JP2012533587A - 自然に存在する細胞内輸送経路を介して化合物を送達するための送達システム及びコンジュゲート - Google Patents

自然に存在する細胞内輸送経路を介して化合物を送達するための送達システム及びコンジュゲート Download PDF

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Abstract

本発明は、特に生物学的に活性のある巨大分子、核酸又はペプチド等の化合物の細胞への送達を容易にするコンジュゲートを含む送達システムに関する。本発明は、化合物、例えば生物学的に活性のある巨大分子、核酸又はペプチドを細胞に送達するための上記コンジュゲートにも関する。本発明は更に、上記コンジュゲートを含む医薬組成物及びその使用に関する。本発明は、細胞又は生物、好ましくは患者に化合物を送達する方法にも関する。コンジュゲートは、（ａ）細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にする少なくとも１つのモジュールと、（ｂ）小胞体（ＥＲ）への輸送を容易にする少なくとも１つのモジュールと、（ｃ）ＥＲからサイトゾルへの転位を媒介する少なくとも１つのモジュールと、（ｄ）送達対象の少なくとも１つの化合物とを含み、モジュール（ａ）〜モジュール（ｃ）及び化合物（ｄ）が任意の配置で互いに結合する。
【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、特に生物学的に活性のある巨大分子、核酸又はペプチド等の化合物の細胞への送達を容易にするコンジュゲートを含む送達システムに関する。本発明は、化合物、例えば生物学的に活性のある巨大分子、核酸又はペプチドを細胞に送達するための上記コンジュゲートにも関する。本発明は更に、上記コンジュゲートを含む医薬組成物及びその使用に関する。本発明は、細胞又は生物、例えば患者に化合物を送達する方法にも関する。
分子レベルで疾患状態に対処しようとする新規の治療法が開発中である。これらの新規の治療用化合物のうちの多くの実用化における主な課題は、該化合物が細胞膜を容易には通過せず、そのためその作用部位があると考えられる細胞内のコンパートメントに到達することができないことである。
ほとんどの大型分子が動物細胞の原形質膜を効率的に通過することができないことから、ほとんどの場合細胞表面上の相互作用により細胞の外側で起こる作用メカニズムを伴う動物細胞に対する調査目的及び治療目的でのこれらの大型分子の適用が通常制限されている。しかしながら、目的の生物学的効果を得るためには、或る特定のタイプの生物学的に活性のある巨大分子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ誘導性の核酸二本鎖、及びプラスミド等のより長い核酸が、サイトゾル又は核等の細胞内コンパートメント内に存在しなければならない。残念なことに、細胞膜の疎水性環境の通過に関してこのような分子が通常有する高い正味電荷によって起こる問題に加えて、これらの分子の外形寸法は、単独で（unassisted：支援なしで）これらの膜に容易に拡散することができる寸法の上限（一般的におよそ５００Ｄａと推測される）を大きく上回る。このため、調査用途及び治療用途の両方に関するこれらの分子の有用性は、それらの目的の活性部位での効率的な蓄積を容易にするように設計された送達技術の使用に強く依存する。
培養細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの適用には、この送達プロセスが、無傷で成長培地を通る巨大分子の移送も含むことが要求され、生きている動物におけるｉｎ ｖｉｖｏでの適用では多くの場合、より困難な経路を強いられる。この経路は身体への導入から始まり、様々な体液、組織及び構造（そのいずれかが重大な化学障壁又は物理障壁を示し得る）の通過が続き、結果として標的細胞に侵入し、目的の作用部位に到達することで終了する。ｉｎ ｖｉｖｏでは、このプロセスは、標的細胞への有用な量の該分子の取り込みを可能にするのに十分長い間、身体からの排出を避ける又は少なくとも遅らせる必要があることも示唆している。全ての文脈において、送達の解決策は、導入される分子、又は途中にある組織、体液、構造及び細胞のいずれに対する不要な変更も最小限に抑えなければならない。例えば、多くの脂質ベースのナノ粒子及びリポソーム製剤は、その制限された生体分布（主に肝臓に蓄積する）及びその細胞毒性効果を引き起こす固有のリスクにより適用性が大きく限定される（非特許文献１）。
また場合によっては、望ましくない二次的影響のリスクを最小限に抑えることが、途中での送達される巨大分子と意図されない結合パートナーとの不要な相互作用を避けることを意図する場合もある。この例には、或る特定の核酸構築物により意図せず誘発する可能性がある非特異的な免疫刺激が含まれる。送達技術によっては、通過中は巨大分子を物理的に遮断又は封入し、適切な時間／位置で該巨大分子を放出又は活性化させるだけで、この課題を解決するのに役立つものもあれば（例えば特許文献１を参照されたい）、この機能がなく、分子自体をこの問題点に対処するように最適化させることに依るものもある。ｓｉＲＮＡ及び他のＲＮＡｉ誘導性の作用物質の場合、より高い免疫刺激のリスクを有することが知られている配列モチーフを避けること、及び核酸骨格に対する化学的変化の両方により、実際に該分子の最適化が可能になり、これにより標的化機構（例えばＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））により最大限の活性を保持しながら、意図されない経路（例えばＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ベースの免疫応答）ではこのような分子は機能の乏しい（poor）基質となる。
最終的に、送達ビヒクル（vehicle）がその送達物（cargo）を標的細胞の表面へと運ぶことに成功すると、上述のように、大きく、かつ／又は高電荷の巨大分子が通常単独では通過することのできない、全ての送達経路に共通の最も厄介な障壁の１つ、すなわち標的細胞の原形質膜に更に直面する。一部の送達技術は、エンドサイトーシス、ピノサイトーシス又はファゴサイトーシス等の自然の内部移行プロセスにより、細胞取り込みを誘起することでこれに対処しようと試みているが、サイトゾルへの接近には依然として、結果として生じるエンドサイトーシス小胞、ピノサイトーシス小胞又はファゴサイトーシス小胞内から同様の膜を通過する必要があるため、このような現在利用可能な解決策は全て、課題を実際に解決することなく、先延ばししているにすぎない。実際、この極めて重要な生体膜の通過の成功が、該通過が細胞表面上で起こるか又はこのような細胞内小胞内から起こるかにかかわらず、これまでに試験されたほぼ全ての送達技術の特に困難な律速段階であることが証明されている。
この課題に対処する一般的なアプローチの１つは、ほぼ全ての細胞がエンドサイトーシス起源、ピノサイトーシス起源又はファゴサイトーシス起源の多くの新たに内部移行した小胞（通常これらはリソソーム運命（lysosomal fate）に分類される）内で自然に駆動する酸性化プロセスを利用している。このためこれらの送達技術は、適切な酸性条件下で、望ましくは送達される分子がリソソーム内で損傷を受ける前に、これらの小胞膜の不安定化又は透過化を「強いる」ｐＨ依存性の能力を有する様々な分子を組み合わせている。「エンドソーム分解（endosomolytic）活性」と称されることもある、この形態のエンドソーム脱出（endosomalescape）は近年幾つかの異なる戦略で実現されている（リポソーム及びいわゆる安定した核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）内への融合脂質の封入を含む、特許文献２で述べられている）。別の例は、巨大分子又はウイルス全体のような更に大きい送達物の細胞膜を通る移送（エンドソームの酸性化（acidication）により活性化されることが知られているものを含む）を媒介するように自然に進化した様々なタンパク質に由来する、いわゆるペプチド形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を利用する（特許文献３）。第３の顕著な例は、エンドソーム分解活性が酸に不安定なマレアメート（maleamate）結合により結合したＰＥＧ基により可逆的に遮断された両親媒性のポリ（ビニルエーテル）であるＰＢＡＶＥの使用である（非特許文献２及び特許文献４）。しかしながら、これまでにこのような技術と共に言及された変動的な成功にもかからわず、これらの「強制的なエンドソーム脱出」プロセスは、これらの解決策の全てではないがほとんどで依然として重要な律速段階であり、このことはこれらのアプローチが未だ最適にはこの課題に対処していないことを示している。
最後に、送達の解決策の設計における重要であるが、見過ごされることの多い問題点は、そのミッションが完了した際に送達ビヒクル又は構築物で起こることについての問題である。これらの送達分子が代謝されないために標的細胞内に蓄積する可能性が、特に反復又は持続的な長期治療に関するこれらの分子の設計に対する更なる要件を課す。とりわけ、送達ビヒクル又は構築物内で使用される構成要素はこれに関していかなる有害な効果をも引き起こさないものでなければならない。結果として、標的細胞によって容易にかつ安全に代謝されることが知られている送達分子は好ましい解決策を提示し、長期的な効果が十分に特徴付けられてはいない人工の非生分解性の化学物質又は分子を利用するものは高いリスクを示す。
国際公開第２００９／０４５４５７号 米国特許出願公開第２００８／０２００６６１号 米国特許出願公開第２００６／０２２２６５７号 米国特許出願公開第２００７／００３６８６５号
Behlke, MA (2006). MolTher, 13:644-670. Rozema, D. B., D. L.Lewis, et al. (2007). Proc Natl Acad Sci U S A 104(32): 12982-7.
このため、特に生物学的に活性のある巨大分子、核酸又はペプチド等の化合物を生きている細胞へと効率的に送達することができる送達システムに対する緊急の必要性がある。細胞内でいかなる有害な副作用をも引き起こさない送達システムに対しても緊急の必要性がある。標的細胞により容易にかつ安全に代謝される構成要素を利用する送達システムも強く望まれている。
本発明は、特に生物学的に活性のある巨大分子、核酸又はペプチド等の化合物の、対象となる生きている細胞、好ましくは対象となる上記の生きている細胞のサイトゾル又は核への送達を容易にするコンジュゲートを含む送達システムに関する。本発明の送達システム及びコンジュゲートは、初期の細胞の標的化及び内部移行、続く膜コンパートメントを通る小胞体（ＥＲ）への逆行性の（retrograde）輸送及びＥＲからサイトゾルへのＥＲ関連分解（ＥＲＡＤ）経路を介した逆行転位（retro-translocation）のために完全な自然経路を利用する（harnessand/or exploit）ように設計される。本発明の送達システム及びコンジュゲートは、サイトゾルに到達すると、化合物をサイトゾルへと送達するか、又は続いて化合物を核へと送達することができる。
このため本発明は、全ての細胞内で遍在的に発生する内因性プロセスを用いることにより、特に生物学的に活性のある巨大分子、核酸又はペプチド等の化合物を標的となるサイトゾル又は核へと効果的に送達することができる送達システム及びコンジュゲートを提供する。本発明のコンジュゲートは、完全に自然のものであり、かつ進化的に最適化させたこれらの内因性プロセスの利点を最大限利用しており、このため該送達システム及び該コンジュゲートは高い効率、低い毒性及び広範な用途で化合物を標的細胞へと送達することができる。本発明により提供される送達システム及びコンジュゲートは、調査目的、治療目的及び診断目的で生物学的に活性のある化合物を培養細胞及び生きている生物の両方へと効果的に送達することを可能にする。本発明により提供されるコンジュゲートは、分解されるため標的細胞内で蓄積しないように設計される。このため、本発明の送達システム及びコンジュゲートは少なくとも、当該技術分野におけるサイトゾル送達問題に対する解決策と、標的細胞における代謝されない又は非分解性の送達ビヒクル／構築物の蓄積に起因する当該技術分野における毒性問題に対する解決策とを提供する。
第１の態様では、本発明は、少なくとも１つのコンジュゲートを含むか又はそれからなる、細胞に化合物を送達するための送達システムであって、該コンジュゲートが、
（ａ）細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にする少なくとも１つのモジュール（ａ）と、
（ｂ）小胞体（ＥＲ）への輸送を容易にする少なくとも１つのモジュール（ｂ）と、
（ｃ）ＥＲからサイトゾルへの転位を媒介する少なくとも１つのモジュール（ｃ）と、
（ｄ）少なくとも１つの化合物（ｄ）と、
を含むか、それらから本質的になるか又はそれらからなり、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）が任意の配置で互いに結合する、細胞に化合物を送達するための送達システムに関する。本発明の送達システムは任意に、核局在化シグナルを含む。
第２の態様では、本発明は、細胞に化合物を送達するためのコンジュゲートであって、
（ａ）細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にする少なくとも１つのモジュール（ａ）と、
（ｂ）ＥＲへの輸送を容易にする少なくとも１つのモジュール（ｂ）と、
（ｃ）ＥＲからサイトゾルへの転位を媒介する少なくとも１つのモジュール（ｃ）と、
（ｄ）少なくとも１つの化合物（ｄ）と、
を含むか、それらから本質的になるか又はそれらからなり、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）が任意の配置で互いに結合する、細胞に化合物を送達するためのコンジュゲートに関する。本発明のコンジュゲートは任意に、核局在化シグナルを含む。
第３の態様では、本発明は、本発明の送達システム又はコンジュゲートを調製する方法に関する。
第４の態様では、本発明は、医薬品としての本発明の送達システム又はコンジュゲートの使用に関する。
第５の態様では、本発明は、本発明の送達システム又はコンジュゲートと、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、及び／又は希釈剤とを含む医薬組成物に関する。
第６の態様では、本発明は、診断用試薬としての本発明の送達システム又はコンジュゲートの使用に関する。
第７の態様では、本発明は、薬剤の製造のための本発明の送達システム又はコンジュゲートの使用に関する。
第８の態様では、本発明は、本発明の送達システム又はコンジュゲートを使用して、化合物（ｄ）を細胞へと送達する方法に関する。
第９の態様では、本発明は、本発明の送達システム又はコンジュゲートを使用して、化合物（ｄ）を生物へと送達する方法に関する。
第１０の態様では、本発明は、本発明の送達システム又はコンジュゲートを使用して、化合物（ｄ）を患者へと送達する方法に関する。
本発明のコンジュゲートの好ましい実施形態を含む図である。モジュール同士、又はモジュールと化合物とを、共有結合的に、非共有結合的に、アダプタ分子を介して、又はアダプタ分子を最適には含むリンカー分子を介して互いに結合することができる。 本発明のコンジュゲートの好ましい実施形態を含む図である。モジュール同士、又はモジュールと化合物とを、共有結合的に、非共有結合的に、アダプタ分子を介して、又はアダプタ分子を最適には含むリンカー分子を介して互いに結合することができる。 本発明のコンジュゲートの好ましい実施形態を含む図である。モジュール同士、又はモジュールと化合物とを、共有結合的に、非共有結合的に、アダプタ分子を介して、又はアダプタ分子を最適には含むリンカー分子を介して互いに結合することができる。 本発明のコンジュゲートの好ましい実施形態を含む図である。モジュール同士、又はモジュールと化合物とを、共有結合的に、非共有結合的に、アダプタ分子を介して、又はアダプタ分子を最適には含むリンカー分子を介して互いに結合することができる。 実施例１に記載のコンジュゲートＲ−ＡＫ−ＣＸの詳細な図である。図２Ａは本発明のコンジュゲートを示し、ここで細胞の標的化／取り込みペプチド（モジュール（ａ））はリシン毒素サブユニットＢであり、ＥＲＡＤ標的化／識別ペプチド（モジュール（ｃ））はＣＯＸ２由来であり、ＥＲ標的化ペプチド（モジュール（ｂ））はＡＫＤＥＬであり、送達物（化合物（ｄ））はｓｉＲＮＡである。ＲＴｂは生分解性のジスルフィド結合によりカルボキシ末端にモジュール（ｃ）及びモジュール（ｂ）を有する結合ペプチドのＮ末端と連結する。ｓｉＲＮＡ送達物は、生分解性（還元性）ジスルフィド結合とアミノリンカーとを含有するセンス鎖の５’末端を介して、スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエートに由来するアダプタにより結合ペプチドと結合する。連結はホルミル基と分岐点のＮ−β−アミノオキシアセチルＬ−ジアミノプロピオニル残基のアミノオキシ基との反応により生じた安定したオキシム結合により起こる。（ＳＧ）３ユニットは様々なモジュールが互いに干渉しない状態を確保するスペーサーとして機能する。 実施例１に記載のコンジュゲートＲ−ＡＫ−ＣＸの詳細な図である。図２Ｂは図２Ａに記載のものと同じ分子を示しているが、この分子は細胞のサイトゾルへと放出された際にｓｉＲＮＡの検出を可能にするために、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端に蛍光色素を含む。 ３ａは、モジュール及び化合物（ｄ）が以下の配置で互いに結合する、本発明によるコンジュゲートを示す図である：モジュール（ａ）は分岐点としてシステイン側鎖と、分岐点の上流に切断部位とを含むペプチドリンカー分子を介してモジュール（ｃ）と共有結合し、モジュール（ｃ）はモジュール（ｂ）と共有結合し、化合物（ｄ）はジスルフィド結合によりシステイン側鎖と共有結合する。３ｂは、モジュール及び化合物（ｄ）が以下の配置で互いに結合する、本発明によるコンジュゲートを示す図である：モジュール（ａ）は分岐点としてシステイン側鎖と、分岐点の上流に切断部位とを含む第１のペプチドリンカー分子を介してモジュール（ｃ）と共有結合し、モジュール（ｃ）は第２のペプチドリンカー分子を介してモジュール（ｂ）と共有結合し、化合物（ｄ）はジスルフィド結合により分岐点のシステイン側鎖と共有結合する。３ｃは、化合物（ｄ）がジスルフィド結合の代わりに酵素切断部位を介してシステイン側鎖と結合する、別の好ましい実施形態を示す図である。好ましくは、モジュール（ａ）がエンドソーム又はＴＧＮ内でコンジュゲートから切断され、それによりモジュール（ｂ）が細胞受容体又は細胞受容体と結合し、それによりＥＲへの更なる輸送を容易にする他の細胞タンパク質に利用可能となる。３ｄは少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）、少なくとも１つのモジュール（ｃ）及び少なくとも１つの化合物（ｄ）が以下の配置で互いに結合する、本発明によるコンジュゲートを示す図である：少なくとも１つのモジュール（ａ）は分岐点としてシステイン側鎖と、分岐点の上流に切断部位とを含むペプチドリンカー分子を介して少なくとも１つのモジュール（ｃ）と共有結合し、少なくとも１つのモジュール（ｃ）は少なくとも１つのモジュール（ｂ）と共有結合し、少なくとも１つの化合物（ｄ）はジスルフィド結合によりシステイン側鎖と共有結合したＤＲＢＤとのイオン（静電）結合により分岐点と非共有結合する。３ｅはモジュール及び化合物が以下の配置又は組合せで互いに結合する、本発明によるコンジュゲートを示す図である：モジュール（ａ）は分岐点としてシステイン側鎖と、分岐点の上流に切断部位とを含むペプチドリンカー分子を介してモジュール（ｃ）と共有結合し、モジュール（ｃ）はペプチドリンカー分子を介してモジュール（ｂ）と共有結合し、化合物（ｄ）はジスルフィド結合によりシステイン側鎖と共有結合したＤＲＢＤとのイオン結合により分岐点と非共有結合する。 モジュール（ａ）が非毒性のリシン毒素サブユニットＢ（ＲＴｂ）であり、モジュール（ｂ）が別個のモジュールとしては存在しないが、ＲＴｂの一部であり、モジュール（ｃ）が別個のモジュールとしては存在しないが、ＲＴｂの一部により与えられる、本発明のコンジュゲートを示す図である。概して、化合物（複数も可）（ｄ）として１個〜４個のｓｉＲＮＡがリジン側鎖上のアミノ基等の接近可能なアミノ基とＮ末端アミノ基とを介して各ＲＴＢ分子とカップリングすることができる。この図に示される構築物はＤＡＲＥ（商標）１．０１／ＤＡＲＥ−Ｒ１／ＲＴＢ−ｓｉＲＮＡ（Ｌｙｓ経由）と称される。簡潔にいうと、初めにＣｙｓ−４の遊離チオールがＮ−エチルマレイミドによる処理により不活性化し、ＲＴｂが活性化ジスルフィドを含有する過剰量の二官能性架橋剤、例えばスルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴとの反応により活性化する。この中間体をアンチセンス鎖の５’末端上に遊離チオールを有するｓｉＲＮＡで処理することで、単純なジスルフィド交換反応で示されたコンジュゲートが生成される。ｓｉＲＮＡカップリングの位置及び数はこの図に示される例に限定されない。ＲＴＢが過剰量の二官能性架橋剤スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（又はスルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）により活性化されるので、１つのＲＴＢモノマー当たり数分子のｓｉＲＮＡを付加することができる。アニオン交換ＨＰＬＣにより複数のｓｉＲＮＡが結合したエンティティを分離することができる。この図の「Ｎ」は例示的なものにすぎず、遊離アミノ側基の実際の位置を表していない（Ｎ末端を除く）。 モジュール（ａ）が非毒性のリシン毒素サブユニットＢ（ＲＴｂ）であり、モジュール（ｂ）が別々のモジュールとしては存在しないが、ＲＴｂの一部であり、モジュール（ｃ）が別々のモジュールとしては存在しないが、ＲＴｂの一部として与えられる、本発明のコンジュゲートを示す図である。送達物である化合物（ｄ）は、センス鎖の５’末端を介して生分解性（還元性）ジスルフィド結合によりＲＴｂ分子の４位でシステイン残基と直接結び付いたｓｉＲＮＡである。この図に示される構築物はＤＡＲＥ（商標）１．０２／ＤＡＲＥ−Ｒ２／ＲＴＢ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｙｓ経由）と称される。 細胞の標的化／取り込みペプチドであるモジュール（ａ）がリシン毒素サブユニットＢであり、ＥＲＡＤ標的化／識別ペプチドであるモジュール（ｃ）がＣＯＸ２由来であり、モジュール（ｂ）のＥＲ標的化機能がＲＴｂによって与えられ、送達物である化合物（ｄ）がｓｉＲＮＡである、本発明のコンジュゲートを示す図である。ＲＴｂは生分解性のジスルフィド結合により、Ｃ末端にモジュール（ｃ）を有する結合ペプチドのＮ末端でシステイン残基と連結する。ｓｉＲＮＡ送達物は、生分解性（還元性）ジスルフィド結合とアミノリンカーとを含有するセンス鎖の５’末端を介して、スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエートに由来するアダプタにより結合ペプチドと結合する。連結はホルミル基と分岐点のＮ−β−アミノオキシアセチルＬ−ジアミノプロピオニル残基のアミノオキシ基との反応により生じた安定したオキシム結合により起こる。（ＳＧ）３ユニットは様々なモジュールが互いに干渉しない状態を確保するスペーサーとして機能する。この図に示される構築物はＤＡＲＥ（商標）−２．０１／ＤＡＲＥ−Ｒ−ＣＸ／ＲＴＢ−Ｃｏｘ２−ＥＲＳＴＥＬ−ｓｉＲＮＡと称される。 （ＳＧ）３スペーサーをＰＥＧスペーサーに置き換えている以外は、図６Ａに記載のものと同じ分子を示す図である。合成は実施例２に記載している。この図に示される構築物はＤＡＲＥ（商標）−２．０２／ＤＡＲＥ−Ｒ−ＣＸｐｅｇ／ＲＴＢ−ｐｅｇ−Ｃｏｘ２−ＥＲＳＴＥＬ−ｓｉＲＮＡと称される。 細胞の標的化／取り込みタンパク質又はペプチドであるモジュール（ａ）がリシン毒素サブユニットＢであり、ＥＲＡＤ標的化／識別ペプチドであるモジュール（ｃ）がＣＯＸ２由来であり、ＥＲ標的化ペプチドであるモジュール（ｂ）がＫＤＥＬであり、送達物である化合物（ｄ）がｓｉＲＮＡである、本発明のコンジュゲートを示す図である。ＲＴｂは生分解性のジスルフィド結合により、Ｃ末端にモジュール（ｃ）とモジュール（ｂ）とを有する結合ペプチドのＮ末端と連結する。ｓｉＲＮＡ送達物は、生分解性（還元性）ジスルフィド結合とアミノリンカーとを含有するセンス鎖の５’末端を介して、スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエートに由来するアダプタにより結合ペプチドと結合する。連結はホルミル基と分岐点のＮ−β−アミノオキシアセチルＬ−ジアミノプロピオニル残基のアミノオキシ基との反応により生じた安定したオキシム結合により起こる。（ＳＧ）３ユニットは様々なモジュールが互いに干渉しない状態を確保するスペーサーとして機能する。この図に示される構築物はＤＡＲＥ（商標）−２．０３／ＤＡＲＥ−Ｒ−ＡＫ−ＣＸ／ＲＴＢ−Ｃｏｘ２−ＡＫＤＥＬ−ｓｉＲＮＡと称される。 ＥＲＡＤ標的化ペプチドであるモジュール（ｃ）が取り除かれていることを除いて、図７に示されるものと同一の本発明のコンジュゲートを示す図である。この図に示される構築物はＤＡＲＥ（商標）−２．０４／ＤＡＲＥ−Ｒ−ＡＫ／ＲＴＢ−ＡＫＤＥＬ−ｓｉＲＮＡと称される。 細胞の標的化／取り込みペプチドであるモジュール（ａ）がリシン毒素サブユニットＢであり、ＥＲＡＤ標的化／識別ペプチドであるモジュール（ｃ）がＳｇｋ１由来であり、ＥＲ標的化ペプチドであるモジュール（ｂ）がＫＤＥＬであり、送達物である化合物（ｄ）がｓｉＲＮＡである、本発明のコンジュゲートを示す図である。ＲＴｂは生分解性のジスルフィド結合により、モジュール（ｂ）とモジュール（ｃ）とを有する結合ペプチドのＮ末端でシステイン残基と連結する。ｓｉＲＮＡ送達物は、生分解性（還元性）ジスルフィド結合とアミノリンカーとを含有するセンス鎖の５’末端を介して、スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエートに由来するアダプタにより結合ペプチドと結合する。連結はホルミル基と分岐点のＮ−β−アミノオキシアセチルＬ−ジアミノプロピオニル残基のアミノオキシ基との反応により生じた安定したオキシム結合により起こる。（ＳＧ）３ユニットは様々なモジュールが互いに干渉しない状態を確保するスペーサーとして機能する。この図に示される構築物はＤＡＲＥ（商標）２．０５／ＤＡＲＥ−Ｒ−ＡＫ−ＳＧＫ／ＲＴＢ−Ｓｇｋ１−ＡＫＤＥＬ−ｓｉＲＮＡと称される。 モジュール（ａ）がトランスフェリン受容体結合ペプチドであり、モジュール（ｂ）がＫＤＥＬであり、モジュール（ｃ）がＣｏｘ２ペプチドである、本発明のコンジュゲートを示す図である。３つのモジュールが全て連続ペプチドとして結合している。（ＳＧ）３ユニットは様々なモジュールが互いに干渉しない状態を確保するスペーサーとして機能する。化合物（ｄ）はｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡ送達物は、生分解性（還元性）ジスルフィド結合を含有するセンス鎖の５’末端を介して、２つの（ＳＧ）３スペーサー間に位置するペプチドのシステイン残基と結合している。この図に示される構築物はＤＡＲＥ（商標）−３．０１ａ／ＤＡＲＥ−Ｔ−ＡＫ−ＣＸ＿ＮＣ／ＴｆＲ−Ｃｏｘ２−ＡＫＤＥＬ−ｓｉＲＮＡ（Ｎ→Ｃ）と称される。 モジュールは、構築物がモジュール（ａ）及びモジュール（ｂ）の両方のＣ末端が非結合型（free）であるようなものである以外は図１０Ａと同じである、本発明のコンジュゲートを示す図である。