ES2847126T3 - Inhibidores de PDE4 para el tratamiento del síndrome de Prader-Willi - Google Patents

Inhibidores de PDE4 para el tratamiento del síndrome de Prader-Willi Download PDF

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Abstract

Un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) para su uso en el tratamiento del Síndrome de Prader-Willi (SPW), cuyo uso comprende administrar el inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) a un sujeto que necesita el mismo y de este modo aliviar, eliminar o prevenir u no o más síntomas del SPW.

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibidores de PDE4 para el tratamiento del síndrome de Prader-Willi
Referencia a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos Número 62/345,133 que se presenta el 3 de junio de 2016; Solicitud Provisional de los Estados Unidos Número 62/375,662 que se presenta el 16 de agosto de 2016.
Apoyo del gobierno
Este trabajo se apoyó en parte por una subvención del Instituto Nacional de Salud R01DK052431; en consecuencia, el gobierno de los Estados Unidos puede tener determinados derechos en la presente invención.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para regular la prohormona convertasa (PC1) y compuestos y tratamientos que aumentan los niveles de la PCI.
Antecedentes de la invención
El Síndrome de Prader-Willi (SPW) es causado por la pérdida de genes que se expresan por el padre en una región impresa del cromosoma 15q. Entre los fenotipos canónicos se encuentran la obesidad hiperfágica, el hipogonadismo central y el déficit de la hormona del crecimiento. Los pacientes con microdeleción poco común del SPW definen una región de deleción crítica mínima de 91 kb que abarca 3 genes, que incluyen el SNORD116 no codificante. Se ha encontrado que el NHLH2 y la PCI se regulan de forma negativa en neuronas del SPW que se derivan de iPSC en comparación con los controles que no se afectan. Los niveles de transcripción de NHLH2 y Pcskl se reducen en el hipotálamo de ratones Snord116p_lm+ en ayunas.
La deficiencia de Nhlh2 en ratones causa obesidad, hipogonadismo, y retraso del crecimiento. El Nhlh2 promueve la expresión de la prohormona convertasa, (PCI). Los humanos y los ratones deficientes en la PCI presentan obesidad hiperfágica, hipogonadismo, disminución de la hormona del crecimiento, y diabetes debido a un procesamiento deficiente de las prohormonas. Por ejemplo, los ratones Snord116p-lm+ presentan defectos funcionales in vivo en el procesamiento de las prohormonas de proinsulina, proGHRH, y progrelina que se asocia con reducciones en la PCI. Actualmente no existen tratamientos para pacientes con SPW y se necesitan con urgencia tratamientos efectivos y sistemas modelo.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona la regulación de la prohormona convertasa mediante la administración de una cantidad efectiva de un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (inhibidor de la PDE4 o PDE4i). La expresión de la prohormona convertasa se puede regular de forma positiva mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de la PDE4. El inhibidor de la PDE4 se puede administrar a una célula o a un paciente con síndrome de Prader-Willi. El inhibidor de la PDE4 se puede administrar a un sujeto obeso. También se espera que esto sea útil para el tratamiento de pacientes con Síndrome de Schaaf-Yang y Trastorno del Espectro Autista.
El inhibidor de la PDE4 se puede administrar por vía oral, intravenosa, subcutánea, intratecal, tópica, intranasal, o en los pulmones.
El inhibidor de la PDE4 puede incluir teofilina, roflumilast, apremilast, ibdulast, GSK356278, MK0952, IBMX, así como también combinaciones de estos fármacos.
En determinadas modalidades, el inhibidor de la PDE4 puede incluir cualquiera de los inhibidores de la Tabla 1A o la Tabla 1B.
En modalidades adicionales, se pueden usar combinaciones de inhibidores de la PDE4 en los presentes métodos. La presente invención incluye también la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un activador de la adenilato ciclasa. El activador de la adenilato ciclasa se puede administrar a una célula o a un paciente con Síndrome de Prader-Willi. El activador de la adenilato ciclasa se puede administrar a un sujeto obeso.
El activador de la adenilato ciclasa se puede administrar por vía oral, intravenosa, intratecal, intranasal, tópica, o en los pulmones. El activador de la adenilato ciclasa puede incluir, Forskolina, FD1, FD2, FD3, FD4, FD5 (NKH477), FD6, así como también combinaciones de estos fármacos.
El inhibidor de la PDE4 también se puede administrar junto con el activador de la adenilato ciclasa.
La presente invención también incluye administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agonista de MC4R. El agonista de MC4R se puede administrar a una célula o a un paciente con Síndrome de Prader-Willi. El agonista de MC4R se puede administrar a un sujeto obeso.
El agonista de MC4R se puede administrar por vía oral, intravenosa, intratecal, intranasal, tópica, o en los pulmones. El agonista de MC4R puede incluir RM-493 (Setmelanotide), TTP2515, derivados del 2-aminotiazol, MK-0493, y combinaciones de los mismos. El agonista de MC4R se puede administrar en combinación con los inhibidores de la PDE4 y/o activadores de la adenilato ciclasa que se describen en la presente descripción.
El tratamiento de la presente invención también incluye métodos en donde la administración resulta en una o más de las siguientes mejoras en el paciente: disminuye o alivia la hiperfagia; aumenta los niveles de PCSK1; aumenta el nivel y/o la actividad de la PCI; disminuye la proporción de proinsulina en la circulación a insulina, lo que aumenta por tanto la secreción de insulina; disminuye la proporción de progrelina en la circulación a grelina; disminuye la proporción en la circulación de POMC a ACTH; alivia el hipotiroidismo, disminuye la proporción en la circulación de prooxitocina a oxitocina, lo que aumenta por tanto la producción de oxitocina en el cerebro y aumenta la producción de alfa-MSH en el cerebro; disminuye la proporción en la circulación de pro-BDNF a BDNF (aumenta los niveles del cerebro de BDNF); y aumenta la proporción de prohormona: hormona (disminuye la hormona promadura); en donde los síntomas, niveles, o proporciones se refieren a los síntomas, niveles, o proporciones de la enfermedad del paciente.
En determinadas modalidades, el tratamiento del Síndrome de Prader-Willi (SPW) comprende administrar un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) a un sujeto que necesite el mismo, lo que alivia, elimina o previene por tanto uno o más síntomas del SPW.
En determinadas modalidades, la administración del PDE4i regula de forma positiva las concentraciones o la actividad del monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) en el sujeto.
En determinadas modalidades, el SPW se caracteriza por una disminución de la expresión de NHLH2.
En modalidades adicionales, la disminución de la expresión de NHLH2 da resulta en una disminución de la expresión de PCSK1.
En determinadas modalidades, el aumento de las concentraciones o la actividad del AMPc regula de forma positiva la expresión de Pcskl.
En modalidades adicionales, el PDE4i es un PDE4i selectivo. En modalidades adicionales, el PDE4i es un PDE4i no selectivo.
En determinadas modalidades, el PDE4i selectivo se selecciona de AN2728, apremilast, cilomilast, diazepam, ibudilast, luteolina, mesembrenona, piclamilast, roflumilast, rolipram, E6005, GSK356278 y MK0952.
En determinadas modalidades, el PDE4i no selectivo se selecciona de xantinas metiladas y derivados de las mismas, cafeína, aminofilina, 3-isobutil-1-metilxantina, paraxantina, pentoxifilina, teobromina, y teofilina.
En otras modalidades adicionales, uno o más síntomas incluyen hiperfagia, reducción de la tasa metabólica, obesidad, hipogonadismo, hipoadrenalismo, disminución de la producción de la hormona del crecimiento, tono muscular deficiente, trastornos del sueño, trastornos gastrointestinales, reducción de estamina, reducción de la capacidad para concentrarse, cognición deficiente, trastornos del comportamiento, ansiedad, retraso del crecimiento, reducción de la conversión de hormonas inmaduras a formas maduras y activas, y diabetes mellitus y diabetes insípida.
En determinadas modalidades, el tratamiento comprende además administrar uno o más agentes terapéuticos efectivos adicionales para tratar o aliviar uno o más síntomas del SPW.
En determinadas modalidades, las hormonas inmaduras comprenden una o más de insulina, grelina, GHRH, alfa-MSH, oxitocina, orexina, BDNF, vasopresina, NPY, AGRP, y gonadotropinas, ACTH.
En determinadas modalidades, uno o más agentes terapéuticos efectivos adicionales para tratar o aliviar el SPW incluyen insulina, un agonista del receptor de insulina, grelina, un agonista del receptor de grelina, GHRH, un agonista del receptor de GHRH, alfa-MSH, un agonista del receptor de alfa-MSH, oxitocina, un agonista del receptor de oxitocina, orexina, un agonista del receptor de orexina, BDNF, un agonista del receptor de BDNF, vasopresina, un agonista del receptor de vasopresina, NPY, un agonista del receptor de NPY, AGRP, un agonista del receptor de AGRP, gonadotropina, un receptor contra gonadotropina, o combinaciones de los mismos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un modelo que muestra cómo las deficiencias en Nhlh2 y la PC1 pueden impulsar los principales fenotipos neuroendocrinos del SPW. Una deficiencia en el procesamiento de las prohormonas que se debe al déficit en la producción de la PC1 y el NHLH2 puede explicar muchos de los principales fenotipos neuroendocrinos del SPW. Se plantea la hipótesis de que la pérdida paterna de SNORD116 puede ser suficiente para causar deficiencias en Nhlh2 y la PC1, lo que a su vez causa defectos funcionales en el procesamiento de las prohormonas. Las flechas/líneas que son discontinuas indican conexiones teóricas. Las flechas/líneas que son sólidas indican las vías que se han investigado.
La Figura 2 es un esquema que muestra el fundamento del tratamiento del SPW que utiliza agentes que aumentan los niveles celulares de AMPc con el fin de aumentar el nivel y/o la actividad de la PC1 celular y aumentar el procesamiento de las prohormonas.
Las Figuras 3A-P son gráficos que muestran que la regulación negativa de la PC1 en modelos del SPW se asocian con un procesamiento deficiente de las prohormonas; los niveles de transcripción de PCSK1 se pueden aumentar en los controles que no se afectan mediante el tratamiento con Forskolina.
La Figura 4 es un esquema que muestra el fundamento terapéutico para la coadministración de agonistas de MC4R y/o inhibidores de AgRP en combinación con Forskolina y/o Teofilina en individuos con SPW y posiblemente otros tipos de obesidad, que incluye la obesidad común.
Las Figuras 5A-H son gráficos que muestran que la aplicación de Forskolina, un agonista de la AC, eleva los niveles de transcripción de PCSKI/PcskI en neuronas primarias de ratón, neuronas que se derivan de iPSC, e islotes pancreáticos primarios de ratón.
