CN110327332A - 氨来呫诺在缓解eae发病上的应用及其实验方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及氨来呫诺在缓解EAE发病，减轻脊髓中炎症细胞浸润和髓鞘脱失上的应用。在具体验证上述结果时，采用了分组实验的形式，具体包括三个方面：氨来呫诺抑制骨髓来源树突细胞表型及功能成熟，且与TBK1/Akt通路相关；氨来呫诺通过抑制Th1/Th17细胞反应改善实验性自身免疫性脑脊髓炎病情；氨来呫诺通过TBK1/Akt通路抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎脾中DC成熟。本发明通过实验结果说明ALX可能通过抑制TBK1/Akt传导通路，影响DC成熟，进而抑制Th1和Th17细胞分化，从而在EAE中起到保护性作用。本实验为探索多发性硬化的发病机制及寻找临床安全有效的治疗药物提供实验依据，可广泛应用在医药技术领域。

Description

氨来呫诺在缓解EAE发病上的应用及其实验方法
技术领域
本发明涉及药物技术领域，具体是指氨来呫诺在缓解EAE发病上的应用及其实验方法。
背景技术
多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，其病理特点为髓鞘特异性T细胞浸润中枢神经系统并引发炎症反应瀑布，导致髓鞘脱失和神经功能损害。早前的研究显示，Th1和Th17细胞对于MS及其动物模型EAE的致病发挥重要作用。这些抗原特异性Th1和Th17细胞在MS和EAE病理过程中分别分泌炎症因子γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)和白介素17(Interleukin-17,IL-17)。IFN-γ具有激活DC、单核细胞、巨噬细胞和小胶质细胞的作用。IL-17可以刺激趋化因子的产生，并且募集中性粒细胞进入中枢神经系统促进炎症的发生。而Th1和Th17细胞由初始T细胞发育分化而来，并且这一过程依赖抗原呈递细胞(antigen presenting cells,APC)的诱导。
DC是功能最强大的APC，其对于诱导初始T细胞的激活，并向各个T细胞亚型分化具有重要作用。激活的成熟DC高表达共刺激分子CD80、CD86和抗原呈递分子MHC II，并分泌高水平的促炎因子，其包括IL-12、IL-6、IL-23等。在上述三种途径的综合作用下，促进Th1和Th17细胞的分化，从而促进炎症反应瀑布的产生。而未成熟的DC虽然具有强大的抗原摄取能力，但是由于低表达共刺激分子及抗原呈递分子，并且促炎因子分泌不足，而不能很好的激活T细胞，并抑制Th1和Th17细胞亚型的分化，最终引发免疫耐受。因此，DC的成熟程度对于T细胞介导的免疫炎症和免疫耐受之间的平衡具有重要作用。但是，目前尚无研究探索氨来呫诺在调节DC成熟过程及DC在诱导T细胞分化中的作用。
氨来呫诺(Amlexanox,ALX)具有抗炎和抗过敏的作用，在美国和中国是一种治疗口腔溃疡的药物，在日本作为治疗哮喘的药物而在临床上得到广泛的应用。最近研究显示，ALX作为TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)的特异性小分子抑制剂，在2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和肥胖相关性代谢紊乱等自身免疫相关疾病中具有抑制炎症的作用。但ALX在中枢神经自身免疫性疾病，如多发性硬化及其动物模型的免疫调节中发挥何种作用仍未研究清楚。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
氨来呫诺在缓解EAE发病，减轻脊髓中炎症细胞浸润和髓鞘脱失上的应用。
进一步地，所述氨来呫诺抑制骨髓来源树突细胞表型及功能成熟，且与TBK1/Akt通路相关。
进一步地，在利用实验验证氨来呫诺抑制骨髓来源树突细胞表型及功能成熟，且与TBK1/Akt及TBK1/IRF3通路相关时，采用的实验步骤如下：
(1)无菌条件下取雌性C57BL/6小鼠股骨和胫骨骨髓进行培养，以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子诱导分化，第8天培养出未成熟骨髓来源树突细胞，随机分为三组，其中LPS组应用LPS刺激BMDC成熟，ALX组同时应用不同浓度的ALX进行干预，对照组不采取任何干预措施，于第10天收集细胞进行后续实验；
