CN116024266A - 用于治疗由于nd4突变造成的莱伯氏遗传性视神经病变的组合物和方法 - Google Patents
用于治疗由于nd4突变造成的莱伯氏遗传性视神经病变的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明实施例之一提供了用于治疗由于ND4突变造成的莱伯氏遗传性视神经病变的组合物和方法。提供了重组核酸,其包含:线粒体靶向序列;线粒体蛋白编码序列,其中所述线粒体蛋白编码序列编码包含线粒体蛋白的多肽;3’UTR核酸序列;和聚腺苷酸尾序列。还提供了包含所述重组核酸的药物组合物以及使用所述药物组合物治疗莱伯氏遗传性视神经病变(LHON)的方法。
Description
优先权信息
本申请要求于2021年8月6日提交的申请号为202110899561.X的中国申请的优先权,其全部内容通过引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及一种编码线粒体蛋白的重组核酸及其相关的药物组合物,以及用其治疗眼科疾病(如莱伯氏遗传性视神经病变)的用途。
背景技术
莱伯氏遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy,LHON)是一种线粒体遗传(由母亲传给后代)的视网膜神经节细胞(RGC)及其轴突变性,其导致急性或亚急性中心视力丧失;这主要影响年轻的成年男性。LHON仅通过母亲传播,因为其主要是由于线粒体(而不是细胞核)基因组中的突变所致,并且仅卵子将线粒体贡献给胚胎。LHON通常是由于三种致病性线粒体DNA(mtDNA)点突变之一所致。这些突变分别在线粒体中的氧化磷酸化链的复合体I的NADH脱氢酶亚基-4蛋白(ND4)、NADH脱氢酶亚基-1蛋白(ND1)和NADH脱氢酶亚基-6蛋白(ND6)亚基基因中的核苷酸位置11778G至A(G11778A)、3460G至A(G3460A)和14484T至C(T14484C)处。每种突变都被认为有永久性视力丧失的重大风险。其通常在数周至数月内进展而没有疼痛,直到双眼视力恶化至0.1以下,这严重影响到患者的生活质量。两种LHON突变体G3460A和T14484C导致患者血小板分离的线粒体NADH脱氢酶活性降低80%。百分之九十的中国LHON患者携带G11778A突变。G11778A突变将ND4蛋白中的精氨酸变成组氨酸,导致LHON患者的功能障碍和视神经损伤。有必要开发转染效率和治疗功效更高的治疗LHON的组合物和方法。
发明内容
本文公开了一种重组核酸,包含(由5’端至3’端依次排列)线粒体靶向序列和线粒体蛋白编码序列;可选地,所述线粒体编码蛋白编码ND4蛋白;可选地,所述ND4蛋白包含与SEQ ID NO:160至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述的重组核酸包含与SEQ ID NO:180和174-176所示的任一条序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。在一些实施方案中,所述的重组核酸包含与SEQ ID NO:180至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。在一些实施方案中,所述的重组核酸包含SEQ ID NO:180所示的序列。
在一些实施方案中,所述的重组核酸包括Kozak序列,所述Kozak序列置于所述线粒体靶向序列的5’端前;可选地,所述Kozak序列为SEQ ID NO:171;可选地,所述Kozak序列与所述线粒体靶向序列之间无多余的核苷酸。
在一些实施方案中,所述的重组核酸包括内含子序列;可选地,所述内含子序列置于所述线粒体靶向序列的5’端前;可选地,所述内含子序列置于所述Kozak序列的5’端前;可选地,所述内含子序列包含与SEQ ID NO:170所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
在一些实施方案中,所述的重组核酸包括启动子序列;可选地,所述启动子序列置于所述线粒体靶向序列、所述Kozak序列、和/或所述内含子序列的5’端前;可选地,所述启动子序列包含与SEQ ID NO:169所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
在一些实施方案中,所述的重组核酸包括3’UTR序列;可选地,所述3’UTR序列置于所述线粒体蛋白编码序列的3’端后;可选地,所述3’UTR序列包含与SEQ ID NO:13所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
在一些实施方案中,所述的重组核酸包括聚腺苷酸尾序列;可选地,所述聚腺苷酸尾序列置于所述线粒体蛋白编码序列和/或所述3’UTR序列的3’端后;可选地,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ ID NO:172或173所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列;可选地,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ IDNO:173所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
在一些实施方案中,所述3’UTR序列和所述聚腺苷酸尾序列之间包含与SEQ IDNO:185所示的间隔序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%相同的序列。
在一些实施方案中,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:1所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
在一些实施方案中,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
在一些实施方案中,所述的重组核酸包括第一末端反向重复(ITR)序列和第二ITR序列。在一些实施方案中,所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO:178所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。在一些实施方案中,所述第二ITR序列包含与SEQ ID NO:179所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
本文公开了一种重组核酸,包含(由5’端至3’端依次排列):线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列、聚腺苷酸尾序列;其中,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ IDNO:173所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
在一些实施方案中,所述3’UTR序列包含与SEQ ID NO:13所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
在一些实施方案中,由所述重组核酸转录产生的包含所述线粒体蛋白编码序列的mRNA的表达量比缺乏所述聚腺苷酸尾序列的对照重组核酸的mRNA的表达量高;优选地,比所述对照重组核酸的mRNA的表达量高至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少150%、至少200%、或至少300%。在一些实施方案中,所述对照重组核酸在所述聚腺苷酸尾序列的位置上由包含SEQ ID NO:172的序列取代;优选地,所述重组核酸转录产生的mRNA的表达量比所述对照重组核酸产生的mRNA的表达量高至少10%、至少15%、或至少20%。
在一些实施方案中,由所述重组核酸翻译产生的所述线粒体蛋白的表达量比缺乏所述聚腺苷酸尾序列的对照重组核酸的所述线粒体蛋白的表达量高;优选地,比所述对照重组核酸的所述线粒体蛋白的表达量高至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少150%、至少200%、或至少300%。在一些实施方案中,所述对照重组核酸在所述聚腺苷酸尾序列的位置上由包含SEQ ID NO:172的序列取代;优选地,所述重组核酸翻译产生的所述线粒体蛋白的表达量比所述对照重组核酸产生的所述线粒体蛋白的表达量高至少10%、至少15%、或至少20%。
在一些实施方案中,所述聚腺苷酸尾序列的长度不多于122个碱基对、不多于125个碱基对、不多于130个碱基对、不多于140个碱基对、不多于150个碱基对、不多于160个碱基对、不多于170个碱基对、不多于180个碱基对、不多于190个碱基对、或不多于200个碱基对。
在一些实施方案中,所述的重组核酸包括Kozak序列,所述Kozak序列置于所述线粒体靶向序列的5’端前;可选地,所述Kozak序列为SEQ ID NO:171;可选地,所述Kozak序列与所述线粒体靶向序列之间无多余的核苷酸。
在一些实施方案中,所述3’UTR序列和所述聚腺苷酸尾序列之间包含与SEQ IDNO:185所示的间隔序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%相同的序列。
本文公开了一种重组核酸,包括(由5’端至3’端依次排列):Kozak序列、线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列,其特征在于:所述Kozak序列为SEQ ID NO:171;所述3’UTR序列包含与SEQ ID NO:13所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列;所述Kozak序列与所述线粒体靶向序列之间无多余的核苷酸。
在一些实施方案中,所述的重组核酸包括聚腺苷酸尾序列,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ ID NO:172或173所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
在一些实施方案中,所述的重组核酸包括内含子序列;可选地,所述内含子序列置于所述Kozak序列的5’端前;可选地,所述内含子序列包含与SEQ ID NO:170所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
在一些实施方案中,所述的重组核酸包括启动子序列;可选地,所述启动子序列包含与SEQ ID NO:169所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。在一些实施方案中,所述启动子序列置于所述内含子序列的5’端前。
本文公开了一种重组核酸,包括(由5’端至3’端依次排列):启动子序列、内含子序列、Kozak序列、线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列;所述内含子序列包含与SEQ ID NO:170所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列;可选的,所述序列还包括3’UTR序列;可选的,所述序列还包括聚腺苷酸尾序列。
在一些实施方案中,所述的重组核酸还包括第一末端反向重复(ITR)序列和第二ITR序列。在一些实施方案中,所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO:178所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。在一些实施方案中,所述第二ITR序列包含与SEQ ID NO:179所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
在一些实施方案中,所述线粒体蛋白编码序列与所述3’UTR序列之间无多余的核苷酸。
在一些实施方案中,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:1所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
在一些实施方案中,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
在一些实施方案中,所述线粒体靶向序列与所述线粒体蛋白编码序列之间无多余的核苷酸。
在一些实施方案中,所述的重组核酸包含(由5’端至3’端依次排列):第一ITR序列、启动子序列、内含子序列、Kozak序列、线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列、聚腺苷酸尾序列,第二ITR序列;优选地,所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO:178所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述启动子序列包含与SEQ ID NO:169所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述内含子序列包含与SEQ ID NO:170所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述Kozak序列为SEQ ID NO:171,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:1所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述3’UTR序列包含与SEQ ID NO:13所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ ID NO:173所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述第二ITR序列包含与SEQ ID NO:179所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
在一些实施方案中,所述的重组核酸包含(由5’端至3’端依次排列):第一ITR序列、启动子序列、内含子序列、Kozak序列、线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列、聚腺苷酸尾序列,第二ITR序列;优选地,所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO:178所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述启动子序列包含与SEQ ID NO:169所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述内含子序列包含与SEQ ID NO:170所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述Kozak序列为SEQ ID NO:171,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:1所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述3’UTR序列包含与SEQ ID NO:13所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ ID NO:173所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述第二ITR序列包含与SEQ ID NO:179所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列。
在一些实施方案中,所述的重组核酸包含(由5’端至3’端依次排列):第一ITR序列、启动子序列、内含子序列、Kozak序列、线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列、聚腺苷酸尾序列、第二ITR序列;优选地,所述第一ITR序列包含SEQ ID NO:178所示的序列,所述启动子序列包含SEQ ID NO:169所示的序列,所述内含子序列包含SEQ ID NO:170所示的序列,所述Kozak序列为SEQ ID NO:171,所述线粒体靶向序列包含SEQ ID NO:1所示的序列,所述线粒体蛋白编码序列包含SEQ ID NO:6所示的序列,所述3’UTR序列包含SEQID NO:13所示的序列,所述聚腺苷酸尾序列包含SEQ ID NO:173所示的序列,所述第二ITR序列包含SEQ ID NO:179所示的序列。
在一些实施方案中,所述的重组核酸包含与SEQ ID NO:174-176、180所示的任一条序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。在一些实施方案中,所述的重组核酸包含与SEQ ID NO:180至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。在一些实施方案中,所述的重组核酸包含SEQ ID NO:180的序列。
本文公开了一种病毒载体,其包含本文所述的一种重组核酸。在一些实施方案中,所述病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。在一些实施方案中,所述rAAV载体是rAAV2载体。
本文公开了一种药物组合物,其包含本文所述的一种重组核酸。本文公开了一种药物组合物,其包含本文所述的一种病毒载体。本文公开了一种药物组合物,其包含本文所述的一种重组腺相关病毒(rAAV)载体。
本文公开了一种药物组合物,其包含本文所述的一种病毒。在一些实施方案中,所述的病毒是一种腺相关病毒(AAV)。在一些实施方案中,所述病毒包含本文所述的一种重组核酸。
在一些实施方案中,所述的药物组合物,其进一步包含其药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中,所述药学上可接受的赋形剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)、α,α-海藻糖脱水物、L-组氨酸盐酸盐一水合物、聚山梨酯20、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4、泊洛沙姆188或其任意组合。在一些实施方案中,所述药学上可接受的赋形剂选自于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、α,α-海藻糖脱水物、L-组氨酸盐酸盐一水合物、聚山梨酯20、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4、泊洛沙姆188或其任意组合。在一些实施方案中,所述药学上可接受的赋形剂包括泊洛沙姆188。在一些实施方案中,所述药学上可接受的赋形剂包含0.0001%-0.01%泊洛沙姆188。在一些实施方案中,所述药学上可接受的赋形剂包含0.001%泊洛沙姆188。在一些实施方案中,所述药学上可接受的赋形剂还包含一种或多种盐。在一些实施方案中,所述一种或多种盐包括NaCl、Na2HPO4和KH2PO4。在一些实施方案中,所述药物组合物的特征在于,a)所述NaCl的浓度为5-15mg/mL;优选的,所述NaCl的浓度为9mg/mL;b)所述KH2PO4的浓度为0.1-0.5mg/mL;优选的,所述KH2PO4的浓度为0.144mg/mL;和/或c)所述Na2HPO4的浓度为0.5-1mg/mL;优选的,所述Na2HPO4的浓度为0.795mg/mL。在一些实施方案中,所述药物组合物的pH为7.2-7.4。在一些实施方案中,所述药物组合物的pH为7.3。
在一些实施方案中,所述药物组合物的病毒滴度为至少1.0×1010vg/mL、至少3.0×1010vg/mL、至少6.0×1010vg/mL。在一些实施方案中,所述药物组合物的病毒滴度为至少9.0×1010vg/mL。
在一些实施方案中,当所述药物组合物经过五个冷冻/解冻循环后,与所述五个冷冻/解冻循环之前的病毒效价相比,所述药物组合物保留了至少60%的病毒滴度。
本文公开了一种根据本文所述的药物组合物在制备用于治疗眼部疾病的药物中的用途。
本文公开了一种治疗眼部疾病的方法,包含向患者施用有效剂量的根据本文所述的药物组合物。
在一些实施方案中,所述眼部疾病是莱伯氏遗传性视神经病变(LHON)。在一些实施方案中,通过眼内或玻璃体内注射来施用所述药物组合物。在一些实施方案中,所述药物组合物通过玻璃体内注射给药。在一些实施方案中,在每个眼中施用0.01-0.1mL的所述药物组合物。在一些实施方案中,在每个眼中施用0.045-0.055mL的所述药物组合物。在一些实施方案中,在每个眼中施用至少1.5×109vg剂量的腺相关病毒;优选地,施用至少3.0×109vg剂量的腺相关病毒。在一些实施方案中,在每个眼中施用至少4.5×109vg剂量的腺相关病毒。
在一些实施方案中,所述的用途或方法包括对患者施用皮质类固醇。在一些实施方案中,所述皮质类固醇包含泼尼松或甲基泼尼松。在一些实施方案中,所述皮质类固醇为泼尼松。在一些实施方案中,在施用所述药物组合物之前大约2天开始施用所述皮质类固醇。在一些实施方案中,口服所述皮质类固醇。在一些实施方案中,在开始施用所述皮质类固醇后,持续施用大约28天。在一些实施方案中,在开始施用所述类固醇后,每天施用,并且每次持续一周施用后减少施用剂量。在一些实施方案中,所述皮质类固醇的用量为:在开始施用时,每日给药40mg,持续一周,然后每日给药30mg,持续一周,然后每日给药20mg,持续一周,然后每日给药10mg,持续一周。
在一些实施方案中,所述的用途或方法包括对患者施用磷酸肌酸钠。在一些实施方案中,所述磷酸肌酸钠是通过静脉注射给药的。在一些实施方案中,与没有施用含有所述重组核酸的药物组合物相比,施用所述药物组合物产生更高的平均视力恢复水平。
另一方面,本文公开了用于治疗LHON的重组核酸、药物组合物和方法。
一方面,本文公开了一种重组核酸,其包含:线粒体靶向序列;线粒体蛋白编码序列,其包含与选自由SEQ ID NO:7、8、10和12组成的组的序列具有至少99%同一性的序列;和3’UTR核酸序列。
在一些情况下,所述线粒体靶向序列编码多肽,所述多肽包含与选自由SEQ IDNO:129-159组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的肽序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:2中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:3中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:4中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:5中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
在一些情况下,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:7或8中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:10中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ IDNO:12中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
在一些情况下,所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:111-125组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述3’UTR核酸序列包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
在一些情况下,所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:17-20、23-24、27-28、31-34、37-38、41-42、45-48、51-52、55-56、59-62、65-66、69-70、73-76、79-80和83-84组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
另一方面,本文公开了一种重组核酸,其包含:线粒体靶向序列,其包含与选自由SEQ ID NO:2、3、4和5组成的组的序列具有至少90%同一性的序列;线粒体蛋白编码序列,其中所述线粒体蛋白编码序列编码包含线粒体蛋白的多肽;和3’UTR核酸序列。
在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:2中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:3中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:4中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:5中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
在一些情况下,所述线粒体蛋白选自由以下组成的组:NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。在一些情况下,所述线粒体蛋白包括NADH脱氢酶4(ND4)或其变体。在一些情况下,所述线粒体蛋白包含与SEQ ID NO:160中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的肽序列。在一些情况下,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6、7或8中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体蛋白包括NADH脱氢酶6(ND6)或其变体。在一些情况下,所述线粒体蛋白包含与SEQ ID NO:161中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:9或10中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体蛋白包括NADH脱氢酶1(ND1)或其变体。在一些情况下,所述线粒体蛋白包含与SEQ ID NO:162中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:11或12中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
在一些情况下,所述3’UTR核酸序列位于所述线粒体靶向序列的3’。在一些情况下,所述3’UTR核酸序列包含选自由以下组成的组的序列:hsACO2、hsATP5B、hsAK2、hsALDH2、hsCOX10、hsUQCRFS1、hsNDUFV1、hsNDUFV2、hsSOD2、hsCOX6c、hsIRP1、hsMRPS12、hsATP5J2、rnSOD2和hsOXA1L。在一些情况下,所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:111-125组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述3’UTR核酸序列包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
在一些情况下,所述线粒体靶向序列位于所述3’UTR核酸序列的5’。在一些情况下,所述线粒体靶向序列位于所述线粒体靶向序列的3’。
在一些情况下,所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:29-84组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
另一方面,本文公开了一种重组核酸,其包含:线粒体靶向序列;线粒体蛋白编码序列,其包含与选自由SEQ ID NO:7、8、10和12组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列;和3’UTR核酸序列。
在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含编码选自由以下组成的组的多肽的序列:hsCOX10、hsCOX8、scRPM2、lcSirt5、tbNDUS7、ncQCR2、hsATP5G2、hsLACTB、spilv1、gmCOX2、crATP6、hsOPA1、hsSDHD、hsADCK3、osP0644B06.24-2、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)ATP9(ncATP9)、hsGHITM、hsNDUFAB1、hsATP5G3、crATP6_hsADCK3、ncATP9_ncATP9、zmLOC100282174、ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_ncATP9、zmLOC100282174_hsADCK3_crATP6_hsATP5G3、zmLOC100282174_hsADCK3_hsATP5G3、ncATP9_zmLOC100282174、hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6_hsATP5G3、crATP6_hsADCK3_zmLOC100282174_hsATP5G3、hsADCK3_zmLOC100282174、hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6、ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_GNFP_ncATP9和ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_lcSirt5_osP0644B06.24-2_hsATP5G2_ncATP9。在一些情况下,所述线粒体靶向序列编码多肽,所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:129-159组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的肽序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQID NO:2或3中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:4中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:5中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
