JPWO2018182008A1 - 遺伝子発現制御機能を有する環状型核酸分子 - Google Patents
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Abstract
本発明は、血清中の安定性が向上し、かつ細胞内に移行して遺伝子発現制御機能を発揮することができる核酸分子の提供を目的とする。下式(A):[式中、各記号の定義は明細書中に記載の通りである]で表される環状型核酸分子は、容易に低コストで合成でき、且つ、前記遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制が可能である。本発明の環状型核酸分子は、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農学、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
Description
本発明は、遺伝子発現制御機能を有する環状型核酸分子、それを含む組成物およびそれらの用途に関する。
遺伝子の発現を抑制する技術として、例えば、RNA干渉(RNAi)が知られている(非特許文献1)。RNA干渉による遺伝子の発現抑制は、例えば、短い二本鎖のRNA分子を、細胞等に投与することによって、実施されるのが一般的である。前記二本鎖のRNA分子は、通常、siRNA(small interfering RNA)と呼ばれる。この他に、環状のRNA分子であり、分子内アニールにより、部分的に二重鎖を形成したRNA分子によっても、遺伝子の発現が抑制できることが報告されている(特許文献1)。
マイクロRNA(miRNA)は、遺伝子の発現を抑制する核酸分子として知られており、例えば、以下のような生成プロセスを経て、遺伝子がコードするタンパク質の転写を抑制すると報告されている。すなわち、まず、核内において、5’末端にキャップ構造、3’末端にポリ(A)を有するmiRNA転写産物(Pri−miRNA)が生成される。前記Pri−miRNAは、RNase(Drosha)により切断され、miRNA前駆体(Pre−miRNA)が生成される。前記Pre−miRNAは、ループ領域とステム領域とを有するヘアピン構造をとる。このPre−miRNAは、核外に移動した後、細胞質のRNase(Dicer)により分解され、3’末端に1〜4塩基のオーバーハングを有する、二本鎖のmiRNAが切り出される。この二本鎖のmiRNAのうち、一方の鎖は、ガイド鎖と呼ばれ、他方の鎖は、パッセンジャー鎖と呼ばれ、前記ガイド鎖が、RNA induced Silencing Complex(RISC)に類似した複合体に結合する。このmiRNA/RISC複合体が特定のmRNAに結合することによって、前記mRNAの切断あるいはタンパク質への翻訳の抑制が生じる。
マイクロRNA(miRNA)は、遺伝子の発現を抑制する核酸分子として知られており、例えば、以下のような生成プロセスを経て、遺伝子がコードするタンパク質の転写を抑制すると報告されている。すなわち、まず、核内において、5’末端にキャップ構造、3’末端にポリ(A)を有するmiRNA転写産物(Pri−miRNA)が生成される。前記Pri−miRNAは、RNase(Drosha)により切断され、miRNA前駆体(Pre−miRNA)が生成される。前記Pre−miRNAは、ループ領域とステム領域とを有するヘアピン構造をとる。このPre−miRNAは、核外に移動した後、細胞質のRNase(Dicer)により分解され、3’末端に1〜4塩基のオーバーハングを有する、二本鎖のmiRNAが切り出される。この二本鎖のmiRNAのうち、一方の鎖は、ガイド鎖と呼ばれ、他方の鎖は、パッセンジャー鎖と呼ばれ、前記ガイド鎖が、RNA induced Silencing Complex(RISC)に類似した複合体に結合する。このmiRNA/RISC複合体が特定のmRNAに結合することによって、前記mRNAの切断あるいはタンパク質への翻訳の抑制が生じる。
miRNAは、分化、細胞増殖、アポトーシス等の生命現象やウイルス感染症、ガン等の多くの疾患に深く関わっていることが明らかになってきている(特許文献2、非特許文献2、非特許文献3)。このことから、特に医療分野における応用が期待されている。
生体内での安定性改善や自然免疫応答の亢進による副作用軽減の目的で、siRNAやmiRNA等の二本鎖核酸の末端を各種のリンカーで連結した、自己アニーリングする、1つもしくは2つのヘアピン型部分二次構造をとり得る一本鎖核酸分子が開発されている(特許文献2〜5)。
Fire,et al., 1998, Nature, 391, 806-811
Deiters, 2009, The AAPS Journal, 12, 51-60
Takeshita et al., 2010, Mol. Ther., 18, 181-187
一般に核酸は、溶液中で分解されやすく不安定であり、特に血清中での安定性に劣るため、例えば遺伝子発現制御を目的として核酸分子を生体に投与した場合でも所望の効果が十分に得られないという問題点があった。また、細胞内移行性や薬物動態の問題も存在している。
本発明は、血清中の安定性が向上し、かつ細胞内に移行して遺伝子発現制御機能を発揮することができる核酸分子の提供を目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、遺伝子発現制御機能を有する一本鎖核酸分子をジスルフィド結合により環状にすることにより血清中の安定性を向上させ、さらに、3’側及びループ側の構造を工夫することでより血清中の安定性を高めることに成功して本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、次の通りである。
[1]下式(A):
[1]下式(A):
[式中、
R1、R2、R1’およびR2’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはヒドロキシであり;
R3、R4、R3’およびR4’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはヒドロキシであり;
X1およびX2は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
Z1〜Z4は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
W1〜W6は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
QおよびTは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖であり(一方がガイド鎖の場合、他方はパッセンジャー鎖である);
Lは、リンカーであり;
mおよびm’は、それぞれ独立して、1〜12の整数であり;
nおよびn’は、それぞれ独立して、1〜10の整数であり;
x1およびx2は、それぞれ独立して、0または1であり;
y1およびy2は、それぞれ独立して、0または1であり;
z1〜z4は、それぞれ独立して、0、1または2であり;および
w1〜w6は、それぞれ独立して、0、1または2である]
で表される環状型核酸分子。
[2]X1、X2、Y1、Y2、Z1〜Z4およびW1〜W6が、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である上記[1]記載の核酸分子。
[3]X1およびX2は、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基であり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基であり;
Z1〜Z4は、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
W1〜W6は、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチドである、上記[1]または[2]記載の核酸分子。
[4]リンカーが、下式:
R1、R2、R1’およびR2’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはヒドロキシであり;
R3、R4、R3’およびR4’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはヒドロキシであり;
X1およびX2は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
Z1〜Z4は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
W1〜W6は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
QおよびTは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖であり(一方がガイド鎖の場合、他方はパッセンジャー鎖である);
Lは、リンカーであり;
mおよびm’は、それぞれ独立して、1〜12の整数であり;
nおよびn’は、それぞれ独立して、1〜10の整数であり;
x1およびx2は、それぞれ独立して、0または1であり;
y1およびy2は、それぞれ独立して、0または1であり;
z1〜z4は、それぞれ独立して、0、1または2であり;および
w1〜w6は、それぞれ独立して、0、1または2である]
で表される環状型核酸分子。
[2]X1、X2、Y1、Y2、Z1〜Z4およびW1〜W6が、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である上記[1]記載の核酸分子。
[3]X1およびX2は、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基であり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基であり;
Z1〜Z4は、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
W1〜W6は、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチドである、上記[1]または[2]記載の核酸分子。
[4]リンカーが、下式:
のいずれかで表される、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の核酸分子。
[5]X1、X2、Y1、Y2、Z1〜Z4およびW1〜W6のうち、すくなくとも1つが、それぞれ独立してメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の核酸分子。
[6]X1、X2、Y1、Y2、Z1〜Z4およびW1〜W6のうち、すくなくとも5つが、それぞれ独立してメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の核酸分子。
[7]ガイド鎖及びパッセンジャー鎖、並びにリンカーを含むポリヌクレオチド鎖が、その一部において二本鎖構造を形成した際に、その両端が平滑末端である、上記[1]〜[6]のいずれかに記載の核酸分子。
[8]標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
上記[1]〜[7]のいずれかに記載の核酸分子を含むことを特徴とする、標的遺伝子発現抑制用組成物。
[9]上記[1]〜[7]のいずれかに記載の核酸分子を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
[10]標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
上記[1]〜[7]のいずれかに記載の核酸分子を使用することを特徴とする、発現抑制方法。
[11]前記核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、上記[10]記載の発現抑制方法。
[12]前記核酸分子を、in vivoまたはin vitroで投与する、上記[10]または[11]記載の発現抑制方法。
[13]前記核酸分子を、非ヒト動物に投与する、上記[10]または[11]記載の発現抑制方法。
[5]X1、X2、Y1、Y2、Z1〜Z4およびW1〜W6のうち、すくなくとも1つが、それぞれ独立してメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の核酸分子。
[6]X1、X2、Y1、Y2、Z1〜Z4およびW1〜W6のうち、すくなくとも5つが、それぞれ独立してメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の核酸分子。
[7]ガイド鎖及びパッセンジャー鎖、並びにリンカーを含むポリヌクレオチド鎖が、その一部において二本鎖構造を形成した際に、その両端が平滑末端である、上記[1]〜[6]のいずれかに記載の核酸分子。
[8]標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
上記[1]〜[7]のいずれかに記載の核酸分子を含むことを特徴とする、標的遺伝子発現抑制用組成物。
[9]上記[1]〜[7]のいずれかに記載の核酸分子を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
[10]標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
上記[1]〜[7]のいずれかに記載の核酸分子を使用することを特徴とする、発現抑制方法。
[11]前記核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、上記[10]記載の発現抑制方法。
[12]前記核酸分子を、in vivoまたはin vitroで投与する、上記[10]または[11]記載の発現抑制方法。
[13]前記核酸分子を、非ヒト動物に投与する、上記[10]または[11]記載の発現抑制方法。
本発明の環状型核酸分子によれば、血清中の安定性が向上し、且つ、細胞内移行後に開裂して活性を示すので、効果の持続が期待できる。
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
(1)環状型核酸分子
本発明の環状型核酸分子は、前述のように、下記式(A)で表されることを特徴とする。
本発明の環状型核酸分子は、前述のように、下記式(A)で表されることを特徴とする。
式(A):
[式中、
R1、R2、R1’およびR2’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはヒドロキシであり;
R3、R4、R3’およびR4’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはヒドロキシであり;
X1およびX2は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
Z1〜Z4は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチドであり;
W1〜W6は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
QおよびTは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖であり(一方がガイド鎖の場合、他方はパッセンジャー鎖である);
Lは、リンカーであり;
mおよびm’は、それぞれ独立して、1〜12の整数であり;
nおよびn’は、それぞれ独立して、1〜10の整数であり;
x1およびx2は、それぞれ独立して、0または1であり;
y1およびy2は、それぞれ独立して、0または1であり;
z1〜z4は、それぞれ独立して、0、1または2であり;および
w1〜w6は、それぞれ独立して、0、1または2である]。
R1、R2、R1’およびR2’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはヒドロキシであり;
R3、R4、R3’およびR4’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはヒドロキシであり;
X1およびX2は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
Z1〜Z4は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチドであり;
W1〜W6は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
QおよびTは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖であり(一方がガイド鎖の場合、他方はパッセンジャー鎖である);
Lは、リンカーであり;
mおよびm’は、それぞれ独立して、1〜12の整数であり;
nおよびn’は、それぞれ独立して、1〜10の整数であり;
x1およびx2は、それぞれ独立して、0または1であり;
y1およびy2は、それぞれ独立して、0または1であり;
z1〜z4は、それぞれ独立して、0、1または2であり;および
w1〜w6は、それぞれ独立して、0、1または2である]。
本発明の環状型核酸分子は、例えば、標的遺伝子の発現を抑制できる。発現抑制とは、例えば、前記標的遺伝子の翻訳の抑制、すなわち、前記標的遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制を意味し、より詳細には、前記標的遺伝子のmRNAからの前記タンパク質の翻訳の抑制を意味する。前記標的遺伝子の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記タンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質が挙げられる。
本発明の環状型核酸分子は、一本鎖の核酸分子の5’末端と3’末端とがジスルフィド結合により連結しているため、例えば、環状型核酸分子のように二本の一本鎖をアニーリングする必要もなく、安価に製造できる。さらに、後述の実施例にて示されるように血清中での安定性が向上する。
また、本発明の環状型核酸分子は、ガイド鎖配列とパッセンジャー鎖配列とが、非ヌクレオチド構造のリンカー分子を介して連結されているため、比較的長いヌクレオチドループを有するpre−miRNAをもとにした一本鎖核酸分子に比べ、合成が容易かつ安価に提供でき、薬物動態や細胞内移行性にも優れる。
また、本発明の環状型核酸分子は、ガイド鎖配列とパッセンジャー鎖配列とが、非ヌクレオチド構造のリンカー分子を介して連結されているため、比較的長いヌクレオチドループを有するpre−miRNAをもとにした一本鎖核酸分子に比べ、合成が容易かつ安価に提供でき、薬物動態や細胞内移行性にも優れる。
本発明の環状型核酸分子において、前記Q領域は、任意の遺伝子発現制御機能を有する核酸分子のガイド鎖配列またはパッセンジャー鎖配列を含み、前記Q領域が前記ガイド鎖配列を含む場合、前記T領域は、前記遺伝子発現制御機能を有する核酸分子のパッセンジャー鎖配列を含み、前記Q領域が前記パッセンジャー鎖配列を含む場合、前記T領域は、前記ガイド鎖配列を含む。
本発明の環状型核酸分子において、前記Q領域は、前述のように、ガイド鎖配列(パッセンジャー鎖配列)を含む。一方、前記T領域は、前記パッセンジャー鎖配列(ガイド鎖配列)を含む。遺伝子発現制御機能を有する核酸分子のガイド鎖およびパッセンジャー鎖配列は、例えば、各種データベースに登録されている(例えば、http://www.mirbase.org/等)。したがって、例えば、これらの情報に基づいて、前記Q領域および前記T領域を設定できる。
前記Q(T)領域において、前記ガイド鎖配列(パッセンジャー鎖配列)の長さは、特に制限されず、例えば、報告されているガイド鎖配列(パッセンジャー鎖配列)の長さが例示できる。具体例として、下限が、例えば、10塩基長〜15塩基長であり、上限が、例えば、25塩基長〜30塩基長であり、塩基長の範囲が、例えば、10〜30塩基長で、好ましくは、15〜20塩基長である。