(2)应用八肽胆囊收缩素检测八肽胆囊收缩素组、氨来呫诺组以及对照组BMDC增殖情况，将第10天收集的各组BMDC同BALB/c小鼠脾CD4+T细胞以1:5、1:10、1:20不同比例共培养2天，应用CCK8检测上述各组T细胞增殖程度；
(3)应用流式细胞学检测各组BMDC表面分子标志物II型主要组织相容性抗原复合物，CD80，CD86平均荧光强度；
(4)应用扫描电镜及透射电镜观察LPS组，ALX组BMDC形态学特点；
(5)应用酶联免疫吸附剂测定方法检测LPS组，ALX组细胞培养上清中的炎症因子IL-6、IL-12、IL-23含量；
(6)应用Western Blot检测LPS组，ALX组和对照组BMDC中TBK1、磷酸化TANK结合激酶1、Akt、p-Akt蛋白表达；
(7)采用SPSS 23.0软件进行统计分析，实验所得数据进行正态性和方差齐性检验，以均数±标准误表示。
进一步地，所述氨来呫诺通过抑制小鼠周围免疫器官脾中辅助T细胞1/辅助T细胞17细胞比例及其炎症因子改善实验性自身免疫性脑脊髓炎病情。
进一步地，在所述氨来呫诺通过抑制Th1/Th17细胞及其炎症因子改善实验性自身免疫性脑脊髓炎病情时，采用的实验步骤为：
(1)采用近交系雌性C57BL/6雌性小鼠作为实验动物，周龄8-10周，体重18-20g，以MOG35-55为抗原，与完全弗氏佐剂和结核菌素混合乳化后予小鼠背部脊柱旁皮下分四点注射，并于免疫当天及第2天两次腹腔注射500ng百日咳毒素，即PTX，建立EAE模型；
(2)将免疫后雌性C57BL/6小鼠随机分为模型对照组和ALX治疗组，自免疫当天开始，ALX治疗组小鼠给予每日两次ALX灌胃，模型对照组小鼠每日同一时间以等量羧甲基纤维素钠(ALX混悬剂)进行等量灌胃，自免疫当日开始，每日评价小鼠神经功能并称重，连续观察至缓解期；
(3)应用HE染色观察脊髓腰膨大处炎性细胞浸润情况，并应用透射电镜及LFB染色观察脊髓髓鞘脱失程度；
(4)应用流式细胞学检测各组小鼠脾中Th1、Th17细胞的比例；
(5)应用ELISA方法检测脾细胞培养上清中的炎症因子白介素-17A、γ干扰素含量；
(6)应用实时荧光定量PCR方法检测小鼠脾组织及脊髓组织中炎症因子IL-17A、IFNγmRNA以及Th1和Th17细胞特异性转录因子T-bet、RORγt mRNA的转录水平；
(7)应用Western Blot技术检测小鼠脊髓中IL-17和IFNγ的蛋白表达水平；
(8)采用SPSS 23.0软件进行统计分析，实验所得数据进行正态性和方差齐性检验，以均数±标准误表示。
进一步地，所述氨来呫诺通过TBK1/Akt通路抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎脾中DC成熟。
本发明还提供了一种技术方案：
一种针对氨来占诺的应用的实验方法，所述氨来占诺为上述所述的氨来占诺的应用，在所述氨来呫诺通过TBK1/Akt通路抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎脾中DC成熟时，采用的实验步骤为：
(1)采用近交系雌性C57BL/6小鼠作为实验动物，8-10周龄，体重18-20g，应用MOG35-55作为抗原，与完全弗氏佐剂和结核菌素混合后给予小鼠背部皮下分四点注射，并于免疫当天及第2天分两次腹腔注射500ng百日咳毒素，建立EAE动物模型；
(2)将免疫后C57BL/6小鼠随机分为模型对照组和ALX治疗组，自免疫当天开始，ALX治疗组小鼠给予每日两次ALX灌胃，模型对照组小鼠每日同一时间以等量羧甲基纤维素钠进行灌胃，在自身免疫性脑脊髓炎，发病初期对小鼠进行取材，以备后续实验；
(3)应用流式细胞学技术检测EAE发病前期脾DC表面分子标志物MHC II，共刺激分子CD80、CD86阳性率及平均荧光强度；
(4)应用ELISA方法检测脾细胞培养上清中的炎症因子IL-6、IL-12及IL-23含量；
(5)应用免疫荧光检测方法观察脾DC中p-Akt表达；
(6)采用SPSS 23.0软件进行统计分析，实验所得数据进行正态性和方差齐性检验，以均数±标准误表示。
根据以上应用以及采用的实验可知，本发明具有如下优点：
