CN108042523A - 甜菜碱（Betaine）在作为预防和治疗多发性硬化症的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甜菜碱(Betaine)在作为预防和治疗多发性硬化症的药物中的应用。betaine作为药物，可以通过抑制DC/IL‑6分泌和Th17的分化缓解MS病理。与对照组相比，betaine治疗组小鼠EAE症状明显缓解，具有更低的临床评分、减少的中枢神经系统白细胞浸润和减弱的脱髓鞘，Th17在外周和中枢神经系统中比例均明显降低，虽然betaine对Th17分化没有直接影响，但是betaine可降低DC衍生的IL‑6产生，DC‑T共培养实验表明betaine是通过降低DC/IL‑6分泌减少Th17的分化比例。由此，betaine可以为预防和治疗多发性硬化症提供一种新的药物选择。

Description

甜菜碱(Betaine)在作为预防和治疗多发性硬化症的药物中 的应用

技术领域

本发明涉及甜菜碱(Betaine)在作为预防或治疗多发性硬化症的药物中的应用。

背景技术

多发性硬化症(Multiple sclerosis,MS)被认为是一种典型的由T细胞介导的中枢神经系统(Central Nervous System，CNS)自身免疫性炎症性疾病。EAE是一种已知的因与MS具有相似的临床、组织和病理相似性而广泛使用的MS动物模型。 CD4⁺自反应性T细胞的激活和分化成为Th1细胞在疾病的起始阶段为关键步骤，这些细胞同样在疾病的长期进化中扮演着重要角色，研究表明Th17细胞为另一种在EAE发病过程中具有重要致病性的T细胞，T细胞的分化过程受到细胞因子的紧密调控，DC作为外周免疫系统中最强大的抗原递呈细胞一旦成熟，其所分泌的细胞因子如IL-6,IL-1,IL-23,IL-12和TNFα可以直接影响初始T细胞的分化命运。在这些细胞因子中，IL-6对于Th17的分化是不可缺少的，研究表明IL-6敲除小鼠对MOG_35-55诱导的EAE具有耐受性，注射IL-6中和抗体可以缓解EAE，理解调控这个过程的因子有助于开发对MS进行干预的新的药物。

Betaine作为一种两性离子季铵盐化合物，于19世纪首先在甜菜汁中发现。Betaine是一种甘氨酸的衍生物，分子式为：(CH₃)₃N⁺CH₂COO^-，分子量为117.2 g/mol。后来betaine陆续在微生物、植物和动物中发现，包括小麦、贝类、菠菜和虾等海产品。Betaine最原始的生理作用为调节渗透压和作为一种甲基供体。作为调节渗透压，betaine可保护细胞、蛋白和酶类免除有害环境(比如高盐、高渗或者极端的温度)。作为一种甲基供体，betaine参与到蛋氨酸的循环中，特别是在人的肝脏和肾脏中。据文献报道，betaine可参与一系列生物学过程。Betaine可消除乙醛对具有诱导抗病毒保护性基因的激活的IFN信号的抑制作用。Betaine还通过抑制前列腺素合成调节大鼠肝脏中巨噬细胞TNF-α的释放。此外，betaine作为一种天然来源的伺料添加剂可以提高脂肪中瘦肉的比例，并且可以通过自身免疫反应改变神经-内分泌系统。进一步研究表明，溃疡性结肠炎和克罗恩病患者尿液中betaine均有显著下降，提示betaine可能参与调节免疫反应。然而betaine是否对 MS具有一定的治疗作用尚不清楚。

发明内容

本发明的目的在于：克服现有技术的不足，公开了甜菜碱(Betaine)在作为预防和治疗多发性硬化症的药物中的应用。在本发明中，我们发现betaine治疗组小鼠明显缓解了小鼠EAE临床症状和减少的炎症细胞对中枢神经系统的浸润。进一步研究表明，betaine以剂量依赖的方式减少DC/IL-6的分泌，并且通过降低 DC/IL-6分泌降低EAE小鼠脾脏和中枢神经系统中Th17的分化比例。总之，本发明研究数据表明betaine作为来源于天然植物甜菜中的成分可以为预防和治疗MS 提供一种新的药物选择。

