WO1999027122A1 - Vecteurs inhibant ou retardant la liaison d'un virus d'immunodeficience aux cellules - Google Patents

Vecteurs inhibant ou retardant la liaison d'un virus d'immunodeficience aux cellules Download PDF

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WO1999027122A1
WO1999027122A1 PCT/FR1998/002503 FR9802503W WO9927122A1 WO 1999027122 A1 WO1999027122 A1 WO 1999027122A1 FR 9802503 W FR9802503 W FR 9802503W WO 9927122 A1 WO9927122 A1 WO 9927122A1
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WO
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viral vector
rantes
cell
polypeptide
region
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Application number
PCT/FR1998/002503
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Majid Mehtali
Tania Sorg
Valérie Calenda
Martine Marigliano
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Transgene S.A.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/195—Chemokines, e.g. RANTES
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to new vectors allowing the expression of a polypeptide making it possible to inhibit or delay the binding of an immunodeficiency virus to a host cell and / or the penetration of said virus into said cell as well as their use for preventing or treating an immunodeficiency disease and in particular the acquired immunodeficiency syndrome
  • AIDS human immunodeficiency virus
  • AIDS develops as a result of an infection with the HTV virus of an individual's T4 lymphocytes.
  • the infection can be asymptomatic for many years, but as soon as the cells are activated, the virus quickly replicates and destroys them.
  • AIDS is characterized by a deficiency in immunity
  • HLV is a retrovirus that belongs to the lentivirus family.
  • any retrovirus it is formed of an envelope surrounding a capsid of protein nature, which contains the genetic material constituted by an RNA molecule associated with various viral proteins necessary for the first stages of the replicative cycle.
  • RNA molecule associated with various viral proteins necessary for the first stages of the replicative cycle.
  • the administration of such molecules poses a certain number of problems, in particular due to the fact that they are metabolized very rapidly in the body which requires the administration of large doses and repeatedly and increases the cost of treatment.
  • the present invention overcomes the drawbacks of the prior art and proposes more suitable vectors expressing the SDF-1 ligands, RANTES, MCP-l ⁇ or MlP-l ⁇ or their derivatives, with the aim of increasing their effectiveness while reducing undesirable effects.
  • lymphocyte cells incubated in the presence of supernatants of cells infected with defective adenoviral vectors expressing RANTES are protected against replication of VfflL.
  • Experiments in murine models confirm the persistence of the adenoviral vector, which can be detected in the liver of animals treated for more than 60 days after injection.
  • the subject of the present invention is a recombinant viral vector into the genome of which is inserted the sequences coding for at least one polypeptide making it possible to inhibit or delay the binding of an immunodeficiency virus to a target cell and / or the penetration of said virus into said cell, said viral vector not being an adenoviral vector into the genome of which is inserted the cDNA coding for murine RANTES.
  • a viral vector refers to a virus whose genome has been modified so as to allow the transfer and expression of a gene of interest in a eukaryotic host cell or organism.
  • a viral vector capable of being used in the context of the present invention can be derived in particular from a poxvirus, a herpes virus, an alphavirus, a retrovirus, an adenovirus or a virus associated with adenovirus.
  • it will be a non-integrative and non-replicative vector.
  • Such vectors and their preparation technique are known to those skilled in the art.
  • adenoviruses offer several advantages which make them vectors of choice in the context of the present invention. Indeed, they infect many cell types, both dividing and quiescent cells, are non-integrative and not very pathogenic. As an indication, their genome consists of a linear and double-stranded DNA molecule of about 36 kb carrying more than thirty genes, both early genes necessary for viral replication and late structural genes. The early genes are divided into 4 regions (designated E1 to E4; E for early meaning early in English). The E1, E2 and E4 regions are essential for viral replication while the E3 region involved in the modulation of the anti-adenovirus immune response in the host is not.
  • an adenoviral vector according to the invention is defective for replication, that is to say incapable of autonomous replication in a host cell.
  • a vector is obtained from an adenovirus whose genome has been modified so as to render non-functional one or more viral genes essential for its replication. These modifications can be diverse (deletion, mutation and / or addition of one or more nucleotides) and localized in the coding regions of the viral genome or outside of them, for example in the promoter regions.
  • a preferred adenoviral vector according to the invention lacks the majority of the E1 region and, optionally, all or part of the E3 region. It may also comprise additional deletions or mutations affecting one or more other viral genes, in particular within the E2, E4 and / or L1-L5 regions. In this regard, use may be made of second generation vectors of the state of the art (see for example international applications WO94 / 28152 and WO97 / 04119). By way of illustration, the deletion of the majority of the region E1 and of a part of the transcription unit E4 is very particularly advantageous.
  • an adenoviral vector according to the invention conserves the cis regions of the adenoviral genome, namely the terminal inverted repeats (ITR) and the packaging region. Their length and nucleotide sequence can vary from one serotype to another. However, they can be easily isolated from literature data. As an indication, the ITRs correspond to the first and last 103 nucleotides (nt) of the 5 ′ and 3 ′ ends of the genome of the adenovirus type 5 (Ad5) and the encapsidation region extends to nt 458.
  • ITR terminal inverted repeats
  • Another interesting variant may consist of mutations or limited deletions, which do not require complementation of the affected functions.
  • ORFs 3, 3 and 4 or 3, 6 and 7 may prove to be advantageous in terms of expression of the transgene.
  • the adenoviral vector according to the invention is, optionally, additionally devoid of all or part of the non-essential E3 region in order to increase the cloning capacities.
  • a preferred adenoviral vector according to the invention is chosen from the following:
  • adenoviral vector devoid of all or part of the El region and, optionally, of all or part of the E3 region
  • adenoviral vector devoid of all or part of the El and E4 regions and, optionally, of all or part of the E3 region
  • adenoviral vector devoid of all or part of the E1 and E4 regions and, optionally, of all or part of the E3 region, and comprising a non-functional mutation of the E2 region
  • adenoviral vector devoid of all or part of the El, E2 and E4 regions and, optionally of all or part of the E3 region.
  • the origin of the adenoviral vector according to the invention can be varied both from the point of view of the species and of the serotype. It can be derived from the genome of an adenovirus of human or animal origin (canine, avian, bovine, murine, ovine, porcine, simian ...) or else from a hybrid comprising fragments of adenoviral genome of at least two different origins. Mention may more particularly be made of the adenoviruses CAV-1 or CAV-2 of canine origin, DAV of avian origin or else Bad of type 3 of bovine origin (Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128: 171 -
  • an adenoviral vector of human origin preferably deriving from an adenovirus of serotype C, in particular of type 2 or 5, will be preferred.
  • An adenoviral vector according to the present invention can be generated in vitro in Escherichia coli (E. coli) by homologous ligation or recombination (see for example international application WO96 / 17070) or alternatively by recombination in a complementation line.
  • the essential characteristic of the viral vector according to the invention is to carry within its genome the sequences coding for at least one polypeptide making it possible to inhibit or delay the first steps of a viral infection, the viral vector does not not being an adenoviral vector expressing the cDNA encoding the murine RANTES.
  • the polypeptide in use in the present invention is a ligand for a cellular receptor, the latter facilitating the binding and / or penetration of an immunodeficiency virus within the target cell. Its binding to the receptor at least partially inhibits the binding and / or entry of the virus into the target cell.
  • the inhibition can be measured by conventional techniques, for example by assessing the activity of the virus's reverse transcriptase, the presence of viral proteins (p24 for the HIV virus) or by fusion inhibition tests as described in Dragic et al. (1996, si ⁇ ra) and Alkhatib et al. (1996, supra).
  • the polypeptide in use in the present invention is preferably chosen from the ligands of a receptor which facilitates, optionally in association with CD4, the binding and / or penetration of the VLH-1 virus into the target cell.
  • a receptor which facilitates, optionally in association with CD4, the binding and / or penetration of the VLH-1 virus into the target cell.
  • the receivers which should also be considered in the context of the present invention are CCR1 (J. Virol., Vol 72, no.7, pages 6260-6263, 1998); GPR1 (Virology 249, pages 367-378, 1998); CCR8 (J. Biol. Chem., 273 (1), pages 386-391, 1998; J. Virol. 71, no. 12, pages 8999-9007, 1997); V28 or CX3CR (Virology 231, pages 130-134, 1997; J. Virol. 71, no. 12, pages 8999- 9007, 1997); the putative MDC receptor (Science, 278, pages 695-698 1997); APJ and CCR9 (J. Virol., Vol 72, no 10, pages 7934-7940, 1998).
  • MDC macrophage derived chemokine
  • v-MLPII Kaposi's sarcoma-associated herpes virus
  • Kledal et al., 1997, Science 277 , 1656-1659 v-MLPII
  • RANTES RANTES
  • MLP-l ⁇ MlP-l ⁇
  • SDF-1 SDF-1
  • RANTES is produced mainly by peripheral blood lymphocytes, macrophages and T cells. It has several activities including chemoattraction involving monocytes and CD4 + / CD45 RO cells " . It contains 68 amino acids. Its sequence is described in Schall et al. (1988, J. Immunol. 141, 1018-1045).
  • MlP-l ⁇ is produced mainly by T lymphocytes and monocytes. It allows chemoattraction relating to monocytes and, to a lesser scale, on T lymphocytes. In addition, it inhibits the proliferation of hematopoietic precursors. Its sequence is described in Obaru et al. (1986, J. Biochem. 99, 885-894).
  • MLP-l ⁇ is produced mainly by T lymphocytes and monocytes. It allows chemoattraction on monocytes and, on a smaller scale, on T lymphocytes. In addition, it inhibits the proliferation of hematopoietic precursors. Its sequence is described in Brown et al. (1989, J. Immunol.
  • SDF-1 is produced primarily by stromal and bone marrow cells. It is involved in chemoattraction mainly involving lymphocytes. Its sequence is described in Tashiro et al. (1993, Science 261, 600-603).
  • a native polypeptide or a derivative thereof can be used. It can be obtained by mutation, substitution, addition and / or deletion of one or more residues of the native polypeptide provided that it is capable of exerting the desired inhibitory effect with respect to viral infection.
  • a derivative in use in the invention retains the receptor binding capacities but has a reduced or zero biological activity. Indeed, it may be advantageous to suppress or reduce the biological activities of the polypeptide, in order to minimize the undesirable side effects.
  • an antagonistic derivative is particularly suitable.
  • antagonistic derivatives of RANTES mention may be made of RANTES provided with a Met residue at the N-terminal end of the mature protein (Proudfoot et al., 1996, J. Biol.
  • nucleotide sequences coding for the polypeptide in use in the present invention can be isolated according to the techniques of the art (PCR, reverse transcription, chemical synthesis, use of suitable probes, etc.). They may be genomic sequences, cDNAs which can be modified, for example at the level of introns (minigene type). Their insertion into the genome of the viral vector according to the invention preferably takes place in a nonessential region or within a modified / deleted region. As it is an adenoviral vector, the preferred cloning site is a replacement for E1.
