WO2021187540A1 - Ｓｃｎ１ａ遺伝子の発現及び／又は機能調節剤 - Google Patents

Ｓｃｎ１ａ遺伝子の発現及び／又は機能調節剤 Download PDF

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WO2021187540A1
WO2021187540A1 PCT/JP2021/010901 JP2021010901W WO2021187540A1 WO 2021187540 A1 WO2021187540 A1 WO 2021187540A1 JP 2021010901 W JP2021010901 W JP 2021010901W WO 2021187540 A1 WO2021187540 A1 WO 2021187540A1
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WO
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antisense oligonucleotide
stranded antisense
acceptable salt
pharmaceutically acceptable
base sequence
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PCT/JP2021/010901
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English (en)
French (fr)
Inventor
光將 栗田
成宏 浅野
和生 関口
宅郎 小堀
高尾 鈴木
正輝 山上
アジャヤラム セレスタ
佐藤　秀昭
忠士 梅本
Original Assignee
大日本住友製薬株式会社
ルクサナバイオテク株式会社
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    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to a single-stranded antisense oligonucleotide that promotes the expression of the SCN1A gene and / or regulates its function, and an agent that regulates the expression and / or function of the SCN1A gene containing the single-stranded antisense oligonucleotide.
  • the SCN1A gene is a gene encoding a voltage-gated sodium channel ⁇ 1 subunit (Nav1.1).
  • the SCN1A gene is highly expressed in the central and peripheral nervous systems.
  • Nav1.1 expressed in nerve cells is activated by depolarization of the cell membrane to allow sodium ions to flow from the extracellular space into the cell.
  • the sodium ions that have flowed into the cells generate action potentials in the nerve cells, and as a result, the nerve cells are excited.
  • Nav1.1 plays a major role in the generation of action potentials in GABAergic (gamma-aminobutyric acid) inhibitory neurons.
  • Non-Patent Document 1 When the expression and / or function of Nav1.1 is reduced, the excitatory suppression balance of the neural circuit is disrupted, and epilepsy, neurodevelopmental disorder, neurodegenerative disease, schizophrenia, dementia, depression / anxiety symptoms, Alzheimer's disease, Parkinson It is considered to be involved in the development of various neuropsychiatric disorders such as illness, migraine, motor disorder, sleep disorder, feeding disorder, autonomic neurodevelopment, pain, and drug dependence (Non-Patent Document 1).
  • Nav1.1, Nav1.2, and Nav1.6 have been identified as alpha subunits of typical voltage-gated sodium channels involved in the development of epilepsy. These alpha subunits affect the generation and frequency of action potentials by transient or sustained sodium ion influx into the cell. Therefore, sodium channel inhibitors (for example, carbamazepine, phenytoin, lamotrigine, lacosamide, topiramate, zonisamide, valproic acid, etc.) exert antiepileptic effects by suppressing the function of sodium channels (Non-Patent Document 2). ..
  • the SCN1A gene has been identified as the responsible gene for Dravet syndrome. Haploinsufficiency due to heterozygous mutations in the SCN1A gene is thought to be involved in the development of Dravet syndrome. In Dravet syndrome, administration of sodium channel inhibitors rather exacerbates epileptic symptoms. Therefore, administration of an existing antiepileptic drug cannot be said to be an effective treatment method, and a new treatment method is required (Non-Patent Document 3).
  • NAT natural antisense transcript
  • SCN1A NAT antisense oligonucleotide against NAT
  • Non-Patent Document 4 2'-O-methylated RNA (2'-OMe) or 2', 4'-BNA (Bridged Nucleic Acid, hereinafter referred to as "LNA". It is a nucleic acid modified with).
  • the above antisense oligonucleotide upregulates the expression of the SCN1A gene, but further improvement is required in terms of efficacy, safety, stability and the like.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and the problem to be solved by the present invention is a single-stranded antisense oligonucleotide that promotes the expression of the SCN1A gene and / or regulates its function, and a single-stranded antisense oligonucleotide.
  • a regulator of expression and / or function of the SCN1A gene which comprises.
  • antisense oligonucleotide of the present invention finds out and complete the invention. That is, the present invention is as follows.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is a single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof that promotes the expression of the potential-dependent sodium channel ⁇ 1 subunit gene and / or regulates its function.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide has a gap region, a 3'wing region attached to the 3'end of the gap region, and a 5'wing region attached to the 5'end of the gap region.
  • the base sequence of the above single-stranded antisense oligonucleotide is In the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, counting from the 5'end, 191 to 201, 239 to 251 and 291 to 297, 331 to 335, 365 to 384, and 404 to 414. Nos. 443-450, 465-472, 506, 543-550, 579, 732-757, 804-816, 909-911, 988-991, Alternatively, a base sequence having 90% or more and 100% or less sequence identity, based on a base sequence complementary to a target region composed of 10 to 25 mer continuous from the bases located at Nos. 1077 to 1096.
  • each nucleotide is bound with a phosphate group and / or an artificial phosphate group.
  • the gap region is a nucleic acid having a sugar portion of 5 to 20 mer and having deoxyribose.
  • the 3'wing region is a modified nucleic acid of 1 to 5 mer.
  • the modified nucleic acid in the 3'wing region comprises at least one selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the 5'wing region is a modified nucleic acid of 1 to 5 mer.
  • the modified nucleic acid in the 5'wing region comprises at least one selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is based on an oligonucleotide having a nucleic acid having a sugar moiety of deoxyribose in the gap region, and the above-mentioned predetermined modified nucleic acid is arranged in the 5'wing region and the 3'wing region.
  • the modified nucleic acid may be AmNA (amide-bridged artificial nucleic acid, Amido-bridged nucleic acid), GuNA (guanidine-bridged artificial nucleic acid, Guanidino-bridged nucleic acid), or scpBNA (2'-O, 4) as a cross-linked modified nucleic acid. Includes at least one of'-C-Spirocyclone bridged nucleic acid).
  • the antisense oligonucleotide of the present invention can be expected to have a high binding affinity for SCN1A NAT. Further, since the antisense oligonucleotide of the present invention is a so-called gapmer type, it functions as a catalyst in the decomposition reaction of SCN1A NAT by an RNA degrading enzyme described later. Therefore, it is considered that a predetermined effect is continuously produced even if a small amount is administered.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is, in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 197 to 201, 240 to 249, 293 to 297, counting from the 5'end. 331 to 334, 413, 444 to 449, 466 to 472, 543 to 548, 733 to 756, 811 to 816, 910, 988 to 991, or 1077. It is a base sequence having 90% or more and 100% or less sequence identity based on a base sequence complementary to a target region composed of 10 to 25 mer continuous from the base located at No.
  • the above 3'wing region is 2 to 5 mer.
  • the 5'wing region is preferably 2 to 5 mer.
  • each nucleotide is bound by a phosphodiester bond, a phosphorothioate bond, a phosphoamidart bond, or a boranophosphate bond.
  • the gap region is 6 to 15 mer.
  • the above 3'wing region is 2 to 4 mer.
  • the 5'wing region is preferably 2 to 4 mer.
  • each nucleotide is bound by a phosphodiester bond or a phosphorothioate bond.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is, in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 197 to 201, 241 to 248, 331 to 332, counting from the 5'end. 12 consecutive bases located at 444-448, 543-548, 733-734, 744-745, 751-756, 812-816, or 989-991. It is preferable that the base sequence has 90% or more and 100% or less sequence identity based on the base sequence complementary to the target region composed of up to 20 mer.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is, in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 197 to 201, 241 to 248, 331 to 332, counting from the 5'end. 12 consecutive bases located at 444-448, 543-548, 733-734, 744-745, 751-756, 812-816, or 989-991. It is preferable that the base sequence is complementary to the target region composed of up to 20 mer.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is, in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 198 to 201, 241-248, 332, 444, counting from the 5'end. 90 based on the base sequence complementary to the target region composed of 14 to 20 mer continuous from the bases located at 543 to 547, 733, 745, 812 to 813, or 989. It is preferable that the base sequence has a sequence identity of% or more and 100% or less.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is, in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 198 to 201, 241-248, 332, 444, counting from the 5'end. It is preferable that the base sequence is complementary to the target region composed of 14 to 20 mer continuous from the bases located at 543 to 547, 733, 745, 812 to 813, or 989. ..
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is SEQ ID NO: 6, 7, 9, 11, 44, 46, 54, 59, 74, 78, 79, 84, 85, 87, 88, 93, 103-107, 109, 117-119, 121-123, 125-127, 135, 136, 138, 149, 153, 158, 165-168, 173, 176, 179-200, 202-205, 207, 209- From the group consisting of the base sequences of 213, 217, 220, 221, 225, 227, 233 to 237, 240, 241, 257, 263 to 266, 272, 273, 275 to 286, 350, 360, 361 and 363 to 365. It is preferably one base sequence of choice.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide complex according to the present invention comprises the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the additional substance is selected from the group consisting of polyethylene glycol, peptides, alkyl chains, ligand compounds, antibodies, proteins, and sugar chains.
  • the medicament according to the present invention is the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide complex or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Is included as an active ingredient.
  • the regulator of the expression and / or function of the potential-dependent sodium channel ⁇ 1 subunit gene according to the present invention is the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the above-mentioned one.
  • the active ingredient comprises a chain antisense oligonucleotide complex or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the therapeutic agent for Drave syndrome is the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide complex or its pharmaceutically acceptable salt. Contains acceptable salts as active ingredients.
  • the preventive agent for Drave syndrome is the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide complex or its pharmaceutically acceptable salt. Contains acceptable salts as active ingredients.
  • the method for promoting the expression of the SCN1A gene and / or regulating the function according to the present invention is the single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the single-stranded antisense.
  • the step of administering the oligonucleotide complex or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient to cells, tissues or individuals expressing the SCN1A gene is included.
  • the method for treating or preventing a neuropsychiatric disorder according to the present invention is the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide complex or a method thereof.
  • the step of administering a pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient to an individual suffering from the above-mentioned neuropsychiatric disorder is included.
  • the above-mentioned neuropsychiatric disorders are diseases associated with a decrease in the expression and / or function of the SCN1A gene, and are, for example, Drave syndrome, Lennox gasto syndrome, West syndrome, epilepsy accumulation, other drug-resistant epilepsy, neurodevelopmental disorders, and nerves.
  • Degenerative diseases schizophrenia, dementia, depression / anxiety symptoms, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, migraine, movement disorders, sleep disorders, eating disorders, autonomic neurological symptoms, pain, drug addiction and the like.
  • the present invention provides an individual with the single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the single-stranded antisense oligonucleotide complex or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention is the single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in the treatment of Drave syndrome, or the single-stranded antisense oligonucleotide complex or a pharmaceutical thereof.
  • the present invention is the single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof used for producing a therapeutic agent for Drave syndrome, or the single-stranded antisense oligonucleotide complex.
  • the pharmaceutically acceptable salt thereof is provided.
  • the present invention it is possible to provide a single-stranded antisense oligonucleotide that promotes the expression of the SCN1A gene and / or regulates the function, and a regulator of the expression and / or function of the SCN1A gene containing the single-stranded antisense oligonucleotide. become.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the configuration of the single-stranded antisense oligonucleotide according to the present embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating a mechanism for improving the expression of the SCN1A gene when the single-stranded antisense oligonucleotide according to the present embodiment is used.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the chemical structure of the single-stranded antisense oligonucleotide used in Example 272.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the chemical structure of the single-stranded antisense oligonucleotide used in Example 348.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the chemical structure of the single-stranded antisense oligonucleotide used in Example 351.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the chemical structure of the second-chain oligonucleotide used in Example 357.
  • the present embodiment an embodiment of the present invention (hereinafter, may be referred to as “the present embodiment”) will be described. However, this embodiment is not limited to this.
  • the notation in the form of "I to J” means the upper and lower limits of the range (that is, I or more and J or less).
  • the unit of I and the unit of J are the same.
  • the antisense oligonucleotide of this embodiment is a single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof that promotes the expression of the potential-dependent sodium channel ⁇ 1 subunit gene and / or regulates its function.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide has a gap region, a 3'wing region attached to the 3'end of the gap region, and a 5'wing region attached to the 5'end of the gap region.
  • the base sequence of the above single-stranded antisense oligonucleotide is In the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, counting from the 5'end, 191 to 201, 239 to 251 and 291 to 297, 331 to 335, 365 to 384, and 404 to 414. Nos. 443-450, 465-472, 506, 543-550, 579, 732-757, 804-816, 909-911, 988-991, Alternatively, a base sequence having 90% or more and 100% or less sequence identity, based on a base sequence complementary to a target region composed of 10 to 25 mer continuous from the bases located at Nos. 1077 to 1096.
  • each nucleotide is bound with a phosphate group and / or an artificial phosphate group.
  • the gap region is a nucleic acid having a sugar portion of 5 to 20 mer and having deoxyribose.
  • the 3'wing region is a modified nucleic acid of 1 to 5 mer.
  • the modified nucleic acid in the 3'wing region comprises at least one selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the 5'wing region is a modified nucleic acid of 1 to 5 mer.
  • the modified nucleic acid in the 5'wing region comprises at least one selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA. This will be described in detail below.
  • SCN1A gene Voltage-gated sodium channel ⁇ 1 subunit gene
  • SCN1A gene is referred to as Goldwin et al. al. It can be defined by the nomenclature of Neuron (2000); 28 (2) 365-368. Synonyms for SCN1A are sodium channel, potential-dependent, type I, ⁇ -subunit; NAC1; Nav1.1; SCN1; EIEE-6 (encephalopacy, epilepsy, early infantile, type 6 (EIEE-6, Dravet)).
  • HBSCI sodium channel protein, brain I alpha subunit; sodium channel, voltage gated, type I alpha subunit; sodium channel, voltage-gated, type I, alpha; sodium channel, voltage-gated, type I, alpha polypep
  • the "single-stranded antisense oligonucleotide” or “antisense oligonucleotide” refers to mRNA, mRNA precursor, or ncRNA (non-co-) of the target gene.
  • Ding RNA hereinafter sometimes referred to as “target RNA” means an oligonucleotide complementary to or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • Antisense oligonucleotides are composed of DNA, RNA and / or analogs thereof.
  • the antisense oligonucleotide suppresses the action of the target mRNA, pre-mRNA or ncRNA by forming a double strand with the target mRNA, pre-mRNA or ncRNA.
  • the antisense oligonucleotide has a base sequence completely complementary to the base sequence of the target mRNA, mRNA precursor, or ncRNA, and one or several in the complementary base sequence. Examples thereof include those having a base sequence in which a base is deleted, substituted, inserted or added, and those containing a base forming one or several fluctuating base pairs in the base sequence.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention may further contain modified nucleotides known in the art other than the "modified nucleic acid in which the sugar portion is an artificial sugar" (modified nucleotide having sugar modification) described later. ..
  • modified nucleotides known in the art include modified nucleotides modified with a phosphate group, modified nucleotides modified with a nucleic acid base, and the like, in addition to modified nucleotides modified with sugar.
  • the structure of both ends of the single-stranded antisense oligonucleotide in the present embodiment is not particularly limited, and may be, for example, -OH or -OR (where R is an alkyl chain or a phosphate ester). It may be a body or an additional substance described later.).
  • oligonucleotide means a polymer of nucleotides in which the same or different nucleotides are linked by 2 to 30 phosphodiester bonds or other bonds. It can also be understood that the oligonucleotide is composed of a nucleobase part, a phosphoric acid part, and a sugar part as shown by the following structural formula.
  • oligonucleotides are roughly classified into natural oligonucleotides and non-natural oligonucleotides.
  • Natural oligonucleotide means an oligonucleotide consisting of naturally occurring nucleotides.
  • the "unnatural oligonucleotide” means an oligonucleotide containing at least one modified nucleotide as a constituent unit, which will be described later.
  • the "non-natural oligonucleotide” is preferably an artificial sugar derivative with a modified sugar moiety; a phosphorothioate derivative in which one non-crosslinked oxygen atom of a phosphodiester bond is replaced with a sulfur atom; a phosphodiester bond.
  • alkylphosphonate eg, methylphosphonate, methoxypropylphosphonate, etc.
  • the non-natural oligonucleotide is a crosslinked artificial sugar derivative in which the sugar portion is modified; a phosphorothioate derivative in which one non-crosslinked oxygen atom of a phosphodiester bond is replaced with a sulfur atom; a phosphodiester bond.
  • Estelized ester derivative; and the sugar part is modified with an artificial sugar (for example, crosslinked sugar) described later, and one non-crosslinked oxygen atom of the phosphodiester bond is replaced with a sulfur atom, or phosphorus.
  • examples thereof include derivatives in which the acid diester bond is triesterified.
  • nucleoside means a compound in which a purine base or a pyrimidine base and a sugar are bound.
  • Naturally occurring nucleosides are sometimes referred to as “natural nucleosides.”
  • Modified nucleosides that do not exist in nature are sometimes referred to as “modified nucleosides”.
  • a modified nucleoside in which the sugar moiety is modified may be referred to as an “artificial sugar-modified nucleoside”.
  • nucleotide means a compound in which a phosphate group is bound to the sugar of the nucleoside.
  • Naturally occurring nucleotides may be referred to as “natural nucleotides”.
  • Modified nucleotides that do not exist in nature may be referred to as “modified nucleotides.” Examples of the "modified nucleotide” include a compound in which a phosphate group is bound to the sugar moiety of the modified nucleoside, a compound in which an artificial phosphate group described later is bound to the sugar moiety of the natural nucleoside, and the like.
  • sugar modification means that the sugar portion of the above nucleotide is modified.
  • the modified sugar portion may be particularly referred to as "artificial sugar”.
  • Modified nucleotides that have been sugar-modified include, for example, AmNA, GuNA, scpBNA, 2'-O-alkyl, 2'-F, 5'-methyl-DNA, LNA, ENA (2'-O, 4').
  • -C-Ethylene-Bridged Nucleic Acid S-cEt (2', 4'-constrained Ethyl Nucleic Acid) and the like can be mentioned.
  • Examples of AmNA include those including structures represented by the symbols “A (Y)”, “5 (Y)”, “G (Y)”, and “T (Y)” described later.
  • Examples of GuNA include structures represented by the symbols “A (Gx)”, “5 (Gx)”, “G (Gx)”, and “T (Gx)” described later.
  • Examples of the scpBNA include those including the structures represented by the symbols “A (S)”, “5 (S)”, “G (S)”, and “T (S)” described later.
  • Nucleotide modifications known in the art other than the sugar modifications can be used to produce the antisense oligonucleotides of the present invention.
  • Known nucleotide modifications include phosphate group modification and nucleobase modification, which will be described later. Such nucleotide modifications are described, for example, in w. BradWan et. Al. J. Med. Chem. 2016, 59.9645-9667.
