DE69434908T2

DE69434908T2 - Rezeptor an der oberfläche von aktivierten t-zellen:act4

Info

Publication number: DE69434908T2
Application number: DE69434908T
Authority: DE
Inventors: Wayne Bainbridge Island GODFREY; David William Half Moon Bay BUCK; Edgar George Atherton ENGLEMAN
Original assignee: Becton Dickinson and Co; Leland Stanford Junior University
Current assignee: Becton Dickinson and Co; Leland Stanford Junior University
Priority date: 1993-11-03
Filing date: 1994-11-03
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2014-11-04
Also published as: US20040265866A1; AU2009248426A1; AU2005202316A1; JP2007089585A; JP2009240311A; AU8065294A; US7364733B2; PT726952E; AU2005202316B2; US20010044522A1; EP0726952B1; US5821332A; AU781998B2; HK1001464A1; WO1995012673A1; US6277962B1; AU9413898A; JPH09504693A; CA2175577A1; DE69434908D1

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen die Isolation und Charakterisierung eines Zelloberflächenrezeptors, welcher ACT-4 genannt wird, und eines Antikörpers zu diesem und die Verwendung des Antigens und der Antikörper zur Überwachung und/oder Modulierung von Immunantworten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Immunantworten werden weitgehend durch eine diverse Sammlung peripherer Blutzellen, die Leukozyten genannt werden, vermittelt. Die Leukozyten umfassen Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten. Granulozyten werden weiter in Neutrophile, Eosinophile und Basophile unterteilt. Lymphozyten sind weiter in T- und B-Lymphozyten unterteilt. T-Lymphozyten stammen von lymphozytenentwickelnden Stammzellen des Embryos. Differenzierung erfolgt im Thymus und schreitet über Prothymozyten, kortikale Thymozyten und medulläre Thymozytenzwischenstufen fort, um verschiedene Arten von reifen T-Zellen zu produzieren. Diese Subtypen umfassen CD8⁺-T-Zellen (auch als zytotoxische/Suppressor-T-Zellen bekannt), die, wenn sie aktiviert werden, die Fähigkeit haben, Targetzellen zu lysieren, und CD4⁺-T-Zellen (auch als T-Helfer- und T-Induktorzellen bekannt), die, wenn sie aktiviert werden, die Fähigkeit haben, andere Immunsystemzelltypen zu stimulieren.
Immunsystemantworten werden in mehreren verschiedenen Situationen ausgelöst. Die häufigste Antwort ist ein gewünschter Schutz gegen infektiöse Mikroorganismen. Jedoch kann eine unerwünschte Immunantwort nach Transplantation von fremden Gewebe auftreten oder bei einer Autoimmunerkrankung, bei welcher eines der körpereigenen Antigene das Ziel der Immunantwort ist. Immunantworten können auch in vitro durch Mitogene oder Antikörper gegen bestimmte Rezeptoren initiiert werden. In jeder dieser Situationen wird eine Immunantwort von einem stimulierenden Ereignis über eine komplexe Wechselwirkung von Leukozytenzelltypen transduziert. Jedoch können die teilnehmenden Zelltypen und das Wesen der Wechselwirkung zwischen Zelltypen aufgrund verschiedener stimulierender Ereignisse variieren. Zum Beispiel werden Immunantworten gegen angreifende Bakterien oft durch die Bildung von Komplexen zwischen einem MHC-Klasse-II-Rezeptor und einem bakteriellen Antigen transduziert, der dann die CD4⁺-T-Zellen aktiviert. Im Gegensatz dazu werden Immunantworten gegen virale Infektionen prinzipiell durch die Bildung von MHC-Klasse-I/viralen Antigen-Komplexen und die darauf folgende Aktivierung von CD8⁺-Zellen transduziert.
Im Verlauf der Jahre sind viele Leukozytenzelloberflächenantigene identifiziert worden, wovon bei einigen gezeigt worden ist, dass sie eine Rolle bei der Signaltransduktion spielen. Es ist festgestellt worden, dass zwischen einem Zelloberflächenrezeptor und entweder einem löslichen Liganden oder einem zelloberflächengebundenen Liganden Signale transduziert werden. Die Aminosäuresequenzen der Leukozytenoberflächenmoleküle umfassen eine Vielzahl charakteristisch wiederkehrender Sequenzen oder Motive. Es wird angenommen, dass diese Motive in der Evolution verwandt sind, ähnliche Faltungsmuster aufweisen und ähnliche Arten von Wechselwirkungen vermitteln. Es ist eine Reihe von Überfamilien, einschließlich Immunglobulin- und Nervenwachstumsfaktorrezeptorübertamilien, beschrieben worden. Mitglieder der Nervenwachstumsfaktorrezeptorfamilie umfassen NGFR, das in Nervenzellen zu finden ist, das B-Zellantigen CD40, das Ratten-OX-40-Antigen, das auf aktivierten CD4⁺-Zellen zu finden ist (Mallet et al., EMBO J. 9, 1063-1068 (1990)) (hierin für alle Zwecke durch Verweis aufgenommen), zwei Rezeptoren für den Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), LTNFR-1 und TNFR-II, zu finden auf einer Vielzahl von Zelltypen, 4-1BB, das auf T-Zellen zu finden ist, SFV-T2, ein offener Leseraster in Shope-Fibrom-Virus, und möglicherweise fas, CD27 und CD30. Siehe im Allgemeinen Mallet & Barclay, Immunology Today 12, 220-222 (1990) (hierin für alle Zwecke durch Verweis aufgenommen).
Godfrey et al., Tissue Antigen, Abstract Nr. AA057, beschreibt den molekularen Klonierungsprozess einer cDNA, die für ein menschliches Homolog des Ratten-OX40-Antigens kodiert. Der Abstract stellt keine Nuclein- oder Aminosäuresequenz dieses menschlichen Homologs bereit.
Die Identifikation von Zelloberflächenrezeptoren hat auf neue Mittel zur Suppression unerwünschter Immunantworten wie z.B. Transplantatabstoßung, Autoimmunerkrankung und Entzündung schließen lassen. Mittel, insbesondere Antikörper, welche die Bindung von Immunzellrezeptoren an lösliche Moleküle oder zellgebundene Rezeptoren blockieren, können Immunantworten stören. Idealerweise sollte ein Mittel nur unerwünschte Immunantworten blockieren (z.B. Transplantatabstoßung), während eine Restkapazität gelassen wird, die gewünschte Antworten auslöst (z.B. als Antwort auf pathogene Mikroorganismen). Die Immunsuppressionswirkung einiger Mittel, z.B. von Antikörpern gegen den CD3-Rezeptor und den IL-2-Rezeptor, sind schon in klinischen Versuchen getestet worden. Obwohl einige Versuche ermutigende Ergebnisse gezeigt haben, bleiben doch signifikante Probleme. Erstens kann ein Patient eine Immunantwort gegenüber einen Blocker entwickeln, wodurch kontinuierliche Immunsuppressionswirkungen vermieden werden, wenn keine anderen Mittel verfügbar sind. Zweitens können Zellen, die das Targetantigen exprimieren, sich an die Gegenwart des Blockers anpassen, indem das Antigen nicht mehr exprimiert wird, während die Immunfunktionen aufrechterhalten werden. In dieser Situation ist die kontinuierliche Behandlung mit einem einzigen Immunsuppressionsmittel unwirksam. Drittens befinden sich viele Targets für therapeutische Mittel auf mehr als einer Leukozytenunterart, mit dem Ergebnis, dass es im Allgemeinen nicht möglich ist, die Reaktion von rein spezifischen Zellunterarten zu blockieren oder diese zu eliminieren, wodurch eine Restimmunkapazität zur Bekämpfung infektiöser Mikroorganismen ungestört bleibt.
Ausgehend von dem Vorangegangen ist es offensichtlich, dass ein Bedarf an zusätzlichen und verbesserten Mitteln besteht, welche Immunantworten unterdrücken können, insbesondere Mittel, die zur selektiven Suppression in der Lage sind. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese und andere Bedürfnisse, zum Teil, durch die Bereitstellung eines Zellrezeptors, der sich auf aktivierten menschlichen CD4⁺-T-Lymphozyten befindet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einer Ausführungsform der Erfindung sind isolierte ACT-4-Rezeptorpolypeptide, wie in Anspruch 1 dargelegt, bereitgestellt. Die Aminosäuresequenz eines solchen Polypeptids, das ACT-4-h-1 genannt wird, ist in 5 dargestellt. ACT-4-Rezeptorpolypeptide zeigen typischerweise zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der ACT-4-h-1-Aminosäuresequenz. Die Polypeptide umfassen für gewöhnlich zumindest ein und manchmal alle der folgenden Domänen: eine Signalsequenz, eine intrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne und eine extrazelluläre Domäne. Viele Polypeptide sind durch ihre Gegenwart auf aktivierten CD4⁺-T-Zellen und ihr wesentliches Fehlen auf den übrigen T-Zellen gekennzeichnet. Manche Polypeptide voller Länge haben vor ihrer Deglykosylierung ein Molekulargewicht von etwa 50 kDa und danach etwa von 27 kDa.
Extrazelluläre Domänen von ACT-4-Rezeptorpolypeptiden umfassen typischerweise zumindest eine disulfidgebundene Schleife und manchmal drei solcher Schleifen. Die extrazellulären Domänen sind für gewöhnlich löslich und in der Lage, spezifisch an einen ACT-4-Liganden zu binden. Manchmal wird eine extrazelluläre Domäne an ein zweites Polypeptid fusioniert, wie z.B. eine konstante Region einer Immunglobulin-Schwerkette. Manche extrazellulären Domänen bestehen im Wesentlichen aus einem Epitop, das spezifisch durch einen Antikörper, der L106 genannt wird, gebunden ist.
In einem anderen Aspekt der Erfindung werden Antikörper bereitgestellt, die spezifisch an ein ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid binden. Die Antikörper sind für gewöhnlich monoklonale Antikörper. Ein Beispiel für einen solchen Antikörper wird L106 genannt. Manche Antikörper hemmen die Aktivierung von CD4⁺-T-Zellen, während andere Antikörper die Aktivierung dieser Zellen stimulieren. Einige Antikörper konkurrieren mit dem L106-Antikörper zur spezifischen Bindung an ein ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid, und die meisten dieser Antikörper konkurrieren auch mit L106 um die spezifische Bindung an aktivierte CD4⁺-T-Zellen. Andere Antikörper binden sich spezifisch an ein anderes Epitop als das durch den L106-Antikörper gebundene.
Es werden auch Fragmente des L106-Antikörpers bereitgestellt, der sich spezifisch an ein ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid bindet.
Es werden auch humanisierte Anfikörper- bereitgestellt, die eine humanisierte Schwerkette und eine humanisierte Leichtkette umfassen. Die humanisierte Leichtkette umfasst drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3) mit Aminosäuresequenzen von den entsprechenden komplementaritätsbestimmenden Regionen einer L106-Antikörper-Leichtkette und einer Gerüstsequenz der variablen Region, die im Wesentlichen mit der Gerüstsequenz der variablen Region einer menschlichen Leichtkette identisch ist. Die humanisierte Schwerkette umfasst drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3) mit Aminosäuresequenzen von den entsprechenden komplementaritätsbestimmenden Regionen einer L106-Antikörper-Schwerkette und einer Gerüstsequenz der variablen Region, die im Wesentlichen mit der Gerüstsequenz der variablen Region einer menschlichen Schwerkette identisch ist. Die humanisierten Antikörper binden spezifisch mit einer Bindungsaffinität, die innerhalb des dreifachen Werts der Bindungsaffinität des L106-Antikörpers liegt, an ein ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Nucleinsäurefragmente bereit, die für die oben diskutierten ACT-4-Rezeptorpolypeptide kodieren. Ein Beispiel für ein solches Nucleinsäurefragment umfasst die Nucleotidsequenz, die für den in 5 dargestellten ACT-4-h-1-Rezeptor kodiert. Die Nucleinsäurefragmente zeigen typischerweise zumindest achtzig Prozent Sequenzidentität mit der Nucleinsäuresequenz aus 5.
Isolierte Zelllinien können die oben diskutierten Nucleinsäurefragmente umfassen. Die Zelllinien exprimieren üblicherweise ein ACT-4-Rezeptorpolypeptid auf deren Zelloberfläche. Einige der Zelllinien sind stabil, wenn das Nucleinsäurefragment in das Genom der Zelllinie aufgenommen wird.
In Verfahren zum Screening auf Immunsuppressiva wird ein ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid mit einem potenziellen Immunsuppressivum kontaktiert. Es wird dann die spezifische Bindung zwischen dem ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid oder -fragment und dem Mittel detektiert. Die Gegenwart einer spezifischen Bindung zeigt immunsuppressive Aktivität an.
In Verfahren zum Screening auf einen ACT-4-Liganden wird eine biologische Probe, die den ACT-4-Liganden enthält, mit einem ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid kontaktiert. Zwischen dem Liganden und dem ACT-4-h1-Rezeptorpolypeptid wird ein Komplex gebildet. Der Komplex wird dann dissoziiert, um den Liganden zu erhalten.
In Verfahren zur Suppression einer Immunantwort bei einem Patienten, der von einer Immunerkrankung oder einem Immunleiden betroffen ist, wird einem Patienten eine therapeutisch wirksame Dosis einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht. Die pharmazeutische Zusammensetzung umfasst einen pharmazeutisch wirksamen Träger und einen monoklonalen Antikörper, der sich spezifisch an ein ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid bindet.
Es werden auch Verfahren zur Detektion aktivierter CD4⁺-T-Zellen bereitgestellt. Eine Gewebsprobe von einem Patienten wird mit einem monoklonalen Antikörper kontaktiert, der sich spezifisch an ein ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid bindet. Es wird eine spezifische Bindung zwischen dem monoklonalen Antikörper und der Gewebsprobe detektiert. Die Gegenwart einer spezifischen Bindung enthüllt die Gegenwart aktivierter CD4⁺-T-Zellen. Die Gegenwart aktivierter CD4⁺T-Zellen diagnostiziert oft eine Erkrankung oder ein Leiden des Immunsystems.
Es werden auch Verfahren zur Induktion einer Immunantwort auf ein ausgewähltes Antigen bereitgestellt. Einem Patienten wird ein monoklonaler Antikörper verabreicht, der sich spezifisch an ein ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid bindet und die Aktivierung von CD4⁺-T-Zellen stimuliert. Der Patient wird dem ausgewählten Antigen exponiert.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Zweifarben-Färbung peripherer Blutlymphozyten zur Analyse der Expression von ACT-4-h-1 auf verschiedenen Zelltypen.
2: Kinetik der ACT-4-h-1-Expression auf alloantigenaktivierten CD4⁺-T-Zellen. MCF = Mittlere Kanalfluoreszenz.
3: Kinetik der ACT-4-h-1-Expression auf Tetanus-Toxoid-aktivierten CD4⁺-T-Zellen.
4: Kinetik der ACT-4-h-1-Expression auf PHA-aktivierten CD4⁺-T-Zellen.
5: cDNA- (oben) und abgeleitete Aminosäuresequenz (unten) von ACT-4-h-1. Die Figur zeigt die Stellen einer N-terminalen Signalsequenz, zwei mögliche Signalspaltstellen (vertikale Pfeile), zwei Glykosylierungsstellen (gly), eine Transmembrandomäne (TM), ein Stopcodon und eine Poly-A-Signalsequenz.
6 Herstellung eines Expressionsvektors zur Produktion stabiler Transfektanten, die ACT-4-h-1 exprimieren.
7: FACS^TM-Analyse, welche die Expression von AC-4-h-1 auf stabilen Transfektanten von COS-7-, Jurkat- und SP2/O-Zelllinien zeigt.
8: Fusion einer extrazellulären ACT-4-h-1-Domäne mit einer konstanten Region einer Immunglobulinschwerkette zur Bildung eines rekombinanten Globulins.
9: Schematische topographische Darstellung eines rekombinanten Globulins, das sich aus der Fusion einer extrazellulären ACT-4-h-1-Domäne mit einer konstanten Region einer Immunglobulinschwerkette bildet, um ein rekombinantes Globulin zu bilden.
DEFINITIONEN
Abkürzungen für die zwanzig natürlich auftretenden Aminosäuren folgen der herkömmlichen Verwendung (Immunology – A Synthesis; E.S. Golub & D.R. Gren; Hrsg., Sinauer Associates, Sunderland, Massachussetts, 2. Auflage (1991)) (hierin für alle Zwecke durch Verweis aufgenommen). Stereoisomere (z.B. D-Aminosäuren) der zwanzig herkömmlichen Aminosäuren, unnatürliche Aminosäuren, wie z.B. α,α-disubstituierte Aminosäuren, N-Alkylaminosäuren, Milchsäure und andere unkonventionelle Aminosäuren, können auch geeignete Komponenten für Polypeptide der vorliegenden Erfindung sein. Beispiel für unkonventionelle Aminosäuren umfassen: 4-Hydroxypyrolin, γ-Carboxyglutamat, ε-N,N,N-Trimethyllysin, ε-N-Acetyllysin; O-Phosphoserin, N-Acetylserin, N-Formylmethionin, 3-Methylhistidin, 5-Hydroxylysin, ω-N-Methylarginin und andere ähnliche Aminosäuren und Iminosäuren (z.B. 4-Hydroxypyrolin). Gemäß der standardmäßigen Verwendung und Konvention ist in der hierin verwendeten Polypeptidbenennung die Linksrichtung die aminoterminale Richtung und die Rechtsrichtung die carboxyterminale Richtung. Auf ähnliche Art und Weise ist das linke Ende der einzelsträngigen Polynucleotidsequenzen wenn nicht anders angegeben das 5'-Ende, die linke Richtung der doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen wird als 5'-Richtung bezeichnet. Die Richtung von der 5'-zu-3'-Addition naszierender RNA-Transkripte wird als Transkriptionsrichtung bezeichnet, die Sequenzregionen auf dem DNA-Strang mit derselben Sequenz wie die RNA, die 5' zum 5'-Ende der RNA-Transkripte sind, werden als „Stromauf-Sequenzen" bezeichnet, Sequenzregionen auf dem DNA-Strang mit derselben Sequenz wie die RNA, die 3' zum 3'-Ende des RNA-Transkripts sind, werden als „Stromab-Sequenzen" bezeichnet.
