JP6471176B2 - 遺伝子発現制御のための天然型ｍｉＲＮＡおよびその用途 - Google Patents

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Description

本発明は、遺伝子発現を抑制する天然型ｍｉＲＮＡおよびその用途に関する。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子の発現を抑制する核酸分子として知られており、例えば、以下のような生成プロセスを経て、遺伝子がコードするタンパク質の転写を抑制すると報告されている。すなわち、まず、核内において、５’末端にキャップ構造、３’末端にポリ（Ａ）を有するｍｉＲＮＡ転写産物（Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）が生成される。前記Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅ（Ｄｒｏｓｈａ）により切断され、ｍｉＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が生成される。前記Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ループ領域とステム領域とを有するヘアピン構造をとる。このＰｒｅ−ｍｉＲＮＡは、核外に移動した後、細胞質のＲＮａｓｅ（Ｄｉｃｅｒ）により分解され、３’末端に１〜４塩基のオーバーハングを有する、二本鎖のｍｉＲＮＡ（成熟ｍｉＲＮＡ）が切り出される。この二本鎖のｍｉＲＮＡのうち、一方の鎖は、ガイド鎖と呼ばれ、他方の鎖は、パッセンジャー鎖と呼ばれ、前記ガイド鎖が、ＲＮＡ ｉｎｄｕｃｅｄ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）に類似した複合体に結合する。このｍｉＲＮＡ／ＲＩＳＣ複合体が、特定のｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に結合することによって、前記ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳が抑制される。
ｍｉＲＮＡは、分化、細胞増殖、アポトーシス等の生命現象やウイルス感染症、ガン等の多くの疾患に深く関わっていることが明らかになってきている（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２）。このことから、特に医療分野における応用が期待されている。
ＷＯ ２０１０／０５６７３７ Ａ２
Deiters, 2009, The AAPS Journal, 12, 51-60 Takeshita et al., 2010, Mol. Ther., 18, 181-187
前記ｍｉＲＮＡを応用するにあたっては、例えば、二本鎖の成熟ｍｉＲＮＡやｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを使用する方法等がある。しかし、前者の場合、使用に先立って、二本の一本鎖核酸分子をアニーリングする必要があり、また、二本鎖を認識するＴＬＲ３等によって自己免疫を発生する可能性がある。一方、後者の場合は、ヌクレオチド数が大きくなるため、合成が容易ではなくコスト面で不利であるばかりでなく、細胞内移行性や薬物動態の問題も存在する。
そこで、本発明は、成熟ｍｉＲＮＡの構造を利用した、新たな天然型ｍｉＲＮＡの提供を目的とする。
尚、本明細書において、「天然型ｍｉＲＮＡ」とは、天然に存在する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖とパッセンジャー鎖とを含み、かつ該成熟ｍｉＲＮＡと同質の活性（即ち、標的遺伝子の発現抑制活性）を有する一本鎖核酸分子を意味し、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖以外の部分に人工の構成要素を含むことを妨げない。
前記目的を達成するために、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、
Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、非ヌクレオチド構造のリンカー領域を介して連結し、
前記Ｘ領域は、成熟ｍｉＲＮＡの（ａ）ガイド鎖配列または（ｂ）パッセンジャー鎖配列を含み、
（ａ）の場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖配列を含み、
（ｂ）の場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含み、
前記ガイド鎖配列と前記パッセンジャー鎖配列とが、二重鎖構造を形成することを特徴とする。
本発明の組成物は、遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。
本発明の組成物は、薬学的組成物であって、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。
本発明の発現抑制方法は、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを使用することを特徴とする。
本発明の疾患の治療方法は、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを、患者に投与する工程を含み、前記天然型ｍｉＲＮＡにおける前記ガイド鎖配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列であることを特徴とする。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡによれば、容易に低コストで合成でき、且つ、前記遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制が可能である。
図１は、天然型ｍｉＲＮＡの一例を示す概略図である。 図２は、実施例１におけるＡＸＬ ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図３は、実施例２におけるＡＸＬ ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図４は、実施例３におけるＡＸＬ ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図５は、実施例４におけるＨＭＧＡ２ ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図６は、実施例５におけるＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図７は、実施例６におけるＡＸＬ ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図８は、実施例７におけるＨＭＧＡ２ ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図９は、実施例８におけるＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図１０は、実施例９におけるＡＸＬ ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図１１は、実施例１０におけるＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図１２は、実施例１１におけるＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。 図１３は、実施例１１におけるＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡ量の相対値を示すグラフである。
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
（１）天然型ｍｉＲＮＡ
本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、前述のように、
Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、非ヌクレオチド構造のリンカー領域を介して連結し、
前記Ｘ領域は、成熟ｍｉＲＮＡの（ａ）ガイド鎖配列または（ｂ）パッセンジャー鎖配列を含み、
（ａ）の場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖配列を含み、
（ｂ）の場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含み、
前記ガイド鎖配列と前記パッセンジャー鎖配列とが、二重鎖構造を形成することを特徴とする。
前記Ｘ領域がガイド配列を含むか（ａ）、パッセンジャー鎖配列を含むか（ｂ）は、必ずしも制限されないが、好ましくは、ガイド鎖配列とパッセンジャー鎖配列とは、天然に存在するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと同じ方向（即ち、5’→3’方向もしくは3’→5’方向）に配置される。即ち、天然に存在するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが5’方向からガイド鎖−ループ領域−パッセンジャー鎖の順序で配置されている場合、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、前記Ｘ領域にガイド鎖配列を含むことが好ましく、逆に、天然に存在するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが3’方向からガイド鎖−ループ領域−パッセンジャー鎖の順序で配置されている場合、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、前記Ｘ領域にパッセンジャー鎖配列を含むことが好ましい。
後述の実施例でいえば、ｍｉＲ−３４ａやｌｅｔ−７ａは前記Ｘ領域にガイド鎖配列を含むことが好ましく、ｍｉＲ−２９ｂは前記Ｘ領域にパッセンジャー鎖配列を含むことが好ましい。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、例えば、標的遺伝子の発現を抑制できる。発現抑制とは、例えば、前記標的遺伝子の翻訳の抑制、すなわち、前記標的遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制を意味し、より詳細には、前記標的遺伝子のｍＲＮＡからの前記タンパク質の翻訳の抑制を意味する。前記標的遺伝子の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記タンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質があげられる。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、一本鎖の核酸分子であるため、例えば、成熟ｍｉＲＮＡのように二本の一本鎖をアニーリングする必要もなく、安価に製造できる。さらに、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、一本鎖の核酸分子であるため、例えば、自己免疫に関与するＴＬＲ３、ＲＩＧ-Ｉ、ＭＤＡ５等に認識されることも回避できる。
また、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、ガイド鎖配列とパッセンジャー鎖配列とが、非ヌクレオチド構造のリンカー分子を介して連結されているため、比較的長いヌクレオチドループを有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをもとにした一本鎖核酸分子に比べ、合成が容易かつ安価に提供でき、薬物動態や細胞内移行性にも優れる。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおける前記Ｘ領域および前記Ｙ領域の配置関係の概略を、図１に示す。なお、図１は、概略であって、例えば、各領域の長さ、形状等は、制限されない。本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、図１に示すように、５’側に前記Ｘ領域が配置され、３’側に前記Ｙ領域が配置され、前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、非ヌクレオチド構造のリンカー領域（図において「Ｐ」で表す）を介して連結している。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記Ｘ領域は、任意の成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列またはパッセンジャー鎖配列を含み、前記Ｘ領域が前記ガイド鎖配列を含む場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖配列を含み、前記Ｘ領域が前記パッセンジャー鎖配列を含む場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含むので、前記Ｘ領域と前記Ｙ領域とは、前記ガイド鎖配列と前記パッセンジャー鎖配列との間で、分子内アニーリング（自己アニーリングともいう）する。即ち、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、前記分子内アニーリングした領域において、二重鎖構造を形成する。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、その５’末端と３’末端とが未連結である、線状一本鎖核酸分子である。本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、例えば、両末端の未結合の維持のため、５’末端が非リン酸基であることが好ましい。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記Ｘ領域は、前述のように、成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列（パッセンジャー鎖配列）を含む。一方、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖配列（ガイド鎖配列）を含む。成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖およびパッセンジャー鎖配列は、例えば、各種データベースに登録されている（例えば、http://www.mirbase.org/等）。したがって、例えば、これらの公知の成熟ｍｉＲＮＡの情報に基づいて、前記Ｘ領域および前記Ｙ領域を設定できる。前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖とは、RNA-induced silencing complex（ＲＩＳＣ）のArgonaute（Ａｇｏ）タンパク質に取り込まれ、ターゲットのｍＲＮＡに結合する鎖であり、前記成熟ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖とは、最終的にＲＩＳＣから除かれる、成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖に相補的な鎖である。通常、成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖とパッセンジャー鎖とは、完全相補的ではなく、それぞれに１ないし数個の対形成しない塩基を含む。
以下の説明では、前記Ｘ領域が前記ガイド鎖配列を含む場合を例にとって詳述するが、当業者であれば、以下の記載から、前記Ｘ領域が前記パッセンジャー鎖配列を含む態様における本発明の天然型ｍｉＲＮＡの構成を容易に理解することができる。
前記Ｘ領域は、例えば、前記ガイド鎖配列のみからなってもよいし、さらに付加配列を有してもよい。後者の場合、前記Ｘ領域は、例えば、前記ガイド鎖配列と前記付加配列とからなり、前記付加配列は、例えば、前記ガイド鎖配列の３’末端に連結している。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記ガイド鎖配列と前記パッセンジャー配列とをアライメントした際、ガイド鎖の３’末端側にオーバーハングを有する場合、前記Ｙ領域は、前記パッセンジャー鎖の５’末端側に前記オーバーハングの配列に相補的な配列を含む。また、前記Ｘ領域が付加配列を含む場合、前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域と前記Ｙ領域とをアライメントした際、前記Ｘ領域の付加配列と相補的な配列を含む。前記Ｘ領域の付加配列が前記ガイド鎖配列の３’末端に連結している場合、前記相補的な配列は、前記パッセンジャー鎖配列の５’末端に連結している。前記相補的な配列は、前記ガイド鎖配列と前記パッセンジャー配列との二重鎖に連続する二重鎖構造を形成し得る限り、完全相補的でなくてもよいが、完全相補的であることが望ましい。前記Ｙ領域は、前記パッセンジャー配列と前記Ｘ領域の付加配列に相補的な配列とのみからなってもよいし、さらに前記Ｘ領域とは対形成しないオーバーハングを有してもよい。すなわち、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、例えば、前記Ｙ領域と前記Ｘ領域とをアライメントした際に、前記Ｙ領域が、３’末端にオーバーハングを有してもよい。ここで、前記Ｙ領域のオーバーハングとは、例えば、前記Ｙ領域と前記Ｘ領域とをアライメントした場合に、前記Ｙ領域が前記Ｘ領域よりも過剰に有する末端の塩基である。オーバーハングの長さ（Ｏ）は、例えば、下記式で表すことができる。
オーバーハングの長さ（Ｏ）＝［Ｙ領域の全長の塩基数（Ｙ）］−［Ｘ領域の全長の塩基数（Ｘ）］
但し、多くの成熟ｍｉＲＮＡは、パッセンジャー鎖の３’末端に、ガイド鎖と対形成しないオーバーハングを有しているので、前記Ｙ領域において、前記パッセンジャー鎖の３’末端側に、さらに人工のオーバーハングを付加する必要がない場合が多い。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、各領域の長さは、特に制限されない。以下に、条件を例示するが、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、これらの記載には限定されない。また、本発明において、塩基の数値範囲は、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、例えば、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
前記Ｘ領域において、前記ガイド鎖配列の長さは、特に制限されず、例えば、報告されている成熟ｍｉＲＮＡにおけるガイド鎖配列の長さが例示できる。具体例として、下限が、例えば、１９塩基長、２０塩基長であり、上限が、例えば、２５塩基長、２４塩基長であり、範囲が、例えば、１９〜２５塩基長、２０〜２４塩基長である。
前記Ｘ領域における前記付加配列の長さは、特に制限されず、下限が、例えば、０塩基長、１塩基長、２塩基長であり、上限が、例えば、７塩基長、５塩基長、４塩基長、３塩基長であり、範囲が、例えば、０〜７塩基長、０〜５塩基長、１〜５塩基長、１〜４塩基長、２〜３塩基長、３〜５塩基長である。前記付加配列の長さの範囲は、３〜７塩基長が好ましく、３〜５塩基長がより好ましい。
前記Ｘ領域における前記付加配列の塩基配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さが３塩基長の場合、例えば、ＵＡＡ、ＵＧＧ、ＵＣＣ、ＣＡＡ、ＣＧＧ、ＣＣＣ等が挙げられる。前記付加配列の長さが４塩基長の場合、例えば、ＵＡＡＵ、ＵＵＡＡ、ＵＵＧＧ、ＵＵＵＵ等が挙げられる。前記付加配列の長さが５塩基長の場合、例えば、ＵＡＡＵＵ、ＵＣＣＧＧ、ＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＡ、ＵＵＵＡＵ、ＵＵＡＵＵ、ＵＡＵＵＵ、ＵＵＵＡＡ、ＵＵＡＵＡ、ＵＡＵＵＡ、ＵＵＡＡＵ、ＵＡＵＡＵ、ＵＵＡＡＡ、ＵＡＵＡＡ、ＵＡＡＵＡ、ＵＡＡＡＵ、ＵＡＡＡＡ、ＵＵＵＧＧ、ＡＵＵＡＡ、ＡＵＵＵＵ、ＣＵＵＡＡ、ＣＵＵＵＵ、ＧＵＵＡＡ、ＧＵＵＵＵ等が挙げられる。前記付加配列の長さが７塩基長の場合、例えば、ＵＡＡＵＵＡＡ、ＵＣＣＧＧＣＣ等が挙げられる。前記付加配列の塩基配列および前記付加配列と相補的な配列の塩基配列は、ＡＵリッチであることが好ましい。
前記Ｘ領域の長さは、特に制限されず、下限が、例えば、１９塩基長、２１塩基長、２３塩基長であり、上限が、例えば、３５塩基長、３０塩基長、２８塩基長、２６塩基長であり、範囲が、例えば、１９〜３５塩基長、１９〜３０塩基長、２１〜２８塩基長、２３〜２６塩基長である。
前記Ｙ領域における前記オーバーハング（前記パッセンジャー鎖自体がオーバーハングを有する場合はそれを含む）の長さは、特に制限されず、下限が、例えば、０塩基長、１塩基長であり、上限が、例えば、４塩基長、３塩基長であり、範囲が、例えば、０〜４塩基長、１〜３塩基長、２塩基長である。