モジュール（ａ）は、２つのシステイン残基により形成されるジスルフィド結合によりそのＮ末端で分岐点のＮ−β−アミノオキシアセチルＬ−ジアミノプロピオニル残基と連結している。化合物（ｄ）はｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡ送達物は、アミノリンカーを含有するセンス鎖の５’末端を介してスクシンイミジル４−ホルミルベンゾエートに由来するアダプタにより結合ペプチドと結合している。連結はアダプタのホルミル基と分岐点のＮ−β−アミノオキシアセチルＬ−ジアミノプロピオニル残基のアミノオキシ基との反応により生じた安定したオキシム結合により起こる。（ＳＧ）３ユニットは様々なモジュールが互いに干渉しない状態を確保するスペーサーとして機能する。この図に示される構築物はＤＡＲＥ（商標）−３．０１ｂ／ＤＡＲＥ−Ｔ−ＡＫ−ＣＸ＿ＣＣ／ＴｆＲ−Ｃｏｘ２−ＡＫＤＥＬ−ｓｉＲＮＡ（→Ｃ；→Ｃ）と称される。 モジュール（ａ）がトランスフェリン受容体結合ペプチドであり、モジュール（ｂ）がＫＤＥＬであり、モジュール（ｃ）がＳｇｋ１ペプチドである、本発明のコンジュゲートを示す図である。３つのモジュール全てが連続ペプチドとして結合しており、Ｎ末端にモジュール（ｃ）を、Ｃ末端にモジュール（ｂ）を有する。（ＳＧ）３ユニットは様々なモジュールが互いに干渉しない状態を確保するスペーサーとして機能する。化合物（ｄ）はｓｉＲＮＡであり、センス鎖の５’末端を介して生分解性（還元性）ジスルフィド結合により、２つの（ＳＧ）３スペーサー間に位置するペプチドのシステイン残基と結合している。この図に示される構築物はＤＡＲＥ（商標）−３．０２／ＤＡＲＥ−Ｔ−ＡＫ−ＳＧＫ／Ｓｇｋ１−ＴｆＲ−ＡＫＤＥＬ−ｓｉＲＮＡと称される。 モジュール（ａ）がトランスフェリン受容体結合ペプチドであり、モジュール（ｂ）がＫＤＥＬであり、モジュール（ａ）とＣ末端で結合し、モジュール（ｃ）がＩｇＭ（μ）である、本発明のコンジュゲートを示す図である。モジュール（ａ）は２つのシステイン残基により形成されるジスルフィド結合によりそのＮ末端で分岐点のＮ−β−アミノオキシアセチルＬ−ジアミノプロピオニル残基と連結している。化合物（ｄ）はｓｉＲＮＡであり、アミノリンカーを含有するセンス鎖の５’末端を介してスクシンイミジル４−ホルミルベンゾエートに由来するアダプタにより結合ペプチドと結合している。連結はアダプタのホルミル基と分岐点のＮ−β−アミノオキシアセチルＬ−ジアミノプロピオニル残基のアミノオキシ基との反応により生じた安定したオキシム結合により起こる。（ＳＧ）３ユニットは様々なモジュールが互いに干渉しない状態を確保するスペーサーとして機能する。この図に示される構築物はＤＡＲＥ（商標）−３．０３／ＤＡＲＥ−Ｔ−ＡＫ−ＩｇＭ／ＴｆＲ−ＡＫＤＥＬ−ＩｇＭ（μ）−ｓｉＲＮＡと称される。 ここではモジュール（ｂ）（この例ではＫＤＥＬモチーフである）がモジュール（ｃ）（ＩｇＭ（μ）配列である）のＣ末端に存在することを除いて図１２に示されるコンジュゲートと同一の構成を有するコンジュゲートを示す図である。この図に示される構築物はＤＡＲＥ（商標）−３．０４／ＤＡＲＥ−Ｔ−ＩｇＭ−ＡＫ／ＴｆＲ−ＩｇＭ（μ）−ＡＫＤＥＬ−ｓｉＲＮＡと称される。 ２つの送達物分子である２つの化合物（ｄ）が生分解性ジスルフィド結合により結合している、本発明のコンジュゲートを示す図である。細胞の標的化／取り込みペプチドであるモジュール（ａ）がリシン毒素サブユニットＢであり、ＥＲＡＤ標的化／識別ペプチドであるモジュール（ｃ）及びＥＲ標的化ペプチドであるモジュール（ｂ）は、本発明のコンジュゲートに使用される任意のモジュール（ｃ）及びモジュール（ｂ）であり得るが、結合ペプチドのＣ末端に位置する。ＲＴｂであるモジュール（ａ）は、生分解性（還元性）ジスルフィド結合により、ｄＰＥＧ１２スペーサーにより隔てられた２つの分岐点のＮ−β−アミノオキシアセチルＬ−ジアミノプロピオニル残基を含有する結合ペプチドのＮ末端でシステイン残基と連結している。送達物分子である２つの化合物（ｄ）はｓｉＲＮＡであり、そのそれぞれがアミノリンカーを含有するセンス鎖の５’末端を介してスクシンイミジル４−ホルミルベンゾエートに由来するアダプタにより結合ペプチドと結合している。連結はアダプタのホルミル基と２つの分岐点のＮ−β−アミノオキシアセチルＬ−ジアミノプロピオニル残基のアミノオキシ基との反応により生じた安定したオキシム結合により起こる。例示的な構築物（ここでモジュール（ｃ）はＣｏｘ２ペプチドであり、モジュール（ｂ）はＫＤＥＬである）の合成を実施例１９に記載する。 実施例２０に記載のように、ＤＡＲＥ（商標）３．０２構築物である、送達物としてｆＬｕｃ−ｓｉＲＮＡを有するＤＡＲＥ（商標）−Ｔ−ＡＫ−ＳＧＫの分取アニオン交換ＨＰＬＣ追跡結果（trace）を示す図である。分離を流速３ｍＬ／分で６０分間、６Ｍの尿素を含有する２５ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）中での０Ｍから０．８Ｍまでの臭化ナトリウムの線形勾配溶出で１ｍＬのＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムにより行った。カラム溶出液を２６０ｎｍ及び５５０ｎｍのＵＶでモニタリングした。ｘ軸は時間（分）であり、ｙ軸は２６０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）である。第１のピークは所望のＤＡＲＥ（商標）３．０２構築物である。 実施例２０に記載のように、ＤＡＲＥ（商標）３．０２構築物である、送達物としてＧＡＰＤＨ−ｓｉＲＮＡを有するＤＡＲＥ（商標）−Ｔ−ＡＫ−ＳＧＫの分取アニオン交換ＨＰＬＣ追跡結果を示す図である。分離を流速３ｍＬ／分で６０分間、６Ｍの尿素を含有する２５ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）中での０Ｍから０．８Ｍまでの臭化ナトリウムの線形勾配溶出で１ｍＬのＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムにより行った。カラム溶出液を２６０ｎｍ及び５５０ｎｍのＵＶでモニタリングした。ｘ軸は時間（分）であり、ｙ軸は２６０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）である。第１のピークは所望のＤＡＲＥ（商標）３．０２構築物である。 実施例２０に記載のように、ＨＰＬＣで精製した、ｆＬｕｃ ｓｉＲＮＡ送達物を有するＤＡＲＥ（商標）３．０２構築物、及びＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ送達物を有するＤＡＲＥ（商標）３．０２構築物のＰＡＧＥ分析を示す図である。１５％ＰＡＧＥゲル（８ｃｍ×６．５ｃｍ）を、６Ｍの尿素を含有するトリスホウ酸塩泳動バッファーを用いて、１時間〜１．５時間、２２０Ｖ及び２５ｍＡで泳動させた。 ＨＰＬＣで精製した、ｆＬｕｃ−ｓｉＲＮＡ送達物を有するＤＡＲＥ（商標）３．０２構築物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す図である（実施例２０を参照されたい）。構築物はＭＳ条件に完全には安定ではなく、そのため２０５４４Ｄａの算出質量の領域でｍ／ｚを有する弱い分子イオンのみを観察することができる。６８３０のｍ／ｚで観察された主要ピークはｆＬｕｃ−ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖によるものであり（算出質量 ６８２７Ｄａ）、約１３７００のｍ／ｚに中心がある（centered）広範なピークはペプチドとコンジュゲートしたセンス鎖によるものである。 ＨＰＬＣで精製した、ＧＡＰＤＨ−ｓｉＲＮＡ送達物を有するＤＡＲＥ（商標）３．０２構築物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す図である（実施例２０を参照されたい）。構築物はＭＳ条件に完全には安定ではなく、そのため２０５７７Ｄａの算出質量の領域でｍ／ｚを有する弱い分子イオンのみを観察することができる。６７９９のｍ／ｚで観察された主要ピークはＧＡＰＤＨ−ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖によるものであり（算出質量 ６７９６Ｄａ）、約１３８００のｍ／ｚに中心がある広範なピークはペプチドとコンジュゲートしたセンス鎖によるものである（算出質量 １３７８１Ｄａ）。
図１
Legend 注釈
cell targetingmodule a 細胞標的化モジュールａ
retrogradetransport module b (must be at C-term of peptide) 逆行性輸送モジュールｂ（ペプチドのＣ末端に存在しなければならない）
ERAD module c(must be peptide) ＥＲＡＤモジュールｃ（ペプチドでなければならない）
compound(cargo) 化合物（送達物）
covalent link 共有結合
non-covalentlink 非共有結合
linkermolecule (possibly adaptor) リンカー分子（アダプタである可能性もある）
図２
Ricin リシン
図３
Legend 注釈
celltargeting module a 細胞標的化モジュールａ
retrogradetransport module b 逆行性輸送モジュールｂ
ERAD module c ＥＲＡＤモジュールｃ
compound(cargo) 化合物（送達物）
covalent link 共有結合
peptide/linker ペプチド／リンカー
cleavage site 切断部位

図５
(Cys at pos.4) （４位にＣｙｓ）
図６
(Cys at pos.4) （４位にＣｙｓ）
図７
(Cys at pos.4) （４位にＣｙｓ）
図８
(Cys at pos.4) （４位にＣｙｓ）
図９
(Cys at pos.4) （４位にＣｙｓ）
図１０
siRNA w/ リンカー リンカーを有するｓｉＲＮＡ
図１１
siRNA w/ リンカー リンカーを有するｓｉＲＮＡ
図１４
Ricin リシン
peptide ペプチド
図１７
HPLC purified ＨＰＬＣ精製
図１８
% intensity 強度（％）
Mass (m/z) 質量（ｍ／ｚ）
図１９
% intensity 強度（％）
Mass (m/z) 質量（ｍ／ｚ）
本発明を以下で詳細に説明する前に、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬は変化し得るため、本発明は、これらの方法論、プロトコル及び試薬に限定されないことを理解するべきである。本明細書で使用される専門用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明の範囲の限定を意図しないことも理解すべきである。他に特に規定がなければ、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は概して、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。概して、本明細書で使用される命名法、並びに細胞培養、分子遺伝学、有機化学及び核酸化学及びハイブリダイゼーションにおける実験手順は当該技術分野でよく知られており、かつ一般的に利用されるものである。標準的な技法を核酸及びペプチドの合成に使用する。これらの技法及び手順は一般的に、当該技術分野での従来方法及び本文書全体を通して提示される様々な一般参考文献、例えば［３］に従って行われる。本明細書で使用される命名法、並びに以下に記載の分析化学及び有機合成に使用される実験手順は当該技術分野でよく知られており、かつ一般的に利用されるものである。標準的な技法又はその変法を化学合成及び化学分析に使用する。
好ましくは、本明細書で使用される用語は過去に記載のように規定される［４］。
冠詞「a」及び「an」は、１つ又は２つ以上（すなわち少なくとも１つ）の該冠詞の文法上の対象物を表すために本明細書で使用される。例えば、「要素（an element）」は１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」という言葉及びその変化形（variations such as"comprises" and "comprising"）は、記載の整数若しくは工程、又は整数群若しくは工程群を包含するが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数群若しくは工程群を排除しないことを意図することを理解されたい。
一部の文献は本明細書の本文全体を通して引用される。本明細書で引用される文献（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号寄託配列（sequence submissions）等を含む）はそれぞれ、上記又は下記にかかわらず、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書において、本発明には先行発明に基づくかかる開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるものはない。
以下において、本発明の要素を説明する。これらの要素を特定の実施形態と共に挙げるが、これらは任意の様式でかつ任意の数を組み合わせて、更なる実施形態を作製してもよいことを理解すべきである。様々に記載された実施例及び好ましい実施形態は、明示的に記載された実施形態のみに本発明を限定するものとは解釈されないものとする。この記載は、明示的に記載された実施形態と任意の数の開示された及び／又は好ましい要素とを組合せた実施形態を支持及び包含することを理解すべきである。さらに、文脈上他の意味を示す場合を除き、本願に記載の全ての要素の任意の置換及び組合せが本願の記載により開示されていると解釈するものとする。
本明細書ではポリヌクレオチド配列を記載するのに従来の表記法が使用される：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は５’方向と表す。ＤＮＡ上の基準点に対して５’側に位置しているＤＮＡ鎖上の配列は「上流配列」と表し、ＤＮＡ上の基準点に対して３’側に位置しているＤＮＡ鎖上の配列は「下流配列」と表す。
「ポリヌクレオチド」は、核酸の一本鎖又は平行鎖及び逆平行鎖を意味する。このためポリヌクレオチドは一本鎖核酸又は二本鎖核酸のいずれかであり得る。
「核酸」という用語は通常、ポリヌクレオチドを指す。好ましくは、本発明のコンジュゲートの核酸は、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、モルホリノ修飾ｉＲＮＡ（米国特許出願公開第２０１０／００７６０５６号及び米国特許第７，７４５，６０８号においてManoharan et al.により説明されるようなもの）、アンチジーン（anti-gene）ＲＮＡ（ａｇＲＮＡ）等である。
「相同な（Homologous）」は本明細書で使用する場合、２つのポリマー分子間、例えば２つの核酸分子、例えば２つのＤＮＡ分子若しくは２つのＲＮＡ分子間、又は２つのペプチド分子間のサブユニット配列類似性を指す。２つの分子両方のサブユニット位置が同じモノマーサブユニットで占められている場合、例えば２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンで占められている場合、これらの分子はこの位置で相同である。２つの配列間の相同性は一致する又は相同な位置の数の一次関数である。例えば、２つの化合物配列における位置の半分（例えば１０サブユニット長のポリマーにおける５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、９０％（例えば１０個のうち９個）の位置が一致しているか又は相同である場合、２つの配列は９０％の相同性を共有している。例として、ＤＮＡ配列5'ATTGCC3'と5'TATGGC3'とは５０％の相同性を共有している。
本明細書で使用する場合、「相同性」は「同一性」と同意語として使用される。２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の同一性（％）の測定は数学アルゴリズムを用いて達成することができる。例えば、２つの配列を比較するのに有用な数学アルゴリズムはKarlin and Altschul, 1993［６］等で修正されたKarlinand Altschul, 1990［５］のアルゴリズムである。このアルゴリズムはAltschul, etal., 1990［７］のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれており、例えばＵＲＬ（universalresource locator）が「http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/」である全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）のワールドワイドウェブサイトでアクセスすることができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本明細書に記載の核酸と相同なヌクレオチド配列を得るために以下のパラメータ（ギャップペナルティ＝５、ギャップ延長ペナルティ＝２、ミスマッチペナルティ＝３、マッチリワード（match reward）＝１、期待値１０．０、及びワードサイズ＝１１）を用いて、ＮＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトでは「ｂｌａｓｔｎ」を指定する）により行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、本明細書に記載のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために以下のパラメータ（期待値１０．０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（scoring matrix））を用いて、ＸＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトでは「ｂｌａｓｔｎ」を指定する）又はＮＣＢＩ「ｂｌａｓｔｐ」プログラムにより行うことができる。比較目的でギャップのあるアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをAltschul et al., 1997［８］に記載のように利用することができる。代替的に、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ又はＰＨＩ−Ｂｌａｓｔを、分子間の距離関係（同上）、及び共通のパターンを共有する分子間の関係を検出する反復サーチ（iterated search）を行うのに使用することができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ及びＰＨＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、各プログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
２つの配列間の同一性（％）を、ギャップを許容して又は許容せずに、上記の技法と同様の技法を用いて測定することができる。同一性（％）を算出する際には、通常、正確な一致数を計測する。
本発明による「タンパク質」は、自然に存在し得るアミノ酸残基、又は自然に存在するアミノ酸残基の誘導体（好ましくはペプチド結合により結合する）の鎖を表し、このタンパク質は少なくとも２５１個のアミノ酸残基又はアミノ酸残基誘導体からなる。
本発明による「ペプチド」は、自然に存在し得るアミノ酸残基、又は自然に存在するアミノ酸残基の誘導体（好ましくはペプチド結合により結合する）の鎖を表し、このペプチドは２５０個以下のアミノ酸残基又はアミノ酸残基誘導体からなる。好ましくは、本発明で使用されるペプチドは、１０個〜２５０個のアミノ酸残基又はアミノ酸残基誘導体の長さである。より好ましくは、本発明で使用されるペプチドは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９又は２５０アミノ酸長である。
「アミノ酸」という用語は、自然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに自然に存在するアミノ酸と同じように機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を表す。自然に存在するアミノ酸は遺伝子コードによりコードされるもの、並びに後に修飾されるこれらのアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート及びＯ−ホスホセリンである。
本明細書で使用する場合、アミノ酸は、以下の表１に示すように、そのフルネームにより、それに対応する３文字コードにより、又はそれに対応する１文字コードにより表される：
表１．アミノ酸及びそれらの３文字コード及び１文字コード
Figure 2012533587
「アミノ酸類似体」は、自然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基及びＡ基と結合するα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを表す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えばノルロイシン）又は修飾ペプチド骨格を有するが、自然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。
「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、自然に存在するアミノ酸と同じように機能する化合物を表す。
本発明は、本明細書に記載のようなタンパク質又はペプチドの類似体を含むコンジュゲートも提供する。類似体は、自然に存在するタンパク質又はペプチドとは、保存的なアミノ酸配列の差異、又は配列に影響を与えない修飾、又はその両方により異なり得る。例えば、保存的なアミノ酸変化を行うことができ、該変化はタンパク質又はペプチドの一次配列を変更するが、通常その機能を変更しない。保存的なアミノ酸置換には通常、以下の群の中での置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。
本発明は、修飾タンパク質又は修飾ペプチドを含むコンジュゲートも提供する。一次配列を通常変更しない修飾には、タンパク質及びペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの化学的誘導体化、例えばアセチル化又はカルボキシル化が含まれる。グリコシル化した修飾タンパク質又は修飾ペプチド、例えば合成中及びプロセシング中に又は更なるプロセシング工程において、例えばタンパク質又はペプチドを、グリコシル化に影響を与える酵素、例えば哺乳動物のグリコシル化酵素又は脱グリコシル化酵素に曝すことによって、タンパク質又はペプチドのグリコシル化パターンを変えることにより作製されるものも本発明に含まれる。リン酸化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン又はホスホスレオニンを有するタンパク質又はペプチドも本発明に包含される。
当然のことながら、本発明のコンジュゲートにおいて使用されるタンパク質及びペプチドに、活性に影響を与えることなく修飾されたアミノ酸残基を組み込むことができることも理解されよう。例えば末端を、ブロッキング基、すなわちＮ末端及びＣ末端を「不要な分解」（この用語には化合物の機能に影響を与えると考えられる末端での化合物の任意のタイプの酵素的分解、化学的分解又は生化学的分解、すなわちその末端での化合物の逐次分解を包含するような意味がある）から保護及び／又は安定化するのに好適な化学的置換基を含むように誘導体化することができる。
ブロッキング基には、ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性に悪影響を与えないペプチド化学の技術分野で従来的に使用される保護基が含まれる。例えば、好適なＮ末端ブロッキング基を、Ｎ末端のアルキル化又はアシル化により導入することができる。好適なＮ末端ブロッキング基の例としては、分岐又は非分岐のＣ１〜Ｃ５アルキル基、ホルミル基及びアセチル基等のアシル基、並びにそれらの置換形態、例えばアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基、Ｆｍｏｃ基又はＢｏｃ基が挙げられる。アミノ酸のデスアミノ類似体も有用なＮ末端ブロッキング基であり、ペプチドのＮ末端とカップリングさせることができるか、又はＮ末端残基（reside）の代わりに使用することができる。好適なＣ末端ブロッキング基（Ｃ末端のカルボキシル基が組み込まれているか又は組み込まれていない）は、エステル類、ケトン類又はアミド類を含む。エステル形成アルキル基又はケトン形成アルキル基、特にメチル、エチル及びプロピル等の低級アルキル基、並びに第一級アミン（−ＮＨ２）等のアミド形成アミノ基、並びにメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ等のモノアルキルアミノ基及びジアルキルアミノ基等が、Ｃ末端ブロッキング基の例である。アグマチン等のデスカルボキシル化アミノ酸類似体も有用なＣ末端ブロッキング基であり、ペプチドのＣ末端残基とカップリングさせることができるか、又はその代わりに使用することができる。さらに、末端の遊離アミノ基及び遊離カルボキシル基をペプチドから完全に取り除き、ペプチド活性に影響を与えることなくそのデスアミノ形態及びデスカルボキシル化形態を得ることができることが理解されよう。
他の修飾を活性に悪影響を与えることなく組み込むこともでき、これらの他の修飾には、天然のＬ−異性体型のアミノ酸のうちの１つ又は複数とＤ−異性体型のアミノ酸との置換が含まれるが、これらに限定されない。このため本発明のコンジュゲートに使用されるタンパク質又はペプチドには、１つ又は複数のＤ−アミノ酸残基が含まれ得るか、又は全てがＤ型のアミノ酸が含まれ得る。本発明によるタンパク質又はペプチドのレトロ−インベルソ（Retro-inverso）型、例えば全てのアミノ酸がＤ−アミノ酸型に置換された逆ペプチドも考慮される。
本発明のコンジュゲートに使用されるタンパク質又はペプチドの酸付加塩も機能的等価物として考慮される。このため、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、ヘキサフルオロリン酸、テトラフルオロホウ酸等の無機酸、又は酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石（tataric）酸、クエン酸、安息香酸、トリフルオロ酢酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル（salicyclic）酸等の有機酸で処理した本発明によるタンパク質又はペプチドが、本発明のコンジュゲートに使用するのに好適なペプチドの水溶性塩をもたらす。
タンパク質分解に対する耐性を改善する、又は溶解性を最適化する、又は治療剤としてより好適なものとするように（例えば本発明のコンジュゲートにおける化合物（ｄ）として使用する場合）、通常の分子生物学的技法を用いて修飾されたタンパク質及びペプチドも含まれる。このようなペプチドの類似体には、自然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基を含有するもの、例えばＤ−アミノ酸又は自然には存在しない合成アミノ酸が含まれる。