Der Begriff „Polynucleotidsequenz" bezeichnet ein einzelsträngiges oder doppelsträngiges Polymer von Desoxyribonucleotid- oder Ribonucleotidbasen, gelesen vom 5'- zum 3'-Ende. Es umfasst selbst-replizierende Plasmide, infektiöse Polymere von DNA oder RNA und nicht-funktionelle DNA oder RNA.
Die folgenden Begriffe werden dazu verwendet, die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehreren Polynucleotiden zu beschreiben: „Referenzsequenz", „Vergleichsfenster", „Sequenzidentität", „Prozentsatz der Sequenzidentität" und „wesentliche Identität". Eine „Referenzsequenz" ist eine definierte Sequenz, die als Basis für einen Sequenzvergleich verwendet wird, eine Referenzsequenz kann eine Teilmenge einer größeren Sequenz sein, z.B. als ein Segment einer cDNA voller Länge oder einer Gensequenz, die in einem Sequenzprotokoll angegeben ist, wie z.B. die in 5 dargestellte Polynucleotidsequenz, oder kann eine vollständige cDNA oder Gensequenz umfassen. Im Allgemeinen ist eine Referenzsequenz zumindest 20 Nucleotide lang, häufig zumindest 25 Nucleotide und oft zumindest 50 Nucleotide. Da zwei Polynucleotide jeweils (1) eine Sequenz umfassen (d.h. einen Abschnitt der vollständigen Polynucleotidsequenz), die zwischen den beiden Polynucleotiden ähnlich ist, und (2) weiters eine Sequenz umfassen kann, die zwischen den beiden Polynucleotiden divergiert, werden Sequenzvergleiche zwischen zwei (oder mehreren) Polynucleotiden typischerweise durchgeführt, indem Sequenzen der zwei Polynucleotide über ein „Vergleichsfenster" verglichen werden, um lokale Regionen der Sequenzähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen. Ein „Vergleichsfenster" beschreibt wie hierin verwendet ein konzeptuelles Segment von zumindest 20 zusammenhängenden Nucleotidpositionen, worin eine Polynucleotidsequenz mit einer Referenzsequenz von zumindest 20 zusammenhängenden Nucleotiden verglichen werden kann und worin der Abschnitt der Polynucleotidsequenz im Vergleichsfenster zur optimalen Anordnung der zwei Sequenzen Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) im Ausmaß von 20 Prozent oder weniger im Vergleich zur Referenzsequenz umfassen kann (die keine Additionen oder Deletionen umfasst). Eine optimale Anordnung von Sequenzen zur Anordnung eines Vergleichsfensters kann mithilfe eines lokalen Homologiealgorithmus von Smith & Waterman, Appl. Math. 2, 482 (1981), durch den Homologieanordnungsalgorithmus von Needleman & Wunsch , J. Mol. Biol. 48, 443 (1970), durch das Verfahren zur Bestimmung von Ähnlichkeit von Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85, 2444 (1988), durch computerisierte Implementationen dieser Algorithmen (FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Information) oder GAP, BESTFIT, FAST und TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madi son, Wisconsin)) oder durch Inspektion durchgeführt werden, und es wird die beste Anordnung (d.h. die im höchsten Prozentsatz der Sequenzähnlichkeit gegenüber dem Vergleichsfenster resultiert), die von den verschiedenen Verfahren erzeugt wird, ausgewählt. Der Begriff „Sequenzidentität" bedeutet, dass zwei Polynucleotidsequenzen über das Vergleichsfenster identisch sind (d.h. auf einer Nucleotid-für-Nucleotid-Basis). Die Formulierung „Prozentsatz der Sequenzidentität" wird berechnet, indem zwei über das Vergleichsfenster optimal angeordnete Sequenzen verglichen werden, die Zahl der Positionen, an welchen die identische Nucleinsäurebase (z.B. A, T, C, G, U oder I) in beiden Sequenzen auftritt, bestimmt wird, was die Zahl der übereingestimmten Positionen ergibt, die Zahl der übereingestimmten Positionen durch die Gesamtzahl der Positionen im Vergleichsfenster (d.h. der Fenstergröße) dividiert wird und das Ergebnis mit 100 multipliziert wird, um den Prozentsatz der Sequenzidentität zu ergeben. Der Begriff „wesentliche Identität" bezeichnet wie hierin verwendet eine Eigenschaft einer Polynucleotidsequenz, worin das Polynucleotid eine Sequenz umfasst, die zumindest 70, 80 oder 85 Prozent Sequenzidentität aufweist, vorzugsweise zumindest 90 bis 95 Prozent Sequenzidentität, noch üblicher zumindest 99 Prozent Sequenzidentität, im Vergleich zu einer Referenzsequenz über ein Vergleichsfenster von zumindest 20 Nucleotidpositionen, häufig über ein Fenster von zumindest 25-50 Nucleotiden, worin der Prozentsatz der Sequenzidentität durch den Vergleich der Referenzsequenz mit der Polynucleotidsequenz berechnet wird, die Deletionen oder Additionen umfassen kann, die 20 Prozent oder weniger der Referenzsequenz über das Vergleichsfenster ergeben. Die Referenzsequenz kann eine Teilmenge einer größeren Sequenz umfassen, z.B. als Segment der in 5 dargestellten ACT-4-h-1-Sequenz voller Länge.
Wenn der Begriff „wesentliche Identität" auf Polypeptide angewendet wird, hat er die Bedeutung, dass zwei Peptidsequenzen, wenn sie optimal angeordnet werden, wie z.B. durch die Programme BLAZE (Intelligenetics), GAP oder BESTFIT unter Einsatz von Standardlückengewichten, sie zumindest 70 oder 80 Prozent Sequenzidentität, bevorzugt zumindest 90 Prozent Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 95 Prozent Sequenzidentität oder mehr (z.B. 99 Prozent Sequenzidentität), aufweisen. Vorzugsweise unterscheiden sich nicht identische Restpositionen durch konservative Aminosäuresubstitutionen. Konservative Aminosäuresubstitutionen bezeichnen die Auswechselbarkeit von Resten mit ähnlichen Seitenketten. Zum Beispiel besteht eine Gruppe von Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten aus. Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin, eine Gruppe von Aminosäuren mit aliphatischen Hydroxylseitenketten aus Serin und Threonin, eine Gruppe von Aminosäuren mit amidhältigen Seitenketten aus Asparagin und Glutamin, eine Gruppe von Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten aus Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan, eine Gruppe von Aminosäuren mit basischen Seitenketten aus Lysin, Arginin und Histidin und eine Gruppe von Aminosäuren mit schwefelhältigen Seitenketten aus Cystein und Methionin. Bevorzugte konservative Aminosäuresubstitutionsgruppen sind: Valin-Leucin-Isoleucin, Phenylalanin-Tyrosin, Lysin-Arginin, Alanin-Valin und Asparagin-Glutamin.
Die Formulierung „im Wesentlichen rein" bedeutet, dass eine Zielspezies die vorherrschende gegenwärtige Spezies ist (d.h. auf molarer Basis häufiger als jede andere spezielle Spezies in der Zusammensetzung vorhanden ist) und dass vorzugsweise eine im Wesentlichen gereinigte Fraktion eine Zusammensetzung ist, worin die Zielspezies zumindest etwa 50 Prozent (auf molarer Basis) aller gegenwärtigen makromolekularen Spezies umfasst. Im Allgemeinen umfasst eine im Wesentlichen reine Zusammensetzung mehr als etwa 80 bis 90 Prozent aller makromolekularen Spezies, die in der Zusammensetzung gegenwärtig sind. Noch bevorzugter wird die Zielspezies auf wesentliche Homogenität gereinigt (eine kontaminierte Spezies kann in der Zusammensetzung mittels herkömmlicher Detektionsverfahren nicht detektiert werden), worin die Zusammensetzung im Wesentlichen aus einer einzigen makromolekularen Spezies besteht.
Der Begriff „natürlich auftretend" bezeichnet wie hierin verwendet und auf ein Ziel angewendet die Tatsache, dass ein Ziel in der Natur zu finden ist. Zum Beispiel ist eine Polypeptid- oder Polynucleotidsequenz, die in einem Organismus gegenwärtig ist (einschließlich Viren), die aus einer Quelle in der Natur isoliert werden kann und nicht vorsätzlich von Menschenhand im Labor modifiziert wurde, natürlich auftretend.
Der Begriff „Epitop" umfasst jegliche Proteindeterminante, die in der Lage ist, spezifisch an ein Immunglobulin oder einen T-Zellrezeptor zu binden. Es besteht eine spezifische Bindung, wenn die Dissoziationskonstante für die Antikörperbindung an ein Antigen ≤ 1 μM, vorzugsweise ≤ 100 nM und am bevorzugtesten ≤ 1 nM, ist. Epitopische Determinanten bestehen üblicherweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen, wie z.B. Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, und haben für gewöhnlich spezielle dreidimensionale strukturelle Eigenschaften wie auch spezifische Ladungseigenschaften.
Der Begriff „stärker verwandte Varianten" bezeichnet wie hierin verwendet eine Gensequenz, die evolutionär ist und funktionell zwischen Menschen und höheren Säugetierspezies verwandt ist, wie z.B. Primaten, Schweinen und Rindern. Der Begriff umfasst nicht Gensequenzen von Nagetieren, wie z.B. Ratten. Daher ist das verwandte Primatengen zum ACT-4-h-1-Gen das Primatengen, das für ein exprimiertes Protein kodiert, welches den höchsten Grad an Sequenzidentität mit dem ACT-4-h-1-Rezeptorprotein aufweist und das ein Expressionsmuster ähnlich zu jenem des ACT-4-h-1 Protein zeigt (d.h. exprimiert auf aktivierten CD4⁺-Zellen).
Der Begriff „Patient" umfasst menschliche und veterinäre Subjekte.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
1. ACT-4-Rezeptorpolypeptide
Es werden Rezeptoren auf der Oberfläche von aktivierten CD4⁺-T-Zellen (die als ACT-4-Rezeptoren bezeichnet werden) und Fragmenten davon bereitgestellt. Der Begriff ACT-4-Rezeptorpolypeptid wird generisch verwendet, um Rezeptoren voller Länge und Fragmente davon zu umfassen. Die Aminosäuresequenz des ersten ACT-4-Rezeptors, der charakterisiert werden soll (hierin nachstehend als ACT-4-h-1 bezeichnet), ist in 5 dargestellt. Die Erfindung –h bezeichnet den menschlichen Ursprung, und die Erfindung –1 gibt an, dass ACT-4-h-1 der erste ACT-4-Rezeptor ist, der charakterisiert wird. Der Begriff ACT-4-Rezeptor bezeichnet nicht nur das Protein mit der in 5 dargestellte Sequenz, sondern auch andere Proteine, die allele, nichtallele und stärker zugehörige Varianten von ACT-4-h-1 darstellen, und natürliche oder induzierte Mutanten einer dieser. Für gewöhnlich zeigen ACT-4-Rezeptorpolypeptide eine wesentliche Sequenzidentität mit der ACT-4-h-1-Sequenz. Typischerweise enthält ein ACT-4-Rezeptorpolypeptid zumindest 4 und häufiger 5, 6, 7, 10 oder 20, 50 oder mehr zusammenhängende Aminosäuren der ACT-4-h-1-Sequenz. Es ist fachbekannt, dass funktionelle Domänen, wie z.B. Bindungsdomänen, oder Epitope aus nur vier Aminosäureresten gebildet werden.
ACT-4-Rezeptorpolypeptide zeigen typischerweise wesentliche Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von ACT-4-h-1 und können von Nucleotidsequenzen kodiert werden, die wesentliche Sequenzidentität mit der Nucleotidsequenz aufweisen, die für das in 5 dargestellte ACT-4-h-1 kodiert. Die Nucleotide, die für die ACT-4-Rezeptorproteine kodieren, hybridisieren unter stringenten Bedingungen typischerweise auch an die ACT-4-h-1-Sequenz. Diese Nucleotide hybridisieren üblicherweise jedoch nicht unter stringenten Bedingungen an die Nucleinsäure, die für den OX-40-Rezeptor kodiert, wie von Mallet et al., EMBO J. 9, 1063-68 (1990), beschrieben. (Siehe insbesondere 2A des Verweises von Mallet et al.) Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und sind unter verschiedenen Umständen unterschiedlich. Im Allgemeinen sollen stringente Bedingungen etwa 5 °C niedriger sein als der thermische Schmelzpunkt (Tm) der spezifischen Sequenz bei definierter Ionenstärke und pH. Die Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und pH), bei welcher 50 % der Targetsequenz an eine perfekt übereingestimmte Sonde hybridisieren. Typischerweise sind stringente Bedingungen jene Bedingungen, unter welchen die Salzkonzentration zumindest etwa 0,02 molar bei pH 7 und die Temperatur weniger als etwa 60 °C beträgt. Da andere Faktoren die Stringenz der Hybridisierung signifikant beeinflussen, einschließlich unter anderem die Basenzusammensetzung und Größe der komplementären Stränge, ist die Gegenwart organischer Lösungsmittel und das Ausmaß der Basenfehlpaarung, die Kombination von Parametern wichtiger als die absolute Messung irgendeines Parameters.
Für gewöhnlich teilen ACT-4-Rezeptorpolypeptide zumindest eine antigene Determinante mit ACT-4-h-1, reagieren aber nicht spezifisch mit Antikörpern gegen das Ratten-OX-40-Polypeptid. Die Existenz einer gemeinsamen Antigendeterminante wird durch Kreuzreaktivität des Variantenproteins mit einem Antikörper nachgewiesen, der gegen ACT-4-h-1 hergestellt wird (siehe Abschnitt IV). Die Kreuzreaktivität wird oft unter Einsatz polyklonaler Seren gegen ACT-4-h-1 getestet, kann aber auch unter Einsatz einer oder mehrere monoklonaler Antikörper gegen ACT-4-h-1, wie z.B. den L106 genannten Antikörper, getestet werden.
Oft enthalten ACT-4-Rezeotorpolypeptide modifizierte Polypeptid-Rückgrate. Modifikationen umfassen chemische Derivatisierungen von Polypeptiden, wie z.B. Acetylierungen, Carboxylierungen und dergleichen. Sie umfassen auch Glykosylierungsmodifikationen (N- und O-gebunden) und verarbeitende Varianten eines typischen Polypeptids. Diese Verarbeitungsschritte umfassen spezifisch Enzymmodifikationen, wie z.B. Ubiquitinierung und Phosphorylierung. Siehe z.B. Hershko & Ciechanover, Ann. Rev. Bioch. 51, 335-364 (1982). Das ACT-4-h-1-Protein wird z.B. stark modifiziert, insofern, dass das beobachtete Molekulargewicht etwa 50 kDa beträgt, während das vorausberechnete Molekulargewicht, das auf der Aminosäuresequenz basierte, nur 27 kDa beträgt. Es sind zwei vermeintliche Glykosylierungsstellen in seiner extrazellulären Domäne identifiziert worden.
ACT-4-Rezeptoren teilen wahrscheinlich manche oder alle topologischen Eigenschaften, die für ACT-4-h-1 gefunden wurden. Die Aminosäuresequenz für ACT-4-h-1 enthält eine vermeintliche N-terminate Signalsequenz mit 22 oder 24 Aminosäuren. Die 24-Aminosäuresequenz basiert wahrscheinlicher auf den Kriterien von Heijne, Nucleic Acids Res. 14, 4683-4690 (1986) (hierin für alle Zwecke durch Verweis aufgenommen). Der ACT-4-h-1-Rezeptor enthält einen einzigen zusätzlichen hydrophoben Abschnitt von 27 Aminosäuren, welcher sich über die Reste 213-240 erstreckt. Der hydrophobe Abschnitt entspricht vermutlich einer Transmembrandomäne, und seine Gegenwart entspricht ACT-4-h-1 als integralem Membranprotein vom Typ I (d.h. mit einer einzigen Transmembrandomäne, worin die N-terminate Domäne die extrazelluläre Region umfasst und der C-Terminus die intrazelluläre Region umfasst).
Die 189 oder 191 Aminosäuren (abhängig vom exakten Ort der Signalspaltstelle) von ACT-4-h-1, die amino-proximal zum Transmembransegment liegen, werden extrazelluläre Domäne genannt, während die 37 Aminosäuren, die carboxy-proximal zum Transmembransegment liegen, intrazelluläre Domäne genannt werden. Vom Amino-Terminus hat die extrazelluläre Domäne eine vermeintliche hydrophobe NH₂-terminale Signalsequenz und drei Intrakettenschleifen, die durch Disulfidbindung zwischen gepaarten Cysteinresten gebildet werden.
Die topologische Anordnung von ACT-4-Rezeptorpolypeptiden ist jener anderer Mitglieder der Nervenwachstumsfaktorrezeptorfamilie ähnlich, insbesondere dem Ratten-OX-40-Rezeptor. Die anderen Mitglieder zeigen eine gewisse Divergenz in der Zahl extrazellulärer Disulfidschleifen und Glykosylierungsstellen und in der Größe der intrazellulären Domäne. Siehe Mallet & Barclay, siehe oben.
Obwohl nicht alle zuvor diskutierten Domänen notwendigerweise in allen ACT-4-Rezeptorpolypeptiden vorliegen, wird von einer extrazellulären Domäne erwartet, in den meisten gegenwärtig zu sein. Es ist tatsächlich bei einigen ACT-4-Rezeptorpolypeptiden möglich, dass nur eine extrazelluläre Domäne gegenwärtig ist und der natürliche Zustand solcher Proteine nicht zelloberflächengebundene Proteine, sondern lösliche Proteine ist, z.B. in einer extrazellulären Körperflüssigkeit dispergiert. Die Gegenwart löslicher Variantenformen ist für andere Zelloberflächenrezeptoren beobachtet worden, einschließlich ein Mitglied der Nervenwachstumsfaktorrezeptorfamilie, SFV-T2. Siehe Mallet & Barclay, siehe oben.
Neben im Wesentlichen Volllängenproteinen stellt die vorliegende Erfindung biologisch aktive Fragmente der Polypeptide bereit. Signifikante biologische Aktivitäten umfassen Rezeptorbindung, Antikörperbindung (z.B. konkurriert das Fragment mit einem intakten ACT-4-Rezeptor um spezifische Bindung an einen Antikörper), Immunogenizität (d.h. Besitz von Epitopen, welche die B- oder T-Zellantworten gegen das Fragment stimulieren) und Agonismus oder Antagonismus der Bindung eines ACT-4-Rezeptorpolypeptids an seinen Liganden. Ein Segment eines ACT-4- Rezeptorproteins oder eine Domäne davon umfasst für gewöhnlich zumindest etwa 5, 7, 9, 11, 13, 16, 20, 40, oder 100 zusammenhängende Aminosäuren.