本発明の環状型核酸分子において、前記遺伝子発現制御機能を有する核酸分子の配列は、例えば、本発明の環状型核酸分子が、in vivoまたはin vitroで細胞内に導入された場合に、前記標的遺伝子の発現を抑制する活性を示す配列である。前記発現抑制配列は、特に制限されず、目的の標的遺伝子の種類に応じて、適宜設定できる。前記発現抑制配列は、例えば、siRNAによるRNA干渉に関与する配列を適宜適用できる。RNA干渉は、一般に、長い二本鎖RNA(dsRNA)が、細胞内において、Dicerにより、3’末端が突出した19〜21塩基対程度の二本鎖RNA(siRNA:small interfering RNA)に切断され、その一方の一本鎖RNAが標的mRNAに結合して、前記mRNAを分解することにより、前記mRNAの翻訳を抑制する現象である。前記標的mRNAに結合する前記siRNAにおける一本鎖RNAの配列は、例えば、標的遺伝子の種類に応じて様々な種類が報告されている。本発明は、例えば、前記siRNAの一本鎖RNAの配列を、前記発現抑制配列として使用できる。本発明においては、例えば、出願時において公知となっている前記siRNAの一本鎖RNA配列の他、将来的に明らかとなる配列に関しても、前記発現抑制配列として利用できる。
具体的には、前記遺伝子発現制御機能を有する核酸分子としては、例えば、TGF−β1遺伝子の発現抑制用核酸分子が挙げられる。TGF−β1遺伝子の発現抑制配列として、下記のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
3’-CGUCUCAUGUGUGUCGUAU-5’(配列番号1)
ガイド鎖配列として当該配列を選択した場合には、パッセンジャー鎖配列としてはその相補配列を用いることができる。前記相補配列は、例えば、前記ガイド鎖配列と、100%の相補性を示す配列でもよいし、アニーリング可能な範囲で100%未満の相補性を示す配列でもよい。前記相補性は、特に制限されず、例えば、90%〜100%、93%〜100%、95%〜100%、98%〜100%、99%〜100%等が例示できる。
前記相補配列は、例えば、下記のヌクレオチド配列を含むものが例示できる。
5’-GCAGAGUACACACAGCA-3’(配列番号2)
遺伝子発現制御機能を有する核酸分子としては、例えば、TGF−β1遺伝子の発現抑制用核酸分子を用いた場合には、TGF−β1遺伝子の発現抑制が可能なため、TGF−β1遺伝子の発現が原因となる疾患、例えば、肺線維症および急性肺傷害等を予防または治療できる。
3’-CGUCUCAUGUGUGUCGUAU-5’(配列番号1)
ガイド鎖配列として当該配列を選択した場合には、パッセンジャー鎖配列としてはその相補配列を用いることができる。前記相補配列は、例えば、前記ガイド鎖配列と、100%の相補性を示す配列でもよいし、アニーリング可能な範囲で100%未満の相補性を示す配列でもよい。前記相補性は、特に制限されず、例えば、90%〜100%、93%〜100%、95%〜100%、98%〜100%、99%〜100%等が例示できる。
前記相補配列は、例えば、下記のヌクレオチド配列を含むものが例示できる。
5’-GCAGAGUACACACAGCA-3’(配列番号2)
遺伝子発現制御機能を有する核酸分子としては、例えば、TGF−β1遺伝子の発現抑制用核酸分子を用いた場合には、TGF−β1遺伝子の発現抑制が可能なため、TGF−β1遺伝子の発現が原因となる疾患、例えば、肺線維症および急性肺傷害等を予防または治療できる。
前記遺伝子発現制御機能を有する核酸分子としては、例えば、COL1A1遺伝子の発現抑制用核酸分子が挙げられる。COL1A1遺伝子の発現抑制用核酸分子としては、miR-29b1が挙げられ、下記のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
3’-GUGACUAAAGUUUACCACGAU-5’(配列番号3)
ガイド鎖配列として当該配列を選択した場合には、パッセンジャー鎖配列としてはその相補配列を用いることができる。前記相補配列は、例えば、前記ガイド鎖配列と、100%の相補性を示す配列でもよいし、アニーリング可能な範囲で100%未満の相補性を示す配列でもよい。前記相補性は、特に制限されず、例えば、90%〜100%、93%〜100%、95%〜100%、98%〜100%、99%〜100%等が例示できる。
前記相補配列は、例えば、下記のヌクレオチド配列を含むものが例示できる。
5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’(配列番号4)
遺伝子発現制御機能を有する核酸分子としては、例えば、COL1A1遺伝子の発現抑制用核酸分子を用いた場合には、COL1A1遺伝子の発現抑制が可能なため、COL1A1遺伝子の発現が原因となる疾患、例えば、骨形成不全症等を予防または治療できる。
3’-GUGACUAAAGUUUACCACGAU-5’(配列番号3)
ガイド鎖配列として当該配列を選択した場合には、パッセンジャー鎖配列としてはその相補配列を用いることができる。前記相補配列は、例えば、前記ガイド鎖配列と、100%の相補性を示す配列でもよいし、アニーリング可能な範囲で100%未満の相補性を示す配列でもよい。前記相補性は、特に制限されず、例えば、90%〜100%、93%〜100%、95%〜100%、98%〜100%、99%〜100%等が例示できる。
前記相補配列は、例えば、下記のヌクレオチド配列を含むものが例示できる。
5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’(配列番号4)
遺伝子発現制御機能を有する核酸分子としては、例えば、COL1A1遺伝子の発現抑制用核酸分子を用いた場合には、COL1A1遺伝子の発現抑制が可能なため、COL1A1遺伝子の発現が原因となる疾患、例えば、骨形成不全症等を予防または治療できる。
式(A)において、
n個のR1およびR2、n’個のR1’およびR2’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基(後述)、アルコキシ基(後述)またはヒドロキシである。n個のR1、およびR2、n’個のR1’およびR2’は、好ましくは同一であり、より好ましくは同一で水素原子である。
n個のR1およびR2、n’個のR1’およびR2’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基(後述)、アルコキシ基(後述)またはヒドロキシである。n個のR1、およびR2、n’個のR1’およびR2’は、好ましくは同一であり、より好ましくは同一で水素原子である。
式(A)において、
m個のR3およびR4、m’個のR3’およびR4’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基(後述)、アルコキシ基(後述)またはヒドロキシである。m個のR3およびR4、m’個のR3’およびR4’は、好ましくは同一であり、より好ましくは同一で水素原子である。
m個のR3およびR4、m’個のR3’およびR4’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基(後述)、アルコキシ基(後述)またはヒドロキシである。m個のR3およびR4、m’個のR3’およびR4’は、好ましくは同一であり、より好ましくは同一で水素原子である。
X1およびX2は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
Y1およびY2は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
Z1〜Z4は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
W1〜W6は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
好ましくは、X1、X2、Y1、Y2、Z1〜Z4およびW1〜W6が、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。好ましくは、X1、X2、Y1、Y2、Z1〜Z4およびW1〜W6のうちのいずれか1つ、より好ましくはいずれか2つ、いっそう好ましくは3つ、特に好ましくは4つ、特により好ましくは5つ、最も好ましくは6つがメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
好ましくは、Z1〜Z4のいずれか1つ、より好ましくはいずれか2つ、特に好ましくはいずれか3つがメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
好ましくは、W1〜W6のいずれか1つ、より好ましくはいずれか2つ、いっそう好ましくは3つ、特に好ましくは4つ、特により好ましくは5つ、最も好ましくは6つがメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
Y1およびY2は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
Z1〜Z4は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
W1〜W6は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
好ましくは、X1、X2、Y1、Y2、Z1〜Z4およびW1〜W6が、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。好ましくは、X1、X2、Y1、Y2、Z1〜Z4およびW1〜W6のうちのいずれか1つ、より好ましくはいずれか2つ、いっそう好ましくは3つ、特に好ましくは4つ、特により好ましくは5つ、最も好ましくは6つがメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
好ましくは、Z1〜Z4のいずれか1つ、より好ましくはいずれか2つ、特に好ましくはいずれか3つがメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
好ましくは、W1〜W6のいずれか1つ、より好ましくはいずれか2つ、いっそう好ましくは3つ、特に好ましくは4つ、特により好ましくは5つ、最も好ましくは6つがメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
本明細書において、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基を総称してヌクレオチド残基とも称する。前記ヌクレオチド残基は、リボヌクレオチド残基が好ましい。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基が挙げられる。本発明の核酸分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。前記ヌクレオチド残基は、メトキシ基で置換されていてもよい。
前記非修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、具体的には、例えば、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されていてもよい。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。
修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基又はデオキシリボヌクレオチド残基は、例えば、フッ素原子、メチル基または前記未修飾ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい。前記代替物は、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、PNA(ペプチド核酸)、LNA(Locked Nucleic Acid)、ENA(2’−O,4’−C−Ethylenebridged Nucleic Acid)等があげられる。
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
前記塩基は、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、プリン、イソグアニン、7−デアザアデニン等があげられる。前記塩基は、例えば、2−アミノアデニン、6−メチル化プリン等のアルキル誘導体;2−プロピル化プリン等のアルキル誘導体;5−ハロウラシルおよび5−ハロシトシン;5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシン;6−アゾウラシル、6−アゾシトシンおよび6−アゾチミン;5−ウラシル(プソイドウラシル)、4−チオウラシル、5−ハロウラシル、5−(2−アミノプロピル)ウラシル、5−アミノアリルウラシル;8−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の8−置換プリン;5−トリフルオロメチル化および他の5−置換ピリミジン;7−メチルグアニン;5−置換ピリミジン;6−アザピリミジン;N−2、N−6、およびO−6置換プリン(2−アミノプロピルアデニンを含む);ジヒドロウラシル;3−デアザ−5−アザシトシン;2−アミノプリン;5−アルキルウラシル;7−アルキルグアニン;5−アルキルシトシン;N6、N6−ジメチルアデニン;5−アミノ−アリル−ウラシル;N3−メチルウラシル;置換1、2、4−トリアゾール;2−ピリジノン;5−ニトロインドール;3−ニトロピロール;5−メトキシウラシル;ウラシル−5−オキシ酢酸;5−メトキシカルボニルメチルウラシル;5−メチル−2−チオウラシル;5−メトキシカルボニルメチル−2−チオウラシル;5−メチルアミノメチル−2−チオウラシル;3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)ウラシル;3−メチルシトシン;5−メチルシトシン;N4−アセチルシトシン;2−チオシトシン;N6−メチルアデニン;N6−イソペンチルアデニン;2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン;N−メチルグアニン;O−アルキル化塩基等があげられる。また、プリンおよびピリミジンは、例えば、米国特許第3、687、808号、「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」、858〜859頁、クロシュビッツ ジェー アイ(Kroschwitz J.I.)編、John Wiley & Sons、1990、およびイングリッシュら(Englischら)、Angewandte Chemie、International Edition、1991、30巻、p.613に開示されるものが含まれる。
前記塩基は、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、プリン、イソグアニン、7−デアザアデニン等があげられる。前記塩基は、例えば、2−アミノアデニン、6−メチル化プリン等のアルキル誘導体;2−プロピル化プリン等のアルキル誘導体;5−ハロウラシルおよび5−ハロシトシン;5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシン;6−アゾウラシル、6−アゾシトシンおよび6−アゾチミン;5−ウラシル(プソイドウラシル)、4−チオウラシル、5−ハロウラシル、5−(2−アミノプロピル)ウラシル、5−アミノアリルウラシル;8−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の8−置換プリン;5−トリフルオロメチル化および他の5−置換ピリミジン;7−メチルグアニン;5−置換ピリミジン;6−アザピリミジン;N−2、N−6、およびO−6置換プリン(2−アミノプロピルアデニンを含む);ジヒドロウラシル;3−デアザ−5−アザシトシン;2−アミノプリン;5−アルキルウラシル;7−アルキルグアニン;5−アルキルシトシン;N6、N6−ジメチルアデニン;5−アミノ−アリル−ウラシル;N3−メチルウラシル;置換1、2、4−トリアゾール;2−ピリジノン;5−ニトロインドール;3−ニトロピロール;5−メトキシウラシル;ウラシル−5−オキシ酢酸;5−メトキシカルボニルメチルウラシル;5−メチル−2−チオウラシル;5−メトキシカルボニルメチル−2−チオウラシル;5−メチルアミノメチル−2−チオウラシル;3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)ウラシル;3−メチルシトシン;5−メチルシトシン;N4−アセチルシトシン;2−チオシトシン;N6−メチルアデニン;N6−イソペンチルアデニン;2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン;N−メチルグアニン;O−アルキル化塩基等があげられる。また、プリンおよびピリミジンは、例えば、米国特許第3、687、808号、「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」、858〜859頁、クロシュビッツ ジェー アイ(Kroschwitz J.I.)編、John Wiley & Sons、1990、およびイングリッシュら(Englischら)、Angewandte Chemie、International Edition、1991、30巻、p.613に開示されるものが含まれる。
式(A)中、
mおよびm’は、それぞれ独立して、1〜12の整数であり、好ましくは同一で4〜8の整数であり、特に好ましくは6である。
nおよびn’は、それぞれ独立して、1〜10の整数であり、好ましくは同一で2〜7の整数であり、特に好ましくは2または7である。
x1およびx2は、それぞれ独立して、0または1であり、好ましくは同一で1である。
y1およびy2は、それぞれ独立して、0または1であり、好ましくは同一で1である。
z1〜z4は、それぞれ独立して、0、1または2であり、好ましくは0または1であり、より好ましくは同一で1である。
w1〜w6は、それぞれ独立して、0、1または2であり、好ましくは0または1であり、より好ましくは同一で1である。
mおよびm’は、それぞれ独立して、1〜12の整数であり、好ましくは同一で4〜8の整数であり、特に好ましくは6である。
nおよびn’は、それぞれ独立して、1〜10の整数であり、好ましくは同一で2〜7の整数であり、特に好ましくは2または7である。
x1およびx2は、それぞれ独立して、0または1であり、好ましくは同一で1である。
y1およびy2は、それぞれ独立して、0または1であり、好ましくは同一で1である。
z1〜z4は、それぞれ独立して、0、1または2であり、好ましくは0または1であり、より好ましくは同一で1である。
w1〜w6は、それぞれ独立して、0、1または2であり、好ましくは0または1であり、より好ましくは同一で1である。
式(A)中、Lはリンカーである。具体的には、リンカーは下記式(I)中のL領域で表わされる構造を有する。
下式(I):
(式(I)中、
X1およびX2は、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHであり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
L1は、nL個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、mL個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
mLは、0〜30の整数であり;
nLは、0〜30の整数であり;
R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造(I)であり、
Aは、任意の原子団であり、ただし、下式(Ia)は、アミノ酸またはペプチドである。)
X1およびX2は、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHであり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
L1は、nL個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、mL個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
mLは、0〜30の整数であり;
nLは、0〜30の整数であり;
R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造(I)であり、
Aは、任意の原子団であり、ただし、下式(Ia)は、アミノ酸またはペプチドである。)
前記式(A)中のLは、前記式(I)中の−OR1−または−OR2−を介して隣接するヌクレオチド残基に結合する。
前記式(I)中、X1およびX2は、例えば、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHである。前記式(I)中において、X1がH2であるとは、X1が、X1の結合する炭素原子とともに、CH2(メチレン基)を形成することを意味する。X2についても同様である。