また、タンパク質分解に対する感受性を増大させるように（例えば本発明のコンジュゲートにおいてモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及び／又はモジュール（ｃ）として使用する場合）、通常の分子生物学的技法を用いて修飾されたタンパク質及びペプチドも本発明のコンジュゲートに使用される。好ましくは、タンパク質分解に感受性のあるタンパク質又はペプチドはユビキチン化部位又はユビキチン化モチーフを含む。このようなモチーフの同定に関しては、http://iclab.life.nctu.edu.tw/ubipred/を参照されたい［９、１０］。好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートに使用されるモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）又はモジュール（ｃ）のタンパク質又はペプチドはユビキチン化部位又はユビキチン化モチーフを含み、そのためポリユビキチン鎖がモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）又はモジュール（ｃ）のタンパク質又はペプチド上に形成される。好ましくは、ポリユビキチン鎖はユビキチンのリジン１１又はリジン４８に生成される［１１、１２］。好ましくは、少なくとも４つのユビキチン分子がタンパク質分解に感受性のあるモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）又はモジュール（ｃ）上のリジン残基（複数も可）に結合し、それにより２６Ｓ−プロテアソームによるその認識及び分解の可能性を増大させる。付加的に又は代替的に、タンパク質分解に感受性があるタンパク質又はペプチドを、１つ又は複数のリジン残基を付加するように修飾するか、かつ／又はそのアミノ酸のうち１つ又は複数を１つ又は複数のリジン残基で置換し、これによりタンパク質分解に感受性があるタンパク質又はペプチド内にユビキチン化部位を作製する。
本発明のコンジュゲートに使用されるタンパク質及びペプチドが、本明細書に挙げられる特定の例示的なプロセスのうちのいずれの生成物にも限定されないことを理解すべきである。
本明細書で使用される場合、本発明に使用されるペプチド又はポリペプチドの「変異体」は、そのアミノ酸配列において少なくとも１つの変化を含み、ここで該少なくとも１つの変化はアミノ酸の置換、挿入、欠失、Ｎ末端の切断、Ｃ末端の切断、又はこれらの変化の任意の組合せである。本発明に使用されるペプチド又はポリペプチドの変異体は、そのアミノ酸残基の２つ以上における変化を含み得る。好ましい実施形態では、本発明に使用することができる変異体は、アミノ酸配列における総数２００個まで（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、１８０個、１８５個、１９０個、１９５個又は２００個まで）の変化（すなわち置換、挿入、欠失、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、及び／又はそれらの任意の組合せ）を示す。アミノ酸置換は保存的であっても又は非保存的であってもよい。好ましい実施形態では、本発明に使用することができる変異体は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個までのアミノ酸置換、好ましくは保存的なアミノ酸変化により得られるタンパク質又はドメインと異なる。変異体は、付加的に又は代替的にアミノ酸の欠失（Ｎ末端切断、Ｃ末端切断若しくは内部欠失、又はこれらの任意の組合せであり得る）を含み得る。Ｎ末端切断、Ｃ末端切断及び／又は内部欠失を含むこのような変異体は、本願との関連では「欠失変異体」又は「断片」と称される。「欠失変異体」及び「断片」という用語は、本明細書で区別なく使用される。欠失変異体は自然に存在していても（例えばスプライス変異体であっても）よく、又は好ましくは組換えＤＮＡ技法を用いた遺伝子操作手段により、人工的に構築してもよい。
本発明による「コンジュゲート」は、対象となる化合物（ｄ）（例えば核酸分子又はペプチド）と、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）との物理的結び付き（assciation）を指す。幾つかの実施形態では、「コンジュゲート」は、上述の構成要素の非共有結合的な結び付き（例えば静電相互作用、水素結合相互作用又は疎水性相互作用）又は共有結合的な結び付きを指す。他の実施形態では、コンジュゲートの構成要素が全て互いに共有結合していてもよく、他の実施形態では、構成要素の１つのサブセットのみが互いに共有結合している。
本発明による「送達」は、化合物を細胞に、例えば好ましくは細胞のサイトゾル（細胞質）に、又は細胞小器官、好ましくは核に輸送するプロセスを指す。
本発明との関連では「化合物」は、生物学的に活性のある化合物、すなわち生物学的構成要素との反応性を有する化合物を指す。より具体的には、本発明に使用される化合物は、生きている細胞に関連する天然の細胞プロセスを変化させるように設計される。本明細書では、天然の細胞プロセスは、生物学的に活性のある化合物を送達する前の細胞に関連するプロセスである。本発明では、送達される生物学的に活性のある化合物の一例である、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞へと送達される本発明の化合物により、タンパク質又はｍＲＮＡ等の物質の細胞産生又は阻害が引き起こされる。医薬品、ペプチド、タンパク質及び核酸、細胞毒性剤、放射性作用物質及び他の治療成分（moieties）又は診断成分が本発明の化合物の例である。
本明細書に使用される場合、「生物学的に活性のある化合物」は、それが特徴とする特性を示す形態の生体分子である。機能的酵素は例えば、該酵素が特徴とする特徴的な触媒活性を示すものである。
本発明との関連では、「結合した」という用語は、モジュールと化合物とが互いに物理的に結合しているか、又は互いに結び付いていることを意味する。幾つかの実施形態では、「結合した」は、上述の構成要素の非共有結合的な結び付き（例えば静電相互作用、水素結合相互作用又は疎水性相互作用）又は共有結合的な結び付きを指す。他の実施形態では、全ての構成要素が互いに共有結合していてもよく、他の実施形態では、構成要素の１つのサブセットのみが互いに共有結合している。
「任意の配置で互いに結合する」という用語は、モジュール及び化合物が、互いに線形に及び／又は非線形に、互いに等しい又は異なる化学量論で結合することができることを更に意味する。
本明細書で「細胞標的化モジュール」又は「モジュール（ａ）」とも称される「細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にするモジュール」という語句は、本発明との関連では、（ｉ）対象となる細胞の表面に特異的に結合すること（ここで好ましくは細胞は、脊椎動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、例えばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類又はヒトの細胞等、更により好ましくはヒトの細胞である）、及び（ｉｉ）エンドサイトーシスプロセス（細胞内の膜結合小器官又は膜結合小胞への接近を可能にする、受容体媒介性の取り込み、ピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、マクロピノサイトーシス又は液相エンドサイトーシスであり得る）であり得る天然プロセスによる、モジュール及びそれに結合したコンジュゲートの更なる構成要素の無傷細胞への侵入を媒介することが可能な化学エンティティ、例えばポリペプチド又はオリゴペプチド、好ましくはポリペプチドを指す。好ましくは、細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にするモジュールは、細胞内の膜結合小胞、膜結合小管又は膜結合管状小胞構造を生じるプロセスで、細胞により取り込まれる）。モジュールと特異的に結合する構造は好ましくは、細胞表面受容体である。当業者は、例えば（ｉ）上記モジュールを、例えば放射性マーカー又は蛍光マーカーで標識すること、（ｉｉ）標識化されたモジュールを無傷細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばヒト細胞と共にインキュベートすること、及び（ｉｉｉ）細胞内で、すなわち無傷細胞の細胞質における細胞内の膜結合小器官又は膜結合小胞において、例えば蛍光顕微鏡検査法により、標識化されたモジュールを検出することができるかを評価することにより、モジュールが細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にするかを容易に評価することができる（例えば［１３〜１５］を参照されたい）。
本明細書において「ＥＲ標的化モジュール」又は「モジュール（ｂ）」とも称される「小胞体（ＥＲ）への輸送を容易にするモジュール」という語句は、本発明との関連では、モジュール、及びそれに結合したコンジュゲートの更なる構成要素のＥＲへの輸送を媒介することが可能な化学エンティティ、例えばポリペプチド又はオリゴペプチド、好ましくはオリゴペプチドを指す。ゴルジ装置を介したＥＲへの輸送は、ＥＲからゴルジ装置へと、更には原形質膜へと分泌されることになっている分子を送達する生合成分泌輸送とは反対の方向にあり、そのためＥＲへの逆行性の輸送経路としても知られている。当業者は、例えば（ｉ）上記モジュールを、例えば放射性マーカー又は蛍光マーカーで標識すること、（ｉｉ）上記の標識化されたモジュールと、細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にするモジュール（モジュール（ａ））とを結合すること、（ｉｉｉ）両方のモジュールを無傷細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばヒト細胞と共にインキュベートすること、及び（ｉｖ）例えば蛍光顕微鏡検査法又はＮ−グリコシル化状態の評価により、上記の標識化されたモジュールを細胞のＥＲで検出することができるかを評価することにより、モジュールがＥＲへの輸送を容易にするかを容易に評価することができる［１４、１６］。
本明細書で「ＥＲＡＤ標的化モジュール」又は「モジュール（ｃ）」とも称される「ＥＲからサイトゾルへの転位を媒介するモジュール」という語句は、本発明との関連では、例えばＥＲ関連分解（ＥＲＡＤ）の基質として作用することにより、モジュール、及びそれに結合したコンジュゲートの更なる構成要素のＥＲの内腔からサイトゾルへの侵入を媒介することが可能な化学エンティティ、好ましくはポリペプチド又はオリゴペプチドを指す。ＥＲからサイトゾルへの輸送は逆行転位としても知られている。ＥＲＡＤ経路は、ユビキチン化、及び続くプロテアソームと呼ばれるタンパク質分解複合体による分解に関してミスフォールドした（misfolded）又は誤ったグリコシル化が行われた（misglycosylated）タンパク質を通常標的とする細胞経路である。ＥＲからサイトゾルへの転位を媒介するモジュールを使用したＥＲＡＤ経路を利用することにより、本発明のコンジュゲートは、化合物を細胞質へと送達することができ、コンジュゲートの細胞標的化モジュール、ＥＲ標的化モジュール及びＥＲＡＤ標的化モジュールが残っている場合、それらはプロテオソームにより分解されるのが好ましい。当業者は、例えば（ｉ）上記モジュールを、例えば放射性マーカー又は蛍光マーカーで標識すること、（ｉｉ）上記の標識化されたモジュールと、細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にするモジュール（モジュール（ａ））及びＥＲへの輸送を容易にするモジュール（モジュール（ｂ））とを結合すること、（ｉｉｉ）コンジュゲートされたモジュールを無傷細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばヒト細胞と共にインキュベートすること、並びに（ｉｖ）例えば蛍光顕微鏡検査法又はウェスタンブロッティングにより、上記の標的化されたモジュールを細胞のサイトゾルで検出することができるか、またおそらくはプロテオソームにより、経時的に分解されるかを評価することにより、モジュールがＥＲからサイトゾルへの転位を媒介するかを容易に評価することができる（例えば［１７］を参照されたい）。
また当業者は、（ｉ）モジュール及び化合物（ｄ）を、例えば異なる放射性マーカー又は蛍光マーカーで標識すること、（ｉｉ）モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）を互いに結合すること、（ｉｉｉ）コンジュゲートされたモジュール及び化合物を無傷細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばヒト細胞と共にインキュベートすること、並びに（ｉｖ）例えば蛍光顕微鏡検査法により、化合物（ｄ）及びモジュールを細胞のサイトゾルで検出することができるかを評価することにより、上述の機能性を有するモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）が化合物を細胞へと送達することができるかを容易に評価することができる。
また当業者は、すなわちコンジュゲートのモジュール（ａ）；モジュール（ａ）及びモジュール（ｂ）；モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）；並びにモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）の細胞内識別を求めるのに細胞の同時染色を使用することができる。例えば、モジュール、複数のモジュール、又はコンジュゲートを含む細胞を、以下の実施例７に記載のように免疫組織化学を用いて細胞内コンパートメント、例えばエンドソーム、リソソーム、トランスゴルジネットワーク、ゴルジ装置、ＥＲ、カベオラ及び細胞質に関して同時染色することができる。
第１の態様では、本発明は、細胞に化合物を送達するためのコンジュゲートを含むか又はそれからなる送達システムであって、該コンジュゲートが、
（ａ）細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にする少なくとも１つのモジュール（ａ）と、
（ｂ）小胞体（ＥＲ）への輸送を容易にする少なくとも１つのモジュール（ｂ）と、
（ｃ）ＥＲからサイトゾルへの転位を媒介する少なくとも１つのモジュール（ｃ）と、
（ｄ）少なくとも１つの化合物（ｄ）と、
を含むか、それらから本質的になるか又はそれらからなり、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）が任意の配置で互いに結合する、細胞に化合物を送達するためのコンジュゲートを含むか又はそれからなる送達システムに関する。
好ましくは、本発明による、細胞に化合物を送達するためのコンジュゲートを含むか又はそれからなる送達システムは、
（ａ）細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にする少なくとも１つのモジュール（ａ）と、
（ｂ）モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）、並びに化合物（ｄ）、並びに任意でモジュール（ａ）の小胞体（ＥＲ）への輸送を容易にする少なくとも１つのモジュール（ｂ）と、
（ｃ）少なくとも１つの化合物（ｄ）、及び任意でモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）又はモジュール（ｃ）のうちの１つ又は複数のＥＲからサイトゾルへの転位を媒介する少なくとも１つのモジュール（ｃ）と、
（ｄ）少なくとも１つの化合物（ｄ）と、
を含むか、それらから本質的になるか又はそれらからなり、
モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）が任意の配置で互いに結合する。
好ましい実施形態では、本発明の送達システムは核局在化シグナルを更に含む。
好ましくは、本発明の第１の態様による送達システムは、本発明の第２の態様のコンジュゲートを含むか、それらから本質的になるか又はそれらからなる。
第２の態様では、本発明は、細胞に化合物を送達するためのコンジュゲートであって、
（ａ）細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にする少なくとも１つのモジュール（ａ）と、
（ｂ）小胞体（ＥＲ）への輸送を容易にする少なくとも１つのモジュール（ｂ）と、
（ｃ）ＥＲからサイトゾルへの転位を媒介する少なくとも１つのモジュール（ｃ）と、
（ｄ）少なくとも１つの化合物（ｄ）と、
を含むか、それらから本質的になるか又はそれらからなり、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）が任意の配置で互いに結合する、細胞に化合物を送達するためのコンジュゲートに関する。
好ましくは、本発明による細胞に化合物を送達するためのコンジュゲートは、
（ａ）細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にする少なくとも１つのモジュール（ａ）と、
（ｂ）モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）、並びに化合物（ｄ）、並びに任意でモジュール（ａ）の小胞体（ＥＲ）への輸送を容易にする少なくとも１つのモジュール（ｂ）と、
（ｃ）少なくとも１つの化合物（ｄ）、及び任意でモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）又はモジュール（ｃ）のうちの１つ又は複数のＥＲからサイトゾルへの転位を媒介する少なくとも１つのモジュール（ｃ）と、
（ｄ）少なくとも１つの化合物（ｄ）と、
を含むか、それらから本質的になるか又はそれらからなり、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）が任意の配置で互いに結合する。
好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは核局在化シグナルを更に含む。
本発明によるコンジュゲートは、少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）、少なくとも１つのモジュール（ｃ）及び少なくとも１つの化合物（ｄ）を含むか、それらから本質的になるか又はそれらからなる。本発明のコンジュゲートの少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）、少なくとも１つのモジュール（ｃ）及び少なくとも１つの化合物（ｄ）は、任意の配置、組合せ又は化学量論で互いに結合する。
本発明のコンジュゲートの好ましい実施形態では、コンジュゲートの２個以上のモジュールが、単一のタンパク質又はペプチド、すなわち細胞標的化／取り込み機能性（モジュール（ａ））とＥＲ輸送機能性（モジュール（ｂ））とを含むタンパク質若しくはペプチド、細胞標的化／取り込み機能性（モジュール（ａ））とＥＲからサイトゾルへの転位機能性（モジュール（ｃ））とを含むタンパク質若しくはペプチド、ＥＲ輸送機能性（モジュール（ｂ））とＥＲからサイトゾルへの転位機能性（モジュール（ｃ））とを含むタンパク質若しくはペプチド、又は細胞標的化／取り込み機能性（モジュール（ａ））とＥＲ輸送機能性（モジュール（ｂ））とＥＲからサイトゾルへの転位機能性（モジュール（ｃ））とを含むタンパク質若しくはペプチド内に含まれ得る、又は含有され得る。これらの実施形態内では、２つ以上のモジュールが任意の配置、組合せ又は化学量論で連続したタンパク質又はペプチドとして互いに結合する。
好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）、モジュール（ｃ）及び化合物（ｄ）は、以下の配置又は組合せのうちの１つで互いに結合する：（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）；（ｂ）、（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）；（ｂ）、（ｃ）、（ａ）及び（ｄ）;（ｃ）、（ｂ）、（ａ）及び（ｄ）；（ａ）、（ｃ）、（ｂ）及び（ｄ）；（ｃ）、（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｂ）及び（ａ）；（ｄ）、（ｃ）、（ｂ）及び（ａ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｃ）及び（ａ）；（ｄ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ａ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ａ）；（ｃ）、（ｂ）、（ｄ）及び（ａ）；（ｃ）、（ｄ）、（ａ）及び（ｂ）；（ｄ）、（ｃ）、（ａ）及び（ｂ）；（ａ）、（ｄ）、（ｃ）及び（ｂ）；（ｄ）、（ａ）、（ｃ）及び（ｂ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｂ）；（ｃ）、（ａ）、（ｄ）及び（ｂ）；（ｂ）、（ｄ）、（ａ）及び（ｃ）；（ｄ）、（ｂ）、（ａ）及び（ｃ）；（ａ）、（ｄ）、（ｂ）及び（ｃ）；（ｄ）、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）及び（ｃ）；又は（ｂ）、（ａ）、（ｄ）及び（ｃ）（ここでそれぞれの配置又は組合せにおいて、少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）、少なくとも１つのモジュール（ｃ）及び少なくとも１つの化合物（ｄ）が存在する）。モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）のそれぞれの示される順番は、それぞれモジュールと化合物との間の結合を表す。このため、配置（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）では、（ａ）が（ｂ）と結合し、（ｂ）が（ｃ）と結合し、（ｃ）が（ｄ）と結合する。この文脈での「結合した」という用語は、上で定義され、以下でより具体的に教示されるような意味を有し、例えば共有結合、非共有結合及びリンカー分子を介した結合を包含する。
本発明のコンジュゲートのモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）、モジュール（ｃ）及び化合物（ｄ）が以下の配置又は組合せのうちの１つで互いに結合するのが特に好ましい：（ａ）ｘ、（ｂ）ｙ、（ｃ）ｚ及び（ｄ）ｎ；（ｂ）ｙ、（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ及び（ｄ）ｎ；（ｂ）ｙ、（ｃ）ｚ、（ａ）ｘ及び（ｄ）ｎ；（ｃ）ｚ、（ｂ）ｙ、（ａ）ｘ及び（ｄ）ｎ；（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｂ）ｙ及び（ｄ）ｎ；（ｃ）ｚ、（ａ）ｘ、（ｂ）ｙ及び（ｄ）ｎ；（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ、（ｂ）ｙ及び（ａ）ｘ；（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ、（ｂ）ｙ及び（ａ）ｘ；（ｂ）ｙ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ａ）ｘ；（ｄ）ｎ、（ｂ）ｙ、（ｃ）ｚ及び（ａ）ｘ；（ｂ）ｙ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ａ）ｘ；（ｃ）ｚ、（ｂ）ｙ、（ｄ）ｎ及び（ａ）ｘ；（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ、（ａ）ｘ及び（ｂ）ｙ；（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ、（ａ）ｘ及び（ｂ）ｙ；（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ；（ｄ）ｎ、（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ；（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ；（ｃ）ｚ、（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ；（ｂ）ｙ、（ｄ）ｎ、（ａ）ｘ及び（ｃ）ｚ；（ｄ）ｎ、（ｂ）ｙ、（ａ）ｘ及び（ｃ）ｚ；（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｂ）ｙ及び（ｃ）ｚ；（ｄ）ｎ、（ａ）ｘ、（ｂ）ｙ及び（ｃ）ｚ；（ａ）ｘ、（ｂ）ｙ、（ｄ）ｎ及び（ｃ）ｚ；又は（ｂ）ｙ、（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ及び（ｃ）ｚ（ここでｘは１〜５、すなわち１、２、３、４又は５、好ましくは１の整数であり、ｙは１〜５、すなわち１、２、３、４又は５、好ましくは１の整数であり、ｚは１〜５、すなわち１、２、３、４又は５、好ましくは１の整数であり、ｎは１〜５０、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０、より好ましくは２、３、４又は５の整数である）。
２つ以上の化合物（ｄ）を含む本発明によるコンジュゲートは、より多くの化合物（ｄ）を細胞に送達することができ、このためモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びにただ１つの化合物（ｄ）を含む本発明によるコンジュゲートと比較して化合物（ｄ）を送達する効率を増大させることができる。好ましくは、本発明によるコンジュゲートは、少なくとも２個〜５０個の化合物（ｄ）を含む。より好ましくは本発明によるコンジュゲートは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個又は５０個の化合物（ｄ）を含む。より好ましくは、本発明によるコンジュゲートは、少なくとも２個、３個、４個又は５個の化合物（ｄ）を含む。好ましくは、２つ以上の化合物（ｄ）を含むコンジュゲートは、同じか又は異なる少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個又は５０個の化合物（ｄ）を含む。
好ましい実施形態では、２つ以上の化合物（ｄ）を含むコンジュゲートは、少なくとも２個の同じ化合物（ｄ）を含む。好ましくは、少なくとも２個の同じ化合物（ｄ）は、２個の核酸、２個のタンパク質、２個のペプチド、２個の抗原、２個の酵素、２個の小分子、２個の治療用分子、２個の診断用分子及び２個の画像化分子からなる群から選択される。好ましくは、少なくとも２個の同じ化合物（ｄ）は、少なくとも２個の同じ核酸を含む。より好ましくは、少なくとも２個の同じ化合物（ｄ）は、少なくとも２個の同じｓｉＲＮＡを含む。