前記オーバーハングの配列は、特に制限されず、例えば、３’側から、ＵＵ、ＣＵ、ＧＣ、ＵＡ、ＡＡ、ＣＣ、ＵＧ、ＣＧ、ＡＵ、ＴＴ等が例示できる。前記オーバーハングは、例えば、ＴＴとすることで、ＲＮＡ分解酵素に対する耐性を付加できる。
前記Ｙ領域の長さは、特に制限されず、下限が、例えば、１９塩基長、２１塩基長、２３塩基長であり、上限が、例えば、３７塩基長、３２塩基長、３０塩基長、２８塩基長であり、範囲が、例えば、１９〜３７塩基長、１９〜３２塩基長、２１〜３７塩基長、２１〜３０塩基長、２３〜２８塩基長である。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡの全長（Ｔ）は、特に制限されず、下限が、例えば、３８塩基長、４２塩基長、４６塩基長であり、上限が、例えば、７２塩基長、６２塩基長、５８塩基長、５４塩基長であり、範囲が、例えば、３８〜７２塩基長、４０〜６８塩基長、３８〜６２塩基長、４２〜５８塩基長、４６〜５４塩基長である。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記成熟ｍｉＲＮＡの種類は、特に制限されず、標的とする遺伝子の種類に応じて、適宜選択できる。
前記成熟ｍｉＲＮＡとしては、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（miRBase Accession No. MI0000268）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（miRBase Accession No. MI0000060）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（miRBase Accession No. MI0000067）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（miRBase Accession No. MI0000479）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ（miRBase Accession No. MI0000105）等の成熟ｍｉＲＮＡがあげられる。
ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（配列番号１／配列番号２）
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU ／CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号３／配列番号４）
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU ／CUAUACAAUCUACUGUCUUUC
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号５／配列番号６）
UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU ／CUAUACAAUCUAUUGCCUUCCC
ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号７／配列番号８）
UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG ／CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG
ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ（配列番号１０／配列番号９）
GCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGA ／UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
ここで、各ヌクレオチド配列は、ガイド鎖配列／パッセンジャー配列（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂのみパッセンジャー鎖配列／ガイド鎖配列）の順で、それぞれ5’→3’方向に記載している。
ｍｉＲ−３４ａのガイド鎖は、例えば、ＡＸＬ、ＭＥＴ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＳＩＲＴ１、ＣＣＮＤ１、ＳＩＲＴ１、ＢＣＬ−２等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、肝がん、乳がん等の疾患を予防または治療できる。
ｌｅｔ−７ａのガイド鎖は、例えば、ＨＭＧＡ２（high mobility group AT-hook 2）、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、ＴＬＲ４等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、肝がん、乳がん等の疾患を予防または治療できる。
ｌｅｔ−７fのガイド鎖は、例えば、ＨＭＧＡ２（high mobility group AT-hook 2）、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、ＴＬＲ４等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、肝がん、乳がん等の疾患を予防または治療できる。
ｍｉＲ−１５０のガイド鎖は、例えば、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ４Ａ４、ＳＭＡＤ２、ＳＰ１等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、肺線維症、肝線維症等の疾患を予防または治療できる。
ｍｉＲ−２９ｂのガイド鎖は、例えば、ＣＯＬ１Ａ１、ＭＣＬ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＴＧＦｂ３等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、肝がん、乳がん、肺線維症、肝線維症等の疾患を予防または治療できる。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡの構成単位は、特に制限されず、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基があげられる。本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡが、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１個もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基であってもよい。本発明の天然型ｍｉＲＮＡが、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびＵ（ウラシル）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有する。
前記非修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、具体的には、例えば、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい。前記代替物は、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等があげられる。
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記非ヌクレオチド構造のリンカー領域は、アミノ酸残基、ポリアミン残基、およびポリカルボン酸残基からなる群から選択される少なくとも一つを含むことが好ましい。前記リンカー領域は、アミノ酸残基、ポリアミン残基、およびポリカルボン酸残基以外の残基を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。例えば、前記リンカー領域は、ポリカルボン酸残基、テレフタル酸残基またはアミノ酸残基のいずれかを含むものであってよい。
本発明において、「ポリアミン」は、アミノ基を複数（２つ、または３つ以上）含む任意の化合物をいう。前記「アミノ基」は、−ＮＨ２基に限定されず、イミノ基（−ＮＨ−）も含む。本発明において、前記ポリアミンは、特に限定されないが、例えば、１，４−ジアミノベンゼン、１，３−ジアミノベンゼン、１，２−ジアミノベンゼン等が挙げられる。また、本発明において、「ポリカルボン酸」は、カルボキシ基を複数（２つ、または３つ以上）含む任意の化合物をいう。本発明において、前記ポリカルボン酸は、特に限定されないが、例えば、１，４−ジカルボキシベンゼン（テレフタル酸）、１，３−ジカルボキシベンゼン（イソフタル酸）、１，２−ジカルボキシベンゼン（フタル酸）等が挙げられる。また、本発明において、「アミノ酸」は、後述するように、分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む任意の有機化合物をいう。前記「アミノ基」は、−ＮＨ２基に限定されず、イミノ基（−ＮＨ−）も含む。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記アミノ酸残基は、複数のアミノ酸残基が連結したものであってもよい。なお、本発明において、複数のアミノ酸残基が連結したアミノ酸残基とは、例えば、ペプチド構造を含む残基をいう。より具体的には、前記複数のアミノ酸残基が連結したアミノ酸残基は、例えば、後述する化学式（Ｉ）のアミノ酸残基において、後述する化学式（Ｉａ）がペプチド（例えば、グリシン二量体またはグリシン三量体等）であるアミノ酸残基をいう。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記アミノ酸残基は、グリシン残基、テレフタル酸アミド残基、プロリン残基またはリシン残基であってもよい。また、前記アミノ酸残基は、修飾アミノ酸残基またはアミノ酸の誘導体であってもよい。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記リンカー領域は、例えば、下記化学式（Ｉ−０）で表わされる。
前記化学式（Ｉ−０）中、
Ｑ１１およびＱ１２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｑ１およびＱ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
前記Ｘ領域および前記Ｙ領域は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー残基に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ−０）であり、
Ａは、任意の原子団である。
前記Ｘ領域および前記Ｙ領域と、−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記Ｘ領域は、−ＯＲ２−を介して、前記Ｙ領域は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記Ｘ領域は、−ＯＲ１−を介して、前記Ｙ領域は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
前記化学式（Ｉ−０）において、例えば、Ｑ１１がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であり、Ｑ１がＮＨ（イミノ基）であってもよい。また、例えば、Ｑ１１がＮＨ（イミノ基）であり、Ｑ１がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であってもよい。また例えば、Ｑ１２がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であり、Ｑ２がＮＨ（イミノ基）であってもよい。また、例えば、Ｑ１２がＮＨ（イミノ基）であり、Ｑ２がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であってもよい。
前記化学式（Ｉ−０）中、Ｑ１１およびＱ１２は、例えば、それぞれカルボニル基であってもよい。この場合において、Ｑ１およびＱ２が、それぞれイミノ基であることが好ましい。また、この場合において、下記化学式（Ｉα）の構造が、下記化学式（Ｉα２）で表されることがより好ましい。
前記化学式（Ｉα２）中、
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１００における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄにおいて例示する後述の置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。また、前記化学式（Ｉα２）の構造が、下記化学式（Ｉα３）で表されることがさらに好ましい。
なお、Ｑ１１およびＱ１２がカルボニル基であり、かつＱ１およびＱ２がイミノ基である場合、前記化学式（Ｉ−０）のリンカー残基は、カルボン酸アミド残基であるということもできるが、カルボン酸残基であるということもできる。例えば、後述の実施例における「TPA」構造は、テレフタル酸アミド残基であるということもできるが、前記化学式（Ｉα３）で表されるテレフタル酸の残基であるということもできる。
前記化学式（Ｉ−０）中、Ｑ１１およびＱ１２が、それぞれイミノ基であってもよい。この場合において、Ｑ１およびＱ２が、それぞれカルボニル基であることが好ましい。また、この場合において、下記化学式（Ｉβ）の構造が、下記化学式（Ｉβ２）で表されることがより好ましい。
前記化学式（Ｉβ２）中、
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。具体的には、例えば、前記化学式（Ｉα２）中のＲ１００と同様である。また、前記化学式（Ｉβ２）の構造が、下記化学式（Ｉβ３）で表されることがさらに好ましい。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記リンカー残基が、アミノ酸残基である場合、前記アミノ酸残基は、例えば、下記化学式（Ｉ）で表わされる。なお、下記化学式（Ｉ）の構造は、前記化学式（Ｉ−０）で表される構造の一例である。
前記式（Ｉ）中、例えば、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｌ１およびＬ２は、前記と同様である。
前記microRNAの配列に対する相補的配列は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記アミノ酸残基に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記化学式（Ｉａ）は、アミノ酸またはペプチドである。
前記化学式（Ｉ）、（Ｉα）または（Ｉａ）中の原子団Ａは、例えば、鎖式原子団、脂環式原子団、芳香族性原子団、ヘテロ芳香族性原子団、およびヘテロ脂環式原子団からなる群から選択される少なくとも一つを含んでいても含んでいなくても良い。前記鎖式原子団は、特に限定されないが、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等が挙げられる。前記脂環式原子団は、特に限定されないが、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等が挙げられる。前記芳香族性原子団は、特に限定されないが、例えば、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、縮環系アリール、縮環系アリールアルキル、縮環系アルキルアリール等が挙げられる。前記ヘテロ芳香族性原子団は、特に限定されないが、例えば、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリール、縮環系ヘテロアリール、縮環系ヘテロアリールアルキル、縮環系アルキルヘテロアリール等が挙げられる。また、前記化学式（Ｉ）、（Ｉα）または（Ｉａ）中の原子団Ａにおいて、前記各原子団は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基または保護基は、複数の場合は同一でも異なってもよい。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。
本発明において、「アミノ酸」は、前述のとおり、分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む任意の有機化合物をいう。前記「アミノ基」は、−ＮＨ２基に限定されず、イミノ基（−ＮＨ−）も含む。例えば、プロリン、ヒドロキシプロリン等は、分子中に−ＮＨ２基を含まず、イミノ基（−ＮＨ−）を含むが、本発明における「アミノ酸」の定義に含まれる。本発明において、前記「アミノ酸」は、後述するとおり、天然アミノ酸でもよいし、人工アミノ酸でもよい。例えば、後述する化学式（Ｉａ２）または（Ｉａ３）で表される化合物も、分子中にアミノ基およびカルボキシ基を含むため、本発明における「アミノ酸」の定義に含まれる。したがって、例えば、前記化学式（Ｉ）において、原子団Ａが、後述の化学式（Ａ２）または化学式（Ａ２ａ）で表される構造は、本発明における「アミノ酸残基」の定義に含まれる。また、例えば、後述の実施例における「TPA」構造も、本発明における「アミノ酸残基」の定義に含まれる。また、本発明において、「ペプチド」は、２分子以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造の有機化合物をいう。前記ペプチド結合は、酸アミド構造でも良いし、酸イミド構造でも良い。また、前記化学式（Ｉａ）で表すアミノ酸またはペプチド分子中にアミノ基が複数存在する場合は、前記化学式（Ｉａ）中に明示しているアミノ基は、いずれのアミノ基であっても良い。また、前記化学式（Ｉａ）で表すアミノ酸またはペプチド分子中にカルボキシ基が複数存在する場合は、前記化学式（Ｉａ）中に明示しているカルボキシ基は、いずれのカルボキシ基であっても良い。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡの前記アミノ酸残基において、前記アミノ酸は、例えば、前述のとおり、天然アミノ酸でも良いし、人工アミノ酸であっても良い。なお、本発明において、「天然アミノ酸」は、天然に存在する構造のアミノ酸またはその光学異性体をいう。前記天然アミノ酸の製造方法は特に限定されず、例えば、天然から抽出しても良いし、合成しても良い。また、本発明において、「人工アミノ酸」は、天然に存在しない構造のアミノ酸をいう。すなわち、前記人工アミノ酸は、アミノ酸すなわちアミノ基を含むカルボン酸誘導体（分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む有機化合物）であって、天然に存在しない構造のカルボン酸誘導体をいう。前記人工アミノ酸は、例えば、ヘテロ環を含まないことが好ましい。前記アミノ酸は、例えば、タンパク質を構成するアミノ酸であっても良い。前記アミノ酸は、例えば、グリシン、α−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシリシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、トリプトファン、β−アラニン、１−アミノ−２−カルボキシシクロペンタン、アミノ安息香酸、アミノピリジンカルボン酸および下記化学式（Ｉａ２）で表されるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１種類であっても良く、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。また、前記化学式（Ｉａ）のペプチドでないアミノ酸に、光学異性体、幾何異性体、立体異性体等の異性体が存在する場合は、いずれの異性体でも良い。
前記化学式（Ｉａ２）中、
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１００における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。また、前記化学式（Ｉａ２）の構造は、例えば、下記化学式（Ｉａ３）であってもよい。
なお、前記化学式（Ｉａ）の構造が、前記化学式（Ｉａ２）である場合、前記化学式（Ｉ）中の原子団Ａの構造は、下記化学式（Ａ２）で表される。下記化学式（Ａ２）中のＲ１００は、前記化学式（Ｉａ２）中のＲ１００と同じである。また、前記化学式（Ｉａ）の構造が、前記化学式（Ｉａ３）である場合、前記化学式（Ｉ）中の原子団Ａの構造は、下記化学式（Ａ２ａ）で表される。
前記化学式（Ｉ）の構造は、例えば、下記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）が例示でき、下記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）において、ｎおよびｍは、前記化学式（Ｉ）と同じである。