为实现上述目标，本发明提供了如下技术方案：

本发明公开了甜菜碱(betaine)的一种新用途，即甜菜碱(Betaine)在作为治疗多发性硬化症的药物中的应用。

Betaine的化学结构式如下所示：

Betaine的分子式为：(CH₃)₃N⁺CH₂COO^-，分子量为117.2g/mol。可溶于水和醇，易潮解，有甜味，是天然高效甲基供体，能部分代替蛋氨酸和氯化胆碱，能调节渗透压。

为了更好理解本发明的实质，下面将进一步结合具体的药理试验和结果对甜菜碱(Betaine)在作为预防和治疗多发性硬化症的药物中的应用进行说明。

IL-17分泌细胞(Th17)在多种自身免疫疾病包括多发性硬化症(Multiplesclerosis，MS)中均具有致病性，而树突状细胞(Dendritic cell,DC)衍生的细胞因子在初始CD4⁺T细胞向辅助性T细胞(Th1和Th17)的分化中具有不可或缺的作用。因此，封闭DC细胞因子分泌的小分子化合物可能对治疗MS具有一定的作用。在此研究中，我们发现betaine可以作为预防和治疗多发性硬化症的药物，通过抑制DC/IL-6分泌和Th17的分化缓解MS病理。通过一种广泛使用的MS动物模型EAE(experimental autoimmune encephalomyelitis)，我们发现与对照组相比， betaine治疗组小鼠EAE症状明显缓解，包括具有更低的临床评分、减少的中枢神经系统白细胞浸润和减弱的脱髓鞘。并且，作为MS主要致病效应细胞的之一的 Th17在外周和中枢神经系统中比例均明显的降低，而且，体外分化实验表明betaine 对Th17分化没有直接影响，DC体外培养实验表明betaine可降低DC衍生的IL-6 产生，在DC-T共培养系统中，betaine处理可降低Th17的分化比例，综合以上结果表明betaine是通过降低DC/IL-6分泌减少Th17的分化比例。总而言之，我们的数据表明betaine在调控MS病理中具有关键作用，对今后MS的预防和治疗具有重要意义，可以为预防和治疗MS提供一种新的药物选择。

附图说明

图1为Betaine缓解EAE小鼠临床症状

(A)Betaine化学结构；(B-D)100mg、300mg或1g/kg体重betaine免疫前第3 天200μL/只小鼠灌胃给药，相同体积的无菌水做对照，检测EAE临床评分，数据表示为mean±SEM(n＝15)**p<0.01,***p<0.001(Mann-Whitney U test)，###p< 0.001(two-way ANOVAtest)。在EAE免疫小鼠的第18天取中腰段脊髓，石蜡包埋切片，进行(E)H&E染色和(F)快蓝染色Scale bars,200μm，并对中枢细胞浸润和脱髓鞘情况进行统计分析(G和H)，每组取5只小鼠颈椎脱臼处死，每只小鼠切15 张片子，进行统计学分析。(I-L)1g/kg体重betaine分别在免疫小鼠构建EAE模型的第3天、第16天、第22天和第27天开始灌胃给药，相同体积无菌水做对照，检测EAE临床评分，数据用Mean±SEM表示，*p<0.05，**p<0.01(Student's ttest).

图2为Betaine抑制体内Th17分化

在免疫后的第9天分别取1g/kg体重betaine给药治疗组和对照组的EAE小鼠脾脏，获得脾脏白细胞，CD4、CD8、B220和CD11b表面染色，脾脏中各细胞类型的比例(A)和细胞数量(B)用流式检测。脾细胞体外用20μg/mlMOG_35-55重刺激48h，分别对IL-17A、IFN-γ和Foxp3进行胞内染色，流式分析Th17、Th1、Treg和γδTCR⁺IL-17A⁺细胞比例，并用Graphpad Prism进行统计分析(C-J)。收集重刺激上清，ELISA检测Th17、Th1和Treg分泌的特征性细胞因子IL-17A(K)、IFN-γ(L)和 TGF-β1(M)。体外20μg/mlMOG_35-55重刺激72h，淋巴结中的Th1(N)、Th17(O)、Treg(P) 和γδTCR⁺IL-17A⁺(Q)细胞经胞内染色后进行流式分析和统计。数据用mean±SEM 表示，每组n＝5-8，**p<0.01(Student's t test)。