別の好ましい実施形態では、２つ以上の化合物（ｄ）を含むコンジュゲートは、少なくとも２個の異なる化合物（ｄ）を含む。好ましくは、少なくとも２個の異なる化合物（ｄ）は、核酸、タンパク質、ペプチド、抗原、酵素、小分子、治療用分子、診断用分子及び画像化分子からなる群から選択される第１の化合物（ｄ）と、核酸、タンパク質、ペプチド、抗原、酵素、小分子、治療用分子、診断用分子及び画像化分子からなる群から選択される第２の化合物（ｄ）とを含む（ここで第１の化合物（ｄ）及び第２の化合物（ｄ）は互いに異なっている）。好ましい実施形態では、少なくとも２個の異なる化合物（ｄ）は、少なくとも２個の異なる核酸を含む。好ましくは、少なくとも２個の異なる化合物（ｄ）は、同じ標的に指向性を有する少なくとも２個の異なるｓｉＲＮＡを含む。別の好ましい実施形態では、少なくとも２個の異なる化合物（ｄ）は、少なくとも２個の異なる標的に指向性を有する少なくとも２個の異なるｓｉＲＮＡを含む。別の好ましい実施形態では、少なくとも２個の異なる化合物（ｄ）は、少なくとも１つの核酸と、少なくとも１つのタンパク質又はペプチドとを含む。好ましくは、少なくとも１つの核酸がｓｉＲＮＡであり、少なくとも１つのタンパク質又はペプチドがＲＩＳＣタンパク質又はペプチドである。
モジュール（ｂ）（単数又は複数）がただ１つの他のモジュール又は化合物と結合するように該配置内に位置している本発明のコンジュゲートが、コンジュゲートの他のモジュール及び／又は化合物（複数も可）による立体障害又は他の不要な相互作用を避ける又は少なくとも最小限に抑えることが好ましい。このため、本発明のコンジュゲートの好ましい実施形態は、（ｃ）、（ｄ）、（ａ）及び（ｂ）；（ｄ）、（ｃ）、（ａ）及び（ｂ）；（ａ）、（ｄ）、（ｃ）及び（ｂ）；（ｄ）、（ａ）、（ｃ）及び（ｂ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｂ）；並びに（ｃ）、（ａ）、（ｄ）及び（ｂ）であり、ここでそれぞれの実施形態には少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）及び少なくとも１つのモジュール（ｃ）並びに少なくとも１つの化合物（ｄ）が存在する。指定した位置におけるモジュール（ｂ）の存在には、モジュール（ｂ）が非結合型であり、他のモジュール（ａ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）による障害を受けず、そのため立体障害又は他の不要な相互作用を避ける又は少なくとも最小限に抑えることができるという利点がある。モジュール（ｂ）がオリゴペプチドを含むか、それらから本質的になるか又はそれらからなる場合、このようなオリゴペプチドのＣ末端が非結合型であり、更なるモジュール、化合物（複数も可）又はリンカー分子との任意の結合（共有結合又は非共有結合）がこのようなオリゴペプチドのＮ末端で又はＮ末端付近で起こることが好ましい。
本発明のコンジュゲートの特に（Particulary）好ましい実施形態は以下の配置である：（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ、（ａ）ｘ及び（ｂ）ｙ；（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ、（ａ）ｘ及び（ｂ）ｙ；（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ；（ｄ）ｎ、（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ；（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ；並びに（ｃ）ｚ、（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここでｘは１〜５、すなわち１、２、３、４又は５、好ましくは１の整数であり、ｙは１〜５、すなわち１、２、３、４又は５、好ましくは１の整数であり、ｚは１〜５、すなわち１、２、３、４又は５、好ましくは１の整数であり、ｎは１〜１０、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０、好ましくは３の整数である）。したがって、ｘが１であり、ｙが１であり、ｚが１であり、ｎが１〜５０、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０、より好ましくは２、３、４又は５の整数である（is is）のが特に好ましい。
化合物（ｄ）（単数又は複数）が第２の位置又は第３の位置に位置しており、モジュール（ｂ）（単数又は複数）がただ１つの他のモジュール又は化合物と結合するように該配置内に位置している、例えば該配置の最後の位置に位置している（すなわちモジュール（ｂ）（単数又は複数）のＣ末端が非結合型である）本発明のコンジュゲートが好ましい。したがって、本発明のコンジュゲートの特に好ましい実施形態は、（ｃ）、（ｄ）、（ａ）及び（ｂ）；（ａ）、（ｄ）、（ｃ）及び（ｂ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｂ）；並びに（ｃ）、（ａ）、（ｄ）及び（ｂ）であり、ここでそれぞれの実施形態には少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）、少なくとも１つのモジュール（ｃ）及び少なくとも１つの化合物（ｄ）が存在する。第２の位置又は第３の位置における化合物（ｄ）の存在には、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）の生物学的作用に対する化合物（ｄ）による立体障害を避けることにより化合物（ｄ）の細胞への、及び更には細胞内への侵入が容易になるという利点がある。また、モジュール（ｂ）は非結合型であり、他のモジュール（ａ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）による障害を受けず、そのため立体障害及び他の不要な相互作用を避ける又は少なくとも最小限に抑えることができる。
本発明のコンジュゲートの特に（Particulary）好ましい実施形態は、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ、（ａ）ｘ及び（ｂ）ｙ；（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ；（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ；並びに（ｃ）ｚ、（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙであり、ここでｘは１〜５、すなわち１、２、３、４又は５、好ましくは１の整数であり、ｙは１〜５、すなわち１、２、３、４又は５、好ましくは１の整数であり、ｚは１〜５、すなわち１、２、３、４又は５、好ましくは１の整数であり、ｎは１〜５０、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０、より好ましくは２、３、４又は５の整数である。したがって、ｘが１であり、ｙが１であり、ｚが１であり、ｎが１〜５０、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０、より好ましくは２、３、４又は５の整数である（is is）のが特に好ましい。
モジュール（ｂ）が末端に、好ましくは最後の位置に配置され、そのＣ末端が非結合型であり、化合物（ｄ）が第２の位置又は第３の位置に位置する、本発明のコンジュゲートの最も好ましい実施形態では、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）の配置、並びにモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）の数は以下の通りである：
（ｉ）（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここでｘは１の整数であり、ｚは１の整数であり、ｎは１の整数であり、ｙは１の整数である）、
（ｉｉ）（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここでｘは１の整数であり、ｚは１の整数であり、ｎは２の整数であり、ｙは１の整数である）、
（ｉｉｉ）（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここでｘは１の整数であり、ｚは１の整数であり、ｎは３の整数であり、ｙは１の整数である）、
（ｉｖ）（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここでｘは１の整数であり、ｎは１の整数であり、ｚは１の整数であり、ｙは１の整数である）、
（ｖ）（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここでｘは１の整数であり、ｎは２の整数であり、ｚは１の整数であり、ｙは１の整数である）、又は
（ｖｉ）（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここでｘは１の整数であり、ｎは３の整数であり、ｚは１の整数であり、ｙは１の整数である）。
好ましくは、本発明のコンジュゲートの少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）、少なくとも１つのモジュール（ｃ）及び少なくとも１つの化合物（ｄ）（任意の順番、組合せ又は化学量論で互いに配置されている）は、共有結合により互いに結合している、非共有結合により互いに結合している、少なくとも１つのアダプタ分子を介して互いに結合している、かつ／又は少なくとも１つのアダプタ分子を任意で含む少なくとも１つのリンカー分子を介して互いに結合している。
「共有結合」という用語は、結合対の各原子が１つの電子を提供し、化学結合において電子対を形成するタイプの化学結合を意味する。
「非共有結合」という用語は、典型的には巨大分子間における、電子対の共有を伴わないが電磁相互作用のより多くの分散した変動（more dispersed variations）を伴うタイプの化学結合を意味する。
「リンカー分子」という用語は、本発明との関連では、２つの分子又は化合物を互いに結合又はコンジュゲートさせることができる分子を表す。この結合又はコンジュゲーションは共有結合により達成することができる。このため、上述の特徴を有する任意の分子を用いて、本発明のコンジュゲートのモジュール及び化合物を互いに結合することができる。好ましくは、リンカー分子は、モジュールと化合物との間の立体障害を避けるために様々なモジュールと化合物（複数も可）とを空間的に分離するのに役立つ。このような立体障害は、モジュールが結合又は相互作用し、本明細書で概説されるような各機能を発揮しなければならない、細胞構造、例えばタンパク質、脂質又は炭水化物鎖への接近及び／又はこれらとの相互作用を阻害する可能性がある。
「アダプタ分子」という用語は、本発明との関連では、例えばモジュール（例えばモジュール（ａ））と化合物（ｄ）との間で間接的かつ非共有的な結合を形成する分子を指す。例えば、アダプタ分子（モジュール（ａ）と共有結合している）を用いて、モジュール（ａ）と化合物（ｄ）とを間接的かつ非共有的に結合することができる（アダプタ分子が化合物（ｄ）と非共有結合を形成する）。このため、アダプタ分子は、化合物（ｄ）をモジュール（ａ）から一定の距離に維持するスペーサーとしても機能する。間接的かつ非共有的な結合はイオン（静電）相互作用又は疎水性相互作用をベースにしている。
モジュール（ａ）と化合物（ｄ）とのコンジュゲーションに関して、様々なタイプの結合を以下の記載で例示する。この例示は任意のモジュール−モジュール、任意のモジュール−化合物（ｄ）、又は任意の化合物（ｄ）−化合物（ｄ）のコンジュゲーションに適用可能であることを理解されたい。例えば、本発明のコンジュゲートのモジュール（ａ）を、非共有結合により化合物（ｄ）と直接結合することができる。また本発明のコンジュゲートのモジュール（ａ）を、共有結合により化合物（ｄ）と直接結合することができる。本発明のコンジュゲートのモジュール（ａ）を、モジュール（ａ）及び化合物（ｄ）と共有結合を形成するリンカー分子を介して、化合物（ｄ）と間接的かつ共有的に更に結合することができる。また、化合物（ｄ）を、アダプタ分子を介してモジュール（ａ）と間接的に結合することができ、アダプタ分子と化合物（ｄ）とが非共有結合により互いに連結し、アダプタ分子はモジュール（ａ）と共有結合する。さらに、化合物（ｄ）を、アダプタ分子及びリンカー分子を介してモジュール（ａ）と間接的に結合することができ、アダプタ分子と化合物（ｄ）とが非共有結合により互いに連結し、アダプタ分子がモジュール（ａ）と隣接するモジュール（例えばモジュール（ｃ）又はモジュール（ｂ））とを結合するリンカー分子と共有結合する。
本発明のコンジュゲートのモジュール及び化合物を、様々な結合タイプにより互いに結合することができる。このため、本発明のコンジュゲートは、必ずしも同じ結合タイプにより互いに結合したモジュール及び化合物を含む訳ではない。例えば、共有結合を、非共有結合と共に、及び／又はリンカー分子若しくはアダプタ分子を介した共有結合と共に使用することができる。所望の標的細胞送達戦略に応じて、特異的な共有結合及び／又は非共有結合と共に、アダプタ分子及び／又はリンカー分子を用いて又は用いずに、コンジュゲートを設計することができる。このようにして、当業者は、異なる用途に有用な異なるタイプのコンジュゲートを作製することができる。
好ましくは、本発明によるコンジュゲートの少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）、少なくとも１つのモジュール（ｃ）及び少なくとも１つの化合物（ｄ）を、好ましくはジスルフィド結合、アミド結合、オキシム結合及び／又はヒドラゾン結合により、互いに共有結合する。
「ジスルフィド結合（"disulfide-linkage"（disulfide-bond））」という用語は、２つのチオール基のカップリングにより通常得られる化学結合を指す。該結合はＳＳ結合又はジスルフィド架橋とも呼ばれる。タンパク質におけるジスルフィド結合は、システイン残基のチオール基の間に形成される。
「アミド結合」（ペプチド結合）という用語は、或る分子のカルボキシル基が他の分子のアミン基と反応することにより水分子（Ｈ２Ｏ）が放出される場合に２つのタンパク質又はペプチド間に形成される化学結合を指す。
「オキシム結合」という用語は、グリオキシル酸（aglyoxylic）アルデヒド官能基を有するタンパク質又はペプチドと、アミノオキシ基で官能基化された（functionalized）タンパク質又はペプチドとのカップリングにより得られる化学結合を指す。オキシム結合は、アルデヒド又はケトンとヒドロキシルアミン又はアミノオキシで修飾された構成要素との反応により得られる。オキシム結合を用いて、全ての形態の分子、すなわち小分子、糖、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド等を一緒に結合することができる。これらの官能基が本発明のコンジュゲートの合成された構成要素に存在していてもよく、又は１つ若しくは両方の官能基を本発明のコンジュゲートの構成要素に導入してもよい。本発明のコンジュゲートを調製する好ましい方法では、アミノオキシ修飾が合成ペプチドに含まれ、ベンズアルデヒド官能基（function）がｓｉＲＮＡに結合する。
「ヒドラゾン結合（"hydrazone-linkage"（hydrazone-bond））」という用語は、平均３個〜６個のアリールアルデヒド基又はアシルヒドラジド基を含有するようにアミノ基で修飾された、タンパク質又はペプチドを互いに縮合させることにより得られる化学結合を指す。ヒドラゾン結合は、アルデヒド又はケトンと、ヒドラジン又はアシルヒドラジンで修飾した構成要素との反応により得られる。「アシルヒドラゾン結合」はアルデヒド又はケトンとアシルヒドラジンで修飾された構成要素との反応により得られる。市販の試薬キットが利用可能であり、本発明のコンジュゲートに使用される２つの生体分子をカップリング又は連結させる本発明の方法内において使用することができる。
４つの一般的に知られるタイプの非共有結合的な相互作用がある：水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用。これらを本発明のコンジュゲートに使用されるモジュール及び／又は化合物（複数も可）の相互作用のベースとすることができる。
好ましくは、本発明によるコンジュゲートの少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）、少なくとも１つのモジュール（ｃ）及び／又は少なくとも１つの化合物（ｄ）を、非共有結合、好ましくはイオン（静電）結合により及び／又は疎水性結合により互いに結合する。
「疎水性相互作用」（疎水性結合）という用語は、炭化水素（又は溶質中の脂溶性炭化水素様の基）が水性媒体中で分子間凝集物を形成する傾向に応じた相互作用を指す。
「イオン（静電）結合」（イオン結合又は静電結合）という用語は、或る原子が電子を失って陽イオンを形成し、他の原子が電子を受け取って陰イオンを形成する非共有結合を指す。生体系では、ほとんどの静電結合又は相互作用が、プロトン化した基と脱プロトン化した基との間、すなわちタンパク質のカルボン酸基又はＤＮＡ分子若しくはＲＮＡ分子におけるリン酸基のいずれかと相互作用するリジン側鎖アミノ基又はアルギニン側鎖アミノ基に存在する。
本発明による特に好ましいリンカー分子は、ペプチド、修飾ペプチド、アミノ酸残基、修飾アミノ酸残基、又は親水性の炭水化物鎖、好ましくは１個〜２０個の反復単位、すなわち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個の好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ここで１個〜２０個、すなわち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個のエチレングリコール単位が互いに連結している）を有するポリジオール鎖である。これらのリンカー分子が、少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）、少なくとも１つのモジュール（ｃ）及び／又は少なくとも１つの化合物（ｄ）と共有結合により、好ましくはアミド結合若しくはジスルフィド結合により互いに結合する。
上記リンカー分子を互いに組み合わせることもでき、例えば１）少なくとも１つのモジュール（ａ）を少なくとも１つのモジュール（ｂ）若しくは少なくとも１つのモジュール（ｃ）と；２）少なくとも１つのモジュール（ｂ）を少なくとも１つのモジュール（ａ）若しくは少なくとも１つのモジュール（ｃ）と；３）少なくとも１つのモジュール（ａ）を少なくとも１つのモジュール（ｂ）及び少なくとも１つのモジュール（ｃ）と；又は４）少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）及び／若しくは少なくとも１つのモジュール（ｃ）を少なくとも１つの化合物（ｄ）と共有結合するために、ペプチドリンカーを修飾アミノ酸残基リンカーと組み合わせることができるか、又は修飾アミノ酸残基リンカーを修飾ペプチドリンカーと組み合わせることができる。好ましくは、少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）、又は少なくとも１つのモジュール（ｃ）をアミド結合により共有結合する。好ましくは、少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）及び／又は少なくとも１つのモジュール（ｃ）を、ジスルフィド結合により少なくとも１つの化合物（ｄ）と共有結合する。
本発明による「ペプチドリンカー」という用語は、自然に存在し得るアミノ酸残基、又は自然に存在するアミノ酸残基の誘導体（好ましくはペプチド結合又はジスルフィド結合により結合する）の鎖を意味する。
好ましくは、本発明のペプチドリンカーは、２個〜５０個若しくは２個〜３０個のアミノ酸残基若しくはアミノ酸残基誘導体、好ましくは２個〜２０個若しくは２個〜１５個のアミノ酸残基若しくはアミノ酸残基誘導体、より好ましくは２個〜１０個、２個〜５個、又は２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個のアミノ酸残基若しくはアミノ酸残基誘導体からなる。好ましくは、リンカー配列は柔軟（flexible）であり、そのためコンジュゲートの単一の固定した立体構造を保持しない。ペプチドリンカーを用いて、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を互いに離し、かつ／又はモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を化合物（ｄ）から離すことができる。例えば、第１のペプチドリンカーがモジュール（ａ）と化合物（ｄ）との間に位置し、第２のペプチドリンカーが化合物（ｄ）とモジュール（ｃ）との間に位置し、それにより化合物（ｄ）の及び／又は化合物（ｄ）周辺の分子の柔軟性（flexiblity）を与えるように、モジュール（ａ）、第１のペプチドリンカー、化合物（ｄ）、第２のペプチドリンカー、モジュール（ｃ）及びモジュール（ｂ）という正確な配置を有する本発明のコンジュゲートに２つのペプチドリンカーを位置付けることができる。当業者は、必要に応じてコンジュゲート内に、コンジュゲートのモジュール、化合物及び使用目的に特異的なペプチドリンカー（単数又は複数）を、過度の実験を行うことなく位置付けることができる。ペプチドリンカーの長さを、化合物を含むコンジュゲートの生体活性を最適化するように選択し、過度の実験を行うことなく経験的に決定することができる。リンカーペプチドは、モジュール及び化合物の官能基の障害を除去し、立体的な又は不要な相互作用を避けるのに十分長く、かつ十分柔軟であるものとする。ペプチドリンカーの例としては、GGGGS（配列番号１）、GKSSGSGSESKS（配列番号２）、GSTSGSGKSSEGKG（配列番号３）、GSTSGSGKSSEGSGSTKG（配列番号４）、GSTSGSGKPGSGEGSTKG（配列番号５）、EGKSSGSGSESKEF（配列番号６）及びSGSGSG（（ＳＧ）３、配列番号７）が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適なリンカーペプチドは、文献［１８〜２０］及び米国特許第４，７５１，１８０号、米国特許第４，９３５，２３３号等でこれまでに説明されているようなものである。
本発明による「修飾ペプチドリンカー」という用語は、自然に存在し得るアミノ酸残基、又は更に化学修飾した、自然に存在するアミノ酸残基の誘導体（好ましくはペプチド結合により結合する）の鎖を意味する。好ましい修飾ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と共有結合したペプチドである。このような修飾ペプチドリンカーは主に、合成を容易にする短いポリエチレングリコール（polyethelenglycol）（ＰＥＧ）反復からなり得る。ＰＥＧはペプチド系治療薬の送達及び安定化に関して既に認可されており、非毒性である。例えば、Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミド−ｄＰＥＧ１２−酸を、合成を単純化し、溶解性を改善し、合成ペプチド内の様々な機能ドメインと連結するリンカーの柔軟性を確保するために幾つかのアミノ酸残基の反復を置き換えるスペーサーとして利用することができる。
「アミノ酸残基リンカー」という用語は、自然に存在するアミノ酸及びアミノ酸誘導体を包含する。好ましくは、アミノ酸リンカーのアミノ酸は、低分子アミノ酸又は疎水性の非芳香族アミノ酸である。本発明との関連では、低分子アミノ酸は好ましくは、分子量が１２５ダルトン未満のアミノ酸である。好ましくは、低分子アミノ酸は、グリシン、アラニン、セリン、システイン、スレオニン、バリンのアミノ酸、及びその誘導体からなる群から選択される。本発明との関連では、疎水性の非芳香族アミノ酸は好ましくは、カイト・ドーリットル疎水性親水性指数が０．５を超え、より好ましくは１．０を超え、更に好ましくは１．５を超え、かつ芳香族ではない任意のアミノ酸である。好ましくは、本発明との関連では疎水性の非芳香族アミノ酸は、アラニン（カイト・ドーリットル疎水性親水性指数１．８）、メチオニン（カイト・ドーリットル疎水性親水性指数１．９）、イソロイシン（カイト・ドーリットル疎水性親水性指数４．５）、ロイシン（カイト・ドーリットル疎水性親水性指数３．８）、バリン（カイト・ドーリットル疎水性親水性指数４．２）のアミノ酸、及び上に規定のようなカイト・ドーリットル疎水性親水性指数を有するそれらの誘導体からなる群から選択される。
「修飾アミノ酸残基リンカー」という用語は、化学修飾した自然に存在するアミノ酸及びアミノ酸誘導体を包含する。例えば、修飾アミノ酸は、単一のアミノ酸をアシル化剤又はスルホン化剤（アミノ酸に存在する遊離アミノ部分と反応し、それぞれアミド類又はスルホンアミド類を形成する）と反応させることにより調製される。好ましい修飾アミノ酸リンカーは、アセチル化又はスルホン化したアミノ酸である。修飾アミノ酸リンカーとして活性化システイン（Ｃ（ＮＰｙＳ））の使用も好ましい。
アダプタ分子は、好ましくはイオン（静電）相互作用又は疎水性相互作用により、例えばモジュール（例えばモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）又はモジュール（ｃ）、好ましくはモジュール（ａ））と化合物（ｄ）との間に間接的かつ非共有的な結合を形成する。
本発明のコンジュゲートの好ましい実施形態では、アダプタ分子は、例えば疎水性相互作用により、化合物（ｄ）との非共有結合を形成することでモジュール（ａ）と化合物（ｄ）とを間接的かつ非共有的に結合し、ここでアダプタ分子はモジュール（ａ）と共有結合する。また、モジュール（ａ）はモジュール（ｃ）と共有結合し、モジュール（ｃ）はモジュール（ｂ）と共有結合する。
本発明のコンジュゲートの別の好ましい実施形態では、アダプタ分子はイオン（例えば静電）相互作用又は疎水性相互作用により化合物（ｄ）と相互作用し、ここでアダプタ分子はモジュール（ａ）とモジュール（ｃ）とを連結させるリンカー分子と共有結合する。また、モジュール（ｃ）はモジュール（ｂ）と共有結合する。結果として、モジュール（ａ）及び化合物（ｄ）はアダプタ分子を介して互いに間接的かつ非共有的に結合する。このため、本発明のコンジュゲートは好ましくは、モジュール（ａ）とモジュール（ｃ）との間にリンカー分子を含み、ここでリンカー分子は化合物（ｄ）と非共有結合するアダプタ分子と共有結合する。好ましくは、アダプタ分子はリンカー分子の側鎖から分岐する。
一般的に、１つ又は複数のアダプタ分子を用いて、例えば化合物（ｄ）とモジュール、例えばモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）又はモジュール（ｃ）、好ましくはモジュール（ａ）とを互いに間接的かつ非共有的に結合することができる。本発明のコンジュゲートの好ましい実施形態では、２つ、３つ、４つ又は５つのアダプタ分子を用いて、化合物（ｄ）とモジュール、例えばモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）又はモジュール（ｃ）、好ましくはモジュール（ａ）とを互いに間接的かつ非共有的に結合する。より好ましくは、本発明のコンジュゲートにおいて２つのアダプタ分子を用いて、化合物（ｄ）とモジュール、例えばモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）又はモジュール（ｃ）、好ましくはモジュール（ａ）とを互いに間接的かつ非共有的に結合する。
例えば好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、イオン（静電）相互作用及び／又は疎水性相互作用により化合物（ｄ）とそれぞれ相互作用する２つのアダプタ分子を含み、ここで２つのアダプタ分子はそれぞれコンジュゲートのモジュール（ａ）と共有結合する。また、モジュール（ａ）はモジュール（ｃ）と共有結合し、モジュール（ｃ）はモジュール（ｂ）と共有結合する。このため結果として、モジュール（ａ）と化合物（ｄ）とが２つのアダプタ分子を介して互いに間接的かつ非共有的に結合する。好ましくは、２つのアダプタ分子は同じである。本発明のこの好ましい実施形態の得られるコンジュゲートは、送達ビヒクル（すなわち、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ））に対する化合物（ｄ）の比が増大している。