前記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）において、ｎおよびｍは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記化学式（Ｉ−１）においてｎ＝１１およびｍ＝１２、または、ｎ＝５およびｍ＝４と、前記化学式（Ｉ−４）においてｎ＝５およびｍ＝４と、前記化学式（Ｉ−６）において、ｎ＝４およびｍ＝４と、前記化学式（１−７）においてｎ＝５およびｍ＝４とがあげられる。その構造を、下記化学式（Ｉ−１ａ）、（Ｉ−１ｂ）、（Ｉ−４ａ）、（Ｉ−６ａ）および（Ｉ−７ａ）に示す。
あるいは、本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記リンカー領域は、例えば、下記式（ＩＩ）で表わされる。
前記式（ＩＩ）中、例えば、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり、
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記Ｘ領域および前記Ｙ領域は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記非ヌクレオチド構造に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（ＩＩ）である。
前記式（ＩＩ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記式（ＩＩ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
前記式（ＩＩ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
前記式（ＩＩ）中、環Ａにおいて、ｌは、１または２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、前記ピロリジン骨格である。前記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、前記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型およびＤ型のいずれでもよい。
前記式（ＩＩ）中、Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基である。Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。
置換基Ｒ３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４またはオキソ基（＝Ｏ）等である。
Ｒ４およびＲ５は、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。以下、同様である。置換基Ｒ３は、これらの列挙する置換基であってもよい。
前記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 Prenum Press, London and New York, 1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、シリル含有基もあげられる。以下、同様である。
前記式（ＩＩ）中、Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
前記式（ＩＩ）中、Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
Ｌ１のｎおよびＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎおよびｍは、例えば、前記非ヌクレオチド構造の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎおよびｍは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基である。前記置換基および前記保護基は、例えば、前述と同様である。
前記式（ＩＩ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
前記Ｘ領域および前記Ｙ領域は、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記非ヌクレオチド構造に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式（ＩＩ）の構造である。Ｒ１および／またはＲ２が前記ヌクレオチド残基の場合、前記非ヌクレオチド構造は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１および／またはＲ２を除く前記式（ＩＩ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１および／またはＲ２が前記式（ＩＩ）の構造の場合、前記非ヌクレオチド構造は、例えば、前記式（ＩＩ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（ＩＩ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（ＩＩ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１およびＲ２が存在しない場合、前記非ヌクレオチド構造は、例えば、前記式（ＩＩ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基のみから形成される。
前記Ｘ領域および前記Ｙ領域と、−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記Ｘ領域は、−ＯＲ２−を介して、前記Ｙ領域は、−ＯＲ１−を介して、前記式（ＩＩ）の構造と結合する。
条件（２）
前記Ｘ領域は、−ＯＲ１−を介して、前記Ｙ領域は、−ＯＲ２−を介して、前記式（ＩＩ）の構造と結合する。
前記式（ＩＩ）の構造は、例えば、下記式（ＩＩ−１）〜式（ＩＩ−９）が例示でき、下記式において、ｎおよびｍは、前記式（ＩＩ）と同じである。下記式において、ｑは、０〜１０の整数である。
前記式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−９）において、ｎ、ｍおよびｑは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（ＩＩ−１）において、ｎ＝８、前記（ＩＩ−２）において、ｎ＝３、前記式（ＩＩ−３）において、ｎ＝４または８、前記（ＩＩ−４）において、ｎ＝７または８、前記式（ＩＩ−５）において、ｎ＝３およびｍ＝４、前記（ＩＩ−６）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（ＩＩ−７）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記（ＩＩ−８）において、ｎ＝５およびｍ＝４、前記式（ＩＩ−９）において、ｑ＝１およびｍ＝４があげられる。前記式（ＩＩ−４）の一例（ｎ＝８）を、下記式（ＩＩ−４ａ）に、前記式（ＩＩ−８）の一例（ｎ＝５、ｍ＝４）を、下記式（ＩＩ−８ａ）に示す。
本発明において、「アルキル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキル基を含む。前記アルキルの炭素数は、特に制限されず、例えば、１〜３０であり、好ましくは、１〜６であり、より好ましくは、１〜４である。前記アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等があげられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ-ヘキシル、イソヘキシル等があげられる。
本発明において、「アルケニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルケニルを含む。前記アルケニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の二重結合を有するもの等があげられる。前記アルケニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルケニルは、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル、３−メチル−２−ブテニル等があげられる。
本発明において、「アルキニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキニルを含む。前記アルキニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の三重結合を有するもの等があげられる。前記アルキニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルキニルは、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル等があげられる。前記アルキニルは、例えば、さらに、１個または複数の二重結合を有してもよい。
本発明において、「アリール」は、例えば、単環芳香族炭化水素基および多環芳香族炭化水素基を含む。前記単環芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル等があげられる。前記多環芳香族炭化水素基は、例えば、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントリル、２−フェナントリル、３−フェナントリル、４−フェナントリル、９−フェナントリル等があげられる。好ましくは、例えば、フェニル、１−ナフチルおよび２−ナフチル等のナフチル等があげられる。
本発明において、「ヘテロアリール」は、例えば、単環芳香族複素環式基および縮合芳香族複素環式基を含む。前記ヘテロアリールは、例えば、フリル（例：２−フリル、３−フリル）、チエニル（例：２−チエニル、３−チエニル）、ピロリル（例：１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル）、イミダゾリル（例：１−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１，２，４−トリアゾール−１−イル、１，２，４−トリアゾール−３−イル、１，２，４−トリアゾール−４−イル）、テトラゾリル（例：１−テトラゾリル、２−テトラゾリル、５−テトラゾリル）、オキサゾリル（例：２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル）、イソキサゾリル（例：３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル）、チアゾリル（例：２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル）、チアジアゾリル、イソチアゾリル（例：３−イソチアゾリル、４−イソチアゾリル、５−イソチアゾリル）、ピリジル（例：２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、ピリダジニル（例：３−ピリダジニル、４−ピリダジニル）、ピリミジニル（例：２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル）、フラザニル（例：３−フラザニル）、ピラジニル（例：２−ピラジニル）、オキサジアゾリル（例：１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）、ベンゾフリル（例：２−ベンゾ［ｂ］フリル、３−ベンゾ［ｂ］フリル、４−ベンゾ［ｂ］フリル、５−ベンゾ［ｂ］フリル、６−ベンゾ［ｂ］フリル、７−ベンゾ［ｂ］フリル）、ベンゾチエニル（例：２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル、４−ベンゾ［ｂ］チエニル、５−ベンゾ［ｂ］チエニル、６−ベンゾ［ｂ］チエニル、７−ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンズイミダゾリル（例：１−ベンゾイミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ベンゾイミダゾリル、５−ベンゾイミダゾリル）、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノキサリル（例：２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、６−キノキサリニル）、シンノリニル（例：３−シンノリニル、４−シンノリニル、５−シンノリニル、６−シンノリニル、７−シンノリニル、８−シンノリニル）、キナゾリル（例：２−キナゾリニル、４−キナゾリニル、５−キナゾリニル、６−キナゾリニル、７−キナゾリニル、８−キナゾリニル）、キノリル（例：２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、６−キノリル、７−キノリル、８−キノリル）、フタラジニル（例：１−フタラジニル、５−フタラジニル、６−フタラジニル）、イソキノリル（例：１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、６−イソキノリル、７−イソキノリル、８−イソキノリル）、プリル、プテリジニル（例：２−プテリジニル、４−プテリジニル、６−プテリジニル、７−プテリジニル）、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル（例：１−アクリジニル、２−アクリジニル、３−アクリジニル、４−アクリジニル、９−アクリジニル）、インドリル（例：１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、４−インドリル、５−インドリル、６−インドリル、７−インドリル）、イソインドリル、フェナジニル（例：１−フェナジニル、２−フェナジニル）またはフェノチアジニル（例：１−フェノチアジニル、２−フェノチアジニル、３−フェノチアジニル、４−フェノチアジニル）等があげられる。
本発明において、「シクロアルキル」は、例えば、環状飽和炭化水素基であり、炭素数は、例えば、３〜１５である。前記シクロアルキルは、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基等があげられ、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、橋かけ環式炭化水素基等があげられる。
本発明において、「橋かけ環式炭化水素基」は、例えば、ビシクロ［２．１．０］ペンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチルおよびビシクロ［３．２．１］オクチル、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．３．１］ノナン、１−アダマンチル、２−アダマンチル等があげられる。
本発明において、「スピロ炭化水素基」は、例えば、スピロ［３．４］オクチル等があげられる。
本発明において、「シクロアルケニル」は、例えば、環状の不飽和脂肪族炭化水素基を包み、炭素数は、例えば、３〜７個である。前記シクロアルケニルは、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等があげられ、好ましくは、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等である。前記シクロアルケニルは、例えば、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基およびスピロ炭化水素基も含む。
本発明において、「アリールアルキル」は、例えば、ベンジル、２−フェネチル、およびナフタレニルメチル等があげられ、「シクロアルキルアルキル」または「シクリルアルキル」は、例えば、シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル等があげられ、「ヒドロキシアルキル」は、例えば、ヒドロキシメチルおよび２−ヒドロキシエチル等があげられる。
本発明において、「アルコキシ」は、例えば、前記アルキル−Ｏ−基を含み、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、およびｎ−ブトキシ等があげられ、「アルコキシアルキル」は、例えば、メトキシメチル等があげられ、「アミノアルキル」は、例えば、２−アミノエチル等があげられる。
本発明において、「ヘテロシクリル」は、例えば、１−ピロリニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、ピロリジノン、１−イミダゾリニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、１−イミダゾリジニル、２−イミダゾリジニル、４−イミダゾリジニル、イミダゾリジノン、１−ピラゾリニル、３−ピラゾリニル、４−ピラゾリニル、１−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノン、ピペリジノ、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、ピペラジノン、２−モルホリニル、３−モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等があげられる。
本発明において、「ヘテロシクリルアルキル」は、例えば、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル等があげられ、「ヘテロシクリルアルケニル」は、例えば、２−ピペリジニルエテニル等があげられ、「ヘテロアリールアルキル」は、例えば、ピリジルメチルおよびキノリン−３−イルメチル等があげられる。
本発明において、「シリル」は、化学式Ｒ３Ｓｉ−で表される基を含み、Ｒは、独立して、前記アルキル、アリールおよびシクロアルキルから選択でき、例えば、トリメチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基等があげられ、「シリルオキシ」は、例えば、トリメチルシリルオキシ基等があげられ、「シリルオキシアルキル」は、例えば、トリメチルシリルオキシメチル等があげられる。
本発明において、「アルキレン」は、例えば、メチレン、エチレン、およびプロピレン等があげられる。
本発明において、前述した各種基は、置換されてもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（ハロアルキル、例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル（例：ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル）、アルコキシアルキル（例：メトキシメチル、エトキシメチル、エトキシエチル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、アルキルアリール（例、ｐ−メチルフェニル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アミノアルキル（例：アミノメチル）、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、カルバモイル、スルファモイル、オキソ、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓがあげられる。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、前述のように、前記標的遺伝子の発現抑制ができる。このため、本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、例えば、遺伝子が原因となる疾患の治療剤として使用できる。本発明の天然型ｍｉＲＮＡが、例えば、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を有する場合、例えば、前記標的遺伝子の発現抑制により、前記疾患を治療できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。前記疾患は、特に制限されず、例えば、目的の疾患に応じて前記発現抑制配列を適宜設定できる。前記疾患としては、例えば、乳がん、肺がん、胃がん、大腸がん、肝がん、膵がん、食道がん、前立腺がん、胆嚢がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、骨肉腫、白血病等のがん、肺線維症、肝線維症等の疾患があげられる。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡの使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記天然型ｍｉＲＮＡを投与すればよい。
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