前記式(I)中、Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSである。
前記式(I)中、L1は、nL個の炭素原子を有するアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、L1は、前記アルキレン鎖の1つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Y1がOの場合、その酸素原子とL1の酸素原子は隣接せず、OR1の酸素原子とL1の酸素原子は隣接しない。
前記式(I)中、L2は、mL個の炭素原子を有するアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、L2は、前記アルキレン鎖の1つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Y2がOの場合、その酸素原子とL2の酸素原子は隣接せず、OR2の酸素原子とL2の酸素原子は隣接しない。
L1のnLおよびL2のmLは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、0であり、上限も、特に制限されない。nLおよびmLは、例えば、前記リンカー領域Lの所望の長さに応じて、適宜設定できる。nLおよびmLは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、0〜30が好ましく、より好ましくは0〜20であり、さらに好ましくは0〜15である。nLとmLは、同じでもよいし(nL=mL)、異なってもよい。nL+mLは、例えば、0〜30であり、好ましくは0〜20であり、より好ましくは0〜15である。
Ra、Rb、RcおよびRdは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル(ハロアルキル、例:CF3、CH2CF3、CH2CCl3)、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル(例:メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチル)、アルケニル(例:ビニル)、アルキニル(例:エチニル)、シクロアルキル(例:シクロプロピル、アダマンチル)、シクロアルキルアルキル(例:シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル)、シクロアルケニル(例:シクロプロペニル)、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル(例:ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル)、アルコキシアルキル(例:メトキシメチル、エトキシメチル、エトキシエチル)、アリール(例:フェニル、ナフチル)、アリールアルキル(例:ベンジル、フェネチル)、アルキルアリール(例:p−メチルフェニル)、ヘテロアリール(例:ピリジル、フリル)、ヘテロアリールアルキル(例:ピリジルメチル)、ヘテロシクリル(例:ピペリジル)、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル(例:モルホリルメチル)、アルコキシ(例:メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ)、ハロゲン化アルコキシ(例:OCF3)、アルケニルオキシ(例:ビニルオキシ、アリルオキシ)、アリールオキシ(例:フェニルオキシ)、アルキルオキシカルボニル(例:メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニル)、アリールアルキルオキシ(例:ベンジルオキシ)、アミノ[アルキルアミノ(例:メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ)、アシルアミノ(例:アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ)、アリールアルキルアミノ(例:ベンジルアミノ、トリチルアミノ)、ヒドロキシアミノ]、アミノアルキル(例:アミノメチル)、アルキルアミノアルキル(例:ジエチルアミノメチル)、カルバモイル、スルファモイル、オキソ、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。これらの置換基は、1または複数のさらなる置換基またはさらなる保護基で置換されていても良い。前記さらなる置換基は、特に限定されないが、例えば、上記例示に係る置換基でも良い。前記さらなる保護基は、特に限定されないが、例えば、下記例示に係る保護基でも良い。以下において同様である。
前記保護基(または、前記さらなる保護基)は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献(J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 Prenum Press, London and New York, 1973)の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、tert−ブチルジメチルシリル基(TBDMS)、ビス(2−アセトキシエチルオキシ)メチル基(ACE)、トリイソプロピルシリルオキシメチル基(TOM)、1−(2−シアノエトキシ)エチル基(CEE)、2−シアノエトキシメチル基(CEM)およびトリルスルフォニルエトキシメチル基(TEM)、ジメトキシトリチル基(DMTr)等があげられる。R3がOR4の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基およびTEM基等があげられる。この他にも、下式(P1)および(P2)のシリル含有基があげられ、中でも、DMTr基および前記シリル含有基のいずれかであることが好ましい。
前記式(I)において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Cl、Br、FおよびI等のハロゲンに置換されてもよい。
前記式(A)中のLは、前記式(I)中の−OR1−または−OR2−を介して、隣接するヌクレオチド残基のリン酸基に結合する。ここで、R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよい。R1およびR2が存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式(I)の構造である。R1および/またはR2が前記式(I)の構造の場合、前記リンカー領域(L)は、前記式(I)の構造からなる残基が、2つ以上連結された構造となる。前記式(I)の構造は、例えば、1個、2個、3個または4個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記(I)の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。
前記式(I)中、原子団Aは、下式(Ia):
がアミノ酸またはペプチドとなる限り、特に制限されない。
例えば、前記(I)または(Ia)中の原子団Aは、例えば、鎖式原子団、脂環式原子団、および芳香族性原子団からなる群から選択される少なくとも一つを含んでいても含んでいなくても良い。前記鎖式原子団は、特に限定されないが、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等が挙げられる。前記脂環式原子団は、特に限定されないが、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等が挙げられる。前記芳香族性原子団は、特に限定されないが、例えば、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、縮環系アリール、縮環系アリールアルキル、縮環系アルキルアリール等が挙げられる。また、前記式(I)または(Ia)中の原子団Aにおいて、前記各原子団は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基または保護基は、複数の場合は同一でも異なってもよい。前記置換基としては、例えば、前記Ra、Rb、RcおよびRdで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ra、Rb、RcおよびRdで例示した保護基と同様である。
例えば、前記(I)または(Ia)中の原子団Aは、例えば、鎖式原子団、脂環式原子団、および芳香族性原子団からなる群から選択される少なくとも一つを含んでいても含んでいなくても良い。前記鎖式原子団は、特に限定されないが、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等が挙げられる。前記脂環式原子団は、特に限定されないが、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等が挙げられる。前記芳香族性原子団は、特に限定されないが、例えば、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、縮環系アリール、縮環系アリールアルキル、縮環系アルキルアリール等が挙げられる。また、前記式(I)または(Ia)中の原子団Aにおいて、前記各原子団は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基または保護基は、複数の場合は同一でも異なってもよい。前記置換基としては、例えば、前記Ra、Rb、RcおよびRdで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ra、Rb、RcおよびRdで例示した保護基と同様である。
本発明において、「アミノ酸」は、分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ1つ以上含む任意の有機化合物をいう。また、「ペプチド」は、2分子以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造の有機化合物をいう。前記ペプチド結合は、酸アミド構造でも良いし、酸イミド構造でも良い。また、前記式(Ia)で表すアミノ酸分子中にアミノ基が複数存在する場合は、前記式(Ia)中に明示しているアミノ基は、いずれのアミノ基であっても良い。また、前記式(Ia)で表すアミノ酸分子中にカルボキシ基が複数存在する場合は、前記式(Ia)中に明示しているカルボキシ基は、いずれのカルボキシ基であっても良い。
本発明の環状型核酸分子の前記リンカー領域(L)において、前記アミノ酸は、天然アミノ酸でも良いし、人工アミノ酸であっても良い。なお、本発明において、「天然アミノ酸」は、天然に存在する構造のアミノ酸またはその光学異性体をいう。前記天然アミノ酸の製造方法は特に限定されず、例えば、天然物から抽出しても良いし、合成しても良い。また、本発明において、「人工アミノ酸」は、天然に存在しない構造のアミノ酸をいう。すなわち、前記人工アミノ酸は、アミノ酸すなわちアミノ基を含むカルボン酸誘導体(分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ1つ以上含む有機化合物)であって、天然に存在しない構造のカルボン酸誘導体をいう。前記アミノ酸は、例えば、タンパク質を構成するアミノ酸であっても良い。前記アミノ酸は、例えば、グリシン、α−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシリシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、プロリン、4−ヒドロキシプロリン、トリプトファン、β−アラニン、1−アミノ−2−カルボキシシクロペンタン、アミノ安息香酸、アミノピリジンカルボン酸および下記化学式(Ia2)で表されるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも1種類であっても良く、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基としては、例えば、前記Ra、Rb、RcおよびRdで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ra、Rb、RcおよびRdで例示した保護基と同様である。また、前記化学式(Ia)のアミノ酸またはペプチドに、光学異性体、幾何異性体、立体異性体等の異性体が存在する場合は、いずれの異性体でも良い。
前記化学式(Ia2)中、
R100は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、1個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。R100における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ra、Rb、RcおよびRdで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。また、前記化学式(Ia2)の構造は、例えば、下記化学式(Ia3)であってもよい。
R100は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、1個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。R100における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ra、Rb、RcおよびRdで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。また、前記化学式(Ia2)の構造は、例えば、下記化学式(Ia3)であってもよい。
なお、前記化学式(Ia)の構造が、前記化学式(Ia2)である場合、前記化学式(I)中の原子団Aの構造は、下記化学式(A2)で表される。下記化学式(A2)中のR100は、前記化学式(Ia2)中のR100と同じである。また、前記化学式(Ia)の構造が、前記化学式(Ia3)である場合、前記化学式(I)中の原子団Aの構造は、下記化学式(A2a)で表される。
前記化学式(I)の構造は、例えば、下記化学式(I−1)〜(I−7)が例示でき、下記化学式(I−1)〜(I−7)において、nLおよびmLは、前記化学式(I)と同じである。
前記化学式(I−1)〜(I−7)において、nLおよびmLは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記化学式(I−1)においてnL=11およびmL=12、または、nL=5およびmL=4と、前記化学式(I−4)においてnL=5およびmL=4と、前記化学式(I−6)において、nL=4およびmL=4と、前記化学式(1−7)においてnL=5およびmL=4とがあげられる。それらの構造を、下記化学式(I−1a)、(I−1b)、(I−4a)、(I−6a)および(I−7a)に示す。中でも、式(I−1b)、(I−4a)、(I−6a)および(I−7a)が好ましい。
あるいは、本発明の環状型核酸分子において、前記リンカー領域Lは、下記式(II)で表わされる。
前記式(II)中、
X1およびX2は、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHであり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
R3は、環A上のC−3、C−4、C−5またはC−6に結合する水素原子または置換基であり、
L1は、nL個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、mL個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
lは、1または2であり;
mLは、0〜30の整数であり;
nLは、0〜30の整数であり;
環Aは、前記環A上のC−2以外の1個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環A内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造(II)であり、
前記式(A)中のLは、前記式(II)中の−OR1−または−OR2−を介して隣接するヌクレオチド残基に結合する。
X1およびX2は、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHであり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
R3は、環A上のC−3、C−4、C−5またはC−6に結合する水素原子または置換基であり、
L1は、nL個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、mL個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
lは、1または2であり;
mLは、0〜30の整数であり;
nLは、0〜30の整数であり;
環Aは、前記環A上のC−2以外の1個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環A内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造(II)であり、
前記式(A)中のLは、前記式(II)中の−OR1−または−OR2−を介して隣接するヌクレオチド残基に結合する。
前記式(II)中、X1およびX2は、例えば、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHである。前記式(II)中において、X1がH2であるとは、X1が、X1の結合する炭素原子とともに、CH2(メチレン基)を形成することを意味する。X2についても同様である。
前記式(II)中、Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSである。
前記式(II)中、L1は、nL個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、L1は、前記アルキレン鎖の1つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Y1がOの場合、その酸素原子とL1の酸素原子は隣接せず、OR1の酸素原子とL1の酸素原子は隣接しない。
前記式(II)中、L2は、mL個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、L2は、前記アルキレン鎖の1つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Y2がOの場合、その酸素原子とL2の酸素原子は隣接せず、OR2の酸素原子とL2の酸素原子は隣接しない。
L1のnLおよびL2のmLは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、0であり、上限も、特に制限されない。nLおよびmLは、例えば、前記リンカー領域(L)の所望の長さに応じて、適宜設定できる。nLおよびmLは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、0〜30が好ましく、より好ましくは0〜20であり、さらに好ましくは0〜15である。nLとmLは、同じでもよいし(nL=mL)、異なってもよい。nL+mLは、例えば、0〜30であり、好ましくは0〜20であり、より好ましくは0〜15である。
Ra、Rb、RcおよびRdは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基である。前記置換基および前記保護基は、例えば、前述と同様である。
前記式(II)において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Cl、Br、FおよびI等のハロゲンに置換されてもよい。
前記式(A)中の前記Lは、前記式(II)中の−OR1−または−OR2−を介して、隣接するヌクレオチド残基のリン酸基に結合する。ここで、R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよい。R1およびR2が存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式(II)の構造である。R1および/またはR2が前記式(II)の構造の場合、前記リンカー領域(L)は、前記式(II)の構造からなる残基が、2つ以上連結された構造となる。前記式(II)の構造は、例えば、1個、2個、3個または4個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記(II)の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。