  • nucleotide sequences can be inserted at the same place or at different places in the viral genome, use the same or different regulatory elements and, possibly, be in reverse orientation with respect to each other in order to minimize interference phenomena at the level of gene expression.
  • the nucleotide sequences are placed under the control of the elements necessary for their expression in a host cell.
  • the expression "elements necessary for expression” designates the genetic elements allowing the transcription of the nucleotide sequence into RNA and the translation of an mRNA into polypeptide.
  • the promoter is of particular importance.
  • H can be isolated from any gene of eukaryotic or even viral origin and can be constitutive or regulable. Alternatively, it may be the natural promoter of the gene in question. In addition, it can be modified so as to improve the promoter activity, to suppress a region inhibiting transcription, to make a constitutive promoter regulable or vice versa, to introduce a restriction site ...
  • a promoter is up to the within the reach of ordinary skill in the art and will be adapted to the viral vector selected. Mention may be made, by way of examples, of the retroviral LTRs adapted to a retroviral vector, the 7.5K promoter of the vaccinia virus or also the eukaryotic promoters of the PGK (Phospho Glycerate kinase) genes, of immunoglobulin. (lymphocyte-specific), the SR ⁇ promoter hybrid between the origin of SV40 and the LTR of HTLV-I (Takebe et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 466-472), the SM22 promoter and the promoter Desmine (patent application WO 98/15575).
  • PGK Phospho Glycerate kinase
  • tissue specific promoters are preferred promoters.
  • the promoter of ⁇ l-Antitrypsin Long et al., Biochemistry, 1984, 23, 4828-37; Yull et al, Transgenic Research, 4, 770-74 (1995)
  • the promoter of FacteurIX Salier et al., J. of Biol. Chem., 265, no.12, 7062-68, 1990
  • the promoter of the Albumin gene Izban et al., J. Biol.
  • nucleotide sequences in use in the context of the present invention may also comprise additional elements improving their expression, their maintenance in the host cell or the localization of the polypeptide. Such elements are known to those skilled in the art. It is indicated that the nucleotide sequence in use in the context of the present invention preferably comprises a signal sequence allowing the secretion of the polypeptide outside the host cell. It may be the native signal sequence or a heterologous sequence derived from a secreted eukaryotic or viral polypeptide. In addition, the presence of a splicing sequence may be advantageous for improving the levels of expression. In this regard, the second intron of the rabbit ⁇ -globin gene (Green et al., 1988, Nucleic Acid Res.
  • a particularly advantageous viral vector according to the invention derives from an adenovirus devoid of most of the El and E3 regions and into which is inserted in place of the El region an expression cassette comprising the CMV or RSV promoter, a sequence splicing, the cDNA coding for human RANTES or its derivative RANTES ⁇ 1-8 and a polyadenylation sequence.
  • the viral vector according to the invention can comprise additional exogenous nucleotide sequences coding for one or more polypeptides improving the therapeutic effect with regard to viral infection (neutralizing antibodies, immunoconjugates, immunotoxins, etc.).
  • the invention also relates to an infectious viral particle as well as to a eukaryotic host cell comprising a viral vector according to the invention.
  • Said host cell is advantageously a mammalian cell and, preferably, a human cell and can comprise said vector in the form integrated or not in its genome. It will preferably be a hematopoietic stem or differentiated cell (totipotent stem cell, leukocyte, lymphocyte, monocyte or macrophage ).
  • An infectious viral particle according to the invention is prepared according to conventional techniques in the field of art. Its propagation is carried out in a complementation cell adapted to the deficiencies it carries.
  • a complementation cell adapted to the deficiencies it carries.
  • an adenoviral vector use will be made, for example, of the line 293 established from human embryonic kidney cells, which effectively complements the El function (Graham et al, 1977, J. Gen. Virol. 36, 59 -72) or derived lines for double complementation (Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559-565; Krougliak and Graham, 1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586; Wang et al., 1995 Gene Therapy 2, 775-783; Lusky et al., 1998, J. of Virology, no.
  • the invention also relates to a method for preparing an infectious viral particle comprising a viral vector according to the invention, according to which:
  • said viral vector according to the invention is introduced into a complementation cell capable of tram complementarying said vector, so as to obtain a transfected complementation cell, (ii) said transfected complementation cell is cultured under conditions suitable for allowing the production of said infectious viral particle, and (iii) recovering said infectious viral particle in cell culture.
  • the infectious viral particle can be recovered from the culture supernatant but also from the cells.
  • One of the commonly used methods is to lyse the cells by consecutive freeze / thaw cycles to collect the virions in the lysis supernatant. These can be amplified and purified according to the techniques of the art (chromatographic process, ultracentrifugation in particular through a gradient of cesium chloride ).
  • a subject of the invention is also a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as therapeutic or prophylactic agent, at least one viral vector, an infectious viral particle or a eukaryotic host cell according to the invention in association with an acceptable carrier of a pharmaceutical view.
  • the pharmaceutical composition of the invention can comprise at least one viral vector into which is inserted a sequence coding for at least one polypeptide making it possible to inhibit or delay the binding of an immunodeficiency virus to a target cell and / or the penetration of said virus into said cell.
  • a composition is capable of allowing the coexpression of several polypeptides having said properties of inhibiting or delaying the binding of a virus to a host cell. This coexpression optionally allows said polypeptides to act in synergy.
  • the composition of the invention can comprise a viral vector containing a sequence coding for several polypeptides, the nucleotide sequences coding for each of the polypeptides can be placed under the control of the same promoter, or of different promoters which may or may not be inducible. These nucleotide sequences can also be inserted in an identical or different region of the viral genome and be oriented in the same or reverse manner on the vector. The techniques enabling the design of vectors endowed with such characteristics are well known to those skilled in the art.
  • the composition according to the invention can comprise several viral vectors each expressing one or more peptides of interest.
  • composition according to the invention is intended for the preventive or curative treatment of diseases linked to an infection with an immunodeficiency virus and, more particularly, with an HTV virus of any serotype. It can be VLH-1 or HIV-2 (Hill et al., 1997, J. Virol. 71, 6296-6304).
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be manufactured in a conventional manner.
  • a therapeutically effective amount of the therapeutic or prophylactic agent is combined with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • routes of administration intragastric, subcutaneous, intracardiac, intramuscular, intraperitoneal, intratumoral, intranasal, intrapulmonary or intratracheal ... etc.
  • the appropriate route of administration and dosage vary according to various parameters, for example, the individual to be treated, the stage of the disease or the nucleotide sequences to be transferred.
  • the viral particles according to the invention can be formulated in doses of between 10 4 and 10 15 iu (infectious units), advantageously 10 5 and 10 iu and, preferably, 10 and 10 iu.
  • the formulation may also include a pharmaceutically acceptable diluent, adjuvant or excipient or any other substance which improves the antiviral effect or the stability.
  • a pharmaceutically acceptable diluent, adjuvant or excipient or any other substance which improves the antiviral effect or the stability can be found in French application 97 06600.
  • the present invention relates to the therapeutic or prophylactic use of at least one viral vector, an infectious viral particle or a eukaryotic host cell according to the invention, for the preparation of a medicament intended for the treatment of diseases immunodeficiency and, in particular, AIDS by gene therapy.
  • the use of at least one viral vector into which is inserted a sequence coding for at least one polypeptide making it possible to inhibit or delay the binding of an immunodeficiency virus to a target cell and / or the penetration of said virus into said cell.
  • Such use is able to allow the coexpression of several polypeptides having said inhibiting or retarding properties.
  • This coexpression optionally allows said polypeptides to act in synergy.
  • the nucleotide sequences coding for each of the polypeptides can be placed under the control of the same promoter, or of different promoters, inducible or not.
  • the present invention also relates to the therapeutic or prophylactic use of an adenoviral vector into the genome of which is inserted the cDNA coding for the murine RANTES or of a plasmid vector comprising the sequences coding for at least one polypeptide making it possible to inhibit or delay the binding of an immunodeficiency virus to a target cell and / or the penetration of said virus into said cell, for the preparation of a medicament intended for the treatment of diseases of immunodeficiency through gene therapy.
  • the polypeptide in use in the present invention has the characteristics set out above, just like the adenoviral vector allowing the expression of the cDNA encoding the murine RANTES.
  • the plasmid vector it is possible to use a plasmid of the state of the art or to construct it by the techniques of genetic manipulation.
  • it has the genetic elements enabling it to replicate and maintain itself in a microorganism and / or a host cell, such as for example at least one origin of replication and a selection gene (gene coding for an auxotrophy or conferring resistance to an antibiotic). It may also include additional elements improving its maintenance, its stability or even its integration into the chromosomes of the host.
  • a viral vector according to the invention or a plasmid vector in use in the present invention can be used as such or in combination with other compounds, such as cationic lipid compounds optionally in the presence of neutral or zwitterionic lipids. These compounds are widely described in the literature accessible to those skilled in the art.
  • the medicament can be administered directly in vivo, for example by intravenous injection.
  • the polypeptide will be secreted into the blood where it can exert its antiviral action.
  • it is also possible to adopt the ex vivo approach which consists in taking cells from the patient (stem cells from the bone marrow, peripheral blood lymphocytes, etc.), transfecting them or infecting them in vitro according to the techniques of the art and readminister them to the patient.
  • the present invention also relates to a method of treatment or prevention of SLDA, according to which a therapeutically effective amount of a viral vector, a viral particle or a cell is administered.
  • a therapeutically effective amount of a viral vector, a viral particle or a cell is administered.
  • the constructions described below are produced according to general techniques of genetic engineering and molecular cloning, detailed in particular in Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) or according to manufacturer's recommendations when using a commercial kit.
  • the homologous recombination technique is extensively detailed in Chartier et al. (1996, J. Virol. 70, 4805-4810) and the strain used for this purpose is preferably the E. coli BJ 5183 strain (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580).
  • the technique used consists of filling the protruding 5 ′ ends with the large fragment of DNA polymerase I from E.
  • coli Klenow
  • Amplification techniques by PCR are known to those skilled in the art (see for example PCR Protocols - A Guide to Methods and Applications, 1990, published by Innis, Gelfand, Sninsky and White, Académie Press Inc).
  • PCR reverse transcription technique the reverse complement of mRNA is conventionally transcribed using an oligonucleotide located after the STOP codon and then the amplification of the cDNA at 1 using two suitable primers.
  • the adenoviral genome fragments used in the various constructions described below are indicated precisely according to their position in the nucleotide sequence of the Ad5 genome as disclosed in the Genebank database under the reference M73260.
  • the cells are transfected or transduced according to standard techniques well known to those skilled in the art.
