CN105699639A - 一种胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法 - Google Patents

一种胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检验方法，采用小鼠建立模型用于临床前动物模型，实验稳定性高，且节省实验成本，方法可靠，经济高效，适用于胶质瘤疫苗的效力评价。

Description

一种胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术检验领域，具体涉及一种胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法。
背景技术
神经胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤，肿瘤组织与正常脑组织之间没有明显界限，外科手术及放化疗效果均不佳，术后极易复发，患者生存率低，严重威胁人类健康。针对胶质瘤的不良预后，肿瘤免疫治疗能有效打破机体对肿瘤的耐受，产生抗肿瘤免疫反应，因此极有可能成为扭转神经胶质瘤复发的有效方法。针对神经胶质瘤的肿瘤免疫治疗已经报道的肿瘤疫苗主要包括，肿瘤细胞疫苗、基因疫苗、肽疫苗、肿瘤裂解物疫苗、树突状细胞疫苗等等。肿瘤疫苗的主要作用机制主要为给机体提供肿瘤相关抗原，通过抗原提呈细胞将抗原提呈给效应细胞进而激发特异性免疫功能来攻击肿瘤细胞，克服肿瘤的免疫逃逸状态。近年研究实验证实，针对某些肿瘤类型，肿瘤疫苗可不同程度的延长肿瘤患者的生存期，具有很好的抗肿瘤效果。因此，近年来肿瘤疫苗的研发工作受到极大重视，相应临床前肿瘤疫苗效力检测方法的研究也不断推进。用于肿瘤疫苗体内效力检验的动物模型是评价疫苗作用和安全性的重要方法。在肿瘤疫苗的研发和转化过程中，由于肿瘤疫苗治疗肿瘤病灶部位、靶标和生物学特征的不同，因此不同肿瘤类型的肿瘤疫苗有必要通过配套的动物体内效力检验方法用以检验该疫苗的安全性和抗肿瘤效力。
现有已经用于评价胶质瘤肿瘤疫苗体内效力的小鼠肿瘤模型多采用皮下接种肿瘤细胞，很难模拟胶质瘤所在颅内的生长环境；有的小鼠模型采用颅内原位接种肿瘤细胞，则通过小动物核磁共振仪观察记录颅内肿瘤细胞生长情况，由于该方法荷瘤用肿瘤细胞需要特殊标记，检测仪器使用过程需要特殊防护，因此，这种检测方法并不适于中小规模实验室和医疗研究机构的应用；此外，现有检测方法的检测指标多限于小鼠的生存期和效应性T细胞的侵润情况，忽视免疫抑制性细胞的检测，并不能全面的分析肿瘤疫苗发挥抗肿瘤功能的机制。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种检验胶质瘤肿瘤疫苗体内抗肿瘤效力的方法，它可以更加全面、高效、节省成本的评价肿瘤疫苗的治疗效果。
一种胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法，包括以下步骤：
(1)、建立模型：在小鼠颅内原位注射带荧光素酶的胶质瘤细胞系GL261-Luc2，24小时后,将荧光素酶底物注射到小鼠腹腔，通过活体成像系统观察，建立颅内荷瘤小鼠模型；
(2)、免疫过程：肿瘤注射后第3天开始，间隔5-10日给予小鼠模型胶质瘤肿瘤疫苗免疫注射2-4次。
(3)、疫苗免疫后每周通过活体成像系统观察记录肿瘤细胞增殖的情况，同时记录小鼠死亡时间，绘制生存曲线，计算5周存活率；
(4)、距末次胶质瘤肿瘤疫苗免疫小鼠3-14天后处死小鼠，统计小鼠脾细胞数目变化；
(5)、距末次胶质瘤肿瘤疫苗免疫小鼠3-14天后处死小鼠，对小鼠颅内肿瘤组织微环境中CD8+T细胞(杀伤性T细胞)，Treg细胞(调节性T细胞)和MDSC(骨髓来源的抑制性细胞)进行抗体标记，采用流式细胞术检测细胞群比例；
(6)、根据以下5个指标判定胶质瘤肿瘤疫苗效力：疫苗免疫后小鼠颅内肿瘤生长缓慢或完全消失；5周存活率20％以上；脾细胞数量增加；肿瘤组织微环境中CD8+T细胞比例增加；Treg和MDSC比例二者或其中一种细胞比例降低。