好ましくは、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を用いずに、アダプタ分子と共有結合させ、それにより官能基に干渉するリスクを最小限に抑える。
好ましいアダプタ分子は、ＲＮＡ結合タンパク質若しくは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合タンパク質（ＤＲＢＰ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）結合タンパク質（ＤＤＢＰ）等のタンパク質の核酸結合ドメイン、一本鎖抗体、又は表面受容体のリガンド結合ドメインである。モジュールと化合物とを互いに間接的かつ非共有的に結合又はコンジュゲートさせるために本発明のコンジュゲートに使用することができるより好ましいアダプタ分子は、二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（ＤＲＢＰ）である。ＤＲＢＰを様々な機能のために本発明で使用することができる。ＤＲＢＰは化合物（ｄ）をモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及び／又はモジュール（ｃ）（複数も可）から一定の距離に保つスペーサーとして機能することができる。ＤＲＢＰは化合物（ｄ）とモジュール、例えばモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）又はモジュール（ｃ）、好ましくはモジュール（ａ）との間に安定した間接的かつ非共有的な結合を形成することもできる。ＤＲＢＰはモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を用いて送達される化合物（ｄ）のアニオン電荷を中和又は低減させるのにも役立ち得る。ＤＲＢＰは、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）のカチオン電荷がエンドサイトーシス事象により細胞に侵入するのに十分となるように、化合物（ｄ）のアニオン電荷を十分に低減させることにより本発明のコンジュゲートの取り込みを更に促進させることができる。
化合物（ｄ）が核酸である場合、ＤＲＢＰアダプタ（複数も可）又はＤＤＢＰアダプタ（複数も可）の使用が好ましい。化合物（ｄ）が二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である場合、本発明のコンジュゲートはＤＲＢＰアダプタ（複数も可）を含む。化合物（ｄ）が二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）である場合、本発明のコンジュゲートはＤＤＢＰアダプタ（複数も可）を含む。
本発明のコンジュゲートにおいてアダプタ分子として利用することができる好ましいｄｓＲＮＡ結合タンパク質（ＤＲＢＰ）及び括弧内のそのアクセッション番号には、ＰＫＲ（ＡＡＡ３６４０９、ＡＡＡ６１９２６、Ｑ０３９６３）、ＴＲＢＰ（Ｐ９７４７３、ＡＡＡ３６７６５）、ＰＡＣＴ（ＡＡＣ２５６７２、ＡＡＡ４９９４７、ＮＰ６０９６４６）、スタウフェン（Staufen）（ＡＡＤ１７５３１、ＡＡＦ９８１１９、ＡＡＤ１７５２９、Ｐ２５１５９）、ＮＦＡＲ１（ＡＦ１６７５６９）、ＮＦＡＲ２（ＡＦ１６７５７０、ＡＡＦ３１４４６、ＡＡＣ７１０５２、ＡＡＡ１９９６０、ＡＡＡ１９９６１、ＡＡＧ２２８５９）、ＳＰＮＲ（ＡＡＫ２０８３２、ＡＡＦ５９９２４、Ａ５７２８４）、ＲＨＡ（ＣＡＡ７１６６８、ＡＡＣ０５７２５、ＡＡＦ５７２９７）、ＮＲＥＢＰ（ＡＡＫ０７６９２、ＡＡＦ２３１２０、ＡＡＦ５４４０９、Ｔ３３８５６）、カナダプチン（kanadaptin）（ＡＡＫ２９１７７、ＡＡＢ８８１９１、ＡＡＦ５５５８２、ＮＰ４９９１７２、ＮＰ１９８７００、ＢＡＢ１９３５４）、ＨＹＬＬ（ＮＰ５６３８５０）、ｈｙｐｏｎａｓｔｉｃ ｌｅａｖｅｓ（ＣＡＣ０５６５９、ＢＡＢ００６４１）、ＡＤＡＲ１（ＡＡＢ９７１１８、Ｐ５５２６６、ＡＡＫ１６１０２、ＡＡＢ５１６８７、ＡＦ０５１２７５）、ＡＤＡＲ２（Ｐ７８５６３、Ｐ５１４００、ＡＡＫ１７１０２、ＡＡＦ６３７０２）、ＡＤＡＲ３（ＡＡＦ７８０９４、ＡＡＢ４１８６２、ＡＡＦ７６８９４）、ＴＥＮＲ（ＸＰ０５９５９２、ＣＡＡ５９１６８）、ＲＮａｓｅＩＩＩ（ＡＡＦ８０５５８、ＡＡＦ５９１６９、Ｚ８１０７０、Ｑ０２５５５／Ｓ５５７８４、Ｐ０５７９７）、及びＤｉｃｅｒ（ＢＡＡ７８６９１、ＡＦ４０８−４０１、ＡＡＦ５６０５６、Ｓ４４８４９、ＡＡＦ０３５３４、Ｑ９８８４）、ＲＤＥ−４（ＡＹ０７１９２６）、ＦＬＪ２０３９９（ＮＰ０６０２７３、ＢＡＢ２６２６０）、ＣＧ１４３４（ＡＡＦ４８３６０、ＥＡＡ１２０６５、ＣＡＡ２１６６２）、ＣＧ１３１３９（ＸＰ０５９２０８、ＸＰ１４３４１６、ＸＰ１１０４５０、ＡＡＦ５２９２６、ＥＥＡ１４８２４）、ＤＧＣＲＫ６（ＢＡＢ８３０３２、ＸＰ１１０１６７）、ＣＧ１８００（ＡＡＦ５７１７５、ＥＡＡ０８０３９）、ＦＬＪ２００３６（ＡＡＨ２２２７０、ＸＰ１３４１５９）、ＭＲＰ−Ｌ４５（ＢＡＢ１４２３４、ＸＰ１２９８９３）、ＣＧ２１０９（ＡＡＦ５２０２５）、ＣＧ１２４９３（ＮＰ６４７９２７）、ＣＧ１０６３０（ＡＡＦ５０７７７）、ＣＧ１７６８６（ＡＡＤ５０５０２）、Ｔ２２Ａ３．５（ＣＡＢ０３３８４）及びアクセッション番号ＥＡＡ１４３０８が含まれる。このようなＤＲＢＰの配列は当該技術分野で既知であり、それらの対応するアクセッション番号から得ることができる。
本発明に使用されるＤＲＢＰ配列は、FFMEELNTYRQKQGVVLKYQELPNSGPPHDRRFTFQVIIDGREFPEGEGRSKKEAKNAAAKLAVEILNKE（配列番号８、［２１、２２］も参照されたい）である。この好ましいＤＲＢＰ配列は、完全ＤＲＢＰ配列ではなくｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ＤＲＢＤ）配列であり、ＰＫＲ（アクセッション番号ＡＡＡ３６４０９、ＡＡＡ６１９２６、Ｑ０３９６３）からの切断により得られる。
より好ましいアダプタ分子は、上述の自然に存在するＤＲＢＰそれぞれよりもｄｓＲＮＡとの結合能が低減し、そのため細胞における化合物の目的の生体活性に干渉しにくい野生型二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質の変異体（ＤＲＢＰ変異体）である。
本発明でより好ましいＤＲＢＰ変異体は、アミノ酸配列における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個又は１５０個までのアミノ酸変化（すなわち、置換、挿入、欠失、Ｎ末端切断及び／又はＣ末端切断）により、該ＤＲＢＰ変異体が誘導されるＤＲＢＰタンパク質と異なる。アミノ酸置換は保存的であっても又は非保存的であってもよい。本発明で好ましいＤＲＢＰ変異体は、該ＤＲＢＰ変異体が誘導されるＤＲＢＰタンパク質に対する或る特定の程度の配列同一性により代替的に又は付加的に特徴付けることができる。このため、本発明で好ましいＤＲＢＰ変異体は、それぞれの参照（すなわち野生型）ＤＲＢＰに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
また、ＤＲＢＰ変異体は、野生型ＤＲＢＰタンパク質の活性の少なくとも３０％程度の関連する生体活性を示す場合にのみ、本発明との関連ではＤＲＢＰ変異体とみなす。本発明との関連では、関連する「生体活性」は「結合活性」、すなわちＤＲＢＰ変異体が化合物と結合する能力である。当業者は、ＤＲＢＰ変異体が低減したｄｓＲＮＡ結合活性、すなわち野生型ＤＲＢＰタンパク質の活性の少なくとも３０％を有するかを容易に評価することができる。野生型ＤＲＢＰの結合活性と比較したＤＲＢＰ変異体の「結合活性」を求めるのに好適なアッセイ、例えば結合アッセイが当業者にとって既知である［２２、２３］。
本発明のコンジュゲートにおけるアダプタ分子として利用することができる好ましいｄｓＤＮＡ結合タンパク質（ＤＤＢＰ）は、以下の既知のＤＮＡ結合モチーフのうちの１つを含む任意のタンパク質又はタンパク質ドメインである：ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフ、亜鉛フィンガーモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、ウィングドヘリックス（ターンヘリックス）モチーフ、ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフ又はＨＭＧ−ボックスモチーフ。特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、ＨＭＧＢ１／２（高移動度群ボックス１タンパク質及び高移動度群ボックス２タンパク質、それぞれＧｅｎｅＩＤ ３１４６及び３１４８）、ｃｒｐ（ＧｅｎｅＩＤ ９４７８６７）、Ｅｇｒ１（ＧｅｎｅＩＤ １９５８）、Ｊｕｎ（ＧｅｎｅＩＤ ３７２５）、ＦＯＸＡ１（フォークヘッドボックスＡ１、ＧｅｎｅＩＤ ３１６９）、ＥＴＳ１（ＧｅｎｅＩＤ ２１１３）、Ｔｗｉｓｔ１（ＧｅｎｅＩＤ ２２１６０）、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＣ（ヒストンクラスター２、ＧｅｎｅＩＤ ８３３８）等からなる群から選択されるＤＤＢＰを含む。
本発明のコンジュゲートのモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）、モジュール（ｃ）及び化合物（ｄ）が以下の配置又は組合せを有し、かつ以下の結合タイプを含むのが特に好ましい：
（ｉ）（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎが（ｂ）ｙと共有結合する）、
（ｉｉ）（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎが（ｂ）ｙと非共有結合する）、
（ｉｉｉ）（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘが（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｂ）ｙと共有結合する）、
（ｉｖ）（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘが（ｄ）ｎと非共有結合し、（ｄ）ｎが（ｃ）ｚと非共有結合し、（ｃ）ｚが（ｂ）ｙと共有結合する）、
（ｖ）（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する）、
（ｖｉ）（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎが（ｂ）ｙと非共有結合する）、
（ｖｉｉ）（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する）、
（ｖｉｉｉ）（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘが（ｄ）ｎと非共有結合し、（ｄ）ｎが（ｃ）ｚと非共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する）、又は
（ｉｘ）（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘが（ａ）ｘと共有結合するアダプタ分子を介して（ｄ）ｎと非共有結合し、（ｄ）ｎが（ｃ）ｚと共有結合するアダプタ分子を介して（ｃ）ｚと非共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する）
（ここで、
ｘは１〜５、好ましくは１の整数であり、
ｙは１〜５、好ましくは１の整数であり、
ｚは１〜５、好ましくは１の整数であり、
ｎは１〜５０、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の整数である）。
より好ましい実施形態に関して上記又は下記で具体的に示される結合以外には、それぞれのモジュールの間に他の結合、好ましくは共有結合が存在しないことが好ましい。
このため、末端位置に、好ましくは最後の（すなわちＣ末端）位置にモジュール（ｂ）を有し、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）と化合物（ｄ）とが互いに完全に共有結合するか、又は互いに部分的に共有結合する本発明によるコンジュゲート、例えばコンジュゲート：（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎが（ｂ）ｙと共有結合する）、又はコンジュゲート：（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘは（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚは（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎは（ｂ）ｙと非共有結合する）が特に好ましい。これらの例では、モジュール（ｂ）は、他のモジュール（ａ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）による障害を受けない。モジュール（ｂ）は他のモジュールの結合によって伸長してもいない。このため立体障害又は他の不要な相互作用を避ける又は少なくとも最小限に抑えることができる。
ｉｎ ｖｉｖｏでの適用では、Ｃ末端位置にモジュール（ｂ）を含み、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）が互いに完全に共有結合する、及び／又はリンカー分子を介して互いに共有結合するコンジュゲート、例えばコンジュゲート：（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘは（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚは（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎは（ｂ）ｙと共有結合する）、又はコンジュゲート：（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘはリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚはリンカー分子を介して（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎはリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する）、又はコンジュゲート：（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘは（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎは（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚは（ｂ）ｙと共有結合する）を使用するのが好ましい。これらの例示的なコンジュゲートは、互いに非共有的にのみ結合した又は部分的に非共有的に結合したモジュール及び化合物を含むコンジュゲートと比較してより安定であり、このためｉｎ ｖｉｖｏでの適用により好ましい。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの適用では、例えば細胞培養物において、Ｃ末端位置にモジュール（ｂ）を含み、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）が一部だけ共有結合したコンジュゲート、例えばコンジュゲート：（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘは（ｄ）ｎと非共有結合し、（ｄ）ｎは（ｃ）ｚと非共有結合し、（ｃ）ｚはリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する）を使用するのが好ましい。この例示的なコンジュゲートはあまり複雑ではなく、合成するのがより容易であるため、主要な試験システムとしてのｉｎ ｖｉｔｒｏでの適用により好ましい。この例示的なコンジュゲートにおける核酸化合物は、細胞におけるその生体活性に関して化合物分子のライブラリを試験するためにより容易に交換することもできる。このため、本発明のコンジュゲートはスクリーニングアッセイにも有用である。
第２の位置又は第３の位置に化合物（ｄ）を含み、化合物（ｄ）がモジュール（ａ）又はモジュール（ｃ）と直接的に共有結合した又は結合（linkage）分子を介して間接的に共有結合したコンジュゲート、例えばコンジュゲート：（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘは（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎは（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚは（ｂ）ｙと共有結合する）、又はコンジュゲート：（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘはリンカー分子を介して（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎはリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚはリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する）も好ましい。これらの例示的なコンジュゲートは、化合物（ｄ）の柔軟性を確保する。また、化合物（ｄ）とモジュール（ａ）及びモジュール（ｃ）とを連結するリンカー分子はスペーサー機能を有し、この機能によりモジュール（ａ）及びモジュール（ｃ）が化合物（ｄ）から安全に離れた状態が維持される。このため立体障害及び他の不要な相互作用を避ける又は少なくとも最小限に抑えることができる。
以下の配置を含む本発明によるコンジュゲートがより好ましい：
（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘは（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎは（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚは（ｂ）ｙと共有結合し、ｘは１の整数であり、ｎは２又は３の整数であり、ｚは１の整数であり、ｙは１の整数である）、又は
（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘはリンカー分子を介して（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎはリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚはリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合し、ｘは１の整数であり、ｎは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の整数であり、ｚは１の整数であり、ｙは１の整数である）。
本発明のコンジュゲートのモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）、モジュール（ｃ）及び化合物（ｄ）が以下の配置（arragements）で互いに結合するのが特に好ましい：
（ｉ）（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｄ）ｎと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｂ）ｙと共有結合する；
（ｉｉ）（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｄ）ｎと非共有結合し、（ｃ）ｚが（ｂ）ｙと共有結合する；
（ｉｉｉ）（ａ）ｘが（ｄ）ｎと共有結合し、（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｂ）ｙと共有結合する；
（ｉｖ）（ａ）ｘが（ｄ）ｎと非共有結合し、（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｂ）ｙと共有結合する；
（ｖ）（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｄ）ｎと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する；
（ｖｉ）（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｃ）ｚと共有結合するアダプタ分子を介して（ｄ）ｎと非共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する；
（ｖｉｉ）（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｄ）ｎと共有結合し、（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する；又は
（ｖｉｉｉ）（ａ）ｘが（ａ）ｘと共有結合するアダプタ分子を介して（ｄ）ｎと非共有結合し、（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する。
それぞれ具体的に上に記された共有結合及び非共有結合以外には、それぞれのモジュールの間に他の結合、好ましくは共有結合が存在しないことが好ましい。
より好ましい本発明のコンジュゲートのモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）、モジュール（ｃ）及び化合物（ｄ）は以下の配置で互いに結合する：
（ｉ）（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｄ）ｎと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｂ）ｙと共有結合する；
（ｉｉ）（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｄ）ｎと非共有結合し、（ｃ）ｚが（ｂ）ｙと共有結合する；
（ｉｉｉ）（ａ）ｘが（ｄ）ｎと共有結合し、（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｂ）ｙと共有結合する；
（ｉｖ）（ａ）ｘが（ｄ）ｎと非共有結合し、（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｂ）ｙと共有結合する；
（ｖ）（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｄ）ｎと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する；
（ｖｉ）（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｃ）ｚと共有結合するアダプタ分子を介して（ｄ）ｎと非共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する；
（ｖｉｉ）（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｄ）ｎと共有結合し、（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する；又は
（ｖｉｉｉ）（ａ）ｘが（ａ）ｘと共有結合するアダプタ分子を介して（ｄ）ｎと非共有結合し、（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する）
（ここで、
ｘは１〜５、好ましくは１の整数であり、
ｙは１〜５、好ましくは１の整数であり、
ｚは１〜５、好ましくは１の整数であり、
ｎは１〜５０、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の整数である）。
それぞれ具体的に上記された共有結合及び非共有結合以外には、それぞれのモジュールの間に他の結合、好ましくは共有結合が存在しないことが好ましい。
本発明のコンジュゲートの好ましい実施形態を、図１Ａ〜図１Ｄ、図２Ａ及び図２Ｂ、図３の３ａ〜３ｅ、図４、図５、図６Ａ及び図６Ｂ、図７、図８、図９、図１０Ａ及び図１０Ｂ、図１１、図１２、図１３及び図１４で例示する。図１Ａ〜図１Ｄは、モジュール（互いに別々に、又は化合物（ｄ）と共に）が共有結合的に、非共有結合的に、アダプタ分子を介して、又はアダプタ分子を最適には含むリンカー分子を介して結合し得る、本発明のコンジュゲートの好ましい実施形態を例示する。図２Ａ及び図２Ｂ、図３の３ａ〜３ｅ、図４、図５、図６Ａ及び図６Ｂ、図７、図８、図９、図１０Ａ及び図１０Ｂ、図１１、図１２、図１３及び図１４は、本明細書に及び以下の実施例に記載のような本発明のコンジュゲートの更なる好ましい実施形態を例示する。
別の好ましい実施形態では、任意の組合せ、順番又は化学量論で互いに配置された、少なくとも１つのモジュール（ａ）及び／又は少なくとも１つのモジュール（ｂ）及び／又は少なくとも１つのモジュール（ｃ）及び／又は少なくとも１つの化合物（ｄ）を共有結合させる、本発明のコンジュゲートのリンカー分子、例えばペプチド、修飾ペプチド、アミノ酸残基又は修飾アミノ酸残基は更に、
（ｉ）少なくとも１つの分岐点、好ましくはシステイン側鎖、リジン側鎖、若しくは側鎖上にアミノオキシ部分を含有する非天然アミノ酸、及び／又は
（ｉｉ）少なくとも１つの切断部位、好ましくはエンドソーム酵素、トランスゴルジネットワーク酵素、ゴルジ酵素、ＥＲ酵素、サイトゾル酵素若しくは核内酵素の切断部位、
を含む。
本発明との関連では「分岐点」という用語は、分子、好ましくは化合物又はアダプタ分子が結合又はカップリングすることができる、リンカー分子、例えばペプチドリンカー（liker）、好ましくはアミノ酸側鎖の位置を意味する。
本発明との関連では「切断部位」という用語は、例えば化学的切断によって又は酵素による切断によって、例えば特定の配列を認識するプロテアーゼ若しくはペプチダーゼによって、又は特定の化学結合を認識する酵素によって切断可能なコンジュゲート内の特定のアミノ酸配列（例えばペプチドリンカー分子のアミノ酸配列内の特定の配列）又は特定の化学結合（例えばジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ））を意味する。
本発明のコンジュゲートのリンカー分子が分岐点と切断部位との両方を含む場合、切断部位が分岐点の上流、例えば３’側に位置するのが好ましい。
任意の順番、組合せ又は化学量論で互いに配置させることがきる、本発明のコンジュゲートの少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）、少なくとも１つのモジュール（ｃ）及び／又は少なくとも１つの化合物（ｄ）を連結させるリンカー分子における切断部位の存在により、化合物（ｄ）の細胞への送達中に、例えば細胞取り込み後に、小胞体（ＥＲ）の標的化後に、サイトゾルへの送達後に、又は核への送達後に１つ又は複数のモジュール及び／又は少なくとも１つの化合物（ｄ）の分離が可能になる。好ましくは、本発明のコンジュゲートは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の切断部位を含む。より好ましくは、コンジュゲートは少なくとも１個、２個、３個、４個又は５個の切断部位を含む。更に好ましくは、コンジュゲートは１個、２個、３個、４個又は５個の切断部位を含む。
