서열번호 179에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로) 제1 ITR 서열, 프로모터 서열, 인트론 서열, Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열, 3' UTR 서열, 폴리A 신호 서열 및 제2 ITR 서열을 포함하되,
    바람직하게는, 상기 제1 ITR 서열은 서열번호 178에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 프로모터 서열은 서열번호 169에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 Kozak 서열은 서열번호 171이고; 상기 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 173에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 그리고 상기 제2 ITR 서열은 서열번호 179에 제시된 서열과 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  29. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, (5' 말단에서 3' 말단까지 순차적으로) 제1 ITR 서열, 프로모터 서열, 인트론 서열, Kozak 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 미토콘드리아 단백질 암호화 서열, 3' UTR 서열, 폴리A 신호 서열 및 제2 ITR 서열을 포함하되,
    바람직하게는, 상기 제1 ITR 서열은 서열번호 178에 제시된 바와 같은 서열을 포함하며; 상기 프로모터 서열은 서열번호 169에 제시된 바와 같은 서열을 포함하고; 상기 인트론 서열은 서열번호 170에 제시된 바와 같은 서열을 포함하며; 상기 Kozak 서열은 서열번호 171이고; 상기 미토콘드리아 표적화 서열은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열을 포함하며; 상기 미토콘드리아 단백질 암호화 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하고; 상기 3' UTR 서열은 서열번호 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하며; 상기 폴리A 신호 서열은 서열번호 173에 제시된 바와 같은 서열을 포함하고; 그리고 상기 제2 ITR 서열은 서열번호 179에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  30. 제13항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 174 내지 176 및 180에 제시된 바와 같은 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  31. 제13항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 180과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산을 포함하는, 바이러스 벡터.
  33. 제32항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터인, 바이러스 벡터.
  34. 제33항에 있어서, 상기 rAAV 벡터는 rAAV2 벡터인, 바이러스 벡터.
  35. 아데노-연관 바이러스(AAV)를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 AAV는 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산을 포함하는, 약제학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 이의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 인산염 완충 식염수(PBS), α,α-트레할로스 탈수화물, L-히스티딘 하이드로클로라이드 일수화물, 폴리솔베이트 20, NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, 폴록사머 188 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 약제학적 조성물.
  38. 제36항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 인산염 완충 식염수(PBS), α,α-트레할로스 탈수화물, L-히스티딘 하이드로클로라이드 일수화물, 폴리솔베이트 20, NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, 폴록사머 188 및 이들의 임의의 조합물로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 폴록사머 188을 포함하는, 약제학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 0.0001% 내지 0.01%의 폴록사머 188을 포함하는, 약제학적 조성물.
  41. 제39항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 0.001%의 폴록사머 188을 포함하는, 약제학적 조성물.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 하나 이상의 염을 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 하나 이상의 염은 NaCl, Na2HPO4 및 KH2PO4를 포함하는, 약제학적 조성물.
  44. 제43항에 있어서,
    a) 5 내지 15㎎/㎖ 농도의 NaCl; 바람직하게는, 9㎎/㎖ 농도의 NaCl;
    b) 0.1 내지 0.5㎎/㎖ 농도의 KH2PO4; 바람직하게는, 0.144㎎/㎖ 농도의 KH2PO4; 및/또는
    c) 0.5 내지 1㎎/㎖ 농도의 Na2HPO4; 바람직하게는, 0.795㎎/㎖ 농도의 Na2HPO4
    를 포함하는, 약제학적 조성물.
  45. 제35항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 pH가 7.2 내지 7.4인, 약제학적 조성물.
  46. 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 pH가 7.3인, 약제학적 조성물.
  47. 제35항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 바이러스 역가가 적어도 1.0×1010 vg/㎖, 적어도 3.0×1010 vg/㎖ 또는 적어도 6.0×1010 vg/㎖인, 약제학적 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 바이러스 역가가 적어도 9.0×1010 vg/㎖인, 약제학적 조성물.
  49. 제35항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 냉동/해동 주기 전의 바이러스 역가에 비해서 5회의 냉동/해동 주기 후에 바이러스 역가의 적어도 60%를 유지하는, 약제학적 조성물.
  50. 안질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 제35항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  51. 제50항에 있어서, 상기 안질환은 레베르 유전성 시신경병증(Leber's hereditary optic neuropathy: LHON)인, 용도.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 안구내 또는 유리체내 주사에 의해 투여되는, 용도.
  53. 제52항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 유리체내 주사에 의해 투여되는, 용도.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 0.01 내지 0.1㎖/눈의 용량으로 투여되는, 용도.
  55. 제54항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 0.045 내지 0.055㎖/눈의 용량으로 투여되는, 용도.
  56. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노-연관 바이러스는 적어도 1.5×109 vg/눈의 용량으로 투여되고; 바람직하게는, 상기 아데노-연관 바이러스는 적어도 3.0×109 vg/눈의 용량으로 투여되는, 용도.
  57. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노-연관 바이러스는 적어도 4.5×109 vg/눈의 용량으로 투여되는, 용도.
  58. 제50항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 코르티코스테로이드를 환자에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 용도.
  59. 제58항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 프레드니손 또는 메틸프레드니솔론을 포함하는, 용도.
  60. 제59항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 프레드니손인, 용도.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 상기 약제학적 조성물의 투여 약 2일 전에 시작해서 투여되는, 용도.
  62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 경구 투여되는, 용도.
  63. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 투여를 시작한 후 약 28일 동안 연속 투여되는, 용도.
  64. 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 상기 투여를 시작한 후 매일 투여되고, 매주 연속 투여된 후에 감소되는 용량으로 투여되는, 용도.
  65. 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코르티코스테로이드는 투여 시작 시 1주 동안 매일 40㎎, 이어서, 1주 동안 매일 30㎎, 이어서, 1주 동안 매일 20㎎ 및 마지막에 1주 동안 매일 10㎎의 투약량으로 투여되는, 용도.
  66. 제50항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 크레아틴 인산나트륨을 상기 환자에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 용도.
  67. 제66항에 있어서, 상기 크레아틴 인산나트륨은 정맥내 주사에 의해 투여되는, 용도.
  68. 제50항 내지 제67항에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 상기 투여는 상기 재조합 핵산이 없는 약제학적 조성물의 투여에 비해서 더 높은 평균 시력 회복 수준을 초래하는, 용도.
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