Segmente von ACT-4-Rezeptorpolypeptiden enden oft nahe den Grenzen funktioneller oder struktureller Domänen. Strukturelle und funktionelle Domänen werden durch den Vergleich von Nucleotid- und/oder Aminosäuresequenzdaten wie z.B. in 5 dargestellt mit öffentlichen oder privaten Sequenzdatenbanken identifiziert. Vorzugsweise werden computerisierte Vergleichsverfahren dazu verwendet, Sequenzmotive oder voraussichtliche Proteinkonformationsdomänen, die in anderen Proteinen bekannter Struktur und/oder Funktion auftreten, zu identifizieren. Strukturelle Domänen umfassen eine intrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne und eine extrazelluläre Domäne, die hingegen drei disulfidgebundene Schleifen enthält. Funktionelle Domänen umfassen eine extrazelluläre Bindungsdomäne, durch welche das ACT-4-Rezeptorpolypeptid mit externen löslichen Molekülen oder anderen zellgebundenen Liganden wechselwirkt, und eine intrazelluläre signaltransduzierende Domäne.
Einige Fragmente enthalten nur extrazelluläre Domänen, wie z.B. eine oder mehrere disulfidgebundene Schleifen. Solche Fragmente behalten oft die Bindungsspezifität eines intakten ACT-4-Rezeptorpolypeptids bei, sind jedoch eher löslich als membrangebunden. Solche Fragmente sind als kompetitive Inhibitoren der ACT-4-Rezeptorbindung zweckdienlich.
ACT-4-Rezpetoren werden weiters durch ihren Status als Mitglieder der Nervenwachstumsfaktorrezeptorfamilie identifiziert. Die Aminosäuresequenz von ACT-4-h-1 ist zumindest zu 20 % mit NGF-R, TNF-R, CD40, 4-1BB und fas/APO1 identisch. ACT-4-h-1 zeigt 62 % Aminosäuresequenzidentität mit dem Ratten-OX-40-Gen, das auch durch selektive Expression auf aktivierten CD4⁺-Zellen charakterisiert ist.
ACT-4-Rezeptoren werden auch durch eine charakteristische Zellverteilung identifiziert. Am bemerkenswertesten ist, dass ACT-4-Rezeptoren für gewöhnlich einfach auf aktivierten CD4⁺-T-Zellen detektiert werden (Prozentsatz der Zellen, die für gewöhnlich mehr als 25 oder 50 % und oft etwa 80 % exprimieren; worin die mittlere Kanalfluoreszenz für gewöhnlich größer als etwa 10 und oft etwa 20-25 % auf einem „Coulter Profile Flow Cytometer" nach Immunfluoreszenzfärbung ist). ACT-4-Rezeptoren sind für gewöhnlich auf den ruhenden T-Zellen, B-Zellen (wenn sie nicht mit PMA aktiviert werden), NK-Zellen und Monozyten (wenn sie nicht mit PMA aktiviert werden) im Wesentlichen abwesend. „Im Wesentlichen abwesend" bedeutet, dass der Prozentsatz der Zellen, die ACT-4 exprimieren, für gewöhnlich geringer als etwa 5 % ist und noch üblicher geringer als etwa 2 % und dass der mittlere Kanal für gewöhnlich geringer als etwa 4 ist und noch üblicher geringer als etwa 2, gemessen auf einem „Coulter Profile Flow Cytometer", nach Immunfluoreszenzfärbung der Zellen (siehe Beispiel 2). ACT-4-Rezeptoren werden für gewöhnlich in geringem Ausmaß auf aktivierten CD8⁺-Zellen exprimiert (Prozent der Zellen, die etwa 4-10 % exprimieren, mittlere Kanalfluoreszenz etwa 2-4 auf einem „Coulter Profile Flow Cytometer" nach Immunfluoreszenzfärbung). Das geringe Expressionsausmaß, das auf CD8⁺-Zellen zu beobachten ist, zeigt, dass die Expression auf eine Unterpopulation von CD8⁺-Zellen beschränkt ist. Die Expression von ACT-4-Rezeptoren auf der Oberfläche aktivierter CD4⁺-Zellen ist für mehrere verschiedene Aktivierungsmechanismen, einschließlich alloantigener, tetanus-toxoider oder mitogener (z.B. PHA-) Reize, beobachtet worden. Die Expression ist nach etwa 7 Tagen alloantigener oder tetanus-toxoider Stimulation und nach etwa drei Tagen der PHA-Stimulation am höchsten. Diese Daten zeigen, dass ACT-4-Rezeptoren wie Antigene mit früher Aktivierung, die auf den ruhenden Zellen im Wesentlichen abwesend sind, klassifiziert. werden sollten. Die Beobachtung, dass ACT-4-Rezeptoren vorzugsweise auf aktivierten CD4⁺-Zellen exprimiert werden und in viel geringerem Ausmaß auf aktivierten CD8⁺-Zellen exprimiert werden, aber auf den meisten oder allen Unterarten von Lymphzellen (ausgenommen als Antwort auf höchst unphysiologische Reize wie z.B. PMA) im Wesentlichen fehlen, steht im Gegensatz zur Zelltypspezifität anderer Aktivierungsantigene, die auf menschlichen Leukozyten zu finden sind.
Die Expression von ACT-4-Rezeptoren auf der Oberfläche aktivierter CD4⁺-T-Zellen lässt darauf schließen, dass der Rezeptor eine Rolle bei der Aktivierung dieser Zellen spielt. Eine solche Rolle entspricht jener anderer Mitglieder der Nervenwachstumsfaktorrezeptorfamilie. Zum Beispiel stimuliert CD40 den G1-S-Phasenübergang in B- Lymphozyten, und der Nervenwachstumsfaktorrezeptor transduziert ein Signal vom zytokinen Nervenwachstumsfaktor, was in Nervendifferenzierung und -überleben resultiert (Y.-A. Barde, Neuron 2; 1525-1534 (1989)) (hierin für alle Zwecke durch Verweis aufgenommen). Jedoch können auch andere Rollen für ACT-4-Rezeptoren ins Auge gefasst werden, z.B. die Wechselwirkung mit anderen Lymphzelltypen. Die Gegenwart solcher Rollen entspricht den verschiedenen Funktionen anderer Nervenwachstumsrezeptorfamilienmitglieder, wie z.B. dem Tumor-Nekrose-Faktor, dessen Wechselwirkung mit dem Tumornekrosefaktorrezeptor zu Entzündungen oder Tumorzelltod führen kann.
Fragmente oder Analoga, die im Wesentlichen eine oder mehrer funktionelle Domänen umfassen (z.B. eine extrazelluläre Domäne), von ACT-4-Rezeptoren können an heterologe Polypeptidsequenzen fusioniert werden, sodass das resultierende Fusionsprotein die funktionelle(n) Eigenschaft(en) zeigt, die durch das ACT-4-Rezeptorfragment und/oder den Fusionspartner verliehen werden. Die Orientierung des ACT-4-Rezeptorfragments in Bezug auf den Fusionspartner hängt von den experimentellen Überlegungen wie z.B. einer erleichterten Herstellung, Stabilität gegenüber Proteolyse, thermischer Stabilität, immunologischer Reaktivität, Amino- oder Carboxyl-terminaler Restmodifikation und so weiter ab. Potenzielle Fusionspartner umfassen chromogene Enzyme, wie z.B. β-Galactosidase, Protein A oder G, ein FLAG-Protein, wie z.B. das von Blanar & Rutter, Science 256, 1014-1018 (1992), beschriebene, Toxine (z.B. Diphterietoxin, Pseudonomas-Ektotoxin-A, Ricintoxin oder Phospholipase C) und Immunglobulinkomponenten.
Rekombinante Globuline (Rg), die durch Fusion von ACT-4-Rezeptorfragmenten und Immunglobulinkomponenten gebildet werden, haben oft die meisten oder alle physiologischen Eigenschaften, die mit der konstanten Region der speziell verwendeten Immunglobulinklasse verbunden sind. Zum Beispiel können die rekombinanten Globuline in der Lage sein, ein Komplement zu fixieren, antikörperabhängige Zelltoxizität zu vermitteln, B-Zellen zu stimulieren oder Blutgefäßwände zu durchdringen und in den interstitiellen Raum einzutreten. Die rekombinanten Globuline werden üblicherweise durch die Fusion des C-Terminus einer extrazellulären ACT-4-Rezeptordo mäne an den N-Terminus der konstanten Regiondomäne eines Schwerkettenimmunglobulins gebildet, wodurch die Konformation einer authentischen Immunglobulinkette simuliert wird. Die Immunglobulinkette ist bevorzugt menschlichen Ursprungs, insbesondere wenn das rekombinante Globutin zur therapeutischen Verwendung gedacht ist. Rekombinante Globuline sind für gewöhnlich löslich und haben eine Reihe vorteilhafter Eigenschaften in Bezug auf nicht modifizierte ACT-4-Rezeptoren. Diese Eigenschaften umfassen eine verlängerte Serumhalbwertszeit, die Fähigkeit, Targetzellen zu lysieren, für welche ein ACT-4-Rezeptor Affinität aufweist, durch Effektorfunktionen, und die Fähigkeit, Moleküle wie z.B. Protein A und G zu binden, die verwendet werden können, um das rekombinante Globulin in Bindungsanalysen zu immobilisieren.
II. Verfahren zur Produktion von Polypeptiden
A. Rekombinationsverfahren
Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen von ACT-4-h-1, die in 5 dargestellt sind, und entsprechende Sequenzen für andere ACT-4-Rezeptorvarianten, die in Abschnitt III siehe unten beschrieben sind, ermöglichen die Produktion von Polypeptiden der ACT-4-Rezptorpolypeptidsequenzen voller Länge und Fragmenten davon. Solche Polypeptide können in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen durch Expression von Polynucleotiden produziert werden, die für den ACT-4-Rezeptor oder Fragmente und Analoga davon kodieren. Die klonierten DNA-Sequenzen werden in Wirten exprimiert, nachdem die Sequenzen operabel an eine Expressionskontrollsequenz in einem Expressionsvektor gebunden sind (d.h. so positioniert sind, dass die Funktion der Expressionskontrollsequenz in einem Expressionsvektor gesichert ist). Expressionsvektoren sind typischerweise entweder als Episome oder als wichtiger Teil der Wirtschromosomen-DNA in Wirtsorganismen replizierbar. Häufig enthalten Expressionsvektoren Selektionsmarker, z.B. Tetracyclinresistenz der Hygromycinresistenz, um die Detektion und/oder Auswahl dieser Zellen zu ermöglichen, die mit den gewünschten DNA-Sequenzen transformiert wurden (siehe z.B. US-Patent Nr. 4.704.362).
E. coli ist ein prokaryotischer Wirt, der zur Klonierung der DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung zweckdienlich ist. Andere Mikrobenwirte, die zur Verwendung geeignet sind, umfassen Bacilli, wie z.B. Bacillus subtilis, und andere Enterobacteriaceae, wie z.B. Salmonella, Serratia und verschiedene Pseudomonas-Spezies. In diesen prokaryotischen Wirten können auch Expressionsvektoren hergestellt werden, die typischerweise Expressionskontrollsequenzen enthalten, die mit der Wirtszelle kompatibel sind (z.B. ein Replikationsstartpunkt). Zusätzlich ist jede beliebige Zahl einer Vielzahl von bekannten Promotoren gegenwärtig, wie z.B. das Lactosepromotorsystem, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem, ein Beta-Lactamase-Promotorsystem oder ein Promotorsystem von Phagenlambda. Die Promotoren steuern typischerweise die Expression, gegebenenfalls mit einer Operatorsequenz, und haben Ribosomenbindungsstellensequenzen und dergleichen zur Initiierung und Durchführung von Transkription und Translation.
Zur Expression können auch andere Mikroben, wie z.B. Hefe, verwendet werden. Saccharomyces ist ein bevorzugter Wirt, und zwar mit geeigneten Vektoren, die Expressionskontrollsequenzen aufweisen, wie z.B. Promotoren, einschließlich 3-Phosphoglyceratkinase oder anderer glykolytischer Enzyme, und wie gewünscht einem Replikationsstartpunkt, mit Terminationssequenzen und dergleichen. Insektenzellen (z.B. SF9) mit geeigneten Vektoren, die für gewöhnlich vom Baculovirus abstammen, sind auch dazu geeignet, ACT-4-Rezeptor- oder Ligandenpolypeptide zu exprimieren. Siehe Luckow et al., Bio/Technology 6, 47-55 (1988) (für alle Zwecke hierin durch Verweis aufgenommen).
Höhere eukaryotische Säugetiergewebszellkulturen können auch dazu verwendet werden, die Polypeptide der vorliegenden Erfindung zu exprimieren und zu produzieren (siehe Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, NY, NY (1987)) (für alle Zwecke hierin durch Verweis aufgenommen). Tatsächlich werden eukaryotische Zellen bevorzugt, da eine Reihe geeigneter Wirtszelllinien, die in der Lage sind, menschliche Proteine zu sekretieren und authentisch zu modifizieren, auf dem Gebiet der Erfindung entwickelt worden sind, und umfassen CHO-Zelllinien, verschiedene COS-Zelllinien, HeLa-Zellen, Myelomzelllinien, Jurkat-Zellen etc. Expressions vektoren für diese Zellen können Expressionskontrollsequenzen umfassen, wie z.B. einen Replikationsstartpunkt, einen Promotor (z.B. einen HSV-tk-Promotor oder pgk-(Phosphoglyceratkinase-) Promotor), einen Enhancer (Queen et al., Immunol. Rev. 89, 49 (1986)) und notwendige verarbeitende Informationsstellen, wie z.B. Ribosombindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen (z.B. eine SV40-large-T-Ag-Poly-A-Additionsstelle), und Transkriptionsterminatorsequenzen. Bevorzugte Expressionskontrollsequenzen sind Promotoren, die von Immunglobulingenen, SV40, Adenovirus, Rinderpapillomavirus und dergleichen stammen. Die Vektoren, die DNA-Segmente von Interesse enthalten (z.B. Polypeptide, die für einen ACT-4-Rezeptor kodieren), können mittels fachbekannter Verfahren in die Wirtszelle transferiert werden, die abhängig von der Art des Zellwirts variieren. Zum Beispiel wird die CaCl₂-Transfektion häufig für prokaryotische Zellen verwendet, während CaPO₄-Behandlung oder Elektroporation für andere Zellwirte verwendet werden können. Die Vektoren können als Episom bestehen oder in das Wirtschromosom integriert sein.
B. Natürlich auftretende ACT-4-Rezeptorproteine
Natürliche ACT-4-Rezeptorpolypetide werden mittels herkömmlicher Verfahren wie z.B. Affinitätschromatographie isoliert. Zum Beispiel werden polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen zuvor gereinigte ACT-4-h-1 gezüchtet und mittels fachbekannter Verfahren an eine geeignete Affinitätssäule angebracht. Siehe z.B. Hudson & Hay, Practical Immunology (Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK (1980)), Kapitel 8 (für alle Zwecke hierin durch Verweis aufgenommen). Zum Beispiel kann Anti-ACT-4-h-1 durch Vernetzung der F_c-Domäne mit einem homobifunktionellen Vernetzer, z.B. Dimethyl-Pimelinimidat, auf einer Protein-A-Sepharosesäule immobilisiert werden. Die Zellextrakte werden dann durch die Säule geleitet und das ACT-4-Rezeptorprotein spezifisch an die Säule gebunden und z.B. mit 0,5 M pyrogener Säure, pH 2,5, eluiert. Für gewöhnlich wird eine intakte Form des ACT-4-Rezeptors mithilfe solcher Isolationsverfahren erhalten. Peptidfragmente werden mittels chemischer (z.B. Cyanogenbromid-) oder enzymatischer Spaltung (z.B. V8-Protease oder Trypsin) des intakten Moleküls aus intakten ACT-4-Rezeptoren erhalten.
C. Andere Verfahren
Alternativ dazu können ACT-4-Rezeptorpolypeptide mittels chemischer Verfahren synthetisch hergestellt werden oder durch In vitro-Translationssysteme unter Einsatz einer Polynucleotidmatrize zur Steuerung von Translation produziert werden. Verfahren zur chemischen Synthese von Polypeptiden und In-vitro-Translation sind fachbekannt und von Berger & Kimmel, Methods in Enzymology, Band 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, Kalifornien (1987), weiter beschreiben.
III. Nucleinsäuren
A. Klonierung von ACT-4-Rezeptornucleinsäuren
Beispiel 5 zeigt die Nucleinsäuresequenzdaten für einen cDNA-Klon eines ACT-4-Rezeptors, der ACT-4-h-1 genannt wird. Die Sequenz umfasst sowohl die translatierte Region und 3'- und 5'-flankierende Regionen. Diese Sequenzdaten können dazu verwendet werden, Sonden herzustellen, mit welchen andere ACT-4-Rezeptorgene isoliert werden können. Diese Gene umfassen das menschliche genomische Gen, das für ACT-4-h-1 kodiert, und cDNA und genomische Klone höherer Säugetierspezies und alleler und nicht-alleler Varianten und natürliche und induzierte Mutanten all dieser Gene. Insbesondere werden alle Nucleinsäurefragmente bereitgestellt, die für alle in dieser Anwendung offenbarten ACT-4-Rezeptorpolypeptide kodieren. Genomische Bibliotheken vieler Spezies sind im Handel erhältlich (z.B. Clontech, Palo Alto, Kalifornien) oder können mittels herkömmlicher Verfahren de novo isoliert werden. cDNA-Bibliotheken werden am besten aus aktivierten CD4⁺-Zellen hergestellt, die AC-4-h-1 in großen Mengen exprimieren.