Las Figuras 6A-F son gráficos que muestran que la aplicación de inhibidores de fosfodiesterasa a neuronas que se derivan de iPSC aumentan los niveles de transcripción de PCSKI y el procesamiento de las prohormonas. La Figura 6A: La Teofilina aumenta los niveles de transcripción de PCSKI en neuronas ARC hipotalámicas que se derivan de iPSC D34 (línea 1023A) a una concentración de 10 mM. La Figuras 6B-C: El Roflumilast aumenta los niveles de transcripción de PCSKI en neuronas que se derivan de iPSC en el día 40 de la diferenciación (línea 1043D3) a una concentración de 1 mM. La Figuras 6D-E: La combinación del tratamiento con Roflumilast (100 nM) y Forskolina (1 pM) aumenta los niveles de transcripción de PCSKI y aumenta el procesamiento de POMC a ACTH en concentraciones más bajas que cualquiera de los agentes solos, lo que sugiere un efecto aditivo o posiblemente sinérgico. La Figura 6F: El MK0952 que se aplica a 10 pM en combinación con Forskolina a 1 pM aumenta los niveles de transcripción de PCSKI ~ 2 veces en neuronas que se derivan de iPSC (línea 1043D3). Las Figuras 7A-B son gráficos que muestran que un único tratamiento con MK0952 aumenta la PcskI hipotalámica en ratones de tipo salvaje. La Figura 7A es un gráfico que muestra que los pesos corporales de todos los ratones que se usaron fueron comparables. La Figura 7B es un gráfico que muestra que el MK0952 que se administra por sonda oral en metilcelulosa al 10 % a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal aumenta los niveles hipotalámicos de PcskI en aproximadamente 25 %. El tratamiento con Forskolina a 25 mg/kg no resulta en un aumento de los niveles hipotalámicos de PcskI. La combinación del tratamiento con MK0952 (10 mg/kg) y Forskolina (25 mg/kg) también resulta en un aumento del 25 % en los niveles de transcripción hipotalámicos de PcskI, probablemente debido en gran parte a los efectos de MK0952.
Las Figuras 8A-C son esquemas, tablas y gráficos que muestran aspectos del diseño del ensayo clínico.
Descripción detallada
La presente descripción proporciona métodos para regular los niveles de la PC1 (prohormona convertasa 1) in vitro o in vivo. Los métodos se pueden usar para regular de forma positiva (aumentar la expresión) o aumentar los niveles y/o la actividad de la PC1. También se abarca en la presente descripción el tratamiento del Síndrome de Prader-Willi (SPW) y otras formas de obesidad. El tratamiento puede comprender la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de PDE4 y/o un activador de la adenilato ciclasa. También se espera que esto sea útil para tratar pacientes con Síndrome de Schaaf-Yang y Trastorno del Espectro Autista (Fabienne Schaller Frangoise Watrin Rachel Sturny Annick Massacrier Pierre Szepetowski Frangoise Muscatelli; Hum Mol Genet (2010) 19 (24): 4895-4905. DOI: https://doi.org/10.1093/hmg/ddg424: Green L, Fein D, Modahl C, Feinstein C, Waterhouse L, Morris M. Oxytocin and autistic disorder: alterations in peptide forms. Biol Psychiatry. 15 de octubre de 2001; 50(8):609-13.
Los mecanismos teóricos para aumentar los niveles/actividad celular de la prohormona convertasa I incluyen pero no se limitan a: (1) la regulación positiva a nivel de transcripción mediante la activación de promotores endógenos, (2) el aumento directo de la actividad enzimática de la PC1, (3) el aumento de las tasas de traducción de PCSKI a PC1, (4) la disminución de la degradación de la enzima/proteína PC1, un posible enfoque es mediante la disminución de los niveles (mediante el “bloqueo genético” de oligo antisentido, la inhibición tradicional de moléculas pequeñas, u otras) del inhibidor endógeno de la PC1, ProSAAS, (5) disminución de la degradación (objetivo de miARN, desintegración no mediada por sentido, niveles putativos de metilación de ARNm) de la transcripción de PCSKI, lo que aumenta por tanto la traducción, (6) la PC1 en sí misma se procesa de un zimógeno de 92 kDa a una enzima madura de 66 kDa, lo que aumenta por tanto los niveles de procesamiento de preproPC1 también podría tener utilidad terapéutica, y (7) administración de ADNc de PCSKI adicional a la célula por métodos de terapia génica, (8) administración de ARN de SNORD116 por métodos de terapia génica, y (9) administración directa de la enzima PC1 en la circulación y/o tejidos con terapias de reemplazo enzimático.
Los presentes hallazgos sugieren que las principales características neuroendocrinas del SPW probablemente se deben a la deficiencia funcional de la PC1. Ver la Figura 1. Como el gen que codifica para PC1, PCSKI, está intacto en el SPW, el aumento de los niveles de expresión y/o actividad de la PC1 en pacientes con SPW corregirá esta deficiencia funcional de la PC1. Farmacológicamente, este aumento en los niveles de la PC1 se puede alcanzar mediante la administración de agentes que aumentan los niveles del monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) o bloquean la degradación del AMPc.
Las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos (PDE) catalizan la hidrólisis de AMP cíclico y el GMP cíclico, lo que regula por tanto las concentraciones intracelulares de estos nucleótidos cíclicos, sus vías de señalización y, en consecuencia, una miríada de respuestas biológicas en la salud y la enfermedad. Maurice y otros. Advances in targeting cyclic nucleotide phosphodiesterases. Nat. Rev. Drug. Discov. 13(4):290-314 (2014). Las isoformas de la PDE4 se expresan altamente en células que regulan las respuestas inmunoinflamatorias y la remodelación tisular. Id. la inhibición de la PDE4 resulta en un aumento en los niveles de AMPc en la célula. Se dispone de un gran número de inhibidores de la PDE4. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de la PDE4 incluyen: Teofilina, Roflumilast, Apremilast, Ibudilast, GSK356278, MK0952, IBMX (3-isobutil-1-metilxantina), Mesembrenona, Rolipram, Piclamilast, Luteolina, Drotaverina, AN2728, Cilomilast, Diazepam, Luteolina, y E6005. Otros inhibidores de la fosfodiesterasa incluyen, xantinas metiladas y derivados (tales como cafeína, aminofilina, paraxantina, pentoxifilina, teobromina, y teofilina).
Los niveles de AMPc también se pueden aumentar mediante el uso de agentes que activan la adenilato ciclasa. Los ejemplos no limitantes de activadores de la adenilato ciclasa incluyen: Forskolina, FD1, FD2, FD3, FD4, FD5 (NKH477), y FD6.
Los inhibidores de la PDE4 y los activadores de la adenilato ciclasa se pueden denominar solos o en combinación como agentes terapéuticos.
Tabla 1A: Inhibidores de la PDE4 que se seleccionan
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(continuación)
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Tabla 2: Activadores de la adenilato ciclasa que se seleccionan
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Abreviaturas
ACTH: hormona adrenocorticotrópica.
AgRP: proteína que se relaciona con Agouti; una proteína que también se produce en el núcleo arqueado y es un agonista inverso en MC4R. ProAgRP se procesa a AgRP por la PC1.
AMPc: monofosfato de adenosina cíclico
GH: La grelina (la “hormona del hambre”), también conocida como lenomorelina (DCI), es una hormona peptídica que se produce por células enteroendocrinas en el fondo del estómago que funciona como un neuropéptido en el sistema nervioso central.
proGHRH: hormona liberadora de hormonas de procrecimiento.
GHRH: la hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH), también conocida como somatoliberina o por varios otros nombres en sus formas endógenas y como somatorelina (DCI) en su forma farmacéutica, es una hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GH). Es una hormona peptídica de 44 aminoácidos que se produce en el núcleo arqueado del hipotálamo.
PC1: La proproteína convertasa 1, también conocida como prohormona convertasa 1, prohormona convertasa 3, proproteína convertasa 3, neuroendocrina convertasa 1, o neuroendocrina convertasa 3, y con frecuencia se abrevia como PC1/3 es una enzima que en los humanos se codifica por el gen PCSK1. La PCI y la PC2, los productos de proteína de los genes PCSK1 y PCSK2, escinden diferencialmente muchas hormonas neuroendocrinas o endocrinas, que incluyen proopiomelanocortina, proinsulina, y proglucagón.
PC2: la proproteína convertasa 2 (PC2) también conocida como prohormona convertasa 2 o neuroendocrina convertasa 2 (NEC2) es una serina proteasa y proproteína convertasa PC2, como la proproteína convertasa I (PC1), es una enzima responsable de la primera etapa en la maduración de muchos péptidos neuroendocrinos a partir de sus precursores, tal como la conversión de proinsulina en intermediarios de insulina. Para generar la forma bioactiva de la insulina (y muchos otros péptidos), se requiere una segunda etapa que implica la eliminación de los residuos básicos C-terminales; esta etapa es mediada por carboxipeptidasas E y/o D. La PC2 juega sólo un papel menor en la primera etapa de la biosíntesis de insulina, pero un papel mayor en la primera etapa de la biosíntesis de glucagón en comparación con la PC1. La PC2 se une a la proteína neuroendocrina que se denomina 7B2, y si esta proteína no está presente, la proPC2 no se puede volver enzimáticamente activa.
7B2 logra esto mediante la prevención de la agregación de proPC2 a formas inactivables. El dominio C-terminal de 7B2 también inhibe la actividad de PC2 hasta que se escinde en formas inactivas más pequeñas. Por tanto, 7B2 es tanto un activador como un inhibidor de PC2. En humanos, la proproteína convertasa 2 se codifica por el gen PCSK2. Se relaciona con la enzima bacteriana subtilisina, y en total existen 9 genes diferentes similares a la subtilisina en mamíferos: furina, PACE4, PC4, PC5/6, PC7/8, PCSK9 y SKII/SIP.
PCSK1: el gen que codifica para PC1.
PCSK2: el gen que codifica para PC2.
POMC: Pro-opiomelanocortina (POMC) es un polipéptido precursor con 241 residuos de aminoácidos. La POMC se sintetiza en la hipófisis a partir del precursor polipeptídico preproopiomelanocortina (pre-POMC) de 285 aminoácidos de longitud, mediante la eliminación de una secuencia de péptido señal de 44 aminoácidos de longitud durante la traducción.
PDE4: fosfodiesterasa 4.
SPW: Síndrome de Prader Willi.
SNORD 116: SNORD116 (también conocido como HBII-85) es una molécula de ARN no codificante (ARNnc) que funciona en la modificación de otros ARN pequeños nucleares (ARNpn). Este tipo de ARN modificador se encuentra usualmente en el nucléolo de la célula eucariota, que es un sitio principal de biogénesis de ARNpn. Es conocido como ARN pequeño nucleolar (ARNpno) y también con frecuencia se denomina como ARN guía. SNORD116 pertenece a la clase de caja C/D de ARNpno que contiene los motivos de secuencia que se conservan conocidos como caja C (UGAUGA) y caja D (CUGA). La mayoría de los miembros de la familia de caja C/D funcionan dirigiendo la 2'-O-metilación específica del sitio de los sustratos de ARN. En el genoma humano, existen 29 copias que se repiten en tándem de SNORD116, en la región SPW del cromosoma 15. Además, otras especies de ARN no codificantes se codifican a partir del locus SNORD116, que incluye el ARN no codificante largo, 116HG, cinco pno-lncARN y dos spa-lncARN. El SNORD116 es un locus de ARN no codificante huérfano que carece de objetivos que se definen claramente. Los modelos de ratón que carecen de Snord116 paterno muestran síntomas similares al SPW humano, que incluyen la hiperfagia y la deficiencia del crecimiento.