本发明通过实验结果说明ALX可能通过抑制TBK1/Akt传导通路，影响DC成熟，进而抑制Th1和Th17细胞分化，从而在自身免疫性脑脊髓炎中起到保护性作用；
本实验为探索MS的发病机制及寻找临床安全有效的治疗药物提供实验依据。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明。
氨来呫诺在缓解EAE发病，减轻脊髓炎症细胞浸润和髓鞘脱失程度上的应用。
氨来占诺抑制骨髓来源树突细胞表型及功能成熟，且与TBK1/Akt通路相关。
在利用实验验证氨来占诺抑制骨髓来源树突细胞表型及功能成熟，且与TBK1/Akt通路相关时，采用的实验步骤如下：
(1)无菌条件下取雌性C57BL/6小鼠股骨和胫骨骨髓进行培养，以GM-CSF诱导分化，第8天培养出未成熟BMDC，随机分为三组，其中LPS组应用LPS(1μg/ml)刺激BMDC成熟，ALX组同时应用不同浓度(2μM-500μM)的ALX进行干预，对照组不采取任何干预措施，于第10天收集细胞进行后续实验；
(2)应用CCK8检测各ALX组、LPS组以及对照组BMDC增殖情况，将第10天收集的各组BMDC同BALB/c小鼠脾CD4+T细胞以1:5、1:10、1:20不同比例共培养2天，应用CCK8检测上述各组T细胞增殖程度；
(3)应用流式细胞学检测各组BMDC表面分子标志物MHC II，CD80，CD86平均荧光强度；
(4)应用扫描电镜及透射电镜观察LPS组，ALX(2μM,10μM)组形态学特点；
(5)应用酶联免疫吸附实验方法检测LPS组，ALX(2μM,10μM)组细胞培养上清中的炎症因子IL-6、IL-12、IL-23含量；
(6)应用Western Blot检测对照组，LPS组，ALX(2μM,10μM)组TBK1、p-TBK1(Ser172)、Akt、p-Akt(Ser473,Thr308)蛋白表达；
(7)采用SPSS 23.0软件进行统计分析，实验所得数据进行正态性和方差齐性检验，以均数±标准误表示(Mean±SEM)，多组计量资料均数的比较应用ONE-WAY-ANOVA中Dunnet t检验进行方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。
根据以上实验，得出的实验结果为：
1)显微镜下观察GM-CSF诱导BMDC生长情况，第8天时可见细胞表面突起短而稀少，LPS再刺激2天后，即培养第10天可见细胞表面突起增多变长。
2)应用CCK8检测，结果显示低浓度ALX(2μM-10μM)对BMDC增殖无明显抑制作用，而高浓度ALX(20μM-100μM)对BMDC增殖出现不同程度的抑制。
3)应用CCK8检测，结果显示ALX(2μM,10μM)对BMDC诱导的同种异基因CD4+T细胞增殖具有抑制作用。
4)应用流式细胞学检测，结果显示LPS增强BMDC表面分子标志物MHC II，CD80，CD86平均荧光强度；ALX抑制LPS诱导的MHC II，CD86表达，而对CD80无明显影响。
5)应用ELISA检测，结果显示LPS刺激BMDC后IL-23、IL-12、IL-6分泌增加；ALX抑制IL-23、IL-12分泌，而对IL-6无明显作用。
6)Western Blot检测，结果显示LPS促进p-TBK1和p-Akt蛋白表达，ALX进一步促进p-TBK1表达，而抑制p-Akt蛋白表达。
氨来呫诺通过抑制Th1/Th17细胞反应改善实验性自身免疫性脑脊髓炎病情。
在氨来呫诺通过抑制Th1/Th17细胞及其炎症因子改善实验性自身免疫性脑脊髓炎病情时，采用的实验步骤为：
(1)采用近交系雌性C57BL/6雌性小鼠作为实验动物，周龄8-10周，体重为18-20g，以MOG35-55为抗原，与完全弗氏佐剂和结核菌素混合乳化后予小鼠背部脊柱旁皮下注射，并于免疫当天(即第0h)及第2天(即48h)两次腹腔注射500ng百日咳毒素(PTX)，成功建立EAE模型；
(2)将免疫后雌性C57BL/6小鼠随机分为EAE模型对照组组和ALX治疗组，自免疫当天开始，ALX治疗组小鼠给予每日两次ALX(50mg/kg)灌胃，EAE模型对照组组小鼠每日同一时间以等量羧甲基纤维素钠(ALX混悬液)进行灌胃，自免疫日开始，每日评价小鼠神经功能并称重，连续观察至缓解期，神经功能评分采用Knoz五分评分法；