Die Sonden, die zur Isolation von Klonen verwendet werden, umfassen typischerweise eine Sequenz von zumindest etwa 24 zusammenhängenden Nucleotiden (oder deren Komplementen) der in 5 dargestellten cDNA-Sequenz. Zum Beispiel kann ein Polynucleotid voller Länge, das der in 5 dargestellten Sequenz entspricht, markiert werden und als Hybridisierungssonde zur Isolation von genomischen Klonen aus einer menschlichen genomischen Klonbibliothek in z.B. λEMBL4 oder λGEM11 (Promega Corporation, Madison, Wisconsin) verwendet werden; typische Hybridisierungsbedingungen zum Screenen von Plaque-Hybridisierungen (Benton & Davis, Science 196, 180 (1978)) können Folgende sein: 50 % Formamid, 5 × SSC oder SSPE, 1-5 × Denhardt-Lösung, 0,1-1 % SDS, 100-200 μg gescherte heterologe DNA oder tRNA, 0-10 % Dextransulfat, 1 × 10⁵ bis 1 × 10⁷ cpm/ml einer denaturierten Sonde mit einer spezifischen Aktivität von etwa 1 × 10⁸ cpm/μg und Inkubation bei 42 °C für einen Zeitraum von etwa 6-36 Stunden. Die Prähybridisierungsbedingungen sind im Wesentlichen identisch, mit der Ausnahme, dass die Sonde nicht inkludiert ist und die Inkubationszeit typischerweise reduziert ist. Die Waschbedingungen sind typischerweise 1-3 × SSC, 0,1-1 % SDS, 50-70 °C mit einem Austausch der Waschlösung bei etwa 5-30 Minuten. Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind typischerweise weniger stringent für die Isolierung höherer zugehöriger oder nicht-alleler Varianten als z.B. für den menschlichen genomischen Klon von ACT-4-h-1.
Alternativ dazu können Sonden verwendet werden, um ACT-4-Rezeptorgene durch Verfahren zu klonieren, welche die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwenden. Verfahren zur PCR-Ampifikation sind z.B. in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Hrsg. H.A. Erlich Freeman Press, NY, NY, (1992)); PCR Protocol: A Guide to Methods and Applications (Hrsg. Innis et al., Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990)); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991), K.A. Eckert und T.A. Kunkel, PCR Methods and Applications 1, 17 (1991), PCR (Hrsg., McPherson et al., IRL Press, Oxford); und im US-Patent Nr. 4.683.202. beschrieben.
Alternativ dazu können synthetische Polynucleotidsequenzen, die allen oder einem Teil der in 5 dargestellten Sequenzen entsprechen, mittels chemischer Synthese von Oligonucleotiden hergestellt werden.
Nucleotidsubstitutionen, -deletionen und -additionen können in die Polynucleotide der Erfindung eingeführt werden. Die Nucleotidsequenzvariation kann aus der Degeneration des genetischen Codes, aus Sequenzpolymorphismen verschiedener ACT-4-Rezeptorallele, geringfügigeren Seguenzierungsfehlern resultieren oder durch Zufallsmutagenese der kodierenen Nucleinsäuren unter Einsatz von Bestrahlung oder Exposition gegenüber EMS oder durch Veränderung, die durch ortsspezifische Mutagenese oder andere Verfahren moderner Molekularbiologie erzeugt werden, eingeführt werden. Siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY, 2. Auflage (Hrsg.) (1989)). Für Nucleotidsequenzen, die in der Lage sind, transkribiert und translatiert zu werden, um ein funktionelles Polypeptid zu produzieren, resultiert die Degeneration des genetischen Codes in einer Reihe von Nucleotidsequenzen, die für dasselbe Polypeptid kodieren. Die Erfindung umfasst all diese Sequenzen. Im Allgemeinen sollten Nucleotidsubstitutionen, -deletionen und -additionen die Fähigkeit eines ACT-4-Rezeptorpolynucleotids im Wesentlichen nicht stören, an die in 5 gezeigte Sequenz von ACT-4-h-1 unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren. Typischerweise umfassen ACT-4-Rezeptorpolynucleotide zumindest 25 aufeinander folgende Nucleotide, die mit einer natürlich auftretenden ACT-4-Rezeptorsequenz (z.B. 5) im Wesentlichen identisch sind, noch üblicher umfassen ACT-4-Rezeptorpolynucleotide zumindest 50 bis 100 aufeinander folgende Nucleotide, die mit einer natürlich auftretenden ACT-4-Rezeptorsequenz im Wesentlichen identisch sind.
ACT-4-Rezeptorpolynucleotide können kurze Oligonucleotide sein (z.B. etwa 10, 15, 25, 50 oder 100 zusammenhängende Basen der ACT-h-1-Sequenz, die in 5 dargestellt ist), wie z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden und PCR- (oder LCR-) Primer. ACT-4-Rezeptorpolynucleotidsequenzen können auch einen Teil eines größeren Polynucleotids umfassen, der Sequenzen umfasst, welche die Transkription (Expressionssequenzen) und die Translation der kodierenden Sequenzen erleichtern, sodass das kodierte Polypeptidprodukt produziert wird. Die Herstellung solcher Polynucleotide ist fachbekannt und weiters in Sambrook et al., siehe oben (C.S.H.P. Press, NY, 2. Auflage, (1989)), beschrieben. Das ACT-4-Rezeptorpolynucleotid kann im Leseraster mit einer anderen Polynucleotidsequenz, die für ein anderes Protein (z.B. Glutathion-S-Transferase, β-Galactosidase oder eine Immunglobulin-F_c-Domäne) kodiert, zur Kodierung der Expression eines Fusionsproteins fusioniert werden (siehe z.B. Byrn et al., Nature 344, 667-670 (1990)).
IV. Antikörper und Hybridome
Es werden Antikörper gegen ACT-4-Rezeptoren und zu ihren Liganden (siehe Abschnitt V) bereitgestellt.
A Allgemeine Eigenschaften von Antikörpern
Antikörper oder Immunglobuline bestehen typischerweise aus vier kovalent gebundenen Peptidketten. Zum Beispiel hat ein IgG-Antikörper zwei Leichtketten und zwei Schwerketten. Jede Leichtkette ist kovalent an eine Schwerkette gebunden. Hingegen ist jede Schwerkette kovalent an die andere gebunden, um eine „Y"-Konfiguration zu bilden, die auch als Immunglobulinkonformation bekannt ist. Fragmente dieser Moleküle oder sogar Schwer- oder Leichtketten alleine können Antigene binden. Antikörper, Fragmente von Antikörpern und einzelne Ketten werden hierin auch als Immunglobuline bezeichnet.
Eine Schwer- oder Leichtkette eines normalen Antikörpers hat eine N-terminale (NH₂) variable (V) Region und eine C-terminale (-COOH) konstante (C) Region. Die variable Schwerkettenregion wird als V_H bezeichnet (einschließlich z.B. V_γ), und die variable Leichtkettenregion wird als V_L bezeichnet (einschließlich V_K oder V_λ). Die variable Region ist Teil des Moleküls, das sich an das zugehörige Antigen des Antikörpers bindet, während die Fc-Region (die zweiten und dritten Domänen der C-Region) die Effektorfunktion des Antikörpers (z.B. die Komplementfixierung, Opsonisierung) bestimmt. Ein variables Regiongen am N-Terminus (im Allgemeinen etwa 110 Aminosäuren) und ein konstantes κ- (kappa-) oder λ- (lambda-) Regiongen am COOH-Terminus kodiert für Immunglobulin- oder Antikörper-„Leichtketten" voller Länge (im Allgemeinen etwa 25 kDa, etwa 214 Aminosäuren). Ein variables Regiongen (im All gemeinen kodiert es für etwa 116 Aminosäuren) und eines der konstanten Regiongene, z.B. gamma (kodiert für etwa 330 Aminosäuren), kodiert auf ähnliche Art und Weise für Immunglobulin- oder Antikörper-„Schwerketten" voller Länge (von im Allgemeinen etwa 50 kD, etwa 446 Aminosäuren). Typischerweise umfasst „V_L" den Abschnitt der Leichtkette, für welchen V_L- und/oder J_L- (J oder Verbindungsregion) Gensegmente kodieren, und „V_H" umfasst den Abschnitt der Schwerkette, für welchen V_H- und/oder D_H- (D oder Diversitätsregion) und J_H-Gensegmente kodieren. Siehe im Allgemeinen Roitt et al., Immunology (2. Auflage, (1989), Kapitel 6, und Paul, Fundamental Immunology (Raven Press, 2. Auflage (1989)).
Eine variable Immunglobulin-Leicht- oder -Schwerkettenregion besteht aus einer „Gerüst"-Region, die durch drei hypervariable Regionen unterbrochen ist, die auch komplementaritätsbestimmende Regionen oder CDRs genannt werden. Es ist das Ausmaß der Gerüstregion und CDRs definiert worden (siehe Kabat et al., „Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)). Die Sequenzen der Gerüstregionen verschiedener Leicht- oder Schwerketten sind innerhalb einer Spezies relativ konserviert. Die Gerüstregion eines Antikörpers, d.h. die kombinierten Gerüstregionen der konstituierenden Leicht- und Schwerketten, dient der Positionierung und Anordnung der CDRs im dreidimensionalen Raum. Die CDRs sind primär für die Bindung eines Epitops an ein Antigen verantwortlich. Die CDRs werden typischerweise als CDR1, CDR2 und CDR3 bezeichnet, vom N-Terminus ausgehend nacheinander nummeriert.
Die konstante Region des Schwerkettenmoleküls, das auch als C_H bekannt ist, bestimmt den Isotyp des Antikörpers. Antikörper werden abhängig vom Schwerkettenisotyp als IgM, IgD, IgG, IgA und IgE bezeichnet. Die Isotypen sind in mu- (μ-), delta(Δ-), gamma- (γ-), alpha- (α-) bzw. epsilon- (ε-) Segment der konstanten Schwerkettenregion kodiert. Außerdem gibt es eine Reihe von γ-Subtypen. Es gibt zwei Arten von Leichtketten, κ und λ. Die Determinanten dieser Subtypen liegen typischerweise in der konstanten Region der Leichtkette, die auch im Allgemeinen als C_L und insbesondere als C_κ und C_λ bezeichnet wird.
Die Schwerkettenisotypen bestimmen verschiedene Effektorfunktionen des Antikörpers, wie z.B. Opsonisierung oder Komplementfixierung. Zusätzlich bestimmt der Schwerkettenisotyp die sekretierte Form des Antikörpers. Sekretierte IgG-, IgD- und IgE-Isotypen sind typischerweise in einer einzelnen Einheit oder in monomerer Form zu finden. Ein sekretierter IgM-Isotyp ist in pentamerer Form zu finden, sekretiertes IgA kann sowohl in monomerer als auch dimerer Form zu finden sein.
B. Produktion von Antikörpern
Antikörper, die entweder einen ACT-4-Rezeptor, einen Liganden dafür oder Bindungsfragmente von beiden binden, können mithilfe verschiedenster Mittel hergestellt werden. Die Produktion von nicht-menschlichen monoklonalen Antikörpern, z.B. Mäuse, Ratten usw., ist bekannt und kann z.B. durch Immunisierung des Tiers mit einer Formulierung erreicht werden, die einen Act-4-Rezeptor oder seine Liganden oder ein immunogenes Fragment eines dieser enthalten. Insbesondere sind Zellen als Immunogene nützlich, die mit rekombinanten ACT-4-Rezeptorgenen stabil transfiziert sind und auf ihrer Zelloberfläche ACT-4-Rezeptoren exprimieren. Antikörperproduzierende Zellen, die von immunisierten Tieren erhalten werden, werden unbegrenzt vermehrt und auf die Produktion eines Antikörpers gescreent, der sich an ACT-4-Rezeptoren oder deren Liganden bindet. Siehe Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (C.S.H.P., NY, 1988).
Es sind ebenfalls verschiedene Verfahren zur Erzeugung menschlicher monoklonaler Antikörper beschrieben worden, die aber im Allgemeinen beschwerlicher als murine Verfahren und nicht auf alle Antigene anwendbar sind. Für einen Übersichtsartikel siehe z.B. Larrick et al., US-Patent Nr. 5.001.065. Ein Verfahren, das erfolgreich verwendet worden ist, um menschliche monoklonale Antikörper gegen eine Vielzahl von Antigenen einzusetzen, ist das Triomverfahren von Ostberg et al., Hybridoma 2, 361-367 (1983); Ostberg, US-Patent Nr. 4.634.666, und Engleman at al., US-Patent Nr. 4.634.666. Die antikörperproduzierenden Zelllinien, die mithilfe dieses Verfahrens erhalten wurden, werden Triome genannt, weil sie von drei Zellen – zwei menschlichen und einer Mauszelle – abstammen. Es ist festgestellt worden, dass Triome einen stabileren Antikörper produzieren als gewöhnliche Hybridome, die aus menschlichen Zellen produziert werden.
Ein alternativer Ansatz ist die Erzeugung von humanisierten Immunglobulinen durch die Bindung von CDR-Regionen nicht-menschlicher Antikörper an menschliche konstante Regionen durch DNA-Rekombinationsverfahren. Siehe Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989), und WO 90/07861. Die humanisierten Immunglobuline besitzen Gerüstreste einer variablen Region im Wesentlichen von menschlichem Immunglobulin (Akzeptorimmunglobulin genannt) und komplementaritätsbestimmende Regionen im Wesentlichen von einem Mausimmunglobulin, z.B. den L106-Antikörper (wird als Spenderimmunglobulin bezeichnet). Die konstante(n) Region(en) stammt/stammen, wenn sie vorhanden sind, im Wesentlichen von einem menschlichen Immunglobulin. Die menschlichen variablen Domänen werden für gewöhnlich aus menschlichen Antikörpern ausgewählt, deren Gerüstsequenzen einen hohen Grad an Sequenzidentität mit den murinen variablen Regiondomänen zeigen, von welchen die CDRs abstammten. "Die Schwer- und Leichtkettengerüstreste der variablen Region können von denselben oder unterschiedlichen menschlichen Antikörpersequenzen abstammen. Die menschlichen Antikörpersequenzen können die Sequenzen von natürlich auftretenden menschlichen Antikörpern sein oder Consensus-Sequenzen verschiedener menschlicher Antikörper. Siehe Carter et al., WO 92/22653. Bestimmte Aminosäuren der menschlichen Gerüstreste der variablen Region werden zur Substitution basierend auf deren möglichem Einfluss auf CDR-Konformation und/oder Bindung an ein Antigen ausgewählt. Die Untersuchung solch möglicher Einflüsse erfolgt durch Modellierung, Untersuchung der Eigenschaften von Aminosäuren an bestimmten Orten oder empirische Untersuchung der Wirkungen von Substitution oder Mutagenese bestimmter Aminosäuren.
Zum Beispiel, wenn sich eine Aminosäure zwischen einem murinen L106-Gerüstrest der variablen Region und einem ausgewählten menschlichen Gerüstrest der variab len Region unterscheidet, sollte die menschliche Gerüstaminosäure für gewöhnlich durch die entsprechende Gerüstaminosäure des Mausantikörpers ersetzt werden, wenn vernünftigerweise erwartet wird, dass die Aminosäure:

(1) das Antigen nicht-kovalent direkt bindet,
(2) an eine CDR-Region angrenzt,
(3) andererseits mit einer CDR-Region wechselwirkt (z.B. innerhalb etwa 3A einer CDR-Region liegt) oder
(3) Teil des VL-VH-Grenzbereichs ist.

Andere Kandidaten für eine Substitution sind menschliche Akzeptorgerüstaminosäuren, die für ein menschliches Immunglobulin an dieser Stelle unüblich sind. Diese Aminosäuren können durch Aminosäuren aus der entsprechenden Position des L106-Antikörpers oder aus den entsprechenden Positionen mehrerer typischer menschlicher Immunglobuline ersetzt werden.
Ein weiterer Ansatz zur Isolierung von DNA-Sequenzen, die für einen menschlichen monoklonalen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon kodieren, ist das Screening einer DNA-Bibliothek menschlicher B-Zellen gemäß der allgemeinen Arbeitsvorschrift, die von Huse et al., Science 246, 1275-1281 (1989), beschrieben worden ist, und dann das Klonieren und die Amplifikation der Sequenz, die für den Antikörper (oder Bindungsfragment) der gewünschten Spezifität kodiert. Die Arbeitsvorschrift, die von Huse beschrieben worden ist, wird in Kombination mit Phagendisplayverfahren effizienter gemacht. Siehe z.B. Dower et al., WO 91/17271, und McCafferty et al., WO 92/01047. Ein Phagendisplayverfahren kann auch zur Mutagenisierung von CDR-Regionen von Antikörpern verwendet werden, von denen zuvor gezeigt worden ist, dass sie eine Affinität für ACT-4-Rezeptoren oder deren Liganden zeigen. Es werden Antikörper ausgewählt, die eine verbesserte Bindungsaffinität aufweisen.
Anti-ACT-4-Rezeptorantikörper, die sich spezifisch an dasselbe Epitop binden wie der L106-Antikörper, werden für gewöhnlich mithilfe eines kompetitiven Bindungstests identifiziert. Der Test hat drei Komponenten, ein ACT-4-Polypeptid (z.B. ACT-4- h-1), einen L106-Antikörper, der für gewöhnlich markiert ist, und den zu testenden Antikörper. Oft wird das ACT-4-Rezeptorpolypeptid an einen festen Träger immobilisiert. Der Testantikörper bindet sich an dasselbe Epitop wie der L106-Antikörper, wenn er die Menge des L106-Antikörpers reduziert, die sich spezifisch an das ACT-4-Rezeptorpolypetid bindet. Das Ausmaß des Screenings, das notwendig ist, um solche Antikörper zu erhalten, kann durch die Herstellung von Antikörpern mit einer Arbeitsvorschrift reduziert werden, in welcher das spezifische Epitop, das durch L106 gebunden ist, als Immunogen verwendet wird. Antikörper, die sich an dasselbe Epitop binden wie L106, können eine im Wesentlichen aber nicht vollständig identische Aminosäuresequenz zu dem L106-Antikörper zeigen oder können eine unverwandte primäre Struktur mit dem L106-Antikörper aufweisen.
Anti-ACT-4-Rezeptorantikörper mit einer anderen Bindungsspezifität als L106 (d.h. die sich an ein anderes Epitop binden) werden mithilfe eines komplementären Ansatzes identifiziert. Testantikörper werden auf Versagen gescreent, mit dem L106-Antikörper um die Bindung an ein ACT-4-Rezeptorpolypeptid zu konkurrieren. Das Ausmaß des Screenings kann durch die Herstellung von Antikörpern mit einer Arbeitsvorschrift reduziert werden, in welcher ein Fragment als Immunogen verwendet wird, dem eine spezifisches Epitop fehlt, das durch L106 gebunden ist.