  • Modifications of nucleotides described in (Non-Patent Document 5) and the like can be mentioned. Modifications of these nucleotides can be performed on the basis of methods known in the art described in the literature cited in the above literature.
  • the "phosphate group” means a naturally occurring phosphodiester bond (bond represented by the symbol "-” described later) in which the phosphoric acid portion of the nucleotide is bound in a naturally occurring manner.
  • phosphate group modification means that the phosphoric acid portion of the above nucleotide is modified.
  • the modified phosphate moiety may be particularly referred to as an "artificial phosphate group".
  • borane phosphate bond a bond indicated by the symbol “x” described later
  • alkylphosphonate and the like.
  • nucleobase modification means that the nucleic acid base portion of the above nucleotide is modified.
  • the modified nucleobase portion may be particularly referred to as an "artificial nucleobase".
  • artificial nucleobase examples include 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine, 5-propynylcytosine and the like.
  • DNA or RNA analog means a molecule having a structure similar to DNA or RNA.
  • peptide nucleic acid (pNA), morpholinoethanol and the like can be mentioned.
  • ncRNA means a general term for RNA that is not involved in protein translation.
  • examples of the ncRNA include ribosome RNA, transfer RNA, miRNA, NAT and the like.
  • nucleic acid base portion of the above oligonucleotide examples include a timinyl group, a cytosynyl group, an adeninyl group, a guanynyl group, a 5-methylcitosynyl group, a urasilyl group, and 2-oxo-4-hydroxy-5-methyl-1,2-dihydropyrimidine-1.
  • the nucleic acid base portion includes a timyl group, a cytosynyl group, an adeninyl group, a guanynyl group, a 5-methylcitosinyl group, a urasilyl group and the like.
  • uracil (U) and thymine (T) are compatible. Both uracil (U) and thymine (T) can form a base pair with the complementary strand adenine (A). The same applies to the nucleobase portion of the antisense oligonucleotide.
  • the target RNA means an RNA whose function is suppressed by binding of the antisense oligonucleotide.
  • the target RNA means SCN1A NAT.
  • Examples of the target RNA include human SCN1A NAT represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter, may be referred to as “hSCN1A NAT”), monkey SCN1A NAT represented by SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3.
  • Mouse SCN1A NAT hereinafter, may be referred to as “mSCN1A NAT”) and the like.
  • binding to a target RNA means that the nucleobase of a single-stranded antisense oligonucleotide forms a double-stranded nucleic acid together with the nucleobase of the target RNA by complementarity with the target RNA. means.
  • the double-stranded nucleic acid may be formed in at least one part of the target RNA.
  • the strength of binding to the target RNA can be measured, for example, by an index of thermal stability. Examples of the thermal stability index include the melting temperature (Tm value) of the double-stranded nucleic acid.
  • the Tm value is preferably 40 to 90 ° C, more preferably 50 to 70 ° C.
  • the target region means a region in SCN1A NAT that binds to the single-stranded antisense oligonucleotide.
  • the target region includes a target region consisting of the indicated base sequence and a region on the ncRNA precursor of SCN1A NAT.
  • Binding to the target region means that the antisense oligonucleotide of the present invention forms a double strand with the target region.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention does not necessarily have to form a double strand with the entire target region, and may form a double strand with a part of the target region. That is, the oligonucleotide of the present invention preferably has perfect complementarity with the target region, but may be complementary to at least a part of the target region as long as it binds to SCN1A NAT. Just do it.
  • the part of the target region means a region having a base length of 10 to 15 nucleotides in the target region.
  • Complementary to at least part of the target area means complementary to the base of at least a portion of the target region on SCN1A NAT.
  • it also includes being complementary to the base of the region on the ncRNA or ncRNA precursor corresponding to at least a part of the region.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide according to this embodiment is (A) In the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 191 to 201, 239 to 251 and 291 to 297, 331 to 335, 365 to 384, 404 counting from the 5'end. Nos. 414, 443-450, 465-472, 506, 543-550, 579, 732-757, 804-816, 909-911, 988- 90% or more and 100% or less based on the base sequence complementary to the target region composed of 10 to 25 mer (preferably 10 to 23 mer) continuous from the base located at No.
  • Base sequence with sequence identity (B) In the above target region, a base sequence complementary to the base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added, or (C) A base sequence that hybridizes to an oligonucleotide having the target region under stringent conditions.
  • each base sequence shown in the sequence listing shall be used to indicate only the sequence information of the nucleic acid base portion.
  • the structural information of the oligonucleotide including the sugar part and the phosphoric acid part in addition to the nucleobase part is in the description format shown in Tables 3-1 to 3-12 and Table 4-1 to Table 4-3 described later. It shall be shown.
  • sequence identity means the optimum alignment when two base sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art (preferably, the algorithm is for the optimum alignment). It means the ratio (%) of the same base to the total overlapping base sequence in (which may consider the introduction of a gap in one or both of the sequences).
  • sequence identity of the base sequence can be easily confirmed by those skilled in the art. For example, NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Basic Local Element Search Tool) can be used.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide according to the present embodiment is 95% or more and 100% or less the same as the base sequence complementary to the above-mentioned predetermined target region in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It is preferably having sex, more preferably 98% or more and 100% or less sequence identity, and even more preferably 100% sequence identity.
  • the "base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added” is, for example, deleted, substituted, inserted or added by deletion, substitution, insertion or addition. Examples thereof include a base sequence having 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more sequence identity with respect to the previous base sequence.
  • the above-mentioned deletions, substitutions, insertions or additions are independently present in 1 place, 2 places, 3 places, 4 places, or 5 places. It may be caused by a combination of a plurality.
  • the "stringent conditions" are 6 ⁇ SSC (composition of 1 ⁇ SSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS and 5 ⁇ . Conditions of incubating at room temperature for 12 hours in a solution containing Denhardt, 100 ⁇ g / mL denatured salmon sperm DNA and 50% (v / v) formamide, and further washing at 0.5 ⁇ SSC at a temperature of 50 ° C. or higher. To say. In addition, more stringent conditions, such as incubating at 45 ° C or 60 ° C for 12 hours, washing at 0.2 ⁇ SSC or 0.1 ⁇ SSC, 60 ° C or 65 ° C during washing. It also includes more severe conditions such as cleaning under the above temperature conditions.
  • the target region is the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 197 to 201, 240 to 249, 293 to 297, 331 to 331, counting from the 5'end. Located at 334, 413, 444 to 449, 466 to 472, 543 to 548, 733 to 756, 811 to 816, 910, 988 to 991, or 1077 It is preferable that the base sequence is composed of 10 to 25 mer or 10 to 23 mer which is continuous from the base. In one aspect of the present embodiment, the target region is the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 197 to 201, 240 to 249, 293 to 297, 331 to 331, counting from the 5'end.
  • the 3'wing region is preferably 2 to 5 mer, and the 5'wing region is preferably 2 to 5 mer.
  • the target region is the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 197 to 201, 241 to 248, 331 to 332, 444, counting from the 5'end. ⁇ 448, 543 to 548, 733 to 734, 744 to 745, 751 to 756, 812 to 816, or 10 to 25 mer consecutive from the base located at 989 to 991. It is preferably a base sequence composed of 10 to 23 mer or 12 to 20 mer.
  • the target region is the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, counting from the 5'end, 198 to 201, 241-248, 332, 444, and the like.
  • Nucleotide sequence composed of 10 to 25 mer, 10 to 23 mer, 15 to 20 mer, or 14 to 19 mer continuous from the base located at 543 to 547, 733, 745, 812 to 813, or 989. Is preferable.
  • the target region is located at 200, 244, 246, 546, or 812 counting from the 5'end in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. It is preferably a base sequence composed of 10 to 25 mer, 10 to 23 mer, 12 to 20 mer, 14 to 18 mer, or 15 to 17 mer continuous from the base.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide can bind to SCN1A NAT.
  • binding of the oligonucleotide of the present invention to SCN1A NAT includes the direct binding of the antisense oligonucleotide of the present invention to SCN1A NAT and the binding of SCN1A NAT to the ncRNA precursor.
  • One aspect of the antisense oligonucleotide of the present invention is a single-stranded oligonucleotide that promotes the expression of the potential-dependent sodium channel ⁇ 1 subunit gene and / or regulates its function, and is shown in Tables 1-1 to 1. It consists of any of the nucleotide sequences listed in -5, and can bind to the target region of human SCN1A NAT listed in Tables 1-1 to 1-5.
  • the target region is a region in human SCN1A NAT that is particularly related to inhibiting the function of human SCN1A NAT or promoting the expression of the human SCN1A gene and / or regulating the function.
  • the symbol “A'” is a, A, A (M), A (L), A (Y) described later. ), A (Gx), or A (S).
  • the symbol “C'” means c, C, C (M), 5 (L), 5 (Y), 5 (Gx), or 5 (S) described later.
  • the symbol “G'” means g, G, G (M), G (L), G (Y), G (Gx), or G (S) described later.
  • the symbol “T'” means t, T, U, U (M), T (m), T (L), T (Y), T (Gx), or T (S), which will be described later.
  • the nucleotide sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is SEQ ID NO: 6, 7, 9, 11, 44, 46, 54, 59, 74, 78, 79, 84, 85, 87. , 88, 93, 103-107, 109, 117-119, 121-123, 125-127, 135, 136, 138, 149, 153, 158, 165-168, 173, 176, 179-200, 202-205.
  • the nucleotide sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is SEQ ID NO: 6, 7, 11, 78, 79, 84, 87, 93, 105, 118, 121-123, 136, 138. , 149, 165 to 167, 176, 180 to 199, 202 to 205, 207, 210, 213, 217, 220, 221, 225, 233, 235 to 237, 240, 241, 257, 264, 266, 272, 273. It is more preferable that it is one base sequence selected from the group consisting of the base sequences of 275 to 286, 350, 360, 361 and 364.
  • the nucleotide sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is SEQ ID NO: 7, 123, 138, 165, 166, 167, 180-199, 203, 205, 207, 235, 236, 240. , 241, 257, 266, 272 and 275 to 286, more preferably one base sequence selected from the group.
  • One aspect of the antisense oligonucleotide of the present invention is a single-stranded oligonucleotide that promotes the expression of the potential-dependent sodium channel ⁇ 1 subunit gene and / or regulates its function, and is shown in Table 2. It consists of any of the nucleotide sequences and can bind to the target region of any of the SCN1A NATs listed in Table 2.
  • the target region is a region in mouse SCN1A NAT that is particularly related to inhibiting the function of SCN1A NAT or promoting the expression of the SCN1A gene and / or regulating the function.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide according to this embodiment may be in the form of a pharmacologically acceptable salt.
  • the "pharmacologically acceptable salt” is a salt of the antisense oligonucleotide of the present invention, which is a physiologically acceptable salt of the antisense oligonucleotide of the present invention, that is, the antisense oligonucleotide.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • the "pharmaceutically acceptable salt” means a salt that is pharmacologically acceptable as described above and is an acid addition salt or a base addition salt.
  • the acid addition salt include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, hydroiodide, nitrate and phosphate, and citrate, oxalate and phthalate.
  • organic acid salts such as acid salts and camphor sulfonates
  • the base addition salt include inorganic base salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, barium salt and aluminum salt, and trimethylamine, triethylamine, pyridine, picolin, 2,6-rutidine and ethanol.
  • Examples thereof include organic base salts such as amines, diethanolamines, triethanolamines, tromethamines [tris (hydroxymethyl) methylamines], tert-butylamines, cyclohexylamines, dicyclohexylamines and N, N-dibenzylethylamines.
  • organic base salts such as amines, diethanolamines, triethanolamines, tromethamines [tris (hydroxymethyl) methylamines], tert-butylamines, cyclohexylamines, dicyclohexylamines and N, N-dibenzylethylamines.
  • a salt (amino acid salt) with a basic amino acid such as arginine, lysine, ornithine, aspartic acid or glutamic acid or an acidic amino acid can be mentioned.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide according to the present embodiment has a gap region, a 3'wing region attached to the 3'end of the gap region, and a 5'attached to the 5'end of the gap region. Includes a wing region (see, eg, FIG. 1).
  • the single-stranded antisense oligonucleotide is preferably in the single-stranded form.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide may be hybridized with a second-stranded oligonucleotide described later to take a double-stranded form (double-stranded antisense oligonucleotide).
  • the base sequence of the second-stranded oligonucleotide is a base sequence having 90% or more and 100% or less sequence identity based on the base sequence complementary to the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide. Is preferable.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide is a so-called gapmer type antisense oligonucleotide.
  • Gapmer-type antisense oligonucleotides inhibit the function of target RNA by the following mechanism. First, the antisense oligonucleotide binds to the target region of the target RNA (from the upper part to the central part in FIG. 2). Next, the RNA-degrading enzyme RNaseH recognizes and binds to the complex of the antisense oligonucleotide and the target RNA (center of FIG. 2). Then, the target RNA is cleaved and degraded by an enzymatic degradation reaction with RNase H.
  • the antisense oligonucleotide is not affected by enzymatic degradation by RNase H (lower part of FIG. 2). Therefore, the antisense oligonucleotide can bind to another target RNA to cleave and degrade the RNA.
  • the gapmer-type antisense oligonucleotide functions as a catalyst in the above-mentioned enzymatic decomposition reaction by RNase H, and therefore, it is considered that a predetermined effect is continuously produced even with a small amount of administration.
  • the antisense oligonucleotide inhibits the function of SCN1A NAT by the mechanism as described above, so that it promotes the expression of the SCN1A gene suppressed by haploinsufficiency due to heterozygous mutation and / Alternatively, it can be suitably used for adjusting the function.
  • intrathecal administration which is a route of administration usually used in clinical application
  • the effect of promoting the expression of the SCN1A gene by the single-stranded antisense oligonucleotide and / or regulating the function is obtained.
  • promoting the expression of the SCN1A gene means promoting the transcription of the SCN1A gene.
  • “Regulating the function of the SCN1A gene” means regulating the function such as translation into a protein.
  • the functions of the SCN1A gene include protein folding, protein modification, intracellular transport, degradation, and the like.
  • the gap region is a nucleic acid having a sugar portion of 5 to 20 mer and having deoxyribose.
  • the gap region is composed of 5 to 20 mer of natural nucleotides having a deoxyribose sugar, non-natural nucleotides, or both of them.
  • the gap region has a sugar moiety of deoxyribose, which makes it possible to form a complex recognizable by RNase H together with SCN1A NAT, which is a target RNA.
  • the number of bases in the gap region is 5 to 20 mer, preferably 6 to 15 mer, more preferably 7 to 13 mer, and even more preferably 7 to 11 mer.
  • Examples of natural nucleotides having a sugar moiety of deoxyribose include deoxyadenosine monophosphate, deoxyguanosine monophosphate, thymidine monophosphate, and deoxycytidine monophosphate.
  • examples of the natural nucleotides constituting the gap region include those containing structural formulas corresponding to the symbols a, c, g and t described later.
  • Examples of the unnatural nucleotide whose sugar portion is deoxyribose include 2-thio-thymidine-phosphate, 2-aminoadenosine-phosphate, and 7-deazaguanosine-phosphate.
  • a part of the sugar portion may be an artificial sugar as long as the effect of the present invention is exhibited. That is, in one aspect of the present embodiment, the gap region may be a nucleic acid in which a part of the sugar part is deoxyribose and another part of the sugar part is an artificial sugar.
  • the 3'wing region is a modified nucleic acid of 1 to 5 mer.
  • the 3'wing region is composed of 1 to 5 mer of modified nucleotides.
  • the modified nucleic acid in the 3'wing region comprises at least one selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the 3'wing region may be a modified nucleic acid having a sugar portion of 1 to 5 mer, which is an artificial sugar.
  • modified nucleic acid in which the sugar portion is an artificial sugar include those listed above (sugar modification, artificial sugar).
  • the number of bases in the 3'wing region is 1 to 5 mer, preferably 2 to 5 mer, more preferably 2 to 4 mer, and even more preferably 3 to 4 mer.
  • the 5'wing region is a modified nucleic acid of 1 to 5 mer.
  • the 5'wing region is composed of 1 to 5 mer of modified nucleotides.
  • the modified nucleic acid in the 5'wing region comprises at least one selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the 5'wing region may be a modified nucleic acid having a sugar portion of 1 to 5 mer, which is an artificial sugar. Examples of the modified nucleic acid in which the sugar portion is an artificial sugar include those listed above (sugar modification, artificial sugar).
  • the number of bases in the 5'wing region is 1 to 5 mer, preferably 2 to 5 mer, and more preferably 2 to 4 mer.
  • the gap region is preferably 6 to 15 mer
  • the 3'wing region is preferably 2 to 4 mer
  • the 5'wing region is preferably 2 to 4 mer.
  • the gap region is 7 to 13 mer
  • the 3'wing region is 2 to 4 mer
  • the 5'wing region is 2 to 4 mer.
  • the gap region is 7 to 11 mer
  • the 3'wing region is 2 to 4 mer
  • the 5'wing region is 2 to 4 mer.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide may further comprise a native nucleotide attached to the 3'end of the 3'wing region.
  • the number of bases of the natural nucleotide bound to the 3'end of the 3'wing region may be one or several, or may be one.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is of the gapmer type.
  • the notation method of "XYZ” or “XYZW” may be used.
  • "X” indicates the number of bases in the 5'wing region
  • "Y” indicates the number of bases in the gap region
  • "Z” indicates the number of bases in the 3'wing region
  • "W” indicates the number of bases in the 3'wing region. The number of bases of the natural nucleoside bound to the 3'end of the 3'wing region is shown.
  • XYZ includes 2-8-4, 2-8-3, 2-8-5, 2-9-2, 2-9-3, 2-9-4, 2-9- 5, 2-10-3, 2-10-4, 2-10-5, 2-11-3, 2-11-4, 2-11-5, 2-12-3, 2-12-4, 2-12-5, 3-8-2, 3-8-3, 3-8-4, 3-8-5, 3-9-3, 3-9-4, 3-9-5, 3- 10-3, 3-10-4, 3-10-5, 3-11-3, 3-11-4, 3-11-5, 3-12-3, 3-12-4, 3-12- 5, 4-8-2, 4-8-3, 4-8-4, 4-8-5, 4-9-3, 4-9-4, 4-9-5, 4-10-3, 4-10-4, 4-10-5, 4-11-2, 4-11-3, 4-11-4, 4-11-5, 5-8-2, 5-8-3, 5- 8-4, 5-8-5, 5-9-2, 5-9-3, 5-9-4, 5-9-5, 5-10-2, 5-10-3, 5-10- 4, 5-10-5, 5-11-2, 5-11-3, 5-11-4, 5-11-5 and the
  • the notation "2-8-4" means that the 5'wing region is a 2 mer oligonucleotide, the gap region is an 8 mer oligonucleotide, and the 3'wing region is a 4 mer oligonucleotide. do.