  • use is made of the complementation cell lines 293
  • the cells A549 (ATCC CCL-185), Vero (ATCC CCL-81) and PMI (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog # 3038) are used. It is understood that other cell lines can be used. The cells are cultured according to the techniques of the art or according to the recommendations of the supplier.
  • EXAMPLE 1 Construction of an adenoviral vector expressing the human RANTES
  • the cDNA encoding human RANTES is cloned by reverse transcription-PCR (RT-PCR) from RNA isolated from human lymphocytes activated for 3 days in the presence of IL-2 and anti-CD3 antibodies.
  • Reverse transcription is carried out with the oligonucleotide oTG10794 (SEQ LD NO: 1), the amplification by PCR with the oligonucleotides oTG10793 (SEQ LD NO: 2) and oTG10794 by applying the following experimental conditions: 30 cycles of 1 min to 94 ° C, 1 min at 62 ° C and 1 min 30 at 72 ° C).
  • the amplified fragment (297 bp) is digested by speech, purified and inserted into the vector M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene 26, 91-99) previously linearized with Xbal and dephosphorylated, to give the vector M 13 TG6219.
  • the presence of the RANTES gene is confirmed by enzymatic digestion (for example Bgl ⁇ l-Sac ⁇ .) And its nucleotide sequence by sequencing according to the methods of the art.
  • the adenoviral transfer vector pTG6600 is generated by introduction into the El region of Ad5 of the BgI ⁇ .-Bam ⁇ L fragment isolated from pCI (Promega) and carrying the CMV promoter, a synthetic splicing sequence (donor site J-globin human / intron 1 / IgG immunoglobulin acceptor site), a multiple cloning site (MCS) and the polyadenylation sequence of the SV40 virus (see French application 97 06757), so that the regulatory elements are located in 3 ' sequences Ad5 extending from nucleotides 1 to 458 and 5 'to those at positions 3329 to 6241.
  • the Xbal fragment isolated from M13TG6219 coding for the RANTES cDNA is inserted at the MCS, to give pTG6230.
  • the recombinant adenoviral genome designated pTG6232 is reconstituted by homologous recombination between the Pacl-BstE ⁇ fragment. of pTG6230 and the vector pTG4656 cleaved by CM.
  • the latter is a recombinant adenoviral vector comprising the LacZ gene to replace the E1 region.
  • the HindIR-EcoKV fragment of M13TG6219 is also inserted into the E1 region of the vector pTG8348 similar to pTG6600 apart from the constitution of the cassette d 'expression.
  • the adenoviral vector pTG6264 is constructed by homologous recombination between the vector pTG4656 digested with ClaI and the Pacl-BslE ⁇ l fragment of the transfer vector pTG6254. It is indicated that pTG6264 is a deleted vector from the El (nt 459 to 3328) and E3 regions (nt 28592 to 30470) and comprising the cassette "prom RSV - intron - RANTES - pA ⁇ -globin" in place of the El sequences.
  • the virions AdTG6232 and AdTG6264 are obtained in the following way: the corresponding plasmids are transfected into the complementation line 293. The cell supernatant is recovered after 3 freeze-thaw cycles and used to infect the complementation line A549-E1 + and produce a viral pre-stock. The profile of adenoviral DNA is analyzed according to the Hirth technique (Glutzman and Von Doren, 1983, J. Virol. 45, 91-103). The viral stock is produced by amplification of the particles on the A549-E1 + line and the virions are purified on a cesium chloride gradient.
  • the viral titer in ufp (plaque-forming units) is determined according to the techniques of the art by titration on 293 cells.
  • the number of infectious particles ui (infectious units) is evaluated by immunofluorescence of the adenoviral protein DBP using an anti- DBP (Reich et al., 1983, Virology 128, 480-484).
  • the RANTES ⁇ l-8 derivative is obtained by site-directed mutagenesis of the vector M13TG6219 with the oligonucleotide oTGl 1428 (SEQ ID NO: 3), in order to delete the first 8 amino acids of the mature protein.
  • the H / wdlU-EcoRV fragment of the vector M13TG6267 thus generated is introduced into the transfer plasmid pTG8348. After digestion of the resulting vector with Pacl and 2?
  • pTG6283 is generated which is deleted from the regions El (nt 459 to 3328) and E3 (nt 28592 to 30470) and contains the cassette "prom RSV - intron - RANTES ⁇ l-8 - pA ⁇ -globin "in place of the El sequences.
  • the recombinant adenoviruses AdTG6283 are produced according to the method indicated above.
  • Human A549 or simian Vero target cells are infected with recombinant adenoviruses at a multiplicity of infection equal to 50 or 100. Culture supernatants are harvested 48 and 72 hours after infection, and are centrifuged for 5 minutes at 3500 rpm. to remove cellular debris. The RANTES is assayed in the culture supernatants by ELISA (R&D Systems kit # DRN00). Its concentration varies between 200 and 1000 ng / ml depending on the production.
  • the capacity of the RANTES produced by the recombinant virions to inhibit the infection of the PMI lymphocyte cells by the VL ⁇ virus is evaluated. To do this, they are brought into contact with the cell supernatants obtained from the A549 or Vero line infected with the recombinant adenoviruses AdTG6232 or AdTG6264. The concentration of RANTES in the supernatants collected by ELISA is evaluated. PMI cells are pre-incubated in the presence of a supernatant comprising 500 ng RANTES / 10 cells for 2 hours, then tested by HIV1, isolate M-tropic Bal (multiplicity of infection 10 " or 10).
  • the culture is continued in the presence of supernatant comprising 100 ng / ml of RANTES from D3.
  • Replication of the VLH is followed by analysis of reverse transcriptase activity in PMI culture supernatants (see for example Virology Methods Manual 1996, ed. B. Mahy and H. Kangro Académie Press, Harcourt Brace & Company Publishers).
  • PMI culture supernatants see for example Virology Methods Manual 1996, ed. B. Mahy and H. Kangro Académie Press, Harcourt Brace & Company Publishers.
  • a clear inhibition of viral infection can be observed in the presence of the supernatants of cells infected with AdTG6232 or AdTG6264 or of the recombinant protein.
  • Dose-response experiments are carried out as The PMI cells are preincubated with the supernatants of cells infected with AdTG6232 or AdTG6264 containing variable doses of RANTES (0 - 50 - 100 - 500 ng / 10 6 cells). continued in the presence of cellular supernatants containing doses of RANTES varying from 5 to 100 ng / ml (5 - 25 - 50 - 75 - 100 ng / ml). The cells are thus protected against viral infection up to 25 ng / ml RANTES, whatever the pre-incubation conditions.
  • the different constructs were injected into C57Black / 6 immunocompetent and SCLD immunodeficient mice in order to follow the expression of RANTES or its RANTES ⁇ l-8 derivative, to analyze the persistence of the adenoviral genome, as well as any toxicity linked to the constitutive and strong expression of chemokines.
  • 5 x 10 ui of recombinant adenoviruses AdTG6232 and AdTG6283 are injected intravenously into immunocompetent C57Black / 6 mice.
  • the serum concentration of RANTES and RANTES ⁇ l-8 is determined by ELISA as indicated above. 140 to 200 ng / ml of serum could be detected in animals having received the AdTG6232 virions, the maximum expression being on D3.
  • mice injected with the AdTG6283 construct produce 23 to 85 ng / ml of RANTES ⁇ l-8 for more than 30 days after the injection. These data confirm the functionality of the virions of the invention.
  • the DNA isolated from the livers of treated mice is analyzed by the Southern technique using a specific probe recognizing the E3 / E4 junction of the Ad5 genome. Persistence of the adenoviral genome in liver cells is observed up to 30 days after the injection, regardless of the vector injected. In addition, the anatomical pathology experiments carried out on the livers of the treated mice did not demonstrate any toxicity of the adenoviruses expressing the RANTES. Animals injected with a non-recombinant adenoviral vector are used as a control.
  • RANTES and RANTES ⁇ l-8 between 130 to 630 ng / ml.
  • the serum concentration is slightly lower (20 to 60 ng / ml) in the case of mice injected with AdTG6264.
  • the expression is stable and persistent over more than 30 days when the vectors using the viral promoter RSV (AdTG6264 and AdTG6283) are used. Analyzes by the Southern technique show the persistence of the adenoviral genome up to more than 30 days after the injection, regardless of the vector used.
  • the injection of viral constructs is accompanied by a certain toxicity of the hepatic type, especially in the case of PAdTG6232, probably linked to the immunodeficiency state of the animals.
  • Replication of the VLH is followed by analysis of reverse transcriptase activity in PBL culture supernatants.
  • a clear inhibition of viral infection can be observed in the presence of RANTES produced by adenoviral vector after infection of A549 or Vero cells.
  • FIG. 1 shows the measurement of reverse transcriptase activity in PBL culture supernatants. It is clear that reverse transcriptase activity in PBL infected with VLH after incubation in the presence of RANTES supernatant is comparable to the activity detected in uninfected PBLs, while significantly higher reverse transcriptase activity is detected in PBLs infected with VLH.
  • the in vivo evaluation of the antiviral effect of RANTES is carried out in a mouse model of immunodeficient sciaVscid mice implanted with human PBLs.
  • the PBLs are screened beforehand in order to determine a donor making it possible to obtain inhibition of the viral infection in vitro by RANTES.
  • the adenoviral vector AdTG9338 (RSV-FIX) expressing factor IX (Anson et al., EMBO, vol.3, no.5, pages 1053, 1984) is obtained by a method analogous to that which made it possible to obtain AdTG6264 ( RSV-RANTES).
  • the adenoviral vectors AdTG6264 and AdTG9338 (5.10 9 iu) are injected retro-orbitally into sciaVscid mice on D0. 2,6.10 7 human PBLs are administered to the mice on D2, by the intraperitoneal route.
  • the viral test is carried out 14 days after the adenoviral infection by injecting 5000 TCLD 5 0 of the isolate HIV1 M-tropic Bal intraperitoneally.
  • mice are sacrificed on D28 in order to analyze the viral load.
  • a blood sample is taken before the HIV test (on D4) to determine the expression of RANTES and human factor IX.
  • the quantification of RANTES and the FIX is carried out at the time of the sacrifice (J28).
  • the measurement of the viral load is carried out on D21 and D28.
  • EXAMPLE 6 In vivo evaluation of the antiviral effect of RANTES in a macaque / SIV model. The evaluation of the antiviral effect in a macaque model is carried out on 5 groups of animals according to the scheme established in the table below:
  • AdTG6401 is used as a negative control for adenoviral infection; it is a first generation adenovirus whose adenoviral skeleton is identical to that . from the other vectors involved, but does not carry any expression cassette.
  • the evaluation of the antiviral effect is carried out in parallel on a batch of healthy monkeys at the time of injection of the adenoviruses and a batch of monkeys already contaminated with the IF V.
  • Recombinant adenoviruses are administered to monkeys by intravenous injection.
  • a viral test is carried out on the batch of healthy monkeys 14 days after the adenoviral infection by injecting 10 AID / monkey.