(3)应用HE染色观察脊髓腰膨大处炎性细胞浸润情况，并应用透射电镜及LFB染色观察脊髓髓鞘脱失程度；
(4)应用流式细胞学检测各组小鼠外周免疫器官脾中Th1和Th17细胞的比例；
(5)应用ELISA方法检测脾细胞培养上清中的炎症因子IL-17A、IFNγ含量；(不用去掉)
(6)应用qPCR方法检测小鼠脾组织及脊髓组织中炎症因子IL-17A、IFNγmRNA以及Th1和Th17细胞特异性转录因子T-bet、RORγt mRNA的转录水平；
(7)应用Western Blot技术检测小鼠脊髓中IL-17和IFNγ的蛋白表达水平；
(8)采用SPSS 23.0软件进行统计分析，实验所得数据进行正态性和方差齐性检验，以均数±标准误表示(Mean±SEM)，满足正态性前提下，方差齐时计量资料两均数的比较用t检验，方差不齐时计量资料两均数的比较用t’检验；数据不满足正态性时应用秩和检验，P＜0.05有统计学意义。
根据以上实验，可以得出：
1)ALX减轻EAE发病神经功能损害症状，推迟起病时间，并缓解EAE发病引起的体重下降情况；
2)同EAE模型对照组组相比，ALX干预后HE染色显示炎症细胞浸润程度轻，LFB染色及透射电镜
显示髓鞘脱失程度轻；
3)同EAE模型对照组组相比，ALX干预后小鼠脾内Th1和Th17细胞比例下降，脾细胞培养上清及血清中炎症因子IFNγ和IL-17表达减少，脾中IFNγ、IL-17、T-bet、RORγtmRNA转录水平下降；
4)同EAE模型对照组组相比，ALX干预后脊髓内Th1和Th17细胞浸润减少，炎症因子IFNγ和IL-17
表达下降，脊髓IFNγ、IL-17、T-bet、RORγt mRNA转录水平下降。
氨来呫诺通过TBK1/Akt通路抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎脾中DC成熟。
在氨来呫诺通过TBK1/Akt通路抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎脾中DC成熟时，采用的实验步骤为：
(1)采用近交系雌性C57BL/6小鼠作为实验动物，周龄8-10周，体重18-20g，应用MOG35-55作为抗原，与完全弗氏佐剂和结核菌素混合后给予小鼠背部皮下注射，并于免疫当天(即第0h)及第2天(即48h)分两次腹腔注射500ng百日咳毒素(PTX)，建立EAE动物模型；
(2)将免疫后雌性C57BL/6小鼠随机分为EAE模型对照组组和ALX治疗组，自免疫当天开始，ALX治疗组小鼠给予每日两次ALX(50mg/kg)灌胃，正常对照组及EAE模型对照组组小鼠每日同一时间以等量羧甲基纤维素钠(ALX混悬剂)进行灌胃，在EAE发病初期(免疫后15天)对小鼠进行取材，以备后续实验；
(3)应用流式细胞学技术检测EAE发病前期脾DC表面分子MHC II，共刺激分子CD80、CD86阳性率及平均荧光强度；
(4)应用ELISA方法检测血清及脾细胞培养上清中的炎症因子IL-6、IL-12及IL-23含量；
(5)应用免疫荧光检测方法观察脾DC中p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)表达；
(6)采用SPSS 23.0软件进行统计分析，实验所得数据进行正态性和方差齐性检验，以均数±标准误表示(Mean±SEM)，满足正态性前提下，方差齐时计量资料两均数的比较用t检验，方差不齐时计量资料两均数的比较用t’检验。
通过以上实验，得出的结果为:
1)流式细胞学方法检测结果显示，ALX组小鼠脾中CD80+CD11c+细胞比例较EAE模型对照组组小鼠下降，两组相比有统计学差异，P＜0.01；ALX组小鼠脾中CD86+CD11c+细胞比例较EAE模型对照组组小鼠下降，两组相比有统计学差异，P＜0.05；小鼠脾中MHC+CD11c+细胞比例同EAE模型对照组组小鼠无明显统计学差异；ALX组小鼠脾中CD11c+细胞中CD80、CD86、MHC II平均荧光强度较EAE模型对照组组均降低，差别有统计学意义，P＜0.01；
2)ELISA检测结果显示，ALX组小鼠脾细胞培养上清中IL-12含量较EAE模型对照组组降低，两组相比有统计学差异，P<0.01；ALX组小鼠脾细胞培养上清中IL-23含量较EAE模型对照组组降低，两组相比有统计学差异，P<0.01；ALX组小鼠脾细胞培养上清中IL-6含量较EAE模型对照组组无统计学差异；