  • the 5'wing region is a 2 mer oligonucleotide
  • the gap region is an 8 mer oligonucleotide
  • the 3'wing region is a 4 mer oligonucleotide, 3'.
  • the natural nucleoside that binds to the 3'end of the wing region means that it is 1 nucleotide.
  • the base length of the antisense oligonucleotide of the present invention is preferably 13 to 25 base lengths, more preferably 13 to 23 base lengths, still more preferably 14 to 20 base lengths, and even more preferably 14 to 14 to 20 base lengths. It has a length of 19 bases, and is particularly preferably 14 to 17 bases.
  • the base length of the antisense oligonucleotide of the present invention is 13 to 25 base length, 13 to 23 base length, 14 to 20 base length, 14 to 19 base length, and 14 to 17 base length, particularly to SCN1A NAT.
  • the binding of SCN1A NAT to the ncRNA precursor is strong, and the function of SCN1A NAT can be inhibited more effectively.
  • the base length of the antisense oligonucleotide shall be counted including the number of bases of the natural nucleoside.
  • each nucleotide is bound by a phosphate group and / or an artificial phosphate group, and is bound by a phosphodiester bond or a phosphorothioate bond. preferable.
  • One aspect of the antisense oligonucleotide of the present invention is a gapmer type having a gap region consisting of 6 to 15 bases, a 5'wing region consisting of 2 to 5 bases, and a 3'wing region consisting of 2 to 5 bases. It is an antisense oligonucleotide.
  • the gap region is positioned between the 5'wing region and the 3'wing region.
  • the 5'wing region and the 3'wing region each contain at least one AmNA, GuNA, or scpBNA.
  • the 5'wing region and the 3'wing region may contain 2'-O-alkylated or 2'-F-modified nucleotides, LNA, ENA, or S-cEt.
  • a 2'-O-alkylated nucleotide for example, 2'-O-methylated, 2'-O-methoxyethylated, etc.
  • a 2'-O-alkylated nucleotide of D-ribofuranose may be used. ..
  • the double-stranded antisense oligonucleotide according to the present embodiment includes the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide and A double-stranded antisense oligonucleotide containing a second-strand oligonucleotide that hybridizes to the single-stranded antisense oligonucleotide, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the base sequence of the second-stranded oligonucleotide is a base sequence having 90% or more and 100% or less sequence identity based on the base sequence complementary to the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide. Is preferable.
  • the double-stranded antisense oligonucleotide can be dissociated in a solution and separated into the single-stranded antisense oligonucleotide and the double-stranded oligonucleotide.
  • the separated single-stranded antisense oligonucleotide can bind to the target RNA described above.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide can also be grasped as a "first-stranded oligonucleotide" in relation to the second-stranded oligonucleotide.
  • the first-strand oligonucleotide has an antisense strand against the target RNA described above, but the first-strand oligonucleotide and the second strand
  • a double-stranded oligonucleotide composed of an oligonucleotide will be referred to as a "double-strand antisense oligonucleotide" for convenience.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention can be produced by solid-phase synthesis by the phosphoramidite method. For example, an oligonucleotide having a predetermined base sequence is first synthesized on a solid-phase carrier using a commercially available automatic nucleic acid synthesizer. Next, an oligonucleotide synthesized from a solid-phase carrier using a basic substance or the like is cut out and deprotected to obtain a crude oligonucleotide. Then, the obtained crude oligonucleotide is purified by HPLC or the like.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention can be produced by appropriately changing the base sequence, modification site, etc. of the nucleic acid according to a method known to those skilled in the art.
  • AmNA, GuNA, and scpBNA International Publication No. 2011/052436 (Patent Document 3), International Publication No. 2014/046212 (Patent Document 4), and International Publication No. 2015/125783 (Patent Document 5), respectively. ), It can be manufactured by the method described in.
  • the double-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is first determined by using the same production method as the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide, based on a base sequence complementary to the single-stranded antisense oligonucleotide. Oligonucleotides with sequence identity (second-strand oligonucleotides) are produced. Then, it can be produced by hybridizing the single-stranded antisense oligonucleotide and the second-stranded oligonucleotide.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide complex includes the single-stranded antisense oligonucleotide and an additional substance bound to the single-stranded antisense oligonucleotide.
  • the additional substance is selected from the group consisting of polyethylene glycol, peptides, alkyl chains, ligand compounds, antibodies, proteins, and sugar chains.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide complex is With the above single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, It has an additional substance bound to the single-stranded antisense oligonucleotide, and the additional substance is selected from the group consisting of polyethylene glycol, peptide, alkyl chain, ligand compound, antibody, protein, and sugar chain. ..
  • the double-stranded antisense oligonucleotide complex is With the above double-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, It has the single-stranded antisense oligonucleotide or an additional substance bound to the second-stranded oligonucleotide, and the additional substance is polyethylene glycol, a peptide, an alkyl chain (for example, a saturated aliphatic hydrocarbon or the like). , A ligand compound, an antibody, a protein, and a sugar chain (for example, carbohydrate, polysaccharide, etc.).
  • the “additional substance” means a substance that is bound to the single-stranded antisense oligonucleotide or the second-stranded oligonucleotide and is used to impart a predetermined action. ..
  • the adduct may be attached to the 5'end of the single-stranded antisense oligonucleotide, to the 3'end, or to both the 5'end and the 3'end. You may be.
  • the addition substance may be bound to the 5'end of the second-stranded oligonucleotide, may be bound to the 3'end, or may be bound to both the 5'end and the 3'end. May be.
  • the additive is preferably attached to either the 5'end or the 3'end of the single-stranded antisense oligonucleotide or the second-stranded oligonucleotide.
  • the additional substance may be directly and covalently bound to the single-stranded antisense oligonucleotide or the second-stranded oligonucleotide.
  • the additional substance may be bound to the single-stranded antisense oligonucleotide or the second-stranded oligonucleotide via a linker substance.
  • the linker substance include a linker composed of alkyl, polyethylene glycol, peptide, disulfide and / or a combination thereof.
  • Examples of the peptide used as the above-mentioned additional substance include the following. CPPs (Cell Penetrating Peptides: Cell-penetrating Peptides), TAT (Trans-Activator of Transscription protein), Polyarginine, Glucagon-like Peptides-1, Related Peptides, Synthetic Cyclic RGD Peptides
  • ligand compound used as the additional substance examples include the following. N-Acetylgalactosamine (GalNAc), sugars (glucose, mannose, etc.), lipids (cholesterol, etc.), vitamins (folic acid, vitamin A, vitamin E, etc.), amino acids
  • antibody used as the above-mentioned additional substance examples include the following. Anti-insulin receptor antibody, anti-transferrin receptor antibody, anti-LDL receptor-related protein antibody, anti-CD22 antibody, anti-CD30 antibody, anti-HER2 antibody
  • proteins used as the above-mentioned additional substances include the following. albumin
  • the agent for regulating the expression and / or function of the voltage-gated sodium channel ⁇ 1 subunit gene (hereinafter, may be referred to as “the expression and / or function regulator for the SCN1A gene”) is the anti-agent of the present invention.
  • Sense oligonucleotide or the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide complex is included as an active ingredient.
  • the expression and / or function regulator of the SCN1A gene comprises the double-stranded antisense oligonucleotide or the double-stranded antisense oligonucleotide complex as an active ingredient.
  • the expression and / or function regulator can also be understood as an expression promoter for the SCN1A gene.
  • the expression and / or function regulator can also be understood as a function regulator for the SCN1A gene.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention promotes the expression and / or regulates the function of the SCN1A gene by binding to SCN1A NAT and inhibiting the function of SCN1A NAT, and promotes protein translation from the SCN1A gene.
  • the administration method and preparation of the expression and / or function regulator of the SCN1A gene of the present invention can be used as long as it is an administration method and preparation known in the art.
  • composition containing single-stranded antisense oligonucleotide, etc. as an active ingredient contains the antisense oligonucleotide of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the single-stranded antisense oligonucleotide complex or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Included as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition is a double-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a double-stranded antisense oligonucleotide complex or a pharmaceutical composition thereof. Contains an acceptable salt as an active ingredient.
  • any administration method and preparation known in the art can be used.
  • the pharmaceutical composition is used for treating or preventing a disease related to the SCN1A gene, particularly a disease caused by suppression and / or functional regulation of the expression of the SCN1A gene.
  • the pharmaceutical composition can be used for the treatment or prevention of diseases that can be expected to improve symptoms by promoting the expression of the SCN1A gene or enhancing the expression of Nav1.1.
  • diseases include diseases caused by the disruption of the excitatory suppression balance of neural circuits, Drave syndrome, Lenox Gasteau syndrome, West syndrome, epilepsy stacking, other drug-resistant epilepsy, neurodevelopmental disorders, and nerves.
  • Various mental illnesses including degenerative diseases, schizophrenia, dementia, depression / anxiety symptoms, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, migraine, motor disorders, sleep disorders, eating disorders, autonomic neurological symptoms, pain, drug addiction Neurological disorders and the like can be mentioned.
  • the therapeutic agent for Drave syndrome according to the present embodiment is the single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the single-stranded antisense oligonucleotide complex or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Contains salt as an active ingredient.
  • the preventive agent for Drave syndrome according to the present embodiment is the single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the single-stranded antisense oligonucleotide complex or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Contains salt as an active ingredient.
  • the therapeutic agent for Drave syndrome is the double-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the double-stranded antisense oligonucleotide complex or its pharmaceutically acceptable salt.
  • the preventive agent for Drave syndrome according to the present embodiment is the double-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the double-stranded antisense oligonucleotide complex or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Contains salt as an active ingredient.
  • Dravet syndrome means drug-resistant epilepsy that develops in infancy under 1 year of age. Dravet syndrome is also referred to as severe infantile myoclonic epilepsy (SMEI). According to the Epilepsy Practice Guidelines 2018, for drug-resistant epilepsy, even if two antiepileptic drugs that are appropriate for the epilepsy are tried at a sufficient blood concentration within the range without side effects, for a certain period of time. Epilepsy is defined as epilepsy that cannot control seizures (one year or longer or at least three times the longest seizure interval before treatment, whichever is longer).
  • Dravet syndrome is mainly a systemic seizure during fever and develops in infancy, followed by frequent seizure types such as myochrony seizures, focal seizures, status epilepticus, and tonic-clonic seizures. Appears in. Patients with Dravet syndrome have a poor prognosis, and movement disorders, mental retardation, etc. are also observed. In addition, patients with Dravet syndrome have a much higher rate of sudden death (SUDEP) due to epilepsy attacks than patients with other epilepsy-related illnesses.
  • SUVP sudden death
  • the above-mentioned drug-resistant epilepsy is symptomatic partial epilepsy, temporal lobe epilepsy, etc. with intracranial lesions (for example, cerebrovascular disorder, cerebral dysplasia, tumor, hippocampal sclerosis, encephalitis / encephalopathy, systemic disease, etc.).
  • intracranial lesions for example, cerebrovascular disorder, cerebral dysplasia, tumor, hippocampal sclerosis, encephalitis / encephalopathy, systemic disease, etc.
  • Latent partial epilepsy symptomatic generalized epilepsy associated with degenerative / metabolic disorders such as dentate nucleus red nucleus paleosphere Louis body atrophy (DRPLA), chromosomal abnormalities such as Lenoxgasteau syndrome, West syndrome, 4p-syndrome, nodules
  • DPLA dentate nucleus red nucleus paleosphere Louis body atrophy
  • chromosomal abnormalities such as Lenoxgasteau syndrome, West syndrome, 4p-syndrome, nodules
  • neurodermatological syndrome such as sclerosis, epilepsy associated with cerebral degeneration / metabolic disease after hypoxic-ischemic encephalopathy, epilepsy related to autoimmune encephalitis, etc. More specifically, for example, it is described in the epilepsy clinical practice guideline 2018.
  • the above-mentioned individual means a mammal. Preferred are humans, monkeys, marmosets, dogs, pigs, rabbits, guinea pigs, rats and mice. More preferably, the individual is human.
  • the administration method and dosage form thereof are not particularly limited. That is, any administration method and preparation known in the art can be used as the administration method and preparation of the antisense oligonucleotide of the present invention.
  • the administration method include oral administration and parenteral administration.
  • Parenteral administration includes ophthalmic administration, intravaginal administration, rectal administration, intranasal administration, transdermal administration, intravenous injection, infusion, subcutaneous, intraperitoneal or intramuscular injection, lung administration by suction or inhalation, and intrathecal administration. Administration, intraventricular administration and the like can be mentioned.
  • the preparation of the antisense oligonucleotide of the present invention includes excipients, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, diluents, flavoring agents, fragrances, solubilizing agents, suspending agents, emulsifiers, etc.
  • Various pharmaceutical additives such as stabilizers, preservatives and tensioning agents can be mixed as needed.
  • a preparation such as a transdermal patch, an ointment, a lotion, a cream, a gel, a dropping agent, a suppository, a spray agent, a liquid agent, or a powder may be used. can.
  • the pharmaceutical composition of the antisense oligonucleotide of the present invention is orally administered, for example, a powder, a granule, a suspension or a solution dissolved in water or a non-aqueous medium, a capsule, a powder, a tablet or the like is used. be able to.
  • a preparation such as a sterile aqueous solution can be used.
  • the effective dose of the antisense oligonucleotide of the present invention can be arbitrarily determined depending on the sex, age, body weight, symptoms, etc. of the individual to be administered. Further, it can be arbitrarily determined according to the administration method, route, frequency and the like. For example, the dose may be 0.01 to 100 mg / kg. It is preferably 0.1 to 50 mg / kg, and more preferably 0.1 to 10 mg / kg.
  • the method for promoting the expression and / or regulating the function of the SCN1A gene in the present embodiment is the single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the single-stranded antisense oligonucleotide complex.
  • the step of administering the pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient to cells, tissues or individuals expressing the SCN1A gene is included.
  • the method of promoting expression and / or regulating the function of the SCN1A gene is the double-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the double-stranded antisense.
  • the step of administering the oligonucleotide complex or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient to cells, tissues or individuals expressing the SCN1A gene is included.
  • the method of administering the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or the like to cells, tissues or individuals may be performed in vitro or in vivo.
  • the above-mentioned administration route is used as the administration route.
  • examples of the "cell expressing the SCN1A gene” include nerve cells constituting the central nervous system, cells constituting the peripheral nervous system, and the like.
  • the method for treating or preventing a neuropsychiatric disorder in the present embodiment is the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide complex or its pharmaceutically acceptable salt.
  • the method of treating or preventing a neuropsychiatric disorder is the double-stranded antisense oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the double-stranded antisense oligonucleotide complex or
  • the step of administering the pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient to an individual suffering from the above-mentioned neuropsychiatric disorder is included.
  • Examples of the above-mentioned neuropsychiatric disorder include the above-mentioned neuropsychiatric disorder.
  • As the dosage form, administration route and dose for administration to an individual, the above-mentioned ones can be appropriately adopted.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide according to the present embodiment has been described above.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide having the above-mentioned constitution can promote the expression of the SCN1A gene and / or regulate the function by inhibiting the function of SCN1A NAT.
  • the inhibitory activity (knockdown activity) on the expression of SCN1A NAT can be measured by a known method.
  • a method for measuring the knockdown activity for example, Nature. Examples include the method described in 2015 Feb 19; 518 (7539): 409-12 (Non-Patent Document 6). It can also be measured by transfection of antisense oligonucleotides into SK-N-AS cells, which will be described later, or intracerebroventricular administration to SCN1A haploinsufficiency mice.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiment.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide includes the following embodiments.
  • One aspect of the antisense oligonucleotide of the present invention is a single-stranded oligonucleotide that promotes the expression of the potential-dependent sodium channel ⁇ 1 subunit gene and / or regulates the function, and is the single-stranded antisense oligonucleotide.
  • the nucleotide comprises a gap region, a 3'wing region attached to the 3'end of the gap region, and a 5'wing region attached to the 5'end of the gap region.
  • the base sequence of the above single-stranded antisense oligonucleotide is (A) A base having 90% or more and 100% or less sequence identity with a base sequence complementary to a target region composed of consecutive 10 to 25 mer in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2 or 3. arrangement, (B) In the above target region, a base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added, or (C) A base sequence that hybridizes to an oligonucleotide having the above target region under stringent conditions.
  • each nucleotide is bound with a phosphate group and / or an artificial phosphate group.
  • the gap region is a nucleic acid having a sugar portion of deoxyribose of 6 to 15 mer.
  • the 3'wing region is a modified nucleic acid of 2 to 5 mer.
  • the modified nucleic acid in the 3'wing region comprises at least one selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the 5'wing region is a modified nucleic acid of 2 to 5 mer.
  • the modified nucleic acid in the 5'wing region comprises at least one selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • Another aspect of the antisense oligonucleotide of the present invention is a single-stranded oligonucleotide that promotes the expression of the potential-dependent sodium channel ⁇ 1 subunit gene and / or regulates its function, and is the single-stranded oligonucleotide.
  • the sense oligonucleotide comprises a gap region, a 3'wing region attached to the 3'end of the gap region, and a 5'wing region attached to the 5'end of the gap region.
  • the base sequence of the above single-stranded antisense oligonucleotide is (A) A base having 90% or more and 100% or less sequence identity with a base sequence complementary to a target region composed of continuous 12 to 20 mer in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2 or 3. arrangement, (B) In the above target region, a base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added, or (C) A base sequence that hybridizes to an oligonucleotide having the above target region under stringent conditions.
  • each nucleotide is a phosphodiester bond, a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond, a phosphoamidate bond, a boranophosphate bond, a methylphosphonate bond, or a methoxypropylphosphonate bond.
  • the gap region is a nucleic acid having a sugar portion of deoxyribose of 6 to 15 mer.
  • the 3'wing region is a modified nucleic acid of 2 to 5 mer.
  • the modified nucleic acid in the 3'wing region comprises at least one selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the 5'wing region is a modified nucleic acid of 2 to 5 mer.
  • the modified nucleic acid in the 5'wing region comprises at least one selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is a single-stranded oligonucleotide that promotes the expression of the potential-dependent sodium channel ⁇ 1 subunit gene and / or regulates its function.
  • the strand antisense oligonucleotide comprises a gap region, a 3'wing region attached to the 3'end of the gap region, and a 5'wing region attached to the 5'end of the gap region.
  • the base sequence of the above single-stranded antisense oligonucleotide is (A) A base sequence having 90% or more and 100% or less sequence identity with a base sequence complementary to a target region composed of continuous 12 to 20 mer in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • each nucleotide is bound by a phosphodiester bond, a phosphorothioate bond, a phosphoamidart bond, or a boranophosphate bond.