Dispositivos/inhaladores DPI: inhaladores de polvo seco; típicamente de mano.
Dispositivos MDI: inhaladores de medición de dosis; típicamente de mano.
a-MSH: es un ligando endógeno del receptor de melanocortina 4.
MC2R: receptor de melanocortina 2.
MC4R: receptor de melanocortina 4.
WT: tipo salvaje.
Definiciones
El término “portador farmacéuticamente aceptable”, como se usa en la presente descripción significa que una composición de material o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un relleno, diluyente, excipiente, solvente o material encapsulante líquido o sólido, implica llevar o transportar un agente químico. Los ingredientes diluyentes o portadores no deben ser tales que disminuyan los efectos terapéuticos del compuesto(s) activo(s).
El término “composición”, como se usa en la presente descripción significa que un producto resulta de la mezcla o combinación de más de un elemento o ingrediente.
El “tratar” o “tratamiento” de un estado, trastorno o afección incluye:
(1) Prevenir o retrasar la aparición de síntomas clínicos del estado, trastorno, o afección que se desarrolla en una persona que se puede afligir o predisponer al estado, trastorno, o afección pero que aún no experimenta o muestra síntomas clínicos del estado, trastorno, o afección; o
(2) inhibir el estado, trastorno o afección, es decir, detener, reducir o retrasar el desarrollo de la enfermedad o una recaída de la misma (en caso de tratamiento de mantenimiento) o al menos un síntoma clínico, signo, o prueba de la misma; o
(3) aliviar la enfermedad, es decir, causa que la regresión del estado, trastorno o afección o al menos uno de sus síntomas o signos clínicos o subclínicos.
El beneficio para un sujeto a tratar es estadísticamente significativo o al menos perceptible para el paciente o el médico.
El “Paciente” o “sujeto” se refiere a mamíferos e incluye sujetos humanos y veterinarios.
Los “inhibidores” y “antagonistas”, o “activadores” y “agonistas”, se refieren a moléculas inhibidoras o activadoras, respectivamente, por ejemplo, para la activación de, por ejemplo, un ligando, receptor, cofactor, un gen, célula, tejido, u órgano. Un modulador de, por ejemplo, un gen, un receptor, un ligando, o una célula, es una molécula que altera la actividad del gen, receptor, ligando, o célula, donde la actividad se puede activar, inhibir, o alterar en sus propiedades de regulación. El modulador puede actuar solo, o puede usar un cofactor, por ejemplo, una proteína, ion metálico, o molécula pequeña. Los inhibidores son compuestos que disminuyen, bloquean, previenen, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan o regulan de forma negativa, por ejemplo, un gen, proteína, ligando, receptor, o célula. Los activadores son compuestos que aumentan, activan, facilitan, potencian la activación, sensibilizan, o regulan de forma positiva, por ejemplo, un gen, proteína, ligando, receptor, o célula. Un inhibidor también se puede definir como un compuesto que reduce, bloquea, o inactiva una actividad constitutiva. Un “agonista” es un compuesto que interactúa con un objetivo para causar o promover un aumento en la activación del objetivo. Un “antagonista” es un compuesto que se opone a las acciones de un agonista. Un antagonista previene, reduce, inhibe, o neutraliza la actividad de un agonista. Un antagonista también puede prevenir, inhibir, o reducir la actividad constitutiva de un objetivo, por ejemplo, un receptor objetivo, incluso donde no existe un agonista identificado.
Para examinar el grado de inhibición, por ejemplo, muestras o ensayos que comprenden una determinada, por ejemplo, proteína, gen, célula, u organismo, se tratan con un activador o inhibidor potencial y se comparan con muestras control sin el inhibidor. A las muestras control, es decir, muestras que no se tratan con antagonista, se les asigna un valor de actividad relativa del 100 %. La inhibición se alcanza cuando el valor de actividad con respecto al control es aproximadamente 90 % o menos, típicamente 85 % o menos, más típicamente 80 % o menos, muy típicamente 75 % o menos, generalmente 70 % o menos, más generalmente 65 % o menos, muy generalmente 60 % o menos, típicamente 55 % o menos, usualmente 50 % o menos, más usualmente 45 % o menos, muy usualmente 40 % o menos, preferentemente 35 % o menos, con mayor preferencia 30 % o menos, aún con mayor preferencia 25 % o menos, y con la máxima preferencia menos de 25 %. La activación se alcanza cuando el valor de actividad con respecto al control es aproximadamente 110 %, generalmente al menos 120 %, con mayor generalidad al menos 140 %, con mayor generalidad al menos 160 %, con frecuencia al menos 180 %, con mayor frecuencia al menos 2 veces, con la máxima frecuencia al menos 2,5 veces, usualmente al menos 5 veces, más usualmente al menos 10 veces, preferentemente al menos 20 veces, con mayor preferencia al menos 40 veces, y con la máxima preferencia 40 veces más alto.
La dosificación de la formulación terapéutica variará ampliamente, en dependencia de la naturaleza de la enfermedad, la historia médica del paciente, la frecuencia de administración, la forma de administración, la eliminación del agente del hospedador, y similares. La dosis inicial puede más grande, seguida de dosis de mantenimiento más pequeñas. La dosis se puede administrar con tan poca frecuencia como semanalmente o cada dos semanas, o se fracciona en dosis más pequeñas y se administrar diariamente, dos veces por semana, etc., para mantener un nivel de dosificación efectivo. En algunos casos, la administración oral requerirá una dosis más alta que si se administra por vía intravenosa. En algunos casos, la administración tópica incluirá la aplicación varias veces al día, como sea necesario, por un número de días o semanas con el fin de proporcionar una dosis tópica efectiva.
El término “portador” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el que se administra el compuesto. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, que incluyen aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de olivo, aceite de sésamo y similares. El agua o solución acuosa, las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol se emplean preferentemente como portadores, particularmente para soluciones inyectables. Alternativamente, el portador puede ser un portador en forma sólida de dosificación, que incluye, pero no se limita a uno o más de un aglutinante (para píldoras que se comprimen), un deslizante, un agente encapsulante, un saborizante y un colorante. Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en “Remington's Pharmaceutical Sciences” de E. W. Martin.
Las composiciones terapéuticas que se describen en la presente descripción se pueden administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, que incluye, sin limitación, la administración intranasal, oral, transdérmica, ocular, intraperitoneal, por inhalación, intravenosa, ICV, inyección o infusión intracisternal, subcutánea, implante, vaginal, sublingual, uretral (por ejemplo, supositorio uretral), subcutánea, intramuscular, intravenosa, rectal, sublingual, mucosal, oftálmica, espinal, intratecal, intraarticular, intraarterial, subaracnoidea, bronquial o linfática. La formulación tópica puede estar en forma de gel, ungüento, crema, aerosol, etc; la formulación intranasal se puede administrar como un pulverizador o en una gota; la formulación transdérmica se puede administrar mediante un parche transdérmico o iontorforesis; o, las formulaciones de inhalación se pueden administrar mediante el uso de un nebulizador o dispositivo similar. Las composiciones también pueden tomar la forma de tabletas, píldoras, cápsulas, semisólidos, polvos, formulaciones de liberación sostenida, soluciones, suspensiones, elixires, aerosoles, o cualquier otra composición apropiada.
Para preparar tales composiciones farmacéuticas, se pueden mezclar uno o más inhibidores de la PDE4 y/o uno o más activadores de la adenilato ciclasa, y/o uno o más agonistas de MC4R junto con un portador, adyuvante y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, de acuerdo con las técnicas convencionales de composiciones farmacéuticas. Los portadores farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en las presentes composiciones abarcan cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar, tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua y emulsiones, tales como una emulsión de aceite/agua o agua/aceite, y varios tipos de agentes humectantes. Las composiciones pueden contener adicionalmente excipientes farmacéuticos sólidos tales como almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo y similares. Los excipientes líquidos y semisólidos se pueden seleccionar de glicerol, propilenglicol, agua, etanol y varios aceites, que incluyen aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, etc. Los portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables, incluyen agua, solución salina, dextrosa acuosa, y glicoles. Para ejemplos de portadores, estabilizadores y adyuvantes, ver Remington's Pharmaceutical Sciences, editado por E. W. Martin (Mack Publishing Company, 18a ed., 1990). Las composiciones también pueden incluir estabilizadores y conservantes.
Como se usa en la presente descripción, el término “cantidad terapéuticamente efectiva” es una cantidad suficiente para tratar un trastorno o enfermedad específico o alternativamente, para obtener una respuesta farmacológica para tratar un trastorno o enfermedad in vitro o in vivo en un mamífero tal como un paciente humano o no humano. Los métodos para determinar los medios y la dosificación de administración más efectivas pueden variar con la composición que se usa para la terapia, el propósito de la terapia, la célula objetivo que se trata, y el sujeto que se trata. Las dosificaciones de tratamiento generalmente se pueden ajustar para optimizar la seguridad y la eficacia. Se pueden llevar a cabo administraciones únicas o múltiples con el nivel de dosis y el patrón que se selecciona por el médico que trata. Las formulaciones de dosificación adecuadas y los métodos de administración de los agentes se pueden determinar fácilmente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la composición se administra de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, o de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg. Cuando los compuestos que se describen en la presente descripción se coadministran con otro agente o terapia, la cantidad efectiva puede ser menor que, igual a o mayor que cualquier agente que se usa solo.
Las formulaciones transdérmicas se pueden preparar mediante la incorporación del agente activo en un portador tixotrópico o gelatinoso tal como un medio celulósico, por ejemplo, metilcelulosa o hidroxietilcelulosa, con la formulación que resulta que luego se empaca en un dispositivo transdérmico adaptado para asegurarse en contacto dérmico con la piel de un usuario. Si la composición es en forma de un gel, la composición se puede frotar sobre una membrana del paciente, por ejemplo, la piel, preferentemente piel intacta, limpia, y seca, del hombro o la parte superior del brazo y/o la parte superior del torso, y se mantiene sobre el mismo por un período de tiempo suficiente para la administración del inhibidor de la PDE4 y/o el activador de la adenilato ciclasa al suero sanguíneo del paciente. La composición de la presente invención en forma de gel se puede contener en un tubo, una bolsita, o una bomba de medición. Tal tubo o sobre puede contener una dosis unitaria, o más de una dosis unitaria, de la composición. Una bomba de medición puede ser capaz de dispensar una dosis que se mide de la composición.