Antikörper, die in der Lage sind, die Aktivierung von CD4⁺-Zellen zu stimulieren oder zu hemmen, können mithilfe von Screeningverfahren, die in Abschnitt VI, siehe unten, diskutiert werden, identifiziert werden. Einige Antikörper können die Aktivierung als Antwort auf einige bestimmte Reize (z.B. alloantigene aber nicht mitogene oder vice versa) jedoch nicht auf andere selektiv hemmen. Eine gewisse Hemmkapazität der Antikörper kann von dem Zeitpunkt nach der Aktivierung abhängen, an welchem der Antikörper zugegeben wird. Einige Antikörper können die Fähigkeit haben, CD4⁺-Zellen unabhängig von anderen Reizen zu aktivieren, während andere Anti-ACT4-Rezeptorantikörper nur die Fähigkeit haben können, die Wirksamkeit eines anderen Reizes, wie z.B. des von PHAs bereitgestellten Reizes, zu erhöhen.
Antikörper, die durch die oben angeführten Verfahren isoliert wurden, können dazu verwendet werden, anti-idiotypische Antikörper z.B. durch die Immunisierung eines Tiers mit dem primären Antikörper zu erzeugen. Für Anti-ACT-4-Rezeptorantikörper wird ein Anti-Idiotyp-Antikörper, dessen Bindung an den primären Antikörper durch ACT-4-Rezeptoren oder Fragmente davon gehemmt wird, ausgewählt. Da sowohl der anti-idiotypische Antikörper als auch die ACT-4-Rezeptoren oder Fragmente davon das primäre Immunglobulin binden, kann das anti-idiotypische Immunglobulin das „innere Bild" eines Epitops darstellen und daher den ACT-4-Liganden ersetzen.
C. Epitopkartierung
Das durch L106 oder jeden beliebigen anderen Anti-ACT-4-Rezeptorantikörper gebundene Epitop wird durch die Bereitstellung einer Familie von Fragmenten bestimmt, die verschiedene Aminsäuresegmente eines ACT-4-Rezeptorpolypeptids, wie z.B. ACT-4-h-1, enthalten. Jedes Fragment umfasst typischerweise zumindest 4, 6, 8, 10, 20, 50 oder 100 zusammenhängende Aminosäuren. Gemeinsam deckt die Familie des Polypeptids viele oder alle Aminosäuresequenzen eines ACT-4-Rezeptorpolypetids voller Länge ab. Mitglieder der Familie werden individuell auf Bindung an z.B. den L106-Antikörper getestet. Das kleinste Fragment, das sich spezifisch an den zu testenden Antikörper bindet, stellt die Aminosäuresequenz des Epitops dar, das vom Antikörper erkannt wird.
D. Fragmente von Antikörpern und Immunotoxine
Fragmente von Antikörpern gegen ACT-4-Rezeptoren oder deren Liganden zeigen typischerweise eine spezifische Bindung an den ACT-4-Rezeptor mit einer Affinität von zumindest 10⁷ M und noch typischer 10⁸ oder 10⁹ M. Antikörperfragmente umfassen separate Schwerketten, Leichtketten, Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc und Fv. Fragmente werden durch DNA-Rekombinationsverfahren oder mittels enzymatischer oder chemischer Trennung intakter Immunglobuline hergestellt.
In einer anderen Ausführungsform werden Immunotoxine bereitgestellt. Ein Immunotoxin ist eine chimäre Verbindung, die aus einem Toxin besteht, das an einen Antikörper mit einer gewünschten Spezifität gebunden ist. Der Antikörper dient als Targetingmittel für das Toxin. Siehe im Allgemeinen Pastan et al., Cell 47, 641-648 (1986): Eine Toxingruppierung ist durch chemische Verfahren oder DNA-Rekombinationsverfahren an einen intakten Antikörper oder ein Fragment davon gebunden. Vorzugsweise ist das Toxin an eine Immunglobulinkette in Form eines zusammenhängenden Proteins gebunden. Siehe z.B. Chovnick et al., Cancer Res. 51, 465, Chaudhary et al., Nature 339, 394 (1989). Beispiele für geeignete Toxinkomponenten sind in Abschnitt I, siehe oben, angeführt und z.B. in The Specificity and Action of Animal, Bacterial and Plant Toxins (Hrsg. P. Cuatrecasas, Chapman Hall, London (1976)) dargelegt.
E. Hybridome und andere Zelllinien
Hybridome, Triome und andere Zelllinien, die die diskutierten Antikörper und deren Fragmente produzieren, siehe oben, umfassen die Hybridomlinie HBL 106, hinterlegt als ATCC HB 11483, welche den L106-Mausantikörper produziert.
F. Verwendungen von Antikörpern
Anti-ACT-4-Rezeptorantikörper und deren Bindungsfragmente sind zum Screening von cDNA-Expressionsbibliotheken zweckdienlich, die vorzugsweise menschliche oder Primaten-cDNA enthielten, die aus verschiedenen Geweben stammte, und zur Identifikation von Klonen, die cDNA-Inserts enthielten, die für strukturell-verwandte immunkreuzreaktive Proteine kodieren. Siehe Aruffo & Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8573-8577 (1987) (hierin für alle Zwecke durch Verweis aufgenommen). Antikörper sind auch zur Identifikation und/oder Reinigung von immunkreuzreaktiven Proteinen zweckdienlich, die strukturell oder evolutionär mit den nativen ACT-4-Rezeptorpolypeptiden oder Fragmenten davon verwandt sind, die dazu verwendet werden, den Antikörper zu erzeugen. Antikörper gegen ACT-4-Liganden sind analog zur Isolation weiterer Liganden und Varianten davon nützlich. Diagnostische und the rapeutische Verwendungen von Antikörpern, Bindungsfragmenten davon, Immunotoxinen und idiotypischen Antikörpern sind in Abschnitt VII, siehe unten, beschrieben.
V. ACT-4-Liganden
Der Begriff ACT-4-Ligand wird verwendet, um ein Protein zu bezeichnen, das sich spezifisch an ein ACT-4-Rezeptorpolypeptid bindet und das in der Lage ist, einen Komplex mit einem solchen Polypeptid, zumindest teilweise, durch nicht-kovalente Bindung zu formen. Liganden können natürlich auftreten oder synthetische Moleküle sein und in löslicher Form oder an die Oberfläche einer Zelle verankert vorliegen. Viele verschiedene Liganden können denselben ACT-4-Rezeptor binden. Umgekehrt kann ein Ligand mehr als einen ACT-4-Rezeptor binden. Der Begriff „ACT-4-Ligand" umfasst üblicherweise nicht Antikörper zu ACT-4-Rezeptorpolypeptiden. Für gewöhnlich initiiert die Bindung eines Liganden an einen ACT-4-Rezeptor ein Signal, das den physischen und/oder funktionellen Phänotyp einer Zelle verändert, die den ACT-4-Rezeptor trägt, und/oder einer Zelle verändert, die den ACT-4-Liganden trägt. Antikörper gegen entweder ACT-4- oder seine Liganden können die Fähigkeit haben, die Signaltransduktion zu blockieren oder zu stimulieren. Es ist natürlich ersichtlich, dass die Bezeichnung von ACT-4 als Rezeptor und seiner spezifischen Bindungspartner als Ligand in gewisser Weise willkürlich ist und unter manchen Umständen umgekehrt werden kann.
Von ACT-4-Liganden wird erwartet, dass sie einen Teil der Eigenschaften anderer Liganden teilen, die sich an Mitglieder der Nervenwachstumsfaktorrezeptorüberfamilie binden. Diese Liganden umfassen die Zytokine TNF-α, TNF-β, CD40-L, CD-27-L und CD30-L. Mit Ausnahme von TNF-β bestehen diese Liganden sowohl als Typ-II-Grundmembranzelloberflächenproteine als auch als lösliche Proteine. Die extrazellulären Domänen dieser Liganden bestehen aus etwa 150 Aminosäuren und bilden verschiedene β-Faltblätter, die sich in einer geschlitzten zylindrischen Struktur assemblieren (von Bazan et al., Current Biology 3, 603-606 (1993), „Jelly-Roll" genannt).
Quellenmaterialien zur Bereitstellung von ACT-4-Liganden werden durch das Screening verschiedener Zellformen, insbesondere Lymphzellen und blutbildender Zellen, Körperflüssigkeiten und Gewebsextrakte, mit markiertem ACT-4-Rezeptor, vorzugsweise in löslicher Form als Sonde, bereitgestellt. Oft wird ein ACT-4-Rezeptor oder ein Bindungsfragment davon zum Zwecke des Screenings an ein zweites Protein gebunden. Insbesondere geeignet sind rekombinante Globuline, die durch die Fusion des extrazellulären Abschnitts von ACT-4 an die konstante Region einer Immunglobulin-Schwerkette gebildet werden.
ACT-4-Liganden werden aus Zellen oder anderem biologischen Material gereinigt, die mithilfe dieses Screeningverfahrens unter Einsatz von Verfahren der klassischen Proteinchemie identifiziert werden. Solche Verfahren umfassen die selektive Präzipitation mit solchen Substanzen wie Ammoniumsulfat, Säulenchromatographie, Immunreinigungsverfahren und andere. Siehe z.B. R. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, NY (1982)). Für gewöhnlich umfassen Reinigungsverfahren einen Affinitätschromatographieschritt, in welchem ein ACT-4-Polypeptid oder ein Bindungsfragment davon als immobilisiertes Reagens verwendet wird. Konstante ACT-4-Regionen können auf herkömmliche Weise durch die Bindung einer Gruppierung einer konstanten Region an Protein A oder G inmobilisiert werden. ACT-4-Liganden können auch unter Einsatz anti-idiotypischer Antikörper als Affinitätsreagens zu ACT-4-Rezeptoren gereinigt werden.
Zur Bestimmung der Aminsäuresequenz oder zum Erhalten der Polypeptidfragmente des Rezeptors kann der Rezeptor mit Trypsin verdaut werden, Peptidfragmente können mithilfe von Umkehrphasen-Hochleistungschromatographie (HPLC) getrennt und mittels Gasphasensequenzierung analysiert werden. Es können ebenfalls andere fachbekannte Sequenzierungsverfahren verwendet werden. Die Sequenzdaten können dazu verwendet werden, degenerierte Sonden zur Isolation von cDNA oder von genomischen Klonen bereitzustellen, die für ACT-4-Liganden kodieren.
Alternativ dazu können cDNA-Klone mittels Expressionsklonierung erhalten werden, die für ACT-4-Liganden kodieren. In diesem Ansatz wird aus Zellen, die einen ACT- 4-Liganden exprimieren, eine cDNA-Bibliothek hergestellt (identifiziert wie besprochen, siehe oben). Die Bibliothek wird in geeigneten Zellen (z.B. COS-7) exprimiert, und Klone, die den ACT-4-Liganden tragen, werden mittels Screening mit markiertem ACT-4 oder Bindungsfragment davon identifiziert, die gegebenenfalls an eine konstante Domäne einer Immunglobulin-Schwerkette fusioniert sind.
Die ACT-4-Liganden oder ihre Bindungsdomänen können zur Affinitätsreinigung bestimmter ACT-4-Rezeptoren verwendet werden. ACT-4-Liganden und Bindungsfragmente davon sind auch als Agonisten oder Antagonisten von ACT-4-Ligandenbindung nützlich und können in therapeutischen Verfahren verwendet werden, die in Abschnitt VII, siehe unten, diskutiert werden. Für membrangebundene ACT-4-Liganden umfassen Bindungsfragmente einen Teil der extrazellulären Domäne eines ACT-4-Rezeptors. ACT-4-Liganden und Fragmente davon sind auch in Screeningtests zur Identifikation von Agonisten und Antagonisten von ACT-4 und/oder seinen Liganden nützlich. ACT-4-Liganden können an ein anderes Protein fusioniert werden, wie z.B. Toxine und konstante Immunglobulindomänen, wie oben für ACT-4-Rezeptoren diskutiert wurde.
VI. Screening auf Agonisten und Antagonisten
ACT-4-Rezeptor und ACT-4-Ligandenfragmente, Analoga davon, Antikörper und anti-idiotypische Antikörper dazu wie auch andere chemische oder biologische Mittel werden auf ihre Fähigkeit gescreent, die Bindung eines ACT-4-Liganden an seinen Rezeptor zu blockieren oder zu verstärken. Außerdem werden sie auf ihre Fähigkeit getestet, Stoffwechselprozesse zu stimulieren oder zu hemmen, wie z.B. die DNA-Synthese oder Proteinphosphorylierung in Zellen, die entweder, einen ACT-4-Rezeptor oder einen ACT-4-Liganden umfassen, der an ihre Oberfläche gebunden ist.
In einigen Verfahren wird die zu testende Verbindung auf ihre Fähigkeit getestet, die Bindung eines gereinigten Bindungsfragments eines ACT-4-Rezeptors (oder Fusionproteins davon) an ein gereinigtes Bindungsfragment eines ACT-4-Liganden (oder eines Fusionsproteins davon) zu blockieren oder zu verstärken. In solchen Versuchen wird für gewöhnlich entweder der Rezeptor oder das Ligandenfragment auf einem festen Träger immobilisiert. Die Testverbindung konkurriert dann mit einem ACT-4-Liganden oder -Rezeptorfragment (das nicht an den Träger gebunden ist) um die Bindung an den Träger. Für gewöhnlich wird entweder die Testverbindung oder der konkurrierende Ligand oder Rezeptor markiert.
In anderen Verfahren werden einer oder beide von ACT-4-Rezeptor und -Ligand oder Bindungsfragmente dieser Moleküle auf einer Zelloberfläche exprimiert. Zum Beispiel wird das ACT-4-h-1-Antigen aus rekombinanter DNA in z.B. COS-7-Zellen (siehe Beispiel 6) exprimiert. In diesen Verfahren wird die Gegenwart von Agonismus oder Antagonismus aus dem Grad der Bindung zwischen einem ACT-4-Rezeptor und seinem Liganden bestimmt, der in Gegenwart der Testverbindung auftritt. Alternativ dazu wird die Aktivität der Testverbindung durch Messung der ³H-Thymidininkorporation in DNA oder ³²P-Inkorporation in Protein bei Zellen, die einen ACT-4-Rezeptor tragen, und/oder Zellen, die einen ACT-4-Liganden tragen, getestet.
Verbindungen, die ACT4-induzierte DNA-Synthese oder Proteinphosphorylierung blockieren, sind Antagonisten. Verbindungen, welche die DNA-Synthese oder -phosphorylierung über eine Wechselwirkung mit einem ACT-4-Rezeptor oder seinem Liganden aktivieren, sind Agonisten. Die agonistische oder antagonistische Aktivität kann auch aus anderen funktionellen oder physikalischen Endpunkten der Leukozytenaktivierung oder aus klinisch wünschenswerten oder unerwünschten Ergebnissen, wie z.B. der zytolytischen Aktivität oder dem Austritt von Leukozyten aus Blutgefäßen in Gewebe, bestimmt werden.
Die Fähigkeit von Mitteln zur Agonisierung oder Antagonisierung von T-Zellproliferation in vitro kann mit der Fähigkeit in Verbindung gebracht werden, die Immunantwort in vivo zu beeinflussen. Die In-vivo-Aktivität wird typischerweise unter Einsatz geeigneter Tiermodelle wie z.B. Mäusen und Ratten getestet. Zum Testen der Wirkung von Mitteln auf Allotransplantatabstoßung können z.B. Tieren vor Einführung des allogenen Gewebes mehrere Male potenzielle therapeutische Mittel ver abreicht werden und die Tiere auf Transplantatabstoßung überwacht werden. Es sind geeignete Verfahren zur Durchführung von Transplantationen und Überwachung auf Transplantatabstoßung beschrieben worden (siehe z.B. Hislop et al., J. Thorac. Cardiovasc. 100, 360-370 (1990)).
VII Therapeutische und diagnostische Verfahren und Zusammensetzungen
A. Diagnostische Verfahren
Erkrankungen und Leiden des Immunsystems, die mit einer geänderten Häufigkeit oder funktionellen Mutation eines ACT-4-Rezeptors oder seiner mRNA oder eines ACT4-Liganden oder seiner mRNA in Verbindung stehen, können unter Einsatz von Sonden und/oder Antikörpern diagnostiziert werden. Die Bereitstellung von Antikörpern gegen den ACT-4-Rezeptor und Nucleinsäuresonden, die zu seiner mRNA komplementär sind, ermöglicht die Unterscheidung von aktivierten CD4⁺-T-Zellen von anderen Leukozytensubtypen. Die Gegenwart solcher Zellen zeigt eine MHC-Klasse-II-induzierte Immunantwort gegen z.B. angreifende Bakterien an. Ein Vergleich der Zahl aktivierter CD4⁺-Zellen und CD8⁺-Zellen kann eine unterschiedliche Diagnose zwischen bakteriellen und viralen Infektionen ermöglichen, die hauptsächlich die jeweiligen aktivierten Zelltypen induzieren. Die Gegenwart aktivierter CD4⁺-Zellen gibt auch unerwünschte Erkrankungen und Leiden des Immunsystems an, wie z.B. die Allotransplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung, Autoimmunerkrankungen, Allergien und Entzündung. Es kann die Wirksamkeit therapeutischer Mittel zur Behandlung solcher Erkrankungen und Leiden überwacht werden.
Durch die Entfernung einer Zellprobe (z.B. einer Blutprobe, einer Lymphknotenbiopsie oder Gewebe) aus einem Patienten kann eine Diagnose erreicht werden. Die Probe wird dann einer Analyse unterworfen, um Folgendes zu bestimmen: (1) die Menge des exprimierten ACT-4-Rezeptors oder -Liganden in bestimmten Zellen der Probe (z.B. durch immunhistochemische Färbung fixierter Zellen mit einem Antikörper oder eine FACS^TM-Analyse), (2) die Menge der ACT-4-Rezeptor- oder -Liganden-mRNA in bestimmten Zellen (durch In-situ-Hybridisierung mit einer markierten kom plementären Polynucieotidsonde), (3) die Menge der ACT-4-Rezeptor- oder -Liganden-mRNA in der Zellprobe durch RNA-Extraktion, gefolgt von Hybridisierung an eine markierte komplementäre Polynucleotidsonde (z.B. durch Northern-Blotting, Dot-Blotting, Lösungshybridisierung oder quantitativer PCR) oder (4) die Menge des ACT-4-Rezeptors oder -Liganden in der Zellprobe (z.B. durch Zellzerstörung gefolgt von Immunoassay oder Western-Blotting des resultierenden Zellextrakts).