前記式(II)中、環Aにおいて、lは、1または2である。l=1の場合、環Aは、5員環であり、例えば、前記ピロリジン骨格である。前記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。l=2の場合、環Aは、6員環であり、例えば、前記ピペリジン骨格である。環Aは、環A上のC−2以外の1個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。また、環Aは、環A内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。環Aは、例えば、L型およびD型のいずれでもよい。
前記式(II)中、R3は、環A上のC−3、C−4、C−5またはC−6に結合する水素原子または置換基である。R3が前記置換基の場合、置換基R3は、1でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。
置換基R3は、例えば、ハロゲン、OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、SH、SR4またはオキソ基(=O)等である。
R4およびR5は、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。以下、同様である。置換基R3は、これらの列挙する置換基であってもよい。
前記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献(J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 Prenum Press, London and New York, 1973)の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、tert−ブチルジメチルシリル基(TBDMS)、ビス(2−アセトキシエチルオキシ)メチル基(ACE)、トリイソプロピルシリルオキシメチル基(TOM)、1−(2−シアノエトキシ)エチル基(CEE)、2−シアノエトキシメチル基(CEM)およびトリルスルフォニルエトキシメチル基(TEM)、ジメトキシトリチル基(DMTr)等があげられる。R3がOR4の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基およびTEM基等があげられる。この他にも、シリル含有基もあげられる。以下、同様である。
前記式(II)の構造は、例えば、下記式(II−1)〜式(II−9)が例示でき、下記式において、nLおよびmLは、前記式(II)と同じである。下記式において、qLは、0〜10の整数である。
前記式(II−1)〜(II−9)において、nL、mLおよびqLは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式(II−1)において、nL=8、前記(II−2)において、nL=3、前記式(II−3)において、nL=4または8、前記(II−4)において、nL=7または8、前記式(II−5)において、nL=3およびmL=4、前記(II−6)において、nL=8およびmL=4、前記式(II−7)において、nL=8およびmL=4、前記(II−8)において、nL=5およびmL=4、nL=7およびmL=6、nL=9およびmL=8、またはnL=11およびmL=10、前記式(II−9)において、qL=1およびmL=4があげられる。前記式(II−4)の一例(nL=8)を、下記式(II−4a)に、前記式(II−8)の一例(nL=5、mL=4)を、下記式(II−8a)に示す。中でも式(II−8a)が好ましい。
本発明において、「アルキル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキル基を含む。前記アルキルの炭素数は、特に制限されず、例えば、1〜30であり、好ましくは、1〜6または1〜4である。前記アルキル基は、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、n−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n−ヘキシル、イソヘキシル、n−ヘプチル、n−オクチル、n−ノニル、n−デシル等があげられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、n−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n−ヘキシル、イソヘキシル等があげられる。
本発明において、「アルケニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルケニルを含む。前記アルケニルは、前記アルキルにおいて、1個または複数の二重結合を有するもの等があげられる。前記アルケニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは2〜8である。前記アルケニルは、例えば、ビニル、1−プロペニル、2−プロペニル、1−ブテニル、2−ブテニル、3−ブテニル、1,3−ブタジエニル、3−メチル−2−ブテニル等があげられる。
本発明において、「アルキニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキニルを含む。前記アルキニルは、前記アルキルにおいて、1個または複数の三重結合を有するもの等があげられる。前記アルキニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは2〜8である。前記アルキニルは、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル等があげられる。前記アルキニルは、例えば、さらに、1個または複数の二重結合を有してもよい。
本発明において、「アリール」は、例えば、単環芳香族炭化水素基および多環芳香族炭化水素基を含む。前記単環芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル等があげられる。前記多環芳香族炭化水素基は、例えば、1−ナフチル、2−ナフチル、1−アントリル、2−アントリル、9−アントリル、1−フェナントリル、2−フェナントリル、3−フェナントリル、4−フェナントリル、9−フェナントリル等があげられる。好ましくは、例えば、フェニル、1−ナフチルおよび2−ナフチル等のナフチル等があげられる。
本発明において、「ヘテロアリール」は、例えば、単環芳香族複素環式基および縮合芳香族複素環式基を含む。前記ヘテロアリールは、例えば、フリル(例:2−フリル、3−フリル)、チエニル(例:2−チエニル、3−チエニル)、ピロリル(例:1−ピロリル、2−ピロリル、3−ピロリル)、イミダゾリル(例:1−イミダゾリル、2−イミダゾリル、4−イミダゾリル)、ピラゾリル(例:1−ピラゾリル、3−ピラゾリル、4−ピラゾリル)、トリアゾリル(例:1,2,4−トリアゾール−1−イル、1,2,4−トリアゾール−3−イル、1,2,4−トリアゾール−4−イル)、テトラゾリル(例:1−テトラゾリル、2−テトラゾリル、5−テトラゾリル)、オキサゾリル(例:2−オキサゾリル、4−オキサゾリル、5−オキサゾリル)、イソキサゾリル(例:3−イソキサゾリル、4−イソキサゾリル、5−イソキサゾリル)、チアゾリル(例:2−チアゾリル、4−チアゾリル、5−チアゾリル)、チアジアゾリル、イソチアゾリル(例:3−イソチアゾリル、4−イソチアゾリル、5−イソチアゾリル)、ピリジル(例:2−ピリジル、3−ピリジル、4−ピリジル)、ピリダジニル(例:3−ピリダジニル、4−ピリダジニル)、ピリミジニル(例:2−ピリミジニル、4−ピリミジニル、5−ピリミジニル)、フラザニル(例:3−フラザニル)、ピラジニル(例:2−ピラジニル)、オキサジアゾリル(例:1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)、ベンゾフリル(例:2−ベンゾ[b]フリル、3−ベンゾ[b]フリル、4−ベンゾ[b]フリル、5−ベンゾ[b]フリル、6−ベンゾ[b]フリル、7−ベンゾ[b]フリル)、ベンゾチエニル(例:2−ベンゾ[b]チエニル、3−ベンゾ[b]チエニル、4−ベンゾ[b]チエニル、5−ベンゾ[b]チエニル、6−ベンゾ[b]チエニル、7−ベンゾ[b]チエニル)、ベンゾイミダゾリル(例:1−ベンゾイミダゾリル、2−ベンゾイミダゾリル、4−ベンゾイミダゾリル、5−ベンゾイミダゾリル)、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノキサリニル(例:2−キノキサリニル、5−キノキサリニル、6−キノキサリニル)、シンノリニル(例:3−シンノリニル、4−シンノリニル、5−シンノリニル、6−シンノリニル、7−シンノリニル、8−シンノリニル)、キナゾリニル(例:2−キナゾリニル、4−キナゾリニル、5−キナゾリニル、6−キナゾリニル、7−キナゾリニル、8−キナゾリニル)、キノリル(例:2−キノリル、3−キノリル、4−キノリル、5−キノリル、6−キノリル、7−キノリル、8−キノリル)、フタラジニル(例:1−フタラジニル、5−フタラジニル、6−フタラジニル)、イソキノリル(例:1−イソキノリル、3−イソキノリル、4−イソキノリル、5−イソキノリル、6−イソキノリル、7−イソキノリル、8−イソキノリル)、プリル、プテリジニル(例:2−プテリジニル、4−プテリジニル、6−プテリジニル、7−プテリジニル)、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル(例:1−アクリジニル、2−アクリジニル、3−アクリジニル、4−アクリジニル、9−アクリジニル)、インドリル(例:1−インドリル、2−インドリル、3−インドリル、4−インドリル、5−インドリル、6−インドリル、7−インドリル)、イソインドリル、フェナジニル(例:1−フェナジニル、2−フェナジニル)またはフェノチアジニル(例:1−フェノチアジニル、2−フェノチアジニル、3−フェノチアジニル、4−フェノチアジニル)等があげられる。
本発明において、「シクロアルキル」は、例えば、環状飽和炭化水素基であり、炭素数は、例えば、3〜15である。前記シクロアルキルは、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基等があげられ、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、橋かけ環式炭化水素基等があげられる。
本発明において、「橋かけ環式炭化水素基」は、例えば、ビシクロ[2.1.0]ペンチル、ビシクロ[2.2.1]ヘプチル、ビシクロ[2.2.2]オクチルおよびビシクロ[3.2.1]オクチル、トリシクロ[2.2.1.0]ヘプチル、ビシクロ[3.3.1]ノナン、1−アダマンチル、2−アダマンチル等があげられる。
本発明において、「スピロ炭化水素基」は、例えば、スピロ[3.4]オクチル等があげられる。
本発明において、「シクロアルケニル」は、例えば、環状の不飽和脂肪族炭化水素基を含み、炭素数は、例えば、3〜7個である。前記基は、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等があげられ、好ましくは、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等である。前記シクロアルケニルは、例えば、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基およびスピロ炭化水素基も含む。
本発明において、「アリールアルキル」は、例えば、ベンジル、2−フェネチル、およびナフタレニルメチル等があげられ、「シクロアルキルアルキル」または「シクリルアルキル」は、例えば、シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル等があげられ、「ヒドロキシアルキル」は、例えば、ヒドロキシメチルおよび2−ヒドロキシエチル等があげられる。
本発明において、「アルコキシ」は、例えば、前記アルキル−O−基を含み、例えば、メトキシ、エトキシ、n−プロポキシ、イソプロポキシ、およびn−ブトキシ等があげられ、「アルコキシアルキル」は、例えば、メトキシメチル等があげられ、「アミノアルキル」は、例えば、2−アミノエチル等があげられる。
本発明において、「ヘテロシクリル」は、例えば、1−ピロリニル、2−ピロリニル、3−ピロリニル、1−ピロリジニル、2−ピロリジニル、3−ピロリジニル、ピロリジノン、1−イミダゾリニル、2−イミダゾリニル、4−イミダゾリニル、1−イミダゾリジニル、2−イミダゾリジニル、4−イミダゾリジニル、イミダゾリジノン、1−ピラゾリニル、3−ピラゾリニル、4−ピラゾリニル、1−ピラゾリジニル、3−ピラゾリジニル、4−ピラゾリジニル、ピペリジノン、ピペリジノ、2−ピペリジニル、3−ピペリジニル、4−ピペリジニル、1−ピペラジニル、2−ピペラジニル、ピペラジノン、2−モルホリニル、3−モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等があげられる。
本発明において、「ヘテロシクリルアルキル」は、例えば、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル等があげられ、「ヘテロシクリルアルケニル」は、例えば、2−ピペリジニルエテニル等があげられ、「ヘテロアリールアルキル」は、例えば、ピリジルメチルおよびキノリン−3−イルメチル等があげられる。
本発明において、「シリル」は、式R3Si−で表される基を含み、Rは、独立して、前記アルキル、アリールおよびシクロアルキルから選択でき、例えば、トリメチルシリル基、tert−ブチルジメチルシリル基等があげられ、「シリルオキシ」は、例えば、トリメチルシリルオキシ基等があげられ、「シリルオキシアルキル」は、例えば、トリメチルシリルオキシメチル等があげられる。
本発明において、「アルキレン」は、例えば、メチレン、エチレン、およびプロピレン等があげられる。
本発明において、前述した各種基は、置換されてもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル(ハロアルキル、例:CF3、CH2CF3、CH2CCl3)、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル(例:メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチル)、アルケニル(例:ビニル)、アルキニル(例:エチニル)、シクロアルキル(例:シクロプロピル、アダマンチル)、シクロアルキルアルキル(例:シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル)、シクロアルケニル(例:シクロプロペニル)、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル(例:ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル)、アルコキシアルキル(例:メトキシメチル、エトキシメチル、エトキシエチル)、アリール(例:フェニル、ナフチル)、アリールアルキル(例:ベンジル、フェネチル)、アルキルアリール(例:p−メチルフェニル)、ヘテロアリール(例:ピリジル、フリル)、ヘテロアリールアルキル(例:ピリジルメチル)、ヘテロシクリル(例:ピペリジル)、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル(例:モルホリルメチル)、アルコキシ(例:メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ)、ハロゲン化アルコキシ(例:OCF3)、アルケニルオキシ(例:ビニルオキシ、アリルオキシ)、アリールオキシ(例:フェニルオキシ)、アルキルオキシカルボニル(例:メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニル)、アリールアルキルオキシ(例:ベンジルオキシ)、アミノ[アルキルアミノ(例:メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ)、アシルアミノ(例:アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ)、アリールアルキルアミノ(例:ベンジルアミノ、トリチルアミノ)、ヒドロキシアミノ]、アミノアルキル(例:アミノメチル)、アルキルアミノアルキル(例:ジエチルアミノメチル)、カルバモイル、スルファモイル、オキソ、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。
あるいは、本発明の環状型核酸分子において、前記リンカー領域(L)は、下記式(III−1)〜(III−3)のいずれかで表わされる。各式中、nLおよびmLは、前記化学式(I)と同じである。
前記化学式(III−1)〜(III−3)において、nLおよびmLは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記化学式(III−1)において、nL=5およびmL=4と、前記化学式(III−2)においてnL=5およびmL=4と、前記化学式(III−3)において、nL=5およびmL=4とがあげられる。それらの構造を、下記化学式(III−1a)、(III−2a)および(III−3a)に示す。好ましくは、式(III−1a)、(III−2a)および(III−3a)である。
本発明の環状型核酸分子は、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、TAMRA、フルオレセイン、Cy3色素、Cy5色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Alexa488等のAlexa色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、2H、13C、15N、17O、18O、33S、34Sおよび36Sがあげられる。
本発明の環状型核酸分子は、前述のように、前記標的遺伝子の発現抑制ができる。このため、本発明の環状型核酸分子は、例えば、遺伝子が原因となる疾患の治療剤として使用できる。本発明の環状型核酸分子が、例えば、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する遺伝子のガイド鎖配列を有する場合、例えば、前記標的遺伝子の発現抑制により、前記疾患を治療できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。前記疾患は、特に制限されず、例えば、目的の疾患に応じて前記発現抑制配列を適宜設定できる。前記疾患としては、例えば、乳がん、肺がん、胃がん、大腸がん、肝がん、膵がん、食道がん、前立腺がん、胆嚢がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、骨肉腫、白血病等のがん、肺線維症、肝線維症等の疾患があげられる。
本発明の環状型核酸分子の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記環状型核酸分子を投与すればよい。
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、in vivoでもin vitroでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、HeLa細胞、293細胞、NIH3T3細胞、COS細胞等の各種培養細胞、ES細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
本発明において、発現抑制の対象となる前記標的遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を設定できる。そして、前述のように、前記標的遺伝子の種類に応じて、前記環状型核酸分子を選択すればよい。
本発明の環状型核酸分子の使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を参照できる。
本発明の環状型核酸分子は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農学、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