在一些情况下,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:7或8中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:10中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ IDNO:12中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
在一些情况下,所述3’UTR核酸序列位于所述线粒体靶向序列的3’。在一些情况下,所述3’UTR核酸序列包含选自由以下组成的组的序列:hsACO2、hsATP5B、hsAK2、hsALDH2、hsCOX10、hsUQCRFS1、hsNDUFV1、hsNDUFV2、hsSOD2、hsCOX6c、hsIRP1、hsMRPS12、hsATP5J2、rnSOD2和hsOXA1L。在一些情况下,所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:111-125组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述3’UTR核酸序列包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
在一些情况下,所述线粒体靶向序列位于所述3’UTR核酸序列的5’。在一些情况下,所述线粒体靶向序列位于所述线粒体靶向序列的3’。
在一些情况下,所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:17-20、23-24、27-28、31-34、37-38、41-42、45-48、51-52、55-56、59-62、65-66、69-70、73-76、79-80和83-84组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
另一方面,本文公开了一种重组核酸,其包含与选自由SEQ ID NO:2、3和4组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的线粒体靶向序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:2中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:3中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:4中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
在一些情况下,所述重组核酸进一步包含线粒体蛋白编码序列,其中所述线粒体蛋白编码序列编码包含线粒体蛋白的多肽。在一些情况下,所述线粒体蛋白选自由以下组成的组:NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。在一些情况下,所述线粒体蛋白包括NADH脱氢酶4(ND4)或其变体。在一些情况下,所述线粒体蛋白包含与SEQ ID NO:160中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的肽序列。在一些情况下,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6、7或8中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体蛋白包括NADH脱氢酶6(ND6)或其变体。在一些情况下,所述线粒体蛋白包含与SEQ ID NO:161中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:9或10中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体蛋白包括NADH脱氢酶1(ND1)或其变体。在一些情况下,所述线粒体蛋白包含与SEQ IDNO:162中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:11或12中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
在一些情况下,所述重组核酸进一步包含3’UTR核酸序列。在一些情况下,所述3’UTR核酸序列位于所述线粒体靶向序列的3’。在一些情况下,所述3’UTR核酸序列包含选自由以下组成的组的序列:hsACO2、hsATP5B、hsAK2、hsALDH2、hsCOX10、hsUQCRFS1、hsNDUFV1、hsNDUFV2、hsSOD2、hsCOX6c、hsIRP1、hsMRPS12、hsATP5J2、rnSOD2和hsOXA1L。在一些情况下,所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:111-125组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述3’UTR核酸序列包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列位于所述3’UTR核酸序列的5’。在一些情况下,所述线粒体靶向序列位于所述线粒体靶向序列的3’。
在一些情况下,所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:29-70组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
另一方面,本文公开了一种重组核酸,其包含线粒体蛋白编码序列,其中所述线粒体蛋白编码序列编码包含线粒体蛋白的多肽,其中所述线粒体蛋白编码序列包含与选自由SEQ ID NO:7、8、10和12组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
在一些情况下,所述重组核酸进一步包含线粒体靶向序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含编码选自由以下组成的组的多肽的序列:hsCOX10、hsCOX8、scRPM2、lcSirt5、tbNDUS7、ncQCR2、hsATP5G2、hsLACTB、spilv1、gmCOX2、crATP6、hsOPA1、hsSDHD、hsADCK3、osP0644B06.24-2、粗糙脉孢菌ATP9(ncATP9)、hsGHITM、hsNDUFAB1、hsATP5G3、crATP6_hsADCK3、ncATP9_ncATP9、zmLOC100282174、ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_ncATP9、zmLOC100282174_hsADCK3_crATP6_hsATP5G3、zmLOC100282174_hsADCK3_hsATP5G3、ncATP9_zmLOC100282174、hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6_hsATP5G3、crATP6_hsADCK3_zmLOC100282174_hsATP5G3、hsADCK3_zmLOC100282174、hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6、ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_GNFP_ncATP9和ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_lcSirt5_osP0644B06.24-2_hsATP5G2_ncATP9。在一些情况下,所述线粒体靶向序列编码多肽,所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:129-159组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的肽序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:2中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:3中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:4中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列包含与SEQID NO:5中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
在一些情况下,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:7或8中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:10中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ IDNO:12中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
在一些情况下,所述重组核酸进一步包含3’UTR核酸序列。在一些情况下,所述3’UTR核酸序列位于所述线粒体靶向序列的3’。在一些情况下,所述3’UTR核酸序列包含选自由以下组成的组的序列:hsACO2、hsATP5B、hsAK2、hsALDH2、hsCOX10、hsUQCRFS1、hsNDUFV1、hsNDUFV2、hsSOD2、hsCOX6c、hsIRP1、hsMRPS12、hsATP5J2、rnSOD2和hsOXA1L。在一些情况下,所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:111-125组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述3’UTR核酸序列包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些情况下,所述线粒体靶向序列位于所述3’UTR核酸序列的5’。在一些情况下,所述线粒体靶向序列位于所述线粒体靶向序列的3’。
在一些情况下,所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:17-20、23-24、27-28、31-34、37-38、41-42、45-48、51-52、55-56、59-62、65-66、69-70、73-76、79-80和83-84组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
另一方面,本文公开了包含本文公开的重组核酸的病毒载体。在一些情况下,所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些情况下,所述AAV载体选自由以下组成的组:AAV1载体、AAV2载体、AAV3载体、AAV4载体、AAV5载体、AAV6载体、AAV7载体、AAV8载体、AAV9载体、AAV10载体、AAV11载体、AAV12载体、AAV13载体、AAV14载体、AAV15载体和AAV16载体。在一些情况下,所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体。在一些情况下,所述rAAV载体是rAAV2载体。
另一方面,本文公开了治疗眼部病症的方法,其包括向有需要的患者施用本文公开的任何药物组合物。在一些情况下,所述眼部病症是莱伯氏遗传性视神经病变(LHON)。在一些情况下,所述方法包括向所述患者的单眼或双眼施用所述药物组合物。在一些情况下,经由眼内注射或玻璃体内注射施用所述药物组合物。在一些情况下,经由玻璃体内注射施用所述药物组合物。在一些情况下,经由玻璃体内注射施用约0.01-0.1mL的所述药物组合物。在一些情况下,经由玻璃体内注射施用约0.05mL的所述药物组合物。
在一些情况下,所述方法进一步包括向所述患者施用甲泼尼龙。在一些情况下,在所述药物组合物的玻璃体内注射之前施用甲泼尼龙。在一些情况下,口服施用甲泼尼龙。在一些情况下,在所述药物组合物的玻璃体内注射之前每日施用甲泼尼龙持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一些情况下,每日施用甲泼尼龙。在一些情况下,施用约32mg/60kg的甲泼尼龙的日剂量。在一些情况下,在所述药物组合物的玻璃体内注射后施用甲泼尼龙。在一些情况下,所述方法进一步包括向所述患者施用磷酸肌酸钠。在一些情况下,静脉内施用磷酸肌酸钠。在一些情况下,静脉内或口服施用甲泼尼龙。在一些情况下,所述方法包括静脉内施用甲泼尼龙持续至少一天,接着口服施用甲泼尼龙持续至少一周。在一些情况下,所述方法包括静脉内施用甲泼尼龙持续约3天,接着口服施用甲泼尼龙持续至少约6周。在一些情况下,以约80mg/60kg的日剂量静脉内施用甲泼尼龙。在一些情况下,施用所述药物组合物比没有所述重组核酸的相当的药物组合物产生更高的平均视力恢复。在一些情况下,施用所述药物组合物比包含SEQ ID NO:15中列出的重组核酸的相当的药物组合物产生更高的平均视力恢复。
在一些实施方案中,本公开提供了治疗眼部病症的方法,其包括向有需要的患者施用(a)包含腺相关病毒(AAV)的第一药物组合物,所述腺相关病毒包含重组核酸,所述重组核酸包含:(i)编码线粒体靶向肽的核酸序列;(ii)编码线粒体蛋白的核酸序列,所述核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:6-12组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的核酸序列;和(iii)3’UTR核酸序列;以及(b)包含类固醇的第二药物组合物。
在一些实施方案中,编码所述线粒体蛋白的所述核酸序列编码多肽,所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:160-162组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,编码线粒体靶向肽的核酸序列编码多肽,所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:126-159组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,编码线粒体靶向肽的核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:1-5组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的核酸序列。在一些实施方案中,所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:13、14和111-125组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的核酸序列(nucleic sequence)。
在一些实施方案中,本公开提供了治疗眼部病症的方法,其包括向有需要的患者施用(a)包含腺相关病毒(AAV)的第一药物组合物,所述腺相关病毒包含重组核酸,所述重组核酸包含:(i)编码线粒体靶向肽的核酸序列,所述线粒体靶向肽包含与选自由SEQ IDNO:126-159组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列(amino sequence);(ii)编码线粒体蛋白的核酸序列;和(iii)3’UTR核酸序列;以及(b)包含类固醇的第二药物组合物。
在一些实施方案中,所述线粒体蛋白选自由以下组成的组:NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。在一些实施方案中,编码线粒体蛋白的核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:6-12组成的组的核酸序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的核酸序列。在一些实施方案中,编码线粒体蛋白的核酸序列编码多肽,所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:160-162组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,编码线粒体靶向肽的核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:1-5组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的核酸序列。在一些实施方案中,所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:13、14和111-125组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
在一些实施方案中,本公开提供了治疗眼部病症的方法,包括向有需要的患者施用(a)包含腺相关病毒(AAV)的第一药物组合物,所述腺相关病毒包含重组核酸,所述重组核酸包含:(i)编码线粒体靶向肽的核酸序列,所述线粒体靶向肽包含与选自由SEQ ID NO:126-159组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列;(ii)编码线粒体蛋白的核酸序列,所述核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:6-12组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的核酸序列;和(iii)与选自由SEQ ID NO:13、14和111-125组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的3’UTR核酸序列;以及(b)包含类固醇的第二药物组合物。
在一些实施方案中,本公开提供了治疗眼部病症的方法,其包括向有需要的患者施用(a)包含腺相关病毒(AAV)的第一药物组合物,所述腺相关病毒包含重组核酸,所述重组核酸包含:(i)编码线粒体靶向肽的核酸序列;和(ii)编码线粒体蛋白的核酸序列;以及(b)包含类固醇的第二药物组合物。在一些实施方案中,所述线粒体蛋白选自由以下组成的组:NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。在一些实施方案中,所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:13、14和111-125组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的核酸序列。
在一些实施方案中,所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:15-84组成的组的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。在一些实施方案中,所述重组核酸包含与SEQ ID NO:15具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一性的序列。
在一些实施方案中,经由眼内注射或玻璃体内注射施用所述第一药物组合物。在一些实施方案中,经由玻璃体内注射施用约0.01-0.1mL的所述第一药物组合物。在一些实施方案中,经由玻璃体内注射施用约0.05mL的所述第一药物组合物。在一些实施方案中,向所述患者的单眼或双眼施用所述第一药物组合物。
在一些实施方案中,所述类固醇选自由以下组成的组:二丙酸阿氯米松、安西奈德、二丙酸倍氯米松、倍他米松、苯甲酸倍他米松、二丙酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、倍他米松磷酸钠和醋酸钠、戊酸倍他米松、丙酸氯倍他索、新戊酸氯可托龙、皮质醇(氢化可的松)、醋酸皮质醇(氢化可的松)、丁酸皮质醇(氢化可的松)、环戊丙酸皮质醇(氢化可的松)、皮质醇(氢化可的松)磷酸钠、皮质醇(氢化可的松)琥珀酸钠、戊酸皮质醇(氢化可的松)、醋酸可的松、地奈德、去氧米松、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、二醋酸二氟拉松、醋酸氟氢可的松、氟尼缩松、醋酸肤轻松、氟轻松醋酸酯、氟米龙、氟氢缩松、哈西奈德、甲羟松、甲泼尼龙、醋酸甲泼尼龙、甲泼尼龙琥珀酸钠、糠酸莫米松、醋酸帕拉米松、泼尼松龙、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠、丁乙酸泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙、曲安奈德、二醋酸曲安西龙和己曲安奈德或其合成类似物。
在一些实施方案中,所述类固醇是糖皮质激素。在一些实施方案中,所述糖皮质激素是甲泼尼龙或泼尼松。
在一些实施方案中,甲泼尼龙被配制为片剂或用于静脉内施用的液体。在一些实施方案中,口服或静脉内施用所述类固醇。
在一些实施方案中,在施用所述第一药物组合物之前施用所述类固醇。在一些实施方案中,在施用所述第一药物组合物之前每日施用所述类固醇持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一些实施方案中,所述类固醇是甲泼尼龙,并且以约30mg/60kg至约40mg/60kg或约30mg至约40mg的日剂量施用。在一些实施方案中,甲泼尼龙的日剂量为约32mg/60kg或32mg。在一些实施方案中,所述类固醇是泼尼松,并且以约50mg/60kg至约70mg/60kg的日剂量施用。在一些实施方案中,泼尼松的日剂量为约60mg/60kg。
在一些实施方案中,在施用所述第一药物组合物后施用所述类固醇。在一些实施方案中,在施用所述第一药物组合物后每日施用所述类固醇持续至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少13周、至少14周或至少15周。
在一些实施方案中,所述类固醇是甲泼尼龙,并且以介于约70mg/60kg与90mg/60kg之间或介于约70mg与90mg之间的日剂量施用。在一些实施方案中,甲泼尼龙的日剂量为约80mg/60kg或80mg。在一些实施方案中,在施用所述第一药物组合物后施用甲泼尼龙持续至少两天。在一些实施方案中,在施用所述第一药物组合物后每日施用甲泼尼龙的后续剂量持续至少7周,并且其中甲泼尼龙的剂量逐周减少。
在一些实施方案中,所述类固醇是泼尼松,并且以介于约50mg/60kg与70mg/60kg之间或介于约50mg与约70mg之间的日剂量施用。在一些实施方案中,泼尼松的日剂量为约60mg/60kg或约60mg。在一些实施方案中,在施用所述第一药物组合物后施用泼尼松持续至少七天。在一些实施方案中,其中七天后,以介于约30mg/60kg与约50mg/60kg之间或介于约30mg与50mg之间的日剂量施用泼尼松。在一些实施方案中,泼尼松的日剂量为约40mg/60kg或40mg。在一些实施方案中,每日施用泼尼松的后续剂量持续至少4天,并且其中泼尼松的剂量逐日减少。
在一些实施方案中,在施用所述第一药物化合物之前和之后施用所述类固醇。
在一些实施方案中,所述类固醇是甲泼尼龙,并且在施用所述第一药物化合物之前每日施用持续至少七天,并且在施用所述第一药物化合物后每日施用持续至少7周。在一些实施方案中,在施用所述第一药物化合物之前以约32mg/60kg或32mg的日剂量施用甲泼尼龙。在一些实施方案中,在施用所述第一药物化合物后以约80mg/60kg或80mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少2天。在一些实施方案中,在施用所述第一药物化合物后三天开始,以约40mg/60kg或40mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少4天。在一些实施方案中,在施用所述第一药物化合物后一周开始,以约32mg/60kg或32mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。在一些实施方案中,在施用所述第一药物化合物后两周开始,以约24mg/60kg或24mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。在一些实施方案中,在施用所述第一药物化合物后三周开始,以约16mg/60kg或16mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。在一些实施方案中,在施用所述第一药物化合物后四周开始,以约8mg/60kg或8mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。在一些实施方案中,在施用所述第一药物化合物后五周开始,以约6mg/60kg或6mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。在一些实施方案中,在施用所述第一药物化合物后六周开始,以约4mg/60kg或4mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。
在一些实施方案中,所述类固醇是泼尼松,并且在施用所述第一药物化合物之前每日施用持续至少两天,并且在施用所述第一药物化合物后每日施用持续至少十一天。在一些实施方案中,在施用所述第一药物化合物之前以约60mg/60kg或60mg的日剂量施用泼尼松。在一些实施方案中,在施用所述第一药物化合物后以约60mg/60kg或60mg的日剂量施用泼尼松持续至少七天。在一些实施方案中,在施用所述第一药物化合物后八天,以约40mg/60kg或40mg的日剂量施用泼尼松持续至少一天。在一些实施方案中,在施用所述第一药物化合物后九天,以约20mg/60kg或20mg的日剂量施用泼尼松持续至少一天。在一些实施方案中,在施用所述第一药物化合物后十天,以约10mg/60kg或10mg的日剂量施用泼尼松持续至少一天。
在一些实施方案中,所述方法进一步包括向所述患者施用磷酸肌酸钠。在一些实施方案中,在施用所述第一药物组合物之前和/或之后静脉内施用磷酸肌酸钠。
在一些实施方案中,施用所述第一药物组合物和第二药物组合物比在没有所述第二药物组合物情况下施用的相当的药物组合物产生更高的平均视力恢复。在一些实施方案中,施用所述第一药物组合物和第二药物组合物比在没有所述第二药物组合物情况下施用的相当的药物组合物产生更低的不良事件发生率。在一些实施方案中,所述不良事件选自前房炎症、玻璃体炎、高眼压、白内障摘除、角膜炎、玻璃体出血、过敏性结膜炎和眼痛。在一些实施方案中,在患有所述眼部病症的患者群体中确定所述更高的平均视力恢复和所述更低的不良事件发生率。在一些实施方案中,所述患者群体是种族匹配的。在一些实施方案中,所述患者群体是中国人或阿根廷人。
在一些实施方案中,所述眼部病症是莱伯氏遗传性视神经病变(LHON)。在一些实施方案中,所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AA8、AAV9和AAV10。在一些实施方案中,所述AAV是AAV2。
在一些实施方案中,本公开提供了筛选治疗眼部病症的患者的方法,所述方法包括:(a)获得来自患者的血清样品;(b)在所述血清样品存在下将靶细胞群与包含腺相关病毒(AAV)的组合物一起培养,所述腺相关病毒包含编码可检测标记的重组核酸;并且(c)在所述培养后检测所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平,其中如果所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平高于预定阈值,则选择所述患者进行所述治疗。
在一些实施方案中,本公开提供了筛选治疗眼部病症的患者的方法,所述方法包括:(a)在来自患者的血清样品存在下将靶细胞群与包含腺相关病毒(AAV)的组合物一起培养,所述腺相关病毒包含编码可检测标记的重组核酸;并且(b)在所述培养后检测所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平,其中如果所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平高于预定阈值,则选择所述患者进行所述治疗。
在一些实施方案中,本公开提供了治疗有需要的患者的眼部病症的方法,其包括:(a)获得来自患者的血清样品;(b)在所述血清样品存在下将靶细胞群与包含第一腺相关病毒(AAV)的组合物一起培养,所述第一腺相关病毒包含编码可检测标记的第一重组核酸;(c)检测所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平;并且(d)向所述患者施用包含第二AAV的药物组合物,所述第二AAV包含第二重组核酸,其中所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平高于预定阈值。
在一些实施方案中,本公开提供了治疗有需要的患者的眼部病症的方法,其包括:(a)在来自患者的血清样品存在下将靶细胞群与包含第一腺相关病毒(AAV)的组合物一起培养,所述第一腺相关病毒包含编码可检测标记的第一重组核酸;(b)检测所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平;并且(c)向所述患者施用包含第二AAV的药物组合物,所述第二AAV包含第二重组核酸,其中所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平高于预定阈值。
在一些实施方案中,所述可检测标记是荧光蛋白。在一些实施方案中,所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。在一些实施方案中,通过流式细胞术或qPCR检测所述可检测标记。在一些实施方案中,所述培养步骤为至少12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更长。
在一些实施方案中,当通过流式细胞术检测时,所述预定阈值是表达所述可检测标记的细胞的约40%。在一些实施方案中,当通过qPCR检测时,所述预定阈值是约0.6的所述可检测标记的相对表达水平。在一些实施方案中,所述靶细胞是HEK-293T细胞。
在一些实施方案中,所述治疗是包含编码线粒体蛋白的核酸序列的重组AAV。在一些实施方案中,所述线粒体蛋白选自由以下组成的组:NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。在一些实施方案中,所述患者包含选自以下的突变:ND4基因中的G11778A、ND1基因中的G3460A和ND6基因中的T14484C。