图3为Betaine减少中枢神经系统浸润的病理性Th17细胞

(A)在免疫构建EAE模型的第18天，用37/70％Percoll分离浸润至中枢神经系统中的细胞，流式细胞仪分析定量。(B-G)1g/kg体重betaine给药治疗组和对照组EAE 小鼠中枢神经系统中Th1、Th17和γδTCR⁺IL-17A⁺细胞比例的代表性流式图及统计数据。中枢神经系统浸润细胞体外20μg/mlMOG_35-55重刺激48h，ELISA检测上清中的IL-17A(H)。数据用mean±SEM表示，每组n＝5-10，^*p<0.05(Student's t test)。

图4为Betaine不直接影响T细胞分化

从6-8周C57BL/6小鼠脾脏中分离初始CD4⁺T细胞，并体外诱导分化成为 Th1、Th17或者Treg细胞，同时加入不同浓度的betaine。(A)Th1、Th17和Treg 细胞培养3天克隆形成情况，收集细胞分别进行IFN-γ、IL-17A和Foxp3胞内染色，并进行流式分析(B)和数据统计(C-E)。ELISA分别检测特征性细胞因子IFN-γ(F)、 IL-17A(G)和TGF-β1(H)的分泌。数据用mean±SEM表示，n＝3。

图5为Betaine降低DC分泌IL-6，但是不影响DC的成熟

未成熟骨髓衍生的树突状细胞5×10⁵/ml接种至24孔板，1、3、10、30或者100μMbetaine处理30min后，加入100ng/mlLPS刺激24h，收集细胞培养上清， ELISA分别检测上清中的IL-6(A)、TNF-α(B)、IL-1β(C)、IL-23(D)和IL-12p70(E) 分泌水平。(F)10μMbetaine与100ng/mlLPS联合刺激未成熟骨髓衍生的树突状细胞，分别在3h、6h、9h、12h和24h时收集上清，检测IL-6分泌的动力学。DC 成熟标记物CD80(G)、CD86(H)、CD40(I)和MHCII(J)的表达水平用流式分析仪进行检测。^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001(Student's t test)。

图6为Betaine通过降低DC分泌IL-6抑制Th17细胞分化

从6-8周C57BL/6小鼠中分离的初始T细胞与1μM或者10μM处理过的DC 进行共培养，同时加入anti-CD3/CD28抗体和不同浓度额IL-6，培养3天。流式分析DC-T共培养系统中的Th17细胞分化比例，所示为代表性流式图(A)和统计数据(B和C)，数据用mean±SEM表示，n＝3，^*p<0.05(Student's t test)。

具体实施方式

下面将结合具体的药理试验和结果对甜菜碱(Betaine)在作为预防和治疗多发性硬化症的药物中的应用的技术方案作进一步说明。结合下面说明，本发明的优点和特征将更加清楚。

下述实验中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规实验方法

下述实验中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一、动物

C57BL/6小鼠购自南京模式动物中心(南京，中国)。所用C57BL/6小鼠为 8-10周龄，饲养于同济大学实验动物中心SPF级实验室，自由食用水和伺料。所有实验均获得批准，并按照同济大学的动物保护委员会的指导进行。

二、EAE诱导及治疗

C57BL/6小鼠(8-10周)皮下注射200μg完全溶于完全弗氏佐剂并包含有热灭活结核杆菌(H37Ra,5mg/ml，BD Diagnostics)的MOG_35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)。免疫第0天及第2天每只小鼠腹腔注射200ng/ 只百日咳毒素(Calbiochem)。每天根据临床症状为小鼠评分，评分标准如下：0分，无临床症状；1分，尾部瘫痪；2分，轻度瘫痪(单侧或双侧后肢无力，不完全瘫痪)；3分，截瘫(双侧后肢完全瘫痪)；4分，截瘫并前肢无力或瘫痪；5分，濒死状态或死亡。药物治疗，betaine(Sigma,B2629)溶于无菌水中并按照1g/Kg剂量在免疫前3天灌胃给药直至实验结束，相同体积的200μL无菌水作为对照。