本発明において、発現抑制の対象となる前記標的遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を設定できる。そして、前述のように、前記標的遺伝子の種類に応じて、前記成熟ｍｉＲＮＡを選択すればよい。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡの使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を参照できる。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農学、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡの合成方法は、特に制限されず、従来公知の核酸の製造方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイトおよびＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。
（２）組成物
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
本発明によれば、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。
また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。
本発明によれば、例えば、遺伝子が原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
本発明において、治療の対象となる疾患は、特に制限されず、例えば、遺伝子の発現が原因となる疾患があげられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定し、さらに、前記標的遺伝子に応じて、前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を選択すればよい。
本発明の発現抑制用組成物および薬学的組成物（以下、組成物という）は、その使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記天然型ｍｉＲＮＡを投与すればよい。
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。
本発明の組成物は、例えば、本発明の天然型ｍｉＲＮＡのみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
本発明の組成物において、前記天然型ｍｉＲＮＡは、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体形成により、例えば、前記天然型ｍｉＲＮＡを効率よくデリバリーすることができる。
前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。
前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤、賦形剤等があげられる。
（３）発現抑制方法
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の発現抑制方法において、前記標的遺伝子の発現抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、成熟ｍｉＲＮＡによる発現抑制があげられる。
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に、前記天然型ｍｉＲＮＡを投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記天然型ｍｉＲＮＡを接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記天然型ｍｉＲＮＡを単独で投与してもよいし、前記天然型ｍｉＲＮＡを含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
（４）治療方法
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを、患者に投与する工程を含み、前記天然型ｍｉＲＮＡにおける前記ガイド鎖配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列であることを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡを使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法等を援用できる。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与のいずれでもよい。
（５）天然型ｍｉＲＮＡの使用
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡの使用である。
本発明の一本鎖核酸は、疾患の治療に使用するための一本鎖核酸であって、前記一本鎖核酸は、前記本発明の天然型ｍｉＲＮＡであり、前記天然型ｍｉＲＮＡにおける前記ガイド鎖配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列であることを特徴とする。
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
成熟ｍｉＲ−３４ａのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000268）に基づいて、付加配列（スペーサー）の塩基長の異なる種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＡＸＬ ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
ポジティブコントロールのｍｉＲＮＡとして、以下に示すガイド鎖（配列番号１）およびパッセンジャー鎖（配列番号２）からなる、二本鎖のヒト成熟ｍｉＲ−３４ａ（ＮＩ−０２０８）、並びに、前記ガイド鎖と前記パッセンジャー鎖とを、ｐｒｅ−ｍｉＲ−３４ａのループ領域の配列を介して連結した一本鎖の天然型ｍｉＲ−３４ａ（ＮＭ−０００４）を合成した。
また、ネガティブコントロールとして、核酸データベース上で登録されているすべての配列に相補性を有さない配列とそれに相補的な配列とからなる二本鎖ＲＮＡ（ＮＩ−００００）を合成した。
前記配列中、アスタリスクは対応するガイド鎖塩基と非相補的である塩基を示す。
下記配列において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。
ＮＭ−０００４（配列番号１１）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGUGAGCAAUAGUAAGGAAGcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＮＩ−０２０８（配列番号１／配列番号２）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’/5’-caaucagcaaguauacugcccu-3’
ＮＩ−００００（配列番号１２／配列番号１３）
5’-UACUAUUCGACACGCGAAGTT-3’/5’-CUUCGCGUGUCGAAUAGUATT-3’
実施例の天然型ｍｉＲＮＡとして、前記ガイド鎖（配列番号１）と付加配列（０、３、５または７塩基長）とからなるＸ領域と、前記パッセンジャー鎖の５’末端に、前記ガイド鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に完全相補的な配列を有するＹ領域とが、下記式のプロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を介して連結している天然型ｍｉＲ−３４ａを合成した。前記天然型ｍｉＲＮＡの合成において、下記式のプロリン誘導体の非ヌクレオチド構造は、Ｌ−プロリンジアミドアミダイト（ＷＯ２０１２／０１７９１９参照）を使用することにより導入した。
前記配列中、アスタリスクは対応するガイド鎖塩基と非相補的である塩基を示す。また、「spacer」の後の数字は、前記Ｘ領域の付加配列の塩基長を示す。
下記配列において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。また、［P］は前記プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を示す。
ＰＨ−００３６（配列番号１４）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[P]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ−００３８（配列番号１５）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[P]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ−００６６（配列番号１６）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[P]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ−００６８（配列番号１７）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGGCC-[P]-GGCCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
（２）ＡＸＬ遺伝子の発現量の測定
前記各ＲＮＡを、２μｍｏｌ／Ｌとなるように、注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。
細胞は、Ｈ１２９９細胞（ＡＴＣＣ）を使用した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ Ｍｅｄｉｕｍ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
まず、細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μＬずつ、４×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ＲＮＡを（Ａ）トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、前記トランスフェクション試薬の添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定し、トランスフェクションを行った。下記組成において、（Ｂ）は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、（Ｃ）は、２μｍｏｌ／Ｌ 前記ＲＮＡ溶液であり、両者をあわせて９８．５μＬ添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記ＲＮＡの最終濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌとした。
トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、オランダ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、トランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、以下に示すように、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＡＸＬ遺伝子の発現量および内部標準であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定した。前記ＡＸＬ遺伝子の発現量は、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量により補正した。
前記ＰＣＲは、試薬としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ I Ｍａｓｔｅｒ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）、機器としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ II（商品名、Ｒｏｃｈｅ）を用いた（以下、同様）。前記ＡＸＬ遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅には、それぞれ、以下のプライマーセットを使用した。
ＡＸＬ遺伝子用ＰＣＲプライマーセット
（配列番号１８） 5’-CTCAACCAGGACGACTCCAT-3’
（配列番号１９） 5’-AGACCGCTTCACTCAGGAAA-3’
ＧＡＰＤＨ遺伝子用プライマーセット
（配列番号２０） 5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’
（配列番号２１） 5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’
なお、コントロール１として、前記培養液に前記（Ｂ）液１００μＬのみを添加した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（−）。また、コントロール２として、トランスフェクションにおいて、前記ＲＮＡ溶液を未添加とし、前記（Ａ）１．５μＬと前記（Ｂ）とを合計１００μＬ添加した以外は、同様にして処理した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（ｍｏｃｋ）。
補正後のＡＸＬ遺伝子の発現量について、コントロール（−）の細胞における発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞での発現量の相対値を求めた。
（３）結果
図２に示すように、実施例の天然型ｍｉＲ−３４ａは、ポジティブコントロールの成熟ｍｉＲ−３４ａやｐｒｅ−ｍｉＲ−３４ａ改変体と同程度に、ＡＸＬ ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、Ｘ領域の付加配列の塩基長を変化させても、ＡＸＬ ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例２）
次に、実施例１の天然型ｍｉＲ−３４ａ（ＰＨ−００３６）において、リンカー領域の非ヌクレオチド構造を改変して、同様にＡＸＬ ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
以下に示すように、ＰＨ−００３６のリンカー領域を、
下記式のリシン誘導体の非ヌクレオチド構造に置換した分子（ＫＨ−０００６）、
下記式のグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造に置換した分子（ＸＨ−００１１）、
下記式のグリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造に置換した分子（ＸＨ−００１３）、
前記化学式（Ｇ２）中のＧｌｙＧｌｙは、下記化学式（ＧｌｙＧｌｙ）で表される原子団であり、ただし、下記化学式（ＧｌｙＧｌｙ）中の末端のカルボニル炭素は、上記化学式（Ｇ２）中のＮ原子に結合しており、下記化学式（ＧｌｙＧｌｙ）中の末端の窒素原子は、上記化学式（Ｇ２）のカルボニル炭素に結合している。
並びに、下記式のテレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造に置換した分子（ＸＨ−００１５）、
をそれぞれ合成した。前記リシン誘導体の非ヌクレオチド構造は、Ｌ−リシンアミドアミダイト（ＷＯ２０１３／１０３１４６参照）を、前記グリシン誘導体の非ヌクレオチド構造は、グリシンアミドアミダイト（ＷＯ２０１３／１０３１４６参照）を、前記グリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造は、グリシルグリシンアミドアミダイト（ＷＯ２０１３／１３３２２１参照）を、前記テレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造は、テレフタル酸アミダイト（ＷＯ２０１３／１３３２２１参照）を、それぞれ使用することにより導入した。
下記配列において、[K]は前記リシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[Gly]は前記グリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[GlyGly]は前記グリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[TP]は前記テレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造を、それぞれ示す。また、下記配列において、各リンカーの５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、その他が前記付加配列であり、各リンカーの３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。
ＫＨ−０００６（配列番号１４）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[K]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ−００１１（配列番号１４）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[Gly]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ−００１３（配列番号１４）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[GlyGly]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ−００１５（配列番号１４）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[TP]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
実施例１と同様に、ポジティブコントロールとして、ＮＭ−０００４およびＮＩ−０２０８を、ネガティブコントロールとして、ＮＩ−００００を用いた。
（２）ＡＸＬ遺伝子の発現量の測定
実施例１と同様の方法により、前記各ＲＮＡでＨ１２９９細胞（ＡＴＣＣ）をトランスフェクトし、ＡＸＬ ｍＲＮＡの発現量を求めた。
（３）結果
図３に示すように、リンカー領域の非ヌクレオチド構造を改変しても、ＡＸＬ ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例３）
次に、実施例２で用いた、テレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造のリンカー領域を有するＸＨ−００１５について、Ｘ領域に付加配列を導入した場合の効果について調べた。使用した天然型ｍｉＲ−３４ａの構造および配列を以下に示す。
前記配列中、アスタリスクは対応するガイド鎖塩基と非相補的である塩基を示す。また、「spacer」は、前記Ｘ領域が付加配列を含むことを示す。
下記配列において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。また、［TP］は前記テレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造を示す。
ＸＨ−００１５（配列番号１４）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[TP]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ−００２４（配列番号１５）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[TP]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
実施例１と同様の方法により、前記各ＲＮＡでＨ１２９９細胞（ＡＴＣＣ）をトランスフェクトし、ＡＸＬ ｍＲＮＡの発現量を求めた。
その結果、図４に示すように、Ｘ領域に付加配列を加えても、ＡＸＬ ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例４）
成熟ｌｅｔ−７ａのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000060）に基づいて、リンカー領域の非ヌクレオチド構造の異なる種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＨＭＧＡ２ ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を有するリンカーを用いたものについては、Ｘ領域に付加配列を導入したものも合成した。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