在一些实施方案中,本公开提供了一种试剂盒,其包含:包含编码可检测标记的重组核酸的腺相关病毒(AAV)、靶细胞群和一种或多种用于检测所述可检测标记的试剂。在一些实施方案中,所述试剂盒进一步包含用于用所述AAV转染所述靶细胞群的转染试剂。在一些实施方案中,所述试剂盒进一步包含第二AAV,所述第二AAV包含编码线粒体蛋白的重组核酸。在一些实施方案中,用于检测可检测标记的一种或多种试剂选自与所述可检测标记结合的抗体和一种或多种对编码所述可检测标记的所述重组核酸具有特异性的引物寡核苷酸。
附图说明
在所附权利要求中特别列出了本发明的新颖特征。通过参考以下列举说明性实施方案(其中利用了本发明的原理)的详细描述及附图将会更好地理解本发明的特征和优点,其中:
图1显示pAAV-CMV-ND4-3’Flag-COX10UTR-SV40载体图谱。
图2显示pAAV-CMV-ND4-3’Flag-COX10UTR-bGH载体图谱。
图3显示pAAV-CMV-ND4-3’Flag-COX10UTR载体图谱。
图4显示质粒在HEK293细胞中的表达效率-mRNA。
图5显示2-8℃处方稳定性实验结果。
图6显示处方稳定性冻融实验结果。
图7显示ND4表达组件的设计。
图8显示第一示例性类固醇给药方案。
图9显示第二示例性类固醇给药方案。
具体实施方式
定义
除另有定义外,本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然在实施或测试本文的制剂或单位剂量时可以使用与本文所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料,但现在要对一些方法和材料进行描述。除另有说明外,本文所采用或考虑的技术是标准方法。所述材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
除非上下文明确另有规定,否则在本文和所附权利要求书中所用的单数形式“一个(种)”、“和”以及“该(所述)”包括复数个指代项。因此,例如提到“化合物”包括多种这类剂,并且提到“所述盐”包括提到一种或多种盐(或提到多种盐)及其本领域技术人员已知的等同物,等等。
如本文所用,除另指出外,术语“或”可以是连接词或反意连接词。如本文所用,除另指出外,任何实施方案可与任何其它实施方案组合。
如本文所用,除另指出外,本文的一些发明实施方案考虑了数值范围。当存在范围时,所述范围包括范围端点。另外,所述范围内的每个子范围和值如同明确写出一样存在。
术语“约”及其与参考数值相关的语法对等词以及其如本文所用的语法对等词可包括值的范围加上或减去该值的10%,如值的范围加上或减去该值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。例如,量“约10”包括9至11的量。
术语“包含”(及相关术语如“包含”或“具有”或“包括”)并不旨在排除在其它某些实施方案(例如本文所述的任何物质组成、组合物、方法或过程等的实施方案)中可“由所描述的特征组成”或“基本上由所描述的特征组成”。
术语“受试者”是指已经或将成为治疗、观察或实验的对象的哺乳动物。术语“哺乳动物”旨在具有其标准含义,并且涵盖例如人、狗、猫、绵羊和母牛。本文所述的方法可用于人的治疗和兽医应用。在一些实施方案中,受试者是人。
术语“治疗”涵盖将至少一种本文公开的化合物或其药学上可接受的盐施用给需要这种施用的哺乳动物受试者,特别是人受试者,并且包括(i)遏制疾病如癌症的临床症状的发展,(ii)使疾病如癌症的临床症状消退,和/或(iii)防止疾病如癌症发作的预防性治疗。
本文所述的化学实体的术语“治疗有效量”是指当向人或非人受试者施用时有效提供治疗益处的量,所述治疗益处如改善症状、减缓疾病进展或预防疾病。
如本文所用,除另指出外,术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。
如本文所用,除另指出外,X mg/60kg的药物剂量是指每60kg患者体重使用X mg的药物。例如,100mg/60kg的药物剂量意指要求体重60kg的患者服用100mg药物,并且相应地,要求体重30kg的另一患者服用50mg药物。
如本文所用,除另指出外,术语“可操作地连接”表示两个或更多个序列之间的功能性连接。例如,目的多核苷酸与调节序列(例如启动子)之间的可操作连接是允许表达目的多核苷酸的功能性连接。在这个意义上,术语“可操作地连接”是指调节区和待转录编码序列的定位,使得调节区对于调节目的编码序列的转录或翻译是有效的。在本文公开的一些实施方式中,术语“可操作地连接”表示这样的构型,其中调节序列相对于编码多肽或功能性RNA的序列置于适当的位置,使得控制序列指导或调节编码多肽的mRNA、多肽和/或功能性RNA的表达或细胞定位,如果它可以介导核酸序列的转录,则启动子与核酸序列可操作地连接。可操作连接的元件可以是连续的或非连续的。用于将两个或更多个DNA序列可操作地连接在一起的基本技术对于本领域普通技术人员来说是熟悉的,并且这些方法已在许多书中描述用于标准分子生物学操作(参见例如Maniatis等人,“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY)。
核酸和多肽序列
在本文的一个方面,提供了一种重组核酸,包含选自以下序列的一个或多个序列:第一ITR序列、启动子序列、内含子序列、Kozak序列、线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列、聚腺苷酸尾序列、和第二ITR序列。在一些实施方案中,所述的重组核酸包含所有这些序列。在一些实施方案中,所述的重组核酸包含(由5’端至3’端依次排列):第一ITR序列、启动子序列、内含子序列、Kozak序列、线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列、聚腺苷酸尾序列、第二ITR序列。在一些实施方案中,所述的各个序列相互可操作地连接。在一些实施方案中,所述的各个调控序列与线粒体蛋白编码序列可操作地连接。
表1为本文公开的核酸和多肽序列。第一列显示每个序列的SEQ ID NO。第二列描述核酸或多肽构建体。例如,构建体COX10-ND4-3’UTR(SEQ ID NO:15)是结合COX10(SEQ IDNO:1)、ND4(SEQ ID NO:6)和3’UTR(SEQ ID NO:13)的核酸序列的核酸。
表1:核酸和多肽序列及SEQ ID NO
腺相关病毒(AAV)
腺相关病毒(AAV)是感染人和一些其他灵长类物种的小型病毒。本文公开的组合物首先包含腺相关病毒(AAV)基因组或其衍生物。
AAV基因组是编码产生AAV病毒颗粒所需的功能的多核苷酸序列。这些功能包括AAV在宿主细胞中复制和包装循环中运行的功能,包括将AAV基因组衣壳化到AAV病毒颗粒中。天然存在的AAV病毒是复制缺陷型的,并且依靠反式提供辅助功能来完成复制和包装循环。因此,本发明的载体的AAV基因组通常是复制缺陷型的。
AAV基因组可以呈正义或负义的单链形式,或者呈双链形式。双链形式的使用允许绕过靶细胞中的DNA复制步骤,从而可加速转基因表达。
AAV基因组可来自AAV的任何天然来源的血清型或分离株或分化枝(Glade)。因此,AAV基因组可以是天然存在的AAV病毒的全基因组。如技术人员所知,自然界中存在的AAV病毒可根据各种生物学体系进行分类。
通常,提到AAV病毒是依照其血清型。血清型对应于AAV的变体亚种,这种变体亚种由于其衣壳表面抗原的表达谱原因而具有独特的反应性,这可用于将其与其它变体亚种区分开。通常,具有特定AAV血清型的病毒不与对任何其它AAV血清型具有特异性的中和抗体有效地发生交叉反应。AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16,以及近来从灵长类动物脑中鉴定的重组血清型,如Rec2和Rec3。
用于本发明的优选AAV血清型是AAV2。用于本发明所特别关注的其它血清型包括AAV4、AAV5和AAV8,它们有效地转导眼睛中的组织,如视网膜色素上皮细胞。使用的AAV的血清型可以为不是AAV4的AAV血清型。关于AAV血清型的综述可见于Choi等人(Curr GeneTher.2005;5(3);299-310)和Wu等人(Molecular Therapy.2006;14(3),316-327)。用于本发明的AAV基因组或AAV基因组的元件的序列(包括ITR序列、rep或cap基因)可来源于AAV整个基因组序列的以下登录号:腺相关病毒1NC_002077,AF063497;腺相关病毒2NC_001401;腺相关病毒3NC_001729;腺相关病毒3B NC_001863;腺相关病毒4NC_001829;腺相关病毒5Y18065、AF085716;腺相关病毒6NC_001862;鸟AAV ATCC VR-865AY186198、AY629583、NC_004828;鸟AAV毒株DA-1NC_006263、AY629583;牛AAV NC_005889、AY388617。
提到AAV病毒也可以是依照分化枝或克隆。这是指天然来源的AAV病毒的系统发生关系,并且通常是指AAV病毒的系统发生组,其可追溯至共同的祖先,并包括其所有的后代。另外,提到AAV病毒可以是依照特定的分离株,即自然界中所见的特定AAV病毒的遗传分离株。术语遗传分离株描述经历了与其它天然存在的AAV病毒的有限遗传混合的AAV病毒群,从而在遗传水平上定义了可识别的不同群体。
可用于本发明的AAV的分化枝和分离株的实例包括:分化枝A:AAV1 NC_002077、AF063497、AAV6 NC_001862、Hu.48AY530611、Hu 43AY530606、Hu 44AY530607、Hu46AY530609;分化枝B:Hu.19AY530584、Hu.20AY530586、Hu 23AY530589、Hu22 AY530588、Hu24 AY530590、Hu21 AY530587、Hu27 AY530592、Hu28 AY530593、Hu 29AY530594、Hu63AY530624、Hu64 AY530625、Hu13 AY530578、Hu56 AY530618、Hu57 AY530619、Hu49AY530612、Hu58 AY530620、Hu34 AY530598、Hu35 AY530599、AAV2 NC_001401、Hu45AY530608、Hu47 AY530610、Hu51 AY530613、Hu52 AY530614、Hu T41 AY695378、Hu S17AY695376、Hu T88 AY695375、Hu T71 AY695374、Hu T70 AY695373、Hu T40 AY695372、HuT32AY695371、Hu T17 AY695370、Hu LG15 AY695377;分化枝C:Hu9 AY530629、Hu10AY530576、Hu11AY530577、Hu53 AY530615、Hu55 AY530617、Hu54 AY530616、Hu7 AY530628、Hu18 AY530583、Hu15AY530580、Hu16 AY530581、Hu25 AY530591、Hu60 AY530622、Ch5AY243021、Hu3 AY530595、Hu1AY530575、Hu4 AY530602Hu2、AY530585、Hu61 AY530623;分化枝D:Rh62 AY530573、Rh48 AY530561、Rh54 AY530567、Rh55 AY530568、Cy2 AY243020、AAV7AF513851、Rh35 AY243000、Rh37 AY242998、Rh36 AY242999、Cy6 AY243016、Cy4 AY243018、Cy3 AY243019、Cy5 AY243017、Rh13 AY243013;分化枝E:Rh38 AY530558、Hu66 AY530626、Hu42 AY530605、Hu67 AY530627、Hu40 AY530603、Hu41 AY530604、Hu37 AY530600、Rh40AY530559、Rh2 AY243007、Bb1 AY243023、Bb2 AY243022、Rh10 AY243015、Hu17AY530582、Hu6 AY530621、Rh25 AY530557、Pi2 AY530554、Pi1 AY530553、Pi3 AY530555、Rh57AY530569、Rh50 AY530563、Rh49 AY530562、Hu39 AY530601、Rh58 AY530570、Rh61AY530572、Rh52 AY530565、Rh53 AY530566、Rh51 AY530564、Rh64 AY530574、Rh43AY530560、AAV8 AF513852、Rh8 AY242997、Rh1 AY530556;分化枝F:Hu14(AAV9)AY530579、Hu31 AY530596、Hu32 AY530597、克隆分离株AAV5Y18065、AF085716、AAV 3NC_001729、AAV3B NC_001863、AAV4 NC_001829、Rh34 AY243001、Rh33AY243002、Rh32 AY243003。
技术人员可基于他们的公知常识选择用于本发明的AAV的适当的血清型、分化枝、克隆或分离株。例如,已显示AAV5衣壳有效地转导灵长类动物视锥光感受器,如通过成功纠正遗传的色觉缺陷所证实(Mancuso等人,Nature 2009,461:784-7)。
然而应当理解的是,本发明还涵盖使用可能尚未鉴定或表征的其它血清型的AAV基因组。AAV血清型决定AAV病毒感染的组织特异性(或向性)。因此,用于根据本发明向患者施用的AAV病毒的优选AAV血清型是在LHON中对眼睛内的靶细胞有天然向性或高感染效率的血清型。因此,用于向患者施用的AAV病毒的AAV血清型可以是感染神经感觉视网膜和视网膜色素上皮细胞的血清型。
通常,AAV的天然来源的血清型或分离株或分化枝的AAV基因组包含至少一个末端反向重复序列(ITR)。ITR序列顺式作用以提供复制的功能性起点,并允许从细胞的基因组中整合及切除载体。可选择的ITR序列可以衍生自任何一种AAV血清型,例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16,以及近来从灵长类(primate)动物脑中鉴定的重组血清型如Rec2和Rec3,非灵长类(non-primate)AAV、禽类(avian)AAV、牛(bovine)AAV,犬(canine)AAV、马(equine)AAV、绵羊(ovine)AAV等。优选的ITR序列是AAV2及其变体的那些。
在优选的实施方案中,一个或多个ITR序列侧接编码ND4或其变体的多核苷酸序列。
AAV基因组通常还包含编码AAV病毒颗粒的包装功能的包装基因,如rep和/或cap基因。rep基因编码蛋白质Rep78、Rep68、Rep52和Rep40或其变体中的一者或多者。cap基因编码一种或多种衣壳蛋白,如VP1、VP2和VP3或其变体。这些蛋白质组成AAV病毒颗粒的衣壳。衣壳变体在下面讨论。
启动子将与包装基因中的每一者可操作地连接。这类启动子的具体实例包括p5、p19和p40启动子(Laughlin等人,1979,PNAS,76:5567-5571)。例如,p5和p19启动子通常用于表达rep基因,而p40启动子通常用于表达cap基因。
如上面所讨论,用于本发明的载体的AAV基因组因此可以是天然存在的AAV病毒的全基因组。例如,包含全AAV基因组的载体可用于在体外制备AAV病毒。然而,虽然原则上可以向患者施用这种载体,但在实践中将很少这样做。优选地,出于对患者施用的目的,AAV基因组将被衍生化。这种衍生化是本领域中的标准,并且本发明涵盖使用AAV基因组的任何已知衍生物以及可通过应用本领域中已知的技术产生的衍生物。Coura和Nardi(VirologyJournal,2007,4:99)以及Choi等人和Wu等人在上面引用的参考文献中对AAV基因组和AAV衣壳的衍生化进行了综述。
AAV基因组的衍生物包括AAV基因组的任何截短或修饰形式,其允许从本发明的载体在体内表达ND4转基因。通常,有可能将AAV基因组显著截短以使其包括最小病毒序列,但保留上述功能。出于安全原因,这是优选的,来降低载体与野生型病毒重组的风险,并且也避免由于靶细胞中存在病毒基因蛋白而引发细胞免疫反应。
通常,衍生物将包括至少一个末端反向重复序列(ITR),优选多于一个ITR,如两个或更多个ITR。一个或多个ITR可来源于具有不同血清型的AAV基因组,或者可以是嵌合或突变ITR。优选的突变ITR是具有trs(末端解链位点(terminal resolution site))缺失的突变ITR。这种缺失允许持续复制基因组以产生含有编码序列和互补序列两者的单链基因组,即自互补AAV基因组。这允许在靶细胞中绕过DNA复制,从而能够加速转基因表达。
一个或多个ITR将优选在任一端侧接编码ND4、ND6、ND1或其变体的多核苷酸序列。优选包含一个或多个ITR以协助本发明的载体在宿主细胞的细胞核中形成多联体,例如在通过宿主细胞DNA聚合酶的作用将单链载体DNA转化成双链DNA之后。这类游离基因多联体的形成在宿主细胞的生命期间保护载体构建体,从而延长了转基因在体内的表达。
在优选的实施方案中,ITR元件将是原AAV基因组保留在衍生物中的仅有序列。因此,衍生物将优选不包括原基因组的rep和/或cap基因以及原基因组的任何其它序列。出于上述原因,也是为了降低载体整合到宿主细胞基因组中的可能性,这是优选的。另外,减小AAV基因组的大小允许增加除了转基因之外还在载体内掺入其它序列元件(如调控元件)的灵活性。
因此,关于AAV2基因组,可以在本发明的衍生物中去除以下部分:一个末端反向重复(ITR)序列、复制(rep)和衣壳(cap)基因(NB:不应将野生型AAV基因组中的rep基因与在LHON中受影响的人基因ND4相混淆)。然而,在包括体外实施方案在内的一些实施方案中,衍生物可另外包括一个或多个rep和/或cap基因或AAV基因组的其它病毒序列。天然存在的AAV病毒在人染色体19上的特异性位点以高频率整合,并显示出可忽略的随机整合频率,使得在治疗环境中可以容忍载体中的整合能力的保留。
在衍生基因组包含编码衣壳蛋白即VP1、VP2和/或VP3的基因的情况下,衍生物可以是一种或多种天然存在的AAV病毒的嵌合、改组或衣壳修饰的衍生物。特别地,本发明涵盖在同一载体内提供来自AAV的不同血清型、分化枝、克隆或分离株的衣壳蛋白序列,即假型化。
通常将选择嵌合、改组或衣壳修饰的衍生物,以为病毒载体提供一种或多种所需的功能。因此,与包含天然存在的AAV基因组如AAV2基因组的AAV病毒载体相比,这些衍生物可显示出基因递送效率提高、免疫原性(体液或细胞)降低、向性范围改变和/或特定细胞类型的靶向改善。基因递送效率的提高可通过以下方式来实现:改善在细胞表面的受体或共受体结合、改善内化、改善在细胞内和进入细胞核的转运、改善病毒颗粒的脱壳和提高单链基因组向双链形式的转化率。效率的提高也可能与向性范围改变或特定细胞群的靶向有关,使得载体剂量不会由施用给不需要其的组织而被稀释。
嵌合衣壳蛋白包括通过天然存在的AAV血清型的两个或更多个衣壳编码序列之间的重组产生的那些。这可例如通过标志补救方法来进行,其中一种血清型的非感染衣壳序列与不同血清型的衣壳序列共转染,并采用定向选择来选择具有所需特性的衣壳序列。可通过细胞内的同源重组来改变不同血清型的衣壳序列,以产生新型嵌合衣壳蛋白。
嵌合衣壳蛋白还包括通过对衣壳蛋白序列进行工程改造以在两种或更多种衣壳蛋白之间(例如在不同血清型的两种或更多种衣壳蛋白之间)转移特定的衣壳蛋白结构域、表面环或特定的氨基酸残基而产生的那些。
也可通过DNA改组或通过易错PCR产生改组或嵌合衣壳蛋白。可通过如下方式来产生杂合AAV衣壳基因,即随机片段化相关AAV基因的序列(例如编码多种不同血清型的衣壳蛋白的序列),然后在自引发聚合酶反应中后续重新装配片段,这也可能在序列同源性的区域中导致交叉。可筛选以这种方式通过改组若干血清型的衣壳基因而产生的杂合AAV基因的文库,以鉴定具有所需功能的病毒克隆。类似地,易错PCR可用于使AAV衣壳基因随机突变,以产生变体的多样文库,然后可针对所需特性对其进行选择。
也可以对衣壳基因的序列进行遗传修饰,以相对于天然野生型序列引入特定的缺失、取代或插入。特别地,可通过在衣壳编码序列的开放阅读框内或者在衣壳编码序列的N和/或C末端插入无关蛋白或肽的序列来修饰衣壳基因。
无关蛋白或肽可有利地为充当特定细胞类型的配体的蛋白或肽,从而改善与靶细胞的结合,或提高载体靶向特定细胞群的特异性。一个实例可包括使用RGD肽来阻止视网膜色素上皮细胞中的摄取,从而增强周围视网膜组织的转导(Cronin等人,2008ARVO文摘:D1048)。无关蛋白也可以是有助于作为生产过程的一部分的病毒颗粒的纯化的蛋白质,即表位或亲和标签。通常选择插入的位点,以便不干扰病毒颗粒的其它功能,例如病毒颗粒的内化、转运。技术人员可基于他们的公知常识来鉴定合适的插入位点。Choi等人在上面引用的参考文献中公开了特定的位点。
本发明另外涵盖以与天然AAV基因组不同的顺序和构型提供AAV基因组的序列。本发明还涵盖用来自另一种病毒的序列或用由来自一种以上病毒的序列组成的嵌合基因来替换一个或多个AAV序列或基因。这类嵌合基因可由来自不同病毒种类的两种或更多种相关病毒蛋白的序列组成。
本发明的载体采取包含AAV基因组或其衍生物和编码ND4、ND6、ND1或其变体的序列的多核苷酸序列的形式。
为了避免疑义,本发明还提供包含本发明的载体的AAV病毒颗粒。本发明的AAV颗粒包括反式衣壳化形式,其中具有一种血清型的ITR的AAV基因组或衍生物被包装在不同血清型的衣壳中。本发明的AAV颗粒还包括镶嵌形式,其中来自两种或更多种不同血清型的未修饰衣壳蛋白的混合物构成病毒包膜。AAV颗粒还包括带有吸附至衣壳表面的配体的化学修饰形式。例如,这类配体可包括用于靶向特定细胞表面受体的抗体。
本发明另外提供包含本发明的载体或AAV病毒颗粒的宿主细胞。
重组核酸序列
本文还公开了包含编码NADH脱氢酶亚基-4(ND4)、NADH脱氢酶亚基-1(ND1)和NADH脱氢酶亚基-6(ND6)多肽或其变体的多核苷酸序列的重组核酸序列。
ND4的多核苷酸序列示于SEQ ID NO:6,并且编码SEQ ID NO:160所示的蛋白质。ND4进一步的核酸序列为SEQ ID NO:7和8。
SEQ ID NO:160的变体可包括其截短物、突变体或同源物及其编码功能性ND4多肽的任何转录变体。本文提到的任何同源物通常与ND4的相关区域至少70%同一性,并且可以在功能上补偿多肽不足。
可采用已知的方法来测量同源性/同一性。例如UWGCG软件包提供了可用于计算同源性的BESTFIT程序(例如按其默认设置使用)(Devereux等人(1984)Nucleic AcidsResearch 12,387-395)。PILEUP和BLAST算法可用于计算同源性或排列序列(通常按其默认设置),例如如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300;Altschul,S,F等人(1990)JMol Biol 215:403-10中所述。可通过美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得用于进行BLAST分析的软件。
在优选的实施方案中,重组核酸序列可编码如下多肽,所述多肽在至少20个(优选至少30个,例如至少40个、60个、100个、200个、300个、400个或更多个连续氨基酸)上或者甚至在所述重组核酸的整个序列上与ND4蛋白质的相关区域(SEQ ID NO:160)至少55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%且更优选至少95%、97%、99%、99.5%或100%相同。相关区域将是提供ND4的功能活性的区域。
或者,且优选地,重组核酸序列可编码如下多肽,所述多肽在其整个序列上与全长ND4(SEQ ID NO:160)至少70%、75%、80%、85%、90%并且更优选至少95%、97%、99%、99.5%或100%相同。通常重组核酸序列与ND4(SEQ ID NO:160)的相关区域相差至少或少于2个、5个、10个、20个、40个、50个或60个突变(其每个可以是取代、插入或缺失)。
重组核酸ND4多肽可与SEQ ID NO:160的特定区域具有一定的同一性百分比,其与跨越上述序列的任何长度的任何具体百分比同一性值相同(即其可具有至少70%、80%或90%且更优选至少95%、97%、99%同一性)。
ND4(SEQ ID NO:160)的变体还包括截短物。可以使用任何截短物,只要变体仍然是功能性的即可。通常将使截短物去除对于蛋白质活性是非必需的和/或不影响折叠蛋白质的构象(特别是活性位点的折叠)的序列。常规上可通过从N或C末端系统性截短不同长度的序列来鉴定适当的截短物。优选的截短物是N末端的,并且可去除除催化结构域以外的所有其它序列。
ND4(SEQ ID NO:160)的变体进一步包括相对于ND4(SEQ ID NO:160)的特定区域具有一个或多个(例如2个、3个、4个、5至10个、10至20个、20至40个或更多个氨基酸插入、取代或缺失)的突变体。如下所述优选在催化结构域以外进行缺失和插入。还通常在对于蛋白酶活性是非必需的和/或不影响折叠蛋白质的构象的区域中进行取代。
取代优选引入一个或多个将氨基酸用化学结构类似、化学性质类似或侧链体积类似的其它氨基酸替换的保守性改变。引入的氨基酸可具有与它们替换的氨基酸类似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。或者,保守性改变可引入另一种芳族或脂族的氨基酸代替预先存在的芳族或脂族氨基酸。保守性氨基酸改变是本领域中熟知的,并且可根据氨基酸的性质进行选择。
类似地,ND4多核苷酸序列(SEQ ID NO:6)的优选变体包括与ND4(SEQ ID NO:6)的相关区域具有至少70%、75%、80%、85%、90%且更优选至少95%、96%、97%、98%、99%或99.5%同一性的多核苷酸。优选该变体在其整个序列上显示出与全长ND4(SEQ ID NO:6)的这些水平的同一性。
线粒体靶向序列(MTS)和3‘非翻译区(3’UTR)可用于将蛋白质或mRNA靶向至线粒体。MTS的电荷、长度和结构对于将蛋白质输入线粒体很重要。特定的3'UTR可能驱动mRNA定位到线粒体表面,从而促进共翻译蛋白进入线粒体。
线粒体靶向序列的多核苷酸序列可编码选自以下的多肽:hsCOX10、hsCOX8、scRPM2、lcSirt5、tbNDUS7、ncQCR2、hsATP5G2、hsLACTB、spilv1、gmCOX2、crATP6、hsOPA1、hsSDHD、hsADCK3、osP0644B06.24-2、粗糙脉孢菌ATP9(ncATP9)、hsGHITM、hsNDUFAB1、hsATP5G3、crATP6_hsADCK3、ncATP9_ncATP9、zmLOC100282174、ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_ncATP9、zmLOC100282174_hsADCK3_crATP6_hsATP5G3、zmLOC100282174_hsADCK3_hsATP5G3、ncATP9_zmLOC100282174、hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6_hsATP5G3、crATP6_hsADCK3_zmLOC100282174_hsATP5G3、hsADCK3_zmLOC100282174、hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6、ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_GNFP_ncATP9和ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_lcSirt5_osP0644B06.24-2_hsATP5G2_ncATP9(关于SEQ ID NO,参见表1)。在一个实例中,多核苷酸序列COX10(SEQ ID NO:1、2或3)可编码线粒体靶向序列MTS-COX10(SEQ ID NO:126)。在另一实例中,多核苷酸序列COX8(SEQ ID NO:4)可编码线粒体靶向序列MTS-COX8(SEQ ID NO:127)。在另一实例中,多核苷酸序列OPA1(SEQ ID NO:5)可编码线粒体靶向序列MTS-OPA1(SEQ ID NO:128)。
3’UTR核酸序列可选自hsACO2(SEQ ID NO:111)、hsATP5B(SEQ ID NO:112)、hsAK2(SEQ ID NO:113)、hsALDH2(SEQ ID NO:114)、hsCOX10(SEQ ID NO:115)、hsUQCRFS1(SEQID NO:116)、hsNDUFV1(SEQ ID NO:117)、hsNDUFV2(SEQ ID NO:118)、hsSOD2(SEQ ID NO:119)、hsCOX6c(SEQ ID NO:120)、hsIRP1(SEQ ID NO:121)、hsMRPS12(SEQ ID NO:122)、hsATP5J2(SEQ ID NO:123)、rnSOD2(SEQ ID NO:124)和hsOXA1L(SEQ ID NO:125)。3’UTR核酸序列也可以是与这里列出的任何3’UTR核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%且更优选至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%同一性的变体。例如,3’UTR核酸序列可以是SEQ ID NO:13或14。
本文还公开了包含线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列和3’UTR核酸序列的重组核酸序列。例如,重组核酸序列可选自SEQ ID NO:15-84。重组核酸序列也可以是与这里列出的任何重组核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%且更优选至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%同一性的变体。
启动子和调控序列
本发明的载体还包括允许在体外或体内表达所公开的转基因的元件。因此,载体通常包含与编码转基因或其变体的多核苷酸序列可操作地连接的启动子序列。
可以使用任何合适的启动子。启动子序列可以是组成型活性的,即可以在任何宿主细胞背景中操作,或者可仅在特定宿主细胞环境中具有活性,从而允许在特定细胞类型中靶向表达转基因。启动子可响应于另一种因子(例如宿主细胞中存在的因子)而显示诱导型表达。无论如何,在施用载体进行治疗的情况下,启动子必须在视网膜细胞背景中具有功能。
在一些实施方案中,为了允许转基因仅在视网膜细胞群中表达,优选启动子显示视网膜细胞特异性表达。因此,来自启动子的表达可以是视网膜细胞特异性的,例如仅局限于神经感觉视网膜和视网膜色素上皮的细胞。
ND4转基因的优选启动子包括任选与巨细胞病毒(CME)增强子元件组合的鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些情况下,ND4转基因的优选启动子包括CAG启动子。特别优选的启动子是杂合CBA/CAG启动子,例如用于rAVE表达盒的启动子。可诱导视网膜特异性基因表达的基于人序列的启动子的实例包括视杆细胞和视锥细胞的视紫红质激酶(Allocca等人,2007,J Viol 81:11372-80)、仅视锥细胞的PR2.1(Mancuso等人,2009,Nature)和/或视网膜色素上皮细胞的RPE65(Bainbridge等人,2008,N Eng J Med)。