3)在发病初期对EAE模型对照组组和ALX组进行免疫荧光染色，结果显示，同EAE模型对照组组小鼠相比，ALX干预EAE小鼠后，脾DC中p-Akt(S473)及p-Akt(T308)荧光强度下降。
综上，ALX通过抑制TBK1/Akt传导通路，影响树突细胞成熟，进而抑制Th1和Th17细胞分化，从而在EAE中起到保护性作用。

Claims (7)

1.氨来呫诺在缓解EAE发病，减轻脊髓中炎症细胞浸润和髓鞘脱失上的应用。
2.根据权利要求1所述的氨来呫诺的应用，其特征在于，所述氨来呫诺抑制骨髓来源树突细胞表型及功能成熟，且与TBK1/Akt通路相关。
3.根据权利要求2所述的氨来呫诺的应用，其特征在于，在利用实验验证氨来呫诺抑制骨髓来源树突细胞表型及功能成熟，且与TBK1/Akt及TBK1/IRF3通路相关时，采用的实验步骤如下：
(1)无菌条件下取雌性C57BL/6小鼠股骨和胫骨骨髓进行培养，以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子诱导分化，第8天培养出未成熟骨髓来源树突细胞，随机分为三组，其中LPS组应用LPS刺激BMDC成熟，ALX组同时应用不同浓度的ALX进行干预，对照组不采取任何干预措施，于第10天收集细胞进行后续实验；
(2)应用八肽胆囊收缩素检测八肽胆囊收缩素组、氨来呫诺组以及对照组BMDC增殖情况，将第10天收集的各组BMDC同BALB/c小鼠脾CD4+T细胞以1:5、1:10、1:20不同比例共培养2天，应用CCK8检测上述各组T细胞增殖程度；
(3)应用流式细胞学检测各组BMDC表面分子标志物II型主要组织相容性抗原复合物，CD80，CD86平均荧光强度；
(4)应用扫描电镜及透射电镜观察LPS组，ALX组BMDC形态学特点；
(5)应用酶联免疫吸附剂测定方法检测LPS组，ALX组细胞培养上清中的炎症因子IL-6、IL-12、IL-23含量；
(6)应用Western Blot检测LPS组，ALX组和对照组BMDC中TBK1、磷酸化TANK结合激酶1、Akt、p-Akt蛋白表达；
(7)采用SPSS23.0软件进行统计分析，实验所得数据进行正态性和方差齐性检验，以均数±标准误表示。
4.根据权利要求1所述的氨来呫诺的应用，其特征在于，所述氨来呫诺通过抑制小鼠周围免疫器官脾中辅助T细胞1/辅助T细胞17细胞比例及其炎症因子改善实验性自身免疫性脑脊髓炎病情。
5.根据权利要求4所述的氨来占诺的应用，其特征在于，在所述氨来呫诺通过抑制Th1/Th17细胞及其炎症因子改善实验性自身免疫性脑脊髓炎病情时，采用的实验步骤为：
(1)采用近交系雌性C57BL/6雌性小鼠作为实验动物，周龄8-10周，体重18-20g，以MOG35-55为抗原，与完全弗氏佐剂和结核菌素混合乳化后予小鼠背部脊柱旁皮下分四点注射，并于免疫当天及第2天两次腹腔注射500ng百日咳毒素，即PTX，建立EAE模型；
(2)将免疫后雌性C57BL/6小鼠随机分为模型对照组和ALX治疗组，自免疫当天开始，ALX治疗组小鼠给予每日两次ALX灌胃，模型对照组小鼠每日同一时间以等量羧甲基纤维素钠(ALX混悬剂)进行等量灌胃，自免疫当日开始，每日评价小鼠神经功能并称重，连续观察至缓解期；
(3)应用HE染色观察脊髓腰膨大处炎性细胞浸润情况，并应用透射电镜及LFB染色观察脊髓髓鞘脱失程度；
(4)应用流式细胞学检测各组小鼠脾中Th1、Th17细胞的比例；
(5)应用ELISA方法检测脾细胞培养上清中的炎症因子白介素-17A、γ干扰素含量；
(6)应用实时荧光定量PCR方法检测小鼠脾组织及脊髓组织中炎症因子IL-17A、IFNγmRNA以及Th1和Th17细胞特异性转录因子T-bet、RORγt mRNA的转录水平；
(7)应用Western Blot技术检测小鼠脊髓中IL-17和IFNγ的蛋白表达水平；
(8)采用SPSS23.0软件进行统计分析，实验所得数据进行正态性和方差齐性检验，以均数±标准误表示。
6.根据权利要求1所述的氨来呫诺的应用，其特征在于，所述氨来呫诺通过TBK1/Akt通路抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎脾中DC成熟。