  • the viral load and the expression of the chemokines are measured, following the same protocol as that used previously, on D 28.

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Abstract

La présente invention concerne un vecteur viral recombinant dans le génome duquel sont insérées les séquences codant pour au moins un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder la liaison d'un virus d'immunodéficience à une cellule cible et/ou la pénétration dudit virus dans ladite cellule, ledit vecteur viral n'étant pas un vecteur adénoviral dans le génome duquel est inséré l'ADNc codant pour le RANTES murin. Elle a également trait à une particule virale infectieuse, une cellule hôte et une composition pharmaceutique comprenant ledit vecteur, particule virale ou cellule hôte. Elle concerne également un procédé de préparation d'une telle particule virale infectieuse. Enfin, elle concerne l'utilisation thérapeutique ou prophylactique d'un vecteur viral, d'une particule virale, d'une cellule hôte, d'un vecteur adénoviral exprimant le RANTES murin ainsi que d'un vecteur plasmidique comprenant les séquences codant pour au moins un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder la liaison d'un virus d'immunodéficience à une cellule cible et/ou la pénétration dudit virus dans ladite cellule, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies d'immunodéficience par thérapie génique.

Description

VECTEURS INHIBANT OU RETARDANT LA LIAISON D ' UN VIRUS D ' IMMUNODEFIC IENCE AUX CELLULES
5 La présente invention a pour objet de nouveaux vecteurs permettant l'expression d'un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder la liaison d'un virus d'immunodéficience à une cellule hôte et/ou la pénétration dudit virus dans ladite cellule ainsi que leur utilisation pour prévenir ou traiter une maladie d'immunodéficience et notamment le syndrome de l'immunodéficience acquise
10 (SIDA) résultant de l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VLH).
Le SIDA se développe à la suite d'une infection par le virus VTH des lymphocytes T4 d'un individu. L'infection peut être asymptomatique pendant de nombreuses années, mais dès que les cellules sont activées, le virus se réplique rapidement et les détruit. Le SIDA se caractérise par un déficit de l'immunité
15 cellulaire, qui a pour effet de rendre l'individu particulièrement sensible à toute infection opportuniste. En juillet 1992, l'OMS a enregistré 501 272 cas de SIDA dans le monde (AIDS Information international literature on acquired immunodeficiency syndrom and related retroviruses, 1992, 8, Leeds University Press. Editor A.W. Boylston, Leeds). Mais ces chiffres sont toutefois inférieurs à la
20 réalité, puisque cette maladie constitue une véritable épidémie dans certains pays africains. A l'heure actuelle, malgré le fait que les traitements de chimiothérapie aient permis d'augmenter l'espérance de vie des malades, le SIDA reste une maladie dont le taux de mortalité est toujours très élevé.
Le VLH est un rétrovirus qui appartient à la famille des lentivirus. Comme
25 tout rétrovirus, il est formé d'une enveloppe entourant une capside de nature protéique, qui contient le matériel génétique constitué par une molécule d'ARN associée à diverses protéines virales nécessaires aux premières étapes du cycle réplicatif. Dès 1984, on a mis en évidence le rôle déterminant de la molécule CD4 présente essentiellement à la surface des lymphocytes T CD4+ et des monocytes, dans la pénétration du virus au sein des cellules cibles.
De nombreuses observations accumulées au cours de ces 10 dernières années, ont suggéré l'existence de cofacteurs supplémentaires. Récemment, l'équipe de Berger a identifié le rôle du récepteur à 7 domaines transmembranaires, désigné initialement fusine et rebaptisé depuis lors CXCR-4 (Oberlin et al., 1996, Nature 382, 833-835 ; Feng et al., 1996, Science 272, 872-877), pour permettre la pénétration du virus suite à l'interaction de l'enveloppe virale et du récepteur CD4. Son ligand SDF-1 (pour stromal cell-derived factor 1 en anglais) semble bloquer efficacement l'infection des lignées lymphocytaires par les isolats Vïïi-1 adaptés aux lignées immortalisées et les T-tropiques.
En outre, plusieurs groupes ont montré que les isolats à tropisme macrophage primaires ou adaptés aux lignées immortalisées utilisent un corécepteur différent pour infecter les cellules hôtes. Le récepteur CCR-5, toujours en association avec CD4, permet l'entrée de ces souches (Dragic et al., 1996, Nature 381, 661-613 ; Alkhatib et al., 1996, Science 272, 1955-1958). Ce récepteur lie normalement le RANTES (pour regulated on activation, normal T cell expressed and secreted en anglais), MlP-lα et MLP-lβ (pour MAC inhibitory protein en anglais) et ces β-chimiokines répriment la pénétration du virus dans les cellules, probablement par un phénomène de compétition et/ou d'internalisation du complexe récepteur/ligand. L'effet inhibiteur est supprimé en présence d'anticorps dirigés contre ces trois molécules (Cocchi et al., 1995, Science 270, 1811-1815).
Les premiers essais envisagés jusqu'à présent, mettent en oeuvre les chimiokines précitées sous forme purifiée, des antagonistes qui bloquent les récepteurs ou encore des anticorps dirigés contre le récepteur. Cependant, l'administration de telles molécules pose un certain nombre de problèmes, notamment dû au fait qu'elles sont métabolisées très rapidement dans l'organisme ce qui nécessite l'administration de fortes doses et de façon répétée et augmente le coût du traitement. La présente invention permet de remédier aux inconvénients de l'art antérieur et propose des vecteurs plus appropriés exprimant les ligands SDF-1, RANTES, MCP-lα ou MlP-lβ ou leurs dérivés, dans le but d'augmenter leur efficacité tout en diminuant les effets indésirables. Un adenovirus recombinant exprimant l'ADNc codant pour le RANTES murin a déjà été décrit dans la littérature (Braciak et al., 1996, J. Immunol. 157, 5076-5084) mais son utilisation à des fins anti-SLDA n'est pas enseignée.
On a maintenant montré que les cellules lymphocytaires incubées en présence de surnageants de cellules infectées par des vecteurs adénoviraux défectifs exprimant le RANTES sont protégées contre la réplication du VfflL Les expériences en modèles murins confirment la persistence du vecteur adénoviral, celui-ci pouvant être détecté dans le foie des animaux traités pendant plus de 60 jours après l'injection.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un vecteur viral recombinant dans le génome duquel est inséré les séquences codant pour au moins un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder la liaison d'un virus d'immunodéficience à une cellule cible et/ou la pénétration dudit virus dans ladite cellule, ledit vecteur viral n'étant pas un vecteur adénoviral dans le génome duquel est inséré l'ADNc codant pour le RANTES murin.
Au sens de la présente invention, un vecteur viral fait référence à un virus dont le génome a été modifié de manière à permettre le transfert et l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule ou un organisme hôte eucaryote. Un vecteur viral susceptible d'être mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention, peut être dérivé notamment d'un poxvirus, d'un virus de l'herpès, d'un alphavirus, d'un rétrovirus, d'un adenovirus ou d'un virus associé à l'adénovirus. Avantageusement, il s'agira d'un vecteur non intégratif et non réplicatif. De tels vecteurs ainsi que leur technique de préparation sont connus de l'homme de l'art.
A cet égard, les adenovirus offrent plusieurs avantages qui en font des vecteurs de choix dans le cadre de la présente invention. En effet, ils infectent de nombreux types cellulaires, aussi bien des cellules en division que quiescentes, sont non-intégratifs et peu pathogènes. A titre indicatif, leur génome est constitué d'une molécule d'ADN linéaire et bicaténaire d'environ 36 kb portant plus d'une trentaine de gènes, à la fois des gènes précoces nécessaires à la replication virale et des gènes tardifs de structure. Les gènes précoces sont répartis en 4 régions (désignées El à E4 ; E pour early signifiant précoce en anglais). Les régions El, E2 et E4 sont essentielles à la replication virale alors que la région E3 impliquée dans la modulation de la réponse immunitaire anti-adénovirus chez l'hôte ne l'est pas. Les gènes tardifs (Ll à L5 ; L pour late signifiant tardif en anglais) recouvrent en partie les unités de transcription précoces et sont, pour la plupart, transcrits à partir du promoteur majeur tardif MLP (pour Major Late Promoter en anglais). Avantageusement, un vecteur adénoviral selon l'invention est défectif pour la replication, c'est à dire incapable de replication autonome dans une cellule hôte. Généralement, un tel vecteur est obtenu à partir d'un adenovirus dont le génome a été modifié de manière à rendre non fonctionnels un ou plusieurs gènes viraux essentiels à sa replication. Ces modifications peuvent être diverses (délétion, mutation et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides) et localisées dans les régions codantes du génome viral ou en dehors de celles-ci, par exemple dans les régions promotrices.
Un vecteur adénoviral préféré selon l'invention est dépourvu de la majorité de la région El et, de façon optionnelle, de tout ou partie de la région E3. Il peut en outre comprendre des delétions ou mutations supplémentaires affectant un ou plusieurs autres gènes viraux, notamment au sein des régions E2, E4 et/ou L1-L5. A cet égard, on peut avoir recours aux vecteurs de seconde génération de l'état de la technique (voir par exemple les demandes internationales WO94/28152 et WO97/04119). A titre illustratif, la délétion de la majorité de la région El et d'une partie de l'unité de transcription E4 est tout particulièrement avantageuse. On indique qu'un vecteur adénoviral selon l'invention conserve les régions en cis du génome adénoviral à savoir les répétitions inversées terminales (ITR) et la région d'encapsidation. Leur longueur et séquence nucléotidique peuvent varier d'un sérotype à l'autre. Cependant, elles peuvent être aisément isolées à partir des données de la littérature. A titre indicatif, les ITRs correspondent aux premiers et derniers 103 nucléotides (nt) des extrémités 5' et 3' du génome de l'adénovirus de type 5 (Ad5) et la région d'encapsidation s'étend jusqu'au nt 458.