在一些实施方案中,启动子包含与SEQ ID NO:169所示的序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%相同的序列。在一些实施方案中,启动子包含与SEQ ID NO:169所示的序列至多1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个核苷酸差别的序列。在一些实施方案中,启动子的序列为SEQ ID NO:169。
本发明的载体还可以包含一个或多个可在转录前或转录后起作用的另外的调控序列。调控序列可以是天然ND4基因座的一部分,或者可以是异源调控序列。本发明的载体可包含来自天然ND4转录物的5′UTR或3′UTR的若干部分。
调控序列是促进转基因的表达的任何序列,即起到增加转录物的表达、改善mRNA的细胞核输出或增强其稳定性的作用。这类调控序列包括例如增强子元件、调控后元件和聚腺苷酸化位点。在本发明的载体背景下,这类调控序列将是顺式作用的。然而,本发明也涵盖使用位于另外的遗传构建体上的反式作用调控序列。
用于本发明的载体的优选调控后元件是土拨鼠肝炎调控后元件(WPRE)或其变体。可用于本发明的载体的另一调控序列是支架附着区(SAR)。
内含子
内含子(Intron)又称间隔顺序,指一个基因或mRNA分子中无编码作用的片段,是真核生物细胞DNA中的间插序列。这些序列被转录在前体RNA中,经过剪接被去除,最终不存在于成熟RNA分子中。
在一些实施方案中,本发明的重组核酸包含内含子。在一些实施方案中,所述内含子位于启动子和Kozak序列之间。在一些实施方案中,所述内含子位于启动子和线粒体靶向序列之间。在一些实施方案中,所述内含子位于启动子和线粒体蛋白编码序列之间。
在一些实施方案中,内含子包含与SEQ ID NO:170所示的序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%相同的序列。在一些实施方案中,内含子包含与SEQ ID NO:170所示的序列至多1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个核苷酸差别的序列。在一些实施方案中,内含子的序列为SEQ ID NO:170。
Kozak序列
kozak序列(Kozak consensus sequence)存在于真核生物mRNA中。核糖体能够识别mRNA上的这段序列,并把它作为翻译起始位点。
在一些实施方案中,本发明的重组核酸包含kozak序列。在一些实施方案中,所述kozak序列为SEQ ID NO:171。在一些实施方案中,所述kozak序列与SEQ ID NO:171有至多1,2,或3个核苷酸差别。
在本领域内的一些技术描述中,kozak序列是SEQ ID NO:171结合其3’端紧接的四核苷酸长度的翻译起始序列,结合后的全序列为GCCACCATGG(SEQ ID NO:177),其中倒数第四至第二核苷酸为起始密码子ATG。因此本领域的专业人员能够理解,当kozak序列和编码序列连接时(例如Kozak序列置于线粒体靶向序列之前时),在编码序列之前加上的Kozak序列不含该四核苷酸长度的翻译起始序列。
聚腺苷酸尾
聚腺苷酸尾(polyA)通常位于基因编码区域的下游,起到终止转录的作用。在一些实施方案中,所述重组核酸含有聚腺苷酸尾。在一些实施方案中,聚腺苷酸尾有150-200个腺苷酸残基。
在一些实施方案中,所述重组核酸含有猴空泡病毒聚腺苷酸尾(SV40 polyA)。在一些实施方案中,猴空泡病毒聚腺苷酸尾包含与SEQ ID NO:173所示的序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%相同的序列。在一些实施方案中,猴空泡病毒聚腺苷酸尾与SEQ ID NO:173所示的序列至多1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个核苷酸差别的序列。在一些实施方案中,猴空泡病毒聚腺苷酸尾的序列为SEQ ID NO:173。
在一些实施方案中,所述重组核酸含有牛生长因子聚腺苷酸尾(bGH polyA)。在一些实施方案中,牛生长因子聚腺苷酸尾包含与SEQ ID NO:172所示的序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%相同的序列。在一些实施方案中,牛生长因子聚腺苷酸尾与SEQ ID NO:172所示的序列至多1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个核苷酸差别的序列。在一些实施方案中,牛生长因子聚腺苷酸尾的序列为SEQ ID NO:172。
在一些实施方案中,所述聚腺苷酸尾序列的长度不多于122个碱基对(basepair;bp)、不多于125个碱基对、不多于130个碱基对、不多于140个碱基对、不多于150个碱基对、不多于160个碱基对、不多于170个碱基对、不多于180个碱基对、不多于190个碱基对、不多于200个碱基对、不多于220个碱基对、不多于240个碱基对、不多于260个碱基对、不多于280个碱基对或不多于300个碱基对。
载体的制备
可通过本领域中已知的用于提供基因治疗的载体的标准方法来制备本发明的载体。因此,成熟的公共结构域转染、包装和纯化方法可用于制备合适的载体制剂。
如上面所讨论,除了编码ND4或其变体的多核苷酸序列之外,本发明的载体还可以包含天然存在的AAV病毒的全基因组。然而,通常将使用衍生化基因组,例如具有至少一个末端反向重复序列(ITR)但可能缺少任何AAV基因如rep或cap的衍生物。
在这类实施方案中,为了将衍生化基因组装配到AAV病毒颗粒中,提供AAV和/或辅助病毒功能的另外的遗传构建体将在宿主细胞中与衍生化基因组组合来提供。这些另外的构建体通常将含有编码结构性AAV衣壳蛋白即cap、VP1、VP2、VP3的基因和编码AAV生命周期所需的其它功能如rep的基因。在另外的构建体上提供的结构性衣壳蛋白的选择将决定包装的病毒载体的血清型。
用于本发明的特别优选的包装病毒载体包含AAV2的衍生化基因组与AAV5或AAV8衣壳蛋白组合。此包装病毒载体通常包含一个或多个AAV2 ITR。
如上所述,AAV病毒不具备复制能力,因此通常也将在一个或多个另外的构建体上提供辅助病毒功能,优选腺病毒辅助功能,以允许AAV复制。
所有上述另外的构建体可作为宿主细胞中的质粒或其它游离基因元件提供,或者可将一个或多个构建体整合到宿主细胞的基因组中。
在这些方面,本发明提供了产生本发明的载体的方法。所述方法包括在宿主细胞中提供包含腺相关病毒(AAV)基因组或其衍生物和编码ND4或其变体的多核苷酸序列的载体,并提供将载体复制和装配到AAV病毒颗粒中的方式。优选地,所述方法包括提供载体,所述载体包含AAV基因组的衍生物和编码ND4或其变体的多核苷酸序列以及一种或多种编码AAV和/或辅助病毒功能的另外的遗传构建体。通常,AAV基因组的衍生物包含至少一个ITR。任选地,所述方法进一步包括纯化装配的病毒颗粒的步骤。另外,所述方法可包括配制用于治疗用途的病毒颗粒的步骤。
治疗方法和医学用途
如上面所讨论,本发明人已经意外地证明,本发明的载体可用于解决LHON潜在的细胞功能障碍问题。特别地,他们已经表明,使用所述载体可纠正与LHON相关的缺陷。这提供了可以藉以治疗、遏制、减轻或预防疾病的变性过程的方式。
因此本发明提供了治疗或预防有需要的患者的LHON的方法,其包括通过直接视网膜注射、视网膜下注射或玻璃体内注射向患者施用治疗有效量的编码本文所述的线粒体蛋白的载体。在一些实施方案中,所述方法进一步包括在施用编码线粒体蛋白的载体之前、期间和/或之后施用类固醇。因此,从而治疗或预防患者的LHON。
适用于本发明方法的载体包括本文所述的载体、编码线粒体蛋白的相当的载体及其生物类似物。适用于根据本发明方法的编码线粒体蛋白的相当的载体包括本领域中描述的那些,例如Guy等人在Ophthalmology 2017;124:1621-1634中和Vignal等人在Ophthalmology 2018;6:945-947中描述的那些,上述文献中的每一者以引用的方式全文并入。生物类似物是生物产品,其与现有的FDA批准的参考产品(“参考产品”)高度类似,并且没有临床上有意义的差别。“高度类似的”产品是具有与参考产品类似的纯度、化学特性和生物活性的产品。然而,参考产品与提出的生物类似物产品的临床非活性组分之间的微小差别是可以接受的。例如,这些可包括稳定剂或缓冲剂与参考产品中使用的稳定剂或缓冲剂相比的微小差别,并且在生产过程期间预期会略有差别(即,可接受的产品内变化)。FDA会仔细评估提出的生物类似物产品与参考产品之间的任何差别,以确保生物类似物满足FDA的高批准标准。“无临床上有意义的差别”意指生物类似物产品与参考产品在安全性、纯度和效力(安全性和有效性)方面没有临床上有意义的差别,这通常是通过人体药代动力学(暴露)和药效动力学(反应)研究、临床免疫原性评估以及必要时另外的临床研究证实的。
在一些实施方案中,需要根据本文提供的方法治疗的患者具有一种或多种线粒体DNA(mtDNA)点突变。在一些实施方案中,患者在编码线粒体的氧化磷酸化链中的复合物I的蛋白质的基因中具有点突变。例如,患者可在编码NADH脱氢酶亚基-4蛋白(ND4)的MT-ND4基因(也称为ND4,NCBI基因ID:4538)中有一种或多种点突变。在一些实施方案中,患者在ND4基因中的核苷酸位置11778具有点突变。在一些实施方案中,点突变是ND4基因中的G11778A。在一些实施方案中,需要根据本文提供的方法治疗的患者具有ND4基因中的G11778A点突变,并且具有中国人和/或阿根廷人血统。
在一些实施方案中,需要根据本文提供的方法治疗的患者具有ND4基因中的G11778A点突变,并且具有阿根廷人血统。在一些实施方案中,需要根据本文提供的方法治疗的患者具有ND4基因中的G11778A点突变,并且具有中国人血统。
在相关方面,本发明提供了本发明的载体在通过直接视网膜注射、视网膜下注射或玻璃体内注射向患者施用所述载体来治疗或预防LHON的方法中的用途。另外,本发明提供了本发明的载体在制造用于通过直接视网膜注射、视网膜下注射或玻璃体内注射来治疗或预防LHON的药物中的用途。
在所有这些实施方案中,可以施用本发明的载体,以便预防LHON的一种或多种症状的发作。患者可以是无症状的。受试者可能易患所述疾病。所述方法或用途可包括鉴定受试者是否有发展LHON的风险或患有LHON的步骤。向这种受试者施用预防有效量的载体。预防有效量是防止疾病的一种或多种症状发作的量。
或者,一旦受试者已出现疾病的症状便可以施用载体,即以治愈现有的疾病症状。向这种受试者施用治疗有效量的拮抗剂。治疗有效量是有效改善疾病的一种或多种症状的量。这种量也可以遏制、减缓或逆转一些与LHON相关的周边视力丧失。这种量也可以遏制、减缓或逆转LHON的发作。
典型的单次剂量介于1010个基因组颗粒与1012个基因组颗粒之间,这取决于需要转导的剩余视网膜组织的量。基因组颗粒在本文中定义为含有可用序列特异性方法(如实时PCR)定量的单链DNA分子的AAV衣壳。该剂量可作为单次剂量提供,但对于对侧眼或者在载体由于无论何种原因(如手术并发症)而可能没有靶向正确的视网膜区域的情况下可重复。治疗优选为对每只眼睛的单次永久性治疗,但可以考虑重复注射,例如在未来的几年中和/或用不同的AAV血清型重复注射。
本发明还提供了监测患者的LHON的治疗或预防的方法,其包括在通过直接视网膜注射、视网膜下注射或玻璃体内注射施用本发明的AAV载体之后测量得自所述患者的视网膜细胞中的离体活性。这种方法可允许测定治疗的功效。
在一些实施方案中,本公开提供了治疗眼部病症(例如,LHON)的方法,其包括施用治疗有效量的本文所述的载体和类固醇。示例性类固醇包括但不限于二丙酸阿氯米松、安西奈德、二丙酸倍氯米松、倍他米松、苯甲酸倍他米松、二丙酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、倍他米松磷酸钠和醋酸钠、戊酸倍他米松、丙酸氯倍他索、新戊酸氯可托龙、皮质醇(氢化可的松)、醋酸皮质醇(氢化可的松)、丁酸皮质醇(氢化可的松)、环戊丙酸皮质醇(氢化可的松)、皮质醇(氢化可的松)磷酸钠、皮质醇(氢化可的松)琥珀酸钠、戊酸皮质醇(氢化可的松)、醋酸可的松、地奈德、去氧米松、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、二醋酸二氟拉松、醋酸氟氢可的松、氟尼缩松、醋酸肤轻松、氟轻松醋酸酯、氟米龙、氟氢缩松、哈西奈德、甲羟松、甲泼尼龙、醋酸甲泼尼龙、甲泼尼龙琥珀酸钠、糠酸莫米松、醋酸帕拉米松、泼尼松龙、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠、丁乙酸泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙、曲安奈德、二醋酸曲安西龙和己曲安奈德或其合成类似物或其组合。在一些实施方案中,所述类固醇是糖皮质激素。在一些实施方案中,所述类固醇选自泼尼松、甲泼尼龙和甲泼尼龙琥珀酸钠。
在一些实施方案中,所述类固醇是甲泼尼龙。在一些实施方案中,甲泼尼龙被配制为用于口服施用的片剂,例如片剂。例如,在一些实施方案中,甲泼尼龙与一种或多种非活性成分如硬脂酸钙、玉米淀粉、赤藓红钠、乳糖、矿物油、山梨酸、蔗糖或FD&C黄6号一起配制为片剂。在一些实施方案中,甲泼尼龙被配制为用于通过注射施用的液体,例如例如,在一些实施方案中,甲泼尼龙琥珀酸钠与一种或多种非活性成分如无水磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠或水合乳糖一起配制为液体,任选地与防腐剂如苄醇一起配制。在一些实施方案中,所述类固醇是或包括其一般形式。
在一些实施方案中,患者接受约1mg/60kg至约100mg/60kg、约1mg/60kg至约80mg/60kg、约1mg/60kg至约60mg/60kg、约1mg/60kg至约40mg/60kg、约1mg/60kg至约20mg/60kg、约20mg/60kg至约100mg/60kg、约20mg/60kg至约80mg/60kg、约20mg/60kg至约60mg/60kg、约20mg/60kg至约40mg/60kg、约40mg/60kg至约100mg/60kg、约40mg/60kg至约80mg/60kg、约40mg/60kg至约60mg/60kg、约60mg/60kg至约100mg/60kg、约60mg/60kg至约80mg/60kg或约80mg/60kg至约100mg/60kg之间的一种或多种类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约4mg/60kg、6mg/60kg、8mg/60kg、10mg/60kg、16mg/60kg、20mg/60kg、24mg/60kg、32mg/60kg、40mg/60kg、48mg/60kg、60mg/60kg或80mg/60kg的一种或多种类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约1mg至约96mg的一种或多种类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受至少约1mg的一种或多种类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受至多约96mg的一种或多种类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约1mg至约2mg、约1mg至约4mg、约1mg至约8mg、约1mg至约16mg、约1mg至约32mg、约1mg至约64mg、约1mg至约96mg、约2mg至约4mg、约2mg至约8mg、约2mg至约16mg、约2mg至约32mg、约2mg至约64mg、约2mg至约96mg、约4mg至约8mg、约4mg至约16mg、约4mg至约32mg、约4mg至约64mg、约4mg至约96mg、约8mg至约16mg、约8mg至约32mg、约8mg至约64mg、约8mg至约96mg、约16mg至约32mg、约16mg至约64mg、约16mg至约96mg、约32mg至约64mg、约32mg至约96mg或约64mg至约96mg的一种或多种类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约1mg、约2mg、约4mg、约8mg、约16mg、约32mg、约64mg或约96mg的一种或多种类固醇剂量。在一些实施方案中,所述类固醇是甲泼尼龙(例如,)。在一些实施方案中,所述类固醇是泼尼松。
在一些实施方案中,在施用治疗性载体之前施用一个或多个类固醇的剂量(即,一个或多个术前类固醇剂量)。在一些实施方案中,在施用治疗性载体前递送类固醇的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中,患者接受约1mg/60kg至约100mg/60kg、约1mg/60kg至约80mg/60kg、约1mg/60kg至约60mg/60kg、约1mg/60kg至约40mg/60kg、约1mg/60kg至约20mg/60kg、约20mg/60kg至约100mg/60kg、约20mg/60kg至约80mg/60kg、约20mg/60kg至约60mg/60kg、约20mg/60kg至约40mg/60kg、约40mg/60kg至约100mg/60kg、约40mg/60kg至约80mg/60kg、约40mg/60kg至约60mg/60kg、约60mg/60kg至约100mg/60kg、约60mg/60kg至约80mg/60kg或约80mg/60kg至约100mg/60kg的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约4mg/60kg、6mg/60kg、8mg/60kg、10mg/60kg、16mg/60kg、20mg/60kg、24mg/60kg、32mg/60kg、40mg/60kg、48mg/60kg、60mg/60kg或80mg/60kg的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约1mg至约96mg的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受至少约1mg的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受至多约96mg的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约1mg至约2mg、约1mg至约4mg、约1mg至约8mg、约1mg至约16mg、约1mg至约32mg、约1mg至约64mg、约1mg至约96mg、约2mg至约4mg、约2mg至约8mg、约2mg至约16mg、约2mg至约32mg、约2mg至约64mg、约2mg至约96mg、约4mg至约8mg、约4mg至约16mg、约4mg至约32mg、约4mg至约64mg、约4mg至约96mg、约8mg至约16mg、约8mg至约32mg、约8mg至约64mg、约8mg至约96mg、约16mg至约32mg、约16mg至约64mg、约16mg至约96mg、约32mg至约64mg、约32mg至约96mg或约64mg至约96mg的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约1mg、约2mg、约4mg、约8mg、约16mg、约32mg、约64mg或约96mg的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中,所述类固醇是甲泼尼龙(例如,)。在一些实施方案中,所述类固醇是泼尼松。
在一些实施方案中,患者接受约20mg/60kg至约45mg/60kg、约25mg/60kg至约45mg/60kg、约30mg/60kg至约45mg/60kg、约35mg/60kg至约45mg/60kg、约40mg/60kg至约45mg/60kg、约20mg/60kg至约40mg/60kg、约25mg/60kg至约40mg/60kg、约30mg/60kg至约40mg/60kg、约35mg/60kg至约40mg/60kg、约20mg/60kg至约35mg/60kg、约25mg/60kg至约35mg/60kg、约30mg/60kg至约35mg/60kg、约20mg/60kg至约30mg/60kg、约25mg/60kg至约30mg/60kg或约20mg/60kg至约25mg/60kg之间的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约25mg/60kg、约26mg/60kg、约27mg/60kg、约28mg/60kg、约29mg/60kg、约30mg/60kg、约31mg/60kg、约32mg/60kg、约33mg/60kg、约34mg/60kg或约35mg/60kg的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中,所述类固醇是甲泼尼龙(例如,)。在一些实施方案中,在施用治疗性载体前递送约25mg/60kg与约45mg/60kg之间的甲泼尼龙(例如,)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中,在施用治疗性载体前递送约32mg/60kg的甲泼尼龙(例如,)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中,患者接受约50mg/60kg至约70mg/60kg、约55mg/60kg至约70mg/60kg、约60mg/60kg至约70mg/60kg、约65mg/60kg至约70mg/60kg、约50mg/60kg至约65mg/60kg、约55mg/60kg至约65mg/60kg、约60mg/60kg至约65mg/60kg、约50mg/60kg至约60mg/60kg、约55mg/60kg至约60mg/60kg或约50mg/60kg至约55mg/60kg之间的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约55mg/60kg、约56mg/60kg、约57mg/60kg、约58mg/60kg、约59mg/60kg、约60mg/k、约61mg/60kg、约62mg/60kg、约63mg/60kg、约64mg/60kg或约65mg/60kg的一个或多个术前剂量。在一些实施方案中,所述类固醇是泼尼松。在一些实施方案中,在施用治疗性载体前递送约50mg/60kg与约70mg/60kg之间的泼尼松的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中,在施用治疗性载体前递送约60mg/60kg的泼尼松的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中,在施用治疗性载体后施用一个或多个类固醇的剂量(即,一个或多个术后类固醇剂量)。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送类固醇的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送类固醇的日剂量持续至少1周、2周、3周、4周、5天、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或至少15周。在一些实施方案中,患者接受约1mg/60kg至约100mg/60kg、约1mg/60kg至约80mg/60kg、约1mg/60kg至约60mg/60kg、约1mg/60kg至约40mg/60kg、约1mg/60kg至约20mg/60kg、约20mg/60kg至约100mg/60kg、约20mg/60kg至约80mg/60kg、约20mg/60kg至约60mg/60kg、约20mg/60kg至约40mg/60kg、约40mg/60kg至约100mg/60kg、约40mg/60kg至约80mg/60kg、约40mg/60kg至约60mg/60kg、约60mg至约100mg/60kg、约60mg/60kg至约80mg/60kg and约80mg/60kg至约100mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约1mg至约96mg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受至少约1mg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受至多约96mg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约1mg至约2mg、约1mg至约4mg、约1mg至约8mg、约1mg至约16mg、约1mg至约32mg、约1mg至约64mg、约1mg至约96mg、约2mg至约4mg、约2mg至约8mg、约2mg至约16mg、约2mg至约32mg、约2mg至约64mg、约2mg至约96mg、约4mg至约8mg、约4mg至约16mg、约4mg至约32mg、约4mg至约64mg、约4mg至约96mg、约8mg至约16mg、约8mg至约32mg、约8mg至约64mg、约8mg至约96mg、约16mg至约32mg、约16mg至约64mg、约16mg至约96mg、约32mg至约64mg、约32mg至约96mg或约64mg至约96mg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约1mg、约2mg、约4mg、约8mg、约16mg、约32mg、约64mg或约96mg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,所述类固醇是甲泼尼龙(例如,)。在一些实施方案中,所述类固醇是泼尼松。
在一些实施方案中,患者接受约70mg/60kg至约90mg/60kg、75mg/60kg至约90mg/60kg、约80mg/60kg至约90mg/60kg、约85mg/60kg至约90mg/60kg、约70mg/60kg至约85mg/60kg、约75mg/60kg至约85mg/60kg、约80mg/60kg至约85mg/60kg、约70mg/60kg至约80mg/60kg、约75mg/60kg至约80mg/60kg或约70mg/60kg至约75mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约75mg/60kg、约76mg/60kg、约77mg/60kg、约78mg/60kg、约79mg/60kg、约80mg/60kg、约81mg/60kg、约82mg/60kg、约83mg/60kg、约84mg/60kg或约85mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,所述类固醇是甲泼尼龙琥珀酸钠(例如,)。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送介于约70mg与约90mg/60kg之间的甲泼尼龙琥珀酸钠(例如,)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送约80mg/60kg的甲泼尼龙琥珀酸钠(例如,SOLU-)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中,患者接受约30mg/60kg至约50mg/60kg、35mg/60kg至约50mg/60kg、约40mg/60kg至约50mg/60kg、约45mg/60kg至约50mg/60kg、约30mg/60kg至约45mg/60kg、约35mg/60kg至约45mg/60kg、约40mg/60kg至约45mg/60kg、约30mg/60kg至约40mg/60kg、约35mg/60kg至约40mg/60kg或约30mg/60kg至约35mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约35mg/60kg、约36mg/60kg、约37mg/60kg、约38mg/60kg、约39mg/60kg、约40mg/60kg、约41mg/60kg、约42mg/60kg、约43mg/60kg、约44mg/60kg或约45mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,所述类固醇是甲泼尼龙(例如,)。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送介于约30mg/60kg与约50mg/60kg之间的甲泼尼龙(例如,)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送约40mg/60kg的甲泼尼龙(例如,)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中,患者接受约20mg/60kg至约45mg/60kg、25mg/60kg至约45mg/60kg、约30mg/60kg至约45mg/60kg、约35mg/60kg至约45mg/60kg、约40mg/60kg至约45mg/60kg、约20mg/60kg至约40mg/60kg、约25mg/60kg至约40mg/60kg、约30mg/60kg至约40mg/60kg、约35mg/60kg至约40mg/60kg、约20mg/60kg至约35mg/60kg、约25mg/60kg至约35mg/60kg、约30mg/60kg至约35mg/60kg、约20mg/60kg至约30mg/60kg、约25mg/60kg至约30mg/60kg或约20mg/60kg至约25mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约25mg/60kg、约26mg/60kg、约27mg/60kg、约28mg/60kg、约29mg/60k、约30mg/60kg、约31mg/60kg、约32mg/60kg、约33mg/60kg、约34mg/60kg或约35mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,所述类固醇是甲泼尼龙(例如,)。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送介于约20mg/60kg与约45mg/60kg之间的甲泼尼龙(例如,)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送约32mg/60kg的甲泼尼龙(例如,)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中,患者接受约15mg/60kg至约35mg/60kg、20mg/60kg至约35mg/60kg、约25mg/60kg至约35mg/60kg、约30mg/60kg至约35mg/60kg、约15mg/60kg至约30mg/60kg、约20mg/60kg至约30mg/60kg、约25mg/60kg至约30mg/60kg、约15mg/60kg至约25mg/60kg、约20mg/60kg至约25mg/60kg、约15mg/60kg至约20mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约20mg/60kg、约21mg/60kg、约22mg/60kg、约23mg/60kg、约24mg/60kg、约25mg/60kg、约26mg/60kg、约27mg/60kg、约28mg/60kg、约29mg/60kg或约30mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,所述类固醇是甲泼尼龙(例如,)。