三、组织病理和免疫组织化学分析

每只小鼠用200μL 10％水合氯醛进行深度麻醉，然后0.9％NaCl心脏灌流去除各器官中的外周血，4％多聚甲醛灌流进行固定。取中腰短脊髓组织样品4％(w/v) 多聚甲醛4℃固定过夜。石蜡包埋后H&E染色分析炎症浸润，快蓝染色分析脊髓脱髓鞘，Image-Pro软件进行统计分析

四、细胞染色和流式分析

脾脏细胞、中枢神经系统浸润细胞或体外CD4⁺T分化实验细胞用PMA (50ng/ml；Sigma-Aldrich)、ionomycin(750ng/ml；Sigma-Aldrich)和brefeldin A(10μg/ml； Sigma-Aldrich)37℃刺激5小时。细胞表面标记CD4(BioLegend,00528)、 CD8(eBioscience,11-0081)、B220(eBioscience,12-0452)和CD11b(eBioscience,11-0112) 分别用相应的抗体4℃避光染色30min，然后细胞用固定通透液重悬，分别进行胞内IL-17A(BioLegend,506904,1:100)和IFN-γ(BioLegend,505810,1:100)染色。对于 Foxp3(eBioscience,12-5773-82,1:100)染色，细胞无需进行重刺激，使用Foxp3染色试剂盒按照说明书进行操作。流式分析为BD FACSVerse系统，并用FlowJo7.6软件进行分析

五、中枢神经系统浸润细胞分离和分析

脑和脊髓用预冷的组织匀浆器进行匀浆，70μm细胞滤网过滤收集至15ml离心管中，500g 4℃离心10min获得细胞，然后将细胞重悬在8ml 37％Percoll中，轻轻加入4ml70％Percoll，780g 25℃密度梯度离心25min，收集位于37/70％Percoll界面处的细胞，进行分析

六、CD4+T细胞分离和体外分化

磁珠(Invitrogen,11415D)分离7-8周C57BL/6小鼠脾中CD4⁺T细胞，4×10⁵细胞/孔接种至96孔板中，加入200μL包含10％FBS、2mML-谷氨酰胺和50μMβ-巯基乙醇的1640完全培养基进行培养，加入anti-CD3(2μg/ml；BD Pharmingen)和anti-CD28 (2μg/ml；BDPharmingen)抗体激活细胞，加入IL-12(10ng/ml；Peprotech)和 anti-IL-4(10μg/ml；BDPharmingen)诱导Th1细胞分化。对于Th17细胞分化，除了加入anti-IL-4(10μg/ml)andanti-IFN-γ(10μg/ml，BD Bioscience，551216,)抗体外还需加入Th17“细胞因子混合物”，包括IL-6(30ng/ml)、TGF-β1(3ng/ml), TNF-α(10ng/ml)和IL-1β(10ng/ml)。Treg细胞体外分化可通过加入IL-2(10ng/ml)、 TGF-β1(5ng/ml)和anti-IFN-γ(10μg/ml)完成。不同浓度的betaine与细胞因子一同加入，培养3天后收集培养上清和细胞，评估其对各种T细胞亚型分化的影响，

七、MOG重刺激上清中细胞因子的ELISA检测

EAE小鼠的betaine(1g/Kg体重)治疗组和对照组于第9天颈椎脱臼处死，分离脾脏，获得单细胞悬液，RBC裂解液裂解3min，去除红细胞，500g 4℃离心3分钟，含有20μg/mlMOG_35-55的10％FBS1640培养基中重悬，以2×10⁵/well/200μl接种至96孔板，5％CO₂培养箱中37℃培养48h,上清收集后根据特定的ELISA Kits，按照产品说明书操作步骤，分别检测IL-17a、IFN-γ和TGF-β₁的含量。