Une autre variante intéressante peut consister en des mutations ou des delétions limitées, ne nécessitant pas de complémentation des fonctions touchées. On peut citer par exemple la mutation thermosensible de la région E2 (Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339) ou la délétion partielle de la région E4 conservant notamment les séquences codant pour les cadres de lecture ouverts (ORF)_3 et/ou 6 et 7 qui ne nécessite pas de complémentation de la fonction E4 (Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048). En outre, le maintien de ORFs 3, 3 et 4 ou 3, 6 et 7 peut s'avérer avantageux en terme d'expression du transgène. Il est également possible d'avoir recours à un vecteur minimal conservant essentiellement les régions en cis essentielles à la replication (ITRs et région d'encapsidation) et défectif pour l'ensemble des fonctions vitales. Comme déjà mentionné, le vecteur adénoviral selon l'invention est, de façon optionnelle, en outre dépourvu de tout ou partie de la région E3 non essentielle afin d'accroître les capacités de clonage. Cependant, on peut envisager de conserver les séquences E3 codant pour les polypeptides permettant l'échappement au système immunitaire de l'hôte, notamment la glycoprotéine gpl9k (Gooding et al., 1990, Critical Review of Immunology 10, 53-71)
Un vecteur adénoviral préféré selon l'invention est choisi parmi les suivants :
(1) vecteur adénoviral dépourvu de tout ou partie de la région El et, de manière optionnelle, de tout ou partie de la région E3,
(2) vecteur adénoviral dépourvu de tout ou partie des régions El et E2 et, de manière optionnelle, de tout ou partie de la région E3,
(3) vecteur adénoviral dépourvu de tout ou partie des régions El et E4 et, de manière optionnelle, de tout ou partie de la région E3,
(4) vecteur adénoviral dépourvu de tout ou partie des régions El et E4 et, de manière optionnelle, de tout ou partie de la région E3, et comportant une mutation non fonctionnelle de la région E2, et (5) vecteur adénoviral dépourvu de tout ou partie des régions El, E2 et E4 et, de manière optionnelle de tout ou partie de la région E3.
Par ailleurs, l'origine du vecteur adénoviral selon l'invention, peut être variée aussi bien du point de vue de l'espèce que du sérotype. Il peut dériver du génome d'un adenovirus d'origine humaine ou animale (canine, aviaire, bovine, murine, ovine, porcine, simienne...) ou encore d'un hybride comprenant des fragments de génome adénoviral d'au moins deux origines différentes. On peut citer plus particulièrement les adenovirus CAV-1 ou CAV-2 d'origine canine, DAV d'origine aviaire ou encore Bad de type 3 d'origine bovine (Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128: 171-
176 ; Spibey et Cavanagh, J. Gen. Virol., 1989, 70: 165-172 ; Jouvenne et al., Gène,
1987, 60: 21-28 ; Mittal et al., J. Gen. Virol., 1995, 76: 93-102). Cependant, on préférera un vecteur adénoviral d'origine humaine dérivant de préférence d'un adenovirus de sérotype C, notamment de type 2 ou 5. Un vecteur adénoviral selon la présente invention peut être généré in vitro dans Escherichia coli (E. coli) par ligation ou recombinaison homologue (voir par exemple la demande internationale WO96/17070) ou encore par recombinaison dans une lignée de complémentation.
Comme indiqué précédemment, la caractéristique essentielle du vecteur viral selon l'invention est de porter au sein de son génome les séquences codant pour au moins un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder les premières étapes d'une infection virale, le vecteur viral n'étant pas un vecteur adénoviral exprimant l'ADNc codant pour le RANTES murin.
Selon un mode de réalisation avantageux, le polypeptide en usage dans la présente invention est un ligand d'un récepteur cellulaire, ce dernier facilitant la liaison et/ ou la pénétration d'un virus d'immunodéficience au sein de la cellule cible. Sa liaison au récepteur inhibe au moins partiellement la liaison et/ou l'entrée du virus au sein de la cellule cible. L'inhibition peut être mesurée par les techniques classiques, par exemple en évaluant l'activité de la transcriptase inverse du virus, la présence de protéines virales (p24 pour le virus VIH) ou par des tests d'inhibition de fusion tels que décrits dans Dragic et al. (1996, siψra) et Alkhatib et al. (1996, supra).
Le polypeptide en usage dans la présente invention est de préférence choisi parmi les ligands d'un récepteur facilitant, éventuellement en association avec CD4, la liaison et/ou la pénétration du virus VLH-1 dans la cellule cible. On peut citer les chimiokines liant le récepteur CCR-5, CXCR-4, CCR-2B, CCR-3, US28, BOB (ou GPR-15) ou encore BONZO (ou STRL-33) (Pleskoff et al., 1997, Science 276,1874-1878 ; Deng et al., 1997, Nature 388, 296-300 ; Liao et al., 1997, J. Exp. Med. 185, 2015-2023). Les récepteurs qu'il convient également de considérer dans le cadre de la présente invention sont CCR1 (J. Virol., vol 72, no.7, pages 6260- 6263, 1998) ; GPR1 (Virology 249, pages 367-378, 1998) ; CCR8 (J.Biol.Chem., 273 (1), pages 386-391, 1998 ; J. Virol. 71, no.12, pages 8999-9007, 1997) ; V28 ou CX3CR (Virology 231, pages 130-134, 1997 ; J. Virol. 71, no.12, pages 8999- 9007, 1997) ; le récepteur putatif de MDC (Science, 278, pages 695-698 1997) ; APJ et CCR9 (J. Virol., Vol 72, no 10, pages 7934-7940, 1998). Parmi ces ligands, on mentionnera le MDC (pour macrophage derived chemokine ; Pal et al., 1997, Science 278, 695-698) , le v-MLPII (Kaposi's sarcoma-associated herpès virus ; Kledal et al., 1997, Science 277, 1656-1659) et plus particulièrement le RANTES, le MLP-lα, le MlP-lβ et le SDF-1, notamment d'origine humaine. On rappelle ci-après les propriétés des polypeptides précités. Le RANTES est produit essentiellement par les lymphocytes du sang périphérique, les macrophages et les cellules T. H présente plusieurs activités parmi lesquelles la chimioattraction portant sur les monocytes et les cellules CD4+/CD45 RO". Il comporte 68 acides aminés. Sa séquence est décrite dans Schall et al. (1988, J. Immunol. 141, 1018-1045).
Le MlP-lα est produit essentiellement par les lymphocytes T et les monocytes. Il permet la chimioattraction portant sur les monocytes et, à moindre échelle, sur les lymphocytes T. En outre, il inhibe la prolifération des précurseurs hématopoïétiques. Sa séquence est décrite dans Obaru et al. (1986, J. Biochem. 99, 885-894).
Le MLP-lβ est produit essentiellement par les lymphocytes T et les monocytes. Il permet la chimioattraction portant sur les monocytes et, à moindre échelle, sur les lymphocytes T. En outre, il inhibe la prolifération des précurseurs hématopoïétiques. Sa séquence est décrite dans Brown et al. (1989, J. Immunol.
142, 679-687).
Le SDF-1 est produit essentiellement par les cellules stromales et de la moelle osseuse. Il intervient dans la chimioattraction portant principalement sur les lymphocytes. Sa séquence est décrite dans Tashiro et al. (1993, Science 261, 600- 603).
Dans le cadre de la présente invention, on peut mettre en oeuvre un polypeptide natif ou un dérivé de ce dernier. Il peut être obtenu par mutation, substitution, addition et/ou délétion d'un ou plusieurs résidus du polypeptide natif sous réserve qu'il soit capable d'exercer l'effet inhibiteur recherché vis à vis de l'infection virale. De préférence, un dérivé en usage dans l'invention retient les capacités de liaison au récepteur mais a une activité biologique réduite ou nulle. En effet, il peut être avantageux de supprimer ou réduire les activités biologiques du polypeptide, afin de minimiser les effets secondaires indésirables. A cet égard, un dérivé antagoniste convient tout particulièrement. A titre d'exemples de dérivés antagonistes du RANTES, on peut citer le RANTES pourvu d'un résidu Met à l'extrémité N-terminale de la protéine mature (Proudfoot et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, 2599 -2603),J'aminooxypentane-RANTES ou AOP-RANTES (Science 276, pages 276-279, 1997) et le RANTES délété des 8 premiers résidus en position N- terminale (ci-après désigné RANTES Δl-8 ; Arenzana-Seisdedos et al., 1996, Nature 383, 400) qui ne présentent plus les propriétés chimiotactiques et d'activation des monocytes caractérisant le RANTES natif. A titre d'exemple de dérivé antagoniste de SDF-1, on peut citer le peptide correspondant aux 9 résidus N-terminaux de SDF-1 (Loetscher et al., 1998, J.Biol.Chem. Vol.273, no.35, pages 22279-22283).
Les séquences nucléotidiques codant pour le polypeptide en usage dans la présente invention peuvent être isolées selon les techniques de l'art (PCR, réverse transcription, synthèse chimique, utilisation de sondes adéquates...). Il peut s'agir de séquences génomiques, ADNc qui peuvent être modifiées par exemple au niveau des introns (type minigène). Leur insertion dans le génome du vecteur viral selon l'invention a, de préférence, lieu dans une région non essentielle ou au sein d'une région modifiée/délétée. S'agissant d'un vecteur adénoviral, le site de clonage préféré est en remplacement de El. Dans le cas où l'on met en oeuvre plusieurs séquences nucléotidiques, elles peuvent être insérées au même endroit ou à des endroits différents du génome viral, utiliser les mêmes éléments de régulation ou des éléments différents et, éventuellement, être en orientation réverse les unes par rapport aux autres afin de minimiser les phénomènes d'interférence au niveau de l'expression génique.
Bien entendu, les séquences nucléotidiques sont placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression dans une cellule hôte. La locution "éléments nécessaires à l'expression" désigne les éléments génétiques permettant la transcription de la séquence nucléotidique en ARN et la traduction d'un ARNm en polypeptide. Parmi ceux-ci, le promoteur revêt une importance particulière. H peut être isolé d'un gène quelconque d'origine eucaryote ou même virale et peut être constitutif ou régulable. Alternativement, il peut s'agir du promoteur naturel du gène en question. Par ailleurs, il peut être modifié de manière à améliorer l'activité promotrice, supprimer une région inhibitrice de la transcription, rendre un promoteur constitutif régulable ou vice versa, introduire un site de restriction... Le choix d'un promoteur est à la portée de l'homme de l'art et sera adapté au vecteur viral retenu. On peut mentionner, à titre d'exemples, les LTR rétroviraux adaptés à un vecteur rétroviral, le promoteur 7,5K du virus de la vaccine ou encore les promoteurs eucaryotes des gènes PGK (Phospho Glycerate kinase), d'immunoglobuline (lymphocyte-spécifique), le promoteur SRα hybride entre l'origine de SV40 et le LTR de HTLV-I (Takebe et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 466-472), le promoteur SM22 et le promoteur de la Desmine (demande de brevet WO 98/15575). Il est également envisagé dans le cadre de la présente invention d'utiliser des promoteurs tissus spécifiques. Parmi les promoteurs tissus spécifiques, les promoteurs foie- spécifiques sont des promoteurs préférés. On peut notamment citer : le promoteur de l'αl-Antitrypsine (Long et al., Biochemistry, 1984, 23, 4828-37 ; Yull et al, Transgenic Research, 4, 770-74 (1995)), le promoteur du FacteurIX (Salier et al., J. of Biol. Chem., 265, no.12, 7062-68, 1990), le promoteur du gène de l'Albumine (Izban et al., J. Biol. Chem, 264, no.16, 9171-79, 1989), ces derniers promoteurs pouvant être couplés à l'Apo E enhancer dans le but d'augmenter le taux de transcription du gène placé sous le contrôle de ce promoteur (Shachter et al., Journal of Lipids research, vol 34, 1993, page 1699). On peut également avoir recours à un promoteur inductible parle virus HIV (LTR de HIV) Dans le cadre d'un vecteur adénoviral, les promoteurs CMV précoce (Cytomégalovirus), RSV (Rous Sarcoma Virus) et les promoteurs foie-spécifiques éventuellement couplés à une séquence augmentant le taux de transcription telle que l'Apo E enhancer sont préférés.