Esta invención también proporciona las composiciones como se describen anteriormente para administración intranasal. Como tal, las composiciones pueden comprender además un potenciador de la penetración. Southall y otros. Developments in Nasal Drug Delivery. 2000. El inhibidor de la PDE4 y/o el activador de la adenilato ciclasa se pueden administrar por vía intranasal en una forma líquida tal como una solución, una emulsión, una suspensión, gotas, o en una forma sólida tal como un polvo, gel, o ungüento. Los dispositivos para administrar medicamentos intranasales son bien conocidos en la técnica. La administración de fármacos por vía nasal se puede llevar a cabo mediante el uso de dispositivos que incluyen, pero no se limitan a, inhaladores intranasales, dispositivos de pulverización intranasal, atomizadores, frascos de pulverización nasal, recipientes de dosis unitaria, bombas, goteros, frascos exprimibles, nebulizadores, inhaladores de medición de dosis (MDI), inhaladores de dosis presurizada, insufladores, y dispositivos bidireccionales. El dispositivo de administración nasal se puede medir para administrar una cantidad de dosificación efectiva precisa a la cavidad nasal. El dispositivo de administración nasal puede ser para la administración de una única unidad o la administración de múltiples unidades. En un ejemplo específico, el atomizador electrónico ViaNase de Kurve Technology (Bethell, Washington) se puede usar en esta invención (http://www.kurvetech.com). Los compuestos de la presente invención también se pueden administrar a través de un tubo, un catéter, una jeringa, un paquete, una compresa, un tampón nasal o mediante infusión submucosa. Publicaciones de patente de los Estados Unidos Números 20090326275, 20090291894, 20090281522 y 20090317377.
El inhibidor de la PDE4 y/o el activador de la adenilato ciclasa se pueden formular como aerosoles mediante el uso de procedimientos estándar. El inhibidor de la PDE4 y/o el activador de la adenilato ciclasa se pueden formular con o sin solventes, y se formulan con o sin portadores. La formulación puede ser una solución, o puede ser una emulsión acuosa con uno o más surfactantes. Por ejemplo, una pulverización de aerosol se puede generar de un recipiente presurizado con un propulsor adecuado, tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, hidrocarburos, aire comprimido, nitrógeno, dióxido de carbono, u otro gas adecuado. La unidad de dosificación se puede determinar al proporcionar una válvula para administrar una cantidad que se mide. Los dispensadores de pulverización con bomba pueden dispensar una dosis que se mide o una dosis que tiene un tamaño de partícula o gota específico. Como se usa en la presente descripción, el término “aerosol” se refiere a una suspensión de partículas finas sólidas o gotas de solución líquida en un gas. Específicamente, el aerosol incluye una suspensión de gotas provenientes de un inhibidor de la PDE4 y/o del activador de la adenilato ciclasa que se puede producir en cualquier dispositivo adecuado, tal como un MDI, un nebulizador o un pulverizador de niebla. El aerosol también incluye una composición de polvo seco de la composición de la presente invención que se suspende en aire u otro gas portador. Gonda (1990) Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313. Raeburn y otros, (1992) Pharmacol. Toxicol. Methods 27:143-159.
El inhibidor de la PDE4 y/o el activador de la adenilato ciclasa se pueden administrar en la cavidad nasal como un polvo en una forma tal como microesferas que se administran por un insuflador nasal. El inhibidor de la PDE4 y/o el activador de la adenilato ciclasa se pueden absorber en una superficie sólida, por ejemplo, un portador. El polvo o las microesferas se pueden administrar en forma seca, dispensable en aire. El polvo o las microesferas se pueden almacenar en un recipiente del insuflador. Alternativamente, el polvo o las microesferas se pueden rellenar en una cápsula, tal como una cápsula de gelatina, u otra unidad de dosis única que se adapta para la administración nasal.
La composición farmacéutica se puede administrar a la cavidad nasal mediante la colocación directa de la composición en la cavidad nasal, por ejemplo, en forma de un gel, un ungüento, una emulsión nasal, una loción, una crema, un tampón nasal, un gotero, o una tira bioadhesiva. En determinadas modalidades, puede ser deseable prolongar el tiempo de estancia de la composición farmacéutica en la cavidad nasal, por ejemplo, para potenciar la absorción. Por tanto, la composición farmacéutica se puede formular opcionalmente con un polímero bioadhesivo, una goma (por ejemplo, goma xantana), quitosano (por ejemplo, polisacárido catiónico altamente purificado), pectina (o cualquier carbohidrato que espese como un gel o emulsione cuando se aplica a la mucosa nasal), una microesfera (por ejemplo, almidón, albúmina, dexirano, ciclodextrina), gelatina, un liposoma, carbámero, alcohol polivinílico, alginato, goma arábiga, quitosanos y/o celulosa (por ejemplo, metilo o propilo; hidroxilo o carboxilo; carboximetilo o hidroxilpropilo).
La composición que contiene el inhibidor de la PDE4 y/o el activador de la adenilato ciclasa se puede administrar por inhalación oral en el tracto respiratorio, es decir, los pulmones.
Los sistemas de administración típicos para agentes inhalables incluyen inhaladores de nebulización, inhaladores de polvo seco (DPI), e inhaladores de dosis que se miden (MDI).
Los dispositivos nebulizadores producen una corriente de aire a alta velocidad que causa que un agente terapéutico en forma de líquido se pulverice como niebla. El agente terapéutico se formula en una forma líquida tal como una solución o una suspensión de partículas de tamaño adecuado. En una modalidad, las partículas se micronizan. El término “micronizado” se define como que tiene aproximadamente el 90 % o más de las partículas con un diámetro menor que aproximadamente 10 mm. Los dispositivos nebulizadores adecuados se proporcionan comercialmente, por ejemplo, por PARI GmbH (Starnberg, Alemania). Otros dispositivos nebulizadores incluyen Respimat (Boehringer Ingelheim) y aquellos que se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Números 7,568,480 y 6,123,068, y WO 97/12687. El inhibidor de la PDE4 y/o el activador de la adenilato ciclasa se pueden formular para su uso en un dispositivo nebulizador como una solución acuosa o como una suspensión líquida.
Los dispositivos DPI administran típicamente un agente terapéutico en forma de un polvo de flujo libre que se puede dispersar en la corriente de aire en un paciente durante la inspiración. Los dispositivos DPI que usan una fuente de energía externa también se pueden usar en la presente invención. Con el objetivo de alcanzar un polvo de flujo libre, el agente terapéutico se puede formular con un excipiente adecuado (por ejemplo, lactosa). Se puede confeccionar una formulación de polvo seco, por ejemplo, mediante la combinación de lactosa seca que tiene un tamaño de partícula entre aproximadamente 1 pm y 100 pm con partículas que se micronizan de los presentes compuestos y se mezcla en seco. Alternativamente, los presentes compuestos se pueden formular sin excipientes. La formulación se carga en un dispensador de polvo seco, o en cartuchos o cápsulas de inhalación para su uso con un dispositivo de administración de polvo seco. Los ejemplos de dispositivos DPI que se proporcionan comercialmente incluyen Diskhaler (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, N.C.) (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 5,035,237); Diskus (GlaxoSmithKline) (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 6,378,519; Turbuhaler (AstraZeneca, Wilmington, Del.) (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 4,524,769); y Rotahaler (GlaxoSmithKline) (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 4,353,365). Ejemplos adicionales de dispositivos DPI adecuados se describen en las Patentes de los Estados Unidos Número 5,415,162, 5,239,993 y 5,715,810 y referencias en las mismas.
Los dispositivos MDI descargan típicamente una cantidad que se mide de agente terapéutico mediante el uso de gas propulsor que se comprime. Las formulaciones para la administración de MDI incluyen una solución o suspensión del ingrediente activo en un propulsor licuado. Ejemplos de propulsores incluyen hidrofluoroalcanos (HFA), tales como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HfA 134a) y 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoro-n-propano, (HFA 227), y clorofluorocarbonos, tal como CCla F. Los componentes adicionales de las formulaciones de HFA para la administración de MDI incluyen cosolventes, tales como etanol, pentano, agua; y surfactantes, tales como trioleato de sorbitán, ácido oleico, lecitina, y glicerina. (Ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Número 5,225,183, EP 0717987, y WO 92/22286). La formulación se carga en un frasco de aerosol, que forma parte de un dispositivo MDI. Se proporcionan ejemplos de dispositivos MDI que se desarrollan específicamente para su uso con propulsores HFA en las Patentes de los Estados Unidos Número 6,006,745 y 6,143,227. Para ejemplos de procesos de preparación de formulaciones adecuadas y dispositivos adecuados para dosificación por inhalación ver las Patentes de los Estados Unidos Número 6,268,533, 5,983,956, 5,874,063 y 6,221,398, y WO 99/53901, WO 00/61108, WO 99/55319 y WO 00/30614.
El inhibidor de la PDE4 se puede encapsular en liposomas o microcápsulas para su administración mediante inhalación. Un liposoma es una vesícula que se compone por una membrana de bicapa lipídica y un interior acuoso. La membrana lipídica se puede confeccionar por fosfolípidos, ejemplos de los cuales incluyen fosfatidilcolina tal como lecitina y lisolecitina; fosfolípidos ácidos tales como fosfatidilserina y fosfatidilglicerol; y esfingofosfolípidos tales como fosfatidiletanolamina y esfingomielina. Alternativamente, se puede añadir colesterol. Una microcápsula es una partícula revestida con un material de revestimiento. Por ejemplo, el material de revestimiento puede consistir en una mezcla de un polímero formador de película, un plastificante hidrófobo, un agente de activación superficial y/o un polímero lubricante que contiene nitrógeno. Las Patentes de los Estados Unidos Número 6,313,176 y 7,563,768. El inhibidor de la PDE4 y/o el activador de la adenilato ciclasa pueden ser dados solos o en combinación con otros fármacos para el tratamiento de las enfermedades anteriores durante un período de tiempo corto o prolongado, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 60 días o 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o continuamente durante la vida del paciente. Las presentes composiciones se pueden administrar a un mamífero, preferentemente a un paciente humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, conejos, simios, bovinos, ovinos, porcinos, caninos, felinos, animales de granja, animales deportivos, mascotas, equinos, y primates.
Los siguientes son ejemplos no limitativos.
Ejemplo 1
Manipulación de la expresión y la actividad de la PC1 en neuronas hipotalámicas y células p que se derivan de iPSG La activación de la ciclasa por Forskolina y/o la inhibición del catabolismo del AMPc por la inhibición de la fosfodiesterasa (Teofilina, IBMX) aumentará los niveles de la PC1 en modelos in vitro del SPW con los aumentos consecuentes en el procesamiento de las prohormonas. La identificación de una deficiencia aparente de múltiples tejidos en PCSK1 en modelos in vivo e in vitro del SPW establece un objetivo terapéutico racional que puede aliviar los principales síntomas neuroendocrinos del SPW (Figura 1).