好ましくは、本発明のコンジュゲートは、切断部位でコンジュゲートを切断する酵素によって認識される切断部位を含む。コンジュゲートは、細胞の特定のコンパートメント若しくは小器官に又は細胞のサイトゾルに位置し、そこで活性のある酵素により好ましくは認識され、切断される切断部位を伴って調製することができる。好ましい実施形態では、コンジュゲートは、標的細胞のエンドソーム、トランスゴルジネットワーク、ゴルジ体、ＥＲ、サイトゾル又は核に位置し、そこで活性のある酵素により認識され、切断される切断部位を含む。別の好ましい実施形態では、コンジュゲートは、少なくとも２つの切断部位（それぞれの切断部位は、それぞれ標的細胞の異なるコンパートメント、小器官又はサイトゾルに位置し、そこで活性のある少なくとも２個の異なる酵素により認識され、切断される）を含む。
特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、好ましくは初期／回収エンドソームに位置し、そこで活性のあるエンドソーム酵素により認識され、切断される切断部位を含む。好ましくは、切断部位は、フューリン、ＣＨＭＰ１Ａ、ＥＣＥ１、ＳＴＡＭＢＰ、ＵＳＰ１０、ＵＳＰ６、ＺＦＹＶＥ９等により認識され、切断される。
特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、トランスゴルジネットワーク酵素により認識され、切断される切断部位を含む。好ましくは、切断部位はフューリン等により認識され、切断される。
特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、ゴルジ酵素により認識され、切断される切断部位を含む。好ましくは、切断部位は、ＡＤＡＭ１０、ＢＡＣＥ１、ＣＡＰＮ８、ＣＴＳＣ、ＥＣＥ２、ＭＢＴＰＳ１、ＮＣＳＴＮ、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ６、ＰＣＳＫ７、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、ＲＨＢＤＦ１、Ｓｉｔｅ−１プロテアーゼ（Ｓ１Ｐ）、Ｓｉｔｅ−２プロテアーゼ（Ｓ２Ｐ）、ＳＰＰＬ２Ｂ、ＺＭＰＳＴＥ２４等により認識され、切断される。特に好ましい実施形態では、切断部位はゴルジ体特異的酵素ＥＣＥ２、ＰＣＳＫ７、ＳＰＰＬ２Ｂ等により認識され、切断される。
特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、ＥＲ酵素により認識され、切断される切断部位を含む。好ましくは、切断部位は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）ファミリー由来のタンパク質、ＢＡＣＥ１、ＢＡＣＥ２、ＣＡＳＰ７、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＨ、ＣＴＳＺ、システインプロテアーゼＥＲ−６０、ＤＰＰ４、ＥＲＡＰ２、ＥＲＭＰ１、ＨＴＲＡ２、ＫＬＫ６、ＭＢＴＰＳ１、ＮＣＬＮ、ＮＣＳＴＮ、ＰＣＳＫ、ＰＲＳＳ５０、ＲＣＥ１、ＳＰＣＳ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＺＭＰＳＴＥ２４等により認識され、切断される。
特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、サイトゾル酵素により認識され、切断される切断部位を含む。好ましくは、切断部位は、カルパイン等により認識され、切断される。
特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、核内酵素により認識され、切断される切断部位を含む。好ましくは、切断部位は、ＣＡＰＮ７、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１４、ＧＺＭＢ、ＬＯＮＰ２、ＰＩＴＲＭ１、ＰＳＭＡ１、ＰＳＭＢ１、ＰＳＭＣ１、ＰＳＭＥ３、ＳＥＮＰ１等により認識され、切断される。
好ましい実施形態では、切断部位は、酵素により切断されると、コンジュゲートの少なくとも１つのモジュール（ａ）がコンジュゲートから放出されるようにコンジュゲート内に位置している。この実施形態では、切断部位は好ましくは、モジュール（ａ）とモジュール（ｃ）若しくはモジュール（ｂ）との間、又はモジュール（ａ）と化合物（ｄ）との間に位置している。好ましくは、コンジュゲートからモジュール（ａ）を放出させる切断部位は、標的細胞のエンドソーム、トランスゴルジネットワーク、ゴルジ体、ＥＲ、サイトゾル又は核に位置し、そこで活性のある酵素により認識され、切断される。より好ましくは、コンジュゲートからモジュール（ａ）を放出させる切断部位は、エンドソーム酵素、トランスゴルジネットワーク酵素、ゴルジ酵素、ＥＲ酵素、サイトゾル酵素又は核内酵素により認識され、切断される。
別の好ましい実施形態では、切断部位は、酵素により切断されると、コンジュゲートの少なくとも１つのモジュール（ｂ）がコンジュゲートから放出されるようにコンジュゲート内に位置している。この実施形態では、切断部位は好ましくは、モジュール（ｂ）とモジュール（ａ）若しくはモジュール（ｃ）との間、又はモジュール（ｂ）と化合物（ｄ）との間に位置している。好ましくは、コンジュゲートからモジュール（ｂ）を放出させる切断部位は、ＥＲ、サイトゾル又は核に位置し、そこで活性のある酵素（例えばカルパイン、ＰＤＩファミリータンパク質、ＢＡＣＥ１、ＢＡＣＥ２、ＣＡＰＮ７、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１４、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＨ、ＣＴＳＺ、ＤＰＰ４、システインプロテアーゼＥＲ−６０、ＥＲＡＰ２、ＥＲＭＰ１、ＧＺＭＢ、ＨＴＲＡ２、ＫＬＫ６、ＬＯＮＰ２、ＭＢＴＰＳ１、ＮＣＬＮ、ＮＣＳＴＮ、ＰＣＳＫ、ＰＩＴＲＭ１、ＰＳＭＡ１、ＰＳＭＢ１、ＰＳＭＣ１、ＰＳＭＥ３、ＰＲＳＳ５０、ＲＣＥ１、ＳＥＮＰ１、ＳＰＣＳ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＺＭＰＳＴＥ２４等）により認識され、切断される。好ましくは、ＥＲ、サイトゾル及び／又は核で活性のある酵素は、コンジュゲートがＥＲ、サイトゾル又は核に到達するまでコンジュゲートからモジュール（ｂ）を切り離さない。より好ましくは、コンジュゲートからモジュール（ｂ）を放出させる切断部位は、ＥＲ、サイトゾル及び／又は核に位置し、そこで活性があるが、本発明のコンジュゲートがＥＲ、サイトゾル又は核に到達する前に通る（travels）細胞コンパートメント又は小器官のいずれにおいても位置しないか、又は活性がない酵素により認識され、切断される。更に好ましくは、コンジュゲートからモジュール（ｂ）を放出させる切断部位は、ＥＲ、サイトゾル及び／又は核にのみ位置し、そこでのみ活性がある酵素により認識され、切断される。
特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、ＥＲ、サイトゾル及び／又は核に位置し、そこで活性があるが、本発明のコンジュゲートがＥＲ、サイトゾル又は核に到達する前に通る（すなわちＥＲ、サイトゾル又は核の上流にある）細胞コンパートメント又は細胞小器官（例えばエンドソーム、ゴルジ体等）のいずれにおいても位置しないか、又は活性がない酵素により認識され、切断される切断部位をペプチドリンカー内に含む。好ましくは、切断部位は、ＣＡＳＰ７、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＨ、ＣＴＳＺ、ＥＲ−６０、ＨＴＲＡ２、ＫＬＫ６、ＮＣＬＮ、ＰＤＩファミリータンパク質、ＰＲＳＳ５０、ＲＣＥ１、ＴＯＲ１Ａ等により認識され、切断される。
別の特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、ＥＲにのみ位置し、そこでのみ活性がある酵素により認識され、切断される切断部位をペプチドリンカー内に含む。好ましくは、切断部位は、ＥＲ−６０、ＥＲＭＰ１、ＰＤＩファミリータンパク質、ＳＰＣＳ１、ＴＭＰＲＳＳ３等により認識され、切断される。
別の好ましい実施形態では、切断部位は、酵素により切断されると、コンジュゲートの少なくとも１つの化合物（ｄ）がコンジュゲートから放出されるようにコンジュゲート内に位置している。この実施形態では、切断部位は、好ましくは化合物（ｄ）とモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）又はモジュール（ｃ）との間に位置する。化合物（ｄ）が核へと送達されることが望まれ、コンジュゲートが核局在化シグナルを含む場合、酵素により切断されると、少なくとも１つの化合物（ｄ）及び核局在化シグナルがコンジュゲートから放出されるように、切断部位は、化合物（ｄ）及び核局在化シグナルと、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）又はモジュール（ｃ）との間に位置するのが好ましい。好ましくは、コンジュゲートから化合物（ｄ）又は化合物（ｄ）及び核局在化シグナルを放出させる切断部位は、サイトゾル又は核に位置し、そこで活性のある酵素により認識され、切断される。
好ましい実施形態では、サイトゾル又は核で活性のある酵素は、コンジュゲートがサイトゾル又は核に到達するまで、コンジュゲートから化合物（ｄ）又は化合物（ｄ）及び核局在化シグナルを切り離さない。より好ましくは、コンジュゲートから化合物（ｄ）又は化合物（ｄ）及び核局在化シグナルを放出させる切断部位は、サイトゾル及び／又は核にのみ位置し、そこでのみ活性のある酵素により認識され、切断される。
特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、サイトゾル及び／又は核に位置し、そこで活性があるが、本発明のコンジュゲートがサイトゾル又は核に到達する前に通る（すなわちサイトゾル又は核の上流にある）細胞コンパートメント又は細胞小器官（例えばエンドソーム、トランスゴルジネットワーク、ゴルジ体、ＥＲ）のいずれにおいても位置しないか、又は活性がない酵素により認識され、切断される切断部位をペプチドリンカー内に含む。好ましくは、ペプチドリンカー内の切断部位は、カルパイン、ＡＴＧ４Ａ、ＣＡＰＮ１０、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ９、ＧＺＭＢ、ＰＲＥＰ、ＰＲＥＰＬ等により認識され、切断される。
好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、サイトゾルにのみ位置し、そこでのみ活性のある酵素により認識され、切断される切断部位をペプチドリンカー内に含む。好ましくは、ペプチドリンカー内の切断部位は、カルパイン、ＰＲＥＰＬ等により認識され、切断される。
別の好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、核にのみ位置し、そこでのみ活性のある酵素により認識され、切断される切断部位をペプチドリンカー内に含む。好ましくは、ペプチドリンカー内の切断部位は、ＣＡＰＮ７、ＰＩＴＲＭ１等により認識され、切断される。
本発明の代替的な実施形態では、コンジュゲートが切断部位での切断が望まれる目的のコンパートメント、小器官又はサイトゾルに到達するまで切断部位が切断に利用不可能なように、コンジュゲート内の切断部位は遮蔽される。切断部位の遮蔽は、コンジュゲート内の切断部位と結合又は相互作用する分子により達成することができ、これにより、コンジュゲートの切断が望まれる目的のコンパートメント、小器官又はサイトゾルにコンジュゲートが到達した時に遮蔽分子がコンジュゲートから放出され、切断部位が曝露される。コンジュゲートからの遮蔽分子の放出により、切断酵素が切断部位を認識し、切断して、細胞内の所望の位置で目的のモジュール、化合物（ｄ）、又は化合物（ｄ）及び核局在化シグナルを放出することが可能になる。代替的には、本発明のコンジュゲート（conjuigate）内の切断部位の遮蔽は、コンジュゲートの三次元（３Ｄ）構造によるものであり得る。この代替的な実施形態では、切断部位はコンジュゲート内に位置し、そのため該切断部位がコンジュゲートの３Ｄ構造の内部にあり（すなわち遮蔽されており）、好ましくはコンジュゲートの一部を除去することにより切断に利用可能となる（例えば、モジュール（ａ）及び／又はモジュール（ｂ）がコンジュゲートから切り離されると、モジュール（ｃ）と化合物（ｄ）との間に位置する切断部位がもはや遮蔽されなくなり、その対応する酵素による切断に利用可能である）。好ましくは、遮蔽分子又は内部の切断部位を遮蔽するコンジュゲートの一部分は、エンドソーム、ＴＧＮ／ゴルジ装置、ＥＲ、サイトゾル又は核において放出される。
本発明のコンジュゲートの好ましい実施形態は例えば、以下の構成を含む：（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘは切断部位を含むリンカー分子を介して（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎは異なる切断部位を含むリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚは（ｂ）ｙと共有結合し、ｘは１の整数であり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の整数であり、ｚは１の整数であり、ｙは１の整数である）。このため、例えばコンジュゲートの細胞取り込み後に、モジュール（ａ）とモジュール（ｄ）との間の切断部位を介して、モジュール（ａ）を化合物（ｄ）と、並びにモジュール（ｃ）及びモジュール（ｂ）と分離することが可能である。モジュール（ａ）は細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にするため、その機能は細胞侵入後にはもはや必要なく、このためモジュール（ａ）の存在はもはや必要とされない。例えばサイトゾルへの移送後に、化合物（ｄ）とモジュール（ｃ）との間の切断部位を介して、化合物（ｄ）をモジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）と分離することが更に可能である。
本発明の好ましい実施形態では、細胞への取り込み後、及び／又はゴルジ装置への到達時に、モジュール（ａ）を化合物（ｄ）と、並びにモジュール（ｃ）及び／又はモジュール（ｂ）と分離するために、ペプチドリンカー分子内、好ましくはモジュール（ａ）と化合物（ｄ）及びモジュール（ｃ）又はモジュール（ｂ）とを共有結合させるペプチドリンカー分子内にフューリン切断部位を付加することが好ましい。最小フューリン切断部位はArg-X-X-Arg（配列番号９）である。しかしながら、フューリン酵素はArg-X-(Lys/Arg)-Arg部位（配列番号１０）を好む。フューリンは分泌経路の主要なプロセシング酵素であり、トランスゴルジネットワークに位置する。フューリンはArg-X-X-Arg（配列番号９）配列又はArg-X-(Lys/Arg)-Arg（配列番号１０）配列を有するタンパク質又はペプチド、そのためペプチドリンカーも切断する。結果として、フューリンは、ＴＧＮ／ゴルジ装置を介したコンジュゲートのＥＲへの輸送中にモジュール（ａ）と、化合物（ｄ）及びモジュール（ｃ）又はモジュール（ｂ）との間のフューリン切断部位でペプチドリンカーを切断し、これによりモジュール（ａ）を化合物（ｄ）と、並びにモジュール（ｃ）及び／又はモジュール（ｂ）と分離する。サイトゾルへの移送後に化合物（ｄ）をモジュール（ｃ）及び／又はモジュール（ｂ）と分離するため、ペプチドリンカー分子内、好ましくは化合物（ｄ）とモジュール（ｃ）又はモジュール（ｂ）とを共有結合させるペプチドリンカー分子内にカルパイン切断部位を付加することが好ましい。ペプチドTPLKSPPPSPR（配列番号１１）はカルパイン切断部位として作用し得る［２４］。
別の好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、表２等に挙げられる配列を含むカルパイン切断部位を代替的に又は付加的に含んでいてもよい。
表２．本発明のコンジュゲートに使用されるカルパイン切断部位
Figure 2012533587
Figure 2012533587
Figure 2012533587
Figure 2012533587
当業者は、本明細書で言及される切断部位の代わりに又はそれに加えて別の切断部位（複数も可）を容易に使用することができる。他の酵素に関する切断認識配列がいずれの当業者にも利用可能であり、入手可能（accessible）である。
好ましくは、本発明のコンジュゲートの化合物が分岐点と、好ましくはリジン側鎖とのアミド結合により、システイン側鎖とのジスルフィド結合により、又は側鎖上にアミノオキシ部分を含有する非天然アミノ酸を介して共有結合する。
このため、本発明によるコンジュゲートの好ましい実施形態では、モジュール及び化合物（ｄ）が以下の配置で互いに結合する：モジュール（ａ）は分岐点としてシステイン側鎖と分岐点の上流に切断部位とを含むペプチドリンカー分子を介してモジュール（ｃ）と共有結合し、モジュール（ｃ）はモジュール（ｂ）と共有結合し、化合物（ｄ）はジスルフィド結合によりシステイン側鎖と共有結合する（例えば図３の３ａを参照されたい）。
本発明によるコンジュゲートの別の好ましい実施形態では、モジュール及び化合物が以下の配置で互いに結合する：モジュール（ａ）は分岐点としてシステイン側鎖と分岐点の上流に切断部位とを含むペプチドリンカー分子を介してモジュール（ｃ）と共有結合し、モジュール（ｃ）はペプチドリンカー分子を介してモジュール（ｂ）と共有結合し、化合物（ｄ）はジスルフィド結合により分岐点のシステイン側鎖と共有結合する（例えば図３の３ｂを参照されたい）。
モジュール（ａ）とモジュール（ｃ）とを連結させるペプチドリンカー分子における切断部位により、例えば細胞侵入後にモジュール（ａ）をモジュール（ｃ）及びモジュール（ｂ）と分離することが可能になる。切断部位が、化合物（ｄ）が共有結合したペプチドリンカーの分岐点の上流に位置しているため、化合物（ｄ）並びにモジュール（ｃ）及びモジュール（ｂ）をモジュール（ａ）と分離することができる。
別の好ましい実施形態では、化合物（ｄ）がシステイン側鎖とのジスルフィド結合の代わりに酵素切断部位を介して結合する（例えば図３の３ｃを参照されたい）。好ましくは、モジュール（ａ）をエンドソーム又はＴＧＮにおいてコンジュゲートと切り離し、モジュール（ｂ）を、細胞受容体、又は細胞受容体と結合することによりＥＲへの更なる輸送を容易にする他の細胞タンパク質に利用可能にする。好ましい実施形態では、フューリン（エンドソーム及びＴＧＮで活性のある）切断部位又は別の前駆タンパク質転換酵素の切断部位を、細胞内で更なる輸送がもはや必要とされないモジュール（複数も可）を切り離すように本発明のペプチドリンカー分子において設計することができる。このような切断は任意の細胞小器官（例えばエンドソーム、ＴＧＮ、ゴルジ体等）で起こすことができ、当業者は標準的な方法を用いて、過度の実験を行うことなく所望の切断部位を含むペプチドリンカー分子を合成することが可能である。
好ましくは、本発明のコンジュゲートの化合物（ｄ）は、システイン側鎖とのジスルフィド結合により共有結合したＤＲＢＤ又はその変異体とのイオン結合により又は疎水性結合により分岐点と非共有結合する。
このため、本発明によるコンジュゲートの好ましい実施形態では、少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）、少なくとも１つのモジュール（ｃ）及び少なくとも１つの化合物（ｄ）が以下の配置で互いに結合する：少なくとも１つのモジュール（ａ）が分岐点としてシステイン側鎖と分岐点の上流に切断部位とを含むペプチドリンカー分子を介して少なくとも１つのモジュール（ｃ）と共有結合し、少なくとも１つのモジュール（ｃ）が少なくとも１つのモジュール（ｂ）と共有結合し、少なくとも１つの化合物（ｄ）がジスルフィド結合によりシステイン側鎖と共有結合したＤＲＢＤとのイオン（静電）結合により分岐点と非共有結合する（例えば図３の３ｄを参照されたい）。
別の好ましい実施形態では、少なくとも２つの化合物（ｄ）が、ジスルフィド結合によりシステイン側鎖と共有結合したＤＲＢＤとのイオン結合により分岐点と非共有結合する。
本発明によるコンジュゲートの別の好ましい実施形態では、例えばモジュール及び化合物が以下の配置又は組合せで互いに結合する：モジュール（ａ）が分岐点としてシステイン側鎖と分岐点の上流に切断部位とを含むペプチドリンカー分子を介してモジュール（ｃ）と共有結合し、モジュール（ｃ）がペプチドリンカー分子を介してモジュール（ｂ）と共有結合し、化合物（ｄ）がジスルフィド結合によりシステイン側鎖と共有結合したＤＲＢＤとのイオン結合により分岐点と非共有結合する（例えば図３の３ｅを参照されたい）。
図１Ａ〜図１Ｄ、図２Ａ及び図２Ｂ、図３の３ａ〜３ｅ、図４、図５、図６Ａ及び図６Ｂ、図７、図８、図９、図１０Ａ及び図１０Ｂ、図１１、図１２、図１３及び図１４に記載のコンジュゲートは本発明のコンジュゲートの考え得る構成のごく一部しか表さないことを理解されたい。当業者は過度の実験を行うことなく他の構成のコンジュゲートを作製することができ、これらのコンジュゲートも本発明の範囲内に包含される。
本発明のコンジュゲートは、予期せぬ免疫反応のリスクを最小限に抑えるために内因性起源のモジュールを含むのが好ましい。外因性起源のモジュールも本発明のコンジュゲート内で使用することができる。外因性起源のモジュール（複数も可）を本発明のコンジュゲート内で使用する場合、外因性モジュールが、毒性、又は免疫活性化等の他の不要な活性、又は発癌性に関する最小限のリスクを有するのが好ましい。
本発明のコンジュゲートは、細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にし、好ましくはヒト起源である、少なくとも１つのモジュール（モジュール（ａ）と表される）を含む。
基本的には、標的細胞の表面上の１つ又は２つ以上の分子又は構造と結合する高い親和性を有する任意の分子又は構造がモジュール（ａ）として好適であり、好ましくは逆行性の輸送を受けることが可能な小胞コンパートメントへの内部移行を誘起する。代替的には、モジュール（ａ）は標的細胞の外側での（すなわち、使用前のプレインキュベーションにおける、細胞培養培地での、又は生物の血液、髄液、間質液等での、「間接的な標的化アダプタ分子」と本明細書で規定される）分子との結合により間接的にこの標的細胞取り込み機能性を与えることができ、標的細胞が間接的な標的化アダプタ分子を直接認識し、間接的な標的化アダプタ分子は好ましくは逆行性の輸送を受けることが可能な小胞コンパートメントへの内部移行を誘起する。
好ましい実施形態では、二重特異性抗体（例えばダイアボディ又は一本鎖抗体）を、所望の標的細胞上でコンジュゲートのモジュール（ａ）と細胞表面受容体との両方を結合するのに使用する。簡潔にいうと、標的細胞へのコンジュゲートの曝露又は投与前に、二重特異性抗体を二重特異性抗体により認識されるモジュール（ａ）を含むコンジュゲートと共にプレインキュベートする。標的細胞に曝露又は投与すると、二重特異性抗体−コンジュゲート複合体は、二重特異性抗体により認識される細胞表面受容体と結合する。細胞表面受容体との結合の結果として、二重特異性抗体−コンジュゲート複合体が好ましくは小胞コンパートメントへの内部移行を誘起し、それにより逆行性の輸送を開始することができる。別の実施形態では、モジュール（ａ）は所望の標的細胞上で細胞表面受容体と結合する抗体と結合することができる抗体（免疫グロブリン、Ｉｇ）結合ドメインを含み、それにより対象となる細胞に対して本発明のコンジュゲートを間接的に標的化する。別の好ましい実施形態では、モジュール（ａ）は、対象となる細胞に対して本発明のコンジュゲートを間接的に標的化するために、所望の標的細胞上で細胞表面受容体と結合するビオチン化リガンドと結合することができるビオチンアクセプタペプチドを含む。
このため、エンドサイトーシスを用いて細胞に侵入することができ、逆行性の輸送を受けることが可能な小胞コンパートメントへの内部移行を好ましくは誘起する任意のリガンド又は結合粒子を、所望の細胞に対して本発明のコンジュゲートを標的化するのに利用することができるため、本発明は細胞の標的化に関する柔軟なプラットフォームを提供する。実際、このような標的化アプローチが、ウイルスベクターを標的化するのに一般的に使用され、文献に十分に記載されている（例えば［２５］を参照されたい）。また、この間接的な標的化アプローチは、本発明の送達システム若しくはコンジュゲートと共に使用する試薬、又はそれを含むキットの開発に有利である。このため当業者は、対象となる細胞に対して本発明に包含されるコンジュゲートを間接的に標的化するために、過度の実験を行うことなく、モジュール（ａ）と間接的な標的化アダプタ分子との様々な組合せを認識し、使用することができるであろう。
特に好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、トランスサイトーシス機能性を直接又は間接的に与えるモジュール（ａ）を含み、これによりコンジュゲートが、組織、腫瘍、内皮細胞等を貫通することができるか、又は組織、腫瘍、内皮細胞等内へと浸透することができる。トランスサイトーシス（trancytosis）機能性のためのモジュール（ａ）として使用することができる分子の例としては、アルブミン、オロソムコイド、ＩｇＧ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール（ＬＤＬ受容体を介さない）、ゴナドトロフィン、トランスフェリン（トランスフェリン受容体を介さない）、メラノトランスフェリン（ｐ９７、［２６］）、インスリン、ＬＤＬ、ｄＩｇＡ（二量体免疫グロブリン（Ｉｇ）Ａ）、ビタミンＢ１２、ビタミンＤ、ビタミンＡ、鉄、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、フェリチン、サイログロブリン等が挙げられるが、これらに限定されない（総説に関しては［２７］を参照されたい）。代替的に、本発明のコンジュゲートに使用されるトランスサイトーシス機能性を含むモジュール（ａ）として、アルブミン、オロソムコイド、ＩｇＧ、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ受容体を介さない）、ゴナドトロフィン、トランスフェリン（トランスフェリン受容体を介さない）、メラノトランスフェリン（ｐ９７）、インスリン、ＬＤＬ、ｄＩｇＡ、ビタミンＢ１２、ビタミンＤ、ビタミンＡ、鉄、ＨＲＰ、フェリチン、サイログロブリン等に指向性を有する抗体を使用することができる。
高い効率及び速い動態で任意の細胞に自然に取り込まれる分子全てを、モジュール（ａ）として又は間接的にモジュール（ａ）と結合させるために使用することができる（ただし、該分子は、細胞内の膜状小器官内に内部移行するか又はそこに到達する）。このような分子は、免疫応答又は毒性を誘発するリスクが低いのが好ましい。細胞に取り込まれることが知られているが、或る特定の二次活性、例えば増大した免疫刺激リスクも有する他の分子も、モジュール（ａ）として使用することができる。
好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ａ）、又はモジュール（ａ）が結合した間接的な標的化アダプタ分子は、特異的な細胞の標的化及び細胞取り込みを可能にする、引き起こす、及び／又はもたらす細胞表面マーカーのリガンドを含む。好ましくは、細胞表面マーカーの上記リガンドは、好ましくはヒト起源の細胞表面受容体リガンド、抗体、糖、脂質又はナノ粒子である。