  • the gap region is a nucleic acid having a sugar portion of deoxyribose of 6 to 15 mer.
  • the 3'wing region is a modified nucleic acid of 2 to 5 mer.
  • the modified nucleic acid in the 3'wing region comprises at least one selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the 5'wing region is a modified nucleic acid of 2 to 5 mer.
  • the modified nucleic acid in the 5'wing region comprises at least one selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is a single-stranded oligonucleotide that promotes the expression of the potential-dependent sodium channel ⁇ 1 subunit gene and / or regulates its function.
  • the strand antisense oligonucleotide comprises a gap region, a 3'wing region attached to the 3'end of the gap region, and a 5'wing region attached to the 5'end of the gap region.
  • the base sequence of the above single-stranded antisense oligonucleotide is (A) A base having 90% or more and 100% or less sequence identity with a base sequence complementary to a target region composed of continuous 13 to 20 mer in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2 or 3.
  • each nucleotide is bound by a phosphodiester bond, a phosphorothioate bond, a phosphoamidart bond, or a boranophosphate bond.
  • the gap region is a nucleic acid having a sugar portion of 6 to 13 mer and having deoxyribose.
  • the 3'wing region is a modified nucleic acid of 2 to 5 mer.
  • the modified nucleic acid in the 3'wing region comprises at least one selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the 5'wing region is a modified nucleic acid of 2 to 5 mer.
  • the modified nucleic acid in the 5'wing region comprises at least one selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is a single-stranded oligonucleotide that promotes the expression of the potential-dependent sodium channel ⁇ 1 subunit gene and / or regulates its function.
  • the strand antisense oligonucleotide comprises a gap region, a 3'wing region attached to the 3'end of the gap region, and a 5'wing region attached to the 5'end of the gap region.
  • the base sequence of the above single-stranded antisense oligonucleotide is (A) A base sequence having 90% or more and 100% or less sequence identity with a base sequence complementary to a target region composed of continuous 14 to 18 mer in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • each nucleotide is bound by a phosphodiester bond, a phosphorothioate bond, a phosphoamidart bond, or a boranophosphate bond.
  • the gap region is a nucleic acid having a sugar portion of 6 to 13 mer and having deoxyribose.
  • the 3'wing region is a modified nucleic acid of 2 to 5 mer.
  • the modified nucleic acid in the 3'wing region comprises at least two selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the 5'wing region is a modified nucleic acid of 2 to 5 mer.
  • the modified nucleic acid in the 5'wing region comprises at least two selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is a single-stranded oligonucleotide that promotes the expression of the potential-dependent sodium channel ⁇ 1 subunit gene and / or regulates its function.
  • the strand antisense oligonucleotide comprises a gap region, a 3'wing region attached to the 3'end of the gap region, and a 5'wing region attached to the 5'end of the gap region.
  • the base sequence of the above single-stranded antisense oligonucleotide is (A) A base sequence having sequence identity with a base sequence complementary to a target region composed of continuous 14 to 18 mer in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a base sequence having sequence identity.
  • each nucleotide is bound by a phosphodiester bond or a phosphorothioate bond.
  • the gap region is a nucleic acid having a sugar portion of 6 to 11 mer and having deoxyribose.
  • the 3'wing region is a modified nucleic acid of 2 to 4 mer.
  • the modified nucleic acid in the 3'wing region comprises at least two selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the 5'wing region is a modified nucleic acid of 2 to 4 mer.
  • the modified nucleic acid in the 5'wing region comprises at least two selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is a single-stranded oligonucleotide that promotes the expression of the potential-dependent sodium channel ⁇ 1 subunit gene and / or regulates its function.
  • the strand antisense oligonucleotide comprises a gap region, a 3'wing region attached to the 3'end of the gap region, and a 5'wing region attached to the 5'end of the gap region.
  • the base sequence of the above single-stranded antisense oligonucleotide is (A) A base sequence having sequence identity with a base sequence complementary to a target region composed of continuous 14 to 17 mer in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • each nucleotide is bound by a phosphodiester bond or a phosphorothioate bond.
  • the gap region is a nucleic acid having a sugar portion of 7 to 10 mer and having deoxyribose.
  • the 3'wing region is a modified nucleic acid of 2 to 4 mer.
  • the modified nucleic acid in the 3'wing region comprises at least two selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the 5'wing region is a modified nucleic acid of 2 to 4 mer.
  • the modified nucleic acid in the 5'wing region comprises at least two selected from the group consisting of AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • Single-stranded antisense oligonucleotides containing AmNA and scpBNA were synthesized on a 0.2 ⁇ mol or 1 ⁇ mol scale using an automatic nucleic acid synthesizer (nS-8 type, manufactured by GeneDesign, Inc.). Chain length extension was performed using a standard phosphoramidite protocol. At this time, CPG resin was used as the solid phase carrier.
  • DDTT ((Dimethylamino-methyleneidene) amino) -3H-1,2,4-dithiazazaline-3-thione) and the like were used for sulphurization for phosphorothioatetization (PS) skeleton formation.
  • single-stranded antisense oligonucleotides containing AmNA and scpBNA the hydroxyl group at the terminal 5'position is not protected by a DMTr (4,5'-dimethoxytrityl) group, and the 3'position is supported on the solid phase. I got it as a product. Subsequently, the single-stranded antisense oligonucleotide was excised from the solid-phase carrier by alkali treatment, and recovered in the form of a solution. Then, the solvent was distilled off from the recovered solution to obtain a crude product. The obtained crude product was purified by reverse phase HPLC to obtain a purified single-stranded antisense oligonucleotide. The purity and structure of each of the obtained antisense oligonucleotides were confirmed by LC-MS (manufactured by Waters).
  • Examples 272, 348 to 353, 357 to 362 in Table 3-11 were synthesized according to the above protocol by using phosphoramidite having a corresponding additional substance (for example, compound synthesis in FIGS. 3 to 6).
  • phosphoramidite having an additional substance Spacer-CE Phosphoramidite 9 and 6-Fluorescein-CE Phosphoramidite were used in Example 272, and in Examples 348 to 353, Cholesterol TEG Phosphoramidite, Phosphoramidite, Phosphoramidite, and Phosphoramidite were used.
  • Examples 357 to 362 5'-Tocopherol-CE Phosphoramidite was used.
  • Examples 357 to 362 were prepared by hybridizing a single-stranded antisense oligonucleotide synthesized by the same method as described above with a second-stranded antisense oligonucleotide having an additional substance.
  • Tables 3-1 to 3-12 and 4-1 to 4-3 below show single-stranded antisense oligonucleotides, single-stranded antisense oligonucleotide complexes and double-stranded antisense prepared by the methods described above.
  • List sense oligonucleotides The single-stranded antisense oligonucleotides and the like shown in Tables 3-1 to 3-12 are antisense oligonucleotides for human SCN1A NAT.
  • the single-stranded antisense oligonucleotides shown in Tables 4-1 to 4-3 are antisense oligonucleotides for mouse SCN1A NAT.
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • R 3 , R 4 , and R 5 independently represent a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 1 to 7 carbon atoms.
  • R 3 and R 5 in GuNA represented by the above-mentioned “Gx” are both hydrogen atoms and R 4 is a methyl group, it is indicated as “Gm”, and R 3 is a hydrogen atom and When both R 4 and R 5 are methyl groups, it is indicated as “Gdm”, and when R 3 and R 5 are hydrogen atoms and R 4 is a tert-butyl group, it is indicated as "GtB”.
  • ⁇ Evaluation of SCN1A gene expression The expression evaluation of the SCN1A gene was divided into an expression evaluation using a human neuroblast type and an expression evaluation using a mouse primary neuron, depending on the produced single-stranded antisense oligonucleotide and the like. Hereinafter, specific procedures for each expression evaluation will be described.
  • Human neuroblast type SK-N-AS (ATCC® CRL-2137 TM) was cultured in culture medium at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • As the culture medium for SK-N-AS cells those having the following composition were used.
  • DMEM Dulbecco-modified Eagle's medium
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • NEAA non-essential amino acid
  • SK-N-AS cells 500,000 cells / well
  • SK-N-AS cells 500,000 cells / well
  • each antisense oligonucleotide (final concentration 40 nM) diluted with phosphate buffered saline (PBS) was transfected into the above-mentioned cells using the lipofection method.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the negative control group cells transfected with PBS in which the antisense oligonucleotide was not lysed were used. Transfected cells were cultured in growth medium at 37 ° C. and 5% CO 2 for 48 hours.
  • cDNA complementary DNA obtained from this reverse transcription reaction
  • real-time PCR was performed using a pre-designed gene-specific probe (see below) with Taqman gene expression assets (manufactured by Applied Biosystems). (95 ° C; 3 seconds, 60 ° C; 30 seconds for 40 cycles).
  • Tables 6-1 to 6-5 show the expression ratio (expression increase rate) of the human SCN1A gene in each single-stranded antisense oligonucleotide or the like obtained by the above method.
  • the expression ratio of the human SCN1A gene determined in the negative control group was set to 1.
  • Those having an expression ratio of 1.1 or more were judged to be antisense oligonucleotides capable of promoting the expression of the human SCN1A gene.
  • the expression ratio of 1.1 or more is an antisense oligonucleotide capable of regulating the function of the human SCN1A gene.
  • the expression ratio (expression increase rate) of the human SCN1A gene in the single-stranded antisense oligonucleotides of Reference Examples 1 to 7 was determined by the same method. The results are shown in Table 7.
  • Mouse primary neurons were cultured in culture medium at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the culture medium for the primary mouse nerve cells the medium having the following composition was used.
  • mouse primary neurons derived from mouse fetal cerebrum
  • each cell 20,000 to 40,000 cells / well
  • cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 3 to 14 days were seeded on a 96-well plate with each cell (20,000 to 40,000 cells / well) and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 3 to 14 days.
  • each antisense oligonucleotide final concentration 1 ⁇ M
  • PBS phosphate buffered saline
  • As the negative control group cells in which PBS in which antisense oligonucleotide was not dissolved were added to the culture medium were used.
  • the cells were cultured in culture medium at 37 ° C. and 5% CO 2 for 48 hours.
  • Table 8 shows the expression ratio (expression increase rate) of the mouse SCN1A gene in each single-stranded antisense oligonucleotide obtained by the above method.
  • the expression ratio of the mouse SCN1A gene determined in the negative control group was set to 1.
  • Those having an expression ratio of 1.1 or more were judged to be antisense oligonucleotides capable of promoting the expression of the mouse SCN1A gene.
  • the expression ratio of 1.1 or more is an antisense oligonucleotide capable of regulating the function of the mouse SCN1A gene.
  • cDNA complementary DNA
  • real-time PCR using a pre-designed gene-specific probe (see below) with Taqman gene expression assemblies (manufactured by Applied Biosystems). Performed 95 ° C; 3 seconds, 60 ° C; 30 seconds for 40 cycles).
  • Table 9 shows the evaluation results (probe: Hs04404701_m1) of human SCN1A NAT expression suppression.
  • the expression rate of human SCN1A NAT determined in the negative control group was set to 1. Those having an expression rate of 0.8 or less were judged to be antisense oligonucleotides capable of reducing the expression of human SCN1A NAT.
  • Tm value was measured in phosphate buffer solution (final concentration: 10 mM phosphate buffer solution, 100 mM NaCl, 0.5 mM, respectively) so that each antisense oligonucleotide and complementary RNA were 1 ⁇ M (final concentration). It was diluted with EDTA) and warmed at 95 ° C. for 30 minutes. Then, after cooling at room temperature for 3 hours, the temperature was raised from 20 ° C. to 100 ° C. at 0.5 ° C./min, and the absorbances at wavelengths of 260 nm and 320 nm were measured at 0.5 ° C. intervals. A graph was created with the vertical axis representing the absorbance at 260 nm minus the absorbance at 320 nm and the horizontal axis representing the temperature, and the Tm value was calculated from the change in absorbance by the median method.
  • Tables 10-1 and 10-2 below show the evaluation results of the Tm value.
  • a human liver cancer-derived cell line (HepG2) or a human hepatocyte cell line (HepaRG) was cultured in a growth medium at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions.
  • As the growth medium a medium having the following composition was used.
  • Fetal Bovine Serum Cat # S1820, manufactured by biowest 1 mM sodium pyruvate solution: Gibco, Cat # 11360-070 100 ⁇ M non-essential amino acid (NEAA): Gibco, Cat # 11140-050 100 ⁇ g / mL penicillin-streptomycin [Nacalai Tesque Cat # 09376-34 (10000 units / ml of penicillin, 10000 ⁇ g / ml of streptomycin, containing stabilizer)] Minimum Essential Medium (manufactured by Life Technologies, Cat # 11095-080)
  • each cell (2.5 to 4.8 ⁇ 10 5 cells / well: 96 holes, 0.7 to 2.0 ⁇ 10 5 cells / well: 386 holes) was seeded on a 96-well plate or a 386-well plate. bottom.
  • the seeded cells were cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 , and then each oligonucleotide (final concentration) formed into a complex with Lipofectamine RNAiMAX (Cat # 13778030, manufactured by Thermo Fisher Scientific). : 3 to 100 nM) was added. Then, the cells were cultured in Opti-Minimium Essential Medium (Cat # 31985070, manufactured by Thermo Fisher Scientific) under the conditions of 37 ° C.
  • Table 11 shows the results of cytotoxicity evaluation of antisense oligonucleotides.
  • Table 12 shows the results of serum stability evaluation of antisense oligonucleotides. At this time, those having a residual rate of 50% or more after 72 hours were judged to be stable antisense oligonucleotides.
  • mice Male Crl: CD1 (ICR) mice aged 4 to 6 weeks are administered intracerebroventricularly with each antisense oligonucleotide diluted with phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • RNAlater solution (Cat # AM7021 manufactured by Thermo Fisher Scientific), and total RNA is extracted from the prefrontal cortex (brain tissue) using RNeasy Mini Kit (manufactured by QIAGEN). .. High-Capacity cDNA Reversion Transition Kit (Thermo Fisher Scientific, Cat # 4374966) and Taqman Reverse Transcript Reagents (Thermo Fisher Scientific) do.
  • cDNA complementary DNA
  • real-time PCR was performed using a pre-designed gene-specific probe (see below) with Taqman gene expression assets (manufactured by Applied Biosystems). (95 ° C; 3 seconds, 60 ° C; 30 seconds for 40 cycles).