本発明の環状型核酸分子の合成方法は、例えば、従来タンパク質化学で公知の製造方法を利用することができる。前記合成に必要となる直鎖の一本鎖核酸分子の製造方法は、例えば、遺伝子工学的手法を利用した合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、PCRカセットによる方法があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびH−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、RNA Phosphoramidites(2’−O−TBDMSi、商品名、三千里製薬)、ACEアミダイトおよびTOMアミダイト、CEEアミダイト、CEMアミダイト、TEMアミダイト等があげられる。
かくして得られた一本鎖核酸分子は、例えば、ジスルフィド結合を有する化合物を用いて環化反応に付し5’末端と3’末端とを連結させて環状の核酸分子を得ることができる。該環化反応としては、当分野で通常実施される各種反応を利用することができ、例えば、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)(DSP)やジチオビス(スクシンイミジルオクタノエート)(DSO)等のホモ二官能性の架橋剤を用いる方法があげられる。
具体的には、固相合成方法で得られた一本鎖核酸分子(5’、3’−末端いずれもアミノ基を含む)を、例えば、リン酸緩衝液に溶かし、ホモ二官能性の架橋剤(約10当量)を加え、25℃にて数時間反応させる。出発原料の一本鎖核酸分子は、ほぼ消失し、反応混合物は、逆相クロマトにより精製し、目的化合物を高収率で得ることができる。
かくして得られた一本鎖核酸分子は、例えば、ジスルフィド結合を有する化合物を用いて環化反応に付し5’末端と3’末端とを連結させて環状の核酸分子を得ることができる。該環化反応としては、当分野で通常実施される各種反応を利用することができ、例えば、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)(DSP)やジチオビス(スクシンイミジルオクタノエート)(DSO)等のホモ二官能性の架橋剤を用いる方法があげられる。
具体的には、固相合成方法で得られた一本鎖核酸分子(5’、3’−末端いずれもアミノ基を含む)を、例えば、リン酸緩衝液に溶かし、ホモ二官能性の架橋剤(約10当量)を加え、25℃にて数時間反応させる。出発原料の一本鎖核酸分子は、ほぼ消失し、反応混合物は、逆相クロマトにより精製し、目的化合物を高収率で得ることができる。
(2)組成物
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の環状型核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の環状型核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の環状型核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の環状型核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
本発明によれば、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。
また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明の環状型核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の環状型核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。
本発明によれば、例えば、遺伝子が原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
本発明において、治療の対象となる疾患は、特に制限されず、例えば、遺伝子の発現が原因となる疾患があげられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定し、さらに、前記標的遺伝子に応じて、前記環状型核酸分子のガイド鎖配列を選択すればよい。
本発明の発現抑制用組成物および薬学的組成物(以下、組成物という)は、その使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記環状型核酸分子を投与すればよい。
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、in vivoでもin vitroでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、HeLa細胞、293細胞、NIH3T3細胞、COS細胞等の各種培養細胞、ES細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。
本発明の組成物は、例えば、本発明の環状型核酸分子のみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
本発明の組成物において、前記環状型核酸分子は、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体形成により、例えば、前記環状型核酸分子を効率よくデリバリーすることができる。
前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。
前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤、賦形剤等があげられる。
(3)発現抑制方法
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の環状型核酸分子を使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明の環状型核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の環状型核酸分子を使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明の環状型核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の発現抑制方法において、前記標的遺伝子の発現抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、環状型核酸分子による発現抑制があげられる。
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に、前記環状型核酸分子を投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記環状型核酸分子を接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、in vivoでもin vitroでもよい。
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記環状型核酸分子を単独で投与してもよいし、前記環状型核酸分子を含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
(4)治療方法
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明の環状型核酸分子を、患者に投与する工程を含み、前記環状型核酸分子における前記ガイド鎖配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する環状型核酸分子のガイド鎖配列であることを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の環状型核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明の環状型核酸分子を、患者に投与する工程を含み、前記環状型核酸分子における前記ガイド鎖配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する環状型核酸分子のガイド鎖配列であることを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の環状型核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法等を援用できる。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与のいずれでもよい。
(5)環状型核酸分子の使用
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明の環状型核酸分子の使用である。
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明の環状型核酸分子の使用である。
本発明の環状型核酸分子は、疾患の治療に使用するための環状型の核酸分子であって、前記環状型核酸分子における前記ガイド鎖配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する環状型核酸分子のガイド鎖配列であることを特徴とする。
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
製造例:環状型核酸分子の合成
一本鎖核酸分子の合成
以下に示す一本鎖核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機(商品名ABI Expedite(商標登録)8909 Nucleic Acid Synthesis System、アプライドバイオシステムスおよび商品名ABI 3900 DNA Synthesizer、アプライドバイオシステムス)により合成した。3’側よりRNAアミダイトとして、EMMアミダイト(国際公開第2013/027843号)を用いた固相合成を行った。また、リンカー領域にはL−プロリンアミダイト(日本国特許4965745)、グリシンアミダイト(日本国特許5876890)、L−リジンアミダイト(日本国特許5876890)を用いた。前記アミダイトの脱保護は、定法に従った。
本発明の一本鎖核酸分子の3’末端には、下記Phthalamido C−6 Linker lcaa CPG(ChemGenes)を用いた。
一本鎖核酸分子の合成
以下に示す一本鎖核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機(商品名ABI Expedite(商標登録)8909 Nucleic Acid Synthesis System、アプライドバイオシステムスおよび商品名ABI 3900 DNA Synthesizer、アプライドバイオシステムス)により合成した。3’側よりRNAアミダイトとして、EMMアミダイト(国際公開第2013/027843号)を用いた固相合成を行った。また、リンカー領域にはL−プロリンアミダイト(日本国特許4965745)、グリシンアミダイト(日本国特許5876890)、L−リジンアミダイト(日本国特許5876890)を用いた。前記アミダイトの脱保護は、定法に従った。
本発明の一本鎖核酸分子の3’末端には、下記Phthalamido C−6 Linker lcaa CPG(ChemGenes)を用いた。
本発明の一本鎖核酸分子の5’末端には、下記Tfa−NH−C6アミダイトを用いた。Tfa−NH−C6アミダイトは、6−アミノ−1−ヘキサノール(1g)とトリフルオロ酢酸エチル(1.6g)をエタノール中で反応させ、溶媒留去して乾燥させた後、常法でホスホロアミダイト化させることにより合成した(2.6g)。Tfa−NH−C6アミダイトは商業的に入手したものを用いてもよい。
本発明の一本鎖核酸分子のリンカー領域(L)には、下記構造のL−プロリンリンカー(以下、P又はPAとする)、グリシンリンカー(以下、Glyとする)、L−リジンリンカー(以下、K又はKAとする)を用いた。
得られた一本鎖核酸分子は、HPLCにより精製後、次工程である環状化反応に使用した。PA−0028〜PA−0033については未精製のまま、次工程に使用した。表1に調製した一本鎖核酸分子の名称および塩基配列を示す。配列中、大文字はRNA、小文字はDNA(ChemGenes)を表す。また、下線太字は2’−O−メチルリボース(SamchullyPharm)を含むヌクレオチドを表す。
参考例として用いた、二本鎖核酸分子であるsiRNA及び一本鎖核酸分子の名称および塩基配列を表2に示す。
各核酸分子は、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機(商品名ABI Expedite(登録商標) 8909 Nucleic Acid Synthesis System、アプライドバイオシステムス)により合成した。前記合成には、RNAアミダイトとして、RNA Phosphoramidites(2’−O−TBDMSi、商品名、三千里製薬)およびEMMアミダイト(国際公開第2013/027843号)を用いた。前記アミダイトの脱保護は、定法に従った。合成したRNAは、HPLCにより精製した。
各核酸分子は、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機(商品名ABI Expedite(登録商標) 8909 Nucleic Acid Synthesis System、アプライドバイオシステムス)により合成した。前記合成には、RNAアミダイトとして、RNA Phosphoramidites(2’−O−TBDMSi、商品名、三千里製薬)およびEMMアミダイト(国際公開第2013/027843号)を用いた。前記アミダイトの脱保護は、定法に従った。合成したRNAは、HPLCにより精製した。
実施例1:PA−0001−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0001−DSPの構造を示す。
PA−0001−DSPは、前記PA−0001の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDithiobis(succinimidyl propionate)(以下、DSP−ONSuとする、同仁堂)を結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0001−DSPの構造を示す。
PA−0001−DSPは、前記PA−0001の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDithiobis(succinimidyl propionate)(以下、DSP−ONSuとする、同仁堂)を結合させた環状型核酸分子である。
PA−0001−DSPの合成
114μmol/LのPA−0001 350μL、10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 65μL、エタノール 250μL、1%トリエチルアミン水溶液 35μLを混合し、40℃にて6時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製(カラム:Develosil C8−UG−5、5μm、10×50mm;流速:4.7mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:40℃;Buffer A:50mmol/L TEAA(pH7.0)、5%CH3CN;Buffer B:CH3CN)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水(大塚製薬)に溶解させた。純度98.69%のPA−0001−DSPを得た。質量分析:16224.00(計算値:16224.08)。精製後のHPLCチャートを図1に示す。
114μmol/LのPA−0001 350μL、10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 65μL、エタノール 250μL、1%トリエチルアミン水溶液 35μLを混合し、40℃にて6時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製(カラム:Develosil C8−UG−5、5μm、10×50mm;流速:4.7mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:40℃;Buffer A:50mmol/L TEAA(pH7.0)、5%CH3CN;Buffer B:CH3CN)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水(大塚製薬)に溶解させた。純度98.69%のPA−0001−DSPを得た。質量分析:16224.00(計算値:16224.08)。精製後のHPLCチャートを図1に示す。
実施例2:PA−0001−DSOの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0001−DSOの構造を示す。
PA−0001−DSOは、前記PA−0001の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDithiobis(succinimidyl octanoate)(以下、DSO−ONSuとする、同仁堂)を結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0001−DSOの構造を示す。
PA−0001−DSOは、前記PA−0001の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDithiobis(succinimidyl octanoate)(以下、DSO−ONSuとする、同仁堂)を結合させた環状型核酸分子である。
PA−0001−DSOの合成
160μmol/LのPA−0001 250μL、10mmol/LのDSO−ONSu/DMSO溶液 160μL、イソプロパノール 255μL、1%トリエチルアミン水溶液 35μLを混合し、40℃にて4時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製(カラム:Develosil C8−UG−5、5μm、10×50mm;流速:4.7mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:40℃;Buffer A:50mmol/L TEAA(pH7.0)、5%CH3CN;Buffer B:CH3CN)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水(大塚製薬)に溶解させた。純度97.39%のPA−0001−DSOを得た。質量分析:16364.20(計算値:16364.35)。精製後のHPLCチャートを図2に示す。
160μmol/LのPA−0001 250μL、10mmol/LのDSO−ONSu/DMSO溶液 160μL、イソプロパノール 255μL、1%トリエチルアミン水溶液 35μLを混合し、40℃にて4時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製(カラム:Develosil C8−UG−5、5μm、10×50mm;流速:4.7mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:40℃;Buffer A:50mmol/L TEAA(pH7.0)、5%CH3CN;Buffer B:CH3CN)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水(大塚製薬)に溶解させた。純度97.39%のPA−0001−DSOを得た。質量分析:16364.20(計算値:16364.35)。精製後のHPLCチャートを図2に示す。
実施例3:PA−0002−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0002−DSPの構造を示す。
PA−0002−DSPは、前記PA−0002の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0002−DSPの構造を示す。
PA−0002−DSPは、前記PA−0002の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0002−DSPの合成