八、骨髓中树突状细胞分离、刺激、细胞因子和成熟检测

从6-8周C57BL/6小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓细胞，在含有10％FBS、2mML- 谷氨酰胺、50μMβ-巯基乙醇、20ng/ml GM-CSF和1ng/ml IL-4的1640完全培养基培养7天以获得骨髓衍生的树突状细胞，离心收集细胞，5×105细胞/孔/1ml接种至24 孔板中，分别加入1、3、10、30和100μMbetaine孵育30min，加入100ng/ml LPS刺激24h诱导树突状细胞的成熟，收集上清和细胞，上清用特定的ELISA Kits按照操作说明书分别检测IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-23和IL-12p70，细胞表面染CD11c⁺后再染CD80、CD86、CD40或者MHCII，流式分析。

九、树突状细胞-T细胞共培养

对于检测DC介导的T细胞激活和分化，DC在经过100ng/ml LPS和不同浓度的betaine处理24h后，轻轻吹打，收集细胞，充分洗涤。用CD4⁺CD62L⁺T细胞分离 Kit(MiltenyiBiotec,130-093-227)从6-8周小鼠脾脏中分离初始T细胞，将初始T细胞和充分洗涤的DC细胞按照5:1的比例接种至96孔板，然后加入anti-CD28(2μg/ml)、 anti-CD3(2μg/ml)、anti-IFN-γ(10μg/ml)、anti-IL-4(10μg/ml)和不同浓度的betaine,培养 3天后，表面染CD4后胞内染色IL-17A，流式检测Th17细胞比例。

十、统计分析

EAE小鼠处理组间统计学差异用two-way ANOVA test分析，两组间特定某一天的临床评分统计学差异用Mann–Whitney U-test分析，其他数据统计用Student’s t-test分析，数据表示为mean±SEM，P＜0.05被认为有统计学意义。

实验结果：

一、Betaine缓解小鼠EAE临床症状

Betaine的化学结构式如图1A所示，为一种三甲基甘氨酸，常被用作甲基供体，据文献报道其可以介导髓鞘的损伤修复，多发性硬化症为一种常见的自身免疫疾病，同时也是一种免疫介导脱髓鞘和中枢神经系统的退行性疾病。因此，我们评估betaine是否对多发性硬化症具有一定的治疗作用，首先，8-10周C57BL/6 雄鼠用MOG_35-55诱导EAE模型，然后分别用不同剂量的betaine(100mg/Kg、 300mg/Kg和1g/Kg体重)在免疫前第三天灌胃给药，对照组给予相同体积200μL 无菌水作为对照。

每天评估EAE临床评分直至实验结束，结果如图1B-D所示，结果表明只有 1g/Kg体重剂量的betaine不仅延缓EAE发病，而且显著缓解疾病的严重程度、降低EAE临床评分。

在免疫小鼠的第18天取白细胞浸润最明显、脱髓鞘最严重的中腰段脊髓进行组织学分析，检测中枢神经系统白细胞的浸润及髓鞘损伤情况，如图1E所示，HE 染色结果表明betaine治疗组与对照组相比脊髓中白细胞浸润明显降低，图1F所示，快蓝染色结果同样表明治疗组脱髓鞘程度明显减弱，Image-Pro软件进行统计分析，结果见图1G-H，治疗组和对照组之间具有统计学意义。

为了更深入的了解betaine治疗EAE的潜在机制，我们在EAE不同病理时期进行betaine给药治疗，我们发现在C57BL/6小鼠EAE诱导的前期阶段尚没有临床症状时进行betaine给药治疗仍然可以有效的缓解疾病，如图1I所示。但是，在平均EAE发病临床评分达到1.5分或者疾病的复发期或缓解期并没有表现出治疗效果，结果见图1J-I。表明betaine并不能对已经有明显临床症状的EAE进行有效的治疗，也就是说Th17已经诱导分化以后betaine可能会丧失治疗效果。

总之，研究数据表明betaine对EAE具有一定的疗效和保护作用。

二、Betaine不影响外周主要免疫细胞亚群

多发性硬化症是一种由外周免疫系统中免疫细胞引发的一种自身免疫疾病，据文献报道T细胞、B细胞和单核细胞参与多发性硬化症的病理过程，为了进一步探索betaine对免疫细胞的影响，在免疫构建模型的第12天，取EAE对照组和betaine 治疗组小鼠的脾脏，获得脾脏单细胞悬液，进行CD4、CD8、B220和CD11b表面染色，经流式分析，结果表明betaine并不影响小鼠体内T细胞、B细胞和巨噬细胞/单核细胞在脾脏中的比例和细胞数量，结果如图2A-B所示，综合这些数据使我们推测betaine在EAE病理中不是通过直接作用于T细胞、B细胞和巨噬细胞/单核细胞发挥治疗作用，鉴于CD4细胞的分化和增殖是参与EAE发病的一个重要先决条件，因此，我们接下来探索betaine是否通过影响辅助性T细胞而发挥疾病的治疗作用。