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送介于约15mg/60kg与约35mg/60kg之间的甲泼尼龙(例如,)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送约24mg/60kg的甲泼尼龙(例如,)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中,患者接受约5mg/60kg至约25mg/60kg、10mg/60kg至约25mg/60kg、约15mg/60kg至约25mg/60kg、约20mg/60kg至约25mg/60kg、约5mg/60kg至约20mg/60kg、约10mg/60kg至约20mg/60kg、约15mg/60kg至约20mg/60kg、约5mg/60kg至约15mg/60kg、约10mg/60kg至约15mg/60kg或约5mg/60kg至约10mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约10mg/60kg、约11mg/60kg、约12mg/60kg、约13mg/60kg、约14mg/60kg、约15mg/60kg、约16mg/60kg、约17mg/60kg、约18mg/60kg、约19mg/60kg或约20mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,所述类固醇是甲泼尼龙(例如,)。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送介于约5mg/60kg与约25mg/60kg之间的甲泼尼龙(例如,)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送约16mg/60kg的甲泼尼龙(例如,)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中,患者接受约1mg/60kg至约20mg/60kg、5mg/60kg至约20mg/60kg、约10mg/60kg至约20mg/60kg、约15mg/60kg至约20mg/60kg、约1mg/60kg至约15mg/60kg、约5mg/60kg至约15mg/60kg、约10mg/60kg至约15mg/60kg、约1mg/60kg至约10mg/60kg、约5mg/60kg至约10mg/60kg或约1mg/60kg至约5mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约1mg/60kg、约2mg/60kg、约3mg/60kg、约4mg/60kg、约5mg/60kg、约6mg/60kg、约7mg/60kg、约8mg/60kg、约9mg/60kg、约10mg/60kg、约11mg/60kg、约12mg/60kg、约13mg/60kg、约14mg/60kg或约15mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,所述类固醇是甲泼尼龙(例如,)。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送介于约1mg/60kg与约20mg/60kg之间的甲泼尼龙(例如,)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送约8mg/60kg的甲泼尼龙(例如,)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送约6mg/60kg的甲泼尼龙(例如,)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送约4mg/60kg的甲泼尼龙(例如,)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中,患者接受约30mg/60kg至约50mg/60kg、35mg/60kg至约50mg/60kg、约40mg/60kg至约50mg/60kg、约45mg/60kg至约50mg/60kg、约30mg/60kg至约45mg/60kg、约35mg/60kg至约45mg/60kg、约40mg/60kg至约45mg/60kg、约30mg/60kg至约40mg/60kg、约35mg/60kg至约40mg/60kg或约30mg/60kg至约35mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约35mg/60kg、约36mg/60kg、约37mg/60kg、约38mg/60kg、约39mg/60kg、约40mg/60kg、约41mg/60kg、约42mg/60kg、约43mg/60kg、约44mg/60kg或约45mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,所述类固醇是泼尼松。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送介于约30mg/60kg与约50mg/60之间的泼尼松的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送约40mg/60kg的泼尼松的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中,患者接受约10mg/60kg至约30mg/60kg、15mg/60kg至约30mg/60kg、约20mg/60kg至约30mg/60kg、约25mg/60kg至约30mg/60kg、约10mg/60kg至约25mg/60kg、约15mg/60kg至约25mg/60kg、约20mg/60kg至约25mg/60kg、约10mg/60kg至约20mg/60kg、约15mg/60kg至约20mg/60kg或约10mg/60kg至约15mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约15mg/60kg、约16mg/60kg、约17mg/60kg、约18mg/60kg、约19mg/60kg、约20mg/60kg、约21mg/60kg、约22mg/60kg、约23mg/60kg、约24mg/60kg或约25mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,所述类固醇是泼尼松。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送介于约10mg/60kg与约30mg/60kg之间的泼尼松的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送约20mg/60kg的泼尼松的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中,患者接受约1mg/60kg至约20mg/60kg、5mg/60kg至约20mg/60kg、约10mg/60kg至约20mg/60kg、约15mg/60kg至约20mg/60kg、约1mg/60kg至约15mg/60kg、约5mg/60kg至约15mg/60kg、约10mg/60kg至约15mg/60kg、约1mg/60kg至约10mg/60kg、约5mg/60kg至约10mg/60kg或约1mg/60kg至约5mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约1mg/60kg、约2mg/60kg、约3mg/60kg、约4mg/60kg、约5mg/60kg、约6mg/60kg、约7mg/60kg、约8mg/60kg、约9mg/60kg、约10mg/60kg、约11mg/60kg、约12mg/60kg、约13mg/60kg、约14mg/60kg或约15mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,所述类固醇是泼尼松。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送介于约1mg/60kg与约20mg/60kg之间的泼尼松的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送约10mg/60kg的泼尼松的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中,患者接受约1g/60kg至约15g/60kg、约5g/60kg至约15g/60kg、约10g/60kg至约15g/60kg、约1g/60kg至约10g/60kg、约5g/60kg至约10g/60kg或约1g/60kg至约5g/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,患者接受约1g/60kg、约2g/60kg、约3g/60kg、约4g/60kg、约5g/60kg、约6g/60kg、约7g/60kg、约8g/60kg、约9g/60kg、约10g/60kg、约11g/60kg、约12g/60kg、约13g/60kg、约14g/60kg或约15g/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中,所述类固醇是磷酸肌酸钠。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送介于约1g/60kg与约15g/60kg之间的磷酸肌酸钠的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中,在施用治疗性载体后递送约2g/60kg的磷酸肌酸钠的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中,患者在施用治疗性AAV载体的同一天接受静脉内剂量的磷酸肌酸钠(2g/60kg)和静脉内剂量的甲泼尼龙琥珀酸钠(例如,80mg/60kg),并在施用治疗性AAV载体之后每日都接受上述药物持续3天。在施用治疗性AAV载体之后第3天,以40mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如,)片剂持续4天。在施用治疗性AAV载体之后第7天,以32mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如,)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第14天,以24mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如,)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第21天,以16mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如,)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第28天,以8mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如,)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第35天,以6mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如,)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第42天,以4mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如,)片剂持续7天。
在一些实施方案中,患者在施用治疗性AAV载体之前7天以32mg/60kg的剂量接受甲泼尼龙(例如,)片剂。在施用治疗性AAV载体当天,患者接受静脉内剂量的甲泼尼龙琥珀酸钠(例如,(80mg/60kg),其每日施用持续3天。在施用治疗性AAV载体之后第3天,以40mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如,)片剂持续4天。在施用治疗性AAV载体之后第7天,以32mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如,)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第14天,以24mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如,)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第21天,以16mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如,)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第28天,以8mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如,)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第35天,以6mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如,)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第42天,以4mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如,)片剂持续7天。关于LHON基因疗法的治疗方案的示例性示意图参见图8。
在一些实施方案中,患者在施用治疗性AAV载体之前以60mg/60kg的剂量接受泼尼松片剂,并在施用治疗性AAV载体之后每日接受泼尼松片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第8天,以40mg/kg的剂量向患者施用泼尼松片剂持续一天。在施用治疗性AAV载体之后第9天,以20mg/kg的剂量向患者施用泼尼松片剂持续一天。在施用治疗性AAV载体之后第10天,以10mg/kg的剂量向患者施用泼尼松片剂持续一天。关于LHON基因疗法的治疗方案的示例性示意图参见图9。
剂量和间隔可单独调整成足以维持治疗效果。技术人员将能够在不进行过多实验的情况下优化有效的局部剂量。
在一些实施方案中,在例如至少10名患者的群体中,在施用本文所述的治疗性AAV载体之前、期间和/或之后施用类固醇导致比施用不含类固醇的相当的治疗性AAV载体实现更高的平均视力恢复。在一些实施方案中,在例如至少10名患者的群体中,在施用治疗性AAV载体之前、期间和/或之后施用类固醇导致比施用不含类固醇的相当的治疗性AAV载体实现更低的不良事件发生率。在一些实施方案中,所述不良事件选自前房炎症、玻璃体炎、高眼压、白内障摘除、角膜炎、玻璃体出血、过敏性结膜炎和眼痛。
在一些实施方案中,通过与在施用治疗性AAV载体之前、期间和/或之后不施用类固醇而用治疗性AAV载体治疗眼部病症的患者群体进行比较来确定根据本发明方法实现的更高的平均视力恢复和更低的不良事件发生率。在一些实施方案中,根据本公开的方法治疗的患者群体和用相当的治疗性AAV载体治疗的患者群体是种族匹配的。在一些实施方案中,患者群体是中国人或阿根廷人。
诊断方法和试剂盒
在一些实施方案中,本公开提供了筛选治疗眼部病症的患者的方法。在这类实施方案中,所述方法包括在得自患者的血清样品存在下将靶细胞群与包含AAV的组合物一起培养,所述AAV包含编码可检测标记的重组核酸序列;并在培养后检测靶细胞中可检测标记的表达水平,其中如果靶细胞中可检测标记的表达水平高于预定阈值,则选择所述患者进行所述治疗。在一些实施方案中,所述方法进一步包括向所述患者施用包含AAV的药物组合物,所述AAV包含编码线粒体蛋白的重组核酸序列。
本文所述的筛选治疗眼部病症的患者的方法利用来自患者的血清样品来评估特定患者对用于递送治疗性蛋白质的重组病毒载体的免疫反应。患者血清中存在的可溶性因子(例如,抗体)可防止靶细胞的病毒感染,从而减少治疗性蛋白质的递送和/或降低药物组合物的功效。本公开的方法利用编码可检测标记的AAV,使得可通过检测标记来测量靶细胞的感染性水平。在一些实施方案中,本公开提供了用于鉴定对AAV组合物显示低免疫反应性的患者并选择这些患者用本文所述的治疗性AAV载体进行治疗的方法。在一些实施方案中,本公开提供了用于鉴定对AAV组合物显示高免疫反应性的患者并将这些患者排除在将来用本文所述的治疗性AAV载体进行治疗之外的方法。
在一些实施方案中,靶细胞中可检测标记的表达水平与患者针对AAV载体的免疫反应相关。例如,来自患者的对AAV显示高免疫反应性的血清含有可溶性因子,其防止编码可检测标记的AAV感染靶细胞,并防止可检测标记在靶细胞中表达。在这样的情况下,在患者血清存在下培养的靶细胞中可检测标记的表达水平相对于在不存在患者血清的情况下培养的靶细胞中可检测标记的表达水平降低。或者,来自患者的对AAV显示低免疫反应性的血清含有较少或不含防止编码可检测标记的AAV感染靶细胞的可溶性因子。在这样的情况下,在患者血清存在下培养的靶细胞中可检测标记的表达水平相对于在不存在患者血清的情况下培养的靶细胞中可检测标记的表达水平是相同的或没有显著降低。
可检测标记可以是不由靶细胞和/或AAV载体内源性表达的任何蛋白质或核酸分子。可检测标记的实例包括但不限于FLAG标签、多组氨酸标签(例如6xHis)、SNAP标签、Halo标签、cMyc标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签、抗生物素蛋白、酶、荧光蛋白、发光蛋白、化学发光蛋白、生物发光蛋白和磷光蛋白。在一些实施方案中,荧光蛋白选自由以下组成的组:蓝色/UV蛋白(如BFP、TagBFP、mTagBFP2、Azurite、EBFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire和T-Sapphire);青色蛋白(如CFP、eCFP、Cerulean、SCFP3A、mTurquoise、mTurquoise2、单体Midoriishi-Cyan、TagCFP和mTFP1);绿色蛋白(如:GFP、eGFP、meGFP(A208K突变)、Emerald、Superfolder GFP、单体Azami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover和mNeonGreen);黄色蛋白(如YFP、eYFP、Citrine、Venus、SYFP2和TagYFP);橙色蛋白(如单体Kusabira-Orange、mKOκ、mKO2、mOrange和mOrange2);红色蛋白(如RFP、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mApple、mRuby和mRuby2);远红外蛋白(如mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune和NirFP);近红外蛋白(如TagRFP657、IFP1.4和iRFP);长斯托克斯位移蛋白(如mKeima Red、LSS-mKate1、LSS-mKate2和mBeRFP);光激活型蛋白(如PA-GFP、PAmCherry1和PATagRFP);光转换型蛋白(如Kaede(绿色)、Kaede(红色)、KikGR1(绿色)、KikGR1(红色)、PS-CFP2、PS-CFP2、mEos2(绿色)、mEos2(红色)、mEos3.2(绿色)、mEos3.2(红色)、PSmOrange和PSmOrange);以及光开关型蛋白(如Dronpa)。在一些实施方案中,可检测标签可选自AmCyan、AsRed、DsRed2、DsRed Express、E2-Crimson、HcRed、ZsGreen、ZsYellow、mCherry、mStrawberry、mOrange、mBanana、mPlum、mRasberry、tdTomato、DsRed单体和/或AcGFP,所有这些均可得自Clontech。在特定的实施方案中,可检测标记是GFP。
可通过本领域中通常已知的方法检测可检测标记,包括但不限于流式细胞术、qPCR、Western印迹、ELISA和免疫组织化学法。在特定的实施方案中,检测方法是高通量检测方法,如流式细胞术或qPCR,使得可以同时分析多个患者样品。在一些实施方案中,检测方法是流式细胞术。在一些实施方案中,检测方法是qPCR。
在一些实施方案中,为筛选治疗眼部病症的患者设置预先确定的可检测标记的表达水平的阈值。在一些实施方案中,选择满足或超过此阈值的患者用本文所述的治疗性AAV载体进行治疗。在一些实施方案中,不满足此阈值的患者被排除在将来用本文所述的治疗性AAV载体进行治疗之外,或者必须在开始用本文所述的治疗性AAV载体进行治疗之前接受免疫抑制方案。
在一些实施方案中,预先确定的阈值可表示为测试样品中可检测标记的绝对表达水平,高于该水平则患者被表征为适合基因疗法,和/或低于该水平则患者被表征为不适合基因疗法。例如,在通过qPCR检测可检测标记的一些实施方案中,预先确定的阈值是大于或等于0.2的绝对表达水平。在这样的实施方案中,如果可检测标记的绝对表达水平大于或等于0.2,则患者被表征为适合基因疗法,并且如果可检测标记的绝对表达水平小于0.2,则患者被表征为不适合基因疗法。在一些实施方案中,预先确定的阈值是大于或等于0.6的绝对表达水平。在这样的实施方案中,如果可检测标记的绝对表达水平大于或等于0.6,则患者被表征为适合基因疗法,并且如果可检测标记的绝对表达水平小于0.6,则患者被表征为不适合基因疗法。
在通过流式细胞术检测可检测标记的一些实施方案中,预先确定的阈值是测试样品中大于或等于20%标记阳性靶细胞的绝对表达水平(例如,%GFP+细胞≥20%)。在这样的实施方案中,如果可检测标记的绝对表达水平大于或等于20%标记阳性靶细胞,则患者被表征为适合基因疗法,并且如果可检测标记的绝对表达水平小于20%标记阳性靶细胞,则患者被表征为不适合基因疗法。在一些实施方案中,预先确定的阈值是测试样品中大于或等于40%标记阳性靶细胞的绝对表达水平(例如,%GFP+细胞≥40%)。在这样的实施方案中,如果可检测标记的绝对表达水平大于或等于40%标记阳性靶细胞,则患者被表征为适合基因疗法,并且如果可检测标记的绝对表达水平小于40%标记阳性靶细胞,则患者被表征为不适合基因疗法。
在一些实施方案中,预先确定的阈值可表示为测试样品中可检测标记的相对表达水平(即,测试样品中可检测标记相对于对照样品的表达),高于该水平则患者被表征为适合基因疗法,和/或低于该水平则患者被表征为不适合基因疗法。在通过流式细胞术检测可检测标记的一些实施方案中,预先确定的阈值是测试样品中大于或等于40%标记阳性靶细胞的相对表达水平(例如,%GFP+细胞≥40%)。在这样的实施方案中,如果可检测标记的绝对表达水平大于或等于40%标记阳性靶细胞,则患者被表征为适合基因疗法,并且如果可检测标记的绝对表达水平小于40%标记阳性靶细胞,则患者被表征为不适合基因疗法。在通过流式细胞术检测可检测标记的一些实施方案中,预先确定的阈值是测试样品中大于或等于80%标记阳性靶细胞的相对表达水平(例如,%GFP+细胞≥80%)。在这样的实施方案中,如果可检测标记的绝对表达水平大于或等于80%标记阳性靶细胞,则患者被表征为适合基因疗法,并且如果可检测标记的绝对表达水平小于80%标记阳性靶细胞,则患者被表征为不适合基因疗法。
在一些实施方案中,根据本文所述的方法筛选和/或选择进行治疗的患者具有一种或多种mtDNA点突变。在一些实施方案中,患者在编码线粒体的氧化磷酸化链中的复合体I的蛋白质的基因中具有点突变。例如,患者可在ND4基因中具有一种或多种点突变。在一些实施方案中,患者在ND4基因中的核苷酸位置11778具有点突变。在一些实施方案中,点突变是ND4基因中的G11778A。在一些实施方案中,根据本文所述的方法筛选和/或选择进行治疗的患者具有ND4基因中的G11778A点突变,并且具有中国人和/或阿根廷人血统。
在一些实施方案中,根据本文所述的方法筛选和/或选择进行治疗的患者具有ND4基因中的G11778A点突变,并且具有阿根廷人血统。在一些实施方案中,根据本文所述的方法筛选和/或选择进行治疗的患者具有ND4基因中的G11778A点突变,并且具有中国人血统。
在一些实施方案中,本公开提供了用于筛选治疗眼部病症的患者和/或用于选择治疗眼部病症的患者的试剂盒。在这样的实施方案中,所述试剂盒包含:包含编码可检测标记的重组核酸的AAV和一种或多种用于检测所述可检测标记的试剂。在一些实施方案中,用于检测所述可检测标记的一种或多种试剂选自与所述可检测标记结合的抗体和一种或多种对编码所述可检测标记的重组核酸具有特异性的引物寡核苷酸。
在一些实施方案中,所述试剂盒进一步包含一种或多种用于复原和/或稀释AAV载体和/或检测试剂组分的试剂。在一些实施方案中,所述试剂盒进一步包含一种或多种另外的试剂,如用于将AAV载体引入细胞的缓冲液、洗涤缓冲液和/或细胞培养基。试剂盒的组分可处于分开的容器中,或者可合并在单个容器中。
除了上面提到的组分之外,在一些实施方案中,试剂盒进一步包括关于使用试剂盒的组分来实施本公开的方法的说明书。用于实施所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如,说明书可印刷在诸如纸或塑料等的基材上。如此,说明书可作为包装插页存在于试剂盒中,或者存在于试剂盒或其组分的容器的标签中(即,与包装或子包装相关联)。在其它实施方案中,说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如CD-ROM、磁盘、闪存驱动器等)上的电子存储数据文件存在。又在其它实施方案中,试剂盒中不存在实际的说明书,而是提供例如经由因特网从远程来源获得说明书的方式。此实施方案的实例为包括网址的试剂盒,可以在网址上查看说明书和/或可以从网址下载说明书。如同说明书一样,此获得说明书的方式记录在合适的基材上。
药物组合物和赋形剂
可将本发明的载体配制成药物组合物。除了载体之外,这些组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它物质。这类物质应该是无毒的,并且不应干扰活性成分的功效。载剂或其他物质的确切性质可由技术人员根据施用途径(即这里为直接视网膜注射、视网膜下注射或玻璃体内注射)来确定。
药物组合物通常呈液体形式。液体药物组合物通常包括液体载剂,如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、氯化镁、葡萄糖或其它糖溶液或二醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。在一些情况下,可以使用表面活性剂,如普朗尼克酸(PF68,又名泊洛沙姆188)。
对于在病痛部位注射,活性成分将呈无热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性的水溶液形式。本领域相关技术人员完全能够使用例如等渗媒介物如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液来制备合适的溶液。根据需要可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。
对于延迟释放,载体可包括在配制成缓慢释放的药物组合物中,如根据本领域中已知的方法在由生物相容性聚合物形成的微胶囊中或在脂质体载剂系统中。
另一方面,本文公开了包含腺相关病毒(AAV)的药物组合物,所述腺相关病毒包含本文公开的任何重组核酸。在一些情况下,所述药物组合物进一步包含其药学上可接受的赋形剂。
在一些情况下,所述药学上可接受的赋形剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)、α,α-脱水海藻糖(trehalose dehydrate)、L-组氨酸单盐酸盐一水合物、聚山梨醇酯20、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4、泊洛沙姆188或其任意组合。在一些情况下,所述药学上可接受的赋形剂选自磷酸盐缓冲盐水(PBS)、α,α-脱水海藻糖、L-组氨酸单盐酸盐一水合物、聚山梨醇酯20、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4、泊洛沙姆188及其任意组合。
在一些情况下,所述药学上可接受的赋形剂包括泊洛沙姆188。泊洛沙姆188是环氧乙烷-聚氧丙烯二醇共聚物,作为表面活性剂,具有分散、稳定和乳化等作用。在一些情况下,所述药学上可接受的赋形剂包括0.0001%-0.01%泊洛沙姆188。在一些情况下,所述药学上可接受的赋形剂包括0.0005%-0.005%泊洛沙姆188。在一些情况下,所述药学上可接受的赋形剂包括0.0007%-0.002%泊洛沙姆188。在一些情况下,所述药学上可接受的赋形剂包括0.0008%-0.0012%泊洛沙姆188。所述药学上可接受的赋形剂包括0.0009%-0.0011%泊洛沙姆188。在一些情况下,所述药学上可接受的赋形剂包括0.001%(0.01mg/mL)泊洛沙姆188。
在一些情况下,所述药学上可接受的赋形剂进一步包括一种或多种盐。在一些情况下,所述一种或多种盐包括NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4和KH2PO4。在一些情况下,所述一种或多种盐包括80mM NaCl、5mM NaH2PO4、40mM Na2HPO4和5mM KH2PO4。在一些情况下,所述一种或多种盐包括NaCl、Na2HPO4和KH2PO4。在一些情况下,所述一种或多种盐包括154mM NaCl、5.6mM Na2HPO4和8.4mM KH2PO4。在一些情况下,所述一种或多种盐包括NaCl、Na2HPO4和KH2PO4。在一些情况下,所述一种或多种盐是NaCl、Na2HPO4和KH2PO4。在一些情况下,所述NaCl的浓度为5-15mg/mL。在一些情况下,所述NaCl的浓度为9mg/mL。在一些情况下,所述KH2PO4的浓度为0.1-0.5mg/mL。在一些情况下,所述KH2PO4的浓度为0.144mg/mL。在一些情况下,所述Na2HPO4的浓度为0.5-1mg/mL。在一些情况下,所述Na2HPO4的浓度为0.795mg/mL。
在一些情况下,所述药物组合物的pH为6-8。在一些情况下,所述药物组合物的pH为7.2-7.4。在一些情况下,所述药物组合物的pH为7.3。在一些情况下,所述药物组合物的病毒滴度为至少1.0×1010vg/mL。在一些情况下,所述药物组合物的病毒滴度为至少5.0×1010vg/mL。
在一些情况下,所述药物组合物经受五个冷冻/解冻循环,与所述五个冷冻/解冻循环之前的病毒滴度相比,所述药物组合物保持至少60%、70%、80%或90%的病毒滴度。在一些情况下,所述药物组合物在向患有莱伯氏遗传性视神经病变的患者施用时比没有所述重组核酸的相当的药物组合物产生更高的平均视力恢复。
在一些情况下,所述药物组合物存放于特定材质的容器中。在某些实施例中,所述容器的材质为环烯烃聚合物。
样品