7.一种针对氨来占诺应用的实验方法，其特征在于，所述氨来呫诺的应用为上述权利要求1所述的氨来占诺的应用，通过TBK1/Akt通路抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎脾中DC成熟时，采用的实验步骤为：
(1)采用近交系雌性C57BL/6小鼠作为实验动物，8-10周龄，体重18-20g，应用MOG35-55作为抗原，与完全弗氏佐剂和结核菌素混合后给予小鼠背部皮下分四点注射，并于免疫当天及第2天分两次腹腔注射500ng百日咳毒素，建立EAE动物模型；
(2)将免疫后C57BL/6小鼠随机分为模型对照组和ALX治疗组，自免疫当天开始，ALX治疗组小鼠给予每日两次ALX灌胃，模型对照组小鼠每日同一时间以等量羧甲基纤维素钠进行灌胃，在自身免疫性脑脊髓炎，发病初期对小鼠进行取材，以备后续实验；
(3)应用流式细胞学技术检测EAE发病前期脾DC表面分子标志物MHC II，共刺激分子CD80、CD86阳性率及平均荧光强度；
(4)应用ELISA方法检测脾细胞培养上清中的炎症因子IL-6、IL-12及IL-23含量；
(5)应用免疫荧光检测方法观察脾DC中p-Akt表达；
(6)采用SPSS23.0软件进行统计分析，实验所得数据进行正态性和方差齐性检验，以均数±标准误表示。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102793693A (zh) * 2012-09-07 2012-11-28 天津医科大学 伏立诺他在制备治疗自身免疫及炎症性疾病药物方面的应用
WO2014062621A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-24 Stc.Unm Treatment of autophagy-based disorders and related pharmaceutical compositions, diagnostic and screening assays and kits
CN103874486A (zh) * 2011-09-06 2014-06-18 库尔纳公司 用小分子治疗与电压门控钠通道的α亚基(SCNxA)相关的疾病
CN108042523A (zh) * 2017-12-21 2018-05-18 同济大学 甜菜碱（Betaine）在作为预防和治疗多发性硬化症的药物中的应用
CN109481684A (zh) * 2018-12-21 2019-03-19 浙江大学 以Optineurin为靶点在制备防治自身免疫性疾病药物中的应用
CN109528738A (zh) * 2018-12-24 2019-03-29 陕西师范大学 甘草酸在制备促进髓鞘再生抑制神经炎症药物的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103874486A (zh) * 2011-09-06 2014-06-18 库尔纳公司 用小分子治疗与电压门控钠通道的α亚基(SCNxA)相关的疾病
CN102793693A (zh) * 2012-09-07 2012-11-28 天津医科大学 伏立诺他在制备治疗自身免疫及炎症性疾病药物方面的应用
WO2014062621A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-24 Stc.Unm Treatment of autophagy-based disorders and related pharmaceutical compositions, diagnostic and screening assays and kits
CN108042523A (zh) * 2017-12-21 2018-05-18 同济大学 甜菜碱（Betaine）在作为预防和治疗多发性硬化症的药物中的应用
CN109481684A (zh) * 2018-12-21 2019-03-19 浙江大学 以Optineurin为靶点在制备防治自身免疫性疾病药物中的应用
CN109528738A (zh) * 2018-12-24 2019-03-29 陕西师范大学 甘草酸在制备促进髓鞘再生抑制神经炎症药物的应用

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