优选的，当5个指标中任何2项项检验结果无变化，判定该疫苗未能对胶质瘤的明确的治疗效果。
优选的，疫苗的注射位置为小鼠双侧肩甲部皮下注射。
优选的，所述疫苗的注射体积为50-300μl/只，左右两侧等量注射。
优选的，所述所述携带荧光素酶的胶质瘤细胞系GL261-Luc2的注射量为1-2×104个/只，注射体积为1-3μl。
优选的，所述肿瘤疫苗在肿瘤细胞注射后第3天、10天和17天进行3次免疫注射。
优选的，所述通过小动物活体成像系统观察记录肿瘤细胞增殖情况的时间为肿瘤细胞注射后24h、7天、14天、21天、28天和35天。
本发明的有益效果：本发明提供了一种检验胶质瘤肿瘤疫苗效力的方法，该检验方法用小鼠建立模型用于临床前动物模型，大大节省了实验成本；采用携带荧光素酶的胶质瘤细胞系，可以在不处死小鼠的情况下，通过小动物活体成像系统观测小鼠颅内肿瘤细胞的增殖情况，实验稳定性更高，更为适用于胶质瘤肿瘤疫苗的体内效力评价。且根据5项指标判断疫苗效力，能够更全面的分析和判断肿瘤疫苗的效力。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
携带荧光素酶的小鼠胶质瘤细胞系GL261-luc2细胞和荧光素酶底物购自珀金埃尔默公司；抗体标记物购自BD公司；CpGODN购自Invivogen公司；健康6周雌性SPF级C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；小鼠脑定位系统(包括小鼠立体定向仪、微量注射泵、动物颅骨钻和动物恒温毯)购自上海奥尔科特生物科技有限公司。
实施例1：
胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法评价胶质瘤肿瘤裂解物疫苗的体内抗肿瘤效力。
胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法评价胶质瘤肿瘤裂解物疫苗的体内抗肿瘤效力，步骤如下：
(1)、建立模型：健康6周雌性SPF级C57BL/6小鼠40只，购回后一周内密切观察小鼠生长状况，第二周选取体重等无显著性差异、生长状态良好的小鼠30只，在小鼠前囟后0.5mm，右2mm处钻孔，下针3mm，注射带荧光素酶的胶质瘤细胞系GL261-Luc2细胞系，细胞浓度为1×107/ml，注射体积1.5μl/只，24小时后将荧光素酶底物以150mg/kg剂量腹腔注射到小鼠腹腔，注射体积为100μl，注射5min后通过活体成像系统观察，建立颅内荷瘤小鼠模型。
(2)、免疫过程：将荷瘤小鼠30只随机分为2组，分别为实验组和对照组，每组15只，分别在肿瘤细胞注射后第3天、10天和17天，给实验组荷瘤小鼠肩胛部皮下注射疫苗，阴性对照组荷瘤小鼠肩胛部皮下注射PBS，注射体积为200μl/只，左右两侧各100μl。实验组注射胶质瘤肿瘤裂解物疫苗，疫苗为50μg寡核苷酸佐剂CpGODN和200μl(约400μg蛋白)胶质瘤细胞裂解物(Lysate)的混合物，其中Lysate的制备方法是利用PBS洗涤商业化胶质瘤细胞系GL261两次后，调整浓度为2×107个/ml，经过反复冻融法得到肿瘤细胞裂解物；对照组不注射疫苗，仅注射PBS。
(3)、二组中分别选出10只步骤(2)中的小鼠，在建模后第7天、14天、21天、28天和35天通过小动物活体成像系统观察记录肿瘤大小，见表1。同时记录小鼠死亡时间，统计小鼠5周存活率。
(4)、二组中分别选出5只步骤(2)中的小鼠，在小鼠荷瘤28天后，处死小鼠并解剖取脾，将脾置于PBS中，轻微研磨，过滤后，裂解红细胞，获得单个脾细胞，通过细胞计数，统计小鼠脾细胞数量。
(5)、取步骤(4)中小鼠颅内肿瘤组织，经过轻微研磨，过滤，去除红细胞，获得单个细胞，每组细胞经过抗体(抗体组合如表2)标记利用流式细胞术检验小鼠颅内肿瘤组织微环境中CD8+T细胞、Treg细胞和MDSC各细胞群比例。
荷瘤小鼠经过3次疫苗免疫治疗后，小鼠5周存活率，脾细胞数量，肿瘤组织微环境中CD8+T细胞、Treg细胞和MDSC各细胞群比例，见表3.