Bien entendu, les séquences nucléotidique en usage dans le cadre de la présente invention peuvent en outre comprendre des éléments additionnels améliorant leur expression, leur maintien dans la cellule hôte ou la localisation du polypeptide. De tels éléments sont connus de l'homme de l'art. On indique que la séquence nucléotidique en usage dans le cadre de la présente invention comporte de préférence une séquence signal permettant la sécrétion du polypeptide en dehors de la cellule hôte. Il peut s'agir de la séquence signal native ou d'une séquence hétérologue issue d'un polypeptide eucaryote ou viral sécrété. En outre la présence d'une séquence d'épissage peut être avantageuse pour améliorer les niveaux d'expression. A cet égard, le second intron du gène β-globine de lapin (Green et al., 1988, Nucleic Acid Res. 16, 369 ; Karasuyama et al., 1989, J. Exp. Med. 169, 13- 25) ou la séquence d'épissage synthétique trouvée dans le plasmide pCI (promega Corp, pCI mammalian expression vector El 731 comprenant le site donneur de l'intron 1 de la β-globine humaine et le site accepteur du gène d'une immunoglobine de souris) constituent des exemples préférés.
Un vecteur viral selon l'invention particulièrement avantageux dérive d'un adenovirus dépourvu de l'essentiel des régions El et E3 et dans lequel est insérée à la place de la région El une cassette d'expression comportant le promoteur CMV ou RSV, une séquence d'épissage, l'ADNc codant pour le RANTES humain ou son dérivé RANTES Δ 1-8 et une séquence de polyadénylation.
Par ailleurs, le vecteur viral selon l'invention peut comprendre des séquences nucléotidiques exogènes additionnelles codant pour un ou plusieurs polypeptides améliorant l'effet thérapeutique à l'égard de l'infection virale (anticorps neutralisants, immunoconjugués, immunotoxines...). L'invention a également trait à une particule virale infectieuse ainsi qu'à une cellule hôte eucaryote comprenant un vecteur viral selon l'invention. Ladite cellule hôte est avantageusement une cellule de mammifère et, de préférence, une cellule humaine et peut comprendre ledit vecteur sous forme intégrée ou non dans son génome. Il s'agira de préférence d'une cellule souche ou différentiée hématopoïétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte ou macrophage...).
Une particule virale infectieuse selon l'invention est préparée selon les techniques conventionnelles dans le domaine de l'art. Sa propagation est effectuée dans une cellule de complémentation adaptée aux déficiences qu'il porte. S'agissant d'un vecteur adénoviral, on aura par exemple recours à la lignée 293 établie à partir de cellules de rein embryonnaire humain, qui complémente efficacement la fonction El (Graham et al, 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72) ou des lignées en dérivant pour une double complémentation (Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559-565 ; Krougliak et Graham, 1995, Human Gène Therapy 6, 1575-1586 ; Wang et al., 1995 Gène Therapy 2, 775-783 ; Lusky et al., 1998, J. of Virology, no. 72, 2022-2032 ; demande de brevet internationale WO 97/04119). Mais d'autres lignées obtenues par transfection des séquences de complémentation appropriées peuvent convenir. On peut également employer des virus auxilliaires pour complémenter tout ou partie des fonctions défectives. L'invention concerne également un procédé de préparation d'une particule virale infectieuse comprenant un vecteur viral selon l'invention, selon lequel :
(i) on introduit ledit vecteur viral selon l'invention dans une cellule de complémentation capable de complémenter en tram ledit vecteur, de manière à obtenir une cellule de complémentation transfectée, (ii) on cultive ladite cellule de complémentation transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule virale infectieuse, et (iii) on récupère ladite particule virale infectieuse dans la culture cellulaire. Bien entendu, la particule virale infectieuse peut être récupérée du surnageant de culture mais également des cellules. Une des méthodes couramment employée consiste à lyser les cellules par des cycles consécutifs de congélation/décongélation pour recueillir les virions dans le surnageant de lyse. Ceux-ci peuvent être amplifiés et purifiés selon les techniques de l'art (procédé chromatographique, ultracentrifugation notamment à travers un gradient de chlorure de césium...).
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique, au moins un vecteur viral, une particule virale infectieuse ou une cellule hôte eucaryote selon l'invention en association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
Ainsi, la composition pharmaceutique de l'invention peut comprendre au moins un vecteur viral dans lequel est insérée une séquence codant pour au moins un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder la liaison d'un virus d'immunodéficience à une cellule cible et/ou la pénétration dudit virus dans ladite cellule. Une telle composition est apte à permettre la coexpression de plusieurs polypeptides possédant lesdites propriétés d'inhibition ou de retardement de la liaison d'un virus à une cellule hôte. Cette coexpression permet éventuellement auxdits polypeptides d'agir en synergie. Ainsi, la composition de l'invention peut comporter un vecteur viral contenant une séquence codant pour plusieurs polypeptides, les séquences nucléotidiques codant pour chacun des polypeptides peuvent être placées sous le contrôle du même promoteur, ou de promoteurs différents inductibles ou non. Ces séquences nucléotidiques peuvent en outre être insérées dans une région identique ou différente du génome viral et être orientées de manière identique ou inverse sur le vecteur. Les techniques permettant de concevoir les vecteurs dotés de telles caractéristiques sont bien connues de l'homme du métier. De manière alternative, la composition selon l'invention peut comporter plusieurs vecteurs viraux exprimant chacun un ou plusieurs peptides d'intérêt. La composition selon l'invention est destinée au traitement préventif ou curatif des maladies liées à une infection par un virus d'immunodéficience et, tout particulièrement, par un virus VTH d'un sérotype quelconque. Il peut s'agir du VLH-1 ou du VIH-2 (Hill et al., 1997, J. Virol. 71, 6296-6304).
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace de l'agent thérapeutique ou prophylactique à un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Les voies d'administration envisageables sont multiples (intragastrique, sous-cutanée, intracardiaque, intramusculaire, intrapéritonéale, intratumorale, intranasale, intrapulmonaire ou intratrachéale... etc). Mais, on préférera, une administration par voie intraveineuse, notamment dans le cas d'un vecteur adénoviral. Elle peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu à traiter, du stade de la maladie ou encore des séquences nucléotidiques à transférer. A titre purement indicatif, les particules virales selon l'invention peuvent être formulées sous forme de doses comprises entre 104 et 1015 ui (unités infectieuses), avantageusement 105 et 10 ui et, de préférence, 10 et 10 ui. La formulation peut également inclure un diluant, un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique ou tout autre substance permettant d'améliorer l'effet antiviral ou la stabilité. Un exemple d'une telle substance peut être trouvée dans la demande française 97 06600.
La présente invention est relative à l'utilisation thérapeutique ou prophylactique d'au moins un vecteur viral, d'une particule virale infectieuse ou d'une cellule hôte eucaryote selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies d'immunodéficience et, notamment du SIDA par thérapie génique.
Il est donc également envisagé dans le cadre de la présente invention l'utilisation d'au moins un vecteur viral dans lequel est insérée une séquence codant pour au moins un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder la liaison d'un virus d'immunodéficience à une cellule cible et/ou la pénétration dudit virus dans ladite cellule. Une telle utilisation est apte à permettre la coexpression de plusieurs polypeptides possédant lesdites propriétés d'inhibition ou de retardement. Cette coexpression permet éventuellement auxdits polypeptides d'agir en synergie. Lorsque il est prévu l'utilisation d'un vecteur viral contenant une séquence codant pour plusieurs polypeptides, les séquences nucléotidiques codant pour chacun des polypeptides peuvent être placées sous le contrôle du même promoteur, ou de promoteurs différents, inductibles ou non. Ces séquences nucléotidiques peuvent également être orientées de manière identique ou inverse sur le vecteur et être placée dans une même région virale ou non. Les techniques permettant de concevoir les vecteurs dotés de telles caractéristiques sont bien connues de l'homme du métier. La présente invention concerne également l'utilisation thérapeutique ou prophylactique d'un vecteur adénoviral dans le génome duquel est inséré l'ADNc codant pour le RANTES murin ou d'un vecteur plasmidique comprenant les séquences codant pour au moins un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder la liaison d'un virus d'immunodéficience à une cellule cible et/ou la pénétration dudit virus dans ladite cellule, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies d'immunodéficience par thérapie génique. Bien entendu, le polypeptide en usage dans la présente invention a les caractéristiques énoncées ci-dessus, tout comme le vecteur adénoviral permettant l'expression de l'ADNc codant pour le RANTES murin. Pour ce qui est du vecteur plasmidique, on peut employer un plasmide de l'état de la technique ou le construire par les techniques de manipulations génétiques. Avantageusement, il possède les éléments génétiques lui permettant de se répliquer et de se maintenir dans un microorganisme et/ou une cellule hôte, comme par exemple au moins une origine de replication et un gène de sélection (gène codant pour une auxotrophie ou conférant une résistance à un antibiotique). Il peut également comprendre des éléments supplémentaires améliorant son maintien, sa stabilité ou encore son intégration dans les chromosomes de l'hôte.
Un vecteur viral selon l'invention ou un vecteur plasmidique en usage dans la présente invention peut être utilisé tel quel ou en association avec d'autres composés, tels que des composés lipidiques cationiques éventuellement en présence de lipides neutres ou zwitterioniques. Ces composés sont largement décrits dans la littérature accessible à l'homme du métier.
Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in vivo, par exemple par injection intraveineuse. Le polypeptide sera sécrété dans le sang où il pourra exercer son action antivirale. On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moelle osseuse, lymphocytes du sang périphérique...), de les transfecter ou infecter in vitro selon les techniques de l'art et de les réadminister au patient.
Enfin la présente invention a également pour objet une méthode de traitement ou de prévention du SLDA, selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquement efficace d'un vecteur viral, d'une particule virale ou d'une cellule hôte eucaryote selon l'invention ou d'un vecteur plasmique en usage selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement.
EXEMPLES La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.
Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées notamment dans Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial. La technique de recombinaison homologue est largement détaillée dans Chartier et al. (1996, J. Virol. 70, 4805-4810) et la souche utilisée à cet effet est de préférence la souche E. coli BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). S'agissant de la réparation des sites de restriction, la technique employée consiste en un remplissage des extrémités 5' protubérantes à l'aide du grand fragment de l'ADN polymérase I d'E. coli (Klenow). Les techniques d'amplification par PCR (Polymérase Chain Reaction) sont connues de l'homme de l'art (voir par exemple PCR Protocols - A Guide to Methods and Applications, 1990, édité par Innis, Gelfand, Sninsky et White, Académie Press Inc). Pour la technique de transcription inverse PCR, on procède classiquement, tout d'abord à la transcription du complément inverse de l'ARNm à l'aide d'un oligonucléotide situé après le codon STOP puis à l'amplification de l'ADNc à l'aide de deux amorces adéquates. Par ailleurs, les fragments de génome adénoviral employés dans les différentes constructions décrites ci-après, sont indiqués précisément selon leur position dans la séquence nucléotidique du génome de l'Ad5 telle que divulguée dans la banque de données Genebank sous la référence M73260.
En ce qui concerne la biologie cellulaire, les cellules sont transfectées ou transduites selon les techniques standards bien connues de l'homme du métier. Dans les exemples qui suivent, on a recours aux lignées cellulaires de complémentation 293
(Graham et al, 1977, supra ; disponible à l'ATCC sous la référence CRL1573) et A549-E1+ résultant de la transfection de la lignée humaine A549 par un plasmide exprimant la région El de l'Ad5 sous le contrôle du promoteur PGK (voir WO 94 / 28152). Pour l'évaluation des virions, on utilise les cellules A549 (ATCC CCL-185), Vero (ATCC CCL-81) et PMI (NIH AIDS Research and Référence Reagent Program Catalog # 3038). Il est entendu que d'autres lignées cellulaires peuvent être utilisées. Les cellules sont cultivées selon les techniques de l'art ou selon les recommandations du fournisseur.
EXEMPLE 1 : Construction d'un vecteur adénoviral exprimant le RANTES humain
L'ADNc codant pour le RANTES humain est clone par transcription inverse- PCR (RT-PCR) à partir d'ARN isolés de lymphocytes humains activés pendant 3 jours en présence d'LL-2 et d'anticorps anti-CD3. La transcription-inverse est réalisée avec l'oligonucléotide oTG10794 (SEQ LD NO: 1), l'amplification par PCR avec les oligonucléotides oTG10793 (SEQ LD NO: 2) et oTG10794 en appliquant les conditions expérimentales suivantes : 30 cycles de 1 min à 94°C, 1 min à 62°C et 1 min 30 à 72°C). Le fragment amplifié (297 pb) est digéré parlai, purifié et inséré dans le vecteur M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gène 26, 91-99) préalablement linéarisé par Xbal et déphosphorylé, pour donner le vecteur M 13 TG6219. La présence du gène RANTES est confirmé par digestion enzymatique (par exemple Bglïl-SacΩ.) et sa séquence nucléotidique par séquençage selon les méthodes de l'art.
Le vecteur de transfert adénoviral pTG6600 est généré par introduction au sein de la région El de l'Ad5 du fragment BgIΩ.-BamΗL isolé de pCI (Promega) et portant le promoteur CMV, une séquence d'épissage synthétique (site donneur J-globine humain/intron 1/site accepteur d'immunoglobuline IgG) , un site multiple de clonage (MCS) et la séquence de polyadénylation du virus SV40 (voir la demande française 97 06757), de sorte que les éléments de régulation sont localisés en 3' des séquences Ad5 s'étendant des nucléotides 1 à 458 et en 5' de celles en positions 3329 à 6241. Le fragment Xbal isolé de M13TG6219 codant pour l'ADNc RANTES est inséré au niveau du MCS, pour donner pTG6230. Le génome adénoviral recombinant désigné pTG6232 est reconstitué par recombinaison homologue entre le fragment Pacl-BstEΩ. de pTG6230 et le vecteur pTG4656 clivé par CM. Ce dernier est un vecteur adénoviral recombinant comprenant le gène LacZ en remplacement de la région El. En parallèle, le fragment HindïR-EcoKV de M13TG6219 est également inséré dans la région El du vecteur pTG8348 similaire au pTG6600 mis à part la constitution de la cassette d'expression. Celle-ci contient le promoteur viral RSV, l'intron 2 du gène β-globine de lapin et le signal de polyadénylation de ce même gène. On obtient pTG6254. Le vecteur adénoviral pTG6264 est construit par recombinaison homologue entre le vecteur pTG4656 digéré par Clal et le fragment Pacl-BslEïl du vecteur de transfert pTG6254. On indique que pTG6264 est un vecteur délété des régions El (nt 459 à 3328) et E3 (nt 28592 à 30470) et comportant la cassette "prom RSV - intron - RANTES - pA β-globine" à la place des séquences El .
Les virions AdTG6232 et AdTG6264 sont obtenus de la façon suivante : les plasmides correspondants sont transfectés dans la lignée de complémentation 293. Le surnageant cellulaire est récupéré après 3 cycles de congélation -décongélation et utilisé pour infecter la lignée de complémentation A549-E1+ et produire un pré-stock viral. Le profil de l'ADN adénoviral est analysé selon la technique de Hirth (Glutzman et Von Doren, 1983, J. Virol. 45, 91- 103). Le stock viral est produit par amplification des particules sur la lignée A549-E1+ et les virions sont purifiés sur gradient de chlorure de césium. Le titre viral en ufp (unités formant des plages) est déterminé selon les techniques de l'art par titration sur cellules 293. Le nombre de particules infectieuses ui (unités infectieuses) est évalué par immunofluorescence de la protéine adénovirale DBP utilisant un anticorps anti-DBP (Reich et al., 1983, Virology 128, 480-484).
EXEMPLE 2 : Construction d'un vecteur adénoviral exprimant le dérivé RANTES humain délété des 8 premiers résidus CRANTES Δ1-8V
Le dérivé RANTES Δl-8 est obtenu par mutagénèse dirigée du vecteur M13TG6219 avec l'oligonucléotide oTGl 1428 (SEQ ID NO: 3), afin de déléter les 8 premiers acides aminés de la protéine mature. Après vérification de la mutagénèse par séquençage, le fragment H/wdlU-EcoRV du vecteur M13TG6267 ainsi généré est introduit dans le plasmide de transfert pTG8348. Après digestion du vecteur en résultant par Pacl et 2?stEII et recombinaison homologue avec pTG4656 coupé par Clάl, on génère pTG6283 lequel est délété des régions El (nt 459 à 3328) et E3 (nt 28592 à 30470) et comporte la cassette "prom RSV - intron - RANTES Δl-8 - pA β-globine" à la place des séquences El. Les adenovirus recombinants AdTG6283 sont produits selon la méthode indiquée ci-dessus.
EXEMPLE 3 : Evaluation in vitro de l'effet antiviral des adenovirus AdTG6232. AdTG6264 et AdTG6283.
Les cellules-cibles humaines A549 ou simiennes Vero sont infectées par les adenovirus recombinants à une multiplicité d'infection égale à 50 ou à 100. Les surnageants de culture sont récoltés 48 et 72 heures après infection, et sont centrifugés pendant 5 minutes à 3500 rpm afin d'éliminer les débris cellulaires. Le RANTES est dosé dans les surnageants de culture par ELISA (kit R&D Systems # DRN00). Sa concentration varie entre 200 et 1000 ng/ml selon les productions.
Puis, on évalue la capacité du RANTES produit par les virions recombinants à inhiber l'infection des cellules lymphocytaires PMI par le virus VLΗ. Pour ce faire, elles sont mises en présence des surnageants cellulaires obtenus de la lignée A549 ou Vero infectée par les adenovirus recombinants AdTG6232 ou AdTG6264. On évalue la concentration de RANTES dans les surnageants recueillis par ELISA. Les cellules PMI sont pré-incubées en présence de surnageant comprenant 500 ng RANTES / 10 cellules pendant 2 heures, puis éprouvées par le VIH1, isolât M-tropique Bal (multiplicité d'infection 10" ou 10 ). La culture est poursuivie en présence de surnageant comprenant 100 ng/ml de RANTES à partir de J3. La replication du VLH est suivie par analyse de l'activité de la transcriptase-inverse dans les surnageants de culture PMI (voir par exemple Virology Methods Manual 1996, éd. B. Mahy and H. Kangro Académie Press, Harcourt Brace & Company Publishers). On utilise à titre de contrôle du RANTES obtenu par voie recombinante. Une nette inhibition de l'infection virale peut être observée en présence des surnageants des cellules infectées par l'AdTG6232 ou AdTG6264 ou de la protéine recombinante. Des expériences de dose-réponse sont effectuées comme suit. Les cellules PMI sont mises en pré-incubation avec les surnageants de cellules infectées par AdTG6232 ou AdTG6264 contenant des doses variables de RANTES (0 - 50 - 100 - 500 ng / 106 cellules). La culture est poursuivie en présence des surnageants cellulaires contenant des doses de RANTES variant de 5 à 100 ng/ml (5 - 25 - 50 - 75 - 100 ng/ml). Les cellules sont ainsi protégées vis-à-vis d'une infection virale jusqu'à 25 ng/ml RANTES, quelle que soit les conditions de pré-incubation.
EXEMPLE 4 : Evaluation in vivo des adenovirus AdTG6232. AdTG6264 et AdTG6283.
Les différentes constructions ont été injectées à des souris immunocompétentes C57Black/6 et immunodéficientes SCLD afin de suivre l'expression du RANTES ou de son dérivé RANTES Δl-8, d'analyser la persistence du génome adénoviral, ainsi qu'une éventuelle toxicité liée à l'expression constitutive et forte des chimiokines. En premier lieu, 5x10 ui d'adénovirus recombinants AdTG6232 et AdTG6283 sont injectées par voie intraveineuse à des souris immunocompétentes C57Black/6. La concentration sérique en RANTES et RANTES Δl-8 est déterminée par ELISA comme indiqué précédemment. On a pu détecter de 140 à 200 ng/ml de sérum dans les animaux ayant reçu les virions AdTG6232, le maximum d'expression se situant à J3. Les souris injectées avec la construction AdTG6283 produisent 23 à 85 ng/ml de RANTES Δl-8 pendant plus de 30 jours après l'injection. Ces données confirment la fonctionnalité des virions de l'invention. L'ADN isolé des foies de souris traitées est analysé par la technique de Southern à l'aide d'une sonde spécifique reconnaissant la jonction E3/E4 du génome Ad5. On observe une persistence du génome adénoviral dans les cellules hépatiques jusqu'à 30 jours après l'injection, quel que soit le vecteur injecté. En outre, les expériences d'anatomo-pathologie réalisées sur les foies des souris traitées n'ont pas mis en évidence une quelconque toxicité des adenovirus exprimant le RANTES. On utilise à titre de contrôle des animaux injectés avec un vecteur adénoviral non recombinant.