La región del promotor del gen PCSK1 contiene dos elementos de respuesta de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) (Conkright y otros, 2003; Udupi y otros, 1998). Los agentes que aumentan los niveles celulares de AMPc aumentan el ARNm de PCSK1 y aumentan la secreción de prohormonas que se procesan por la PC1 (Figura 2) (Udupi 1998). La Forskolina y la Teofilina son dos fármacos aprobados por la FDA con perfiles de tratamiento generalmente seguros en poblaciones pediátricas. La Forskolina se une a la adenilato ciclasa cerca de su dominio catalítico a través de interacciones hidrófobas y enlaces de hidrógeno (Tang y Hurley 1998, Tesmer y otros, 1999). La unión de Forskolina causa que la conformación de la adenilato ciclasa cambie a su forma activa, lo que aumenta por tanto la actividad de AC y aumenta los niveles celulares de AMPc (Onda y otros, 2001). La Teofilina y otros inhibidores de la fosfodiesterasa 4 (PDE4), tal como MK0952, aumentan los niveles celulares de AMPc al bloquear su degradación.
Los ejemplos no limitantes de inhibidores de la PDE4 incluyen Teofilina, MK0952, así como también los otros inhibidores de la PDE en las Tablas 1A-B. Los ejemplos no limitantes de activadores de la adenilato ciclasa (AC) incluyen Forskolina y los activadores en la Tabla 2.
Los agentes que se pueden usar en el presente método también incluyen agentes que pueden modificar la actividad de la proteína G, tales como activadores o inhibidores de la proteína G, así como también agonistas de receptores acoplados a la proteína G.
El NHLH2 y el PCSK1 se regulan de forma negativa en la microdeleción y la gran deleción del SPW en neuronas que se derivan de iPSC, como es mostrado por la secuenciación de ARN (Figuras 3A, 3C). Figura 3A: El NHLH2 se regula de forma negativa en la microdeleción y la gran deleción del SPW en neuronas que se derivan de iPSC en comparación con los controles que no se afectan. Figura 3B: La proteína NHLH2 se regula de forma negativa >90 % en la microdeleción y la gran deleción del SPW en neuronas que se derivan de iPSC en comparación con los controles que no se afectan. Figuras 3C-D: La transcripción de PCSKI y su producto de proteína, la PC1, se regula de forma negativa > 55 % y >80 %, respectivamente, en la microdeleción y la gran deleción del SPW en neuronas que se derivan de iPSC en comparación con los controles que no se afectan. Figuras 3E-F: Los ratones en los que solo se ha eliminado la copia paterna de Snord116 (el resto de la región SPW está intacta) presentan >40 % de regulación negativa de la proteína PC1 y PC2 en islotes aislados. Figura 3G: La proinsulina depende de la PC1 para su procesamiento adecuado. Existe una deficiencia funcional en el procesamiento de proinsulina en ratones Snord116p-Im+ en comparación con los compañeros de camada de WT a los 30 minutos siguiendo la inyección de glucosa. Figura 3H: Existe un aumento del 60 % en la proporción de proinsulina a insulina en el plasma de individuos con SPW en comparación con los controles correspondientes de edad e IMC en ayunas, lo que indica un defecto en el procesamiento de proinsulina a insulina. El efecto es menor que el que se ve en un paciente con una mutación de la PC1, consistente con la reducción de ~ 50 % de la PC1 en los modelos del SPW. Figura 3I: La progrelina también se procesa por la PC1; el procesamiento de la progrelina es deficiente en los lisados del estómago de los ratones Snord116p-Im+ en comparación con los compañeros de camada de WT. Los lisados del estómago de ratones sin la PC1 se incluyen como control positivo para el procesamiento de progrelina deficiente. Figura 3J: El procesamiento de ProGHRH también puede ser deficiente en los lisados hipotalámicos de ratones Snord116p-Im+ en comparación con los compañeros de camada de WT, p=0,06. El procesamiento deficiente de proGHRH se asocia con baja GH en circulación y el enanismo en ratones sin la PC1. El Snord116p-Im+ también presenta una GH baja y un enanismo grave. Figura 3K: Los datos preliminares sugieren que el tratamiento de neuronas hipotalámicas que se derivan de iPSC de controles que no se afectan con Forskolina (FSK) puede aumentar los niveles de transcripción de PCSK1 de una manera dependiente de la dosis. Los niveles de transcripción de POMC pueden no afectarse. Figura 3L: El tratamiento de células p que se derivan de iPSC de controles que no se afectan con Forskolina aumentan los niveles de transcripción de PCSK1. Los niveles de transcripción de SNORD116 e INS se pueden afectar mínimamente. Figura 3M: Los niveles de transcripción de Pcsk1 disminuyen un 41 % en el Snord116p-/m+ hipotalámico en ayunas; no existen diferencias en los niveles de Pcsk1 en la realimentación. Figura 3N: Los niveles de transcripción de Nhlh2 disminuyen tanto en ayunas como después de la realimentación en el Snord116p-Im+ hipotalámico en comparación con los compañeros de camada de WT. Figuras 3O-P: Los niveles de transcripción de Agrp y Npy aumentan en el Snord116p-Im+ hipotalámico en la realimentación en comparación con los WT. Los experimentos independientes de seguimiento confirmaron estos cambios mediante QPCR (expresión del gen) y transferencia Western (nivel de proteína) (Figuras 3B, 3D). Los individuos con SPW exhiben una disminución en los niveles de insulina en ayunas en comparación con los controles correspondientes de edad e IMC. Se planteó la hipótesis de que esto se puede deber a un procesamiento deficiente de proinsulina. Los presentes datos ilustran que en un modelo de ratón con SPW, en el que solo se elimina la copia paterna de Snord116, los niveles de proteína de la PC1 y la PC2 disminuyen en islotes aislados y se asocian con una deficiencia funcional en el procesamiento de proinsulina a insulina (Figuras 3E-3G). El procesamiento de la proinsulina también es deficiente (p=0,089) en el plasma de pacientes humanos con SPW en comparación con los controles correspondientes de edad, IMC en ayunas (Figura 3H). Se incluyó el plasma de un paciente en ayunas que albergaba una mutación de la PC1 como control positivo para el procesamiento deficiente de proinsulina.
La hipergrelinemia de los pacientes con SPW es un fenotipo único que se puede asociar con un procesamiento deficiente de progrelina a grelina madura. De hecho, los presentes resultados ilustran que el procesamiento de progrelina a grelina madura fue deficiente en los lisados del estómago de los ratones Snord116p-Im+ en comparación con compañeros de camada de WT (Figura 3I). Se incluyeron lisados del estómago de ratones sin la pC1 como control positivo para el procesamiento deficiente de progrelina.
Como los individuos con SPW, los pacientes con mutación de la PC1 tienen una disminución en los niveles de GH en circulación. Los ratones sin la PC1 tienen un enanismo grave y una disminución de la GH en circulación asociada con un procesamiento deficiente de proGHRH a GHRH. Se encontró que los ratones Snord116p-Im+, que también son enanos y tienen una baja GH en circulación, tienden hacia el procesamiento deficiente de proGHRH a GHRH en los lisados hipotalámicos (Figura 3J).
Como se describe en la Figura 2, la identificación de una disminución en la PC1 y un procesamiento deficiente de las prohormonas en el SPW sugiere una teoría molecular unificada que puede tener en cuenta muchas de las características neuroendocrinas de la enfermedad. Por tanto, los agentes que aumentan la actividad de la PC1 y, por lo tanto, aumentan el procesamiento de las prohormonas, representan una terapia racional y que se dirige a las principales características neuroendocrinas del SPW.
La Forskolina es conocida por aumentar los niveles celulares de Pcskl y puede aumentar el procesamiento de las prohormonas. Se aplicó Forskolina a neuronas y células p que se derivan de iPSC sin SPW y los resultados ilustran que los niveles de transcripción de PCSK1 aumentaron en comparación con las células sin tratar (Figuras 3K-L). Se llevarán a cabo estudios en neuronas y células p que se derivan de SPW.
La respuesta de los niveles de transcripción de PCSK1, los niveles de proteína de la PC1, y los niveles de procesamiento de las prohormonas relevantes se probarán en sistemas modelo in vitro e in vivo. Se tratarán las neuronas hipotalámicas control que no se afectan y las que se derivan de iPSC con niveles graduados de Forskolina, Teofilina y Forskolina Teofilina y se medirán la transcripción y la proteína de la PC1, la transcripción y la proteína de POMC, así como también los niveles de proteína de los productos que se procesan de POMC, que incluye: a-MSH, p-endorfina, y ACTH. Estos péptidos se cuantificarán en lisados de células totales, así como también los niveles que se secretan en el medio celular. Las células se tratarán con diferentes concentraciones de Forskolina y Teofilina con el fin de determinar si los niveles de las PC1 se pueden aumentar de una manera dependiente de la dosis y con el fin de identificar un intervalo de dosificación óptimo para aumentar los niveles de la PC1 y el procesamiento de POMC. También se probarán en estos ensayos otros inhibidores de la PDE4 y la adenilato ciclasa (ver, Tablas 1A-B y 2).
Se realizará la secuenciación de ARN por lotes y/o la secuenciación de ARN de una única célula para identificar otras transcripciones que son las que más se afectan por los tratamientos farmacológicos. Se espera que este enfoque prediga los efectos fuera del objetivo tras el tratamiento in vivo. La secuenciación de ARN de una única célula se informará especialmente con respecto a los aumentos de la transcripción de PCSK1 siguiendo el tratamiento en neuronas que expresan POMC. Otros activadores de la adenilato ciclasa e inhibidores de la PDF4 (Tablas 1A-B, 2) se probarán en neuronas hipotalámicas que se derivan de iPSC siguiendo el mismo protocolo de estudio que se describe anteriormente.
Se diferenciará iPSC del control que no se afecta y el SPW (deleción grande y mínima) de células p que se derivan de iPSC. Se tratarán las células p que se derivan de iPSC con Forskolina, Teofilina y Forskolina Teofilina y se medirán los niveles de la PC1 a nivel de la transcripción y la proteína. También se medirán los niveles de transcripción de INS, así como también los niveles de proteína de proinsulina, insulina, y péptido c de lisados de células totales, así como también las concentraciones de las proteínas que se secretan por las células p en el medio. Estas células se pueden trasplantar en ratones desnudos para permitir su maduración; estas células se pueden probar in vivo para el procesamiento de insulina; las células que se escinden se probarán como se describe. También se usarán islotes humanos aislados de individuos no diabéticos, no obesos (disponibles para nosotros a través del Registro Nacional de Donantes de Páncreas) para probar los efectos de la Forskolina, la Teofilina, y la Forskolina Teofilina sobre los niveles de la PC1 en islotes pancreáticos humanos completamente maduros.
Ejemplo 2
Fisiología molecular confirmatoria del metabolismo de la PC1 en ratones Snord116p-/m+,Pc1~/- y Pc1+/~.