适用于本文所述的方法的样品可以是来自受试者的核酸样品。如本文所用的“核酸样品”可包括RNA或DNA或其组合。在另一实施方案中,“多肽样品”(例如,肽或蛋白质或由其得到的片段)可用于确定由于遗传性变型,氨基酸已发生变化的信息。核酸和多肽可提取自一种或多种样品,包括但不限于血液、唾液、尿液、口腔内衬的粘膜刮屑、祛痰剂、血清、泪液、皮肤、组织或毛发。可对核酸样品进行核酸信息分析。如本文所用的“核酸信息”包括核酸序列本身、核酸序列中遗传变异的存在/不存在、根据核酸序列而变化的物理性质(例如,Tm)及核酸的量(例如,mRNA拷贝数)。“核酸”意指DNA、RNA、包括人工核苷酸的DNA或包括人工核苷酸的RNA中的任一者。如本文所用,“纯化的核酸”包括cDNA、基因组核酸的片段、采用聚合酶链式反应(PCR)产生的核酸、通过基因组核酸的限制性酶处理形成的核酸、重组核酸及化学合成的核酸分子。“重组”核酸分子包括通过两个以其它方式分开的序列片段的人工组合而成的核酸分子,例如通过化学合成或者通过遗传工程改造技术操纵分离的核酸片段。如本文所用,“多肽”包括蛋白质、蛋白质片段和肽,无论是分离自天然来源的、通过重组技术产生的还是化学合成的。多肽可具有一种或多种修饰,如翻译后修饰(例如,糖基化、磷酸化等)或任何其它修饰(例如,聚乙二醇化等)。多肽可含有一种或多种非天然存在的氨基酸(例如,如具有侧链修饰的氨基酸)。
在一些实施方案中,核酸样品可包括细胞或组织,例如细胞系。可采用本文所述的方法从其中获得核酸的示例性细胞类型包括但不限于以下:血细胞,如B淋巴细胞、T淋巴细胞、白细胞、红细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞;肌肉细胞,如骨骼细胞、平滑肌细胞或心肌细胞;生殖细胞,如精子或卵子;上皮细胞;结缔组织细胞,如脂肪细胞、软骨细胞;成纤维细胞或成骨细胞;神经元;星形细胞;基质细胞;器官特异性细胞,如肾细胞、胰腺细胞、肝细胞或角质细胞;干细胞;或由其发育而来的任何细胞。可从其中获得核酸的细胞可以是血细胞或特定类型的血细胞,包括例如造血干细胞或由造血干细胞产生的细胞,如红细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或血小板。一般地,可以使用任何类型的干细胞,包括但不限于胚胎干细胞、成体干细胞或多能干细胞。
在一些实施方案中,可处理核酸样品以进行RNA或DNA分离,例如可以使细胞或组织样品中的RNA或DNA与核酸样品的其它组分分离。可以采用标准技术,例如通过离心细胞样品,并将沉淀的细胞重新悬浮在例如缓冲溶液(例如,磷酸盐缓冲盐水(PBS))中,由此从核酸样品中收获细胞。在一些实施方案中,在离心细胞悬浮液以获得细胞沉淀后,可将细胞裂解以提取DNA。在一些实施方案中,可将核酸样品浓缩和/或纯化以分离DNA。得自受试者的所有核酸样品,包括经受任何种类的进一步处理的核酸样品,都被认为是得自受试者。在一些实施方案中,本领域中已知的标准技术和试剂盒可用于从核酸样品中提取RNA或DNA,包括例如苯酚提取、组织试剂盒(Qiagen,Chatsworth,Calif.)、基因组DNA纯化试剂盒(Promega)或采用Puregene化学的Qiagen Autopure方法,它们能够纯化非常适于归档的高度稳定的DNA。
在一些实施方案中,确定等位基因的特性(identity)或确定拷贝数可以但不必包括自受试者获得包含RNA和/或DNA的核酸样品,和/或评估来源于核酸样品的基因组DNA(即受试者的基因组)内的一种或多种遗传变异的特性、拷贝数、存在与否及其染色体位置。
进行测定的个体或组织不需要实际上对来自受试者的核酸样品进行物理分析。在一些实施方案中,所述方法可以包括使用通过第三方分析核酸样品获得的信息。在一些实施方案中,所述方法可以包括在多于一个地点进行的步骤。例如,核酸样品可在第一地点得自受试者,如在医疗服务机构或者在自我检测试剂盒的情况下在受试者的家中。可以在同一地点或者在第二地点例如在实验室或其它测试场所分析核酸样品。
核酸
本文所述的核酸和多肽可用于本公开的方法和试剂盒。在一些实施方案中,特异性结合本文所述的核酸和多肽的适体可用于本公开的方法和试剂盒。如本文所用,核酸可包含脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA),无论是单一的还是在聚合物中、天然存在的还是非天然存在的、双链的还是单链的、编码的(例如翻译的基因)还是非编码的(例如调控区)或其任何片段、衍生物、模拟物或互补物。在一些实施方案中,核酸可包括寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸、核酸序列、基因组序列、互补DNA(cDNA)、反义核酸、DNA区域、探针、引物、基因、调控区域、内含子、外显子、开放阅读框、结合位点、靶核酸和等位基因特异性核酸。
如本文所用的“探针”包括用于采用基于核酸的互补性的杂交反应来检查样本中的核酸的核酸片段。
如本文所用的“杂交体”包括在上面提到的核酸的同一类型内或跨越不同类型的任一者之间形成的双链,包括DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA等。
如本文所用的“分离的”核酸是与通常侧接基因或核苷酸序列(如在基因组序列中)和/或已从其它转录序列中(例如,如在RNA文库中)完全或部分纯化的核酸分离的。例如,本公开的分离的核酸相对于其天然存在的复杂细胞环境或当通过重组技术产生时的培养基或当化学合成时的化学前体或其它化学物质而言可以是基本上分离的。在一些情况下,分离的物质可形成组合物的一部分,例如含有其它物质的粗提取物、缓冲系统或试剂混合物。在一些实施方案中,可采用本领域中已知的方法将物质纯化至基本上均匀,例如通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或柱色谱法(例如,HPLC)。关于基因组DNA(gDNA),术语“分离的”也可指同与基因组DNA天然关联的染色体分离的核酸。例如,分离的核酸分子可含有小于约250kb、200kb、150kb、100kb、75kb、50kb、25kb、10kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸,所述核苷酸侧接核酸分子所来源的细胞的gDNA中的核酸分子。
核酸可与其它编码或调控序列融合,可以被认为是分离的。例如,载体中含有的重组DNA包括在如本文所用的“分离”的定义中。在一些实施方案中,分离的核酸可包括异源宿主细胞或异源生物体中的重组DNA分子以及溶液中部分或基本上纯化的DNA分子。分离的核酸还涵盖本公开的DNA分子的体内和体外RNA转录物。可以化学合成或通过重组方式合成分离的核酸分子或核苷酸序列。这类分离的核苷酸序列可用于例如制造编码的多肽,作为用于分离同源序列(例如,来自其它哺乳动物物种)、用于基因作图(例如,通过与染色体原位杂交)或用于如通过Northern印迹分析或本文公开的其它杂交技术检测组织(例如,人体组织)中的基因表达的探针。本公开还涉及在诸如用于选择性杂交的高度严格杂交条件下与本文所述的核苷酸序列杂交的核酸序列。可通过等位基因特异性或序列特异性杂交(例如,在高度严格条件下)检测和/或分离这类核酸序列。核酸杂交的严格条件和方法是技术人员熟知的(参见例如CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel,F.等人,JohnWiley&Sons,(1998)以及Kraus,M.和Aaronson,S.,Methods Enzymol.,200:546-556(1991),其全部教导内容以引用的方式并入本文。
可通过为了最佳比较的目的而比对序列来确定两个或更多个核苷酸或氨基酸序列之间的“同一性”或“同一性百分比”计算(例如,可在第一序列的序列中引入缺口)。然后比较相应位置上的核苷酸,并且两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数(即%同一性=相同位置的数目/位置的总数目×100)。例如,第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的位置的核苷酸占据,则在该位置上分子是相同的。考虑到为了两个序列的最佳比对而需要引入的缺口的数目和每个缺口的长度,两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数。如本文所用,除另指出外,在描述序列相同程度时用到的“相同”和“同一性”两个词语表达的意思一致。譬如,与一个特定序列至少99%相同,即意味着与该序列有至少99%的同一性。
在一些实施方案中,为了比较目的而比对的序列的长度为参考序列的长度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。可通过熟知的方法来完成两个序列的实际比较,例如采用数学算法。Karlin,S.和Altschul,S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90-5873-5877(1993)中描述了这种数学算法的非限制性实例。如Altschul,S.等人,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(1997)中所述,这种算法被结合到NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。当利用BLAST和缺口BLAST程序时,可以使用相应程序(例如,NBLAST)的任何相关参数。例如,用于序列比较的参数可以被设置为评分=100,字长=12,或者可以变化(例如,W=5或W=20)。其它实例包括Myers和Miller的算法、CABIOS(1989)、ADVANCE、ADAM、BLAT和FASTA。在一些实施方案中,可使用例如GCG软件包(Accelrys,Cambridge,UK)中的GAP程序来完成两个氨基酸序列之间的同一性百分比。
“探针”或“引物”可以是以碱基特异性方式与核酸分子的互补链杂交的寡核苷酸。探针可包括引物,引物可以是单链寡核苷酸探针,其可作为采用包括但不限于扩增靶序列的聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式反应(LCR)的方法进行模板导向DNA合成的起始点。如本文所述的寡核苷酸可包括核酸序列或其互补序列的片段(segment/fragment)。在一些实施方案中,DNA片段可以是介于5个与10,000个之间的连续碱基,并且可以在5、10、12、15、20或25个核苷酸至10、15、20、25、30、40、50、100、200、500、1000或10,000个核苷酸范围内。如Nielsen,P.等人,Science 254:1497-1500(1991)中所述,除了DNA和RNA之外,探针和引物还可以包括多肽核酸(PNA)。探针或引物可包含与核酸分子的至少约15个、通常约20-25个且在某些实施方案中约40个、50个、60个或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列的区域。
本公开还提供了分离的核酸,例如探针或引物,其含有可选择性地与包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的核酸杂交的片段或部分,其中所述核苷酸序列可包含至少一个本文所述的遗传变异中所含有的多态性或多态性等位基因或位于相同位置的野生型核苷酸或其互补序列。在一些实施方案中,探针或引物可与连续核苷酸序列或与连续核苷酸序列的互补序列具有至少70%同一性、至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性或至少95%同一性。
在一些实施方案中,核酸探针可以是能够与含有本文所述的遗传变异的与疾患(例如,LHON)相关的基因的互补区杂交的寡核苷酸。本公开的核酸片段可在诸如本文所述的测定中用作探针或引物。
可采用技术人员熟知的标准分子生物学技术来鉴定和分离本公开的核酸,如上述的核酸。在一些实施方案中,DNA可以被扩增和/或可以被标记(例如,放射性标记、荧光标记),并用作筛选例如来源于生物体的cDNA文库的探针。cDNA可来源于mRNA,并且可以含在合适的载体中。例如,可以分离相应的克隆,体内切除之后获得DNA,并且可以通过技术领域公认的方法在任一或两个方向上对克隆的插入片段进行测序,以鉴定编码适当分子量的多肽的正确阅读框。采用这些或类似的方法,多肽和编码多肽的DNA可以被分离、测序并进一步表征。
在一些实施方案中,核酸可包含一种或多种多态性、变异或突变,例如单核苷酸多态性(SNP)、单核苷酸变异(SNV)、拷贝数变异(CNV),例如插入、缺失、倒位和易位。在一些实施方案中,核酸可包含类似物,例如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸或修饰的核酸,例如修饰的主链残基或键联,或与碳水化合物、脂质、多肽或其它物质结合的核酸,或肽核酸(PNA),例如染色质、核糖体和转录体。在一些实施方案中,核酸可包括各种结构的核酸,例如ADNA、B DNA、Z型DNA、siRNA、tRNA及核酶。在一些实施方案中,核酸可以是天然或非天然多态性的,例如与参考序列相比具有一个或多个序列差异,例如添加、缺失和/或取代。在一些实施方案中,参考序列可基于可公开获得的信息,例如U.C.Santa Cruz人类基因组浏览器网关(genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)或NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)。在一些实施方案中,可由本公开的从业者采用本领域中熟知的方法来确定参考序列,例如通过对参考核酸进行测序。
在一些实施方案中,如本文所述,探针可与等位基因、SNP、SNV或CNV杂交。在一些实施方案中,探针可与如本文所述与LHON相关的另一标记物序列结合。
本领域技术人员将知道如何设计探针,使得只有当来自测试核酸样品的基因组序列中存在特定的等位基因时才能发生序列特异性杂交。本公开也可被简化成采用任何方便的基因分型方法来实施,包括商业上可行的对特定遗传变异进行基因分型的技术和方法。
也可以使用对照探针,例如结合较少可变序列的探针,例如与染色体的着丝粒相关的重复DNA可用作对照。在一些实施方案中,探针可得自商业来源。在一些实施方案中,探针可以是例如化学合成或体外合成的,或者是通过标准技术由染色体或基因组DNA制成的。在一些实施方案中,可以使用的DNA的来源包括基因组DNA、克隆的DNA序列、含有一个人类染色体或一个人类染色体的一部分以及宿主的正常染色体互补体和通过流式细胞术或显微切割纯化的染色体的体细胞杂合体。可通过克隆或通过使用PCR的位点特异性扩增来分离所关注的区域。
一种或多种核酸例如探针或引物也可以被标记,例如通过直接标记,以包含可检测标记。可检测标记可包括能够通过物理、化学或生物方法检测的任何标记,例如放射性标记,如32P或3H;荧光标记,如FITC;发色团标记;亲和配体标记;酶标记,如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或I2半乳糖苷酶;酶辅因子标记;半抗原缀合物标记,如地高辛或二硝基苯基;拉曼信号产生标记;磁性标记;自旋标记;表位标记,如FLAG或HA表位;发光标记;重原子标记;纳米颗粒标记;电化学标记;光散射标记;球壳标记;半导体纳米晶体标记,如量子点(描述于6,207,392号美国专利中)和用本领域技术人员已知的任何其它信号产生标记物标记的探针,其中标记物可使探针在有或没有次级检测分子的情况下可视化。可利用标准技术例如切口平移、随机引发和PCR标记将核苷酸直接结合到探针中。如本文所用的“信号”包括可合适地通过适当的方式检测和测量的信号,包括荧光、放射性、化学发光等。
可用于检测的标记部分的非限制性实例包括但不限于合适的酶,如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶;能够形成复合物的结合对的成员,如链霉亲和素/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗体复合物,包括例如兔IgG和抗兔IgG;荧光团,如伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、绿色荧光蛋白、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、二苯乙烯、萤虫黄、孔雀蓝(Cascade Blue)、德克萨斯红、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白、荧光镧系元素络合物如包括铕和铽的那些、花青染料家族成员如Cy3和Cy5、分子信标及其荧光衍生物,以及本领域中已知的其它物质,如在例如Principles of Fluorescence Spectroscopy,Joseph R.Lakowicz(编),Plenum Pub Corp,第2版(1999年7月)和Richard P.Hoagland的第6版Molecular ProbesHandbook中所述;发光物质,如鲁米诺;光散射或等离子体共振物质,如金或银颗粒或量子点;或者放射性物质包括14C、123I、124I、125I、Tc99m、32P、33P、35S或3H。
其它标记也可用于本公开的方法中,例如主链标记。主链标记包含以序列无关方式结合核酸的核酸染料。非限制性实例包括嵌入染料,如菲啶和吖啶(例如,溴化乙锭、碘化丙锭、碘化己锭、二氢乙锭、乙锭同二聚体-1和-2、乙锭一叠氮化物和ACMA);一些小沟结合剂,如吲哚和咪唑(例如,Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580和DAPI);以及杂类核酸染料,如吖啶橙(也能够嵌入)、7-AAD、放线菌素D、LDS751和羟芪巴脒。所有上面提到的核酸染料均可商购自诸如Molecular Probes,Inc的供应商。还有核酸染料的其它实例包括得自Molecular Probes的以下染料:花青染料,如SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRO-1、YO-PRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR Gold、SYBR绿I、SYBR绿II、SYBR DX、SYTO-40、-41、-42、-43、-44、-45(蓝色)、SYTO-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(绿色)、SYTO-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙色)、SYTO-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(红色)。
在一些实施方案中,可以选择不同颜色的荧光团,例如7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、5-(和-6)-羧基-X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、5-(和-6)-羧基荧光素、荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC)、7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸、四甲基罗丹明-5-(和-6)-异硫氰酸酯、5-(和-6)-羧基四甲基罗丹明、7-羟基香豆素-3-羧酸、6-[荧光素5-(和-6)-羧酰胺基]己酸、N-(4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼烷-3a,4a二氮杂-3-引达省丙酸、曙红-5-异硫氰酸酯、赤藓红-5-异硫氰酸酯、TRITC、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy-7、德克萨斯红、Phar-红、别藻蓝蛋白(APC)和CASCADETM蓝乙酰基叠氮化物,使得在或不在一组中的每种探针可以被清楚地可视化。在一些实施方案中,可用荧光显微镜和用于每种荧光团的适当滤光片或者通过使用双或三带通滤光器组观察多个荧光团来观察荧光标记的探针。在一些实施方案中,诸如流式细胞术的技术可用于检查探针的杂交模式。
在其它实施方案中,探针可例如用生物素或地高辛间接标记,或者用放射性同位素如32P和/或3H标记。作为非限制性实例,可通过与可检测标记物缀合的抗生物素蛋白来检测用生物素间接标记的探针。例如,抗生物素蛋白可与酶标记物如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶缀合。在一些实施方案中,可以使用酶的底物和/或催化剂利用比色反应来检测酶标记物。在一些实施方案中,可以使用碱性磷酸酶的催化剂,例如5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐和硝基蓝四唑鎓。在一些实施方案中,催化剂可用于辣根过氧化物酶,例如二氨基苯甲酸盐。
制剂、施用途径和有效剂量
本公开的又一方面涉及包含本公开的药剂或药剂组合的药物组合物的制剂、施用途径和有效剂量。这类药物组合物可用于治疗如上所述的疾患(例如,LHON)。
本公开的化合物可作为药物制剂施用,包括适于口服(包括经颊和舌下)、经直肠、经鼻、局部、透皮贴剂、经肺、经阴道、栓剂或肠胃外(包括眼内、玻璃体内、肌内、动脉内、鞘内、皮内、腹膜内、皮下和静脉内)施用或呈适于通过雾化、吸入或吹入施用的形式的药物制剂。关于药物递送系统的一般信息可见于Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems(Lippencott Williams&Wilkins,Baltimore Md.(1999)。
在各种实施方案中,药物组合物包括载剂和赋形剂(包括但不限于缓冲剂、碳水化合物、甘露糖醇、多肽、氨基酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂)、水、油(包括石油、动物、植物或合成来源的油,如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)、盐水溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液、调味剂、着色剂、防粘剂及其它可接受的添加剂、佐剂或粘结剂、用以接近生理条件的其它药学上可接受的辅助物质如pH缓冲剂、张力调节剂、乳化剂、润湿剂等。赋形剂的实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。在一些实施方案中,药物制剂基本上不含防腐剂。在其它实施方案中,药物制剂可含有至少一种防腐剂。关于药物剂型的一般方法见于Ansel等人,Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems(Lippencott,Williams,&Wilkins,Baltimore Md.(1999))。可以认识到,虽然可以使用本领域普通技术人员已知的任意合适的载体来施用本公开的组合物,但载体的类型可根据施用方式而变化。
也可采用熟知的技术将化合物包封在脂质体内。也可以使用生物可降解的微球作为本公开的药物组合物的载剂。合适的生物可降解微球公开在例如美国专利第4,897,268、5,075,109、5,928,647、5,811,128、5,820,883、5,853,763、5,814,344和5,942,252号中。
可以脂质体或微球(或微颗粒)形式施用化合物。用于向受试者施用的脂质体和微球的制备方法是本领域技术人员熟知的。美国专利第4,789,734号(其内容特此以引用的方式并入)描述了将生物物质包封在脂质体中的方法。基本上,将物质溶解在水溶液中,添加适当的磷脂和脂质,如果需要的话连同表面活性剂一起添加,并且必要时对物质进行渗析或声处理。G.Gregoriadis,第14章,“Liposomes,”Drug Carriers in Biology andMedicine,第2页、增补87-341页(Academic Press,1979)提供了已知方法的综述。
由聚合物或多肽形成的微球是本领域技术人员熟知的,并且可以被设计成通过胃肠道直接进入血流。或者,可以掺入化合物,并植入微球或微球复合物,以在数天至数月的时间段内缓慢释放。参见例如美国专利第4,906,474、4,925,673和3,625,214号以及Jein,TIPS 19:155-157(1998),上述内容特此以引用的方式并入。
可调节药物的浓度,缓冲溶液的pH,并调节等渗性以与眼内注射或玻璃体内注射相容。
可将本公开的化合物配制为在合适媒介物中的无菌溶液或悬浮液。药物组合物可通过常规的熟知灭菌技术进行灭菌,或者可进行无菌过滤。所得到的水溶液可原样包装使用或冻干,冻干制剂在施用之前与无菌溶液合并。Remington“The Science and Practiceof Pharmacy”(第20版,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore MD)中描述了合适的制剂和另外的载剂。
剂或其药学上可接受的盐可单独或与一种或多种其它剂组合提供,或者以一种或多种其它形式提供。例如,制剂可包含特定比例的一种或多种剂,这取决于每种剂的相对效力和预期的适应症。例如,在用于靶向两种不同宿主靶标的组合物中,并且在效力相似的情况下,可以使用约1:1比率的剂。可将两种形式一起配制在同一剂量单位中,例如在一种霜剂、栓剂、片剂、胶囊、气溶胶喷雾剂或要在饮料中溶解的粉末包中;或者可将每种形式配制在单独的单位中,例如两种霜剂、两种栓剂、两种片剂、两种胶囊、片剂和用于溶解片剂的液体、两种气溶胶喷雾剂或粉末包和用于溶解粉末的液体等。
术语“药学上可接受的盐”意指那些保留了在本公开中使用的剂的生物有效性和特性并且不是生物学上或其它方面上不可取的盐。
典型的盐为无机离子比如钠、钾、钙、镁离子等的盐。这类盐包括与无机或有机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、扁桃酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸或马来酸形成的盐。此外,如果剂含有羧基或其它酸性基团,则可以用无机或有机碱将其转化成药学上可接受的加成盐。合适的碱的实例包括氢氧化钠、氢氧化钾、氨、环己胺、二环己胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等。
药学上可接受的酯或酰胺是指保留了在本公开中使用的剂的生物有效性和特性并且不是生物学上或其它方面上不可取的那些酯和酰胺。典型的酯包括乙酯、甲酯、异丁酯、乙二醇酯等。典型的酰胺包括未取代的酰胺、烷基酰胺、二烷基酰胺等。
在一些实施方案中,剂可以与一种或多种例如如上所述的其它化合物、形式和/或剂组合施用。可将含有一种或多种其它活性剂的药物组合物配制成包含一定的摩尔比。例如,第一活性剂与其它活性剂的摩尔比可以是约99:1至约1:99。在实施方案的一些子集中,第一活性剂:其它活性剂的摩尔比范围选自约80:20至约20:80;约75:25至约25:75、约70:30至约30:70、约66:33至约33:66、约60:40至约40:60;约50:50;和约90:10至约10:90。第一活性剂:其它活性剂的摩尔比可以为约1:9,并且在一些实施方案中可以为约1:1。可将两种剂、形式和/或化合物一起配制在同一剂量单位中,例如在一种霜剂、栓剂、片剂、胶囊或要在饮料中溶解的粉末包中;或者可将每种剂、形式和/或化合物配制在单独的单位中,例如两种霜剂、栓剂、片剂、两种胶囊、片剂和用于溶解片剂的液体、气溶胶喷雾剂、粉末包和用于溶解粉末的液体等。
如果必要或需要的话,剂和/或剂组合可再与其它剂一起施用。可与本公开的剂和/或剂组合共同施用的剂的选择可至少部分地取决于所治疗的疾患。
剂(或其药学上可接受的盐、酯或酰胺)可单独或以药物组合物的形式施用,其中活性剂与一种或多种药学上可接受的载剂相掺合或混合。如本文所用的药物组合物可以是制备用于向受试者施用的任何组合物。可以使用一种或多种生理学上可接受的载剂以常规方式配制根据本公开使用的药物组合物,所述载剂包括赋形剂、稀释剂和/或助剂,其例如有助于将活性剂加工成可施用的制剂。适当的制剂可至少部分地取决于所选择的施用途径。可采用多种施用途径或模式向受试者递送用于本公开的剂或其药学上可接受的盐、酯或酰胺,包括口服、经颊、局部、经直肠、经皮、经粘膜、皮下、静脉内、眼内、玻璃体内和肌内施加以及通过吸入。
在一些实施方案中,由于例如存在大的亲脂性部分,可使用油或非水溶剂将剂带入溶液中。或者,可以使用乳液、悬浮液或其它制剂,例如脂质体制剂。关于脂质体制剂,可以采用任何已知的方法制备用于治疗疾患的脂质体。参见例如以引用的方式并入本文的Bangham等人,J.Mol.Biol.23:238-252(1965)和Szoka等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA75:4194-4198(1978)。也可以使配体与脂质体附接,以将这些组合物导向特定的作用位点。也可将本公开的剂并入到食品例如奶油干酪、黄油、色拉酱或冰淇淋中,以在某些受试者群体中促进增溶、施用和/或顺应性。
本公开的化合物可以被配制成用于肠胃外施用(例如,通过注射,例如眼内注射或玻璃体内注射),并且可以单位剂型存在于安瓿、预填充注射器、小体积输注液中,或者存在于添加有防腐剂的多剂量容器中。组合物可采取诸如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式,例如在含水聚乙二醇中的溶液。
对于可注射制剂,媒介物可选自本领域中已知合适的那些,包括水溶液或油悬浮液或乳液,以及芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油,以及酏剂、甘露糖醇、葡萄糖,或无菌水溶液及类似的药物媒介物。制剂还可以包含生物相容性可生物降解的聚合物组合物,如聚(乳酸-共-乙醇酸)。可将这些物质制成微球或纳米球,装载药物并进一步包衣或衍生化,以提供优异的持续释放性能。适用于眼周或眼内注射的媒介物包括例如治疗剂在注射级水、脂质体和适用于亲脂性物质的媒介物中的悬浮液。用于眼周或眼内注射的其它媒介物是本领域中熟知的。
在一些实施方案中,根据常规程序将组合物配制为适于向人静脉内施用的药物组合物。通常,用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲剂中的溶液。在必要的情况下,组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因,以减轻注射部位的疼痛。通常,各成分以单位剂型单独或混合在一起提供,例如作为在密闭密封容器中的干燥的冻干粉末或无水浓缩物,所述容器如指示活性剂的量的安瓿或小药囊。在组合物要通过输注施用的情况下,可将其用含有无菌药物级水或盐水的输注瓶进行分配。在通过注射施用组合物的情况下,可提供注射用无菌水或盐水的安瓿,以便可以在施用之前将各成分混合。
当通过注射施用时,可将活性化合物配制在水溶液中,特别是在生理相容的缓冲液中,如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。溶液可含有配制剂,如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者,活性化合物可呈粉末形式,在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水进行复原。在一些实施方案中,药物组合物不包含添加以增强由肽刺激的免疫反应的佐剂或任何其它物质。在一些实施方案中,药物组合物包含抑制对肽的免疫反应的物质。配制方法是本领域中已知的,例如公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences,最新版,Mack Publishing Co.,Easton P中。