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Abstract

電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現を促進する及び／又は機能調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３'末端に結合している３'ウイング領域と、上記ギャップ領域の５'末端に結合している５'ウイング領域と、を含み、　上記ギャップ領域は、５～２０ｍｅｒの、糖部がデオキシリボースである核酸であり、　上記３'ウイング領域及び上記５'ウイング領域のそれぞれは、１～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、　上記３'ウイング領域及び上記５'ウイング領域それぞれにおける上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。

Description

ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現及び／又は機能調節剤
　本発明は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進する及び／又はその機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに、これを含むＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現及び／又は機能の調節剤に関する。
　ＳＣＮ１Ａ遺伝子は、電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット（Ｎａｖ１．１）をコードする遺伝子である。上記ＳＣＮ１Ａ遺伝子は、中枢神経系及び末梢神経系で高く発現している。例えば、神経細胞に発現しているＮａｖ１．１は、細胞膜の脱分極により活性化し、細胞外から細胞内へナトリウムイオンを流入させる。細胞内へ流入したナトリウムイオンによって、上記神経細胞において活動電位が発生し、その結果、上記神経細胞が興奮する。特に、ＧＡＢＡ作動性（ｇａｍｍａ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ　ａｃｉｄ　作動性）の抑制性ニューロンにおける活動電位の発生に、Ｎａｖ１．１が主要な役割を担っていることが明らかにされている。このＮａｖ１．１の発現及び／又は機能が低下すると、神経回路の興奮抑制バランスが破綻し、てんかん、神経発達障害、神経変性疾患、統合失調症、認知症、うつ・不安症状、アルツハイマー病、パーキンソン病、片頭痛、運動障害、睡眠障害、摂食障害、自律神経症状、疼痛、薬物依存症等の種々の精神神経疾患の発症に関与すると考えられる（非特許文献１）。
　例えば、てんかん発症に関わる代表的な電位依存性ナトリウムチャネルのアルファサブユニットとしては、Ｎａｖ１．１、Ｎａｖ１．２、及びＮａｖ１．６が同定されている。これらのアルファサブユニットは、細胞内への一過性のナトリウムイオン流入又は持続的なナトリウムイオン流入により、活動電位の発生及びその頻度に影響を与える。このことからナトリウムチャネル阻害剤（例えば、カルバマゼピン、フェニトイン、ラモトリジン、ラコサミド、トピラメート、ゾニサミド、バルプロ酸等）は、ナトリウムチャネルの機能を抑制することにより、抗てんかん作用を発揮する（非特許文献２）。
　ＳＣＮ１Ａ遺伝子は、ドラベ症候群の責任遺伝子として同定されている。ＳＣＮ１Ａ遺伝子のヘテロ接合体突然変異によるハプロ不全が、ドラベ症候群の発症に関与すると考えられている。ドラベ症候群では、ナトリウムチャネル阻害剤の投与により、むしろてんかん症状を悪化させる。そのため、既存の抗てんかん薬の投与が有効な治療方法とはいえず、新たな治療方法が求められている（非特許文献３）。
　近年、ノンコ―ディングＲＮＡの一つである天然型アンチセンス転写物（ｎａｔｕｒａｌ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ：ＮＡＴ）が、標的となる遺伝子に結合することによって、標的となる当該遺伝子の発現及び活性化、又は標的となる当該遺伝子からタンパク質への翻訳を制御することが明らかにされている。このような知見に基づいて、標的となる当該遺伝子の発現を促進する又は機能を制御するため、制御に関わるＮＡＴに対する核酸医薬を治療に用いる試みがなされている。
　例えば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子を標的とするＮＡＴ（ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴ）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進することが報告されている（特許文献１、特許文献２、及び非特許文献４）。
　非特許文献４に開示されているＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）又は２’，４’－ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ、以下「ＬＮＡ」と称することがある。）で修飾されたヌクレオシドである。
国際公開第２０１１／１６３４９９号 国際公開第２０１２／０６８３４０号 国際公開第２０１１／０５２４３６号 国際公開第２０１４／０４６２１２号 国際公開第２０１５／１２５７８３号
Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｓｃｉ．（２０１４）３５（３）：１１３－１１８． ＣＮＳ　Ｄｒｕｇｓ．（２０１７）３１（７）：５２７－５３４． Ｐｅｄｉａｔｒ　Ｎｅｕｒｏｌ．（２０１７）６８：１８－３４．ｅ３． ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ．（２０１６）９：２５７－２７７ ｗ．ＢｒａｄＷａｎ　ｅｔ．Ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１６，５９．９６４５－９６６７． Ｎａｔｕｒｅ．　２０１５　Ｆｅｂ　１９；５１８（７５３９）：４０９－１２
　上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現をアップレギュレートするが、有効性、安全性、安定性等の点でさらなる改善が求められている。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに、これを含むＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現及び／又は機能の調節剤を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を進めた結果、ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴに結合し、該ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの発現及び／又は機能を触媒的に抑制することで、ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴが標的とするＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩（以下、「本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド」と称することがある。）を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。
　［１］本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１９１番～２０１番、２３９番～２５１番、２９１番～２９７番、３３１番～３３５番、３６５番～３８４番、４０４番～４１４番、４４３番～４５０番、４６５番～４７２番、５０６番、５４３番～５５０番、５７９番、７３２番～７５７番、８０４番～８１６番、９０９番～９１１番、９８８番～９９１番、若しくは１０７７番～１０９６番に位置する塩基から連続した１０～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
　　上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、であり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び／又は人工リン酸基で結合されており、
　上記ギャップ領域は、５～２０ｍｅｒの、糖部がデオキシリボースである核酸であり、
　上記３’ウイング領域は、１～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記３’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、
　上記５’ウイング領域は、１～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記５’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖部分がデオキシリボースである核酸をギャップ領域に有するオリゴヌクレオチドをベースとして、上述の所定の修飾核酸が５’ウイング領域及び３’ウイング領域に配置されている。当該修飾核酸は、架橋型修飾核酸として、ＡｍＮＡ（アミド架橋型人工核酸、Ａｍｉｄｏ－ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）、ＧｕＮＡ(グアニジン架橋型人工核酸、Ｇｕａｎｉｄｉｎｏ－ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）、又はｓｃｐＢＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｓｐｉｒｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）の中から少なくとも１つを含む。そのため、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴに対して高い結合親和性が期待できる。
　また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、いわゆるギャップマー型であるため、後述するＲＮＡ分解酵素によるＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの分解反応において触媒として機能する。そのため、少量の投与であっても持続的に所定の効果が奏されると考えられる。
　［２］上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１９７番～２０１番、２４０番～２４９番、２９３番～２９７番、３３１番～３３４番、４１３番、４４４番～４４９番、４６６番～４７２番、５４３番～５４８番、７３３番～７５６番、８１１番～８１６番、９１０番、９８８番～９９１番、又は１０７７番に位置する塩基から連続した１０～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であり、
　上記３’ウイング領域は、２～５ｍｅｒであり、
　上記５’ウイング領域は、２～５ｍｅｒであることが好ましい。
　［３］上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホアミダート結合、又はボラノホスフェート結合で結合されており、
　上記ギャップ領域は、６～１５ｍｅｒであり、
　上記３’ウイング領域は、２～４ｍｅｒであり、
　上記５’ウイング領域は、２～４ｍｅｒであることが好ましい。
　［４］上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがホスホジエステル結合又はホスホロチオアート結合で結合されていることが好ましい。
　［５］上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１９７番～２０１番、２４１番～２４８番、３３１番～３３２番、４４４番～４４８番、５４３番～５４８番、７３３番～７３４番、７４４番～７４５番、７５１番～７５６番、８１２番～８１６番、又は９８９番～９９１番に位置する塩基から連続した１２～２０ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
　［６］上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１９７番～２０１番、２４１番～２４８番、３３１番～３３２番、４４４番～４４８番、５４３番～５４８番、７３３番～７３４番、７４４番～７４５番、７５１番～７５６番、８１２番～８１６番、又は９８９番～９９１番に位置する塩基から連続した１２～２０ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列であることが好ましい。
　［７］上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１９８番～２０１番、２４１番～２４８番、３３２番、４４４番、５４３番～５４７番、７３３番、７４５番、８１２番～８１３番、又は９８９番に位置する塩基から連続した１４～２０ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
　［８］上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１９８番～２０１番、２４１番～２４８番、３３２番、４４４番、５４３番～５４７番、７３３番、７４５番、８１２番～８１３番、又は９８９番に位置する塩基から連続した１４～２０ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列であることが好ましい。
　［９］上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号６、７、９、１１、４４、４６、５４、５９、７４、７８、７９、８４、８５、８７、８８、９３、１０３～１０７、１０９、１１７～１１９、１２１～１２３、１２５～１２７、１３５、１３６、１３８、１４９、１５３、１５８、１６５～１６８、１７３、１７６、１７９～２００、２０２～２０５、２０７、２０９～２１３、２１７、２２０、２２１、２２５、２２７、２３３～２３７、２４０、２４１、２５７、２６３～２６６、２７２、２７３、２７５～２８６、３５０、３６０、３６１及び３６３～３６５の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列であることが好ましい。
　［１０］本発明に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩と、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を含む、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩であって、
　上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれる。
　［１１］本発明に係る医薬は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
　［１２］本発明に係る電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現及び／又は機能の調節剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
　［１３］本発明に係るドラベ症候群に対する治療剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
　［１４］本発明に係るドラベ症候群に対する予防剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
　［１５］本発明に係るＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する方法は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として、上記ＳＣＮ１Ａ遺伝子を発現している細胞、組織又は個体に投与する工程を含む。
　［１６］本発明に係る精神神経疾患の治療方法又は予防方法は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として、上記精神神経疾患に罹患している個体に投与する工程を含む。上記精神神経疾患は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現及び／又は機能の低下に関連した疾患であり、例えば、ドラベ症候群、レノックスガストー症候群、ウエスト症候群、てんかん重積、その他薬剤抵抗性てんかん、神経発達障害、神経変性疾患、統合失調症、認知症、うつ・不安症状、アルツハイマー病、パーキンソン病、片頭痛、運動障害、睡眠障害、摂食障害、自律神経症状、疼痛、薬物依存症等が挙げられる。
　［１７］本発明は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を個体に投与することを含む、ドラベ症候群の治療方法を提供する。
　［１８］本発明は、ドラベ症候群の治療に使用するための、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を提供する。
　［１９］本発明は、ドラベ症候群の治療剤を製造するために使用する、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を提供する。
　本発明によれば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに、これを含むＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現及び／又は機能の調節剤を提供することが可能になる。
図１は、本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの構成の一例を示す模式図である。 図２は、本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたときの、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現が向上するメカニズムを説明する模式図である。 図３は、実施例２７２で用いた一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの化学構造を示す模式図である。 図４は、実施例３４８で用いた一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの化学構造を示す模式図である。 図５は、実施例３５１で用いた一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの化学構造を示す模式図である。 図６は、実施例３５７で用いた第二鎖オリゴヌクレオチドの化学構造を示す模式図である。
　以下、本発明の一実施形態（以下「本実施形態」と記すことがある。）について説明する。ただし、本実施形態はこれに限定されるものではない。本明細書において「Ｉ～Ｊ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＩ以上Ｊ以下）を意味する。Ｉにおいて単位の記載がなく、Ｊにおいてのみ単位が記載されている場合、Ｉの単位とＪの単位とは同じである。
　≪ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド≫
　本実施形態のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１９１番～２０１番、２３９番～２５１番、２９１番～２９７番、３３１番～３３５番、３６５番～３８４番、４０４番～４１４番、４４３番～４５０番、４６５番～４７２番、５０６番、５４３番～５５０番、５７９番、７３２番～７５７番、８０４番～８１６番、９０９番～９１１番、９８８番～９９１番、若しくは１０７７番～１０９６番に位置する塩基から連続した１０～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、
又は、
　　上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、であり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び／又は人工リン酸基で結合されており、
　上記ギャップ領域は、５～２０ｍｅｒの、糖部がデオキシリボースである核酸であり、
　上記３’ウイング領域は、１～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記３’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、
　上記５’ウイング領域は、１～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記５’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。以下詳細に説明する。
　＜用語の定義等＞
　まず、本明細書において用いられる用語の定義等について以下に説明する。
　（電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子）
　本実施形態において「電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子」（以下、「ＳＣＮ１Ａ遺伝子」と呼ぶ場合がある。）は、Ｇｏｌｄｗｉｎ　ｅｔ．ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ　（２０００）；２８（２）３６５－３６８の命名法により定義することができる。ＳＣＮ１Ａの同義語としては、ナトリウムチャネル、電位依存性、Ｉ型、αサブユニット；ＮＡＣ１；Ｎａｖ１．１；ＳＣＮ１；ＥＩＥＥ－６　（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，　ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ，　ｅａｒｌｙ　ｉｎｆａｎｔｉｌｅ，　ｔｙｐｅ　６　（ＥＩＥＥ－６，　Ｄｒａｖｅｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ））；ＦＨＭ－３（ｍｉｇｒａｉｎｅ，　ｈｅｍｉｐｌｅｇｉｃ，　ｆａｍｉｌｉａｌ，　ｔｙｐｅ　３）；ＧＥＦＳＰ－２（ｅｐｉｌｅｐｓｙ，　ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ，　ｗｉｔｈ　ｆｅｂｒｉｌｅ　ｓｅｉｚｕｒｅｓ　ｐｌｕｓ，　ｔｙｐｅ　２）；ＨＢＳＣＩ；ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ，　ｂｒａｉｎ　Ｉ　ａｌｐｈａ　ｓｕｂｕｎｉｔ；ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ，　ｖｏｌｔａｇｅ　ｇａｔｅｄ，　ｔｙｐｅ　Ｉ　ａｌｐｈａ　ｓｕｂｕｎｉｔ；ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ，　ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ，　ｔｙｐｅ　Ｉ，　ａｌｐｈａ；ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ，　ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ，　ｔｙｐｅ　Ｉ，　ａｌｐｈａ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；及びｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ，　ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ，　ｔｙｐｅ　Ｉ，　ａｌｐｈａ　ｓｕｂｕｎｉｔ等が挙げられる。
　（一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）
　本実施形態において「一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（以下、「ＡＳＯ」と称することがある。）とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡ(ノンコ－ディングＲＮＡ)（以下、「標的ＲＮＡ」と称することがある。）に対して相補的なオリゴヌクレオチド又はその薬理学上許容される塩を意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はそれらの類似体から構成される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的とするｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡと二本鎖を形成することにより、標的とするｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はｎｃＲＮＡの働きを抑制する。このアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、標的となるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡの塩基配列に対して、完全に相補的な塩基配列を有するもの、当該相補的な塩基配列において１個又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有するもの、及び１個又は数個のゆらぎ塩基対を形成する塩基をその塩基配列中に含むもの等が挙げられる。
　また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、後述する「糖部が人工糖である修飾核酸」（糖修飾されている修飾ヌクレオチド）以外の、当該分野で公知の修飾ヌクレオチドを更に含んでいてもよい。当該分野で公知の修飾ヌクレオチドとしては、糖修飾されている修飾ヌクレオチドに加えて、例えば、後述するリン酸基修飾されている修飾ヌクレオチド、核酸塩基修飾されている修飾ヌクレオチド等が挙げられる。
　なお、本実施形態における一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その両末端の構造は特に制限されず、例えば、－ＯＨであってもよいし、－ＯＲ（ただし、Ｒはアルキル鎖、リン酸エステル体、又は後述する付加物質を示す。）であってもよい。
　（オリゴヌクレオチド）
　本実施形態において「オリゴヌクレオチド」とは、同一又は異なるヌクレオチドが、リン酸ジエステル結合又はその他の結合で２～３０個連結されたヌクレオチドのポリマーを意味する。上記オリゴヌクレオチドは、以下の構造式で示すように核酸塩基部、リン酸部、及び糖部から構成されていると把握することもできる。
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　上記オリゴヌクレオチドは、天然型のオリゴヌクレオチドと非天然型のオリゴヌクレオチドとに大別される。「天然のオリゴヌクレオチド」とは天然に存在しているヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを意味する。「非天然のオリゴヌクレオチド」とは、後述する修飾ヌクレオチドを構成単位として少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドを意味する。「非天然型のオリゴヌクレオチド」としては、好ましくは、糖部が修飾された人工糖誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で１つ置き換えられたホスホロチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で２つ置き換えられたホスホロジチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合がトリエステル化されたエステル誘導体；リン酸ジエステル結合がアミド化されたホスホアミド誘導体；リン酸ジエステル結合がボロン酸エステル化されたボラノホスフェート誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子がアルキル基に置換されたアルキルホスホネート（例えば、メチルホスホネート、メトキシプロピルホスホネート等）誘導体が挙げられる。更に好ましくは、上記非天然のオリゴヌクレオチドは、糖部が修飾された架橋型人工糖誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で１つ置き換えられたホスホロチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合がエステル化されたエステル誘導体；及び、糖部が後述する人工糖（例えば、架橋型糖）で修飾され、かつリン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で１つ置き換えられているか、又はリン酸ジエステル結合がトリエステル化されている誘導体等が挙げられる。
　（ヌクレオシド）
　本実施形態において「ヌクレオシド」とは、プリン塩基又はピリミジン塩基と糖とが結合した化合物を意味する。天然に存在しているヌクレオシドを「天然ヌクレオシド」という場合がある。天然に存在していない修飾されたヌクレオシドを「修飾ヌクレオシド」という場合がある。特に糖部分が修飾された修飾ヌクレオシドを「人工糖修飾ヌクレオシド」という場合がある。
　（ヌクレオチド）
　本実施形態において「ヌクレオチド」とは、上記ヌクレオシドの糖にリン酸基が結合した化合物を意味する。天然に存在しているヌクレオチドを「天然ヌクレオチド」という場合がある。天然に存在していない修飾されたヌクレオチドを「修飾ヌクレオチド」という場合がある。「修飾ヌクレオチド」としては、上記修飾ヌクレオシドの糖部にリン酸基が結合した化合物、及び、天然ヌクレオシドの糖部に後述する人工リン酸基が結合した化合物等が挙げられる。
　（糖修飾、人工糖）
　本実施形態において「糖修飾」とは、上記ヌクレオチドの糖部が修飾されていることを意味する。修飾された糖部を特に「人工糖」という場合がある。糖修飾が施されている修飾ヌクレオチドとしては、例えば、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、ｓｃｐＢＮＡ、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｆ、５’－メチル－ＤＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、Ｓ－ｃＥｔ（２’，４’－ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ　Ｅｔｈｙｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
　ＡｍＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｙ）」、「５（Ｙ）」、「Ｇ（Ｙ）」、「Ｔ（Ｙ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ＧｕＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｇｘ）」、「５（Ｇｘ）」、「Ｇ（Ｇｘ）」、「Ｔ（Ｇｘ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ｓｃｐＢＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｓ）」、「５（Ｓ）」、「Ｇ（Ｓ）」、「Ｔ（Ｓ）」で示される構造を含むものが挙げられる。
　（糖修飾以外の当該分野で公知のヌクレオチドの修飾）
　上記糖修飾以外の当該分野で公知のヌクレオチドの修飾は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するために利用可能である。ヌクレオチドの修飾としては、後述するリン酸基修飾、核酸塩基修飾が知られている。このようなヌクレオチドの修飾は、例えば、ｗ．ＢｒａｄＷａｎ　ｅｔ．Ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１６，５９．９６４５－９６６７．（非特許文献５）等に記載されているヌクレオチドの修飾が挙げられる。これらのヌクレオチドの修飾は、上記文献で引用されている文献において述べられている当該分野で公知の方法に基づいて行うことができる。
　（リン酸基）
　本実施形態において「リン酸基」とは、上記ヌクレオチドのリン酸部の結合様式が天然に存在するホスホジエステル結合（後述する記号「－」で示される結合）であるものを意味する。
　（リン酸基修飾、人工リン酸基）
　本実施形態において「リン酸基修飾」とは、上記ヌクレオチドのリン酸部が修飾されていることを意味する。修飾されたリン酸部を特に「人工リン酸基」という場合がある。上記人工リン酸基を含む結合様式としては、例えば、ホスホロチオアート結合（後述する記号「∧」で示される結合）、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合（後述する記号「＝」で示される結合）、又はボラノホスフェート結合（後述する記号「×」で示される結合）、アルキルホスホネート等が挙げられる。
　（核酸塩基修飾、人工核酸塩基）
　本実施形態において「核酸塩基修飾」とは、上記ヌクレオチドの核酸塩基部が修飾されていることを意味する。修飾された核酸塩基部を特に「人工核酸塩基」という場合がある。人工核酸塩基としては、例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－プロピニルシトシン等が挙げられる。
　（ＤＮＡ又はＲＮＡの類似体）
　上記ＤＮＡ又はＲＮＡの類似体とは、ＤＮＡ又はＲＮＡに類似の構造を持つ分子を意味する。例えば、ペプチド核酸(ｐＮＡ)、モルホリノ核酸等が挙げられる。
　（ｎｃＲＮＡ）
　本実施形態において「ｎｃＲＮＡ」とは、タンパク質の翻訳には関わらないＲＮＡの総称を意味する。上記ｎｃＲＮＡとしては、例えば、リボソ－ムＲＮＡ、転移ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＮＡＴ等が挙げられる。
　（オリゴヌクレオチドの核酸塩基部）