三、Betaine抑制体内Th17细胞分化

通常认为分泌IFN-γ的Th1细胞和分泌IL-17A的Th17细胞是引起EAE的主要病理性效应T细胞。CD4⁺T细胞在EAE发病的病理过程中不可或缺的作用使我们推测 betaine影响了何种辅助性T细胞亚型。在EAE小鼠中betaine治疗并不影响脾脏免疫器官中的T细胞、B细胞和巨噬细胞/单核细胞，我们在免疫C57BL/6小鼠构建模型的第9天取小鼠脾脏细胞，体外MOG重刺激，经流式分析发现，betaine治疗组与对照组相比MOG反应性Th17细胞比例明显下降，但是淋巴结中没有发现Th17的降低，如图2C，2D和2O所示，而Th1、Treg的比例在脾脏和淋巴结中没有改变，如图2E-H，2N和2P所示。由于γδT细胞与Th17细胞具有相似的特征，比如两者均含有细胞因子趋化因子受体6(CCR6)、维甲酸类孤儿受体(RORγt)、芳香烃受体(AhR) 和IL-23受体，因此γδT细胞是体内IL-17A的另一重要来源，因此，我们也同样检测了外周淋巴器官脾脏和淋巴结中的分泌IL-17A的γδTCR细胞，结果betaine同样对γδTCR⁺IL-17A⁺没有影响，结果如图2I,2J和2Q所示。

IL-17A是Th17细胞所分泌的主要炎症效应因子，因此，我们进一步通过ELISA 检测体外MOG_35-55重刺激48h时脾脏细胞中IL-17A的分泌情况，结果表明betaine治疗组与对照组相比Th17抗原特异性反应明显降低，具有统计学差异(p＝0.0052)，但是Th1分泌的特征性细胞因子IFN-γ和Treg分泌的特征性细胞因子TGF-β1均没有改变，见图2K-M所示。

与对照组相比，betaine可引起中枢神经系统白细胞浸润明显下降(图3A)，因此，我们进一步在免疫构建EAE模型的第18天，取小鼠的脊髓和脑，通过胞内染色和流式分析检测浸润至脊髓和脑中的与疾病活性有关的Th1、Th17和γδTCR⁺IL-17A⁺细胞比例，与EAE小鼠外周辅助性T细胞亚型的变化相同，betaine 治疗后可引起中枢神经系统中Th17比例显著下降(p＝0.0348)，如图3D-E所示。而Th1比例没有发生变化(图3B-C)，γδTCR⁺IL-17A⁺有轻微降低(图3F-G)。

以上数据表明betaine通过在外周和中枢神经系统中抑制Th17分化而发挥治疗EAE的作用。

四、Betaine不直接影响T细胞分化

由于在EAE病理过程中体内实验我们观察到betaine在外周和中枢神经系统中均可抑制Th17的分化，接下来我们验证是否betaine直接影响T细胞分化。为了验证该猜想，我们进行T细胞体外分化实验进一步探索betaine对Th1、Th17和Treg细胞分化的影响。

从8-9周C57BL/6雄鼠脾脏中通过磁细胞筛选的方法获得初始CD4⁺T细胞，初始CD4⁺T细胞分别在Th1、Th17和Treg细胞极化条件下进行细胞分化，分化的同时加入不同浓度的betaine，72h时各辅助性T细胞亚型的细胞克隆形成情况在显微镜下拍照观察(图4A)，同时收集上清和细胞，细胞分别进行IFN-γ、IL-17A和Foxp3 胞内染色，结果显示，细胞分化的克隆形成情况未发生改变，提示Th1、Th17和Treg 细胞的增殖和细胞数量可能受到betaine影响，经过流式分析和数据统计，我们发现betaine的确不影响体外Th1、Th17和Treg细胞的分化(图4B-E)。