在一些实施方案中,可用包含本公开的剂或的剂组合的眼用溶液、悬浮液、油膏或插入物来有效地治疗眼部病症。可通过将活性成分溶解在无菌水溶液如生理盐水、缓冲溶液等中或者通过在使用前将要溶解的粉末组合物合并来制备眼药水。可选择本领域中已知的其它媒介物,包括但不限于:平衡盐溶液、盐水溶液、水溶性聚醚如聚乙二醇、聚乙烯类化合物如聚乙烯醇和聚维酮、纤维素衍生物如甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素、石油衍生物如矿物油和白凡士林、动物脂肪如羊毛脂、丙烯酸的聚合物如羧基聚亚甲基凝胶、植物脂肪如花生油和多糖如葡聚糖以及糖胺聚糖如透明质酸钠。如果需要的话,可以添加眼药水中常用的添加剂。这类添加剂包括等渗剂(例如,氯化钠等)、缓冲剂(例如,硼酸、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠等)、防腐剂(例如,苯扎氯铵、苄索氯铵、氯丁醇等)、增稠剂(例如,糖类,如乳糖、甘露糖醇、麦芽糖等;例如,透明质酸或其盐,如透明质酸钠、透明质酸钾等;例如,粘多糖,如硫酸软骨素等;例如,聚丙烯酸钠、羧乙烯基聚合物、交联聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素或本领域技术人员已知的其它剂)。
可通过组合物中的表面活性剂或其它适当的共溶剂来提高本发明组合物的组分的溶解度。这类共溶剂包括聚山梨醇酯20、60和80;Pluronic F68、F-84和P-103;环糊精或本领域技术人员已知的其它试剂。这类共溶剂的使用水平可以是约0.01重量%至2重量%。
可按多剂量形式包装本公开的组合物。防腐剂可优选防止使用期间的微生物污染。合适的防腐剂包括:苯扎氯铵、硫柳汞、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙醇、依地酸二钠、山梨酸、Onamer M或本领域技术人员已知的其它剂。在现有技术的眼用产品中,这类防腐剂的使用水平可以是0.004%至0.02%。在本申请的组合物中,可以按0.001重量%至少于0.01重量%(例如0.001重量%至0.008重量%,优选约0.005重量%)的水平使用防腐剂,优选苯扎氯铵。已发现0.005%浓度的苯扎氯铵可足以保护本公开的组合物免受微生物攻击。
在一些实施方案中,以可溶性而不是悬浮液形式递送本公开的剂,这样允许更快速和定量地吸收至作用位点。一般来说,诸如凝胶剂、霜剂、洗剂、栓剂和油膏的制剂可提供更长时间暴露于本公开的剂的区域,而溶液形式的制剂例如喷雾剂则提供更直接的短期暴露。
另外可以预见,本公开的化合物可以可释放的方式附着于生物相容性聚合物上,用于在持续释放的制剂中使用,所述持续释放的制剂在用于局部、眼内、眼周或全身施用的插入物之上、之中或附着于其上。从生物相容性聚合物中的受控释放也可以水溶性聚合物利用以形成可滴注的制剂。从生物相容性聚合物比如PLGA微球或纳米球中的受控释放可用于适于眼内植入或注射以进行持续释放施用的制剂中,也可以使用任意合适的可生物降解且是生物相容性的聚合物。
进一步编号的实施方案
在下面编号的各项中提供本发明进一步的实施方案:
项1:一种重组核酸,包含(由5’端至3’端依次排列)线粒体靶向序列和线粒体蛋白编码序列;可选地,所述线粒体编码蛋白编码ND4蛋白;可选地,所述ND4蛋白包含与SEQ IDNO:160至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列。
项2:根据项1所述的重组核酸,其特征在于,包含与SEQ ID NO:180和174-176所示的任一条序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项3:根据项1或2所述的重组核酸,其特征在于,包含与SEQ ID NO:180至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项4:根据项1-3任一项所述的重组核酸,其特征在于,包含SEQ ID NO:180所示的序列。
项5:根据项1-4任一项所述的重组核酸,其特征在于,包括Kozak序列,所述Kozak序列置于所述线粒体靶向序列的5’端前;可选地,所述Kozak序列为SEQ ID NO:171;可选地,所述Kozak序列与所述线粒体靶向序列之间无多余的核苷酸。
项6:根据项1-5任一项所述的重组核酸,其特征在于,包括内含子序列;可选地,所述内含子序列置于所述线粒体靶向序列的5’端前;可选地,所述内含子序列置于所述Kozak序列的5’端前;可选地,所述内含子序列包含与SEQ ID NO:170所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项7:根据项1-6任一项所述的重组核酸,其特征在于,包括启动子序列;可选地,所述启动子序列置于所述线粒体靶向序列、所述Kozak序列、和/或所述内含子序列的5’端前;可选地,所述启动子序列包含与SEQ ID NO:169所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项8:根据项1-7任一项所述的重组核酸,其特征在于,包括3’UTR序列;可选地,所述3’UTR序列置于所述线粒体蛋白编码序列的3’端后;可选地,所述3’UTR序列包含与SEQID NO:13所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项9:根据项1-8任一项所述的重组核酸,其特征在于,包括聚腺苷酸尾序列;可选地,所述聚腺苷酸尾序列置于所述线粒体蛋白编码序列和/或所述3’UTR序列的3’端后;可选地,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ ID NO:172或173所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列;可选地,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ ID NO:173所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项10:根据项1-9任一项所述的重组核酸,其特征在于,所述3’UTR序列和所述聚腺苷酸尾序列之间包含与SEQ ID NO:185所示的间隔序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%相同的序列。
项11:根据项1-10任一项所述的重组核酸,其特征在于,
所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:1所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列;和/或
所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项12:根据项1-11任一项所述的重组核酸,其特征在于,还包括第一末端反向重复(ITR)序列和第二ITR序列;可选地,所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO:178所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述第二ITR序列包含与SEQ ID NO:179所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项13:一种重组核酸,包含(由5’端至3’端依次排列):
线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列、聚腺苷酸尾序列;
其中,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ ID NO:173所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项14:根据项13所述的重组核酸,其特征在于,所述3’UTR序列包含与SEQ ID NO:13所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项15:根据项9-14任一项所述的重组核酸,其特征在于,由所述重组核酸转录产生的包含所述线粒体蛋白编码序列的mRNA的表达量比缺乏所述聚腺苷酸尾序列的对照重组核酸的mRNA的表达量高;优选地,比所述对照重组核酸的mRNA的表达量高至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少150%、至少200%、或至少300%。
项16:根据项15所述的重组核酸,其特征在于,所述对照重组核酸在所述聚腺苷酸尾序列的位置上由包含SEQ ID NO:172的序列取代;优选地,所述重组核酸转录产生的mRNA的表达量比所述对照重组核酸产生的mRNA的表达量高至少10%、至少15%、或至少20%。
项17:根据项9-16任一项所述的重组核酸,其特征在于,由所述重组核酸翻译产生的所述线粒体蛋白的表达量比缺乏所述聚腺苷酸尾序列的对照重组核酸的所述线粒体蛋白的表达量高;优选地,比所述对照重组核酸的所述线粒体蛋白的表达量高至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少150%、至少200%、或至少300%。
项18:根据项17所述的重组核酸,其特征在于,所述对照重组核酸在所述聚腺苷酸尾序列的位置上由包含SEQ ID NO:172的序列取代;优选地,所述重组核酸翻译产生的所述线粒体蛋白的表达量比所述对照重组核酸产生的所述线粒体蛋白的表达量高至少10%、至少15%、或至少20%。
项19:根据项9-18任一项所述的重组核酸,其特征在于,所述聚腺苷酸尾序列的长度不多于122个碱基对、不多于125个碱基对、不多于130个碱基对、不多于140个碱基对、不多于150个碱基对、不多于160个碱基对、不多于170个碱基对、不多于180个碱基对、不多于190个碱基对、或不多于200个碱基对。
项20:根据项13-19任一项所述的重组核酸,其特征在于,还包括Kozak序列,所述Kozak序列置于所述线粒体靶向序列的5’端前;可选地,所述Kozak序列为SEQ ID NO:171;可选地,所述Kozak序列与所述线粒体靶向序列之间无多余的核苷酸。
项21:根据项13-20任一项所述的重组核酸,其特征在于,所述3’UTR序列和所述聚腺苷酸尾序列之间包含与SEQ ID NO:185所示的间隔序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%相同的序列。
项22:一种重组核酸,包括(由5’端至3’端依次排列):
Kozak序列,线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列,其特征在于:
所述Kozak序列为SEQ ID NO:171;
所述3’UTR序列包含与SEQ ID NO:13所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列;
所述Kozak序列与所述线粒体靶向序列之间无多余的核苷酸。
项23:根据项22所述的重组核酸,其特征在于,还包括聚腺苷酸尾序列,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ ID NO:172或173所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项24:根据项13-23任一项所述的重组核酸,其特征在于,还包括内含子序列;可选地,所述内含子序列置于所述Kozak序列的5’端前;可选地,所述内含子序列包含与SEQ IDNO:170所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项25:根据项13-24任一项所述的重组核酸,其特征在于,还包括启动子序列;可选地,所述启动子序列包含与SEQ ID NO:169所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项26:根据项25所述的重组核酸,其特征在于,所述启动子序列置于所述内含子序列的5’端前。
项27:一种重组核酸,包括(由5’端至3’端依次排列):
启动子序列、内含子序列、Kozak序列、线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列;
所述内含子序列包含与SEQ ID NO:170所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列;
可选的,所述序列还包括3’UTR序列;可选的,所述序列还包括聚腺苷酸尾序列。
项28:如项13-27任一项所述的重组核酸,其特征在于,还包括第一末端反向重复(ITR)序列和第二ITR序列;可选地,所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO:178所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述第二ITR序列包含与SEQ ID NO:179所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项29:根据项13-28任一项所述的重组核酸,其特征在于,所述线粒体蛋白编码序列与所述3’UTR序列之间无多余的核苷酸。
项30:根据项13-29任一项所述的重组核酸,其特征在于,
所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:1所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列;和/或
所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项31:根据项13-30任一项所述的重组核酸,其特征在于,所述线粒体靶向序列与所述线粒体蛋白编码序列之间无多余的核苷酸。
项32:根据项1-31任一项所述的重组核酸,包含(由5’端至3’端依次排列):第一ITR序列、启动子序列、内含子序列、Kozak序列、线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列、聚腺苷酸尾序列,第二ITR序列;
优选地,所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO:178所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述启动子序列包含与SEQID NO:169所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述内含子序列包含与SEQ ID NO:170所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述Kozak序列为SEQ IDNO:171,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:1所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述3’UTR序列包含与SEQ ID NO:13所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ ID NO:173所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述第二ITR序列包含与SEQ ID NO:179所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项33:根据项1-32任一项所述的重组核酸,包含(由5’端至3’端依次排列):第一ITR序列,启动子序列,内含子序列,Kozak序列,线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列、聚腺苷酸尾序列,第二ITR序列;
优选地,所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO:178所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述启动子序列包含与SEQ ID NO:169所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述内含子序列包含与SEQ ID NO:170所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述Kozak序列为SEQ ID NO:171,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:1所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述3’UTR序列包含与SEQ ID NO:13所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ ID NO:173所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述第二ITR序列包含与SEQ ID NO:179所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列。
项34:根据项1-33任一项所述的重组核酸,包含(由5’端至3’端依次排列):第一ITR序列、启动子序列、内含子序列、Kozak序列、线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列、聚腺苷酸尾序列、第二ITR序列;
优选地,所述第一ITR序列包含SEQ ID NO:178所示的序列,所述启动子序列包含SEQ ID NO:169所示的序列,所述内含子序列包含SEQ ID NO:170所示的序列,所述Kozak序列为SEQ ID NO:171,所述线粒体靶向序列包含SEQ ID NO:1所示的序列,所述线粒体蛋白编码序列包含SEQ ID NO:6所示的序列,所述3’UTR序列包含SEQ ID NO:13所示的序列,所述聚腺苷酸尾序列包含SEQ ID NO:173所示的序列,所述第二ITR序列包含SEQ ID NO:179所示的序列。
项35:根据项13-34任一项所述的重组核酸,其特征在于,包含与SEQ ID NO:174-176、180所示的任一条序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
项36:根据项13-34任一项所述的重组核酸,其特征在于,包含与SEQ ID NO:180至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列;优选地,包含与SEQ ID NO:180相同的序列。
项37:一种病毒载体,其包含项1-36中任一项所述的重组核酸。
项38:根据项37所述的病毒载体,其特征在于,所述病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。
项39:根据项38所述的病毒载体,其特征在于,所述rAAV载体是rAAV2载体。
项40:一种药物组合物,其包含项1-36任一项所述的重组核酸。
项41:一种药物组合物,其包含一种病毒载体,所述病毒载体包含项1-36任一项所述的重组核酸。
项42:根据项41所述的药物组合物,其特征在于,所述病毒载体为腺相关病毒(AAV)载体。
项43:根据项40-42任一项所述的药物组合物,其进一步包含其药学上可接受的赋形剂。
项44:根据项43所述的药物组合物,其特征在于,所述药学上可接受的赋形剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)、α,α-海藻糖脱水物、L-组氨酸盐酸盐一水合物、聚山梨酯20、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4、泊洛沙姆188或其任意组合。
项45:根据项43所述的药物组合物,其特征在于,所述药学上可接受的赋形剂选自于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、α,α-海藻糖脱水物、L-组氨酸盐酸盐一水合物、聚山梨酯20、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4、泊洛沙姆188或其任意组合。
项46:根据项43-45任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述药学上可接受的赋形剂包括泊洛沙姆188。
项47:根据项46所述的药物组合物,其特征在于,所述药学上可接受的赋形剂包含0.0001%-0.01%泊洛沙姆188。
项48:根据项46所述的药物组合物,其特征在于,所述药学上可接受的赋形剂包含0.001%泊洛沙姆188。
项49:根据项46-48任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述药学上可接受的赋形剂还包含一种或多种盐。
项50:根据项49所述的药物组合物,其特征在于,所述一种或多种盐包括NaCl、Na2HPO4和KH2PO4。
项51:根据项50所述的药物组合物,其特征在于,
a)所述NaCl的浓度为5-15mg/mL;优选的,所述NaCl的浓度为9mg/mL;
b)所述KH2PO4的浓度为0.1-0.5mg/mL;优选的,所述KH2PO4的浓度为0.144mg/mL;和/或
c)所述Na2HPO4的浓度为0.5-1mg/mL;优选的,所述Na2HPO4的浓度为0.795mg/mL。
项52:根据项40-51任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物的pH为7.2-7.4。
项53:根据项52所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物的pH为7.3。
项54:根据项40-53任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物的病毒滴度为至少1.0×1010vg/mL、至少3.0×1010vg/mL、至少6.0×1010vg/mL。
项55:根据项54所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物的病毒滴度为至少9.0×1010vg/mL。
项56:根据项40-55任一项所述的药物组合物,当所述药物组合物经过五个冷冻/解冻循环后,与所述五个冷冻/解冻循环之前的病毒效价相比,所述药物组合物保留了至少60%的病毒滴度。
项57:一种根据项40-56任一项所述的药物组合物在制备用于治疗眼部疾病的药物中的用途。
项58:一种治疗眼部疾病的方法,包含向患者施用有效剂量的根据项40-56任一项所述的药物组合物。
项59:根据项57所述的用途或项58所述的方法,其特征在于,所述眼部疾病是莱伯氏遗传性视神经病变(LHON)。
项60:根据项57-59任一项所述的用途或方法,其特征在于,通过眼内或玻璃体内注射来施用所述药物组合物。
项61:根据项60所述的用途或方法,其特征在于,所述药物组合物通过玻璃体内注射给药。
项62:根据项57-61任一项所述的用途或方法,其特征在于,在每个眼中施用0.01-0.1mL的所述药物组合物。
项63:根据项62所述的用途或方法,其特征在于,在每个眼中施用0.045-0.055mL的所述药物组合物。
项64:根据项57-63任一项所述的用途或方法,其特征在于,在每个眼中施用至少1.5×109vg剂量的腺相关病毒;优选地,施用至少3.0×109vg剂量的腺相关病毒。
项65:根据项57-63任一项所述的用途或方法,其特征在于,在每个眼中施用至少4.5×109vg剂量的腺相关病毒。
项66:根据项57-65任一项所述的用途或方法,进一步包括对患者施用皮质类固醇。
项67:根据项66所述的用途或方法,其特征在于,所述皮质类固醇包含泼尼松或甲基泼尼松。
项68:根据项67所述的用途或方法,其特征在于,所述皮质类固醇为泼尼松。
项69:根据项66-68任一项所述的用途或方法,其特征在于,在施用所述药物组合物之前大约2天开始施用所述皮质类固醇。
项70:根据项66-69任一项所述的用途或方法,其特征在于,口服所述皮质类固醇。
项71:根据项66-70任一项所述的用途或方法,其特征在于,在开始施用所述皮质类固醇后,持续施用大约28天。
项72:根据项66-71任一项所述的用途或方法,其特征在于,在开始施用所述类固醇后,每天施用,并且每次持续一周施用后减少施用剂量。
项73:根据项66-72任一项所述的用途或方法,其特征在于,所述皮质类固醇的用量为:在开始施用时,每日给药40mg,持续一周,然后每日给药30mg,持续一周,然后每日给药20mg,持续一周,然后每日给药10mg,持续一周。
项74:根据项57-73任一项所述的用途或方法,进一步包括对患者施用磷酸肌酸钠。
项75:根据项74所述的用途或方法,其特征在于,所述磷酸肌酸钠是通过静脉注射给药的。
项76:根据项57-75任一项所述的用途或方法,其特征在于,与没有施用含有所述重组核酸的药物组合物相比,施用所述药物组合物产生更高的平均视力恢复水平。
实施例
由以下示例性实施方案进一步描述本发明。应当理解的是,这些实施例仅旨在说明本发明,而不是限制本发明的范围。除另指出外,下面的实施例中可采用例如sambrook等人,molecular cloning:alaboratory manual(New York:cold spring harborlaboratory press,1989)中公开的方法和条件或制造商推荐的条件。
实施例1ND4质粒构建和优化
一、质粒构建制备
将线粒体靶向序列(MTS)COX10(SEQ ID NO:1)和人ND4的编码序列(SEQ ID NO:6),3’UTR序列(SEQ ID NO:13)相连接,在终止子前加入FLAG标记肽,在5’端添加CMV启动子(SEQ ID NO:169)和内含子chimeric intron(SEQ ID NO:170),在3’端连接bGH(SEQ IDNO:172)或SV40(SEQ ID NO:173)聚腺苷酸尾(或不连接聚腺苷酸尾),插入AAV2质粒骨架得到:pAAV-CMV-ND4-3’Flag-COX10UTR质粒A(图3;SEQ ID NO:174)、pAAV-CMV-ND4-3’Flag-COX10UTR-bGH质粒B(图2;SEQ ID NO:175)和pAAV-CMV-ND4-3’Flag-COX10UTR-SV40质粒C(图1;SEQ ID NO:176)。连接产物转化大肠杆菌,挑取单菌落进行酶切验证与测序验证。
二、质粒转染细胞
1、转染前一天,胰酶消化HEK293T细胞并计数,细胞铺板,使其在转染当天汇聚度达到70%-80%。
2、对于每孔细胞,使用125μl无血清DMEM培养基稀释2.0μg质粒DNA;使用125μlDMEM培养基稀释6μl PEI(1μg/μl)试剂。
3、混合稀释的DNA和稀释的PEI,在室温保温20分钟。
4、直接将上述复合物加入到每孔中,摇动培养板,轻轻混匀。
5、在37℃,5%的CO2中培养48小时。
6、弃掉培养基后用PBS冲洗,胰酶消化后离心收集细胞待用。
三、qPCR测定mRNA含量
1、总RNA抽提(试剂盒提取)
1)在培养板中加入裂解液RZ裂解细胞,每10cm2面积加1ml RZ,用取样器抽打若干次至溶液透明,15-30℃放置5min,使得核酸蛋白复合物完全分离。
2)加入200μl氯仿,盖好管盖,剧烈振荡15sec,室温放置3min,4℃12,000rpm(~13,400×g)离心10min,样品会分成三层:黄色的有机相,中间层和无色的水相,RNA主要在水相中,水相的体积约为所用裂解液RZ试剂的50%。把水相转移到新管中,进行下一步操作。
3)缓慢加入0.5倍体积无水乙醇,混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中,4℃12,000rpm(~13,400×g)离心30sec,若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱CR3,请分两次转入吸附柱CR3中,4℃12,000rpm(~13,400×g)离心30sec,弃掉收集管中的废液。
4)向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD,4℃12,000rpm(~13,400×g)离心30sec,弃废液,将CR3放入收集管中。
5)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW,室温静置2min,4℃12,000rpm(~13,400×g)离心30sec,弃废液,重复操作一次。
6)将吸附柱放入2ml收集管中,4℃12,000rpm(~13,400×g)离心2min,去除残余液体。
7)将吸附柱CR3转入一个新的1.5ml离心管中,加30-100μl RNase-Free ddH2O,室温放置2min,4℃12,000rpm(~13,400×g)离心2min。
8)超微量紫外分光光度计测定RNA的浓度。
2、反转录
1)取一PCR管,加入含2μg RNA的溶液,加入5×FastKing-RT SuperMix 4μl;用无核糖核酸酶的去离子水补足至20μl。
2)于PCR仪上42℃保温15min,结束后95℃保温3min灭活反转录酶。
3、定量PCR
1)取0.2ml PCR管,配制如下反应体系,每个反转录产物配制3管。2×qPCR Mix 10μl;Rox 0.4μl;10μM基因引物1μl;反转录产物2.0μl;ddH2O 5.6μl。
靶基因flag扩增引物:
正向引物5’-AGACCATGACGGTGAT-3’(SEQ ID NO:181)
反向引物5’-CTTGTCATCGTCATCCT-3’(SEQ ID NO:182)
内参基因actin扩增引物:
正向引物5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’(SEQ ID NO:183)
反向引物5’-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3’(SEQ ID NO:184)
2)PCR扩增:
预变性95℃,30s,
40个循环95℃,5s→55℃,30s→72℃,30s,
溶解曲线55℃→95℃,每10s升温0.5℃。
3)结果处理ΔΔCT法:A=CT(目的基因,待测样本)-CT(内标基因,待测样本);B=CT(目的基因,对照样本)-CT(内标基因,对照样本);K=A-B;表达倍数=2-K。
四、实验结果及讨论
从mRNA水平检测了ND4的表达情况,结果发现:质粒B pAAV2-CMV-rND4-COX10UTR-bGHPolyA和质粒C pAAV2-CMV-rND4-COX10UTR-SV40相比于质粒A pAAV2-CMV-rND4-COX10UTR大幅提升了ND4 mRNA在HEK293细胞中的丰度(图4),并且质粒C较好于质粒B。以上结果说明通过密码子优化和添加不同组合的转录后调控元件,可在细胞中获得表达更多的ND4蛋白,而以SV40 polyA作为聚腺苷酸尾的效果较好。