　上記オリゴヌクレオチドの核酸塩基部としては、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、５－メチルシトシニル基、ウラシリル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、６－アミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基、４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、及び２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基等が挙げられる。好ましくは、上記核酸塩基部としては、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、５－メチルシトシニル基、及びウラシリル基等が挙げられる。当該核酸塩基のうち、ウラシル（Ｕ）とチミン（Ｔ）は、互換性がある。ウラシル（Ｕ）とチミン（Ｔ）のどちらも、相補鎖のアデニン（Ａ）との塩基対を形成することができる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基部においても同様である。
　（標的ＲＮＡ）
　本実施形態において「標的ＲＮＡ」とは、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが結合することによって、その機能が抑制されるＲＮＡを意味する。言い換えると本実施形態において標的ＲＮＡとはＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴを意味する。上記標的ＲＮＡとしては、例えば、配列番号１で表されるヒトＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴ（以下、「ｈＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴ」と称することがある。）、配列番号２で表されるサルＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴ、配列番号３で表されるマウスＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴ（以下、「ｍＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴ」と称することがある。）等が挙げられる。
　（標的ＲＮＡとの結合）
　本実施形態において「標的ＲＮＡとの結合」とは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基が、標的ＲＮＡとの相補性によって、当該標的ＲＮＡの核酸塩基と共に二本鎖核酸を形成することを意味する。上記二本鎖核酸は、上記標的ＲＮＡの少なくとも１部において形成されていればよい。なお、上記標的ＲＮＡとの結合の強さは、例えば、熱安定性の指標により測定することができる。上記熱安定性の指標としては、例えば、上記二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ値）等が挙げられる。上記Ｔｍ値としては、好ましくは４０～９０°Ｃであり、より好ましくは５０～７０°Ｃである。
　（標的領域）
　上記標的領域とは、ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴにおける、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと結合する領域を意味する。上記標的領域には、示された塩基配列からなる標的領域、及びＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴのｎｃＲＮＡ前駆体上の領域を含む。
　（標的領域との結合）
　上記標的領域との結合とは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが標的領域と二本鎖を形成することを意味する。ただし、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、必ずしも標的領域全体と二本鎖を形成する必要はなく、標的領域の一部の領域と二本鎖形成するものであればよい。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的領域と完全な相補性を有しているものであることが好ましいが、ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴと結合する限りにおいて、標的領域の少なくとも一部の領域と相補的であればよい。
　（標的領域の一部）
　上記標的領域の一部とは、標的領域のうち１０～１５ヌクレオチド塩基長の領域を意味する。
　（標的領域の少なくとも一部と相補的）
　上記標的領域の少なくとも一部と相補的とは、ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴ上の標的領域の少なくとも一部の領域の塩基と相補的であることを意味する。ここにおいて、少なくとも一部の領域に対応するｎｃＲＮＡ又はｎｃＲＮＡ前駆体上の領域の塩基と相補的であることも含む。
　＜一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列＞
　本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１９１番～２０１番、２３９番～２５１番、２９１番～２９７番、３３１番～３３５番、３６５番～３８４番、４０４番～４１４番、４４３番～４５０番、４６５番～４７２番、５０６番、５４３番～５５０番、５７９番、７３２番～７５７番、８０４番～８１６番、９０９番～９１１番、９８８番～９９１番、若しくは１０７７番～１０９６番に位置する塩基から連続した１０～２５ｍｅｒ（好ましくは１０～２３ｍｅｒ）で構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　（Ｂ）上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
　（Ｃ）上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である。また、本実施形態において、配列表に示されている各塩基配列は核酸塩基部の配列情報のみを示すために用いるものとする。上記核酸塩基部に加えて糖部及びリン酸部を含めたオリゴヌクレオチドの構造情報は、後述する表３－１～表３－１２及び表４－１～表４－３に示される記載形式で示すものとする。
　本実施形態において「配列同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つの塩基配列をアラインさせた場合の最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方又は両方へのギャップの導入を考慮し得るものである。）における、オーバーラップする全塩基配列に対する同一塩基の割合（％）を意味する。塩基配列の「配列同一性」は、当業者であれば容易に確認することができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用いることができる。
　本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列における上述の所定の標的領域に対して相補的な塩基配列と９５％以上１００％以下の配列同一性を有することが好ましく、９８％以上１００％以下の配列同一性を有することがより好ましく、１００％の配列同一性を有することが更に好ましい。
　本実施形態において、「１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列」としては、例えば、欠失、置換、挿入又は付加によって、欠失、置換、挿入又は付加される前の塩基配列に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を挙げることができる。「１又は数個の塩基」の具体的な数としては、上述の欠失、置換、挿入又は付加が、それぞれ独立して、１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、又は５カ所に存在してもよいし、複数が組み合わさっておこっていてもよい。
　本実施形態において「ストリンジェントな条件」とは、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡと５０％(ｖ／ｖ)ホルムアミドとを含む溶液中、室温にて１２時間インキュベートし、更に０．５×ＳＳＣで５０°Ｃ以上の温度で洗浄する条件をいう。更に、よりストリンジェントな条件、例えば、４５°Ｃ又は６０°Ｃにて１２時間インキュベートすること、０．２×ＳＳＣ又は０．１×ＳＳＣで洗浄すること、洗浄に際し６０°Ｃ又は６５°Ｃ以上の温度条件で洗浄すること等の、より厳しい条件も含む。
　本実施形態の一側面において、上記標的領域は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１９７番～２０１番、２４０番～２４９番、２９３番～２９７番、３３１番～３３４番、４１３番、４４４番～４４９番、４６６番～４７２番、５４３番～５４８番、７３３番～７５６番、８１１番～８１６番、９１０番、９８８番～９９１番、又は１０７７番に位置する塩基から連続した１０～２５ｍｅｒ又は１０～２３ｍｅｒで構成された塩基配列であることが好ましい。
　本実施形態の一側面において、上記標的領域は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１９７番～２０１番、２４０番～２４９番、２９３番～２９７番、３３１番～３３４番、４１３番、４４４番～４４９番、４６６番～４７２番、５４３番～５４８番、７３３番～７５６番、８１１番～８１６番、９１０番、９８８番～９９１番、又は１０７７番に位置する塩基から連続した１０～２５ｍｅｒ又は１０～２３ｍｅｒで構成された塩基配列であり、上記３’ウイング領域は、２～５ｍｅｒであり、上記５’ウイング領域は、２～５ｍｅｒであることが好ましい。
　本実施形態の他の側面において、上記標的領域は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１９７番～２０１番、２４１番～２４８番、３３１番～３３２番、４４４番～４４８番、５４３番～５４８番、７３３番～７３４番、７４４番～７４５番、７５１番～７５６番、８１２番～８１６番、又は９８９番～９９１番に位置する塩基から連続した１０～２５ｍｅｒ、１０～２３ｍｅｒ又は１２～２０ｍｅｒで構成された塩基配列であることが好ましい。
　本実施形態の別の他の側面において、上記標的領域は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１９８番～２０１番、２４１番～２４８番、３３２番、４４４番、５４３番～５４７番、７３３番、７４５番、８１２番～８１３番、又は９８９番に位置する塩基から連続した１０～２５ｍｅｒ、１０～２３ｍｅｒ、１５～２０ｍｅｒ、又は１４～１９ｍｅｒで構成された塩基配列であることが好ましい。
　本実施形態の別の他の側面において、上記標的領域は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて２００番、２４４番、２４６番、５４６番、又は８１２番に位置する塩基から連続した１０～２５ｍｅｒ、１０～２３ｍｅｒ、１２～２０ｍｅｒ、１４～１８ｍｅｒ、又は１５～１７ｍｅｒで構成された塩基配列であることが好ましい。
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴと結合することができる。本明細書において、本発明のオリゴヌクレオチドの「ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴとの結合」とは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴへの直接結合及びＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴのｎｃＲＮＡ前駆体への結合を包含する。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの一態様としては、電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、表１－１～表１－５に記載されているいずれかの塩基配列からなり、表１－１～表１－５に記載されているヒトＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの標的領域と結合することができる。上記標的領域は、ヒトＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴにおいて、特に、ヒトＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの機能を阻害する又はヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節に関連する領域である。例えば、表１－１において５’末端位置が「１９１」であり３’末端位置が「２０５」である場合、ヒトＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの塩基配列（配列番号１の塩基配列）における１９１番目から２０５番目までの塩基配列が、対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列名「１９１－１５」）が標的とする標的領域となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　上記表１－１～表１－５及び後述する表２－１～表２－４において、記号「Ａ’」は、後述するａ、Ａ、Ａ（Ｍ）、Ａ（Ｌ）、Ａ（Ｙ）、Ａ（Ｇｘ）、又はＡ（Ｓ）を意味する。記号「Ｃ’」は、後述するｃ、Ｃ、Ｃ（Ｍ）、５（Ｌ）、５（Ｙ）、５（Ｇｘ）、又は５（Ｓ）を意味する。記号「Ｇ’」は、後述するｇ、Ｇ、Ｇ（Ｍ）、Ｇ（Ｌ）、Ｇ（Ｙ）、Ｇ（Ｇｘ）、又はＧ（Ｓ）を意味する。記号「Ｔ’」は、後述するｔ、Ｔ、Ｕ、Ｕ（Ｍ）、Ｔ（ｍ）、Ｔ（Ｌ）、Ｔ（Ｙ）、Ｔ（Ｇｘ）、又はＴ（Ｓ）を意味する。
　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号６、７、９、１１、４４、４６、５４、５９、７４、７８、７９、８４、８５、８７、８８、９３、１０３～１０７、１０９、１１７～１１９、１２１～１２３、１２５～１２７、１３５、１３６、１３８、１４９、１５３、１５８、１６５～１６８、１７３、１７６、１７９～２００、２０２～２０５、２０７、２０９～２１３、２１７、２２０、２２１、２２５、２２７、２３３～２３７、２４０、２４１、２５７、２６３～２６６、２７２、２７３、２７５～２８６、３５０、３６０、３６１及び３６３～３６５の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列であることが好ましい。
　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号６、７、１１、７８、７９、８４、８７、９３、１０５、１１８、１２１～１２３、１３６、１３８、１４９、１６５～１６７、１７６、１８０～１９９、２０２～２０５、２０７、２１０、２１３、２１７、２２０、２２１、２２５、２３３、２３５～２３７、２４０、２４１、２５７、２６４、２６６、２７２、２７３、２７５～２８６、３５０、３６０、３６１及び３６４の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列であることがより好ましい。
　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号７、１２３、１３８、１６５、１６６、１６７、１８０～１９９、２０３、２０５、２０７、２３５、２３６、２４０、２４１、２５７、２６６、２７２及び２７５～２８６の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列であることが更に好ましい。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの一態様としては、電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、表２に記載されているいずれかの塩基配列からなり、表２に記載されているいずれかのＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの標的領域と結合することができる。上記標的領域は、マウスＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴにおいて、特に、ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの機能を阻害する又はＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節に関連する領域である。例えば、表２－１において５’末端位置が「８４」であり３’末端位置が「９８」である場合、マウスＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの塩基配列（配列番号３の塩基配列）における８４番目から９８番目までの塩基配列が、対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列名「ｍ８４－１５」）が標的とする標的領域となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　＜薬理学上許容される塩＞
　本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬理学上許容される塩の形態であってもよい。ここで、「薬理学上許容される塩」とは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩であって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生理学的に許容される塩、すなわち、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望される生物学的な活性を保持し、かつ望まれない毒物学的効果を保持しない塩を意味する。なお、後述する二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド及び一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体についても同様である。
　＜製薬学的に許容される塩＞
　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、製薬学的に許容される塩の形態であってもよい。ここで「製薬学的に許容される塩」とは、上述の薬理学上許容される塩であってかつ酸付加塩又は塩基付加塩であるものを意味する。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩及びリン酸塩等の無機酸塩、並びに、クエン酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐａｒａ－トルエンスルホン酸塩及びカンファースルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。また、塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩及びアルミニウム塩等の無機塩基塩、並びに、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６－ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン］、ｔｅｒｔ－ブチルアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン及びＮ，Ｎ－ジベンジルエチルアミン等の有機塩基塩等が挙げられる。更には、アルギニン、リジン、オルニチン、アスパラギン酸又はグルタミン酸等の塩基性アミノ酸又は酸性アミノ酸との塩（アミノ酸塩）が挙げられる。なお、後述する二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド及び一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体についても同様である。
　＜一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの構造＞
　本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含む（例えば、図１参照）。上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖の形態であることが好ましい。本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、後述する第二鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖の形態（二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）をとってもよい。上記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、いわゆるギャップマー型のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ギャップマー型のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下のメカニズムで、標的ＲＮＡの機能を阻害する。まず、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡの標的領域に結合する（図２の上部から中央部）。次に、ＲＮＡ分解酵素であるＲＮａｓｅＨが、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡの複合体を認識し結合する（図２の中央部）。その後、ＲＮａｓｅＨによる酵素分解反応により標的ＲＮＡが切断、分解される。このとき、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨによる酵素分解の影響を受けない（図２の下部）。そのため、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、別の標的ＲＮＡに結合して当該ＲＮＡを切断、分解することが可能になる。このようにギャップマー型のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上述のＲＮａｓｅＨによる酵素分解反応において触媒として機能するため、少量の投与であっても持続的に所定の効果が奏されると考えられる。
　また、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本実施形態においては、上述のようなメカニズムでＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの機能を阻害するため、ヘテロ接合突然変異によるハプロ不全で抑制されたＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節するために好適に用いることが可能である。更に本実施形態によれば、臨床応用時に通常用いられる投与経路である髄腔内投与においても、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する効果が発揮され得る。ここで、「ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進する」とは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の転写を促進することを意味する。「ＳＣＮ１Ａ遺伝子の機能を調節する」とは、タンパク質への翻訳等の機能を調節することを意味する。ＳＣＮ１Ａ遺伝子の機能としては、上記翻訳の他にも、タンパク質のフォールディング、タンパク質の修飾、細胞内輸送、分解等が挙げられる。
　（ギャップ領域）
　上記ギャップ領域は、５～２０ｍｅｒの、糖部がデオキシリボースである核酸である。言い換えると、上記ギャップ領域は、５～２０ｍｅｒの、糖部がデオキシリボースである天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド又はこれらの両方から構成されていると把握することもできる。上記ギャップ領域は、糖部がデオキシリボースであることによって、ＲＮａｓｅＨが認識可能な複合体を、標的ＲＮＡであるＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴと共に形成することが可能になる。
　上記ギャップ領域の塩基数は、５～２０ｍｅｒであり、６～１５ｍｅｒであることが好ましく、７～１３ｍｅｒであることがより好ましく、７～１１ｍｅｒが更に好ましい。
　糖部がデオキシリボースである天然ヌクレオチドとしては、例えば、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、チミジン一リン酸、デオキシシチジン一リン酸等が挙げられる。言い換えると、上記ギャップ領域を構成する天然ヌクレオチドとしては、後述する記号ａ、ｃ、ｇ及びｔそれぞれに対応する構造式を含むものが挙げられる。
　糖部がデオキシリボースである非天然ヌクレオチドとしては、例えば、２－チオ－チミジン－リン酸、２－アミノアデノシン－リン酸、７－デアザグアノシン－リン酸等が挙げられる。
　なお、上記ギャップ領域は、本発明の効果が奏する限りにおいて、一部の糖部が人工糖であってもよい。すなわち、本実施形態の一側面において、上記ギャップ領域は、一部の糖部がデオキシリボースであり、且つ他の一部の糖部が人工糖である核酸であってもよい。
　（３’ウイング領域）
　上記３’ウイング領域は、１～５ｍｅｒの、修飾核酸である。言い換えると、上記３’ウイング領域は、１～５ｍｅｒの、修飾ヌクレオチドから構成されていると把握することもできる。上記３’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。上記３’ウイング領域及び後述する上記５’ウイング領域が、上記所定の修飾ヌクレオチドから構成されることによって、標的ＲＮＡに対して高い結合親和性が期待でき、ひいては標的ＲＮＡの機能を効果的に抑制できると考えられる。本実施形態の一側面において、上記３’ウイング領域は、１～５ｍｅｒの、糖部が人工糖である修飾核酸であってもよい。糖部が人工糖である修飾核酸としては、上記（糖修飾、人工糖）で挙げられたものが例示される。
　上記３’ウイング領域の塩基数は、１～５ｍｅｒであり、２～５ｍｅｒであることが好ましく、２～４ｍｅｒであることがより好ましく、３～４ｍｅｒであることが更に好ましい。
　（５’ウイング領域）
　上記５’ウイング領域は、１～５ｍｅｒの、修飾核酸である。言い換えると、上記５’ウイング領域は、１～５ｍｅｒの、修飾ヌクレオチドから構成されていると把握することもできる。上記５’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。本実施形態の一側面において、上記５’ウイング領域は、１～５ｍｅｒの、糖部が人工糖である修飾核酸であってもよい。糖部が人工糖である修飾核酸としては、上記（糖修飾、人工糖）で挙げられたものが例示される。
　上記５’ウイング領域の塩基数は、１～５ｍｅｒであり、２～５ｍｅｒであることが好ましく、２～４ｍｅｒであることがより好ましい。
　本実施形態の一側面において、上記ギャップ領域は、６～１５ｍｅｒであり、上記３’ウイング領域は、２～４ｍｅｒであり、上記５’ウイング領域は、２～４ｍｅｒであることが好ましい。
　本実施形態の一側面において、上記ギャップ領域は、７～１３ｍｅｒであり、上記３’ウイング領域は、２～４ｍｅｒであり、上記５’ウイング領域は、２～４ｍｅｒであることがより好ましい。
　本実施形態の一側面において、上記ギャップ領域は、７～１１ｍｅｒであり、上記３’ウイング領域は、２～４ｍｅｒであり、上記５’ウイング領域は、２～４ｍｅｒであることが更に好ましい。
　（その他の構成）
　本実施形態の一側面において、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記３’ウイング領域の３’末端に結合している天然ヌクレオチドを更に含んでいてもよい。上記３’ウイング領域の３’末端に結合している天然ヌクレオチドの塩基数は、１又は数個であってもよく、１個であってもよい。
　（ギャップマー型の構造の表記方法）
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマー型である。ギャップマー型の構造を表記するにあたっては、「Ｘ－Ｙ－Ｚ」又は「Ｘ－Ｙ－Ｚ－Ｗ」の表記方法を用いることがある。上述の表記方法において、「Ｘ」は５’ウイング領域の塩基数を示し、「Ｙ」はギャップ領域の塩基数を示し、「Ｚ」は３’ウイング領域の塩基数を示し、「Ｗ」は３’ウイング領域の３’末端に結合する天然ヌクレオシドの塩基数を示す。
　「Ｘ－Ｙ－Ｚ」としては、２－８－４、２－８－３、２－８－５、２－９－２、２－９－３、２－９－４、２－９－５、２－１０－３、２－１０－４、２－１０－５、２－１１－３、２－１１－４、２－１１－５、２－１２－３、２－１２－４、２－１２－５、３－８－２、３－８－３、３－８－４、３－８－５、３－９－３、３－９－４、３－９－５、３－１０－３、３－１０－４、３－１０－５、３－１１－３、３－１１－４、３－１１－５、３－１２－３、３－１２－４、３－１２－５、４－８－２、４－８－３、４－８－４、４－８－５、４－９－３、４－９－４、４－９－５、４－１０－３、４－１０－４、４－１０－５、４－１１－２、４－１１－３、４－１１－４、４－１１－５、５－８－２、５－８－３、５－８－４、５－８－５、５－９－２、５－９－３、５－９－４、５－９－５、５－１０－２、５－１０－３、５－１０－４、５－１０－５、５－１１－２、５－１１－３、５－１１－４、５－１１－５等が挙げられる。例えば、「２－８－４」と表記した場合、５’ウイング領域は２ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、ギャップ領域は８ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、３’ウイング領域は４ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであることを意味する。
　「Ｘ－Ｙ－Ｚ－Ｗ」としては、２－８－４－１、２－８－３－１、２－８－５－１、２－９－２－１、２－９－３－１、２－９－４－１、２－９－５－１、２－１０－２－１、２－１０－３－１、２－１０－４－１、２－１０－５－１、２－１１－３－１、２－１１－４－１、２－１１－５－１、２－１２－３－１、２－１２－４－１、２－１２－５－１、３－８－２－１、３－８－３－１、３－８－４－１、３－８－５－１、３－９－２－１、３－９－３－１、３－９－４－１、３－９－５－１、３－１０－３－１、３－１０－４－１、３－１０－５－１、３－１１－３－１、３－１１－４－１、３－１１－５－１、３－１２－３－１、３－１２－４－１、３－１２－５－１、４－８－２－１、４－８－３－１、４－８－４－１、４－８－５－１、４－９－３－１、４－９－４－１、４－９－５－１、４－１０－３－１、４－１０－４－１、４－１０－５－１、４－１１－２－１、４－１１－３－１、４－１１－４－１、４－１１－５－１、５－８－２－１、５－８－３－１、５－８－４－１、５－８－５－１、５－９－２－１、５－９－３－１、５－９－４－１、５－９－５－１、５－１０－２－１、５－１０－３－１、５－１０－４－１、５－１０－５－１、５－１１－２－１、５－１１－３－１、５－１１－４－１、５－１１－５－１等が挙げられる。例えば、２－８－４－１と表記した場合、５’ウイング領域は２ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、ギャップ領域は８ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、３’ウイング領域は４ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、３’ウイング領域の３’末端に結合する天然ヌクレオシドは１ヌクレオチドであることを意味する。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長として、好ましくは１３～２５塩基長であり、より好ましくは１３～２３塩基長であり、更に好ましくは１４～２０塩基長であり、更により好ましくは１４～１９塩基長であり、特に好ましくは１４～１７塩基である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長が、１３～２５塩基長、１３～２３塩基長、１４～２０塩基長、１４～１９塩基長、１４～１７塩基長である場合、特に、ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴへの結合、又はＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴのｎｃＲＮＡ前駆体への結合が強く、ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの機能阻害をより効果的に行うことができる。なお、３’ウイング領域の３’末端に天然ヌクレオシドが更に結合している場合、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、上記天然ヌクレオシドの塩基数を含めてカウントするものとする。
　本実施形態において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び／又は人工リン酸基で結合されており、ホスホジエステル結合又はホスホロチオアート結合で結合されていることが好ましい。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの一態様としては、６～１５塩基からなるギャップ領域、２～５塩基からなる５’ウイング領域、及び２～５塩基からなる３’ウイング領域を有するギャップマー型のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ここにおいて、該ギャップ領域は、該５’ウイング領域と該３’ウイング領域の間に位置付けられる。そして、該５’ウイング領域及び該３’ウイング領域には、それぞれ少なくとも１つのＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、又はｓｃｐＢＮＡが含まれる。該５’ウイング領域及び該３’ウイング領域には、２’－Ｏ－アルキル化若しくは２’－Ｆ化されたヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、又はＳ－ｃＥｔが含まれていてもよい。２’－Ｏ－アルキル化ヌクレオチドとしては、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ－アルキル化（例えば、２’－Ｏ－メチル化、２’－Ｏ－メトキシエチル化等）ヌクレオチドを用いてもよい。
　＜二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド＞
　本実施形態に係る二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドと、を含む二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩である。上記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