120μmol/LのPA−0002 350μL、10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 65μL、イソプロパノール 250μL、1%トリエチルアミン水溶液 35μLを混合し、40℃にて4時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製(カラム:Develosil C8−UG−5、5μm、10×50mm;流速:4.7mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:40℃;Buffer A:50mmol/L TEAA(pH7.0)、5%CH3CN;Buffer B:50mmol/L TEAA(pH7.0)、50%CH3CN)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水(大塚製薬)に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度89.32%のPA−0002−DSPを0.25mg得た。質量分析:16881.90(計算値:16882.50)。精製後のHPLCチャートを図3に示す。
120μmol/LのPA−0002 350μL、10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 65μL、イソプロパノール 250μL、1%トリエチルアミン水溶液 35μLを混合し、40℃にて4時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製(カラム:Develosil C8−UG−5、5μm、10×50mm;流速:4.7mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:40℃;Buffer A:50mmol/L TEAA(pH7.0)、5%CH3CN;Buffer B:50mmol/L TEAA(pH7.0)、50%CH3CN)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水(大塚製薬)に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度89.32%のPA−0002−DSPを0.25mg得た。質量分析:16881.90(計算値:16882.50)。精製後のHPLCチャートを図3に示す。
実施例4:PA−0003−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0003−DSPの構造を示す。
PA−0003−DSPは、前記PA−0003の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0003−DSPの構造を示す。
PA−0003−DSPは、前記PA−0003の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0003−DSPの合成
286μmol/LのPA−0003 110μL、10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 50μL、pH8.5のリン酸緩衝液 40μL(最終濃度200mmol/L)を混合し、35℃にて35分間撹拌した。反応液をゲルろ過にて精製(illustra MicroSpin G−25 Columns、GEヘルスケア)した。分取したフラクションのUV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度70.99%のPA−0003−DSPを0.16mg得た。質量分析:16876.50(計算値:16876.58)。精製後のHPLCチャートを図4に示す。
286μmol/LのPA−0003 110μL、10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 50μL、pH8.5のリン酸緩衝液 40μL(最終濃度200mmol/L)を混合し、35℃にて35分間撹拌した。反応液をゲルろ過にて精製(illustra MicroSpin G−25 Columns、GEヘルスケア)した。分取したフラクションのUV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度70.99%のPA−0003−DSPを0.16mg得た。質量分析:16876.50(計算値:16876.58)。精製後のHPLCチャートを図4に示す。
実施例5:PA−0004−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0004−DSPの構造を示す。
PA−0004−DSPは、前記PA−0004の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0004−DSPの構造を示す。
PA−0004−DSPは、前記PA−0004の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0004−DSPの合成
234μmol/LのPA−0004 116μL、10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 44μL、pH8.5のリン酸緩衝液 40μL(最終濃度200mmol/L)を混合し、35℃にて35分間撹拌した。反応液をゲルろ過にて精製(illustra MicroSpin G−25 Columns、GEヘルスケア)した。分取したフラクションのUV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度67.13%のPA−0004−DSPを0.18mg得た。質量分析:16780.19(計算値:16780.59)。精製後のHPLCチャートを図5に示す。
234μmol/LのPA−0004 116μL、10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 44μL、pH8.5のリン酸緩衝液 40μL(最終濃度200mmol/L)を混合し、35℃にて35分間撹拌した。反応液をゲルろ過にて精製(illustra MicroSpin G−25 Columns、GEヘルスケア)した。分取したフラクションのUV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度67.13%のPA−0004−DSPを0.18mg得た。質量分析:16780.19(計算値:16780.59)。精製後のHPLCチャートを図5に示す。
実施例6:PA−0005−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0005−DSPの構造を示す。
PA−0005−DSPは、前記PA−0005の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0005−DSPの構造を示す。
PA−0005−DSPは、前記PA−0005の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0005−DSPの合成
572μmol/LのPA−0005 70μL(40nmol)、注射用蒸留水 137.3μL、pH8.5のリン酸緩衝液 60μL(最終濃度200mmol/L),10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 32.7μLを混合し、35℃にて35分間撹拌した。反応液に10mg/mLのdithiothreitol(以下、DTTとする)溶液 30μLを加え、25℃にて45分間撹拌した。エタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度74.04%のPA−0005−DSPを0.33mg得た。質量分析:16797.10(計算値:16798.56)。精製後のHPLCチャートを図6に示す。
572μmol/LのPA−0005 70μL(40nmol)、注射用蒸留水 137.3μL、pH8.5のリン酸緩衝液 60μL(最終濃度200mmol/L),10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 32.7μLを混合し、35℃にて35分間撹拌した。反応液に10mg/mLのdithiothreitol(以下、DTTとする)溶液 30μLを加え、25℃にて45分間撹拌した。エタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度74.04%のPA−0005−DSPを0.33mg得た。質量分析:16797.10(計算値:16798.56)。精製後のHPLCチャートを図6に示す。
実施例7:PA−0006−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0006−DSPの構造を示す。
PA−0006−DSPは、前記PA−0006の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0006−DSPの構造を示す。
PA−0006−DSPは、前記PA−0006の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0006 40nmolについてPA−0005と同様に反応を行った。エタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度77.59%のPA−0006−DSPを0.36mg得た。質量分析:16815.70(計算値:16816.53)。精製後のHPLCチャートを図7に示す。
実施例8:PA−0007−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0007−DSPの構造を示す。
PA−0007−DSPは、前記PA−0007の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0007−DSPの構造を示す。
PA−0007−DSPは、前記PA−0007の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0007 40nmolについてPA−0005と同様に反応を行った。エタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度75.32%のPA−0007−DSPを0.35mg得た。質量分析:16763.80(計算値:16764.59)。精製後のHPLCチャートを図8に示す。
実施例9:PA−0008−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0008−DSPの構造を示す。
PA−0008−DSPは、前記PA−0008の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0008−DSPの構造を示す。
PA−0008−DSPは、前記PA−0008の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0008−DSPの合成
218μmol/LのPA−0008 137.6μL(30nmol)、注射用蒸留水 16.3μL、pH8.5のリン酸緩衝液 40μL(最終濃度200mmol/L),10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 6.07μLを混合し、35℃にて4時間撹拌した。反応液に10mg/mLのDTT溶液 10μLを加え、25℃にて3時間撹拌した。
エタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させ、ゲルろ過にて精製(illustra MicroSpin G−25 Columns、GEヘルスケア)した。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度75.28%のPA−0008−DSPを0.04mg得た。質量分析:17008.40(計算値:17009.55)。精製後のHPLCチャートを図9に示す。
218μmol/LのPA−0008 137.6μL(30nmol)、注射用蒸留水 16.3μL、pH8.5のリン酸緩衝液 40μL(最終濃度200mmol/L),10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 6.07μLを混合し、35℃にて4時間撹拌した。反応液に10mg/mLのDTT溶液 10μLを加え、25℃にて3時間撹拌した。
エタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させ、ゲルろ過にて精製(illustra MicroSpin G−25 Columns、GEヘルスケア)した。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度75.28%のPA−0008−DSPを0.04mg得た。質量分析:17008.40(計算値:17009.55)。精製後のHPLCチャートを図9に示す。
実施例10:PA−0009−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0009−DSPの構造を示す。
PA−0009−DSPは、前記PA−0009の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0009−DSPの構造を示す。
PA−0009−DSPは、前記PA−0009の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0009 30nmolについてPA−0008と同様に反応、エタノール沈殿、ゲルろ過にて精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度70.17%のPA−0009−DSPを0.04mg得た。質量分析:16966.40(計算値:16967.20)。精製後のHPLCチャートを図10に示す。
実施例11:PA−0010−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0010−DSPの構造を示す。
PA−0010−DSPは、前記PA−0010の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0010−DSPの構造を示す。
PA−0010−DSPは、前記PA−0010の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0010 30nmolについてPA−0008と同様に反応、エタノール沈殿、ゲルろ過にて精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度66.61%のPA−0010−DSPを0.04mg得た。質量分析:16924.10(計算値:16924.85)。精製後のHPLCチャートを図11に示す。
実施例12:PA−0011−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0011−DSPの構造を示す。
PA−0011−DSPは、前記PA−0011の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0011−DSPの構造を示す。
PA−0011−DSPは、前記PA−0011の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0011 30nmolについてPA−0008と同様に反応、エタノール沈殿、ゲルろ過にて精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度66.43%のPA−0011−DSPを0.07mg得た。質量分析:16882.30(計算値:16882.50)。精製後のHPLCチャートを図12に示す。
実施例13:PA−0012−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0012−DSPの構造を示す。
PA−0012−DSPは、前記PA−0012の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0012−DSPの構造を示す。
PA−0012−DSPは、前記PA−0012の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0012 30nmolについてPA−0008と同様に反応、エタノール沈殿、ゲルろ過にて精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度51.99%のPA−0012−DSPを0.04mg得た。質量分析:16738.00(計算値:16738.50)。精製後のHPLCチャートを図13に示す。
実施例14:PA−0013−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0013−DSPの構造を示す。
PA−0013−DSPは、前記PA−0013の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0013−DSPの構造を示す。
PA−0013−DSPは、前記PA−0013の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
394μmol/LのPA−0013 25.4μL(10nmol)、注射用蒸留水 50.5μL、pH8.5のリン酸緩衝液 20μL(最終濃度200mmol/L),10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 4.1μLを混合し、25℃にて5時間撹拌した。反応液をゲルろ過にて精製(illustra MicroSpin G−25 Columns、GEヘルスケア)した。遠心濃縮機にて濃縮後、注射用蒸留水に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度82.57%のPA−0013−DSPを0.14mg得た。質量分析:16981.20(計算値:16981.31)。精製後のHPLCチャートを図14に示す。
実施例15:PA−0014−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0014−DSPの構造を示す。
PA−0014−DSPは、前記PA−0014の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0014−DSPの構造を示す。
PA−0014−DSPは、前記PA−0014の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0014 10nmolについてPA−0013と同様に反応、精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度80.14%のPA−0014−DSPを0.12mg得た。質量分析:17023.30(計算値:17023.67)。精製後のHPLCチャートを図15に示す。
実施例16:PA−0015−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0015−DSPの構造を示す。
PA−0015−DSPは、前記PA−0015の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0015−DSPの構造を示す。
PA−0015−DSPは、前記PA−0015の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0015 10nmolについてPA−0013と同様に反応、精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度76.21%のPA−0015−DSPを0.09mg得た。質量分析:18138.80(計算値:18138.23)。精製後のHPLCチャートを図16に示す。
実施例17:PA−0016−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0016−DSPの構造を示す。
PA−0016−DSPは、前記PA−0016の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0016−DSPの構造を示す。