ポジティブコントロールのｍｉＲＮＡとして、以下に示すガイド鎖（配列番号３）およびパッセンジャー鎖（配列番号４）からなる、二本鎖のヒト成熟ｌｅｔ−７ａ（ＮＩ−０２０５）、並びに、前記ガイド鎖と前記パッセンジャー鎖とを、ｐｒｅ−ｌｅｔ−７ａのループ領域の配列を介して連結した一本鎖の天然型ｌｅｔ−７ａ（ＮＭ−０００３）を合成した。
また、ネガティブコントロールとして、前記ＮＩ−００００を使用した。
前記配列中、アスタリスクは対応するガイド鎖塩基と非相補的である塩基を示す。
下記配列において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。
ＮＭ−０００３（配列番号２２）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUUAGGGUCACACCCACCACUGGGAGAUAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＮＩ−０２０５（配列番号３／配列番号４）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’/5’-cuauacaaucuacugucuuuc-3’
以下に示すように、前記ガイド鎖（配列番号３）と付加配列（０、３塩基長）とからなるＸ領域と、前記パッセンジャー鎖の５’末端に、前記ガイド鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に完全相補的な配列を有するＹ領域とが、前記プロリン誘導体（[P]）、リシン誘導体（[K]）、グリシン誘導体（[Gly]）、グリシルグリシン誘導体（[GlyGly]）またはテレフタル酸誘導体（[TP]）のリンカーを介して連結している種々の天然型ｌｅｔ−７ａを合成した。前記天然型ｍｉＲＮＡの合成において、各非ヌクレオチド構造は、実施例１および２と同様にして導入した。
前記配列において、「spacer」は、前記Ｘ領域が付加配列を含むことを示す。
下記配列において、[P]は前記プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[K]は前記リシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[Gly]は前記グリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[GlyGly]は前記グリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[TP]は前記テレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造を、それぞれ示す。また、下記配列において、各リンカーの５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、その他が前記付加配列であり、各リンカーの３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。
ＰＨ−００１１（配列番号２３）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[P]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＫＨ−０００３（配列番号２３）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[K]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ−０００２（配列番号２３）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[Gly]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ−０００４（配列番号２３）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[GlyGly]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ−０００６（配列番号２３）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[TP]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＰＨ−００１４（配列番号２４）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[P]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
（２）ＨＭＧＡ２遺伝子の発現量の測定
前記各ＲＮＡを、０．２μｍｏｌ／Ｌとなるように、注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。
細胞は、Ａ５４９細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
まず、細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μＬずつ、４×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ＲＮＡを（Ａ）トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、前記トランスフェクション試薬の添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定し、トランスフェクションを行った。下記組成において、（Ｂ）は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、（Ｃ）は、０．２μｍｏｌ／Ｌ 前記ＲＮＡ溶液であり、両者をあわせて９８．５μＬ添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記ＲＮＡの最終濃度は、０．１ｎｍｏｌ／Ｌとした。
トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、オランダ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、トランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、以下に示すように、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＨＭＧＡ２遺伝子の発現量および内部標準であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定した。前記ＨＭＧＡ２遺伝子の発現量は、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量により補正した。
前記ＰＣＲは、試薬としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ I Ｍａｓｔｅｒ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）、機器としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ II（商品名、Ｒｏｃｈｅ）を用いた（以下、同様）。前記ＨＭＧＡ２遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅には、それぞれ、以下のプライマーセットを使用した。
ＨＭＧＡ２遺伝子用ＰＣＲプライマーセット
（配列番号２５） 5’-GAAGCCACTGGAGAAAAACG-3’
（配列番号２６） 5’-CTTCGGCAGACTCTTGTGAG-3’
ＧＡＰＤＨ遺伝子用プライマーセット
（配列番号２０） 5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’
（配列番号２１） 5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’
なお、コントロール１として、前記培養液に前記（Ｂ）液１００μＬのみを添加した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（−）。また、コントロール２として、トランスフェクションにおいて、前記ＲＮＡ溶液を未添加とし、前記（Ａ）１．５μＬと前記（Ｂ）とを合計１００μＬ添加した以外は、同様にして処理した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（ｍｏｃｋ）。
補正後のＨＭＧＡ２遺伝子の発現量について、コントロール（−）の細胞における発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞での発現量の相対値を求めた。
（３）結果
図５に示すように、実施例の天然型ｌｅｔ−７ａは、ポジティブコントロールの成熟ｌｅｔ−７ａやｐｒｅ−ｌｅｔ−７ａ改変体と同程度に、ＨＭＧＡ２ ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、リンカーの非ヌクレオチド構造を改変したり、Ｘ領域に付加配列を導入したりしても、ＨＭＧＡ２ ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例５）
成熟ｍｉＲ−２９ｂのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000105）に基づいて、リンカー領域の非ヌクレオチド構造の異なる種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を有するリンカーを用いたものについては、Ｘ領域に付加配列を導入したものも合成した。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
ポジティブコントロールのｍｉＲＮＡとして、以下に示すガイド鎖（配列番号９）およびパッセンジャー鎖（配列番号１０）からなる、二本鎖のヒト成熟ｍｉＲ−２９ｂ（ＮＩ−０２１０）、並びに、前記ガイド鎖と前記パッセンジャー鎖とを、ｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ｂのループ領域の配列を介して連結した一本鎖の天然型ｍｉＲ−２９ｂ（ＮＭ−０００５）を合成した。
また、ネガティブコントロールとして、前記ＮＩ−００００を使用した。
前記配列中、アスタリスクは対応するガイド鎖塩基と非相補的である塩基を示す。
下記配列において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。
ＮＭ−０００５（配列番号２７）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUAAAUAGUGAUUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＮＩ−０２１０（配列番号１０／配列番号９）
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-3’/5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
以下に示すように、前記パッセンジャー鎖（配列番号１０）と付加配列（０、３塩基長）とからなるＸ領域と、前記ガイド鎖の５’末端に、前記パッセンジャー鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に完全相補的な配列を有するＹ領域とが、前記プロリン誘導体（[P]）、リシン誘導体（[K]）、グリシン誘導体（[Gly]）、グリシルグリシン誘導体（[GlyGly]）またはテレフタル酸誘導体（[TP]）のリンカーを介して連結している種々の天然型ｍｉＲ−２９ｂを合成した。前記天然型ｍｉＲＮＡの合成において、各非ヌクレオチド構造は、実施例１および２と同様にして導入した。
前記配列中、アスタリスクは対応するガイド鎖塩基と非相補的である塩基を示す。また、「spacer」は、前記Ｘ領域が付加配列を含むことを示す。
下記配列において、[P]は前記プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[K]は前記リシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[Gly]は前記グリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[GlyGly]は前記グリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[TP]は前記テレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造を、それぞれ示す。また、下記配列において、各リンカーの５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、小文字は前記パッセンジャー鎖配列であり、その他が前記付加配列であり、各リンカーの３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、下線部は前記ガイド鎖配列である。
ＰＨ−００４０（配列番号２８）
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[P]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＫＨ−０００８（配列番号２８）
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[K]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ−００１７（配列番号２８）
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[Gly]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ−００１９（配列番号２８）
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[GlyGly]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ−００２１（配列番号２８）
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[TP]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−００４２（配列番号２９）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[P]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
また、ネガティブコントロールとして、実施例１で合成したＮＩ−００００を使用した。
（２）ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量の測定
前記各ＲＮＡを、２μｍｏｌ／Ｌとなるように、注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。
細胞は、Ａ５４９細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
まず、細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μＬずつ、４×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ＲＮＡを（Ａ）トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、前記トランスフェクション試薬の添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定し、トランスフェクションを行った。下記組成において、（Ｂ）は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、（Ｃ）は、２μｍｏｌ／Ｌ 前記ＲＮＡ溶液であり、両者をあわせて９８．５μＬ添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記ＲＮＡの最終濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌとした。
トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、オランダ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、トランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、以下に示すように、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量および内部標準であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定した。前記ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量は、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量により補正した。
前記ＰＣＲは、試薬としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ I Ｍａｓｔｅｒ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）、機器としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ II（商品名、Ｒｏｃｈｅ）を用いた（以下、同様）。前記ＣＯＬ１Ａ１遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅には、それぞれ、以下のプライマーセットを使用した。
ＣＯＬ１Ａ１遺伝子用ＰＣＲプライマーセット
（配列番号３０） 5’-CCCAAGGACAAGAGGCATGT-3’
（配列番号３１） 5’-CCGCCATACTCGAACTGGAA-3’
ＧＡＰＤＨ遺伝子用プライマーセット
（配列番号２０） 5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’
（配列番号２１） 5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’
なお、コントロール１として、前記培養液に前記（Ｂ）液１００μＬのみを添加した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（−）。また、コントロール２として、トランスフェクションにおいて、前記ＲＮＡ溶液を未添加とし、前記（Ａ）１．５μＬと前記（Ｂ）とを合計１００μＬ添加した以外は、同様にして処理した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（ｍｏｃｋ）。
補正後のＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量について、コントロール（−）の細胞における発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞での発現量の相対値を求めた。
（３）結果
図６に示すように、実施例の天然型ｍｉＲ−２９ｂは、ポジティブコントロールの成熟ｍｉＲ−２９ｂやｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ｂ改変体と同程度に、ＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、リンカーの非ヌクレオチド構造を改変したり、Ｘ領域に付加配列を導入したりしても、ＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例６）
成熟ｍｉＲ−３４ａのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000268）に基づいて、リンカー領域の非ヌクレオチド構造およびＸ領域の付加配列の塩基長が異なる、種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＡＸＬ ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
実施例１と同様の方法により、ガイド鎖（配列番号１）と付加配列（０、３、５または７塩基長）とからなるＸ領域と、パッセンジャー鎖の５’末端に、前記ガイド鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に完全相補的な配列を有するＹ領域とが、プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を介して連結している天然型ｍｉＲ−３４ａ（ＰＨ−００３６、ＰＨ−００３８、ＰＨ−００６６およびＰＨ−００６８）を合成した。