Des expériences similaires sont réalisées en souris immunodéficientes SCLD: les animaux traités avec les virions AdTG6232 et AdTG6283 produisent des quantités de
RANTES et RANTES Δl-8 comprises entre 130 à 630 ng/ml. La concentration sérique est légèrement plus faible (20 à 60 ng/ml) dans le cas des souris injectées avec l'AdTG6264. En outre, l'expression est stable et persistente sur plus de 30 jours lorsque l'on met en ouvre les vecteurs utilisant le promoteur viral RSV (AdTG6264 et AdTG6283). Les analyses par la technique de Southern montrent la persistence du génome adénoviral jusqu'à plus de 30 jours après l'injection, quel que soit le vecteur utilisé. L'injection des constructions virales s'accompagne d'une certaine toxicité de type hépatique surtout dans le cas de PAdTG6232, probablement liée à l'état d'immunodéficience des animaux.
EXEMPLE 5 : Evaluation in vitro et in vivo de l'effet antiviral de RANTES sur les PBL humains.
1. Evaluation in vitro de l'effet antiviral de RANTES sur les PBL humains. Les PBL (pour peripherical blood lymphocyte en anglais ou lymphocytes périphériques) humains ont été prélevés chez des sujets sains, purifiés et stimulés pendant 48 heures en présence d'LL2 et d'anticorps anti-CD3. Les cultures de PBL sont pré-incubées pendant 2 heures en présence de surnageant de RANTES (100 ng/10 cellules) produit après infection de cellules Véro ou A549 par les vecteurs adénoviraux AdTG6332 ou AdTG6264. Les PBL sont ensuite éprouvés par le VIH1, isolât M-tropique Bal (multiplicité d'infection 10"4). La culture est poursuivie en présence de surnageant comprenant 50 ng/ml de RANTES à partir de J3. La replication du VLH est suivie par analyse de l'activité de la transcriptase- inverse dans les surnageants de culture des PBL. Une nette inhibition de l'infection virale peut être observée en présence de RANTES produit par vecteur adénoviral après infection de cellules A549 ou Vero. Ces résultats sont illustrés sur la figure 1 qui montre la mesure de l'activité transcriptase inverse dans les surnageants de culture PBL. Il apparait clairement que l'activité transcriptase inverse chez les PBL infectés par le VLH après incubation en présence de surnageant RANTES est comparable à l'activité détectée chez les PBL non infectés, alors qu'une activité transcriptase inverse sensiblement plus importante est détectée chez les PBL infectés par le VLH.
2. Evaluation in vivo de l'effet antiviral de RANTES. L'évaluation in vivo de l'effet antiviral de RANTES est effectuée en modèle murin de souris sciaVscid immunodéficientes implantées avec des PBL humains. Les PBL sont criblés au préalable afin de déterminer un donneur permettant d'obtenir une inhibition de l'infection virale in vitro par RANTES.
Le vecteur adénoviral AdTG9338 (RSV-FIX) exprimant le facteur IX (Anson et al., EMBO, vol.3, no.5, pages 1053, 1984) est obtenu par une méthode analogue à celle ayant permis l'obtention de AdTG6264 (RSV-RANTES). Les vecteurs adénoviraux AdTG6264 et AdTG9338 (5.109iu) sont injectés par voie rétroorbitaire en souris sciaVscid à J0. 2,6.107 PBL humains sont administrés aux souris à J2, par voie intrapéritonéale. L'épreuve virale est réalisée 14 jours après l'infection adénovirale en injectant 5000 TCLD50 de l'isolât VIH1 M-tropique Bal par voie intrapéritonéale. Les souris sont sacrifiées à J28 afin d'analyser la charge virale. Un prélèvement sanguin est réalisé avant l'épreuve VIH ( à J4) afin de déterminer l'expression de RANTES et du facteur IX humain. La quantification de RANTES et du FIX est réalisée au moment du sacrifice (J28). La mesure de la charge virale est réalisée à J21 et à J28.
EXEMPLE 6 : Evaluation in vivo de l'effet antiviral de RANTES en modèle macaque/SIV. L'évaluation de l'effet antiviral en modèle macaque est effectuée sur 5 groupes d'animaux selon le schéma établi dans le tableau ci-dessous :
Tableau 1 :
Figure imgf000025_0001
*AdTG6401 est utilisé comme contrôle négatif de l'infection adénovirale ; c'est un adenovirus de première génération dont le squelette adénoviral est identique à celui.des autres vecteurs impliqués, mais ne véhicule aucune cassette d'expression.
L'évaluation de l'effet antiviral est menée en parallèle sur un lot de singes sains au moment de l'injection des adenovirus et un lot de singes déjà contaminés par le SIV. Les adenovirus recombinants sont administrés aux singes par injection intraveineuse. Une épreuve virale est réalisée sur le lot de singes sains 14 jours après l'infection adénovirale en injectant 10 AID/singe. La charge virale et l'expression des chimiokines sont mesurées, en suivant le même protocole que celui utilisé précédemment, à J 28.

Claims

Revendications
1. Un vecteur viral recombinant dans le génome duquel est inséré les séquences codant pour au moins un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder la liaison d'un virus d'immunodéficience à une cellule cible et/ou la pénétration dudit virus dans ladite cellule, ledit vecteur viral n'étant pas un vecteur adénoviral dans le génome duquel est inséré l'ADNc codant pour le RANTES murin.
2. Un vecteur viral recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polypeptide est un ligand d'un récepteur cellulaire, ledit récepteur facilitant la liaison et/ ou la pénétration d'un virus d'immunodéficience dans la cellule cible.
3. Un vecteur viral recombinant selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le polypeptide est un ligand d'un récepteur, ledit récepteur facilitant la liaison et/ ou la pénétration du virus de l'immunodéficience acquise (VIH) dans la cellule cible, éventuellement en association avec CD4.
4. Un vecteur viral recombinant selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit polypeptide est un ligand d'un récepteur choisi parmi le groupe constitué par les récepteurs CCR-5, CXCR-4, CCR1, CCR-2B, CCR-3, CCR8, US28,
BOB, BONZO, GPR1, V28, le récepteur putatif de MDC, APJ et CCR9.
5. Un vecteur viral recombinant selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que le ligand est choisi parmi le groupe constitué par les ligands RANTES, M P-l , MlP-lβ et SDF-1, notamment d'origine humaine.
6. Un vecteur viral recombinant selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le polypeptide est un dérivé d'un polypeptide natif, en particulier un dérivé antagoniste.
7. Un vecteur viral recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polypeptide est un dérivé antagoniste du RANTES et, notamment le dérivé RANTESΔ1-8 ou le dérivé Met-RANTES.
8. Un vecteur viral recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce que é polypeptide est un dérivé antagoniste de SDF-1 et notamment un peptide comprenant les 9 acides aminés N-terminaux de SDF-1.
9. Un vecteur viral recombinant selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il dérive d'un adenovirus.
10. Un vecteur viral recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il dérive d'un adenovirus dépourvu au moins de la majorité de la région El et, de façon optionnelle, de tout ou partie de la région E3.
11. Un vecteur viral recombinant selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il dérive d'un adenovirus :
(1) dépourvu de tout ou partie de la région El et, de manière optionnelle, de tout ou partie de la région E3,
(2) dépourvu de tout ou partie des régions El et E2 et, de manière optionnelle, de tout ou partie de la région E3,
(3) dépourvu de tout ou partie des régions El et E4 et, de manière optionnelle, de tout ou partie de la région E3, (4) dépourvu de tout ou partie des régions El et E4 et, de manière optionnelle, de tout ou partie de la région E3, et comportant une mutation non fonctionnelle de la région E2, ou (5) dépourvu de tout ou partie des régions El, E2 et E4 et, de manière optionnelle de tout ou partie de la région E3.
12. Un vecteur viral recombinant selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce qu'il dérive d'un adenovirus d'origine humaine, canine, aviaire, bovine, murine, ovine, porcine ou simienne ou encore d'un hybride comprenant des fragments de génome adénoviral d'au moins deux origines différentes.
13. Un vecteur viral recombinant selon l'une des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que les séquences codant pour ledit polypeptide sont placées sous le contrôle du promoteur précoce du virus CMV (Cytomégalovirus), du promoteur RSV (Rous Sarcoma Virus) ou d'un promoteur foie spécifique éventuellement couplé àl'ApoE enhancer.
14. Un vecteur viral recombinant selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisé en ce qu'il dérive d'un adenovirus dépourvu de l'essentiel des régions El et E3 et dans lequel est insérée à la place de la région El une cassette d'expression comportant un promoteur choisi parmi les promoteurs CMV, RSV ou un promoteur foie-spécifique, une séquence d'épissage, l'ADNc codant pour le RANTES humain ou son dérivé RANTES Δl-8 ou le dérivé Met-RANTES et une séquence de polyadénylation.
15. Une particule virale infectieuse comprenant un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 14.
16. Une cellule hôte eucaryote comprenant un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 14 ou infectée par une particule virale infectieuse selon la revendication 15.
17. Un procédé de préparation d'une particule virale infectieuse selon la revendication 15, selon lequel : (i) on introduit ledit vecteur viral dans une cellule de complémentation capable de complémenter en trans ledit vecteur, de manière à obtenir une cellule de complémentation transfectée,
(ii) on cultive ladite cellule de complémentation transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule virale infectieuse, et
(iii) on récupère ladite particule virale infectieuse dans la culture cellulaire.
18. Une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique au moins un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 14, une particule virale infectieuse selon la revendication 15 ou obtenue en mettant en oeuvre un procédé de préparation selon la revendication 17 ou une cellule hôte eucaryote selon la revendication 16, en association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
19. Une composition pharmaceutique selon la revendication 18, destinée au traitement des maladies d'immunodéficience et, plus particulièrement du SIDA.
20. Une composition pharmaceutique selon la revendication 18 ou 19, en vue d'une administration intraveineuse.
21. Utilisation thérapeutique ou prophylactique d'au moins un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 14, d'une particule virale infectieuse selon la revendication 15 ou obtenue en mettant en oeuvre un procédé de préparation selon la revendication 16 ou d'une cellule hôte eucaryote selon la revendication 16, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies d'immunodéficience par thérapie génique.
22. Utilisation thérapeutique ou prophylactique d'un vecteur adénoviral dans le génome duquel est inséré l'ADNc codant pour le RANTES murin ou d'un vecteur plasmidique comprenant les séquences codant pour au moins un polypeptide permettant d'inhiber ou retarder la liaison d'un virus d'immunodéficience à une cellule cible et/ou la pénétration dudit virus dans ladite cellule, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies d'immunodéficience par thérapie génique.
23. Utilisation thérapeutique ou prophylactique selon la revendication 22, caractérisée en ce que ledit polypeptide a les caractéristiques énoncées aux revendications 2 à 8.
24. Utilisation thérapeutique ou prophylactique selon l'une des revendications 21 à 23, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du SIDA par thérapie génique.
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