El aumento de los niveles de AMPc mediante la activación de la adenilato ciclasa (AC) y la inhibición concurrente de la PDE aumentará los niveles de la PC1 en modelos ex vivo e in vivo del SPW y, en consecuencia, puede aumentar el procesamiento de las prohormonas en el modelo de ratón Snord116p-/m+ con el SPW. Debido a que los ratones con una deleción paterna de Snord116 (un modelo de ratón con el SPW) tienen un procesamiento deficiente de proinsulina a insulina que se asocia con reducciones en la transcripción de la PC1 y la proteína, se aislarán islotes de ratones de tipo salvaje (WT) y Snord116p-/m+ y se analizarán las respuestas de estas células a la Forskolina, la Teofilina, y la Forskolina Teofilina. Se realizarán las mismas manipulaciones y mediciones que para las células p que se derivan de iPSC. Si el procesamiento de proinsulina se puede rescatar en islotes aislados de ratones Snord116p-/m+ en comparación con los compañeros de camada de WT, luego las investigaciones del rescate del procesamiento de proinsulina en ratones Snord116p-/m+ que se tratan con Forskolina, Teofilina y Forskolina Teofilina, in vivo se llevarán a cabo.
Los presentes resultados ilustran que los ratones Snord116p-/m+ tienen reducciones en el procesamiento de proinsulina a insulina que se asocian con una reducción de contenido de la PC1 y la PC2 en los islotes (Figuras 3E-G). Además, el procesamiento de progrelina también es deficiente en los estómagos de ratones Snord116p-/m+ así como también el procesamiento de proGHRH a GHRH en el hipotálamo de ratones Snord116p-/m+ en comparación con compañeros de camada de WT (Figuras 3I-J). Además, la proporción de proinsulina a insulina se eleva en individuos en ayunas con SPW en comparación con los controles correspondientes de edad e IMC, lo que sugiere una deficiencia en el procesamiento de proinsulina a insulina (Figura 3H).
Los islotes aislados de ratones heterocigotos y sin Pc1 se incluirán como un control para el procesamiento deficiente de proinsulina, así como también predicción de una respuesta negativa al tratamiento farmacológico. Los niveles periféricos de glucosa, proinsulina, insulina, y péptido c se medirán en ayunas, y 15, 30, 60, y 120 minutos seguido de la inyección de glucosa intraperitoneal. Se establecerá empíricamente la duración óptima del tratamiento farmacológico en ratones Snord116p~/m+ y de WT antes de las medidas periféricas de procesamiento de proinsulina. También se incluirán ratones sin Pc1 y heterocigotos como un control para el procesamiento deficiente de proinsulina en experimentos in vivo. Los períodos de tiempo iniciales para las pruebas serán de 3 días, 1 semana, y 1 mes. También se probarán varios métodos de administración de fármacos.
Se desarrollarán ensayos que pueden distinguir entre progrelina y grelina madura y, se puede usar por tanto para medir el procesamiento de progrelina en la circulación tanto para humanos como para ratones. Se medirá el procesamiento de progrelina siguiendo los tratamientos farmacológicos in vivo que se describen anteriormente en animales Snord116p-/m+, sin PC1, heterocigotos a la PC1, y WT.
El hipotálamo de ratones Snord116p-/m+ de WT, y sin Pc1 y heterocigotos a la Pc1 que se tratan con Forskolina, Teofilina, y Forskolina Teofilina, y los niveles que se miden de proteínas de la PC1, POMC, a-MSH, p-endorfina, y ACTH se analizarán con el fin de evaluar si el tratamiento in vivo puede afectar los niveles de procesamiento de la PC1 y POMC.
Debido a que los animales Snord116p-/m+ son enanos y no desarrollan obesidad, el modelo principal mediante el que se evaluará el procesamiento de POMC son neuronas humanas que se derivan de iPSC, en las que se observan regulaciones negativas más extremas de NHLH2 y la PC1. Sin embargo, las respuestas de la PC1 y POMC a estos agentes farmacológicos también se pueden analizar en neuronas primarias de ratones jóvenes POMC-GFP de WT. Las neuronas que expresan POMC se pueden aislar específicamente mediante el uso de ratones en los que neuronas POMC expresan GFP. Se bloqueará el Pcsk1 como un control para el procesamiento deficiente de POMC. También se puede intentar bloquear isoformas específicas de Snord116 in vitro mediante el uso de enfoques que se basan en oligonucleótidos antisentido que se modifican con ARNsi o 2-O-metilo; los ARNsi son ARN interferentes pequeños, de doble cadena que se usan comúnmente para bloquear los ARN citoplasmáticos, mientras que los oligos antisentido que se modifican con 2-O-metilo se usan para bloquear los ARNpno que se encuentran típicamente en el nucléolo (Liang y otros, 2011). Luego se medirán los niveles de la PC1 y los niveles de procesamiento de POMC y se investigará si el tratamiento farmacológico puede aumentar los niveles de la PC1 y aumentar el procesamiento de POMC en neuronas primarias de ratón en las que Snord116 ha sido derribado con respecto al Wt.
Adicionalmente, se obtendrán o crearán ratones con alelos hipomórficos condicionales de SNORD116. Los animales adultos con tales alelos tendrán Snord116 que se reduce de forma aguda en núcleos hipotalámicos específicos (por ejemplo, el núcleo arqueado) mediante la introducción de construcciones que expresan cre adecuadas, que incluye aquellas que se impulsan por promotores específicos, por ejemplo, para POMC. Este enfoque evitará los efectos del desarrollo somático (retraso) del hipomorfismo de Snord116 en ratones.
El efecto del activador de ciclasa y/o inhibidor de fosfodiesterasa = 50 % o un mayor aumento en el procesamiento de las prohormonas relevantes en al menos un modelo probado: neuronas que se derivan de iPSC del SPW, células p que se derivan de iPSC del SPW, islotes aislados de Snord116p-/m+, prohormonas circulantes Snord116p-/m+, o neuronas primarias de que se bloquean de Snord116. Estos fenotipos se acompañarán por aumentos en las transcripciones y/o proteínas relevantes en las células que se afectan.
Activación de ciclasa
Se aplicó la Forskolina a varios modelos celulares y los resultados ilustran que aumenta de forma sólida y confiable los niveles de transcripción de PCSK1, los niveles de proteína de la PC1 y aumenta funcionalmente el procesamiento de las prohormonas. Los niveles de transcripción de PCSK1/Pcsk1 aumentaron entre 2-3 veces en neuronas que se derivan de iPSC y neuronas primarias de ratón expuestas a Forskolina 10 pM (Figuras 5A, C, D). Las concentraciones de AMP cíclico aumentaron aproximadamente 8,5 veces en neuronas ARC hipotalámicas que se derivan de iPSC se exponen a Forskolina 10 pM, lo que apoya la inferencia de que la aplicación de Forskolina aumenta los niveles de transcripción de PCSK1 al elevar los niveles celulares de AMPc que a su vez activan el elemento promotor de respuesta de AMPc de PCSK1. La Figura 5A es un gráfico que muestra que se aislaron neuronas primarias del cerebro anterior de embriones del día 19.5 (E19.5) de gestación de ratones de tipo salvaje y se cultivaron por 72 horas. Posteriormente, las células se expusieron ya sea Forskolina 10 pM o su vehículo, dimetilsulfóxido (DMSO) por 20 horas. La transcripción de Pcsk1 aumentó ~ 2,5 veces en neuronas primarias que se expusieron a Forskolina. La Figura 5B es un gráfico que muestra neuronas hipotalámicas de tipo arqueado (ARC) de controles que no se afectan (línea Hes Nkx2-1 hESC) el día 37 (D37) de diferenciación que se trataron con Forskolina 10 pM o un vehículo por treinta minutos. Los niveles de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) aumentaron aproximadamente 8,5 veces en las células que se exponen a Forskolina. La Figura 5C es un gráfico que muestra que la exposición de neuronas hipotalámicas que se derivan de iPSC de controles que no se afectan (línea 1023A) en el día 30 de diferenciación a concentraciones graduadas de Forskolina que provoca una respuesta dependiente de la dosis en los niveles de transcripción de PCSK1. La Figura 5D es un gráfico que muestra que la exposición de neuronas que se derivan de iPSC (línea 1043D3) a Forskolina 10 pM por múltiples intervalos de tiempo encuentra que PCSK1 no se regula de forma positiva de forma significativa después de solo 1 hora de exposición, pero se regula de forma positiva de forma significativa por 4 y 18 horas de exposición. Cuatro horas de exposición produjeron el aumento máximo en la regulación positiva, aproximadamente 2,5 veces, de los puntos de tiempo que se probaron. Las Figuras 5E-F son gráficos que muestran el tratamiento de neuronas hipotalámicas ARC que se derivan de iPSC (1023A) de controles que no se afectan en el día 30 de diferenciación con una concentración graduada de Forskolina que identifica un aumento dependiente de la dosis en el procesamiento de POMC tanto para p-endorfina (PEP) como a-hormona estimulante de melanocitos (a-MSH). La Figura 5G-H son gráficos que muestran que el tratamiento de islotes aislados de ratones WT adultos (8-12 semanas de edad) con concentraciones múltiples de Forskolina que muestran una regulación positiva de los niveles de proteína de la PC1, pero no la PC2, a concentraciones de Forskolina de 25 y 50 pM, respectivamente.
El tratamiento con Forskolina no sólo elevó los niveles de transcripción, pero también tuvo consecuencias funcionales en el que se incrementó el procesamiento de POMC tanto para p-endorfina como para a-MSH (Figuras 5E-F). Además, la aplicación de Forskolina a islotes aislados de ratones de tipo salvaje resultó en un aumento de 3 veces en los niveles de la proteína PC1 (Figura 5G). Los niveles de la proteína PC2 no se afectaron (Figura 5H). En conjunto, estos resultados muestran que los niveles de la PC1 aumentan en respuesta a la Forskolina en tres sistemas modelo por separado: neuronas que se derivan de iPSC, neuronas primarias, e islotes aislados. Además, la elevación de la PC1 que se induce por la Forskolina es funcionalmente consecuente, lo que resulta en un aumento de los niveles de procesamiento de las prohormonas.