また、上記天然型ｍｉＲ−３４ａのうち、付加配列が０、３または５塩基長である天然型ｍｉＲ−３４ａ（ＰＨ−００３６、ＰＨ−００３８およびＰＨ−００６６）において、実施例２と同様の方法により、リンカー領域の非ヌクレオチド構造を改変した天然型ｍｉＲ−３４ａを合成した。
下記配列において、[K]はリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[TP]はテレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造を、[Gly]はグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[GlyGly]はグリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、それぞれ示す。また、下記配列において、各リンカーの５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、下線部はガイド鎖配列であり、その他が前記付加配列であり、各リンカーの３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、小文字はパッセンジャー鎖配列である。
ＫＨ−０００６（配列番号１４）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[K]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＫＨ−００１８（配列番号１５）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[K]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＫＨ−００１９（配列番号１６）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[K]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ−００１５（配列番号１４）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[TP]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ−００２４（配列番号１５）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[TP]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ−００４２（配列番号１６）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[TP]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ−００１１（配列番号１４）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[Gly]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ−００４３（配列番号１５）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[Gly]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ−００４４（配列番号１６）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[Gly]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ−００１３（配列番号１４）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[GlyGly]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ−００４５（配列番号１５）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[GlyGly]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＸＨ−００４６（配列番号１６）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[GlyGly]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
また、ポジティブコントロールとして、実施例１のＮＩ−０２０８を用いた。
（２）ＡＸＬ遺伝子の発現量の測定
前記各ＲＮＡの最終濃度が２ｎｍｏｌ／Ｌである点以外は、実施例１と同様の方法により、ＡＸＬ遺伝子の発現量を求めた。
（３）結果
図７に示すように、実施例の天然型ｍｉＲ−３４ａは、ポジティブコントロールのｐｒｅ−ｍｉＲ−３４ａ改変体と同程度に、ＡＸＬ ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、リンカーの非ヌクレオチド構造を改変したり、Ｘ領域に付加配列を導入したりしても、ＡＸＬ ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例７）
成熟ｌｅｔ−７ａのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000060）に基づいて、リンカー領域の非ヌクレオチド構造およびＸ領域の付加配列の塩基長が異なる、種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＨＭＧＡ２ ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
実施例４と同様の方法により、ガイド鎖（配列番号３）と付加配列（０、３または５塩基長）とからなるＸ領域と、パッセンジャー鎖の５’末端に、前記ガイド鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に完全相補的な配列を有するＹ領域とが、プロリン誘導体（[P]）、リシン誘導体（[K]）、テレフタル酸誘導体（[TP]）、グリシン誘導体（[Gly]）またはグリシルグリシン誘導体（[GlyGly]）のリンカーを介して連結している種々の天然型ｌｅｔ−７ａを合成した。前記天然型ｍｉＲＮＡの合成において、各非ヌクレオチド構造は、実施例１および２と同様にして導入した。
下記配列において、[P]はプロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[K]はリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[TP]はテレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造を、[Gly]はグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[GlyGly]はグリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、それぞれ示す。また、下記配列において、各リンカーの５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、その他が前記付加配列であり、各リンカーの３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。
ＰＨ−００１１（配列番号２３）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[P]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＰＨ−００１４（配列番号２４）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[P]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＰＨ−０１０７（配列番号３２）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[P]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＫＨ−０００３（配列番号２３）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[K]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＫＨ−００２０（配列番号２４）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[K]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＫＨ−００２１（配列番号３２）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[K]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ−０００６（配列番号２３）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[TP]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ−００４７（配列番号２４）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[TP]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ−００４８（配列番号３２）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[TP]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ−０００２（配列番号２３）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[Gly]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ−００４９（配列番号２４）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[Gly]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ−００５０（配列番号３２）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[Gly]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ−０００４（配列番号２３）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[GlyGly]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ−００５１（配列番号２４）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[GlyGly]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
ＸＨ−００５２（配列番号３２）
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[GlyGly]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3’
また、ポジティブコントロールとして、実施例４のＮＩ−０２０５を用いた。
（２）ＨＭＧＡ２遺伝子の発現量の測定
前記各ＲＮＡを導入する細胞がＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ）である点、および前記各ＲＮＡの最終濃度が０.２ｎｍｏｌ／Ｌである点以外は、実施例４と同様の方法により、ＨＭＧＡ２遺伝子の発現量を求めた。
（３）結果
図８に示すように、実施例の天然型ｌｅｔ−７ａは、ポジティブコントロールのｐｒｅ−ｌｅｔ−７ａ改変体と同程度に、ＨＭＧＡ２ ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、リンカーの非ヌクレオチド構造を改変したり、Ｘ領域に付加配列を導入したりしても、ＨＭＧＡ２ ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例８）
成熟ｍｉＲ−２９ｂのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000105）に基づいて、リンカー領域の非ヌクレオチド構造およびＸ領域の付加配列の塩基長が異なる、種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
実施例５と同様の方法により、パッセンジャー鎖（配列番号１０）と付加配列（０、３または５塩基長）とからなるＸ領域と、ガイド鎖の５’末端に、前記パッセンジャー鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に完全相補的な配列を有するＹ領域とが、プロリン誘導体（[P]）、リシン誘導体（[K]）、テレフタル酸誘導体（[TP]）、グリシン誘導体（[Gly]）またはグリシルグリシン誘導体（[GlyGly]）のリンカーを介して連結している種々の天然型ｍｉＲ−２９ｂを合成した。前記天然型ｍｉＲＮＡの合成において、各非ヌクレオチド構造は、実施例１および２と同様にして導入した。
下記配列において、[P]はプロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[K]はリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[TP]はテレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造を、[Gly]はグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[GlyGly]はグリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、それぞれ示す。また、下記配列において、各リンカーの５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、小文字は前記パッセンジャー鎖配列であり、その他が前記付加配列であり、各リンカーの３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、下線部は前記ガイド鎖配列である。
ＰＨ−００４０（配列番号２８）
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[P]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−００４２（配列番号２９）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[P]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１０８（配列番号３３）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[P]-CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＫＨ−０００８（配列番号２８）
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[K]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＫＨ−００２２（配列番号２９）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[K]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＫＨ−００２３（配列番号３３）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[K]-CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ−００２１（配列番号２８）
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[TP]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ−００５３（配列番号２９）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[TP]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ−００５４（配列番号３３）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[TP]-CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ−００１７（配列番号２８）
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[Gly]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ−００５５（配列番号２９）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[Gly]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ−００５６（配列番号３３）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[Gly]-CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ−００１９（配列番号２８）
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[GlyGly]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ−００５７（配列番号２９）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[GlyGly]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ−００５８（配列番号３３）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[GlyGly]-CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
また、ポジティブコントロールとして、実施例５のＮＩ−０２１０を用いた。
（２）ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量の測定
前記各ＲＮＡの最終濃度が０．５ｎｍｏｌ／Ｌである点以外は、実施例５と同様の方法により、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量を求めた。
（３）結果
図９に示すように、実施例の天然型ｍｉＲ−２９ｂは、ポジティブコントロールのｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ｂ改変体と同程度に、ＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、リンカーの非ヌクレオチド構造を改変したり、Ｘ領域に付加配列を導入したりしても、ＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例９）
成熟ｍｉＲ−３４ａのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000268）に基づいて、Ｘ領域の付加配列（０、３、５または７塩基長）の塩基配列が異なる種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＡＸＬ ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
実施例１と同様の方法により、ガイド鎖（配列番号１）と付加配列（０、３、５または７塩基長）とからなるＸ領域と、パッセンジャー鎖の５’末端に、前記ガイド鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に相補的な配列（完全相補的または部分相補的な配列）を有するＹ領域とが、プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を介して連結している天然型ｍｉＲ−３４ａを合成した。
前記配列中、アスタリスクは対応するガイド鎖塩基と非相補的である塩基を示す。また、「spacer」の後の数字は、前記Ｘ領域の付加配列の塩基長を示す。
下記配列において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、小文字は前記パッセンジャー鎖配列である。また、［P］は前記プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を示す。