Eine Diagnose kann auch durch In-vivo-Verabreichung eines diagnostischen Reagens (z.B. eines markierten Anti-ACT-4-Rezeptorantikörpers zur Diagnose aktivierter CD4⁺-T-Zellen) und Detektion mittels In-vivo-Bildgebung erreicht werden. Die Konzentration des verabreichten diagnostischen Mittels sollte ausreichend sein, sodass die Bindung an diese Zellen, die das Targetantigen besitzen, im Vergleich zum Hintergrundsignal detektierbar ist. Weiters ist es wünschenswert, dass das diagnostische Reagens schnell aus dem Kreislaufsystem gereinigt wird, um das bestmögliche Target-zu-Hintergrund-Signalverhältnis zu ergeben. Das diagnostische Reagens kann mit einem Radioisotop zur Kamerabildgebung oder mit einem paramagnetischen Isotop für Magnetresonanz- oder Elektronenspinresonanzbildgebung markiert werden.
Eine Veränderung (typischerweise ein Anstieg) des Spiegels des Proteins oder der mRNA eines ACT-4-Rezeptors oder -Liganden in einer Zellprobe einer Person, die außerhalb des Bereichs klinisch normaler Spiegel liegt, kann die Gegenwart einer unerwünschten Immunantwort bei einer Person angeben, von welcher die Probe erhalten wird, und/oder eine Prädisposition der Person für eine Entwicklung (oder das Fortschreiten) einer solchen Antwort angeben. Protein- oder mRNA-Spiegel können als Differenzierungsmarker verwendet werden, um Zelltypen bestimmter Abstammungen (d.h. aktivierte CD4⁺-Zellen für den ACT-4-Rezeptor) und Entwicklungsursprünge zu identifizieren. Eine solche zelltypspezifische Detektion kann zur histopathologischen Diagnose unerwünschter Immunantworten eingesetzt werden.
B. Diagnostische Sets
In einem anderen Aspekt der Erfindung werden diagnostische Sets für die zuvor beschriebenen diagnostischen Verfahren bereitgestellt. Die Sets umfassen Behälter; welche diagnostische Reagenzien umfassen, wie z.B. markierte Antikörper gegen ACT-4-Rezeptoren, und Reagenzien und/oder eine Vorrichtung zur Detektion der Markierung. Es können auch andere Komponenten, die routinemäßig in solchen Sets zu finden sind, gemeinsam mit Anweisungen zur Durchführung des Tests enthalten sein.
C. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung verwendet werden, umfassen ein aktives therapeutisches Mittel, z.B. einen ACT-4-Rezeptor, -Liganden, Fragmente davon und Antikörper und idiotypische Antikörper dagegen und eine Vielzahl anderer Komponenten. Die bevorzugte Form hängt vom beabsichtigten Verabreichungsmodus und der therapeutischen Anwendung ab. Die Zusammensetzungen können auch abhängig von der gewünschten Formulierung pharmazeutisch annehmbare, nicht-toxische Träger oder Verdünnungsmittel umfassen, die als Träger definiert sind, die für gewöhnlich verwendet werden, um pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verabreichung an Tiere oder Menschen zu formulieren. Das Verdünnungsmittel wird so ausgewählt, dass er die biologische Aktivität der Kombination nicht beeinflusst. Beispiele für solche Verdünnungsmittel sind destilliertes Wasser, physiologische Salzlösung, Ringer-Lösungen, Dextroselösung und Hank-Lösung. Zusätzlich dazu kann die pharmazeutische Zusammensetzung der Formulierung auch andere Träger, Adjuvanzien oder nicht-toxische nicht-therapeutische, nicht-immunogene Stabilisatoren und dergleichen umfassen.
D. Therapeutische Verfahren
Die therapeutischen Verfahren verwenden die zuvor zur Behandlung verschiedener Erkrankungen bei Menschen oder Tieren, insbesondere Säugetieren, diskutierten therapeutischen Mittel. Die therapeutischen Mittel umfassen ACT-4-Rezeptoren, Bindungsfragmente davon, ACT-4-Liganden, Bindungsfragmente davon, Anti-ACT-4-Rezeptor- und -Ligandenantikörper und anti-idiotypische Antikörper dagegen, Bindungsfragmente dieser Antikörper, humanisierte Versionen dieser Antikörper, Immunotoxine und andere diskutierte Mittel, siehe oben. Einige therapeutische Mittel funktionieren durch die Blockade oder andererseits durch die Antagonisierung der Wirkung eines ACT-4-Rezeptors mit seinem Liganden. Andere therapeutische Mittel wirken durch die Tötung von Zellen, die ein Polypeptid tragen, gegen welches das Mittel gerichtet ist. Zum Beispiel sind Anti-ACT-4-Rezeptorenantikörper mit Effektorfunktionen oder die an Toxine konjugiert sind, Radioisotope oder Arzneimittel in der Lage, aktivierte CD4⁺-T-Zellen selektiv zu töten. Eine selektive Eliminierung solcher Zellen ist insbesondere vorteilhaft, weil eine unerwünschte Immunantwort reduziert oder eliminiert werden kann, während eine Restimmunkapazität in Form inaktivierter CD4⁺-Zellen und CD8⁺-Zellen zur Bekämpfung der Invasion von Mikroorganismen erhalten bleibt, gegenüber welchen ein Patient in der Folge exponiert werden kann. Andere therapeutische Mittel wirken als Agonisten der Wechselwirkung zwischen dem ACT-4-Rezeptor und -Ligand.
1. Dosierungen und Verabreichungsverfahren
In therapeutischen Anwendungen wird eine pharmazeutische Zusammensetzung (die z.B. einen Anti-ACT-4-Rezeptorantikörper umfasst) in vivo oder ex vivo in einer für eine Heilung, ein teilweises Aufhalten oder ein detektierbares Verlangsamen des Fortschreitens des Leidens und seiner Komplikationen ausreichenden Menge an einen Patienten verabreicht, der schon unter einer unerwünschten Immunantwort leidet (z.B. Transplantatabstoßung). Eine adäquate Menge, um dies zu erreichen, wird als „therapeutisch wirksame Dosis" oder „wirksame Dosis" definiert. Wirksame Mengen für diese Anwendung hängen von der Schwere des Leidens, dem allgemeinen Zu stand des Patienten und dem Verabreichungsweg und gegebenenfalls von der Kombination mit anderen Immunsuppressiva ab, reichen aber im Allgemeinen von etwa 10 ng bis etwa 1 g des aktiven Mittels pro Dosis, wobei für gewöhnlich Einzeldosen von 10 mg bis 100 mg pro Patient verwendet werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen können mithilfe intravenöser Infusion systemisch oder lokal durch Injektion verabreicht werden. Letzteres ist insbesondere für eine lokalisierten unerwünschte Immunantwort wie z.B. einer Wirt-gegen-Transplantat-Abstoßung nützlich. Für einen kurzen Überblick über die Verfahren zur Arzneimittelverabreichung siehe Langer, Science 249, 1527-1533 (1990).
In prophylaktischen Anwendungen werden pharmazeutische Zusammensetzungen an Patienten verabreicht, die das Risiko für eine unerwünschte Immunantwort aufweisen, aber noch nicht daran leiden (z.B. ein Patient kurz vor einer Transplantation). Die Menge des zu verabreichenden Antikörpers ist eine „prophylaktisch wirksame Dosis", deren genaue Mengen vom Gesundheitszustand des Patienten und dem allgemeinen Immunitätsgrad abhängen, aber im Allgemeinen von 10 ng bis 1 g pro Dosis, insbesondere von 10 mg bis 100 mg pro Patient, reichen.
Da die therapeutischen Mittelder Erfindung wahrscheinlich selektiver und im Allgemeinen weniger toxisch als herkömmliche immunmodulierende Mittel sind, verursachen sie weniger wahrscheinlich Nebenwirkungen, die häufig bei herkömmlichen Mitteln zu beobachten sind. Da einige der therapeutischen Mittel menschliche Proteinsequenzen sind (z.B. Bindungsfragmente eines ACT-4-Rezeptors oder -Liganden oder humanisierte Antikörper), ist es weiters weniger wahrscheinlich, dass diese Immunantworten wie z.B. jene verursachen, die bei murinen Anti-CD3-Antikörpern zu beobachten sind. Die therapeutischen Mittel der vorliegenden Erfindung können auch mit traditionellen Therapeutika kombiniert und dazu verwendet werden, die Dosis solcher Mittel auf Spiegel zu senken, die unter jenen Spiegeln liegen, die Nebenwirkungen mit sich bringen. Zum Beispiel können andere Immunsuppressiva, wie z.B. Antikörper gegen die α3-Domäne, T-Zell-Antigene (z.B. OKT4 und OKT3), Antithymozytenglobulin, wie auch chemotherapeutische Mittel, wie z.B. Cyclosporin, Gluko kortikoide, Azathioprin, Prednison, in Kombination mit den therapeutischen Mitteln der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Zur Zerstörung einer spezifischen Population von Targetzellen kann es vorteilhaft sein, die therapeutischen Mittel der vorliegenden Erfindung an ein anderes Molekül zu konjugieren. Zum Beispiel können die Mittel an Liposomen, die besondere Immunsuppressiva enthalten, an einen spezifischen monoklonalen Antikörper oder an ein Cytotoxin oder einen anderen Modulator der Zellaktivität gebunden werden, wodurch die Bindung des Konjugats an eine Targetzellpopulation in der Änderung dieser Population resultiert. Zuvor ist eine Reihe von Proteintoxinen diskutiert worden. Chemotherapeutische Mittel umfassen zum Beispiel Doxorubicin, Daunorubicin, Methotrexat, Cytotoxin und Anti-Sense-RNA. Es können auch Antibiotika verwendet werden. Außerdem können Radioisotope, wie z.B. Yttrium-90, Phosphor-32, Blei-212, Jod-131 oder Palladium-109, verwendet werden. Die emittierte Strahlung zerstört die angesteuerten Zellen.
2. Erkrankungen und Leiden, die auf eine Behandlung ansprechen
Die zuvor diskutierten pharmazeutischen Zusammensetzungen sind zur Behandlung verschiedener Erkrankungen und Leiden des Immunsystems zweckdienlich.
a. Transplantatabstoßung
In den letzten Jahren hat sich eine bedeutende Verbesserung der Wirksamkeit chirurgischer Verfahren zur Transplantation von Geweben und Organen, wie z.B. von Haut, Niere, Leber, Herz, Lunge, Pankreas und Knochenmark, gezeigt. Vielleicht ist das herausragende Hauptproblem das Fehlen von zufrieden stellenden Mitteln zur Induktion von Immuntoleranz beim Empfänger des transplantierten Allotransplantats oder Organs. Wenn allogene Zellen oder Organe in einen Wirt transplantiert werden (d.h. der Spender und Empfänger sind verschiedene Individuen derselben Spezies), wird das Wirtimmunsystem wahrscheinlich eine Immunantwort auf fremde Antigene im Transplantat entwickeln (Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung), die zur Zerstörung des transplantierten Gewebes führt. CD8⁺-Zellen, CD4⁺-Zellen und Monozyten sind alle in der Abstoßung des Transplantatgewebes involviert. Die therapeutischen Mittel der vorliegenden Erfindung dienen dazu, alloantigen-induzierte Immunantworten beim Empfänger (z.B. Blockade oder Eliminierung von Allogenaktivierung von CD4⁺-T-Zellen durch Anti-ACT-4-Rezeptorantikörper) zu blockieren, wodurch vermieden wird, dass solche Zellen in der Zerstörung des transplantierten Gewebes oder Organs involviert sind.
b. Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung
Ein verwandte Anwendung der therapeutischen Mittel der vorliegenden Erfindung ist die Modulation der Immunantwort bei „Transplantat-gegen-Wirt"-Erkrankung (GVHD). GVHD ist eine potenziell tödliche Erkrankung, die auftritt, wenn immunologisch kompetente Zellen in einen Allogen-Empfänger transferiert werden. In dieser Situation können die immunkompetenten Zellen des Spenders Gewebe des Empfängers angreifen. Gewebe der Haut, des Darmepithels und der Leber sind häufige Ziele und können im Verlauf von GVHD zerstört werden. Die Erkrankung ist ein besonders schwerwiegendes Problem, wenn Immungewebe transplantiert wird, wie z.B. bei einer Knochenmarkstransplanfation, aber es ist auch in anderen Fällen, einschließlich Herz- und Lebertransplantaten, von weniger schwerer GVHD berichtet worden. Die therapeutischen Mittel der vorliegenden Erfindung werden dazu verwendet, die Aktivierung von Spender-T-Zellen (insbesondere von aktivierten CD4⁺-T-Zellen, für therapeutische Mittel, die gegen den ACT-4-Rezeptor gerichtet sind) zu blockieren oder zu eliminieren, wodurch deren Fähigkeit gehemmt wird, Targetzellen im Wirt zu lysieren.
c. Autoimmunerkrankungen
Eine weitere Situation, in welcher die Immunsuppression wünschenswert ist, ist die Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wie z.B. bei insulinabhängigem Diabetes mellitus, Multipler Sklerose, dem Stift-Man-Syndrom, rheumatoider Arthritis, Myasthenia gravis pseudoparalytica und Lupus erythematodes. Bei diesen Erkrankungen entwickelt der Körper eine Zell- und/oder humorale Immunantwort gegen eines seiner eigenen Antigene, was zur Zerstörung dieses Antigens und möglicherweise zu einer Verkrüppelung und/oder zum Tod führen kann. Aktivierte. CD4⁺-T-Zellen sollen eine Hauptrolle bei vielen Autoimmunerkrankungen spielen. Autoimmunerkrankungen werden durch die Verabreichung eines der therapeutischen Mittel der Erfindung behandelt, insbesondere von Mitteln, die gegen einen ACT-4-Rezeptor gerichtet sind. Gegebenenfalls kann ein Autoantigen oder ein Fragment davon, gegen welches die Autoimmunerkrankung gerichtet ist, kurz vor, gleichzeitig mit oder kurz nach dem Immunsuppressivum verabreicht werden. Auf diese Art und Weise kann mithilfe der suppressiven Behandlung Toleranz gegenüber dem Autoantigen induziert werden, wodurch der Bedarf an kontinuierlicher Immunsuppression verhindert wird. Siehe z.B. Cobbold et al., WO 90/15152 (1990).
d. Entzündung
Eine Entzündung ist die Folge einer Kapillarerweiterung mit Akkumulation des Fluids und der Migration von phagozytischen Leukozyten, wie z.B. Granulozyten und Monozyten. Eine Entzündung ist zur Verteidigung eines Wirts gegen eine Vielzahl von Infektionen wichtig, kann aber auch bei Entzündungskrankheiten unerwünschte Konsequenzen haben, wie z.B. einen anaphylaktischen Schock, Arthritis und Gicht: Aktivierte T-Zellen spielen eine wichtige modulierende Rolle bei Entzündungen, weil sie Interferon-γ und koloniestimulierende Faktoren freisetzen, die wiederum phagozytische Leukozyten aktivieren. Die aktivierten phagozytischen Leukozyten werden induziert, um eine Vielzahl spezifischer Zelloberflächenmoleküle, die homing-Rezeptoren genannt werden, zu exprimieren, die dazu dienen, Phagozyten an Target-Endothelzellen anzuheften. Entzündungsreaktionen können durch die Behandlung mit therapeutischen Mitteln der vorliegenden Erfindung reduziert oder eliminiert werden. Zum Beispiel therapeutische Mittel, die auf die ACT-4-Rezeptorfunktion abzielen, indem die Aktivierung von CD4⁺-Zellen blockiert wird oder aktivierte CD4⁺-Zellen eliminiert werden, wodurch diese Zellen davon abgehalten werden, Moleküle freizusetzen, die zur Aktivierung von phagozytischen Zelltypen erforderlich sind.
e. Infektiöse Mittel
Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit von Vakzinen zur Prävention oder Behandlung von Erkrankungen und Leiden bereit, die aus infektiösen Mitteln resultieren. Therapeutische Mittel, welche die Fähigkeit haben, CD4⁺-T-Zellen zu aktivieren (z.B. bestimmte monoklonale Antikörper gegen ein ACT-4-h-1-Rezeptorpolypetid), werden kurz vor, gleichzeitig mit oder kurz nach der Impfung, die ein gewähltes Antigen enthält, verabreicht. Das therapeutische Mittel dient der Verstärkung der Immunantwort gegen das gewählte Antigen. Diese Verfahren können insbesondere bei Patienten vorteilhaft sein, die an einer Immunschwächeerkrankung leiden.
Die folgenden Beispiele dienen der Illustration, jedoch nicht der Einschränkung der Erfindung.
BEISPIELE
Beispiel 1: Ein monoklonaler Antikörper gegen ACT-4-h-1
Mäuse wurden mit PHA-transformierten T-Lymphoblasten immunisiert. Splenozytenimmunisierter Mäuse wurden mit SP2/O-Myelomzellen fusioniert, und Hybridome, welche Antikörper sekretieren, die für den T-Zellklon spezifisch sind, wurden ausgewählt. Die Hybridome wurden durch Grenzverdünnung kloniert. Ein monoklonaler Antikörper, L106 genannt, der von einem der resultierenden Hybridome produziert wurde, wurde für eine weitere Charakterisierung ausgewählt. Es wurde festgestellt, dass der L106-Antikörper einen IgG1-Isotyp aufweist. Ein Hybridom, das den Antikörper produziert, der HBL106 genannt wird, ist bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, am 3. November 1993 unter der ATCC-Zugangsnummer ATCC HB 11483 hinterlegt worden.