Inhibición de la fosfodiesterasa
Los inhibidores de la PDE también se han probado en neuronas que se derivan de iPSC y se ha encontrado que la inhibición de la fosfodiesterasa también puede aumentar la transcripción de PCSK1. Sin embargo, el tamaño del efecto de la inhibición de la PDE sobre los niveles de transcripción de PCSK1 es menor que el que se induce por el agonismo de la AC con Forskolina. La Teofilina (10 mM) y el Roflumilast (1 mM), ambos aumentan la transcripción de PCSK1 como agentes únicos, mientras que hasta ahora sólo se ha encontrado que MK052 aumenta la transcripción de PCSK1 en combinación con Forskolina in vitro (Figuras 6A-C, F). El tratamiento en combinación con Forskolina y Roflumilast demuestra que estos agentes pueden trabajar juntos de manera aditiva, posiblemente sinérgica, lo que induce y aumenta la transcripción de PCSK1 a concentraciones más bajas (Forskolina 1 pM, Roflumilast 100 nM) que cuando cualquiera de los agentes es dado solo (Figura 6D). De nuevo, el aumento de la transcripción de PCSK1 debido al tratamiento en combinación con Forskolina y Roflumilast también aumenta el procesamiento de las prohormonas de POMC a ACTH (Figura 6E). Específicamente, las pruebas con concentraciones graduadas de Forskolina en islotes de ratones aislados mostraron una regulación positiva de 3 veces la proteína de la PC1 a concentraciones de 25 pM y 50 pM. No se observaron cambios en los niveles de proteína de la PC2 en respuesta a la aplicación de Forskolina. También se encontró que la Forskolina 10 pM que se aplica a neuronas de ratón primarias aisladas de ratones E19.5 aumenta los niveles de transcripción de Pcsk1 ~ 2 veces.
El fenotipo que más limita a los pacientes con SPW es la hiperfagia, que con más probabilidad es mediada por procesos que ocurren en el sistema nervioso central, particularmente el hipotálamo. Por tanto, los agentes con el objetivo de aliviar la hiperfagia deben ser capaces de penetrar la barrera hematoencefálica. El MK0952 es un inhibidor de la PDE4 intrínsecamente potente (CI50 = 0,6 nM) que penetra en el cerebro con actividad de sangre total que se limita (CI50 = 555 nM) (M. Gallant y otros, 2010). Como se describe en la presente descripción, el MK0952 es el candidato principal para la inhibición de la PDE en la actualidad.
Se realizó una prueba preliminar in vivo de MK0952 en ratones de tipo salvaje. Una sola administración de MK0952 a 10 mg/kg de peso corporal que resulta en un aumento del 25 % en los niveles de transcripción hipotalámicos de Pcsk1 (Figura 7A). La administración de Forskolina a 25 mg/kg no resultó en un aumento de los niveles hipotalámicos de transcripción de Pcsk1. La coadministración de MK0952 a 10 mg/kg y Forskolina a 25 mg/kg indujo de nuevo un aumento de ~ 25 % en los niveles hipotalámicos de Pcsk1, lo que sugiere que este aumento se debió de forma primaria a las acciones de MK0952 (Figura 7B). También se analizarán los niveles en la circulación de AMPc, proBDNF/BDNF cortical, Pcsk1 cerebeloso, Pcsk1 gástrico, y progrelina/grelina gástrica, las concentraciones de proinsulina e insulina en la circulación (y sus proporciones), y finalmente la transcripción de Pcsk1 pulmonar y los niveles de AMPc de estos animales también.
Se completó el primer estudio in vivo con MK0952 que se administró por sonda oral mientras que la Forskolina se administró de forma intraperitoneal una vez a ratones de tipo salvaje en ayunas de 4 horas. Los niveles hipotalámicos de transcripción de Pcsk1 se regularon de forma positiva en un 25 % seguidos ya sea de la administración de 10 mg/kg de MK0952 como un agente único o tanto de 10 mg/kg de MK0952 como 25 mg/kg de Forskolina. Sin embargo, la administración de 25 mg/kg de Forskolina solo no resultó en una regulación positiva de Pcskl hipotalámica, lo que sugiere que la Forskolina en esta dosis no puede acceder al hipotálamo en cantidades suficientes para afectar la transcripción de Pcskl. Esto también sugiere que el aumento de Pcskl hipotalámica seguido de la administración tanto de 25 mg/kg de Forskolina como de 10 mg/kg de MK0952 se debió principalmente a las acciones de MK0952 en el hipotálamo. Esta diferencia refleja probablemente una mayor penetración en el SNC de MK0952, no la relevancia general de un activador de ciclasa para la terapia del SPW. No se detectó ningún cambio en la proporción de proinsulina en la circulación:insulina seguido de la administración de MK0952 o Forskolina. Debido a que el procesamiento de proinsulina a insulina ya es bastante eficiente en los animales de WT, en retrospectiva es poco probable que aumente adicionalmente en ayunas. Sin embargo, estos datos de 'referencia' siguen siendo valiosos para evaluar el procesamiento de proinsulina a insulina bajo el entorno de una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal a 3 mg/kg de glucosa tanto en ratones WT como Snord116p-/m+. Adicionalmente, se recolectaron muestras para la medición de los niveles en la circulación de AMPc, proBDNF/BDNF cortical, PCSK1 cerebelosa, PCSK1 gástrico, y progrelina/grelina gástrica, y finalmente transcripción de PCSK1 pulmonar y los niveles de AMPc.
Ejemplo 3
Estudio clínico de los compuestos en pacientes con Síndrome de Prader Willi (SPW)
El diseño preliminar del estudio clínico propuesto para individuos con SPW en base a la hipótesis de que la expresión de proconvertasa 1 (PC1) disminuye en las neuronas de individuos con SPW (Burnett y otros, 2017). La exposición experimental in vitro e in vivo a agonistas de la adenilato ciclasa e inhibidores de la PDE4 causa una regulación positiva de la expresión y la actividad de la PC1 en neuronas del cerebro anterior que se derivan de células madre humanas, de roedores, y fibroblastos humanos. Se anticipó que la administración de estos fármacos aumentará la conversión de las prohormonas implicadas en hormonas activas.
El estudio clínico abordará e ilustrará la eficacia del fármaco en la potenciación de la actividad de la PC1 de la siguiente manera:
1. Ilustrar los efectos de los agentes terapéuticos candidatos sobre el comportamiento y los fenotipos endocrinos del SPW.
2. Monitorear el perfil de seguridad clínica de tales agentes.
Diseño del estudio:
El estudio clínico utilizará un diseño de estudio cruzado (Cleophas y otros, 2006, Wellek y Blettner 2012, y Louis y otros, 1984). Este diseño proporciona el poder de evaluar el efecto del tratamiento que tiene en cuenta la variabilidad entre sujetos en una pequeña cohorte (A). El período de lavado entre los dos brazos de tratamiento mitigará los efectos de arrastre; la corta duración del estudio minimiza los “efectos de tiempo” (efectos sobre el cambio en el proceso de la enfermedad a lo largo del tiempo).
Criterios de inclusión*:
1. Diagnóstico que se demostró genéticamente del SPW
2. Edad > 18 años
* Se permite la terapia con hormona de crecimiento recombinante.
Criterio de exclusión:
1. Trastorno psiquiátrico grave
2. La no cooperación para tomar la medicación
3. Enfermedad sistémica, por ejemplo, enfermedad gastrointestinal grave como enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad cardíaca, especialmente alteraciones del ritmo, diagnóstico de diabetes, enfermedad o insuficiencia hepática o renal.
4. Anemia que se define como hemoglobina < 10 g/dL
5. Los pacientes que toman fármacos que tienen interacción potencial con el fármaco objetivo, por ejemplo, los inhibidores de la PDE4 interactúan con medicamentos anticonvulsivos, cimetidina, omeprazol, antibióticos, etc. Muchos de estos fármacos alteran la actividad de las enzimas hepáticas y podrían interferir con el metabolismo de un inhibidor de la PDE4. Una lista completa de fármacos de exclusión se basará en las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del agente terapéutico identificado.
Reclutamiento: El reclutamiento de los sujetos se facilitará mediante la asociación con la Fundación SPW (FPWR y PWSA), los grupos de apoyo a pacientes y los médicos que atienden a niños con SPW. La evaluación telefónica identificará a los sujetos potencialmente elegibles que serán invitados a la visita de cribado.
El estudio durará de 4-6 semanas y consistirá de las siguientes visitas:
1. Visita de cribado: En esta visita, se realizará una revisión completa de los registros médicos, los medicamentos y el examen físico junto con las mediciones de laboratorio de cribado (de la Figura 8B, igual que el perfil de seguridad aparte del nivel de fármaco). A los sujetos se les proporcionará una semana de placebo por el período de preinclusión para evaluar el cumplimiento. Esta será una visita ambulatoria corta (~ 3 horas). El resto de las visitas del estudio serán de 6-8 horas de internación de corta duración.
2. Visita de referencia (t1 y t3 de la Figura 8A): Se invitará a participar en el estudio a los sujetos que completen con éxito el período de preinclusión. Los sujetos elegibles serán asignados al azar al grupo AP o al grupo PA (Figura 8A). Se aconsejará a los sujetos que ayunen por > 8 horas durante la visita. El perfil físico incluirá la altura, el peso, la medición de la grasa corporal, los signos vitales, el gasto energético en reposo y un examen físico completo. Se realizará un perfil hipofisario completo que incluye ACTH, cortisol, FSH/LH, estrógeno/testosterona, TSH/T4 libre, GH, IGF-1, IGFBP3. Los sujetos se someterán a una prueba de tolerancia a las comidas mixtas (MMTT) con comida que se estandariza y las mediciones de sangre se obtendrán a los 0, 30, 60, 90, 120 y 180 minutos de un catéter intravenoso IV permanente (Figura 8B).
Los tutores principales completarán los cuestionarios que se relacionan con la hiperfagia (Dykens o Dykens modificados) y se realizará una evaluación del comportamiento mediante el uso del Cuestionario del Estudio de Oxitocina (25-28). Además de esto, completarán un cuestionario de frecuencia de alimentos en 3 días por separado para incluir al menos un fin de semana. Se espera que la visita dure de 6-8 horas. La medicación del estudio por 1 semana se dispensará con la instrucción del cuidador.
3. Visita de seguimiento (t2 y t4 de la Figura 1): el sujeto regresará para una visita de seguimiento 1 semana después del inicio de la medicación del estudio. En esta visita se repetirán las mediciones que se mencionan anteriormente, y se obtendrá un recuento de la medicación, junto con un cuestionario que se estructura para la evaluación de la toxicidad. Cada una de estas visitas será de 6-8 horas. Se permitirá un período de lavado de 1-2 semanas antes de la segunda fase del estudio.
Resultado de las medidas:
1. Perfil hormonal en respuesta a una comida estándar: En base a el efecto de la PC1 sobre la conversión de las prohormonas (tales como proinsulina a insulina, etc.), se anticipa que la administración del fármaco causará un aumento en la proporción de las prohormona:hormona (por ejemplo, proinsulina:insulina) (Burnelt y otros, 2017). Esto se probará mediante la respuesta hormonal a la MMTT estándar. La MMTT se realiza mediante la administración de una comida líquida (6 cc/kg de refuerzo o equivalente a un máximo de 360 cc) seguida de la medición periódica de insulina, proinsulina, prohormona POMC, ACTH, AgRP, proglucagón, glucagón, GLP1, oxitocina (y propéptido), grelina, progrelina, ácidos grasos libres, y glucosa. La MMTT se ha validado en estudios clínicos de sujetos con SPW (P. Gumus Balikcioglu y otros, 2015).