細胞表面受容体リガンドが、成長因子、自己分泌型運動因子（ＡＭＦ）、リポタンパク質、トランスフェリン、表面結合レクチン、ガレクチン、ｃ型レクチン、毒素、その断片、及びその変異体からなる群から選択されるリガンドであるのが特に好ましい。
好ましくは、細胞表面受容体リガンドは、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＧＤＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＴＧＦ、ＰＧＦ及びＰＤＧＦからなる群から選択される成長因子である。
好ましい実施形態では、細胞表面受容体リガンドは、自己分泌型運動因子（ＡＭＦ、グルコースリン酸イソメラーゼ（isomerse）（ＧＰＩ）としても知られる）である。ＡＭＦ、又はＡＭＦ受容体と結合し、その内部移行を誘起する他のペプチド、タンパク質及び小分子は、本発明の好ましい細胞表面受容体リガンドである。好ましくは、本発明のコンジュゲートに使用されるＡＭＦペプチドは、配列番号１１８（完全長ヒトＡＭＦ）を含むアミノ酸配列、又はその断片若しくは変異体を含む。別の実施形態では、本発明のコンジュゲートに使用されるＡＭＦペプチドは、配列番号１１９（完全長マウスＡＭＦ）を含むアミノ酸配列、又はその断片若しくは変異体を含む。
別の好ましい実施形態では、細胞表面受容体リガンドは、スルファターゼ修飾因子（ＳＵＭＦ）である。ＳＵＭＦ、又はＳＵＭＦ受容体と結合し、その内部移行を誘起する他のペプチド、タンパク質及び小分子が、本発明の好ましい細胞表面受容体リガンドである。好ましくは、本発明のコンジュゲートに使用されるＳＵＭＦペプチド又はタンパク質は、ヒトＳＵＭＦ１タンパク質（配列番号１２０、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｑ８ＮＢＫ３［２８］）を含むアミノ酸配列、又はその断片若しくは（of）変異体を含む。
好ましくは、細胞表面リガンドは、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体／スカベンジャ受容体ファミリーリポタンパク質及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体ファミリーリポタンパク質からなる群から選択されるリポタンパク質である。
好ましくは、細胞表面リガンドは、THRPPMWSPVWP（配列番号１２１、［２９］及び米国特許第６７４３８９３号）、GHKVKRPKG（配列番号１２２；［３０］及び国際公開第２００３／０５０２３８号）、及びHAIYPRH（配列番号１２３；［２９］）からなる群から選択されるトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合ペプチドである。
好ましくは、細胞表面リガンドは、可溶性レクチン、コレクチン及びインテレクチン（ＩＴＬＮ）からなる群から選択されるレクチンである。
好ましくは、細胞表面リガンドは、ＬＧＡＬＳ１、ＬＧＡＬＳ２、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ４、ＬＧＡＬＳ５、ＬＧＡＬＳ６、ＬＧＡＬＳ７、ＬＧＡＬＳ８、ＬＧＡＬＳ９、ＬＧＡＬＳ１０、ＬＧＡＬＳ１１、ＬＧＡＬＳ１２及びＬＧＡＬＳ１３からなる群から選択されるガレクチンである。
好ましくは、細胞表面リガンドは、細菌毒素及び植物毒素からなる群から選択される毒素である。好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートのモジュール（ａ）は、リシン毒素Ｂ−サブユニット、コレラ毒素Ｂ−サブユニット、志賀毒素（ＳＴｘ）Ｂ−サブユニット、志賀様毒素（ＳＬＴ）Ｂ−サブユニット（ベロ毒素（ＶＴ）Ｂ−サブユニット）、大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）Ｂ−サブユニット、アブリン毒素Ｂ−サブユニット、百日咳毒素Ｂ−サブユニット、アブリンＢ−サブユニット、モデシンＢ−サブユニット、ボルケンシンＢ−サブユニット、シュードモナス外毒素ＡドメインＩ、シュードモナス外毒素ＡドメインＩＩ、及びシュードモナス外毒素ＡドメインＩＶからなる群から選択される毒素タンパク質又はペプチドを含むか又はそれらからなる。好ましくは、モジュール（ａ）は、リシン毒素Ｂ−サブユニットペプチド（配列番号１２４、又は国際公開第２００８／１５７２６３号に記載のような組換えにより生成されたリシン毒素Ｂ−サブユニット）、コレラ毒素Ｂ−サブユニットペプチド（配列番号１２５）、Ｓｔｘ Ｂ−サブユニットペプチド（配列番号１２６）、ＳＴｘ１（ＳＬＴ−Ｉ又はＶＴ１）Ｂ−サブユニットペプチド（配列番号１２７）、ＳＬＴ−Ｉｂ Ｂ−サブユニットペプチド（配列番号１２８）、ＳＬＴ−Ｉｃ Ｂ−サブユニットペプチド（ＶＴ１ｃペプチド）（配列番号１２９）、ＳＬＴ−ＩＩｂ−サブユニットペプチド（ＶＴ２ペプチド）（配列番号１３０）、ＳＬＴ−ＩＩｃ Ｂ−サブユニットペプチド（ＶＴ２ｃペプチド）（配列番号１３１）、ＳＬＴ−ＩＩｄ Ｂ−サブユニットペプチド（ＶＴ２ｄペプチド）（配列番号１３２）、ＳＬＴ−ＩＩｅ Ｂ−サブユニットペプチド（ＶＴ２ｅペプチド）（配列番号１３３）、ＳＬＴ−ＩＩｆ Ｂ−サブユニットペプチド（ＶＴ２ｆペプチド）（配列番号１３４）、ＬＴ Ｂ−サブユニットペプチド（配列番号１３５又は配列番号１３６）、ＬＴＩＩａ Ｂ−サブユニットペプチド（配列番号１３７）、ＬＴＩＩｂ Ｂ−サブユニットペプチド（配列番号１３８）、又はアブリン毒素Ｂ−サブユニットペプチド（配列番号１３９）を含む。
成長因子、リポタンパク質、トランスフェリン、表面結合レクチン、ガレクチン、ｃ型レクチン又は毒素の変異体は、アミノ酸配列における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個又は６００個までのアミノ酸変化（すなわち置換、挿入、欠失、Ｎ末端切断及び／又はＣ末端切断）により、該変異体が誘導される野生型の成長因子、リポタンパク質、トランスフェリン、表面結合レクチン、ガレクチン、ｃ型レクチン又は毒素タンパク質と異なる。このような変異体は、該変異体が誘導される野生型タンパク質に対する或る特定の程度の配列同一性により代替的に又は付加的に特徴付けることができる。このため、成長因子、リポタンパク質、トランスフェリン、表面結合レクチン、ガレクチン、ｃ型レクチン又は毒素の変異体は、それぞれの参照（野生型）成長因子、リポタンパク質、トランスフェリン、表面結合レクチン、ガレクチン、ｃ型レクチン又は毒素に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
成長因子、リポタンパク質、トランスフェリン、表面結合レクチン、ガレクチン、ｃ型レクチン又は毒素タンパク質の断片（すなわち欠失変異体）は好ましくは、そのＮ末端に及び／又はそのＣ末端に及び／又は内部に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１７０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個又は６００個までのアミノ酸の欠失を有する。
また、成長因子、リポタンパク質、トランスフェリン、表面結合レクチン、ガレクチン、ｃ型レクチン又は毒素タンパク質の変異体又は断片は、野生型の成長因子、リポタンパク質、トランスフェリン、表面結合レクチン、ガレクチン、ｃ型レクチン又は毒素タンパク質の活性の少なくとも３％〜５０％、好ましくは少なくとも３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％又は５０％程度の関連する生体活性を示す場合にのみ、本発明との関連では成長因子、リポタンパク質、トランスフェリン、表面結合レクチン、ガレクチン、ｃ型レクチン又は毒素タンパク質の変異体又は断片とみなされる。好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートに使用される成長因子、リポタンパク質、トランスフェリン、表面結合レクチン、ガレクチン、ｃ型レクチン又は毒素タンパク質の変異体又は断片は、野生型の成長因子、リポタンパク質、トランスフェリン、表面結合レクチン、ガレクチン、ｃ型レクチン又は毒素タンパク質の活性の少なくとも４％〜５０％、少なくとも５％〜５０％、少なくとも１０％〜５０％、少なくとも２０％〜５０％、少なくとも３０％〜５０％、少なくとも４０％〜５０％、又は少なくとも４５％〜５０％程度のその関連する生体活性を示す。これとの関連では、関連する「生体活性」は「細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にする活性」、すなわち細胞と接触し、該細胞に侵入する変異体又は断片の能力である。当業者は、成長因子、リポタンパク質、トランスフェリン、表面結合レクチン、ガレクチン、ｃ型レクチン又は毒素タンパク質の変異体又は断片が、細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にする能力、すなわち野生型の成長因子、リポタンパク質、トランスフェリン、表面結合レクチン、ガレクチン、ｃ型レクチン又は毒素タンパク質の活性の少なくとも３％〜５０％、少なくとも４％〜５０％、少なくとも５％〜５０％、少なくとも１０％〜５０％、少なくとも２０％〜５０％、少なくとも３０％〜５０％、少なくとも４０％〜５０％、又は少なくとも４５％〜５０％、好ましくは少なくとも３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％又は５０％を有するかを容易に評価することができる。それぞれの野生型タンパク質の結合活性と比較した成長因子、リポタンパク質、トランスフェリン、表面結合レクチン、ガレクチン、ｃ型レクチン又は毒素タンパク質の変異体又は断片の「細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にする活性」を求めるのに好適なアッセイ、例えば蛍光標識した変異体又は断片のｉｎ ｖｉｔｒｏ追跡が当業者にとって既知である。本発明と共に使用される好適な野生型の活性標準／ｉｎ ｖｉｔｒｏ追跡アッセイの例が、十分に記載されている（例えば［１４］、［１６］及び［３１］〜［３４］（その全体が本明細書に援用される）等）。
本発明の別の実施形態では、モジュール（ａ）、又はモジュール（ａ）が結合する間接的な標的化アダプタ分子は抗体を含む。好ましくは、該抗体は、抗ＴＧＮ３８／４６、抗トランスフェリン受容体及び抗成長因子受容体からなる群から選択される。
本発明の別の実施形態では、モジュール（ａ）、又はモジュール（ａ）が結合する間接的な標的化アダプタ分子は糖を含む。好ましくは、該糖は、グルコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、Ｎ−アセチルノイラミン酸及びキシロースからなる群から選択される。
本発明の別の実施形態では、モジュール（ａ）、又はモジュール（ａ）が結合する間接的な標的化アダプタ分子は脂質を含む。好ましくは、該脂質は、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質及びステロール脂質からなる群から選択される。
本発明の別の実施形態では、モジュール（ａ）、又はモジュール（ａ）が結合する間接的な標的化アダプタ分子はナノ粒子を含む。好ましくは、該ナノ粒子は、金属、シリケート及びポリマーからなる群から選択される。より好ましくは、該ナノ粒子は、ポリ（ウレタン）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ酸無水物及びポリオルトエステルからなる群から選択されるポリマーである。
本発明の別の実施形態では、モジュール（ａ）、又はモジュール（ａ）が結合する間接的な標的化アダプタ分子は、特異的な細胞の標的化及び細胞取り込みを引き起こす、及び／又はもたらすウイルスペプチドを含む。好ましくは、上記ウイルスペプチドはポリオーマウイルス由来である。より好ましくは、上記ウイルスペプチドは、ＳＶ４０、ネズミ（murine）ポリオーマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、ＫＩウイルス、ＷＵウイルス及びメルケル細胞ポリオーマウイルス由来である。ＳＶ４０の場合、ＧＭ１上のその細胞表面受容体であるシアル酸及びその共受容体であるＭＨＣ Ｉと結合し、その後カベオラへ、またそこからカベオソーム（caveosomes）へと輸送され、更なる輸送によりＳＶ４０が滑面ＥＲへと運ばれることが分かっている［３５］。カベオソームからＥＲへと輸送するのに、ＳＶ４０がカベオラを回避するがカベオソームを利用する二次経路も説明されている［３６］。同様の細胞内輸送経路が、マウスポリオーマウイルス（ｍＰｙＶ）に関して及び他のポリオーマウイルスに関して説明されている［３７］。このため、ＳＶ４０、ネズミポリオーマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、ＫＩウイルス、ＷＵウイルス又はメルケル細胞ポリオーマウイルス由来のウイルスペプチド、断片又は変異体を、本発明のコンジュゲートにおいてモジュール（ａ）として使用することができるか、又はモジュール（ａ）と結合させることができる。
本発明のコンジュゲートは、小胞体（ＥＲ）への輸送を容易にし、好ましくはヒト起源である少なくとも１つのモジュール（モジュール（ｂ）と表される）を含む。基本的には、ＥＲへの輸送を容易にする任意の分子又は構造がモジュール（ｂ）として好適である。好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｂ）は、ＥＲへの輸送を容易にする、好ましくはヒト起源のオリゴペプチドである。本発明のコンジュゲートでは、モジュール（ｂ）は、ＥＲへの輸送を容易にするオリゴペプチドを含むことにより直接的に、又はＥＲへの輸送を容易にする、内因性のタンパク質、ペプチド若しくはオリゴペプチド（本明細書では「内因性のＥＲ輸送タンパク質、ＥＲ輸送ペプチド又はＥＲ輸送オリゴペプチド」として規定される）と結合することにより間接的に逆行性の輸送機能性を与えることができる。
本発明との関連では「オリゴペプチド」という用語は、２個〜９個のアミノ酸残基を含むか又はそれからなるアミノ酸配列を意味する。好ましくは、本発明のコンジュゲートと共に使用されるオリゴペプチドは、２アミノ酸残基長〜９アミノ酸残基長を含む。より好ましくは、本発明のコンジュゲートと共に使用されるオリゴペプチドは、４アミノ酸残基長〜９アミノ酸残基長を含む。より好ましくは、本発明のコンジュゲートと共に使用されるオリゴペプチドは、２アミノ酸残基長、３アミノ酸残基長、４アミノ酸残基長、５アミノ酸残基長、６アミノ酸残基長、７アミノ酸残基長、８アミノ酸残基長又は９アミノ酸残基長である。
本発明のコンジュゲートのモジュール（ｂ）、又はモジュール（ｂ）が結合する内因性のＥＲ輸送タンパク質、ＥＲ輸送ペプチド若しくはＥＲ輸送オリゴペプチドは、アミノ酸配列X1X2X3X4（配列番号１４０）（ここでＸ１がＥ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ又はＳ、好ましくはＫ又はＲであり、Ｘ２がＤ、Ｅ、Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｇ、Ｓ又はＮ、好ましくはＤ又はＥであり、Ｘ３がＥ又はＤ、好ましくはＥであり、Ｘ４がＬ又はＦ、好ましくはＬである）を１つ又は複数含み、任意でＮ末端及び／又はＣ末端に１個〜３個の更なるアミノ酸残基が含まれる、オリゴペプチドを含むことが特に好ましい。
より好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｂ）、又はモジュール（ｂ）が結合する内因性のＥＲ輸送タンパク質、ＥＲ輸送ペプチド若しくはＥＲ輸送オリゴペプチドは、EDEL（配列番号１４１）、HDEL（配列番号１４２）、HEEL（配列番号１４３）、KAEL（配列番号１４４）、KDEF（配列番号１４５）、KEDL（配列番号１４６）、KEEL（配列番号１４７）、KTEL（配列番号１４８）、KVEL（配列番号１４９）、NEDL（配列番号１５０）、PDEL（配列番号１５１）、PGEL（配列番号１５２）、QEDL（配列番号１５３）、QSEL（配列番号１５４）、REDL（配列番号１５５）、RNEL（配列番号１５６）、RTDL（配列番号１５７）、RTEL（配列番号１５８）、ERSTEL（配列番号１５９）、KDEL（配列番号１６０）、AKDEL（配列番号１６１）、PTEL（配列番号１６２）及び／若しくはSTEL（配列番号１６３）モチーフ、又はその変異体を１つ又は複数含むオリゴペプチドを含む［３８、３９］。
EDEL（配列番号１４１）、HDEL（配列番号１４２）、HEEL（配列番号１４３）、KAEL（配列番号１４４）、KDEF（配列番号１４５）、KEDL（配列番号１４６）、KEEL（配列番号１４７）、KTEL（配列番号１４８）、KVEL（配列番号１４９）、NEDL（配列番号１５０）、PDEL（配列番号１５１）、PGEL（配列番号１５２）、QEDL（配列番号１５３）、QSEL（配列番号１５４）、REDL（配列番号１５５）、RNEL（配列番号１５６）、RTDL（配列番号１５７）、RTEL（配列番号１５８）、ERSTEL（配列番号１５９）、KDEL（配列番号１６０）、AKDEL（配列番号１６１）、PTEL（配列番号１６２）及び／若しくはSTEL（配列番号１６３）モチーフの変異体は、モチーフ配列における１個、２個又は３個までのアミノ酸変化（すなわち置換、挿入、欠失、Ｎ末端切断及び／又はＣ末端切断）、好ましくは保存的置換により、該変異体が誘導されるそれぞれの野生型モチーフと異なる。
また上記モチーフ変異体は、それぞれの野生型モチーフの活性の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％程度の関連する生体活性を示す場合にのみ、本発明との関連でモチーフ変異体とみなされる。この文脈での関連する「生体活性」は「小胞体（ＥＲ）への輸送を容易にする活性」、すなわち変異体が小胞体（endoplasmicrecticulum）（ＥＲ）に対してコンジュゲートを標的化する能力である。当業者はEDEL（配列番号１４１）、HDEL（配列番号１４２）、HEEL（配列番号１４３）、KAEL（配列番号１４４）、KDEF（配列番号１４５）、KEDL（配列番号１４６）、KEEL（配列番号１４７）、KTEL（配列番号１４８）、KVEL（配列番号１４９）、NEDL（配列番号１５０）、PDEL（配列番号１５１）、PGEL（配列番号１５２）、QEDL（配列番号１５３）、QSEL（配列番号１５４）、REDL（配列番号１５５）、RNEL（配列番号１５６）、RTDL（配列番号１５７）、RTEL（配列番号１５８）、ERSTEL（配列番号１５９）、KDEL（配列番号１６０）、AKDEL（配列番号１６１）、PTEL（配列番号１６２）及び／又はSTEL（配列番号１６３）モチーフ変異体が、モチーフ変異体がＥＲへの輸送を容易にする能力、すなわちそれぞれの野生型モチーフの活性の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％を有するかを容易に評価することができる。EDEL（配列番号１４１）、HDEL（配列番号１４２）、HEEL（配列番号１４３）、KAEL（配列番号１４４）、KDEF（配列番号１４５）、KEDL（配列番号１４６）、KEEL（配列番号１４７）、KTEL（配列番号１４８）、KVEL（配列番号１４９）、NEDL（配列番号１５０）、PDEL（配列番号１５１）、PGEL（配列番号１５２）、QEDL（配列番号１５３）、QSEL（配列番号１５４）、REDL（配列番号１５５）、RNEL（配列番号１５６）、RTDL（配列番号１５７）、RTEL（配列番号１５８）、ERSTEL（配列番号１５９）、KDEL（配列番号１６０）、AKDEL（配列番号１６１）、PTEL（配列番号１６２）及び／又はSTEL（配列番号１６３）変異体のそれぞれの野生型モチーフの結合活性と比較した「小胞体（ＥＲ）への輸送を容易にする活性」を求めるのに好適なアッセイ、例えば蛍光標識した変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏ追跡が当業者にとって既知である（例えば［３１］を参照されたい）。
別の実施形態では、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｂ）、又は好ましくはモジュール（ｂ）が結合する内因性のＥＲ輸送タンパク質、ペプチド若しくはオリゴペプチドは、ソルチリン、ＳｏｒＬＡ若しくはＳｏｒＣＳタンパク質、ペプチド若しくはオリゴペプチド、又はその断片若しくは変異体である［４０］。
別の実施形態では、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｂ）、又はモジュール（ｂ）が結合する内因性のＥＲ輸送タンパク質、ペプチド若しくはオリゴペプチドは、ＥＲへの輸送を容易にするウイルスペプチドを含む。好ましくは、上記ウイルスペプチドはポリオーマウイルス由来である。より好ましくは、上記ウイルスペプチドはＳＶ４０、ネズミポリオーマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、ＫＩウイルス、ＷＵウイルス及びメルケル細胞ポリオーマウイルス由来である。上記のように、ＳＶ４０はその細胞表面受容体であるＧＭ１上のシアル酸及びその共受容体であるＭＨＣ Ｉと結合し、カベオラへ、そこからカベオソームへ、また最終的に滑面ＥＲへと輸送されることが分かっている［３５］。ＳＶ４０はカベオソームからＥＲへと輸送されるのにカベオラを回避するが、カベオソームを利用することも分かっている［３６］。同様の細胞内輸送経路がマウスポリオーマウイルス（ｍＰｙＶ）に関して及び他のポリオーマウイルスに関して説明されている［３７］。このため、ＳＶ４０、ネズミポリオーマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、ＫＩウイルス、ＷＵウイルス又はメルケル細胞ポリオーマウイルス由来のウイルスペプチド、断片又は変異体をモジュール（ｂ）として使用することができるか、又は本発明のコンジュゲートにおいてモジュール（ｂ）と結合させることができる。
本発明のコンジュゲートは小胞体（ＥＲ）からサイトゾルへの転位（すなわち、ＥＲＡＤ標的化）を容易にする、少なくとも１つのモジュール（モジュール（ｃ）と表される）を含むか又はそれからなり、マウス又はヒト起源であるのが好ましい。代替的に、モジュール（ｃ）は標的細胞においてＥＲＡＤを受けることが可能な又は受けている内因性分子と結合することにより間接的にこのＥＲからサイトゾルへの転位機能を与えることができる。本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）と結合することができる内因性の細胞分子の例としては、ＣＯＸ２、Ｓｇｋ１、α１−抗トリプシン（α１−ＡＴ）のヌルホンコン（null Hong Kong）（ＮＨＫ）変異体、ＡＳＧＰＲ Ｈ２ａ（アシアログリコタンパク質受容体のサブユニット）、ＢＡＣＥ４５７（β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）の膵臓アイソフォーム）、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症コンダクタンス制御因子）のΔＦ５０８、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル−ＣｏＡレダクターゼ）、Ｉｇκ ＬＣ ＮＳ（輸送能力のない（transport-incompetent）免疫グロブリン軽鎖）、ＫＡＩ１（ＣＤ８２としても知られる）、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）クラスＩ分子、Ｐａｅｌ−Ｒ（Ｐａｅｌ受容体）、トランスサイレチン（ＴＴＲ［４１］）等が挙げられるが、これらに限定されない（例えば［４２］を参照されたい）。
好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は迅速なＥＲＡＤ媒介性の分解のために自然状態で半減期が短い細胞分子と結合する。好ましくは、モジュール（ｃ）は内因性ＣＯＸ２又はＳｇｋ１タンパク質又はペプチドと結合する。
好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ２）、免疫グロブリンＭ重鎖（ＩｇＭ（μ））、Ｉｇｈ６（ＩｇＭ（μ）に対するラットホモログ）、血清／グルココルチコイド調節キナーゼ１（Ｓｇｋ１）、ＭＡＴα２、Ｄｅｇ１、接合フェロモンα−因子１タンパク質（ＭＦα１、酵母プレプロ−α因子とも称される）、酵母カルボキシペプチダーゼ（ＣＰＹ）、リシン毒素Ｂ−サブユニット、コレラ毒素Ｂ−サブユニット、志賀毒素（ＳＴｘ）Ｂ−サブユニット、志賀様毒素（ＳＬＴ）Ｂ−サブユニット（ベロ毒素（ＶＴ）Ｂ−サブユニット）、大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）Ｂ−サブユニット、及びアブリン毒素Ｂ−サブユニット、リシン毒素Ａ−サブユニット、コレラ毒素Ａ−サブユニット、志賀毒素Ａ１−サブユニット、志賀様毒素Ａサブユニット（ＶＴ Ａ−サブユニット）、志賀様毒素Ａ１サブユニット（ＶＴ Ａ１−サブユニット）、大腸菌易熱性エンテロトキシン（entertoxin）Ａ−サブユニット、アブリンＡ−サブユニット、そのペプチド断片及びその変異体からなる群から選択されるペプチドを含むか又はそれからなる。
別の実施形態では、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、ＣＬ１（配列番号１６４）、ＣＬ２（配列番号１６５）、ＣＬ６（配列番号１６６）、ＣＬ９（配列番号１６７）、ＣＬ１０（配列番号１６８）、ＣＬ１１（配列番号１６９）、ＣＬ１２（配列番号１７０）、ＣＬ１５（配列番号１７１）、ＣＬ１６（配列番号１７２）、ＳＬ１７（配列番号１７３）からなるＣ末端脱安定化オリゴペプチド、その断片、及びその変異体からなる群から選択されるのが好ましい。好ましくは、ＣＬ１はアミノ酸配列ACKNWFSSLSHFVIHL（配列番号１６４）を有し、ＣＬ２はアミノ酸配列SLISLPLPTRVKFSSLLLIRIMKIITMTFPKKLRS（配列番号１６５）を有し、ＣＬ６はアミノ酸配列FYYPIWFARVLLVHYQ（配列番号１６６）を有し、ＣＬ９はアミノ酸配列SNPFSSLFGASLLIDSVSLKSNWDTSSSSCLISFFSSVMFSSTTRS（配列番号１６７）を有し、ＣＬ１０はアミノ酸配列CRQRFSCHLTASYPQSTVTPFLAFLRRDFFFLRHNSSAD（配列番号１６８）を有し、ＣＬ１１はアミノ酸配列GAPHVVLFDFELRITNPLSHIQSVSLQITLIFCSLPSLILSKFLQV（配列番号１６９）を有し、ＣＬ１２はアミノ酸配列NTPLFSKSFSTTCGVAKKTLLLAQISSLFFLLLSSNIAV（配列番号１７０）を有し、ＣＬ１５はアミノ酸配列PTVKNSPKIFCLSSSPYLAFNLEYLSLRIFSTLSKCSNTLLTSLS（配列番号１７１）を有し、ＣＬ１６はアミノ酸配列SNQLKRLWLWLLEVRSFDRTLRRPWIHLPS（配列番号１７２）を有し、ＳＬ１７はアミノ酸配列SISFVIRSHASIRMGASNDFFHKLYFTKCLTSVILSKFLIHLLLRSTPRV（配列番号１７３）を有する。
より好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、