Beispiel 2: Zellverteilung eines Polypeptids, das von einem L106-Antikörper erkannt wird
Bestimmten Teilnehmern des vierten-Internationalen Workshops und Konferenz über menschliche Leukozytendifferenzierungsantigene (International Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens, Wien 1989) wurden zum Zwecke der Identifikation von Gewebs- und Zelltypen, die sich an den L106-Antikörper binden, Proben zugänglich gemacht, die den Antikörper L106 enthielten. Die Daten des Workshops sind in Leukocyte Typing IV (Hrsg. W. Knapp, Oxford U. Press (1989)) und einer begleitenden Computerdatenbank, die von Walter R. Gilks, MRC Biostatistics Unit, Cambridge University, England, zur Verfügung gestellt wird, präsentiert. Diese Referenz berichtet, dass der L106-Antikörper ein Polypeptid von etwa 50 kDa bindet. Es wurde berichtet, dass dieses Polypeptid in HUT-102-Zellen (einer transformierten T-Zelllinie), PHA-aktivierten peripheren Blutlymphozyten, einer EBV-transformierten B-Lymphoidzelllinie und HTLV-II-transformierten T-Zelllinie, PMA-aktivierten Zellen, ConA- oder PHA-aktivierten PBLs und PMA-aktivierten Monozyten vorhanden ist. Vom Polypeptid wurde berichtet, dass es unter anderem auf ruhenden Basophilen, Endothelzellen, Fibroblasten, Interferon-γ-Granulozyten, peripheren Monozyten, peripheren. mononuklearen Zellen, peripheren T-Zellen und peripheren roten Blutzellen im Wesentlichen fehlte.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Daten erhalten, die zeigen, dass das 50-kDa-Polypeptid (hierin nachstehend „ACT-4-h-1-Rezeptor") vorzugsweise auf der CD4⁺-Subspezies aktivierter T-Zellen exprimiert wird. In einer Versuchsreihe wurde die zellspezifische ACT-4-h-1-Expression auf nicht-fraktionierten PBLs mithilfe eines Zweifarben-Färbungsverfahrens analysiert. PBL wurde mit PHA etwa zwei Tage lang aktiviert (unter Einsatz der Kulturbedingungen, die in Beispiel 3 beschrieben sind) und auf Zelloberflächenexpression von ACT-4-h-1 auf verschiedenen Zellsubtypen durch Färbung mit zwei verschieden markierten Antikörpern (FITC- und PE-Markierungen) analysiert. Markierungen wurden mithilfe der FACS^TM-Analyse im Wesentlichen wie von Picker et al., J. Immunol. 150, 1105-1121 (1993), beschrieben detektiert. Ein Antikörper, L106, war für ACT-4-h-1 spezifisch, der andere Antikörper war für einen besonderen Leukozytensubtyp spezifisch. 1 zeigt drei Diagramme, in welchen die L106-Färbung auf der Y-Achse jedes Diagramms und die Anti-CD4-, Anti-CD8- und Anti-CD19-Färbung als X-Achsen der jeweiligen Diagramme dargestellt sind. Für das Diagramm, das mit Anti-CD4 gefärbt ist, erscheinen viele Zellen als Doppelpositive (d.h. exprimieren sowohl CD4 als auch ACT-4-h-1). Für das Diagramm, das mit Anti-CD8 gefärbt ist, erscheinen weit weniger Zellen als Doppelpositive. Für das Diagramm, das mit Anti-CD19 (einem B-Zellmarker) gefärbt ist, fehlen doppelpositive Zellen im Wesentlichen.
In einer anderen Versuchsreihe wurde die Expression von ACT-4-h-1 mithilfe einer Einfarben-Färbung auf isolierten Zelltypen analysiert. Die Zellen wurden mit fluoreszenzmarkiertem L106-Antikörper gefärbt und die Markierung mittels FACS^TM-Analyse detektiert. Siehe Engleman et al., J. Immunol. 127, 2124-2129 (1981). In einigen Versuchen werden Zellen mittels PHA-Stimulierung etwa zwei Tage lang aktviert (wieder unter Einsatz der in Beispiel 3 beschriebenen Kulturbedingungen). Die Ergebnisse dieses Versuches sind gemeinsam mit den Ergebnissen des zuvor beschriebenen Zweifarben-Färbungsversuches in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1 zeigt, dass etwa 80 % der aktivierten CD4⁺-Zellen ACT-4-h-1 mit einer mittleren Kanalfluoreszenz von >20 exprimierten, unabhängig davon, ob die CD4⁺-Zellen isoliert wurden (Einfarben-Färbung) oder in nicht-fraktionierten PBLs (ZweifarbenFärbung) vorlagen. Das Expressionsausmaß von ACT-4-h-1 auf aktivierten CD8⁺-Zellen ist viel geringer als auf aktivierten CD4⁺-T-Zellen im Zweifarben-Färbungsversuch und viel geringer als bei einer Einfarben-Färbung. Daher scheint das Ausmaß der Expression auf aktivierten CD8⁺-Zellen davon abzuhängen, ob die C8⁺-Zellen aus anderen PBLs vor Aktivierung fraktioniert werden. In nicht-fraktionierten CD8⁺-Zellen (Zweifarben-Färbung) exprimieren etwa 10% der Zellen ACT-4-h-1 mit einer mittleren Kanalfluoreszenz von etwa 4. In den fraktionierten Zellen exprimieren nur etwa 4% der Zellen ACT-4-h-1 mit einer mittleren Kanalfluoreszenz von etwa 2. Diese Daten lassen darauf schließen, dass ACT-4-h-1 nur auf einer kleinen Unterart aktivierter CD8⁺-Zellen exprimiert wird und dass diese Unterart in gewisser Weise stärker vorherrschend ist, wenn die CD8⁺-Zellen in Gegenwart anderer PBLs aktiviert werden.
Tabelle 1 zeigt auch, dass ACT-4-h-1 auf allen getesteten ruhenden Leukozytenunterarten (d.h. CD4⁺-T-Zellen, CD8⁺-T-Zellen, CD19⁺-B-Zellen, CD14⁺-Monozyten, Granulozyten und Plättchen) im Wesentlichen fehlte und auch auf aktivierten B-Zellen und Monozyten im Wesentlichen abwesend war. Es stellte sich auch heraus, dass ACT-4-h-1 in den meisten Tumorzelllinien im Wesentlichen abwesend war. Jedoch zeigten Molt3-, Raji- und NC37-Zelllinien ein geringes Expressionsausmaß. TABELLE 1 ZELLSPEZIFITÄT DER ACT-4-h-1-EXPRESSION

¹MCF = Mittlere Kanalfluoreszenz
²Zellen, die als „aktiviert" angegeben wurden, waren etwa 3 Tage lang mit PHA stimuliert worden.

Beispiel 3: Zeitverlauf der ACT-4-h-1-Expression als Antwort auf die CD4⁺-T-Zellaktivierung
CD4⁺-T-Zellen wurden auf ihre Expression von ACT-4-h-1-Rezeptoren als Antwort auf verschiedene aktivierende Stimuli getestet. CD4⁺-T-Zellen wurden mittels Festphasenimmunadsorption („Panning") aus peripheren mononuklearen Blutzellen gereinigt. 5 × 10⁴ CD4⁺-T-Zellen wurden mit einem aktivierenden Mittel in Mikrotiter-Wells kultiviert, die RPMI-Medium enthielten, das mit 10 % menschlichem Serum ergänzt war. Es wurden drei verschiedene aktivierende Mittel verwendet: (1) 5 × 10⁴ bestrahlte (3000 Rad) Monozyten, (2) PHA (1 μg/ml) und (3) Tetanustoxoid (5 μg/ml). ³H-Thymidin wurde 12-16 h vor der Ernte zu den Kulturen zugegeben. Nach der Ernte wurden die Zellen auf die Expression der Zelloberflächenantigene durch Inkubation mit verschiedenen markierten Antikörpern getestet (L106, Anti-CD4 und Anti-CD8), wie von Engleman et al., J. Immunol. 127, 2124-2129 (1981), beschrieben.
2 zeigt das Auftreten von ACT-4-h-1 als Antwort auf Alloantigenaktivierung. Vor der Aktivierung war keine Expression zu beobachten. Der Prozentsatz der Zellen, die den ACT-4-h-1-Rezeptor exprimieren, nimmt mit der Zeit zu, wobei nach etwa sieben Tagen Alloantigenaktivierung bei etwa 30 % ein Höhepunkt erreicht wird. Die Ergebnisse zeigen auch, dass im Wesentlichen alle Zellen, die ACT-4-h-1 exprimieren, auch den CD4-Rezeptor exprimierten und dass im Wesentlichen keine Zellen den CD8-Rezeptor exprimierten. 3 zeigt ähnliche Daten für das Auftreten von ACT-4-h-1 als Antwort auf Tetanustoxoidaktivierung. Wiederum war der Prozentsatz der Zellen, die ACT-4-h-1 exprimierten, nach etwa sieben Tagen am höchsten. Jedoch exprimierte zu diesem Zeitpunkt ein höherer Prozentsatz von Zellen (etwa 60 %) den Rezeptor. 4 zeigt ähnliche Daten für das Auftreten von ACT-4-h-1 auf CD4⁺-T-Zellen als Antwort auf PHA-Aktivierung. In dieser Situation erreicht der Prozentsatz der CD4⁺-T-Zellen, die den Rezeptor exprimieren, nach drei Tagen Aktivierung bei etwa 65 % seinen Höhepunkt.
Es wird die Schlussfolgerung gezogen, dass ACT-4-h-1 ein CD4⁺-T-Zellaktivierungsantigen ist, das als Antwort auf verschiedene aktivierende Stimuli exprimiert wird.
Beispiel 4: Klonierung von ACT-4-h-1-cDNA
Der cDNA-Klon für den ACT-4-h-1-Rezeptor wurde unter Einsatz eines leicht modifizierten COS-Zellexpressionssystems isoliert; das von Aruffo & Seed, siehe oben;" zum ersten Mal entwickelt wurde. RNA wurde aus 72-Stunden-PHA-aktivierten menschlichen peripheren Blutlymphozyten isoliert. Die Gesamt-RNA wurde mit TRI-Reagens (Molecular Research Center) extrahiert, und poly(A)+-RNA wurde mittels Oligo-dT-Magnetperlenreinigung (Promega) isoliert. cDNA wurde mithilfe des Verfahrens von Gubler & Hoffman, Gene 25, 263-369 (1982), unter Einsatz von reverser Superscript-Transkriptase (Gibco/BRL) und einem Oligo-dT-Primer synthetisch hergestellt. Abgestumpfte cDNA wurde an nicht-selbstkomplementäre BstX1-Adaptoren ligiert und über eine Sephacryl-S-400-Drehsäule zur Entfernung nicht-ligierter Adaptoren und kleiner Fragmente (<300 Basenpaare) geleitet. Die gebundene cDNA wurde dann in einen mit BstX1 geschnittenen eukaryotischen Expressionsvektor, pcDNA-IRL, eine ampicillinresistente Version von pcDNA-1 (Invitrogen), ligiert. Die präzipitierten und gewaschenen Produkte der Ligationsreaktion wurden in einen E.-coli-Stamm WM1100 (BioRad) elektroporiert. Das Plattieren und Zählen einer Aliquote der transformierten Bakterien zeigte eine Gesamtzahl von 2 Millionen unabhängiger Klone in der nicht amplifizierten Bibliothek. Es wurde eine durchschnittliche Insertgröße von 1,2 kb festgestellt. Der Großteil der Bibliothek wurde in flüssiger Kultur, 250 ml Standard-LB-Medium, amplifiziert. Das Plasmid wurde mittels alkalischer Lyse gewonnen und über eine Ionenaustauschsäule (Qiagen) gereinigt.
Subkonfluente COS-7-Zellen wurden mit der gereinigten Plasmid-DNA mittels Elektroporation transfiziert. Die Zellen wurden auf 100-mm-Schalen ausplattiert und 48 Stunden lang wachsen gelassen. Die Zellen wurden mit PBS-EDTA-Lösung von den Platten gewonnen, mit monoklonalem Antikörper L106 inkubiert und nach Standardverfahren Panning unterzogen. Eine zweite Runde Panning zeigte eine Anreicherung, da mehrere COS-Zellen an die Platten adsorbierten. Episomale DNA wurde von den immunselektierten Zellen mittels Hirt-Verfahren gewonnen und zur Amplifikation in Bakterien elektroporiert.
Die Bakterien, die mit dem Plasmid der Hirt-Formulierung der zweiten Runde transformiert worden waren, wurden zu kleinen Pools von etwa 100 Kolonien verdünnt. Die Pools wurden amplifiziert und ihre DNA gereinigt und mittels Immunfluoreszenz auf die Fähigkeit getestet, eine Expression des L106-Antigens auf COS-7-Zellen zu verleihen. Phycoerythrin-konjugierter L106-Antikörper wurde dazu verwendet, COS-7-Zellmonoschichten zu färben, und die Zellen wurden dann mittels manueller Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Miniprep-DNA von 4 von 8 Pools war positiv, wenn sie auf Expression getestet wurde. Der Pool mit der besten Expression, Pool E, wurde in kleinere Pools von ^- 12 Kolonien unterteilt. Drei von acht Subpools waren positiv, und Subpool E1 wurde ausplattiert, um die Analyse einzelner Kolonien zu ermöglichen. Es wurde festgestellt, dass Klon E1-27 auf der Oberfläche transfizierter COS-Zellen eine hochgradige Expression des ACT-4-h-1-Rezeptors verlieh.
Beispiel 5: cDNA-Sequenzanalyse
Das Insert des E1-27 genannten Klons wurde in pBluescript subkloniert und mittels Didesoxykettenterminationsverfahren sequenziert, und zwar unter Einsatz eines T7-Polymerase-Autoread-Sequenzierungssets (Pharmacia) auf einem ALF-Sequenzierer (Pharmacia). Restriktionskartierung zeigte verschiedene geeignete Stellen für Subklonierung. Fünf Subklone wurden in pBluescript erzeugt und auf beiden Strängen mit M13-Vorwärts- und -Universal-Primern sequenziert.
Die cDNA und abgeleitete Aminosäuresequenzen von ACT-4-h-1 sind in 5 dargestellt. Die ACT-4-h-1-cDNA-Sequenz von 1.137 Basenpaaren enthält eine nicht-translatierte 14-bp-5'-Region und eine nicht-translatierte 209-bp-3'-Region. Ein AATAAA-Polyadenylierungssignal ist an Position 1.041 gegenwärtig, gefolgt von einem 80-bp-poly-A-Schwanz, der an Position 1.057 beginnt. Der längste offene Leseraster beginnt mit dem ersten ATG an Position 15 und endet mit einem TGA an Position 846. Die voraussichtliche Aminosäuresequenz ist jene eines typischen Typ-1-Integralmembranproteins. Die Hydrophobizitätsanalyse zeigt eine vermeintliche Signalsequenz, die dem initiierenden ATG folgt, mit einem kurzen Abschnitt basischer Reste, gefolgt von einem langen Abschnitt hydrophober Reste. Eine voraus sichtliche Signalpeptidspaltstelle ist an Rest 22 oder 24 gegenwärtig (letzterer ist aufgrund des Kriteriums von Heijne, Nucleic Acids Res. 14, 4683-4690, (1986), der wahrscheinlichere), wobei ein reifes Protein von 253 Aminosäureresten (oder 255 Aminosäuren, wenn Spaltung an der weniger wahrscheinlichen Stelle auftritt) zurückgelassen wird. Hydrophobizitätsanalyse zeigt auch einen einzelnen großen Abschnitt von 27 hydrophoben Resten, welche die Transmembrandomäne sein soll, die eine extrazelluläre Domäne von 189 (oder 191) Aminosäuren und eine intrazelluläre Domäne von 37 Aminosäuren voraussagt. Die extrazelluläre Domäne ist cysteinreich, wo 18 Cysteine in einem Abschnitt von 135 Aminosäuren zu finden sind. Das voraussichtliche Molekulargewicht (Mr) für das reife Protein beträgt 27.400, und es gibt zwei potenzielle N-Glykosylierungsstellen an den Aminosäureresten 146 und 160.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von ACT-4-h-1 mit bekannten Sequenzen in der Swiss-Prot-Datenbank, die das BLAZE-Programm verwendet, zeigt eine Sequenzähnlichkeit mit Mitgliedern der Überfamilie des Nervenwachstumsfaktorrezeptors. Aminosäuresequenzen sind zumindest zu 20 % identisch für NGF-R, TNF-R, CD40, 41-BB und fas/APO-1 und 62 % für OX-40, wodurch Lücken und Deletionen möglich sind. Anordnungen der verschiedenen Proteine zeigen die Konservierung mehrerer cysteinreicher Motive. Drei dieser Motive sind in ACT-4-h-1 und OX-40 vorhanden verglichen mit vier solcher Motive in NGF-R und CD40.
Ein Vergleich der Nucleotidsequenz von CT-4-h-1 mit bekannten Sequenzen in den Genbank- und EML-Datenbanken unter Einsatz der BLAST- und FASTDB-Programme zeigt einen hohen Grad an Sequenzähnlichkeit mit nur einem Mitglied der Nervenwachstumsfaktorrezeptorfamilie, OX-40. Durch das Ermöglichen von Lücken und Insertionen beträgt die Sequenzidentität 66 %. Ein Vergleich von ACT-4-h-1- und OX-40-Nucleotisequenzen zeigt, dass beide eine nicht-translatierte 14-bp-5'-Region umfassen und beide etwa 80-bp-Poly-A-Schwänze umfassen. In ACT-4-h-1 gibt es jedoch eine kurze Verlängerung der nicht-translatierten 3'-Region von 187 bp auf 209 bp, und es gibt eine Verlängerung der kodierenden Region von 816 bp auf 834 bp, ein Unterschied von 18 bp oder 6 Aminosäureinsertionen. Eine Anordnung der beiden Aminosäuresequenzen zeigt, dass vier der Aminosäureinsertionen vor der Signalsequenzspaltstelle auftreten. Daher enthält das reife ACT-4-h-1-Rezeptorprotein einen Aminosäurerest mehr als OX-40. (d.h. 253 gegenüber 252 Aminosäuren). Bemerkenswerterweise ist die ACT-4-h-1-Nucleotidsequenz viel GC-reicher als die OX-40-Sequenz (70 % gegenüber 55 %), was anzeigt, dass die beiden Sequenzen unter stringenten Bedingungen nicht hyridisieren.