　上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、溶液中で解離して、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、上記第二鎖オリゴヌクレオチドとに分離することができる。分離した上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上述した標的ＲＮＡに結合することができる。なお、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記第二鎖オリゴヌクレオチドとの関係において、「第一鎖オリゴヌクレオチド」と把握することもできる。なお、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチドのうち上記第一鎖オリゴヌクレオチドが上述した標的ＲＮＡに対するアンチセンス鎖を有しているが、上記第一鎖オリゴヌクレオチドと上記第二鎖オリゴヌクレオチドからなる二本鎖オリゴヌクレオチドを便宜上「二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」と呼ぶことにする。
　≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法≫
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト法による固相合成により製造することができる。例えば、市販の核酸自動合成機を使用して固相担体上で所定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをまず合成する。次に、塩基性物質等を用いて固相担体から合成したオリゴヌクレオチドを切出し、脱保護を行ない、粗体のオリゴヌクレオチドを得る。その後、得られた粗体のオリゴヌクレオチドを、ＨＰＬＣ等を用いて精製する。上述の製造法に限らず、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の方法に準じて、核酸の塩基配列、修飾部位等を適宜変更することにより製造できる。また、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡについては、それぞれ国際公開第２０１１／０５２４３６号（特許文献３）、国際公開第２０１４／０４６２１２号（特許文献４）、及び国際公開第２０１５／１２５７８３号（特許文献５）に記載の方法により製造することができる。
　≪二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法≫
　本発明の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、まず、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様の製造方法を用いて、該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を基準として所定の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド（第二鎖オリゴヌクレオチド）を製造する。その後、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび上記第二鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより製造することができる。
　≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体及び二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体≫
　本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を含む。上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれる。
　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩と、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有し、上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれる。
　本実施形態の他の側面において、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、
　上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩と、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有し、上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖（例えば、飽和脂肪族炭化水素等）、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖（例えば、炭水化物、多糖等）からなる群より選ばれる。
　本実施形態において「付加物質」とは、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合している物質であって、所定の作用を付与するために用いられる物質を意味する。上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端に結合していてもよいし、３’末端に結合していてもよいし、５’末端及び３’末端の両方に結合していてもよい。また、上記付加物質は、上記第二鎖オリゴヌクレオチドの５’末端に結合していてもよいし、３’末端に結合していてもよいし、５’末端及び３’末端の両方に結合していてもよい。本実施形態の一側面において、上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方に結合していることが好ましい。また、上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドと直接、共有結合で結合していてもよい。上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドと、リンカー物質を介して結合していてもよい。上記リンカー物質としては例えば、アルキル、ポリエチレングリコール、ペプチド、ジスルフィド等及び／又はこれらの組み合わせで構成されたリンカーが挙げられる。
　上記付加物質として用いられるペプチドとしては、例えば、以下のようなものが挙げられる。ＣＰＰｓ（Ｃｅｌｌ　Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ　Ｐｅｐｔｉｄｅs：細胞膜透過性ペプチド）、ＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ポリアルギニン、グルカゴン様ペプチド－１　類縁ペプチド、合成環状ＲＧＤペプチド
　上記付加物質として用いられるリガンド化合物としては、例えば、以下のようなものが挙げられる。Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、糖類（グルコース、マンノース等）、脂質類（コレステロール等）、ビタミン類（葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ等）、アミノ酸
　上記付加物質として用いられる抗体としては、例えば、以下のようなものが挙げられる。抗インスリン受容体抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、抗ＬＤＬ受容体関連タンパク質抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＨＥＲ２抗体
　上記付加物質として用いられるタンパク質としては、例えば、以下のようなものが挙げられる。アルブミン
　≪電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現及び／又は機能の調節剤≫
　本実施形態に係る電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現及び／又は機能の調節剤（以下、「ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現及び／又は機能調節剤」という場合がある。）は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体を有効成分として含む。本実施形態の一側面において、上記ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現及び／又は機能調節剤は、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体を有効成分として含む。本実施形態の一側面において、上記発現及び／又は機能調節剤は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に対する発現促進剤と把握することもできる。本実施形態の他の側面において、上記発現及び／又は機能調節剤は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に対する機能調節剤と把握することもできる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴに結合し、ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの機能を阻害することにより、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進し及び／又は機能を調節し、ＳＣＮ１Ａ遺伝子からのタンパク質翻訳を促進する。本発明のＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現及び／又は機能調節剤の投与方法及び製剤は、当該分野で公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも利用可能である。
　≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等を有効成分として含有する医薬組成物≫
　本実施形態に係る医薬組成物は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。本実施形態の一側面において、上記医薬組成物は、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。本実施形態の医薬組成物の投与方法及び製剤は、当該分野で公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも利用可能である。
　上記医薬組成物は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に関連した疾患、特にＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現が抑制及び／又は機能調節されることによって引き起こされる疾患の治療又は予防に用いられる。言い方を変えると、上記医薬組成物は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進する、又はＮａｖ１．１の発現を亢進することによって症状の改善が期待できる疾患の治療又は予防に用いることができる。このような疾患の具体例としては、例えば、神経回路の興奮抑制バランスの破綻に起因する疾患、ドラベ症候群、レノックスガストー症候群、ウエスト症候群、てんかん重積、その他薬剤抵抗性てんかん、神経発達障害、神経変性疾患、統合失調症、認知症、うつ・不安症状、アルツハイマー病、パーキンソン病、片頭痛、運動障害、睡眠障害、摂食障害、自律神経症状、疼痛、薬物依存症を始めとする種々の精神神経疾患等が挙げられる。
　≪ドラベ症候群に対する治療剤及び予防剤≫
　本実施形態に係るドラベ症候群に対する治療剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。本実施形態に係るドラベ症候群に対する予防剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
　本実施形態の一側面において、ドラベ症候群に対する治療剤は、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。本実施形態に係るドラベ症候群に対する予防剤は、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
　＜ドラベ症候群＞
　上記ドラベ症候群とは、生後１歳未満の乳児期に発症する薬剤抵抗性てんかんを意味する。また、ドラベ症候群は、重症乳児ミオクロニーてんかん（ｓｅｖｅｒｅ　ｍｙｏｃｌｏｎｉｃ　ｅｐｉｌｅｐｓｙ　ｉｎ　ｉｎｆａｎｃｙ：ＳＭＥＩ）とも呼ばれている。てんかん診療ガイドライン２０１８では、薬剤抵抗性てんかんは、そのてんかんに対して適切とされる抗てんかん薬を単剤又は多剤併用で副作用のない範囲の十分な血中濃度で２剤試みても一定期間（１年以上又は治療前の最長発作間隔の３倍以上のいずれか長い方）発作を抑制できないてんかん、と定義されている。ドラベ症候群は、主に発熱時における全身性のけいれん発作で乳児期に発症し、その後、ミオクロニー発作、焦点発作、痙攣性てんかん重積発作、強直間代性発作等、多彩な発作型が頻回に出現する。ドラベ症候群の患者は、予後不良であり、運動障害、精神発達遅滞等も観察される。更にドラベ症候群の患者は、てんかん発作に起因する突然死（ｓｕｄｄｅｎ　ｄｅａｔｈ　ｉｎ　ｅｐｉｌｅｐｓｙ：　ＳＵＤＥＰ）の割合が他のてんかん関連疾患の患者と比較しても極めて高い。
　＜薬剤抵抗性てんかん＞
　上記薬剤抵抗性てんかんとは、頭蓋内病変（例えば、脳血管障害、脳形成異常、腫瘍、海馬硬化、脳炎・脳症後、全身性疾患等）がある症候性部分てんかん、側頭葉てんかん等の潜因性部分てんかん、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）等の変性・代謝疾患に伴う症候性全般てんかん、レノックスガストー症候群、ウエスト症候群、４ｐ－症候群等の染色体異常、結節性硬化症等の神経皮膚症候群、低酸素性虚血脳症後、脳変性・代謝性疾患に伴うてんかん、自己免疫性脳炎関連てんかん等を意味する。より具体的には、例えば、てんかん診療ガイドライン２０１８に記載されている。
　＜個体＞
　上記個体とは、哺乳動物を意味する。好ましくは、ヒト、サル、マーモセット、イヌ、ブタ、ウサギ、モルモット、ラット及びマウスである。より好ましくは、上記個体はヒトである。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその医薬組成物（ドラベ症候群に対する治療剤及び予防剤を含む）を投与するに当たっては、その投与方法及び剤型は特に限定されない。すなわち、当該分野における公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与方法及び製剤として用いることができる。投与方法としては、例えば、経口投与、非経口投与等が挙げられる。非経口投与としては、点眼投与、腟内投与、直腸内投与、鼻腔内投与、経皮投与、静脈内注射、点滴、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注入、吸引若しくは吸入による肺投与、髄腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの製剤には、賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、嬌味剤、芳香剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、張剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合することができる。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの医薬組成物を局所投与する場合、例えば、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤を用いることができる。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの医薬組成物を経口投与する場合、例えば、散剤、顆粒剤、水若しくは非水性媒体に溶解させた懸濁液又は溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等の製剤を用いることができる。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの医薬組成物を非経口、髄腔内、又は脳室内投与する場合、例えば、無菌水溶液等の製剤を用いることができる。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効投与量は、投与される個体の性別、年齢、体重、症状等により、任意に定めることができる。更に、投与の方法、経路、頻度等に応じても任意に定めることができる。例えば、投与量として０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ等が挙げられる。好ましくは０．１～５０ｍｇ／ｋｇであり、更に好ましくは０．１～１０　ｍｇ／ｋｇである。
　≪ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進及び／又は機能を調節する方法≫
　本実施形態におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進及び／又は機能を調節する方法は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として、上記ＳＣＮ１Ａ遺伝子を発現している細胞、組織又は個体に投与する工程を含む。
　本実施形態の一側面において、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進及び／又は機能を調節する方法は、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として、上記ＳＣＮ１Ａ遺伝子を発現している細胞、組織又は個体に投与する工程を含む。
　本実施形態において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等を細胞、組織又は個体に投与する方法は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで行ってもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで行ってもよい。ｉｎ　ｖｉｖｏで投与する場合、その投与経路は、上述した投与経路が用いられる。
　本実施形態において、「ＳＣＮ１Ａ遺伝子を発現している細胞」としては、例えば、中枢神経系を構成する神経細胞、末梢神経系を構成する細胞等が挙げられる。
　本実施形態における精神神経疾患の治療方法又は予防方法は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として、上記精神神経疾患に罹患している個体に投与する工程を含む。
　本実施形態の一側面において、精神神経疾患の治療方法又は予防方法は、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として、上記精神神経疾患に罹患している個体に投与する工程を含む。
　上記精神神経疾患としては、上述した精神神経疾患が挙げられる。個体に投与する際の剤型、投与経路及び投与量は上述したものを適宜採用することができる。
　以上、本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドについて説明した。上述の構成を備える上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの機能を阻害することによってＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節することが可能になる。ここで、ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの発現に対する抑制活性（ノックダウン活性）は、公知の方法により測定することができる。ノックダウン活性の測定方法としては、例えば、Ｎａｔｕｒｅ．　２０１５　Ｆｅｂ　１９；５１８（７５３９）：４０９－１２（非特許文献６）に記載されている方法等が挙げられる。また、後述するＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのトランスフェクション又はＳＣＮ１Ａハプロ不全マウスへの脳室内投与の方法によっても測定することができる。
　なお、本発明は、上述の実施形態に限定されない。例えば、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の実施態様を含む。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの一態様としては、電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　（Ａ）配列番号１、２、又は３に記載の塩基配列における連続した１０～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列と９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　（Ｂ）上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
　　（Ｃ）上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、であり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び／又は人工リン酸基で結合されており、
　上記ギャップ領域は、６～１５ｍｅｒの、糖部がデオキシリボ－スである核酸であり、
　上記３’ウイング領域は、２～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記３’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、
　上記５’ウイング領域は、２～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記５’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の一態様としては、電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　（Ａ）配列番号１、２、又は３に記載の塩基配列における連続した１２～２０ｍｅｒで構成される標的領域に対して相補的な塩基配列と９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　（Ｂ）上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
　　（Ｃ）上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、であり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合、メチルホスホナート結合、又はメトキシプロピルホスホネート結合で結合されており、
　上記ギャップ領域は、６～１５ｍｅｒの、糖部がデオキシリボ－スである核酸であり、
　上記３’ウイング領域は、２～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記３’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、
　上記５’ウイング領域は、２～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記５’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの別の他の一態様としては、電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列における連続した１２～２０ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列と９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　（Ｂ）上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
　　（Ｃ）上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、であり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホアミダート結合、又はボラノホスフェート結合で結合されており、
　上記ギャップ領域は、６～１５ｍｅｒの、糖部がデオキシリボ－スである核酸であり、
　上記３’ウイング領域は、２～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記３’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、
　上記５’ウイング領域は、２～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記５’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの別の他の一態様としては、電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　（Ａ）配列番号１、２、又は３に記載の塩基配列における連続した１３～２０ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列と９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　（Ｂ）上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホアミダート結合、又はボラノホスフェート結合で結合されており、
　上記ギャップ領域は、６～１３ｍｅｒの、糖部がデオキシリボ－スである核酸であり、
　上記３’ウイング領域は、２～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記３’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、
　上記５’ウイング領域は、２～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記５’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの別の他の一態様としては、電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列における連続した１４～１８ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列と９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホアミダート結合、又はボラノホスフェート結合で結合されており、
　上記ギャップ領域は、６～１３ｍｅｒの、糖部がデオキシリボ－スである核酸であり、
　上記３’ウイング領域は、２～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記３’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも２つを含み、
　上記５’ウイング領域は、２～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記５’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも２つを含む。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの別の他の一態様としては、電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列における連続した１４～１８ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列と配列同一性を有する塩基配列、又は、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがホスホジエステル結合又はホスホロチオアート結合で結合されており、
　上記ギャップ領域は、６～１１ｍｅｒの、糖部がデオキシリボ－スである核酸であり、
　上記３’ウイング領域は、２～４ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記３’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも２つを含み、
　上記５’ウイング領域は、２～４ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記５’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも２つを含む。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの別の他の一態様としては、電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列における連続した１４～１７ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列と配列同一性を有する塩基配列、であり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがホスホジエステル結合又はホスホロチオアート結合で結合されており、
　上記ギャップ領域は、７～１０ｍｅｒの、糖部がデオキシリボ－スである核酸であり、
　上記３’ウイング領域は、２～４ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記３’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも２つを含み、
　上記５’ウイング領域は、２～４ｍｅｒの、修飾核酸であり、
　上記５’ウイング領域における上記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも２つを含む。
　以下、本発明に係る実施例を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　≪ＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴに対する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等の作製≫
　以下の手順でＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴに対する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド及び二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを作製した。
　ＡｍＮＡ及びｓｃｐＢＮＡを含む一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸自動合成機（ｎＳ－８型、株式会社ジーンデザイン製）を用いて、０．２μｍｏｌ又は、１μｍｏｌスケールで合成した。鎖長の伸長は、標準的なホスホロアミダイトプロトコールにて実施した。このとき固相担体は、ＣＰＧレジンを使用した。また、ホスホロチオエート化（ＰＳ）骨格形成のための硫化はＤＤＴＴ（（（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ－ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ）ａｍｉｎｏ）－３Ｈ－１，２，４－ｄｉｔｈｉａｚａｏｌｉｎｅ－３－ｔｈｉｏｎｅ）等を使用した。ＡｍＮＡ及びｓｃｐＢＮＡを含む一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、末端の５’位の水酸基がＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリチル）基で保護されておらず、かつ３’位が固相に担持されたものとして得た。続いてアルカリ処理することにより、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを固相担体から切り出し、溶液の状態で回収した。その後、回収した溶液から溶媒を留去することで粗生成物を得た。得られた粗生成物を逆相ＨＰＬＣにて精製することにより精製された一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを得た。得られた各アンチセンスオリゴヌクレオチドの純度及び構造をＬＣ－ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ社製）により確認した。
　表３－１１における実施例２７２、３４８～３５３、３５７～３６２については、対応する付加物質を有するホスホロアミダイトを用いることで上記プロトコールに従って合成した（例えば、図３～６の化合物合成）。付加物質を有するホスホロアミダイトとしては、実施例２７２では、Ｓｐａｃｅｒ－ＣＥ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　９および６－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ＣＥ　Ｐｈｏｓｐｈｒａｍｉｄｉｔｅを用い、実施例３４８～３５３では、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｌ　ＴＥＧ　ＣＥ　Ｐｈｏｓｐｈｒａｍｉｄｉｔｅ、又は、ＤＭＴ―Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　ＴＥＧ　ＣＥ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを用い、実施例３５７～３６２では、５’―Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ―ＣＥ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを用いた。なお、実施例３５７～３６２については、上記と同様の方法によって合成した一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと付加物質を有する第二鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズすることによって作製した。