PA−0016−DSPは、前記PA−0016の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0016 10nmolについてPA−0013と同様に反応を行った。反応液をHPLCにて精製(カラム:XBridge Oligonucleotide BEH C18、2.5μm、10×50mm;流速:4.0mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:60℃;Buffer A:50mmol/L TEAA(pH7.0)、5%CH3CN;Buffer B:50mmol/L TEAA(pH7.0)、50%CH3CN)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションを遠心濃縮機にて濃縮後、注射用蒸留水に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度62.48%のPA−0016−DSPを0.05mg得た。質量分析:18037.40(計算値:18036.32)。精製後のHPLCチャートを図17に示す。
実施例18:PA−0017−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0017−DSPの構造を示す。
PA−0017−DSPは、前記PA−0017の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0017−DSPの構造を示す。
PA−0017−DSPは、前記PA−0017の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
469μmol/LのPA−0017 42.6μL(20nmol)、注射用蒸留水 29.3μL、pH8.5のリン酸緩衝液 20μL(最終濃度200mmol/L),10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 8.1μLを混合し、25℃にて3.5時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製(カラム:Develosil C8−UG−5、5μm、10×50mm;流速:4.0mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:40℃;Buffer A:50mmol/L TEAA(pH7.0)、5%CH3CN;Buffer B:50mmol/L TEAA(pH7.0)、50%CH3CN)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度90.76%のPA−0017−DSPを0.13mg得た。質量分析:16800.50(計算値:16800.53)。精製後のHPLCチャートを図18に示す。
実施例19:PA−0018−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0018−DSPの構造を示す。
PA−0018−DSPは、前記PA−0018の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0018−DSPの構造を示す。
PA−0018−DSPは、前記PA−0018の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0018 20nmolについてPA−0017と同様に反応、精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度92.87%のPA−0018−DSPを0.13mg得た。質量分析:16776.00(計算値:16776.64)。精製後のHPLCチャートを図19に示す。
実施例20:PA−0019−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0019−DSPの構造を示す。
PA−0019−DSPは、前記PA−0019の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0019−DSPの構造を示す。
PA−0019−DSPは、前記PA−0019の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0019 20nmolについてPA−0017と同様に反応、精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度96.37%のPA−0019−DSPを0.15mg得た。質量分析:16779.90(計算値:16780.59)。精製後のHPLCチャートを図20に示す。
実施例21:PA−0020−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0020−DSPの構造を示す。
PA−0020−DSPは、前記PA−0020の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0020−DSPの構造を示す。
PA−0020−DSPは、前記PA−0020の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0020−DSPの合成
PA−0020 20nmolについてPA−0017と同様に反応、精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度98.13%のPA−0020−DSPを0.13mg得た。質量分析:16731.70(計算値:16732.59)。精製後のHPLCチャートを図21に示す。
PA−0020 20nmolについてPA−0017と同様に反応、精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度98.13%のPA−0020−DSPを0.13mg得た。質量分析:16731.70(計算値:16732.59)。精製後のHPLCチャートを図21に示す。
実施例22:PA−0021−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0021−DSPの構造を示す。
PA−0021−DSPは、前記PA−0021の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0021−DSPの構造を示す。
PA−0021−DSPは、前記PA−0021の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0021 20nmolについてPA−0017と同様に反応、精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度91.16%のPA−0021−DSPを0.14mg得た。質量分析:16763.80(計算値:16764.59)。精製後のHPLCチャートを図22に示す。
実施例23:PA−0024−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0024−DSPの構造を示す。
PA−0024−DSPは、前記PA−0024の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0024−DSPの構造を示す。
PA−0024−DSPは、前記PA−0024の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
337μmol/LのPA−0024 149μL(50nmol)、注射用蒸留水 31μL、pH8.5のリン酸緩衝液 50μL(最終濃度200mmol/L)、10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 20μLを混合し、25℃にて1.5時間撹拌した。反応液を陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製(カラム:DNAPacPA200、9×250mm;流速:2.5mL/min;検出:UV260nm;Buffer A:25mmol/L Tris−HCl(pH8.0)、10%CH3CN;Buffer B:25mmol/L Tris−HCl(pH8.0)、10%CH3CN、700mmol/L NaClO4)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度96.89%のPA−0024−DSPを0.35mg得た。質量分析:16897.20(計算値:16896.61)。精製後のHPLCチャートを図23に示す。
実施例24:PA−0025−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0025−DSPの構造を示す。
PA−0025−DSPは、前記PA−0025の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0025−DSPの構造を示す。
PA−0025−DSPは、前記PA−0025の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0025 50nmolについてPA−0024と同様に反応、精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度93.33%のPA−0025−DSPを0.39mg得た。質量分析:16745.20(計算値:16744.64)。精製後のHPLCチャートを図24に示す。
実施例25:PA−0026−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0026−DSPの構造を示す。
PA−0026−DSPは、前記PA−0026の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0026−DSPの構造を示す。
PA−0026−DSPは、前記PA−0026の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0026 50nmolについて、反応時間を30分間としてPA−0024と同様に反応、精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度95.86%のPA−0026−DSPを0.33mg得た。質量分析:16911.20(計算値:16910.73)。精製後のHPLCチャートを図25に示す。
実施例26:PA−0027−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0027−DSPの構造を示す。
PA−0027−DSPは、前記PA−0027の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0027−DSPの構造を示す。
PA−0027−DSPは、前記PA−0027の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0027 50nmolについて、反応時間を40分間としてPA−0024と同様に反応、精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度92.83%のPA−0027−DSPを0.39mg得た。質量分析:16761.10(計算値:16760.64)。精製後のHPLCチャートを図26に示す。
実施例27:PA−0028−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0028−DSPの構造を示す。
PA−0028−DSPは、前記PA−0028の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0028−DSPの構造を示す。
PA−0028−DSPは、前記PA−0028の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
未精製物として343μmol/LのPA−0028 583μL(未精製物として200nmol)、注射用蒸留水 136μL、pH8.5のリン酸緩衝液 200μL(最終濃度200mmol/L)、10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 81μLを混合し、25℃にて1時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製(カラム:XBridge Oligonucleotide BEH C18、2.5μm、10×50mm;流速:4.0mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:60℃;Buffer A:50mmol/L TEAA(pH7.0)、5%CH3CN;Buffer B:50mmol/L TEAA(pH7.0)、50%CH3CN)した。分取したフラクションをさらに陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製(カラム:DNAPacPA200、9×250mm;流速:2.5mL/min;検出:UV260nm;Buffer A:25mmol/L Tris−HCl(pH8.0)、10%CH3CN;Buffer B:25mmol/L Tris−HCl(pH8.0)、10%CH3CN、700mmol/L NaClO4)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度86.04%のPA−0028−DSPを0.22mg得た。質量分析:16907.40(計算値:16907.64)。精製後のHPLCチャートを図27に示す。
実施例28:PA−0029−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0029−DSPの構造を示す。
PA−0029−DSPは、前記PA−0029の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0029−DSPの構造を示す。
PA−0029−DSPは、前記PA−0029の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0029 200nmol(未精製物として)についてPA−0028と同様に反応、精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度86.88%のPA−0029−DSPを0.10mg得た。質量分析:16922.10(計算値:16921.76)。精製後のHPLCチャートを図28に示す。
実施例29:PA−0030−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0030−DSPの構造を示す。
PA−0030−DSPは、前記PA−0030の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0030−DSPの構造を示す。
PA−0030−DSPは、前記PA−0030の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0030 200nmol(未精製物として)についてPA−0028と同様に反応、精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度88.77%のPA−0030−DSPを0.11mg得た。質量分析:16929.10(計算値:16929.28)。精製後のHPLCチャートを図29に示す。
実施例30:GA−0001−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるGA−0001−DSPの構造を示す。
GA−0001−DSPは、前記GA−0001の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるGA−0001−DSPの構造を示す。
GA−0001−DSPは、前記GA−0001の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
GA−0001 50nmolについて、反応時間を1時間としてPA−0024と同様に反応、精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度90.89%のGA−0001−DSPを0.42mg得た。質量分析:16843.40(計算値:16842.43)。精製後のHPLCチャートを図30に示す。
実施例31:KA−0001−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるKA−0001−DSPの構造を示す。
KA−0001−DSPは、前記KA−0001の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるKA−0001−DSPの構造を示す。
KA−0001−DSPは、前記KA−0001の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
608μmol/LのKA−0001 132μL(80nmol)、注射用蒸留水 139μL、pH8.5のリン酸緩衝液 80μL(最終濃度200mmol/L)、1mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 49μLを混合し、25℃にて1時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製(カラム:Develosil C8−UG−5、5μm、10×50mm;流速:4.0mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:40℃;Buffer A:50mmol/L TEAA(pH7.0)、5%CH3CN;Buffer B:50mmol/L TEAA(pH7.0)、50%CH3CN)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度94.90%のKA−0001−DSPを0.24mg得た。質量分析:16914.00(計算値:16913.55)。精製後のHPLCチャートを図31に示す。
実施例32:PA−0031−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0031−DSPの構造を示す。
PA−0031−DSPは、前記PA−0031の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0031−DSPの構造を示す。
PA−0031−DSPは、前記PA−0031の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
未精製物として812μmol/LのPA−0031 369μL(未精製物として300nmol)、注射用蒸留水 50μL、pH8.5のリン酸緩衝液 120μL(最終濃度200mmol/L)、10mg/mLのDSP−ONSu/DMF溶液 61μLを混合し、25℃にて1時間撹拌した。反応液をエタノール沈殿し、陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製(カラム:DNAPacPA100、9×250mm;流速:2.5mL/min;検出:UV260nm;Buffer A:25mmol/L Tris−HCl(pH8.0)、10%CH3CN;Buffer B:25mmol/L Tris−HCl(pH8.0)、10%CH3CN、700mmol/L NaClO4)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度60.06%のPA−0031−DSPを0.41mg得た。質量分析:18008.80(計算値:18008.27)。精製後のHPLCチャートを図32に示す。
実施例33:PA−0032−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0032−DSPの構造を示す。
PA−0032−DSPは、前記PA−0032の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0032−DSPの構造を示す。
PA−0032−DSPは、前記PA−0032の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0032 300nmol(未精製物として)についてPA−0031と同様に反応、精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度69.74%のPA−0032−DSPを0.43mg得た。質量分析:18153.80(計算値:18153.24)。精製後のHPLCチャートを図33に示す。