Beispiel 6: Produktion von stabilen ACT-4-h-1-Transfektanten
Ein XbaI-HindIll-Fragment wurde aus dem in Beispiel 4 beschriebenem Konstrukt geschnitten und in XbA/HindIII-verdaute pcDNA-I-neo (Invitrogen) insertiert, um einen Expressionsvektor zu erzeugen, der ACT-4-h-1-neo genannt wird (6). Dieser Vektor wurde mit SF1 linearisiert und in drei eukaryotische Zelllinien elektroporiert. Diese Zelllinien waren SP2/O (ein Mausmyelom, das von einem Balb/c-Stamm abstammte), Jurkat (eine transformierte menschliche T-Zelllinie) und COS-7 (eine adhärente Affenzelllinie). Nach einer 48-Stunden-Gewinnungsphase wurden die transformierten Zellen in 1 mg/ml G418 (Gibco) selektiert. Nach drei Wochen Selektion wurden neoresistente Zelllinien mit einer sättigenden Konzentration von L106-Antikörper inkubiert, gewaschen und auf 100-mm-Petrischalen, die mit einem Ziegen-Anti-Maus-IgG beschichtet waren, überschichtet, um Zellen auszuwählen, die ACT-4-h-1 exprimieren. Nach dem Abwaschen ungebundener Zellen wurden adhärente Zellen gewonnen und in Gewebskultur vermehrt. Die Zelllinien wurden zwei weiteren Runden Panning und Expression unterworfen. Die resultierenden Zelllinien wurden durch direkte Immunfluoreszenzfärbung dargestellt, um zahlreich vorliegendes STAN-4-h-1 zu exprimieren (7).
Beispiel 7: Produktion eines ACT-4-h-1-Immunglobulinfusionsproteins
Es ist ein lösliches Fusionsprotein hergestellt worden, in welchem die extrazelluläre Domäne von ACT-4-h-1 über ihren C-Terminus mit dem N-Terminus der konstanten Domäne eines menschlichen Immunglobulins verbunden ist. Der Vektor, der für ACT-4-h-1 kodiert, der in Beispiel 4 beschrieben ist, wurde mit SmaI und NotI gespalten, um alle ACT-4-h-1-Sequenzen stromab der Smal-Stelle, einschließlich Transmembran-, zytoplasmischer nicht-translatierter 3'-Regionen, herauszuschneiden. Die verbleibende Region kodiert für den löslichen extrazellulären Abschnitt von ACT-4-h-1 (8). Die Quelle der konstanten-Immunglobulinregion, die an die extrazelluläre ACT-4-h-1-Domäne gebunden war, war ein Plasmid, das 5K-41BB-Eg1 genannt wurde (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89, 10360-10364). Dieses Plasmid enthält ein genomisches 1,3-kb-BamHI/Eagl-Fragment, das für die Gelenk-, CH2- und terminale CH3-Domänen des menschlichen Ig, Isotyp gamma 1, kodiert. Das Fragment erforderte eine Modifikation zur Insertion in die Smal/NotI-Enden des ACT-4-h-1-Vektors, während der Peptidleseraster über die SmaI-Verbindung beibehalten wurde, die durch eine Ligation des stumpfen Endes gebildet werden soll. Der Vektor 5k-41BB-Eg1 wurde mit BamH1 geschnitten, und die resultierenden 5'-Extensionen wurden mit Klenow-Fragment gefüllt. Der Vektor wurde dann mit EagI geschnitten, der das 1,3-kb-Fragment mit stumpfen und NotI-kompatiblen Enden freisetzt. Dieses Fragment wurde mit Smal/NotI verdautem ACT-4-h-1-Vektor ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli elektroporiert, und multiple transformierte Klone wurden mit PCR unter Verwendung von ACT-4-h-1 und IgG1-Nucleotidfragementen als Primer gescreent.
Plasmide, welche die ACT-4-h-1-IgG1-Kodierung enthielten, wurden in COS-Zellen elektroporiert. Die Zellen wurden fünf Tage lang wachsen gelassen, wonach ihre Überstände geerntet wurden und durch eine 0,2-μm-Membran sterilfiltriert wurden. Die Überstände wurden mittels Dot-Blotting auf die Expression von ACT-4-h-1-IgG1 getestet. Die Überstände wurden auf Mikrozellulose geblottet und mit 5 % fettfreier Trockenmilch blockiert. Replica-Blots wurden mit Antikörper L106 oder mit mit alkalischer Phosphatase markiertem Ziegen-Anti-Human-Immunglobulin-IgG (America Qualex) mit einer Sonde untersucht. Antikörper L106 wurde mit einem Ziegen-Anti-Maus-IgG, das mit alkalischer Phosphatase markiert war, detektiert. NBT/BCIP (Pierce) wurde als kolorimetrisches Substrat verwendet. Hochproduktive positive Klone wurden an der Bindungsstelle sequenziert, um die geeignete Vektorenherstellung nachzuweisen. Das resultierende Fusionsgen ist in 9 dargestellt.
Zum Zwecke der Klarheit und des Verständnisses ist die Erfindung in diesen Beispielen und der obigen Offenbarung detailliert beschrieben worden. Es ist jedoch offensichtlich, dass bestimmte Veränderungen und Modifikationen im Schutzumfang der beiliegenden Patentansprüche durchgeführt werden können.
Zum Zwecke dieser Beschreibung und der beiliegenden Patentansprüche steht ein „isoliertes" Material, wo der Kontext es erlaubt, für ein Material mit einer oder mehreren der folgenden Eigenschaften, dass es (a) gereinigt worden ist und/oder (b) es ausreichend frei von kontaminierender Unreinheit ist, sodass es zumindest für einen Zweck im Schutzumfang eines oder mehrerer der hierin erwähnten Zwecke verwendet werden kann und/oder (c) es ein Material natürlichen Ursprungs ist oder ein Material, das strukturell identisch mit einem Material natürlichen Ursprungs ist, das im Wesentlichen frei ist von zumindest einer natürlichen Hauptkomponente oder befreit wurde, die es in seiner natürlichen Form begleitet oder mit welchen es natürlich verbunden oder gemischt ist, z.B. frei oder befreit von allen oder im Wesentlichen allen natürlichen begleitenden Komponenten, und/oder (d) in Form einer Zusammensetzung vorliegt, die ein Material jeglicher der vorangegangenen Eigenschaften gemeinsam mit weiterem/n Material(ien) vom Wesen eines chemisch oder biologisch oder pharmazeutisch definierten Trägers, Verdünners, Vehikels oder anderen Materials von einer Eigenschaft, die für zumindest einen Zweck im Schutzumfang eines oder mehrerer der hierin erwähnten Zwecke annehmbar ist.
Die vorliegende Offenbarung von Materialien umfasst die Offenbarung solcher Materialien in isolierter Form, und die vorliegende Offenbarung umfasst den Inhalt der vorangegangenen Beschreibung, Zeichnung und beiliegenden Patentansprüche und, wie Fachleuten offensichtlich sein wird, Modifikationen und Variationen und Kombinationen und Subkombinationen der hierin beschriebenen Eigenschaften.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes ACT-4-Rezeptorpolypeptid, das (a) die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2, (b) eine Variante der Aminosäuresequenz Seq.-ID Nr. 2, unter der Voraussetzung, dass solch eine Variante zumindest 70 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 aufweist und mit der Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 um die spezifische Bindung an einen Antikörper konkurriert, oder (c) ein Fragment eines Polypeptids, wie es in (a) oder (b) definiert ist, das zumindest fünf zusammenhängende Aminosäuren lang ist und mit der Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 um die spezifische Bindung an einen Antikörper konkurriert, umfasst oder daraus besteht.
Polypeptid nach Anspruch 1, das (a) die Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne der Seq.-ID Nr. 2, (b) eine Variante der Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne der Seq.-ID Nr. 2, unter der Voraussetzung, dass solch eine Variante zumindest 70 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne der Seq.-ID Nr. 2 aufweist und mit der extrazellulären Domäne der Seq.-ID Nr. 2 um die spezifische Bindung an einen Antikörper konkurriert, oder (c) ein Fragment eines Polypeptids, wie es in (a) oder (b) definiert ist, das zumindest fünf zusammenhängende Aminosäuren lang ist und mit der extrazellulären Domäne der Seq.-ID Nr. 2 um die spezifische Bindung an einen Antikörper konkurriert, umfasst oder daraus besteht.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Polypeptid zumindest eines der folgenden Merkmale aufweist: (a) es umfasst eine oder besteht aus einer Domäne, die aus einer oder mehreren der folgenden Domänen ausgewählt ist: einer Signalsequenz, einer intrazellulären Domäne, einer Transmembrandomäne oder einer extrazellulären Domäne; (b) es weist eine extrazelluläre Domäne mit einer oder mehreren Schleifen in der Kette auf, die durch Disulfidbindung von zwei Cysteinresten gebildet werden; (c) es ist ein natürlich vorkommendes Polypeptid menschlichen Ursprungs; (d) es ist ein natürlich vorkommendes Polypeptid einer Art, die auf der Oberfläche von aktivierten CD4⁺-T-Zellen vorhanden ist und auf aktivierten CD8⁺-T-Zellen und ruhenden T-Zellen im Wesentlichen fehlt; (e) es ist ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 50 kDa vor einer Deglykosylierung und etwa 27 kDa danach; (f) es ist ein Polypeptid, das löslich ist; (g) es ist ein Polypeptid, das zur spezifischen Bindung an einen ACT-4-Liganden in der Lage ist; (h) es bildet einen Teil eines rekombinanten Globulinprodukts; und/oder (i) es bildet einen Teil eines Fusionspolypeptidprodukts.
Polypeptid nach Anspruch 2, worin das Polypeptid einen Teil eines Fusionspolypeptids bildet und an eine konstante Region einer Immunglobulin-Schwerkette fusioniert ist, um ein rekombinantes Globulinfusionsprodukt zu bilden.
Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder 2 in einem Verfahren, das ausgewählt ist aus: (a) dem Screenen eines Antikörper auf spezifische Bindung an das gleiche Epitop, das durch einen L106-Antikörper gebunden ist, folgende Schritte umfassend: das Bereitstellen einer Lösung, die einen zu screenenden Antikörper, den L106-Antikörper und ein ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid umfasst, wobei das Polypeptid spezifisch an den L106-Antikörper bindet; und das Messen der spezifischen Bindung zwischen dem Polypeptid und dem L106-Antikörper oder zwischen dem Polypeptid und dem zu screenenden Antikörper, um zu zeigen, ob der zu screenende Antikörper mit dem gleichen Epitop reagiert wie der L106-Antikörper, und worin der L106-Antikörper durch das Hybridom produziert wird, das unter der ATCC-Zugangsnummer HB 11483 bei der American Type Tissue Culture Collection in Rockville, Maryland, USA, hinterlegt ist; (b) dem Lokalisieren eines spezifisch an einen Anti-ACT-4-Rezeptorpolypeptid-Antikörper gebundenen Epitops, folgende Schritte umfassend: das Bereitstellen einer Familie von Fragmenten, die unterschiedliche Aminosäuresegmente von einer ACT-4-Rezeptorpolypeptidsequenz enthalten, worin jedes der Fragmente zumindest vier zusammenhängende Aminosäuren umfasst und worin die Familie von Fragmenten gemeinsam einen Großteil der oder die gesamte ACT-4-Rezeptorpolypeptid-Aminosäuresgeuenz abdeckt; und das Messen der spezifischen Bindung zwischen dem Fragment und einem Antikörper, um die Aminosäuresequenz des Epitops herauszufinden, das vom Antikörper erkannt wird; (c) dem Screenen auf immunsuppresive Mittel, folgende Schritte umfassend: das Kontaktieren eines ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptids (d.h. auf einer festen Oberfläche immobilisiert) mit einem möglicherweise immunsuppressiven Mittel; und das Detektieren einer spezifischen Bindung zwischen dem ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid und dem Mittel, wobei die spezifische Bindung auf eine immusuppressive Aktivität hinweist; (d) dem Screenen auf einen ACT-4-Liganden, folgende Schritte umfassend: das Kontaktieren einer biologischen Probe, die auf den ACT-4-Liganden gescreent werden soll, mit einem ACT-4-Rezeptorpolypeptid; dann das Reinigen des ACT-4-Liganden durch Isolieren eines Komplexes, der zwischen dem Liganden und dem ACT-4-Rezeptorpolypeptid gebildet wurde; und das Aufspalten des Komplexes, um den Liganden zu erhalten; und (e) dem Testen einer Probe zum Zweck des Detektierens eines spezifischen Bindungspartners eines ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptids, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer zu testenden Probe mit einem direkt oder indirekt markierten ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid und das Detektieren einer spezifischen Bindung zwischen dem spezifischen Bindungspanter und dem ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid, falls in der zu testenden Probe vorhanden, umfasst, wodurch die Gegenwart solch einer Substanz in der Probe aufgedeckt wird.
Isolierter Antikörper oder Fragment davon, der/das spezifisch an ein ACT-4-Rezeptorpolypeptid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 bindet.
Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 6, der/das spezifisch an ein ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid nach Anspruch 1 oder 2 bindet.
Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, worin der Antikörper monoklonal oder humanisiert ist.
Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 6, 7 oder 8, worin der Antikörper oder das Fragment davon (i) mit dem Antikörper L106 um die spezifische Bindung an ein ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid nach Anspruch 1 oder 2 konkurrieren kann; und/oder (ii) spezifisch an aktivierte CD4⁺-T-Zellen binden kann; und/oder (iii) spezifisch an ein anderes Epitop auf einem ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid nach Anspruch 1 oder 2 binden kann als an das, das spezifisch an einen L106-Antikörper gebunden ist, und worin der L106-Antikörper durch das Hybridom, produziert wird, das unter der ATCC-Zugangsnummer HB 11483 bei der American Type Tissue Culture Collection in Rockville, Maryland, USA, hinterlegt ist.
Antikörper oder Fragment davon nach einem der Ansprüche 6, 7, 8 oder 9, worin der Antikörper oder das Antikörperfragment an ein Toxin gebunden ist.
Humanisierter Antikörper oder Fragment davon nach einem der Ansprüche 6, 7, 8, 9 oder 10, worin der Antikörper oder das Fragment davon eine humanisierte Schwerkette und eine humanisierte Leichtkette umfasst.
Humanisierter Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 11, worin (i) die humanisierte Leichtkette drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3) mit Aminosäuresequenzen von den entsprechenden komplementaritätsbestimmenden Regionen einer L106-Antikörper-Leichtkette umfasst und eine Gerüstsequenz der variablen Region aufweist, die im Wesentlichen mit der Gerüstsequenz der variablen Region einer menschlichen Leichtkette identisch ist; und/oder (ii) die humanisierte Schwerkette drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3) mit Aminosäuresequenzen von den entsprechenden komplementaritätsbestimmenden Regionen einer L106-Antikörper-Schwerkette umfasst und eine Gerüstsequenz der variablen Region aufweist, die im Wesentlichen mit der Gerüstsequenz der variablen Region einer menschlichen Schwerkette identisch ist; und/oder (iii) der humanisierte Antikörper spezifisch mit einer Bindungsaffinität an ein ACT-4-h-1-Rezeptorpolypeptid bindet, die innerhalb des dreifachen Werts der Bindungsaffinität des L106-Antikörpers liegt, und worin der L106-Antikörper durch das Hybridom produziert wird, das unter der ATCC-Zugangsnummer HB 11483 bei der American Type Tissue Culture Collection in Rockville, Maryland, USA, hinterlegt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: (i) ein ACT-4-Rezeptorpolypeptid nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4; oder (ii) einen Antikörper nach einem der Ansprüche 6 bis 12 gemeinsam mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel, Exzipienten und/oder Verdünner.
Verwendung eines Antikörpers oder Fragments davon nach einem der Ansprüche 6 bis 12 zur Detektion und/oder Quantifizierung der Gegenwart von aktivierten CD4⁺-T-Zellen in einer Probe von einem Patienten, worin die Gegenwart oder Menge der Expression eines ACT-4-Rezeptorpolypeptids auf CD4⁺-T-Zellen in dieser Probe auf die aktivierten CD4⁺-T-Zellen im Patienten hinweist, was symptomatisch für eine Erkrankung oder ein Leiden des Immunsystems ist.
Verwendung nach Anspruch 14, worin die Detektion oder Quantifizierung von CD4⁺-T-Zellen durch folgende Schritte auf einer Zellprobe durchgeführt wird, die von einem Patienten stammt: (i) das direkte oder indirekte Markieren des Antikörpers; (ii) das Aussetzen der Probe gegenüber dem Antikörper aus Schritt (i); und (iii) das Bestimmen der Menge der spezifischen Bindung des markierten Antikörpers an die ACT-4-Rezeptorpolypeptide, die auf den CD4⁺-T-Zellen in der Probe vorhanden sind.
ACT-4-Rezeptorpolypeptid nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 zur Verwendung in einem Arzneimittel.
Verwendung von (i) einem ACT-4-Rezeptorpolypeptid nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4; oder (ii) einem Antikörper oder Fragment davon nach einem der Ansprüche 6 bis 12 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen und Leiden des Immunsystems.
Verwendung eines Antikörpers oder Fragments davon nach einem der Ansprüche 6 bis 12 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Unterdrückung einer Immunantwort in einem Patienten, der dies benötigt.
Verwendung eines Antikörpers oder Fragments davon nach einem der Ansprüche 6 bis 12 bei der Herstellung eines Medikaments zur Steigerung einer Immunantwort gegen ein gewähltes Antigen in einem Patienten, der dies benötigt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17, 18 oder 19, worin Erkrankungen und Leiden des Immunsystems aus Transplantatabstoßung, Transplantat-Wirt-Reaktionen, Autoimmunerkrankungen, Entzündungserkrankungen und durch infektiöse Agenzien ausgelösten Erkrankungen und Leiden ausgewählt sind.
Verwendung nach Anspruch 20, worin die Autoimmunerkrankung aus Multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis und Lupus erythematodes ausgewählt ist.
Nucleinsäurefragment, das eine Sequenz umfasst oder aus dieser besteht, die für ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 kodiert.
Nucleinsäurefragment nach Anspruch 22, worin das Nucleinsäurefragment (a) die DNA-Sequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder sein RNA-Äquivalent; (b) eine Sequenz, die zumindest 70 % Sequenzidentität mit der von (a) aufweist; oder (c) eine Sequenz, die für ein Polypeptid nach Anspruch 4 kodiert, ist.
Expressionsvektor, ein Nucleinsäurefragment nach Anspruch 22 umfassend.
Zelllinie, die mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 24 transformiert oder transfiziert ist.