Th1、Th17和Treg细胞分化上清用ELISA方法检测各自特征性细胞因子IFN-γ、IL-17A和TGF-β1的分泌，结果表明，ELISA所测分泌清数据与流式分析统计结果完全相符，betaine同样不影响细胞分化特征性细胞因子的分泌。

以上数据表明betaine介导EAE小鼠体内外周和中枢神经系统中Th17的抑制并不是直接作用于T细胞分化。

五、Betaine通过降低DC/IL-6分泌抑制Th17的分化

在细胞分化过程中微环境中的细胞因子是T细胞分化的主要决定因素。能够起始Th17细胞分化并与炎症细胞因子IL-17A形成正反馈通路的IL-6对于Th17细胞分化是必不可少的。我们的研究结果表明betaine在体内可降低Th17分化，但非体外，也就是说，betaine并非直接作用于Th17细胞而是通过上游DC所分泌的细胞因子进行调节。

为了进一步探索betaine介导Th17细胞分化的机制，从6-8周C57BL/6小鼠的胫骨和股骨中分离骨髓细胞，1640完全培液培养7天以获得骨髓衍生的树突状细胞 (BMDC)，然后将细胞接种至24孔板中，在LPS进行刺激同时加不同浓度的betaine(1、 3、10、30或100μM)，以评估betaine对BMDC各种细胞因子分泌的影响，特别是与 Th17细胞分化相关的细胞因子，结果如图5A-E所示，特别是DC分泌的IL-6随着 betaine浓度的增加而逐渐降低，当betaine浓度为100μM时DC所分泌的IL-6与对照组相比可降低达60％。其中在Th17分化过程中同样起重要作用的由DC分泌的TNF-α和IL-1β也在一定程度上受到betaine的抑制，相比较而言，IL-23和IL-12p70却几乎不受任何影响。为了进一步研究betaine对DC分泌IL-6的动力学影响，10μM betaine 处理DC，分别3h、6h、9h、12h和24h收集对照组和betaine处理组上清，ELISA检测不同时间点betaine对DC所分泌IL-6的情况，结果如图5F所示，betaine对DC所分泌的IL-6在9h时具有显著性差异。同时betaine并不影响DC细胞的成熟(图5F-I)，这些数据表明betaine主要显著降低DC所分泌的IL-6但并不影响DC的成熟。

IL-6是导致初始T细胞向Th17细胞分化的关键细胞因子，为了进一步明确betaine对DC所介导对的T细胞分化的影响。我们通过将DC和初始T细胞进行共培养以模拟体内DC对T细胞分化的影响。初始T细胞被分选获得后分别与betaine处理组和对照组的DC在Th17极化条件下(无细胞因子加入)进行共培养3天，然后进行流式细胞分析Th17的比例。结果表明，与对照组相比，betaine处理组的Th17比例从5.03％降至1.48％(图6A-B)，为了进一步评判在DC-T共培养中Th17细胞比例的降低是否由IL-6引起的，我们接下来在DC-T共培养中加入不同浓度的IL-6，结果发现 Th17分化比例得以恢复，表明betaine处理DC引起IL-6分泌降低是导致Th17分化降低的原因。

综合以上结果，我们的数据证明了betaine可以通过抑制DC/IL-6分泌及由此引起的体内脾脏和中枢神经系统中Th17分化水平降低来缓解EAE临床和组织病理状况，表明betaine在调控MS病理中具有关键作用，对今后MS的预防和治疗具有重要意义，可以为预防和治疗MS提供一种新的药物选择。

上述描述仅是对本发明较佳实施例的描述，并非是对本发明范围的任何限定。任何熟悉该领域的普通技术人员根据上述揭示的技术内容做出的任何变更或修饰均应当视为等同的有效实施例，均属于本发明技术方案保护的范围。

Claims (3)

1.甜菜碱(Betaine)在作为预防多发性硬化症的药物中的应用。

2.甜菜碱(Betaine)在作为治疗多发性硬化症的药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：甜菜碱(Betaine)的有效剂量为1g/Kg体重。