　下記表３－１～表３－１２及び表４－１～表４－３に、上述の方法で製造した一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体及び二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを列挙する。表３－１～３－１２において示されている一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等は、ヒトＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　表４－１～表４－３において示されている一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、マウスＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　本明細書において、下記記号又は表記を用いて、対応する構造を表すことがある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　上に示す構造式において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、又は、直鎖若しくは分岐の炭素数１から３のアルキル基を示す。ここにおいて、上述の「＝」で示される結合におけるＲ１及びＲ２は、共にメチル基を示す。Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖若しくは分岐の炭素数１から７のアルキル基、又は炭素数１から７のシクロアルキル基を示す。ここにおいて、上述の「Ｇｘ」で示されるＧｕＮＡにおけるＲ３及びＲ５が共に水素原子で、かつ、Ｒ４がメチル基の場合は、「Ｇｍ」と示し、Ｒ３が水素原子で、かつ、Ｒ４及びＲ５が共にメチル基の場合は、「Ｇｄｍ」と示し、Ｒ３及びＲ５が水素原子で、かつ、Ｒ４がｔｅｒｔ－ブチル基の場合は、「ＧｔＢ」と示す。
　＜参考例＞
　非特許文献４記載の方法にしたがって、表５の示す一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　≪ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現評価≫
　ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現評価は、製造した一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等に応じて、ヒト神経芽細胞種を用いた発現評価と、マウス初代神経細胞を用いた発現評価とに分けて行った。以下、各発現評価の具体的手順について説明する。
　＜ヒト神経芽細胞種を用いた発現評価＞
　ヒト神経芽細胞種ＳＫ－Ｎ－ＡＳ（ＡＴＣＣ（登録商標）　ＣＲＬ－２１３７（商標））を、培養培地中、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で培養した。ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞の培養培地としては、以下の組成のものを用いた。
　ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞の培養培地組成
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）：ＳＩＧＭＡ社製、Ｃａｔ＃Ｄ６４２９
１０％　ウシ胎児血清（ＦＢＳ）：ｂｉｏｗｅｓｔ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１８２０
１００倍希釈非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）：ｇｉｂｃｏ社製、Ｃａｔ＃１１１４０－０５０
１００倍希釈ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液：ナカライテスク社製　Ｃａｔ＃０９３６７－３４（ペニシリン　１００００ユニット／ｍｌ，　ストレプトマイシン　１００００μｇ／ｍｌ、安定剤含有）
　まず、ヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現量測定を行う前日に、６穴プレートにＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞（５０００００　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した各アンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度４０ｎＭ）をリポフェクション法を用いて、上述の細胞にトランスフェクションした。陰性対照群としては、アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳをトランスフェクションした細胞を用いた。トランスフェクションした細胞を増殖培地中で３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で４８時間培養した。その後、上記増殖培地を除去し、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、培養した細胞から全ＲＮＡを抽出した。Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３７４９６６）及びＴａｑｍａｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃Ｎ８０８０２３４）を用いて抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施した。この逆転写反応から得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を利用して、Ｔａｑｍａｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で、予め設計された遺伝子特異的プローブ（下記参照）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した（９５°Ｃ；３秒間、６０°Ｃ；３０秒間を４０サイクル）。
　ヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現評価で用いた遺伝子特異的プローブ一覧
　ｈｕｍａｎ　ＳＣＮ１Ａ：　Ｈｓ００３７４６９６＿ｍ
　ｈｕｍａｎ　ＧＡＰＤＨ：　４３２６３１７Ｅ（インターナルコントロール）
　上述の方法で求められた、各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等におけるヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現比率（発現増加率）を表６－１～６－５に示す。このとき、陰性対照群において求められたヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現比率を１とした。発現比率が１．１以上であるものを、ヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドであると判断した。なお、一般に遺伝子の発現が促進するとその後のタンパク質への翻訳等の機能も向上することが考えられる。そのため、上記発現比率が１．１以上であるものは、ヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の機能を調節することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドであると判断できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　同様の方法で参考例１～７の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現比率（発現増加率）を求めた。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
　＜マウス初代神経細胞を用いた発現評価＞
　マウス初代神経細胞を、培養培地中、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で培養した。マウス初代神経細胞の培養培地としては、以下の組成のものを用いた。
マウス初代神経細胞の培養培地組成
Ｂ－２７　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ｋｉｔ：ｇｉｂｃｏ社製、Ｃａｔ＃Ａ１４１３７０１
１００倍希釈２００ｍＭ－Ｌ－グルタミン溶液：ナカライテスク社製：Ｃａｔ＃１６９４８－０４
１００倍希釈ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液：ナカライテスク社製　Ｃａｔ＃０９３６７－３４（ペニシリン　１００００ユニット／ｍｌ，　ストレプトマイシン　１００００μｇ／ｍｌ、安定剤含有）
　まず、マウス初代神経細胞（マウス胎児大脳由来）を９６穴プレートに各細胞（２００００～４００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で播種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で３日～１４日培養した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した各アンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度１μＭ）を培養培地に添加した。陰性対照群としては、アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳを培養培地に添加した細胞を用いた。細胞を培養培地中で３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で４８時間培養した。その後、上記培養培地を除去し、Ｔａｑｍａｎ　Ｆａｓｔ　Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９９００３）を用いて、抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施した。この逆転写反応から得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を利用して、Ｔａｑｍａｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で、予め設計された遺伝子特異的プローブ（下記参照）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した（９５°Ｃ；３秒間、６０°Ｃ；３０秒間を４０サイクル）。
　ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現評価で用いた遺伝子特異的プローブ一覧
　ｍｏｕｓｅ　Ｓｃｎ１ａ：　Ｍｍ００４５０５８０＿ｍ１
　ｍｏｕｓｅ　ＧＡＰＤＨ：　４３５２３３９Ｅ（インターナルコントロール）
　上述の方法で求められた、各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるマウスＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現比率（発現増加率）を表８に示す。このとき、陰性対照群において求められたマウスＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現比率を１とした。発現比率が１．１以上であるものを、マウスＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を促進することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドであると判断した。なお、一般に遺伝子の発現が促進するとその後のタンパク質への翻訳等の機能も向上することが考えられる。そのため、上記発現比率が１．１以上であるものは、マウスＳＣＮ１Ａ遺伝子の機能を調節することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドであると判断できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　≪ヒトＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの発現に対する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの抑制作用の評価≫
　ヒトＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの発現測定を行う前日に６穴プレートにＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞（５０００００　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。その後、ＰＢＳで希釈した各アンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度４０　ｎＭ）を、リポフェクション法を用いて、上述の細胞にトランスフェクションした。陰性対照群としては、アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳをトランスフェクションした細胞を用いた。トランスフェクションした細胞を増殖培地中で３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で４８時間培養した。その後、上記増殖培地を除去し、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、培養した細胞から全ＲＮＡを抽出した。Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３７４９６６）及びＴａｑｍａｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃Ｎ８０８０２３４）を用いて、抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施した。この逆転写反応から得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を利用して、Ｔａｑｍａｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で、予め設計された遺伝子特異的プローブ（下記参照）を用いてリアルタイムＰＣＲ（を実施した９５°Ｃ；３秒間、６０°Ｃ；３０秒間を４０サイクル）。
　ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞を用いたＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴ発現抑制評価に用いた遺伝子特異的プローブ一覧
　ｈｕｍａｎ　ＳＣＮ１Ａ：　Ｈｓ００３７４６９６＿ｍ
　ｈｕｍａｎ　ＬＯＣ１０２７２４０５８：　Ｈｓ０４４０４７０１_ｍ１
　ｈｕｍａｎ　ＬＯＣ１０２７２４０５８：　Ｈｓ０４４０４７０２_ｍ１
　ｈｕｍａｎ　ＧＡＰＤＨ：　４３２６３１７Ｅ（インターナルコントロール）
　下記表９に、ヒトＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴ発現抑制の評価結果（プローブ：Ｈｓ０４４０４７０１_ｍ１）を示す。このとき、陰性対照群において求められたヒトＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの発現率を１とした。発現率が０．８以下であるものを、ヒトＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの発現を低下させることが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドであると判断した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
　≪ヒトｉＰＳ細胞由来ニューロンのＳＣＮ１Ａ遺伝子及びＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの発現評価≫
　実験項
　ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、培養したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロン（富士フィルム和光純薬社製）から全ＲＮＡを抽出する。Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３７４９６６）及びＴａｑｍａｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃Ｎ８０８０２３４）を用いて、抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施する。この逆転写反応から得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を利用して、Ｔａｑｍａｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で、予め設計された遺伝子特異的プローブ（下記参照）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施する（９５°Ｃ；３秒間、６０°Ｃ；３０秒間を４０サイクル）。
　ヒトｉＰＳ細胞由来ニューロンのＳＣＮ１Ａ遺伝子及びＳＣＮ１Ａ　ＮＡＴの発現評価に用いた遺伝子特異的プローブ一覧
　ｈｕｍａｎ　ＳＣＮ１Ａ：　Ｈｓ００３７４６９６＿ｍ
　ｈｕｍａｎ　ＬＯＣ１０２７２４０５８：　Ｈｓ０４４０４７０１_ｍ１（プローブ１）
　ｈｕｍａｎ　ＬＯＣ１０２７２４０５８：　Ｈｓ０４４０４７０２_ｍ１（プローブ２）
　ｈｕｍａｎ　ＧＡＰＤＨ：　４３２６３１７Ｅ（インターナルコントロール）
　≪アンチセンスオリゴヌクレオチドのＴｍ値評価≫
　Ｔｍ値の測定は、各アンチセンスオリゴヌクレオチド及び相補的なＲＮＡを各１μＭ（終濃度）になるように、リン酸緩衝溶液（終濃度が、それぞれ１０ｍＭ　リン酸緩衝溶液、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ）で希釈し、９５°Ｃで３０分間加温した。その後、室温で３時間冷却したのち、０．５°Ｃ／分で２０°Ｃから１００°Ｃまで温度を上昇させ、０．５°Ｃ毎に波長２６０ｎｍ及び３２０ｎｍの吸光度を測定した。縦軸を２６０ｎｍの吸光度から３２０ｎｍの吸光度を引いた値、横軸を温度としたグラフを作成し、吸光度の変化から中線法にてＴｍ値を計算した。
　下記表１０－１及び１０－２に、Ｔｍ値の評価結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
　≪アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞毒性評価（ヒト配列）≫
　ヒト肝癌由来細胞株（ＨｅｐＧ２）又はヒト肝細胞株（ＨｅｐａＲＧ）を、増殖培地中、３７°Ｃ、５％ＣＯ２条件で培養した。増殖培地としては、以下の組成のものを用いた。
　細胞毒性評価に用いた増殖培地の組成
１０％　ウシ胎児血清（ＦＢＳ）：ｂｉｏｗｅｓｔ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１８２０
１ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム溶液：ｇｉｂｃｏ社製、Ｃａｔ＃１１３６０－０７０
１００μＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）：ｇｉｂｃｏ社製、Ｃａｔ＃１１１４０－０５０１００μg／ｍＬ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ［ナカライテスク社製　Ｃａｔ＃０９３６７－３４（ペニシリン　１００００ユニット／ｍｌ，　ストレプトマイシン　１００００μｇ／ｍｌ、安定剤含有）］
Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｃａｔ＃１１０９５－０８０）
　実験前日に９６穴プレート又は３８６穴プレートに各細胞（２．５～４．８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ：９６穴、０．７～２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ：３８６穴）を播種した。播種した細胞を３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製社製、Ｃａｔ＃１３７７８０３０）との複合体を形成させた各オリゴヌクレオチド（終濃度：３～１００ｎＭ）を添加した。その後、Ｏｐｔｉ－Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃３１９８５０７０）にて、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で２４時間から４８時間上記細胞を培養した。その後、上記増殖培地を除去し、生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（同仁化学研究所社製、Ｃａｔ＃ＣＫ１２）を用いて、細胞生存率を評価した。
　下記表１１に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞毒性評価の結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
　≪アンチセンスオリゴヌクレオチドの血清中安定性評価（ヒト配列）≫
　４００ｐｍｏｌのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むＴｒｉｓ－ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ＝８．０）溶液（４μＬ）に対して、マウス血清（２０μＬ）を混合させた後、ミネラルオイル（１５μＬ）を添加した。この溶液を３７°Ｃにてインキュベートした後、８ｍｏｌ／Ｌ　尿素溶液（１０μＬ）を混合させて血清中の核酸分解酵素を失活させた。超純水（１０μＬ）を添加後に遠心分離によりアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む水層とミネラルオイル層に分離し、水層をＬＣ－ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ社製）によって分析し、得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドのＵＶ－クロマトグラムの面積強度より残存するアンチセンスオリゴヌクレオチドを算出した。「残存オリゴヌクレオチド（％）」とは、血清との混合直後に分析した時点における未分解のアンチセンスオリゴヌクレオチドに対する、７２時間後における未分解のアンチセンスオリゴヌクレオチドの残存率を示す。
　下記表１２に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの血清中安定性評価の結果を示す。このとき、７２時間後において残存率が５０％以上であるものを、安定なアンチセンスオリゴヌクレオチドであると判断した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
　≪アンチセンスオリゴヌクレオチドの正常マウスでのｉｎ　ｖｉｖｏ評価（マウス配列）≫
　４～６週齢のＣｒｌ：ＣＤ１（ＩＣＲ）雄マウスに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した各アンチセンスオリゴヌクレオチドを脳室内投与する。陰性対照群としては、アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳを投与する。投与して４８時間経過後、上記マウスの前頭前野を摘出する。その後、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃ＡＭ７０２１）で、摘出した前頭前野を処理し、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、当該前頭前野（脳組織）から全ＲＮＡを抽出する。Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３７４９６６）及びＴａｑｍａｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃Ｎ８０８０２３４）を用いて、抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施する。この逆転写反応から得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を利用して、Ｔａｑｍａｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で、予め設計された遺伝子特異的プローブ（下記参照）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施する（９５°Ｃ；３秒間、６０°Ｃ；３０秒間を４０サイクル）。
　正常マウスでのｉｎ　ｖｉｖｏ評価に用いた遺伝子特異的プローブ一覧
　ｍｏｕｓｅ　Ｓｃｎ１ａ：　Ｍｍ００４５０５８０＿ｍ１
　ｍｏｕｓｅ　ＧＡＰＤＨ：　４３５２３３９Ｅ（インターナルコントロール）
　以上のように本発明の実施形態及び実施例について説明を行なったが、上述の各実施形態及び各実施例の構成を適宜組み合わせることも当初から予定している。
　今回開示された実施の形態及び実施例はすべての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した実施の形態及び実施例ではなく請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味、及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

Claims (15)

  1. 　電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現を促進する及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、前記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、前記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
    　　配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１９１番～２０１番、２３９番～２５１番、２９１番～２９７番、３３１番～３３５番、３６５番～３８４番、４０４番～４１４番、４４３番～４５０番、４６５番～４７２番、５０６番、５４３番～５５０番、５７９番、７３２番～７５７番、８０４番～８１６番、９０９番～９１１番、９８８番～９９１番、若しくは１０７７番～１０９６番に位置する塩基から連続した１０～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
    　　前記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
    　　前記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、であり、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び／又は人工リン酸基で結合されており、
    　前記ギャップ領域は、５～２０ｍｅｒの、糖部がデオキシリボースである核酸であり、
    　前記３’ウイング領域は、１～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、
    　前記３’ウイング領域における前記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、
    　前記５’ウイング領域は、１～５ｍｅｒの、修飾核酸であり、
    　前記５’ウイング領域における前記修飾核酸は、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  2. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１９７番～２０１番、２４０番～２４９番、２９３番～２９７番、３３１番～３３４番、４１３番、４４４番～４４９番、４６６番～４７２番、５４３番～５４８番、７３３番～７５６番、８１１番～８１６番、９１０番、９８８番～９９１番、若しくは１０７７番に位置する塩基から連続した１０～２５ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であり、
    　前記３’ウイング領域は、２～５ｍｅｒであり、
    　前記５’ウイング領域は、２～５ｍｅｒである、請求項１に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  3. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホアミダート結合、又はボラノホスフェート結合で結合されており、
    　前記ギャップ領域は、６～１５ｍｅｒであり、
    　前記３’ウイング領域は、２～４ｍｅｒであり、
    　前記５’ウイング領域は、２～４ｍｅｒである、請求項１又は請求項２に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  4. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがホスホジエステル結合又はホスホロチオアート結合で結合されている、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  5. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１９７番～２０１番、２４１番～２４８番、３３１番～３３２番、４４４番～４４８番、５４３番～５４８番、７３３番～７３４番、７４４番～７４５番、７５１番～７５６番、８１２番～８１６番、若しくは９８９番～９９１番に位置する塩基から連続した１２～２０ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  6. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１９８番～２０１番、２４１番～２４８番、３３２番、４４４番、５４３番～５４７番、７３３番、７４５番、８１２番～８１３番、若しくは９８９番に位置する塩基から連続した１４～２０ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  7. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号６、７、９、１１、４４、４６、５４、５９、７４、７８、７９、８４、８５、８７、８８、９３、１０３～１０７、１０９、１１７～１１９、１２１～１２３、１２５～１２７、１３５、１３６、１３８、１４９、１５３、１５８、１６５～１６８、１７３、１７６、１７９～２００、２０２～２０５、２０７、２０９～２１３、２１７、２２０、２２１、２２５、２２７、２３３～２３７、２４０、２４１、２５７、２６３～２６６、２７２、２７３、２７５～２８６、３５０、３６０、３６１及び３６３～３６５の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列である、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩と、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を含む、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩であって、
    　前記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれる、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩。
  9. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は請求項８に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む医薬。
  10. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は請求項８に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む、電位依存性ナトリウムチャネルα１サブユニット遺伝子の発現及び／又は機能の調節剤。
  11. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は請求項８に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ドラベ症候群に対する治療剤。
  12. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は請求項８に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ドラベ症候群に対する予防剤。
  13. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は請求項８に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を個体に投与することを含む、ドラベ症候群の治療方法。
  14. 　ドラベ症候群の治療に使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は請求項８に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩。
  15. 　ドラベ症候群の治療剤を製造するために使用する、請求項１～７のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は請求項８に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩。
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