实施例2病毒包装和生产
1、聚合度90%以上的HEK293T细胞按1:3比例传盘。
2、转质粒前1~2h左右,换成无血清培养基,用转染试剂将目的基因质粒和辅助质粒转入HEK293T中。
3、质粒转化24h后,换新的无血清培养基。
4、转染72h收毒。带着培养基,吹下细胞,离心;然后分别收获培养基上清与细胞沉淀。用PEG8000沉淀培养基上清中的病毒,沉淀过夜后收集病毒沉淀。
5、将病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度离心进行纯化,然后用超滤管进行浓缩。
实施例3配方开发
3.1主要成分安全性研究
注射液的辅料包括无水磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化钠、注射用水、泊洛沙姆188。其中无水磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化钠、注射用水作为传统眼用注射溶液处方PBS的组成部分,其实用性和安全性已被证实。
有资料显示,AAV2病毒颗粒溶解度有限,在较高浓度和反复冻融条件下易发生聚集。此外,AAV病毒颗粒对容器表面有较强的吸附作用。因此,申请人在注射液中加入泊洛沙姆188,使注射液维持比较稳定的状态。
配制以下样品:PBS+0.01%泊洛沙姆188+10mg/mL碘克沙醇;PBS+0.01%泊洛沙姆188;PBS+10mg/mL碘克沙醇;PBS+0.001%泊洛沙姆188+1mg/mL碘克沙醇;PBS+0.001%泊洛沙姆188。将样品通过玻璃体腔注射进新西兰兔眼内。分组见下方表2。
表2:分组设计
对注射后的新西兰兔进行临床观察、眼压检测、一般眼科检查,并于试验第22天对试验用新西兰兔进行安乐死、大体解剖和组织病理观察。
(1)临床观察结果:试验期间,所有动物未见除眼部症状以外的全身异常临床表现。
(2)眼压:试验的第22天,与注射操作组相比,PBS+10mg/mL碘克沙醇中雌性动物左眼眼压明显下降(p≤0.05),其余时间点,同性别同眼别内各供试品组合注射操作组的眼压无统计学差异。以上差异无明显的时间反应关系,具有偶发性,与供试品无关。
(3)一般眼科检查:
结膜:
给药后第一天,大部分动物左眼均出现微球结膜充血,在第八天完全恢复。球结膜充血可见于注射操作组,且与样品无剂量关系,因此考虑与注射操作有关,与供试品无关。
第2、3、6组雌性动物观察到左眼轻微结膜水肿,发生率均为1/3眼,在第四天完全恢复。结膜水肿发生率低,无明显剂量反应关系,与供试品无关。
晶状体、玻璃体:
第4组一只雄性动物在D8-D22左眼观察到前部玻璃体内大小一致的灰白色点状颗粒,第5组一只雌性动物在D8-D22左眼观察到晶状体前囊灰白色点状颗粒沉着物和前部玻璃体内大小一致的灰白色点状颗粒,成都均为轻微,以上异常发生率低,无明显的时间/剂量反应关系,与供试品无关。
(4)大体解剖和组织病理:
实验第22天安乐死,注射操作组合各供试品组个别动物的左侧和/或右侧眼球可见轻微角膜缘散在性炎细胞浸润。由于该病变在注射操作组动物也可见,且在个别动物未给药的右侧眼球也可见,因此考虑其可能为试验动物的背景性或自发性病变,与所给供试品不相关。
显微镜观察所有动物的眼球均未见其它明显异常病理改变。
结论:PBS+0.01%泊洛沙姆188+10mg/mL碘克沙醇、PBS+0.01%泊洛沙姆188、PBS+10mg/mL碘克沙醇、PBS+0.001%泊洛沙姆188+1mg/mL碘克沙醇、PBS+0.001%泊洛沙姆188(50uL/眼)单次玻璃体腔注射给与新西兰兔,均未见供试品相关的眼部毒性反应。
证明0.01%泊洛沙姆188辅料用于眼内注射溶液是安全的。
3.2配方稳定性研究
具体的处方设计如表3所示。
表3:处方设计
按以上处方进行生产,并检测产品的稳定性,处方稳定性实验方案如表4、表5所示。
表4:处方稳定性实验方案
储存条件 | 样品总量/规格 | 检测时间点 |
2-8℃ | 20支;0.2mL/支 | 0天、1天、5天 |
分别在0天、1天、5天检测处方1和处方2中的病毒基因组滴度,以此来比较处方稳定性。
表5:处方稳定性冻融实验方案
分别在冻融0次、冻融1次、冻融2次、冻融3次、冻融4次、冻融5次检测处方1和处方2中的病毒基因组滴度,以此来比较处方稳定性。
按以上两个方案开展处方稳定性研究,结果如图5(2-8℃处方稳定性实验结果)和图6(处方稳定性冻融实验结果)所示。
表6:处方稳定性实验病毒基因组滴度检验结果(vg/mL)
如表6所示,储存于2-8℃处方稳定性实验中,处方1病毒基因组滴度有明细下降趋势,处方2中未有显著变化,并且处方1病毒基因组滴度的RSD为153.67%,处方2病毒基因组滴度的RSD为14.39%,因此处方2比处方1稳定。
表7:处方稳定性冻融实验病毒基因组滴度检验结果(vg/mL)
处方 | 0次 | 1次 | 2次 | 3次 | 4次 | 5次 |
处方1 | 1.13×1010 | 4.62×109 | 2.25×109 | 1.25×109 | 1.01×109 | 9.48×108 |
处方2 | 4.72×1010 | 5.48×1010 | 5.33×1010 | 5.33×1010 | 4.94×1010 | 4.08×1010 |
如表7所示,在冻融试验中,处方1病毒基因组滴度有较为明显的下降趋势,处方2中未有显著变化,并且处方1病毒基因组的RSD为113.25%,处方2病毒基因组滴度的RSD为10.53%,因此处方2比处方1稳定。
综上,加入泊洛沙姆188的处方相比于未加入泊洛沙姆188的处方更加稳定。
实施例4评估基因治疗ND4突变相关的Leber遗传性视神经病变(LHON)的安全性和有效性的1/2/3期、单臂、多中心、二阶段的临床研究。
本研究是一项1/2/3期、单臂、多中心、二阶段的临床研究,旨在评价NR082眼用注射液在ND4突变相关LHON受试者中的安全性和有效性。入院后,符合入选标准的所有受试者将接受研究药物治疗和全身免疫调节方案,即口服规定剂量的皮质类固醇(泼尼松)治疗28天,以预防或减少与NR082眼用注射液IVT注射相关的眼部炎症和可能的免疫反应。具体的泼尼松给药方案为:从受试者注射治疗前2天开始,每日给药40mg,持续一周,然后每日给药30mg,持续一周,然后每日给药20mg,持续一周,然后每日给药10mg,持续一周,然后停药。
每例受试者的研究持续时间为包括筛选期,52(±4)周随访期和4年长期安全性随访。研究将包括以下访视:
筛选期(第-42天至第-2天)
住院:入组(第-2天)
住院:治疗(第1天)
住院:安全观察(第2天至第8天)
访视1-访视6:随访(第2周(第15天)至第52周)
访视7-访视14:长期随访及研究结束(每6个月一次,共4年)
治疗组和持续时间:
每例受试者的最长研究持续时间为52(±4)周和4年的长期随访,包括筛选期。
使用的剂量:
1.5×109vg,0.05mL眼/剂(低剂量)
4.5×109vg,0.05mL眼/剂(高剂量)
主要疗效分析
主要疗效终点是治疗后52(±4)周注射眼的BCVA与基线相比改善≥0.3LogMAR的受试者比例。
次要疗效分析
将按照治疗剂量组和访视(如适用),通过分类变量的描述性统计(受试者计数和相关百分比),总结注射眼的BCVA与基线相比改善≥0.3LogMAR的受试者比例(%)。按访视(如适用)计算以上反应变量的精确Clopper-Pearson 95%CI或基于正态近似法计算CI(如适用)。
表8次要疗效分析-最佳矫正视力(BCVA)较基线改善≥0.3LogMAR的受试者比例(%)全分析集(FAS)
百分比以全分析集(FAS)的受试者人数为分母计算得出。
95%置信区间将通过Clopper-Pearson方法估计。
n:例数;95%CI:95%置信区间。
如表8所示,最佳矫正视力(BCVA)较基线改善≥0.3LogMAR的受试者为,低剂量组在第2周、第6周、第12周分别为1例(16.7%)、1例(16.7%)、2例(33.3%),高剂量组在第2周、第6周、第12周分别为4例(66.7%)、4例(66.7%)、4例(66.7%)。
将按照治疗剂量组和访视(如适用),通过连续变量的描述性统计(观察次数[n]、平均值、标准差[SD]、中位数、最小值[min]和最大值[max]),总结注射眼的BCVA(LogMAR)较基线的变化,以及注射眼BCVA与最低值相比的改善;总结注射眼和非注射眼相较于基线的视野参数(视野指数、平均视野缺损值和模式标准偏差值)、对比敏感度参数、视觉诱发电位(VEP)波形参数的变化。
表9次要疗效分析-研究眼的BCVA(LogMAR)较基线的平均变化全分析集(FAS)
BCVA:最佳矫正视力。
n:例数;Mean:均数;SD:标准差;Median:中位数;Min:最小值;Max:最大值。
如表9所示,低剂量组的BCVA在第2周、第6周、第12周较基线的平均值分别提高了0.080LogMAR、0.103LogMAR、0.245LogMAR,高剂量的BCVA组在第2周、第6周、第12周分别提高了0.367LogMAR、0.338LogMAR、0.408LogMAR。
表10次要疗效分析-视野功能参数较基线的平均变化
全分析集(FAS)
视野指数(%)
n:例数;Mean:均数;SD:标准差;Median:中位数;Min:最小值;Max:最大值。
如表10所示,视野指数较基线的平均变化情况为,低剂量组在第2周、第6周、第12周分别提高了6.2%、4.2%、6.7%,高剂量组在第2周、第6周、第12周分别提高了1.0%、12.2%、13.5%。
表11次要疗效分析-视野功能参数较基线的平均变化
全分析集(FAS)
平均视野缺损值变化(dB)
n:例数;Mean:均数;SD:标准差;Median:中位数;Min:最小值;Max:最大值。
如表11所示,平均视野缺损值变化较基线的平均变化情况为,低剂量组在第2周、第6周、第12周分别提高了2.373dB、1.507dB、2.450dB,高剂量组在第2周、第6周、第12周分别提高了0.688dB、4.413dB、5.130dB。
虽然本文示出并描述了本发明优选的实施方案,但对于本领域技术人员来说显而易见的是,这类实施方案仅是作为示例提供的。本领域技术人员在不偏离本发明的情况下将会设想许多变动、更改和替换。应当理解的是,在实施本发明时可采用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本发明的范围,并且由此涵盖这些权利要求及其等同表述的范围内的方法和结构。
以引用的方式并入
本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请出于所有目的以全文引用的方式并入。然而,提及本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请并不被且不应被视为承认或以任何形式暗示它们在世界上任何国家构成有效的现有技术或构成公知常识的一部分。
Claims (68)
1.一种重组核酸,包含(由5’端至3’端依次排列)线粒体靶向序列和线粒体蛋白编码序列;可选地,所述线粒体编码蛋白编码ND4蛋白;可选地,所述ND4蛋白包含与SEQ ID NO:160至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组核酸,其特征在于,包含与SEQ ID NO:180和174-176所示的任一条序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组核酸,其特征在于,包含与SEQ ID NO:180至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的重组核酸,其特征在于,包含SEQ ID NO:180所示的序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的重组核酸,其特征在于,包括Kozak序列,所述Kozak序列置于所述线粒体靶向序列的5’端前;可选地,所述Kozak序列为SEQ ID NO:171;可选地,所述Kozak序列与所述线粒体靶向序列之间无多余的核苷酸。
6.根据权利要求1-5任一项所述的重组核酸,其特征在于,包括内含子序列;可选地,所述内含子序列置于所述线粒体靶向序列的5’端前;可选地,所述内含子序列置于所述Kozak序列的5’端前;可选地,所述内含子序列包含与SEQ ID NO:170所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
7.根据权利要求1-6任一项所述的重组核酸,其特征在于,包括启动子序列;可选地,所述启动子序列置于所述线粒体靶向序列、所述Kozak序列、和/或所述内含子序列的5’端前;可选地,所述启动子序列包含与SEQ ID NO:169所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
8.根据权利要求1-7任一项所述的重组核酸,其特征在于,包括3’UTR序列;可选地,所述3’UTR序列置于所述线粒体蛋白编码序列的3’端后;可选地,所述3’UTR序列包含与SEQID NO:13所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
9.根据权利要求1-8任一项所述的重组核酸,其特征在于,包括聚腺苷酸尾序列;可选地,所述聚腺苷酸尾序列置于所述线粒体蛋白编码序列和/或所述3’UTR序列的3’端后;可选地,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ ID NO:172或173所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列;可选地,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ ID NO:173所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
10.根据权利要求1-9任一项所述的重组核酸,其特征在于,所述3’UTR序列和所述聚腺苷酸尾序列之间包含与SEQ ID NO:185所示的间隔序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%相同的序列。
11.根据权利要求1-10任一项所述的重组核酸,其特征在于,
所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:1所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列;和/或
所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
12.根据权利要求1-11任一项所述的重组核酸,其特征在于,还包括第一末端反向重复(ITR)序列和第二ITR序列;可选地,所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO:178所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述第二ITR序列包含与SEQ ID NO:179所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
13.一种重组核酸,包含(由5’端至3’端依次排列):
线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列、聚腺苷酸尾序列;
其中,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ ID NO:173所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
14.根据权利要求13所述的重组核酸,其特征在于,所述3’UTR序列包含与SEQ ID NO:13所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
15.根据权利要求13或14所述的重组核酸,其特征在于,还包括Kozak序列,所述Kozak序列置于所述线粒体靶向序列的5’端前;可选地,所述Kozak序列为SEQ ID NO:171;可选地,所述Kozak序列与所述线粒体靶向序列之间无多余的核苷酸。
16.根据权利要求13-15任一项所述的重组核酸,其特征在于,所述3’UTR序列和所述聚腺苷酸尾序列之间包含与SEQ ID NO:185所示的间隔序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%相同的序列。
17.一种重组核酸,包括(由5’端至3’端依次排列):
Kozak序列、线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列,其特征在于:
所述Kozak序列为SEQ ID NO:171;
所述3’UTR序列包含与SEQ ID NO:13所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列;
所述Kozak序列与所述线粒体靶向序列之间无多余的核苷酸。
18.根据权利要求17所述的重组核酸,其特征在于,还包括聚腺苷酸尾序列,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ ID NO:172或173所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
19.根据权利要求13-18任一项所述的重组核酸,其特征在于,还包括内含子序列;可选地,所述内含子序列置于所述Kozak序列的5’端前;可选地,所述内含子序列包含与SEQ IDNO:170所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
20.根据权利要求13-19任一项所述的重组核酸,其特征在于,还包括启动子序列;可选地,所述启动子序列包含与SEQ ID NO:169所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
21.根据权利要求20所述的重组核酸,其特征在于,所述启动子序列置于所述内含子序列的5’端前。
22.一种重组核酸,包括(由5’端至3’端依次排列):
启动子序列、内含子序列、Kozak序列、线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列;
所述内含子序列包含与SEQ ID NO:170所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列;
可选的,所述序列还包括3’UTR序列;可选的,所述序列还包括聚腺苷酸尾序列。
23.如权利要求13-22任一项所述的重组核酸,其特征在于,还包括第一末端反向重复(ITR)序列和第二ITR序列;可选地,所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO:178所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述第二ITR序列包含与SEQ ID NO:179所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
24.根据权利要求13-23任一项所述的重组核酸,其特征在于,所述线粒体蛋白编码序列与所述3’UTR序列之间无多余的核苷酸。
25.根据权利要求13-24任一项所述的重组核酸,其特征在于,
所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:1所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列;和/或
所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
26.根据权利要求13-25任一项所述的重组核酸,其特征在于,所述线粒体靶向序列与所述线粒体蛋白编码序列之间无多余的核苷酸。
27.根据权利要求1-26任一项所述的重组核酸,包含(由5’端至3’端依次排列):第一ITR序列、启动子序列、内含子序列、Kozak序列、线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列、聚腺苷酸尾序列、第二ITR序列;
优选地,所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO:178所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述启动子序列包含与SEQ IDNO:169所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述内含子序列包含与SEQ ID NO:170所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述Kozak序列为SEQ ID NO:171,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:1所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQID NO:6所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述3’UTR序列包含与SEQ ID NO:13所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQID NO:173所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列,所述第二ITR序列包含与SEQ ID NO:179所示的序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
28.根据权利要求1-26任一项所述的重组核酸,包含(由5’端至3’端依次排列):第一ITR序列、启动子序列、内含子序列、Kozak序列、线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列、聚腺苷酸尾序列、第二ITR序列;
优选地,所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO:178所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述启动子序列包含与SEQ ID NO:169所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述内含子序列包含与SEQ ID NO:170所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述Kozak序列为SEQ ID NO:171,所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:1所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述3’UTR序列包含与SEQ ID NO:13所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述聚腺苷酸尾序列包含与SEQ ID NO:173所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列,所述第二ITR序列包含与SEQ ID NO:179所示的序列至少99%、至少99.5%或100%相同的序列。
29.根据权利要求1-26任一项所述的重组核酸,包含(由5’端至3’端依次排列):第一ITR序列、启动子序列、内含子序列、Kozak序列、线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列、3’UTR序列、聚腺苷酸尾序列、第二ITR序列;
优选地,所述第一ITR序列包含SEQ ID NO:178所示的序列,所述启动子序列包含SEQID NO:169所示的序列,所述内含子序列包含SEQ ID NO:170所示的序列,所述Kozak序列为SEQ ID NO:171,所述线粒体靶向序列包含SEQ ID NO:1所示的序列,所述线粒体蛋白编码序列包含SEQ ID NO:6所示的序列,所述3’UTR序列包含SEQ ID NO:13所示的序列,所述聚腺苷酸尾序列包含SEQ ID NO:173所示的序列,所述第二ITR序列包含SEQ ID NO:179所示的序列。
30.根据权利要求13-29任一项所述的重组核酸,其特征在于,包含与SEQ ID NO:174-176、180所示的任一条序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
31.根据权利要求13-29任一项所述的重组核酸,其特征在于,包含与SEQ ID NO:180至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。
32.一种病毒载体,其包含权利要求1-31中任一项所述的重组核酸。
33.根据权利要求32所述的病毒载体,其特征在于,所述病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。
34.根据权利要求33所述的病毒载体,其特征在于,所述rAAV载体是rAAV2载体。
35.一种药物组合物,其包含腺相关病毒(AAV),所述腺相关病毒包含权利要求1-31任一项所述的重组核酸。
36.根据权利要求35所述的药物组合物,其进一步包含其药学上可接受的赋形剂。
37.根据权利要求36所述的药物组合物,其特征在于,所述药学上可接受的赋形剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)、α,α-海藻糖脱水物、L-组氨酸盐酸盐一水合物、聚山梨酯20、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4、泊洛沙姆188或其任意组合。
38.根据权利要求36所述的药物组合物,其特征在于,所述药学上可接受的赋形剂选自于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、α,α-海藻糖脱水物、L-组氨酸盐酸盐一水合物、聚山梨酯20、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4、泊洛沙姆188或其任意组合。
39.根据权利要求36-38任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述药学上可接受的赋形剂包括泊洛沙姆188。
40.根据权利要求39所述的药物组合物,其特征在于,所述药学上可接受的赋形剂包含0.0001%-0.01%泊洛沙姆188。
41.根据权利要求39所述的药物组合物,其特征在于,所述药学上可接受的赋形剂包含0.001%泊洛沙姆188。
42.根据权利要求39-41任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述药学上可接受的赋形剂还包含一种或多种盐。
43.根据权利要求42所述的药物组合物,其特征在于,所述一种或多种盐包括NaCl、Na2HPO4和KH2PO4。
44.根据权利要求43所述的药物组合物,其特征在于,
a)所述NaCl的浓度为5-15mg/mL;优选的,所述NaCl的浓度为9mg/mL;
b)所述KH2PO4的浓度为0.1-0.5mg/mL;优选的,所述KH2PO4的浓度为0.144mg/mL;和/或
c)所述Na2HPO4的浓度为0.5-1mg/mL;优选的,所述Na2HPO4的浓度为0.795mg/mL。
45.根据权利要求35-44任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物的pH为7.2-7.4。
46.根据权利要求45所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物的pH为7.3。
47.根据权利要求35-46任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物的病毒滴度为至少1.0×1010vg/mL、至少3.0×1010vg/mL、至少6.0×1010vg/mL。
48.根据权利要求47所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物的病毒滴度为至少9.0×1010vg/mL。
49.根据权利要求35-48任一项所述的药物组合物,当所述药物组合物经过五个冷冻/解冻循环后,与所述五个冷冻/解冻循环之前的病毒效价相比,所述药物组合物保留了至少60%的病毒滴度。
50.一种根据权利要求35-49任一项所述的药物组合物在制备用于治疗眼部疾病的药物中的用途。
51.根据权利要求50所述的用途,其特征在于,所述眼部疾病是莱伯氏遗传性视神经病变(LHON)。
52.根据权利要求50或51所述的用途,其特征在于,通过眼内或玻璃体内注射来施用所述药物组合物。
53.根据权利要求52所述的用途,其特征在于,所述药物组合物通过玻璃体内注射给药。
54.根据权利要求50-53任一项所述的用途,其特征在于,在每个眼中施用0.01-0.1mL的所述药物组合物。
55.根据权利要求54所述的用途,其特征在于,在每个眼中施用0.045-0.055mL的所述药物组合物。
56.根据权利要求50-55任一项所述的用途,其特征在于,在每个眼中施用至少1.5×109vg剂量的腺相关病毒;优选地,施用至少3.0×109vg剂量的腺相关病毒。
57.根据权利要求50-55任一项所述的用途,其特征在于,在每个眼中施用至少4.5×109vg剂量的腺相关病毒。
58.根据权利要求50-57任一项所述的用途,进一步包括对患者施用皮质类固醇。
59.根据权利要求58所述的用途,其特征在于,所述皮质类固醇包含泼尼松或甲基泼尼松。
60.根据权利要求59所述的用途,其特征在于,所述皮质类固醇为泼尼松。
61.根据权利要求58-60任一项所述的用途,其特征在于,在施用所述药物组合物之前大约2天开始施用所述皮质类固醇。
62.根据权利要求58-61任一项所述的用途,其特征在于,口服所述皮质类固醇。
63.根据权利要求58-62任一项所述的用途,其特征在于,在开始施用所述皮质类固醇后,持续施用大约28天。
64.根据权利要求58-63任一项所述的用途,其特征在于,在开始施用所述类固醇后,每天施用,并且每次持续一周施用后减少施用剂量。
65.根据权利要求58-64任一项所述的用途,其特征在于,所述皮质类固醇的用量为:在开始施用时,每日给药40mg,持续一周,然后每日给药30mg,持续一周,然后每日给药20mg,持续一周,然后每日给药10mg,持续一周。
66.根据权利要求50-65任一项所述的用途,进一步包括对患者施用磷酸肌酸钠。
67.根据权利要求66所述的用途,其特征在于,所述磷酸肌酸钠是通过静脉注射给药的。
68.根据权利要求50-67任一项所述的用途,其特征在于,与没有施用含有所述重组核酸的药物组合物相比,施用所述药物组合物产生更高的平均视力恢复水平。
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