ＰＨ−００３６（配列番号１４）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[P]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ−００３８（配列番号１５）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[P]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ−００５８（配列番号３４）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUAA-[P]-UUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ−００５９（配列番号３５）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGG-[P]-UUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ−００６０（配列番号３６）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUCGG-[P]-CCGAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ−００６１（配列番号３７）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUCAA-[P]-UUGAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ−００６２（配列番号３８）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUCGG-[P]-UUGAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ−００６３（配列番号３９）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGG-[P]-CCGAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ−００６４（配列番号４０）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUAA-[P]-UUGAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ−００６５（配列番号４１）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGG-[P]-UUGAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ−００６６（配列番号１６）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[P]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ−００６７（配列番号４２）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUAAUU-[P]-AAUUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ−００６８（配列番号１７）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGGCC-[P]-GGCCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
ＰＨ−００６９（配列番号４３）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUAAUUAA-[P]-UUAAUUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3’
また、ポジティブコントロールとして、実施例１のＮＩ−０２０８を用いた。
（２）ＡＸＬ遺伝子の発現量の測定
実施例１と同様の方法により、ＡＸＬ遺伝子の発現量を求めた。
（３）結果
図１０に示すように、実施例の天然型ｍｉＲ−３４ａは、ポジティブコントロールのｐｒｅ−ｍｉＲ−３４ａ改変体と同程度に、ＡＸＬ ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、Ｘ領域の付加配列（３、５または７塩基長）の塩基配列が異なる場合も、ＡＸＬ ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例１０）
成熟ｍｉＲ−２９ｂのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000105）に基づいて、Ｘ領域の付加配列（０、３、５または７塩基長）の塩基配列が異なる種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
実施例５と同様の方法により、パッセンジャー鎖（配列番号１０）と付加配列（０、３、５または７塩基長）とからなるＸ領域と、前記ガイド鎖の５’末端に、前記パッセンジャー鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に相補的な配列（完全相補的または部分相補的な配列）を有するＹ領域とが、プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を介して連結している種々の天然型ｍｉＲ−２９ｂを合成した。
前記配列中、「spacer」の後の数字は、前記Ｘ領域の付加配列の塩基長を示す。
下記配列において、リンカーの５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、小文字は前記パッセンジャー鎖配列であり、その他が前記付加配列であり、リンカーの３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、下線部は前記ガイド鎖配列である。また、[P]は前記プロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を示す。
ＰＨ−００４０（配列番号２８）
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[P]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−００４２（配列番号２９）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[P]-GGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１０９（配列番号４４）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAA-[P]-UUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１１０（配列番号４５）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUGG-[P]-UUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１１１（配列番号４６）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaCGG-[P]-CCGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１１２（配列番号４７）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaCAA-[P]-UUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１１３（配列番号４８）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaCGG-[P]-UUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１１４（配列番号４９）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUGG-[P]-CCGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１１５（配列番号５０）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAA-[P]-UUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１１６（配列番号５１）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUGG-[P]-UUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１０８（配列番号３３）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[P]-CCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１１７（配列番号５２）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAAUU-[P]-AAUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１１８（配列番号５３）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGGCC-[P]-GGCCGGAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１１９（配列番号５４）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAAUUAA-[P]-UUAAUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
また、ポジティブコントロールとして、実施例５のＮＩ−０２１０を用いた。
（２）ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量の測定
前記各ＲＮＡの最終濃度が０．５ｎｍｏｌ／Ｌである点以外は、実施例５と同様の方法により、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量を求めた。
（３）結果
図１１に示すように、実施例の天然型ｍｉＲ−２９ｂは、ポジティブコントロールのｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ｂ改変体と同程度に、ＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、Ｘ領域の付加配列（３、５または７塩基長）の塩基配列が異なる場合も、ＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
（実施例１１）
成熟ｍｉＲ−２９ｂのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列情報（miRBase Accession No. MI0000105）に基づいて、リンカー領域の非ヌクレオチド構造およびＸ領域の付加配列（０、４または５塩基長）の塩基配列が異なる、種々の本発明の天然型ｍｉＲＮＡを合成し、培養細胞に導入して、標的遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果を調べた。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
実施例５と同様の方法により、パッセンジャー鎖（配列番号１０）と付加配列（０、４または５塩基長）とからなるＸ領域と、前記ガイド鎖の５’末端に、前記パッセンジャー鎖のオーバーハング部分および前記付加配列に相補的な配列（完全相補的または部分相補的な配列）を有するＹ領域とが、プロリン誘導体（[P]）またはグリシルグリシン誘導体（[GlyGly]）のリンカーを介して連結している種々の天然型ｍｉＲ−２９ｂを合成した。前記天然型ｍｉＲＮＡの合成において、各非ヌクレオチド構造は、実施例１および２と同様にして導入した。
下記配列において、[P]はプロリン誘導体の非ヌクレオチド構造を、[GlyGly]はグリシルグリシン誘導体の非ヌクレオチド構造を、それぞれ示す。また、下記配列において、各リンカーの５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、小文字は前記パッセンジャー鎖配列であり、その他が前記付加配列であり、各リンカーの３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、下線部は前記ガイド鎖配列である。
ＰＨ−００４０（配列番号２８）
5’-gcugguuucauauggugguuuaga-[P]-UCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１１７（配列番号５２）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAAUU-[P]-AAUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１２０（配列番号５５）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUUU-[P]-AAAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１２１（配列番号５６）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUUA-[P]-UAAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１２２（配列番号５７）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUAU-[P]-AUAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１２３（配列番号５８）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUAUU-[P]-AAUAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１２４（配列番号５９）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAUUU-[P]-AAAUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１２５（配列番号６０）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUAA-[P]-UUAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１２６（配列番号６１）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUAUA-[P]-UAUAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１２７（配列番号６２）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAUUA-[P]-UAAUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１２８（配列番号６３）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUAAU-[P]-AUUAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１２９（配列番号６４）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAUAU-[P]-AUAUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１３０（配列番号６５）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUAAA-[P]-UUUAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１３１（配列番号６６）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAUAA-[P]-UUAUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１３２（配列番号６７）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAAUA-[P]-UAUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１３３（配列番号６８）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAAAU-[P]-AUUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１３４（配列番号６９）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAAAA-[P]-UUUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１３５（配列番号７０）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUGG-[P]-UUAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１３６（配列番号７１）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUUU-[P]-UUAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１３７（配列番号７２）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaAUUAA-[P]-UUAAUUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１３８（配列番号７３）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaAUUUU-[P]-AAAAUUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１３９（配列番号７４）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaCUUAA-[P]-UUAAGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１４０（配列番号７５）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaCUUUU-[P]-AAAAGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１４１（配列番号７６）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaGUUAA-[P]-UUAACUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１４２（配列番号７７）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaGUUUU-[P]-AAAACUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１４３（配列番号７８）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUAAU-[P]-AUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１４４（配列番号７９）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUAA-[P]-UUAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１４５（配列番号８０）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUGG-[P]-UUAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＰＨ−０１４６（配列番号８１）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUU-[P]-UUUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