表1实施例1中疫苗免疫后颅内肿瘤大小变化
表2
表3：实施例1中小鼠的5周存活率以及体内细胞变化。
实施例2：
胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法评价胶质瘤树突状细胞疫苗的体内抗肿瘤效力。
实验组注射胶质瘤树突状细胞疫苗，胶质瘤树突状细胞疫苗的制备方法为：将1×106个小鼠骨髓细胞诱导的树突状细胞(DC)与200μl(约400μg蛋白)胶质瘤裂解物Lysate共培养12小时后，完成树突状细胞对肿瘤相关抗原的负载，用无菌PBS洗涤树突状细胞，得到肿瘤树突状细胞疫苗；对照组不注射疫苗，仅注射PBS。
胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法，同实施例1，结果如表4和表5。
表4实施例2中疫苗免疫后小鼠的颅内肿瘤大小变化
表5：实施例2中小鼠的5周存活率以及体内细胞变化。
实验结果表明，用肿瘤裂解物疫苗和树突状细胞疫苗免疫荷瘤小鼠后，可有效抑制肿瘤增殖，小鼠5周生存率分别达到30％和20％；脾细胞数量均明显高于对照组，说明疫苗具有免疫激活的作用；肿瘤微环境侵润淋巴细胞中疫苗组CD8+T比例均高于对照组，说明两种疫苗可不同程度的提高肿瘤微环境中杀伤性T细胞比例；此外疫苗1治疗组肿瘤组织微环境中Treg细胞低于对照组，MDSC比例与对照组相比无明显差异，说明疫苗1发挥抗肿瘤的机制涉及对Treg细胞的抑制；疫苗2治疗组肿瘤组织微环境中MDSC低于对照组，Treg细胞比例与对照组相比无明显差异，说明疫苗2发挥抗肿瘤的机制涉及对MDSC的抑制。
以上结果表明，用胶质瘤肿瘤疫苗小鼠体内检测方法评价的两种胶质瘤肿瘤疫苗均不同程度抑制颅内胶质瘤的增殖，延长小鼠生存率，激活机体的免疫系统，突破免疫耐受状态，具有抗肿瘤效力。
综上，本发明实施例具有如下有益效果：本发明中的检验胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力的方法，方法可靠，经济高效，本发明中检验胶质瘤肿瘤疫苗效力的方法，大大节省了实验成本，且实验稳定性更高，更为适用于胶质瘤肿瘤疫苗的效力评价。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、建立模型：在小鼠颅内原位注射带荧光素酶的胶质瘤细胞系GL261-Luc2，24小时后,将荧光素酶底物注射到小鼠腹腔，通过活体成像系统观察，建立颅内荷瘤小鼠模型；
(2)、免疫过程：肿瘤注射后第3天开始，间隔5-10日给予小鼠模型胶质瘤肿瘤疫苗免疫2-4次。
(3)、疫苗免疫后每周通过活体成像系统观察记录肿瘤细胞增殖的情况，同时记录小鼠死亡时间，绘制生存曲线，计算5周存活率；
(4)、距末次胶质瘤肿瘤疫苗免疫小鼠3-14天后处死小鼠，统计小鼠脾细胞数目变化；
(5)、距末次胶质瘤肿瘤疫苗免疫小鼠3-14天后处死小鼠，对小鼠颅内肿瘤组织微环境中CD8+T细胞(杀伤性T细胞)，Treg细胞(调节性T细胞)和MDSC(骨髓来源的抑制性细胞)进行抗体标记，采用流式细胞术检测细胞群比例；
(6)、根据以下5个指标判定胶质瘤肿瘤疫苗效力：疫苗免疫后小鼠颅内肿瘤生长缓慢或完全消失；5周存活率20％以上；脾细胞数量增加；肿瘤组织微环境中CD8+T细胞比例增加；Treg和MDSC比例二者或其中一种细胞比例降低。
2.如权利要求1所述的胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法，其特征在于，当5个指标中任何2项项检验结果无变化，判定该疫苗未能对胶质瘤有明确的治疗效果。
3.如权利要求1所述的胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法，其特征在于，所述疫苗注射位置为小鼠双侧肩甲部皮下注射。
4.如权利要求1所述的胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法，其特征在于，所述疫苗的注射体积为50-300μl/只，左右两侧等量注射。
5.如权利要求1所述的胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法，其特征在于，所述携带荧光素酶的胶质瘤细胞系GL261-Luc2的注射量为1-2×104个/只，注射体积为1-3μl。
6.如权利要求1所述的胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法，所述颅内原位注射位置为前囟后0.5mm，右2mm处钻孔，下针3mm。
7.如权利要求1所述的胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法，所述肿瘤疫苗的免疫注射时间为肿瘤细胞注射后第3天、10天和17天。
8.如权利要求1所述的胶质瘤肿瘤疫苗鼠体效力检测方法，所述通过小动物活体成像系统观察记录肿瘤细胞增殖情况的时间为肿瘤细胞注射后24h、7天、14天、21天、28天和35天。
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