実施例34:PA−0033−DSPの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0033−DSPの構造を示す。
PA−0033−DSPは、前記PA−0033の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
以下に本発明の環状型核酸分子であるPA−0033−DSPの構造を示す。
PA−0033−DSPは、前記PA−0033の5’末端および3’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するDSP−ONSuを結合させた環状型核酸分子である。
PA−0033 300nmol(未精製物として)についてPA−0031と同様に反応、精製を行った。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度57.27%のPA−0033−DSPを0.48mg得た。質量分析:18037.80(計算値:18037.31)。精製後のHPLCチャートを図34に示す。
試験例1(血清中安定性評価実験法)
前記各核酸分子を注射用蒸留水(大塚製薬)で希釈し、HUMAN SERUM STERILE(MP Biomedicals)を添加して任意の時間反応させた。具体的には、1.5mLマイクロチューブを用いた反応液中で前記核酸分子の最終濃度は2.5μmol/L、HUMAN SERUM STERILEの最終濃度を50%とした。
反応後の溶液をTE飽和フェノール(ナカライテスク)で処理し、タンパク質除去を行った。水層を回収し、エタノール沈澱を行って血清処理済み核酸分子を回収した。前記血清処理済み核酸分子を注射用蒸留水に溶解し、レーンあたり5pmolを15%ポリアクリルアミドゲル(バイオクラフト)にて電気泳動した。
参考例1では処理前のバンドが2分以内に消失した。これを基準にTGF−β1発現抑制配列を搭載した各核酸分子の血清中安定性を評価した。結果を図35〜図41に示す。参考例2では処理前のバンドが30分以内に消失した。これを基準にGAPDH発現抑制配列を搭載した各核酸分子の血清中安定性を評価した。結果を図42に示す。参考例3では処理前のバンドが2分以内に消失した。これを基準にmiR-29bガイド鎖配列を搭載した各核酸分子の血清中安定性を評価した。結果を図43に示す。各図に示すように、本発明の核酸分子は血清中の安定性が高いことがわかった。
前記各核酸分子を注射用蒸留水(大塚製薬)で希釈し、HUMAN SERUM STERILE(MP Biomedicals)を添加して任意の時間反応させた。具体的には、1.5mLマイクロチューブを用いた反応液中で前記核酸分子の最終濃度は2.5μmol/L、HUMAN SERUM STERILEの最終濃度を50%とした。
反応後の溶液をTE飽和フェノール(ナカライテスク)で処理し、タンパク質除去を行った。水層を回収し、エタノール沈澱を行って血清処理済み核酸分子を回収した。前記血清処理済み核酸分子を注射用蒸留水に溶解し、レーンあたり5pmolを15%ポリアクリルアミドゲル(バイオクラフト)にて電気泳動した。
参考例1では処理前のバンドが2分以内に消失した。これを基準にTGF−β1発現抑制配列を搭載した各核酸分子の血清中安定性を評価した。結果を図35〜図41に示す。参考例2では処理前のバンドが30分以内に消失した。これを基準にGAPDH発現抑制配列を搭載した各核酸分子の血清中安定性を評価した。結果を図42に示す。参考例3では処理前のバンドが2分以内に消失した。これを基準にmiR-29bガイド鎖配列を搭載した各核酸分子の血清中安定性を評価した。結果を図43に示す。各図に示すように、本発明の核酸分子は血清中の安定性が高いことがわかった。
試験例2(遺伝子発現抑制活性測定法)
細胞は、A549細胞(DSファーマバイオメディカル)を使用した。培地は、10%FBSを含むDMEM(Invitrogen)を使用した。培養条件は、37℃、5%CO2下とした。
まず、細胞を培地中で培養し、その細胞懸濁液を24穴プレートに400μLずつ、4×104細胞/ウェルとなるように分注した。さらに、前記ウェル中の細胞に、前記核酸分子をトランスフェクション試薬RNAiMAX(Invitrogen)を用いて、添付のプロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定しトランスフェクションを行った。下記組成において、(B)は、Opti−MEM(Invitrogen)、(C)は、核酸分子溶液であり、両者をあわせて98.5μL添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記核酸分子の終濃度は1nmol/L、あるいは1、10nmol/Lとした。
細胞は、A549細胞(DSファーマバイオメディカル)を使用した。培地は、10%FBSを含むDMEM(Invitrogen)を使用した。培養条件は、37℃、5%CO2下とした。
まず、細胞を培地中で培養し、その細胞懸濁液を24穴プレートに400μLずつ、4×104細胞/ウェルとなるように分注した。さらに、前記ウェル中の細胞に、前記核酸分子をトランスフェクション試薬RNAiMAX(Invitrogen)を用いて、添付のプロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定しトランスフェクションを行った。下記組成において、(B)は、Opti−MEM(Invitrogen)、(C)は、核酸分子溶液であり、両者をあわせて98.5μL添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記核酸分子の終濃度は1nmol/L、あるいは1、10nmol/Lとした。
トランスフェクション後24時間培養した後、NucleoSpin RNA Plus(タカラバイオ)を用い、添付のプロトコールに従って、RNAを回収した。次に、逆転写酵素(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、Roche)を用い、添付のプロトコールに従って、前記RNAからcDNAを合成した。そして、以下に示すように、合成した前記cDNAを鋳型としてPCRを行い、TGF−β1遺伝子、GAPDH遺伝子、COL1A1遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記TGF−β1遺伝子、GAPDH遺伝子およびCOL1A1遺伝子の発現量は、β−アクチン遺伝子の発現量により補正した。
前記PCRは、試薬としてLightCycler480 SYBR Green I Master(Roche)、機器としてLight Cycler480 Instrument II(Roche)を用いた。TGF−β1遺伝子、COL1A1遺伝子、β−アクチン遺伝子、およびGAPDH遺伝子の増幅には、それぞれ、以下のプライマーセットを使用した。
TGF−β1遺伝子用PCRプライマーセット
5’-ttgtgcggcagtggttgagccg-3’ (配列番号45)
5’-gaagcaggaaaggccggttcatgc-3’ (配列番号46)
COL1A1遺伝子用PCRプライマーセット
5’- cccaaggacaagaggcatgt-3’ (配列番号47)
5’- ccgccatactcgaactggaa-3’ (配列番号48)
β−アクチン遺伝子用プライマーセット
5’-gccacggctgcttccagctcctc-3’ (配列番号49)
5’-aggtctttgcggatgtccacgtcac-3’ (配列番号50)
GAPDH遺伝子用PCRプライマーセット
5’- atggggaaggtgaaggtcg-3’ (配列番号51)
5’- gggtcattgatggcaacaatatc-3’ (配列番号52)
TGF−β1遺伝子用PCRプライマーセット
5’-ttgtgcggcagtggttgagccg-3’ (配列番号45)
5’-gaagcaggaaaggccggttcatgc-3’ (配列番号46)
COL1A1遺伝子用PCRプライマーセット
5’- cccaaggacaagaggcatgt-3’ (配列番号47)
5’- ccgccatactcgaactggaa-3’ (配列番号48)
β−アクチン遺伝子用プライマーセット
5’-gccacggctgcttccagctcctc-3’ (配列番号49)
5’-aggtctttgcggatgtccacgtcac-3’ (配列番号50)
GAPDH遺伝子用PCRプライマーセット
5’- atggggaaggtgaaggtcg-3’ (配列番号51)
5’- gggtcattgatggcaacaatatc-3’ (配列番号52)
また、コントロールとして、トランスフェクションにおいて、前記RNA溶液を未添加とし、前記トランスフェクション試薬1.5μLと前記(B)とを合計100μL添加した以外は、同様にして処理した細胞についても、遺伝子発現量を測定した(mock)。
補正後のTGF−β1遺伝子、COL1A1遺伝子およびGAPDH遺伝子の発現量について、コントロール(mock)の細胞における発現量を1として、各核酸分子を導入した細胞での発現量の相対値を求めた。
これらの結果を図44(TGF−β1遺伝子)、45(COL1A1遺伝子)及び46(GAPDH遺伝子)に示す。縦軸は相対遺伝子発現量である。各図に示すように、本発明の核酸分子は強い遺伝子発現抑制活性を示すことがわかった。
試験例3(マウス生体(血中)における安定性)
(実験方法)
各被験物質に生理食塩水を添加後、ボルテックスミキサーで攪拌して復水し、1mg/mL核酸溶液を調製した。復水後、0.2 μmフィルターを用いて濾過し、投与液とした。雄マウス(C57BL/6Jcl、8週齢、日本クレア製)の尾静脈内に5mg核酸/5mL/kgの投与量で投与した。投与後0時間後に採血する群、0.5時間後に採血する群、1時間後に採血する群、3時間後に採血する群、6時間後に採血する群に分け、1群当たり3匹のマウスを用いた。投与後0、0.5、1、3、6時間後にマウスをイソフルラン吸入麻酔下で心臓よりEDTA処理した注射筒を用いて血液を採取して脱血死させた。血液1容量に対してTrizol LS Reagent(Ambion社製)3容量を添加してボルテックスミキサーで攪拌した後、試薬説明書に従って全RNAを抽出した。
RNA溶液にNuclease P1(Sigma Aldrich社製)を添加し、60℃で2時間加温した。その後、10×Alkaline Phosphatase Bufferを規定量加えて攪拌後、Alkaline Phosphatase(Promega社製)を添加して56℃で2時間加温した。放冷後、生成したDimerの量を高速液体クロマトグラフ−質量分析計で定量した
結果を図47に示す。PH−0009は0.5時間で全く検出できなかったが,本発明のPA−0004−DSP及びPA−0007−DSPは0.5時間で検出された。すなわち,既知の一本鎖核酸分子に比べ,本発明の核酸分子は血液中において安定であることが示された。
(実験方法)
各被験物質に生理食塩水を添加後、ボルテックスミキサーで攪拌して復水し、1mg/mL核酸溶液を調製した。復水後、0.2 μmフィルターを用いて濾過し、投与液とした。雄マウス(C57BL/6Jcl、8週齢、日本クレア製)の尾静脈内に5mg核酸/5mL/kgの投与量で投与した。投与後0時間後に採血する群、0.5時間後に採血する群、1時間後に採血する群、3時間後に採血する群、6時間後に採血する群に分け、1群当たり3匹のマウスを用いた。投与後0、0.5、1、3、6時間後にマウスをイソフルラン吸入麻酔下で心臓よりEDTA処理した注射筒を用いて血液を採取して脱血死させた。血液1容量に対してTrizol LS Reagent(Ambion社製)3容量を添加してボルテックスミキサーで攪拌した後、試薬説明書に従って全RNAを抽出した。
RNA溶液にNuclease P1(Sigma Aldrich社製)を添加し、60℃で2時間加温した。その後、10×Alkaline Phosphatase Bufferを規定量加えて攪拌後、Alkaline Phosphatase(Promega社製)を添加して56℃で2時間加温した。放冷後、生成したDimerの量を高速液体クロマトグラフ−質量分析計で定量した
結果を図47に示す。PH−0009は0.5時間で全く検出できなかったが,本発明のPA−0004−DSP及びPA−0007−DSPは0.5時間で検出された。すなわち,既知の一本鎖核酸分子に比べ,本発明の核酸分子は血液中において安定であることが示された。
安定性及び遺伝子発現抑制効果の両面から、特にPA-0004-DSP、PA-0018-DSP及びPA-0025-DSPが優れていることがわかった。
以上の結果より、遺伝子発現制御機能を有する一本鎖核酸分子(好ましくは5’末端と3’末端を平滑末端化する)をジスルフィド結合により環状にすることで、インビトロにおける発現抑制効果を損ねることなく、二本鎖RNA(siRNA)に比べヒト血清中での安定性を大幅に向上させることが示された。
以上の結果より、遺伝子発現制御機能を有する一本鎖核酸分子(好ましくは5’末端と3’末端を平滑末端化する)をジスルフィド結合により環状にすることで、インビトロにおける発現抑制効果を損ねることなく、二本鎖RNA(siRNA)に比べヒト血清中での安定性を大幅に向上させることが示された。
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
本発明の環状型核酸分子によれば、容易に低コストで合成でき、且つ、前記遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制が可能である。本発明の環状型核酸分子は、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農学、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
本出願は、日本で出願された特願2017−070695(出願日:2017年3月31日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
配列番号1:発現抑制配列
配列番号2:発現抑制配列の相補配列
配列番号3:発現抑制配列
配列番号4:発現抑制配列の相補配列
配列番号5:一本鎖核酸分子_PA-0001
配列番号6:一本鎖核酸分子_PA-0002
配列番号7:一本鎖核酸分子_PA-0003
配列番号8:一本鎖核酸分子_PA-0004
配列番号9:一本鎖核酸分子_PA-0005
配列番号10:一本鎖核酸分子_PA-0006
配列番号11:一本鎖核酸分子_PA-0007
配列番号12:一本鎖核酸分子_PA-0008
配列番号13:一本鎖核酸分子_PA-0009
配列番号14:一本鎖核酸分子_PA-0010
配列番号15:一本鎖核酸分子_PA-0011
配列番号16:一本鎖核酸分子_PA-0012
配列番号17:一本鎖核酸分子_PA-0013
配列番号18:一本鎖核酸分子_PA-0014
配列番号19:一本鎖核酸分子_PA-0015
配列番号20:一本鎖核酸分子_PA-0016
配列番号21:一本鎖核酸分子_PA-0017
配列番号22:一本鎖核酸分子_PA-0018
配列番号23:一本鎖核酸分子_PA-0019
配列番号24:一本鎖核酸分子_PA-0020
配列番号25:一本鎖核酸分子_PA-0021
配列番号26:一本鎖核酸分子_PA-0024
配列番号27:一本鎖核酸分子_PA-0025
配列番号28:一本鎖核酸分子_PA-0026
配列番号29:一本鎖核酸分子_PA-0027
配列番号30:一本鎖核酸分子_PA-0028
配列番号31:一本鎖核酸分子_PA-0029
配列番号32:一本鎖核酸分子_PA-0030
配列番号33:一本鎖核酸分子_GA-0001
配列番号34:一本鎖核酸分子_KA-0001
配列番号35:一本鎖核酸分子_PA-0031
配列番号36:一本鎖核酸分子_PA-0032
配列番号37:一本鎖核酸分子_PA-0033
配列番号38:siRNA_NI-0053(センス鎖)
配列番号39:siRNA_NI-0053(アンチセンス鎖)
配列番号40:siRNA_NI-0011(センス鎖)
配列番号41:siRNA_NI-0011(アンチセンス鎖)
配列番号42:siRNA_NI-0211(センス鎖)
配列番号43:siRNA_NI-0211(アンチセンス鎖)
配列番号44:一本鎖核酸分子_PH-0009
配列番号45:TGF-β1プライマー
配列番号46:TGF-β1プライマー
配列番号47:COL1A1プライマー
配列番号48:COL1A1プライマー
配列番号49:βアクチンプライマー
配列番号50:βアクチンプライマー
配列番号51:GAPDHプライマー
配列番号52:GAPDHプライマー
配列番号2:発現抑制配列の相補配列
配列番号3:発現抑制配列
配列番号4:発現抑制配列の相補配列
配列番号5:一本鎖核酸分子_PA-0001
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配列番号45:TGF-β1プライマー
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配列番号49:βアクチンプライマー
配列番号50:βアクチンプライマー
配列番号51:GAPDHプライマー
配列番号52:GAPDHプライマー
Claims (12)
- 下式(A):
R1、R2、R1’およびR2’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはヒドロキシであり;
R3、R4、R3’およびR4’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはヒドロキシであり;
X1およびX2は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
Z1〜Z4は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
W1〜W6は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり;
QおよびTは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖であり(一方がガイド鎖の場合、他方はパッセンジャー鎖である);
Lは、リンカーであり;
mおよびm’は、それぞれ独立して、1〜12の整数であり;
nおよびn’は、それぞれ独立して、1〜10の整数であり;
x1およびx2は、それぞれ独立して、0または1であり;
y1およびy2は、それぞれ独立して、0または1であり;
z1〜z4は、それぞれ独立して、0、1または2であり;および
w1〜w6は、それぞれ独立して、0、1または2である]
で表される環状型核酸分子。 - X1、X2、Y1、Y2、Z1〜Z4およびW1〜W6が、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である請求項1記載の核酸分子。
- リンカーが、下式:
- X1、X2、Y1、Y2、Z1〜Z4およびW1〜W6のうち、すくなくとも1つが、それぞれ独立してメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸分子。
- X1、X2、Y1、Y2、Z1〜Z4およびW1〜W6のうち、すくなくとも5つが、それぞれ独立してメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸分子。
- ガイド鎖及びパッセンジャー鎖、並びにリンカーを含むポリヌクレオチド鎖が、その一部において二本鎖構造を形成した際に、その両端が平滑末端である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、標的遺伝子発現抑制用組成物。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
- 標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸分子を使用することを特徴とする、発現抑制方法。 - 前記核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項9記載の発現抑制方法。
- 前記核酸分子を、in vivoまたはin vitroで投与する、請求項9または10記載の発現抑制方法。
- 前記核酸分子を、非ヒト動物に投与する、請求項9または10記載の発現抑制方法。
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