ＸＨ−００５９（配列番号６０）
5’-gcugguuucauauggugguuuagaUUUAA-[GlyGly]-UUAAAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
また、ポジティブコントロールとして、実施例５のＮＩ−０２１０を用いた。
（２）ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量の測定
前記各ＲＮＡの最終濃度が０．５ｎｍｏｌ／Ｌである点以外は、実施例５と同様の方法により、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量を求めた。
（３）結果
図１２及び図１３に示すように、実施例の天然型ｍｉＲ−２９ｂは、ポジティブコントロールと同程度に、ＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現を抑制した。また、Ｘ領域の付加配列（４または５塩基長）の塩基配列が異なる場合も、ＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果は維持された。
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
本発明の天然型ｍｉＲＮＡによれば、容易に低コストで合成でき、且つ、前記遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制が可能である。本発明の天然型ｍｉＲＮＡは、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農学、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
本出願は、日本でされた特願２０１４-２６６９１８（出願日２０１４年１２月２７日）及び特願２０１５-１３０４９６（出願日２０１５年６月２９日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (50)

  1. Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、
    前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、非ヌクレオチド構造のリンカー領域を介して連結し、
    前記Ｘ領域は、成熟ｍｉＲＮＡの（ａ）ガイド鎖配列または（ｂ）パッセンジャー鎖配列を含み、
    （ａ）の場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖配列を含み、
    （ｂ）の場合、前記Ｙ領域は、前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含み、
    前記Ｘ領域は、さらに付加配列を含み、
    前記付加配列の長さは、３〜５塩基長であり、
    前記ガイド鎖配列と前記パッセンジャー鎖配列とが、二重鎖構造を形成することを特徴とする、天然型ｍｉＲＮＡ。
  2. 前記Ｙ領域と前記Ｘ領域とをアライメントした際に、前記Ｙ領域が、３’末端にオーバーハングを有する、請求項１記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  3. 前記オーバーハングが、０〜４塩基長である、請求項２記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  4. 前記Ｘ領域が、前記ガイド鎖またはパッセンジャー鎖配列と付加配列とからなり、前記付加配列が、前記ガイド鎖またはパッセンジャー鎖配列の３’末端に連結している、請求項１から３のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  5. 前記付加配列が、ＵＡＡ、ＵＧＧ、ＵＣＣ、ＣＡＡ、ＣＧＧ、ＵＡＡＵ、ＵＵＡＡ、ＵＵＧＧ、ＵＵＵＵ、ＵＡＡＵＵ、ＵＣＣＧＧ、ＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＡ、ＵＵＵＡＵ、ＵＵＡＵＵ、ＵＡＵＵＵ、ＵＵＵＡＡ、ＵＵＡＵＡ、ＵＡＵＵＡ、ＵＵＡＡＵ、ＵＡＵＡＵ、ＵＵＡＡＡ、ＵＡＵＡＡ、ＵＡＡＵＡ、ＵＡＡＡＵ、ＵＡＡＡＡ、ＵＵＵＧＧ、ＡＵＵＡＡ、ＡＵＵＵＵ、ＣＵＵＡＡ、ＣＵＵＵＵ、ＧＵＵＡＡおよびＧＵＵＵＵからなる群から選択される塩基配列である、請求項１から４のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  6. 前記Ｘ領域の長さが、１９〜３５塩基長である、請求項１から５のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  7. 前記Ｙ領域の長さが、２１〜３７塩基長である、請求項１から６のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  8. 全長が、４０〜６８塩基長である、請求項１から７のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  9. 前記リンカー領域が、アミノ酸残基、ポリアミン残基、およびポリカルボン酸残基からなる群から選択される少なくとも一つを含む請求項１から８のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  10. 前記リンカー領域が、ポリカルボン酸残基を含む、請求項９に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  11. 前記ポリカルボン酸残基が、テレフタル酸残基である、請求項１０に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  12. 前記リンカー領域が、アミノ酸残基を含む、請求項９に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  13. 前記アミノ酸残基が、グリシン残基、テレフタル酸アミド残基、プロリン残基またはリシン残基である、請求項１２に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  14. 前記アミノ酸残基が、複数のアミノ酸残基が連結したものである、請求項１２または１３に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  15. 前記複数のアミノ酸残基が連結したものが、グリシン二量体または三量体の残基である、請求項１４に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  16. 前記リンカー残基が、下記化学式（Ｉ−０）で表される請求項１から１５のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
    前記化学式（Ｉ−０）中、
    Ｑ１１およびＱ１２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
    Ｑ１およびＱ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
    Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
    Ｌ１は、単結合、またはｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｌ２は、単結合、またはｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
    ｍは、１〜３０の範囲の整数であり；
    ｎは、１〜３０の範囲の整数であり；
    前記Ｘ領域および前記Ｙ領域は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー残基に結合し、
    ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ−０）であり、
    Ａは、任意の原子団である。
  17. 前記化学式（Ｉ−０）中、Ｑ１１およびＱ１２が、それぞれカルボニル基である請求項１６記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  18. 前記化学式（Ｉ−０）中、Ｑ１およびＱ２が、それぞれイミノ基である請求項１７記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  19. 下記化学式（Ｉα）の構造が、下記化学式（Ｉα２）で表される請求項１７記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
    前記化学式（Ｉα２）中、
    Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。
  20. 前記化学式（Ｉα２）の構造が、下記化学式（Ｉα３）で表される請求項１９記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  21. 前記化学式（Ｉ−０）中、Ｑ１１およびＱ１２が、それぞれイミノ基である請求項１６記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  22. 前記化学式（Ｉ−０）中、Ｑ１およびＱ２が、それぞれカルボニル基である請求項２１記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  23. 前記リンカー領域が、アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基が、下記化学式（Ｉ）で表される請求項１から３および６から１０のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
    前記化学式（Ｉ）中、
    Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
    Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
    Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
    ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
    ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
    前記Ｘ領域および前記Ｙ領域は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記アミノ酸残基に結合し、
    ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
    Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記化学式（Ｉａ）は、アミノ酸またはペプチドである。
  24. 前記アミノ酸残基における前記アミノ酸が、天然アミノ酸および人工アミノ酸の少なくとも一方である請求項２３に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  25. 前記天然アミノ酸が、タンパク質を構成するアミノ酸である請求項２４記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  26. 前記アミノ酸残基における前記アミノ酸が、グリシン、α−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシリシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、トリプトファン、β−アラニン、１−アミノ−２−カルボキシシクロペンタン、アミノ安息香酸、アミノピリジンカルボン酸および下記化学式（Ｉａ２）で表されるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１種類であり、前記アミノ酸は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い、請求項２３または２４に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
    前記化学式（Ｉａ２）中、
    Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。
  27. 前記化学式（Ｉａ２）の構造が、下記化学式（Ｉａ３）で表される請求項２６記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  28. 前記化学式（Ｉ−０）または（Ｉ）の構造が、下記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）であり、下記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）において、ｎは、０〜３０の整数、ｍは、０〜３０の整数である、請求項１６または２３記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  29. 前記化学式（Ｉ−１）において、ｎ＝１１およびｍ＝１２、またはｎ＝５およびｍ＝４である、請求項２８記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  30. 前記化学式（Ｉ−４）において、ｎ＝５およびｍ＝４である、請求項２８記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  31. 前記化学式（Ｉ−６）において、ｎ＝４およびｍ＝４である、請求項２８記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  32. 前記化学式（Ｉ−７）において、ｎ＝５およびｍ＝４である、請求項２８記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  33. 前記リンカー領域の非ヌクレオチド構造が、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む、請求項１から９、１２および１３のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  34. 前記非ヌクレオチド構造が、下記式（ＩＩ）で表わされる、請求項１から８のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
    前記式中、
    Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
    Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
    Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり；
    Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
    ｌは、１または２であり；
    ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
    ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
    環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよく、
    前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
    前記Ｘ領域および前記Ｙ領域は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記非ヌクレオチド構造に結合し、
    ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ)である。
  35. 前記Ｘ領域は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａまたはｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  36. 前記成熟ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａである、請求項３５記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  37. 請求項１記載の天然型ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列が、配列番号１４〜１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列である、請求項３６記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  38. 請求項１記載の天然型ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列が、配列番号３４〜４３からなる群から選択されるヌクレオチド配列である、請求項３６記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  39. 前記成熟ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａである、請求項３５記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  40. 請求項１記載の天然型ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列が、配列番号２３または２４のヌクレオチド配列である、請求項３９記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  41. 請求項１記載の天然型ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列が、配列番号３２のヌクレオチド配列である、請求項３９記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  42. 前記Ｘ領域は、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂの成熟ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖配列を含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  43. 請求項１記載の天然型ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列が、配列番号２８または２９のヌクレオチド配列である、請求項４２記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  44. 請求項１記載の天然型ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列が、配列番号３３および４４〜８１からなる群から選択されるヌクレオチド配列である、請求項４２記載の天然型ｍｉＲＮＡ。
  45. 標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
    請求項１から４４のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする、発現抑制用組成物。
  46. 請求項１から４４のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする、薬学的組成物。
  47. 標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
    請求項１から４４のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで使用することを特徴とする、発現抑制方法。
  48. 前記天然型ｍｉＲＮＡを、細胞または組織に投与する工程を含む、請求項４７記載の発現抑制方法。
  49. 請求項１から４４のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡを、非ヒト動物に投与することを特徴とする、標的遺伝子の発現を抑制する方法。
  50. 疾患の治療に使用するための一本鎖核酸であって、
    前記一本鎖核酸は、請求項１から４４のいずれか一項に記載の天然型ｍｉＲＮＡであり、前記天然型ｍｉＲＮＡにおける前記ガイド鎖配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列であることを特徴とする、一本鎖核酸。
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