Con respecto a los valores que se obtienen antes de la administración del fármaco, se anticipa que habrá un aumento absoluto en la liberación de insulina, una disminución en la liberación de proinsulina y un aumento en la proporción insulina/proinsulina. Todo en un intervalo del 25 %. También se espera que las concentraciones de glucosa disminuyan en 15-20 y en ácidos grasos libres también. En el plasma que se obtiene antes de la MMT, se anticipa que la POMC aumentará y la AgRP se reducirá en un -25 %. La oxitocina también se debe aumentar en un 15-20 %. También se anticipa que se reducirá la proporción progrelina/grelina. También se puede examinar/estudiar el líquido cefalorraquídeo en estos sujetos, pero no se evaluará en relación con una comida. Se pueden ensayar los siguientes componentes: prohormona POMC, beta endorfina, alfa-MSH, AgRP y oxitocina, lo que anticipa que los fármacos reducirán la prohormona POMC, y aumentará la beta endorfina, alfa-MSH y oxitocina, y reducirán el AgRP en comparación con los sujetos que no se tratan.
2. Perfil farmacometabolómico: el perfil metabolómico proporciona una oportunidad adicional para comprender los efectos del fármaco sobre el fenotipo metabólico. Se realizará el perfil metabolómico de los sujetos del estudio antes y después del tratamiento con el fármaco para identificar biomarcadores de a) respuesta al tratamiento en las vías de interés, es decir, la vía de metabolismo de la insulina y otras, b) para identificar diferencias individuales en el tratamiento, mediante la identificación de vías que se regulan selectivamente de forma positiva o negativa en diferentes individuos, y c) identificar los perfiles de efectos secundarios o toxicidad mediante el uso de un análisis en base a la vía que puede no ser evidente para el estudio estándar de perfiles moleculares grandes que se establecen (R. Kaddurah-Daouk, R. Weinshilboum, N. 2015; R.D. Beger y otros, 2016).
3. Cambios en el comportamiento que se relacionan con la hiperfagia: El cuestionario de Dykens (y Dykens modificado) evalúa el comportamiento, la gravedad y el impulso del hambre. Además de estos resultados, el Cuestionario del Comportamiento de Oxitocina evaluará el comportamiento social y emocional que se relaciona con la alimentación. Estos resultados se complementarán con el análisis de los cuestionarios de frecuencia de alimentación. Se espera que el tratamiento también mejore el comportamiento y/o el estado emocional.
Tamaño de la muestra: Se reclutará un tamaño de muestra piloto de 6 sujetos para este estudio. El poder de este tamaño de muestra para detectar los resultados de interés dependerá del tamaño del efecto que se determina por el perfil hormonal o farmacometabolómico in vivo en modelos animales. Como se refleja en la Figura 8C, se requiere un tamaño del efecto de ~ 1,47 para detectar un cambio significativo en una cohorte de 6 sujetos. El tamaño del efecto se calcula como la diferencia en las medias de la observación con el placebo en comparación con el fármaco activo que se divide por la desviación estándar del cambio. Como cada sujeto sirve como su propio control, el diseño del estudio cruzado limita la variabilidad y permite alcanzar el poder en % de los sujetos para un diseño de estudio de brazo paralelo similar.
Información adicional del estudio:
1. En base a estudios anteriores en niños con SPW y la necesidad de alcanzar un tamaño de efecto alto, se ha seleccionado la comida mixta estándar para el estudio.
2. El estudio se llevará a cabo en las instalaciones ambulatorias del Instituto Irving de Investigación Clínica y Traduccional.
3. Se preparará un protocolo IRB para el estudio que se dirige al inhibidor de la PDE y/o activador de la ciclasa apropiado.
4. El perfil metabolómico, si se obtiene en este estudio preliminar, se realizará en el Núcleo de Hormonas y Metabolitos del Centro de Investigación de Diabetes y Endocrinología.
Ejemplo 4 Tratamiento del Síndrome de Prader-Willi - Combinación de la terapia de agonismo de MC4R endógeno y exógeno.
Los individuos con SPW serán tratados mediante el uso de agentes que aumentan los niveles endógenos de hormonas que se procesan en virtud del aumento de la producción de la PC1 a través de la elevación de los niveles de producción celular de AMPc y/o el bloqueo de su degradación.
En el núcleo arqueado, la proconvertasa 1 (PC1) procesa POMC a a-MSH (S.L. Wardlaw 2011). a-MSH es un ligando endógeno del receptor de melanocortina 4 (MC4R). Los humanos y ratones con mutaciones de inactivación en POMC, PCSK1 (el producto del gen PCSK1 es PC1), o MC4R son hiperfágicos y obesos (C. Vaisse y otros 1998). Las mutaciones en el MC4R son la causa genética más común de obesidad en los seres humanos (R.J. Loos y otros, 2008). El AgRP también se produce en el núcleo arqueado y es un agonista inverso en MC4R. ProAgRP se procesa a AgRP por PC1 (S.L. Wardlaw 2011).
Es posible que los aumentos en la producción de la PC1 puedan aumentar la producción tanto de a-MSH como de AgRP, que tienen efectos opuestos en MC4R (Figura 4). El uso de agonistas de MC4R en base a péptidos o moléculas pequeñas podría ayudar a asegurar que las combinaciones extracelulares de agentes que agonizan MC4R superen a aquellos que antagonizan MC4R (Figura 4, Tabla 3). Se esperará que esto impulse la señalización en el MC4R hacia las respuestas anorexigénicas (Figura 4). Los agentes que se unen a AgRP y bloquean sus efectos en MC4R también podrían ser una estrategia útil en este entorno (Tabla 3) (E.C. Lee y P. A Carpino 2016). Los compuestos que actúan de manera similar que no se mencionan en la Tabla 3 también pueden ser útiles. Esta estrategia puede ser eficaz no solo para tratar el SPW, sino también para otras formas de obesidad monogénica/sindrómica, así como también para la obesidad común.
T l : E m l m rí n mini r r n inhi i r F K l PDE
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Resumen/Conclusiones
Aunque el gen que codifica para la PC1, PCSK1, se regula de forma negativa en modelos en base a células y animales del SPW, el gen en sí mismo está intacto y por tanto, podría estar sujeto a manipulación farmacológica. Los presentes datos proporcionan resultados de estudios preclínicos en curso para manipular farmacológicamente los niveles celulares de PCSK1/PC1. Los experimentos in vitro demuestran que la aplicación de Forskolina, un agonista de la adenilil ciclasa regula de forma positiva, robusta y fiable la expresión de PCSK1 en neuronas que se derivan de células madre humanas, neuronas primarias de ratón y aumenta el nivel de la proteína PC1 en islotes aislados de ratón. Además, el tratamiento con Forskolina también aumenta el procesamiento de la prohormona POMC en las neuronas hipotalámicas que se derivan de células madre. La aplicación de los inhibidores de la PDE, Teofilina y Roflumilast, a neuronas de células madre aumenta los niveles de transcripción de PCSK1 tanto como agentes únicos como en combinación con Forskolina. La combinación del tratamiento de Roflumilast y Forskolina también aumenta de forma aditiva el procesamiento de la prohormona POMC (a péptidos anorexigénicos) en las neuronas hipotalámicas de células madre. El tratamiento de neuronas que se derivan de células madre tanto con Forskolina como con MK0952 (un inhibidor de la PDE de clase 4) aumenta el ARNm de PCSK1. Finalmente, una única dosis oral de 10 mg/kg de MK0952 aumenta los niveles hipotalámicos de transcripción de Pcsk1 en un 25 % en ratones de tipo salvaje. Se probarán a continuación aplicaciones más grandes de MK09S2 in vivo tanto en ratones de tipo salvaje como hipomórficos para el Snord116 paterno. Además, se colaboró con Andrea Haqq y colegas para medir los niveles en la circulación de hormonas pro y procesadas (por ejemplo, proinsulina, POMC, pro-oxitocina, proBDNF) en individuos con SPW y controles correspondientes.
También se proporciona un protocolo para el estudio clínico preliminar de MK0952 y otros compuestos candidatos en individuos con SPW. Los objetivos principales de este estudio clínico serán monitorear el perfil de seguridad clínica de estos agentes en sujetos con SPW, así como también medir la valoración de comportamiento y neuroendocrina para evaluar la eficacia preliminar.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) para su uso en el tratamiento del Síndrome de Prader-Willi (SPW), cuyo uso comprende administrar el inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) a un sujeto que necesita el mismo y de este modo aliviar, eliminar o prevenir uno o más síntomas del SPW.
2. Un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el PDE4i regula de forma positiva las concentraciones o la actividad del monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) en el sujeto.
3. Un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el SPW se caracteriza por una disminución en la expresión de Nhlh2.
4. Un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde una disminución en la expresión de Nhlh2 resulta en una disminución en la expresión de Pcsk1.
5. Un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el aumento de las concentraciones o la actividad del AMPc regula de forma positiva la expresión de Pcsk1.
6. Un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el PDE4i es un PDE4i selectivo.
7. Un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el PDE4i es un PDE4i no selectivo.
8. Un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el PDE4i selectivo se selecciona de AN2728, apremilast, cilomilast, diazepam, ibudilast, luteolina, mesembrenona, piclamilast, roflumilast, rolipram, E6005, GSK352278 y MK0956278.
9. Un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el PDE4i no selectivo se selecciona de xantinas metiladas y derivados de las mismas, cafeína, aminofilina, 3-isobutil-1-metilxantina, paraxantina, pentoxifilina, teobromina y teofilina.
10. Un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde uno o más síntomas incluyen hiperfagia, reducción de la tasa metabólica, obesidad, hipogonadismo, disminución de la producción de la hormona del crecimiento, tono muscular deficiente, trastornos del sueño, trastornos gastrointestinales, reducción de estamina, reducción de la capacidad para concentrarse, cognición deficiente, trastornos del comportamiento, ansiedad, retraso del crecimiento, reducción de la conversión de hormonas inmaduras a formas maduras y activas, y diabetes.
11. Un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el uso comprende además administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales efectivos para tratar o aliviar uno o más síntomas del SPW.
12. Un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde las hormonas inmaduras comprenden una o más de insulina, grelina, GHRH, alfa-MSH, oxitocina, orexina, BDNF, vasopresina, NPY, AGRP y gonadotropina.
13. Un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde uno o más agentes terapéuticos adicionales efectivos para tratar o aliviar el SPW incluyen insulina, un agonista del receptor de insulina, grelina, un agonista del receptor de grelina, GHRH, un agonista del receptor de GHRH, alfa-MSH, un agonista del receptor alfa-MSH, oxitocina, un agonista del receptor de oxitocina, orexina, un agonista del receptor de orexina, BDNF, un agonista del receptor de BDNF, vasopresina, un agonista del receptor de vasopresina, NPY, un agonista del receptor de NPY, AGRP, un agonista del receptor de AGRP, gonadotropina, un receptor de gonadotropina, o combinaciones de los mismos.
14. Un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el PDE4i es MK0952.
15. Un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4i) para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el PDE4i es MK0952.
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