（ａ）（ＣＯＸ２）、ＩｇＭ（μ）、Ｓｇｋ１、ＭＡＴα２、ＭＦα１、Ｉｇｈ６、Ｄｅｇ１、ＣＰＹ、Ｓｌｔ−Ｉ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−Ｉ Ｂ−サブユニット、Ｓｌｔ−ＩＩ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−ＩＩ Ｂ−サブユニット、Ｓｔｘ １ Ａ−サブユニット、Ｓｔｘ１ Ｂ−サブユニット、リシン毒素Ａ−サブユニット、リシン毒素Ｂ−サブユニット、コレラ毒素Ａ−サブユニット、コレラ毒素Ｂ−サブユニット、ＬＴ Ａ−サブユニット、ＬＴ Ｂ−サブユニット、ＬＴ−ＩＩａ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩａ Ｂ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ｂ−サブユニット、アブリンＡ−サブユニット、アブリンＢ−サブユニット、その断片及びその変異体からなる群から選択されるタンパク質のペプチド、又は
（ｂ）アミノ酸配列ＣＬ１（配列番号１６４）、ＣＬ２（配列番号１６５）、ＣＬ６（配列番号１６６）、ＣＬ９（配列番号１６７）、ＣＬ１０（配列番号１６８）、ＣＬ１１（配列番号１６９）、ＣＬ１２（配列番号１７０）、ＣＬ１５（配列番号１７１）、ＣＬ１６（配列番号１７２）、ＳＬ１７（配列番号１７３）又はその断片若しくは変異体を含むか、それから本質的になるか又はそれからなるペプチド
を含むか、それらから本質的になるか又はそれらからなる。
ＣＯＸ２、ＩｇＭ（μ）、Ｓｇｋ１、ＭＡＴα２、ＭＦα１、Ｉｇｈ６、Ｄｅｇ１、ＣＰＹ、Ｓｌｔ−Ｉ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−Ｉ Ｂ−サブユニット、Ｓｌｔ−ＩＩ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−ＩＩ Ｂ−サブユニット、Ｓｔｘ １ Ａ−サブユニット、Ｓｔｘ１ Ｂ−サブユニット、リシン毒素Ａ−サブユニット、リシン毒素Ｂ−サブユニット、コレラ毒素Ａ−サブユニット、コレラ毒素Ｂ−サブユニット、ＬＴ Ａ−サブユニット、ＬＴ Ｂ−サブユニット、ＬＴ−ＩＩａ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩａ Ｂ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ｂ−サブユニット、アブリンＡ−サブユニット、アブリンＢ−サブユニットの変異体は、それぞれの野生型のＣＯＸ２、ＩｇＭ（μ）、Ｓｇｋ１、ＭＡＴα２、ＭＦα１、Ｉｇｈ６、Ｄｅｇ１、ＣＰＹ、Ｓｌｔ−Ｉ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−Ｉ Ｂ−サブユニット、Ｓｌｔ−ＩＩ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−ＩＩ Ｂ−サブユニット、Ｓｔｘ １ Ａ−サブユニット、Ｓｔｘ１ Ｂ−サブユニット、リシン毒素Ａ−サブユニット、リシン毒素Ｂ−サブユニット、コレラ毒素Ａ−サブユニット、コレラ毒素Ｂ−サブユニット、ＬＴ Ａ−サブユニット、ＬＴ Ｂ−サブユニット、ＬＴ−ＩＩａ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩａ Ｂ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ｂ−サブユニット、アブリンＡ−サブユニット、アブリンＢ−サブユニットのペプチド又はタンパク質とそれぞれ、変異体がその対応する野生型のタンパク質／ペプチドのアミノ酸配列と比較して、変異体のアミノ酸配列において１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１４８個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２２０個、２５０個、２７０個、３００個、３３１個、３５０個、３６８個、３７０個、３７１個、３８７個、４００個、４１０個、４１５個、４１７個、４２０個、４２２個、４２４個、４３５個、４４０個、４５０個、４７０個、５００個、５０４個、５０５個、５１０個、５１５個、５２０個、５５０個、５６０個、５７０個、５７９個、５８５個又は５９０個までのアミノ酸変化（すなわち置換、挿入、欠失、Ｎ末端切断及び／又はＣ末端切断）を含むアミノ酸配列を含むという点で異なる。このような変異体は、その元となる野生型タンパク質に対する或る特定の程度の配列同一性により代替的に又は付加的に特徴付けることができる。このため、ＣＯＸ２、ＩｇＭ（μ）、Ｓｇｋ１、ＭＡＴα２、ＭＦα１、Ｉｇｈ６、Ｄｅｇ１、ＣＰＹ、Ｓｌｔ−Ｉ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−Ｉ Ｂ−サブユニット、Ｓｌｔ−ＩＩ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−ＩＩ Ｂ−サブユニット、Ｓｔｘ １ Ａ−サブユニット、Ｓｔｘ１ Ｂ−サブユニット、リシン毒素Ａ−サブユニット、リシン毒素Ｂ−サブユニット、コレラ毒素Ａ−サブユニット、コレラ毒素Ｂ−サブユニット、ＬＴ Ａ−サブユニット、ＬＴ Ｂ−サブユニット、ＬＴ−ＩＩａ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩａ Ｂ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ｂ−サブユニット、アブリンＡ−サブユニット、アブリンＢ−サブユニットのタンパク質変異体又はペプチド変異体は、それぞれの参照（すなわち野生型）ＣＯＸ２、ＩｇＭ（μ）、Ｓｇｋ１、ＭＡＴα２、ＭＦα１、Ｉｇｈ６、Ｄｅｇ１、ＣＰＹ、Ｓｌｔ−Ｉ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−Ｉ Ｂ−サブユニット、Ｓｌｔ−ＩＩ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−ＩＩ Ｂ−サブユニット、Ｓｔｘ １ Ａ−サブユニット、Ｓｔｘ１ Ｂ−サブユニット、リシン毒素Ａ−サブユニット、リシン毒素Ｂ−サブユニット、コレラ毒素Ａ−サブユニット、コレラ毒素Ｂ−サブユニット、ＬＴ Ａ−サブユニット、ＬＴ Ｂ−サブユニット、ＬＴ−ＩＩａ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩａ Ｂ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ｂ−サブユニット、アブリンＡ−サブユニット、アブリンＢ−サブユニットのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
ＣＯＸ２、ＩｇＭ（μ）、Ｓｇｋ１、ＭＡＴα２、ＭＦα１、Ｉｇｈ６、Ｄｅｇ１、ＣＰＹ、Ｓｌｔ−Ｉ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−Ｉ Ｂ−サブユニット、Ｓｌｔ−ＩＩ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−ＩＩ Ｂ−サブユニット、Ｓｔｘ １ Ａ−サブユニット、Ｓｔｘ１ Ｂ−サブユニット、リシン毒素Ａ−サブユニット、リシン毒素Ｂ−サブユニット、コレラ毒素Ａ−サブユニット、コレラ毒素Ｂ−サブユニット、ＬＴ Ａ−サブユニット、ＬＴ Ｂ−サブユニット、ＬＴ−ＩＩａ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩａ Ｂ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ｂ−サブユニット、アブリンＡ−サブユニット、アブリンＢ−サブユニットのタンパク質又はペプチドのペプチド断片（又は欠失変異体）は好ましくは、そのＮ末端に及び／又はそのＣ末端に及び／又は内部に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１４８個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２２０個、２５０個、２７０個、３００個、３３１個、３５０個、３６８個、３７０個、３７１個、３８７個、４００個、４１０個、４１５個、４１７個、４２０個、４２２個、４２４個、４３５個、４４０個、４５０個、４７０個、５００個、５０４個、５０５個、５１０個、５１５個、５２０個、５５０個、５６０個、５７０個、５７９個、５８５個又は５９０個までのアミノ酸の欠失を有する。
またＣＯＸ２、ＩｇＭ（μ）、Ｓｇｋ１、ＭＡＴα２、ＭＦα１、Ｉｇｈ６、Ｄｅｇ１、ＣＰＹ、Ｓｌｔ−Ｉ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−Ｉ Ｂ−サブユニット、Ｓｌｔ−ＩＩ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−ＩＩ Ｂ−サブユニット、Ｓｔｘ １ Ａ−サブユニット、Ｓｔｘ１ Ｂ−サブユニット、リシン毒素Ａ−サブユニット、リシン毒素Ｂ−サブユニット、コレラ毒素Ａ−サブユニット、コレラ毒素Ｂ−サブユニット、ＬＴ Ａ−サブユニット、ＬＴ Ｂ−サブユニット、ＬＴ−ＩＩａ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩａ Ｂ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ｂ−サブユニット、アブリンＡ−サブユニット、アブリンＢ−サブユニットのタンパク質／ペプチド、タンパク質／ペプチド変異体又はタンパク質／ペプチド断片は、対応する野生型のＣＯＸ２、ＩｇＭ（μ）、Ｓｇｋ１、ＭＡＴα２、ＭＦα１、Ｉｇｈ６、Ｄｅｇ１、ＣＰＹ、Ｓｌｔ−Ｉ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−Ｉ Ｂ−サブユニット、Ｓｌｔ−ＩＩ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−ＩＩ Ｂ−サブユニット、Ｓｔｘ １ Ａ−サブユニット、Ｓｔｘ１ Ｂ−サブユニット、リシン毒素Ａ−サブユニット、リシン毒素Ｂ−サブユニット、コレラ毒素Ａ−サブユニット、コレラ毒素Ｂ−サブユニット、ＬＴ Ａ−サブユニット、ＬＴ Ｂ−サブユニット、ＬＴ−ＩＩａ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩａ Ｂ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ｂ−サブユニット、アブリンＡ−サブユニット、アブリンＢ−サブユニットのタンパク質／ペプチドそれぞれの活性の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％程度の関連する生体活性を示す場合にのみ、本発明との関連ではＣＯＸ２、ＩｇＭ（μ）、Ｓｇｋ１、ＭＡＴアルファ２、ＭＡＴα２、ＭＦα１、Ｉｇｈ６、Ｄｅｇ１、ＣＰＹ、Ｓｌｔ−Ｉ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−Ｉ Ｂ−サブユニット、Ｓｌｔ−ＩＩ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−ＩＩ Ｂ−サブユニット、Ｓｔｘ １ Ａ−サブユニット、Ｓｔｘ１ Ｂ−サブユニット、リシン毒素Ａ−サブユニット、リシン毒素Ｂ−サブユニット、コレラ毒素Ａ−サブユニット、コレラ毒素Ｂ−サブユニット、ＬＴ Ａ−サブユニット、ＬＴ Ｂ−サブユニット、ＬＴ−ＩＩａ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩａ Ｂ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ｂ−サブユニット、アブリンＡ−サブユニット、アブリンＢ−サブユニットのタンパク質／ペプチド、タンパク質／ペプチド変異体又はタンパク質／ペプチド断片とみなされる。この文脈での関連する「生体活性」は「小胞体（ＥＲ）からサイトゾルへの転位を媒介する活性」、すなわち変異体又は断片がＥＲの内腔から細胞のサイトゾルへと転位させる能力である。
当業者は、ＣＯＸ２、ＩｇＭ（μ）、Ｓｇｋ１、ＭＡＴα２、ＭＦα１、Ｉｇｈ６、Ｄｅｇ１、ＣＰＹ、Ｓｌｔ−Ｉ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−Ｉ Ｂ−サブユニット、Ｓｌｔ−ＩＩ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−ＩＩ Ｂ−サブユニット、Ｓｔｘ １ Ａ−サブユニット、Ｓｔｘ１ Ｂ−サブユニット、リシン毒素Ａ−サブユニット、リシン毒素Ｂ−サブユニット、コレラ毒素Ａ−サブユニット、コレラ毒素Ｂ−サブユニット、ＬＴ Ａ−サブユニット、ＬＴ Ｂ−サブユニット、ＬＴ−ＩＩａ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩａ Ｂ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ｂ−サブユニット、アブリンＡ−サブユニット、アブリンＢ−サブユニットのタンパク質／ペプチド、タンパク質／ペプチド変異体又はタンパク質／ペプチド断片が、ＥＲの内腔からサイトゾルへと転位させる能力、すなわち野生型のＣＯＸ２、ＩｇＭ（μ）、Ｓｇｋ１、ＭＡＴα２、ＭＦα１、Ｉｇｈ６、Ｄｅｇ１、ＣＰＹ、Ｓｌｔ−Ｉ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−Ｉ Ｂ−サブユニット、Ｓｌｔ−ＩＩ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−ＩＩ Ｂ−サブユニット、Ｓｔｘ １ Ａ−サブユニット、Ｓｔｘ１ Ｂ−サブユニット、リシン毒素Ａ−サブユニット、リシン毒素Ｂ−サブユニット、コレラ毒素Ａ−サブユニット、コレラ毒素Ｂ−サブユニット、ＬＴ Ａ−サブユニット、ＬＴ Ｂ−サブユニット、ＬＴ−ＩＩａ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩａ Ｂ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ｂ−サブユニット、アブリンＡ−サブユニット、アブリンＢ−サブユニットのタンパク質／ペプチドの活性の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％を有するかを容易に評価することができる。ＣＯＸ２、ＩｇＭ（μ）、Ｓｇｋ１、ＭＡＴα２、ＭＦα１、Ｉｇｈ６、Ｄｅｇ１、ＣＰＹ、Ｓｌｔ−Ｉ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−Ｉ Ｂ−サブユニット、Ｓｌｔ−ＩＩ Ａ−サブユニット、ＳＬｔ−ＩＩ Ｂ−サブユニット、Ｓｔｘ １ Ａ−サブユニット、Ｓｔｘ１ Ｂ−サブユニット、リシン毒素Ａ−サブユニット、リシン毒素Ｂ−サブユニット、コレラ毒素Ａ−サブユニット、コレラ毒素Ｂ−サブユニット、ＬＴ Ａ−サブユニット、ＬＴ Ｂ−サブユニット、ＬＴ−ＩＩａ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩａ Ｂ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ａ−サブユニット、ＬＴＩＩｂ Ｂ−サブユニット、アブリンＡ−サブユニット、アブリンＢ−サブユニットのタンパク質／ペプチド、タンパク質／ペプチド変異体又はタンパク質／ペプチド断片のそれぞれの野生型タンパク質／ペプチドの結合活性と比較した「小胞体（ＥＲ）からサイトゾルへの転位を媒介する能力」を求めるのに好適なアッセイ、変異体又は断片のｉｎ ｖｉｔｒｏ追跡が当該技術分野で既知である（例えば［１７］を参照されたい）。
ＣＯＸ２タンパク質のペプチド断片は、そのＮ末端に及び／又はそのＣ末端に及び／又は内部に、好ましくはそのＮ末端に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２０個、１５０個、１７０個、２００個、２２０個、２５０個、２７０個、３００個、３５０個、３７０個、４００個、４２０個、４５０個、４７０個、５００個、５０４個、５２０個、５５０個、５６０個、５７０個、５７９個、５８５個又は５９０個までのアミノ酸の欠失を有するのが好ましい。
ＩｇＭ（μ）タンパク質のペプチド断片は、そのＮ末端に及び／又はそのＣ末端に及び／又は内部に、好ましくはそのＮ末端に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２０個、１５０個、１７０個、２００個、２２０個、２５０個、２７０個、３００個、３２０個、３５０個、３６０個、３７０個、３８０個、３９０個、４００個、４１０個、４２０個、４３５個又は４４０個までのアミノ酸の欠失を有するのが好ましい。
Ｓｇｋ１タンパク質のペプチド断片は、そのＮ末端に及び／又はそのＣ末端に及び／又は内部に、好ましくはそのＣ末端に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２０個、１５０個、１７０個、２００個、２２０個、２５０個、２７０個、３００個、３２０個、３２５個、３３１個、３５０個、３６０個、３６８個、３７１個、３８０個、３８７個、４００個、４１０個、４１５個、４１７個、４２２個又は４２４個までのアミノ酸の欠失を有するのが好ましい。
ＭＡＴα２ペプチドのペプチド断片は、そのＮ末端に及び／又はそのＣ末端に及び／又は内部に、好ましくはそのＣ末端に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３５個、１４０個、１４８個、１５０個又は１６０個までのアミノ酸の欠失を有するのが好ましい。
ＭＦα１ペプチドのペプチド断片は、そのＮ末端に及び／又はそのＣ末端に及び／又は内部に、好ましくはそのＣ末端に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３５個、１４０個、１４８個、１５０個又は１６０個までのアミノ酸の欠失を有するのが好ましい。
好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）はヒトＣＯＸ２タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ３５３５４、配列番号１７４）のペプチドを含むか又はそれからなる。本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）がヒトＣＯＸ２のアミノ酸５０４〜アミノ酸６０４（配列番号１７５）を含むか若しくはそれからなる、好ましくはそれからなるヒトＣＯＸ２タンパク質のＣ末端ペプチド断片を含むか又はそれからなることが特に好ましい。より好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）はヒトＣＯＸ２タンパク質のアミノ酸５８０〜アミノ酸５９８（配列番号１７６）又はアミノ酸５８０〜アミノ酸６０４（配列番号１７７）を含むか若しくはそれからなる、好ましくはそれからなるヒトＣＯＸ２タンパク質のＣ末端ペプチド断片を含むか又はそれからなる。
本発明のコンジュゲートの特に好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は、ＣＯＸ２のアミノ酸配列NX1SX2X3X4X5X6X7X8X9INPTX10X11X12X13（配列番号１７８）（ここでＸ１はＡ、Ｓ又はＶであり、Ｘ２はＳ、Ａ又はＴであり、Ｘ３はＳ又はＶであり、Ｘ４はＲ、Ｈ又はＮであり、Ｘ５はＳ又はＴであり、Ｘ６はＧ、Ｒ、Ｔ又はＡであり、Ｘ７はＬ、Ｖ又はＭであり、Ｘ８はＤ、Ｎ又はＥであり、Ｘ９はＤ又はＮであり、Ｘ１０はＶ又はＬであり、Ｘ１１はＬ又はＶであり、Ｘ１２はＬ又はＩであり、Ｘ１３はＫ又はＮである）を含むか若しくはそれからなるペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
本発明のコンジュゲートのより好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は、ＣＯＸ２のアミノ酸配列NASSSRSGLDDINPTVLLK（配列番号１７６）、NASASHSRLDDINPTVLIK（配列番号１７９）、又はNASSSHSGLDDINPTVLLK（配列番号１８０）を含むか若しくはそれからなるペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
本発明のコンジュゲートの特に好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は、アミノ酸配列NX1SSX2X3SX4X5DDINPTVLLK（配列番号１８１）（ここでＸ１はＡ、Ｇ又はＶであり、Ｘ２はＳ又はＡであり、Ｘ３はＲ、Ｈ又はＮであり、Ｘ４はＧ、Ｒ又はＡであり、Ｘ５はＬ又はＳである）を含むか若しくはそれからなるペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
本発明のコンジュゲートのより特に好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は、ヒトＣＯＸ２のアミノ酸配列NASSSRSGLDDINPTVLLKERSTEL（配列番号１７７）を含むか若しくはそれからなるペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、マウスＩｇＭ（μ）タンパク質（アクセッション番号ＣＡＡ２７３２６、配列番号１８２）のペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）がマウスＩｇＭ（μ）のアミノ酸４２１〜アミノ酸４５５（配列番号１８３）を含むか若しくはそれからなる、好ましくはそれからなる、マウスＩｇＭ（μ）タンパク質のＣ末端ペプチド断片を含むか又はそれからなるのが特に好ましい。より好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、マウスＩｇＭ（μ）のアミノ酸４３６〜アミノ酸４５５（配列番号１８４）を含むか若しくはそれからなる、好ましくはそれからなる、マウスＩｇＭ（μ）タンパク質のＣ末端ペプチド断片を含むか又はそれからなる。
本発明のコンジュゲートのより好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は、ＩｇＭ（μ）のアミノ酸配列GKPTLYNVSLIMSDTGGTCY（配列番号１８４）、GKPTLYNVSLVMSDTAGTCY（配列番号１８５）、GKPTLYQVSLIMSDTGGTCY（配列番号１８６）又はGKPTLYQVSSLIMSDTGGTSY（配列番号１８７）を含むか若しくはそれからなるペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、ヒトＩｇＭ（μ）タンパク質（アクセッション番号ＣＡＣ２０４５８、配列番号１８８）のペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）がヒトＩｇＭ（μ）のアミノ酸４２１〜アミノ酸４５５（配列番号１８９）を含むか若しくはそれからなる、好ましくはそれからなる、ヒトＩｇＭ（μ）タンパク質のＣ末端ペプチド断片を含むか又はそれからなるのが特に好ましい。より好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、ヒトＩｇＭ（μ）のアミノ酸４３６〜アミノ酸４５５（配列番号１８５）を含むか若しくはそれからなる、好ましくはそれからなる、ヒトＩｇＭ（μ）タンパク質のＣ末端ペプチド断片を含むか又はそれからなる。
本発明のコンジュゲートの特に好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は、ＩｇＭ（μ）のアミノ酸配列GKPTLYX1VSLX2MSDTX3GTX4Y（配列番号１９０）（ここでＸ１はＮ又はＱであり、Ｘ２はＩ又はＶであり、Ｘ３はＧ又はＡであり、Ｘ４はＣ又はＳである）を含むか若しくはそれからなるペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、マウスＳｇｋ１タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＷＶＣ６、配列番号１９１）のペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）がマウスＳｇｋ１タンパク質のアミノ酸１〜アミノ酸１００（配列番号１９２）を含むか若しくはそれからなる、好ましくはそれからなる、マウスＳｇｋ１タンパク質のＮ末端ペプチド断片を含むか、本質的にそれからなるか又はそれからなるのが特に好ましい。好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、マウスＳｇｋ１タンパク質のアミノ酸１〜アミノ酸６０（配列番号１９３）を含むか若しくはそれからなる、好ましくはそれからなる、マウスＳｇｋ１タンパク質のＮ末端ペプチド断片を含むか、本質的にそれからなるか又はそれからなる。好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、マウスＳｇｋ１タンパク質のアミノ酸１〜アミノ酸３３（配列番号１９４）を含むか若しくはそれからなる、好ましくはそれからなる、マウスＳｇｋ１タンパク質のＮ末端ペプチド断片を含むか、本質的にそれからなるか又はそれからなる。
好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、ヒトＳｇｋ１タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ００１４、配列番号１９５）のペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）がヒトＳｇｋ１タンパク質のアミノ酸１〜アミノ酸１００（配列番号１９６）を含むか若しくはそれからなる、好ましくはそれからなる、ヒトＳｇｋ１タンパク質のＮ末端ペプチド断片を含むか、本質的にそれからなるか又はそれからなるのが特に好ましい。好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、ヒトＳｇｋ１タンパク質のアミノ酸１〜アミノ酸６０（配列番号１９７）を含むか若しくはそれからなる、好ましくはそれからなる、ヒトＳｇｋ１タンパク質のＮ末端ペプチド断片を含むか、本質的にそれからなるか又はそれからなる。好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、ヒトＳｇｋ１タンパク質のアミノ酸１〜アミノ酸３３（配列番号１９８）を含むか若しくはそれからなる、好ましくはそれからなる、ヒトＳｇｋ１タンパク質のＮ末端ペプチド断片を含むか、本質的にそれからなるか又はそれからなる。好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、ヒトＳｇｋ１タンパク質のアミノ酸１〜アミノ酸３０（配列番号１９９）を含むか若しくはそれからなる、好ましくはそれからなる、ヒトＳｇｋ１タンパク質のＮ末端ペプチド断片を含むか、本質的にそれからなるか又はそれからなる。
本発明のコンジュゲートの特に好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は、マウスＳｇｋ１タンパク質のアミノ酸配列MTX1X2X3X4EX5X6X7X8X9X10X11LTYSX12X13RGX14VAX15LX16AFMKQRX17MGLNDFIQKX18X19X20NX21YACKHX22EVQSX23LX24X25（配列番号２００）（ここでＸ１はＶ又はＩであり、Ｘ２はＫ又はＱであり、Ｘ３はＡ又はＴであり、Ｘ４はＸ（Ｘは０個のアミノ酸である）又はＡであり、Ｘ５はＡ又はＴであり、Ｘ６はＡ又はＳであり、Ｘ７はＲ、Ｋ、Ｇ又はＶであり、Ｘ８はＳ、Ｇ又はＰであり、Ｘ９はＴ、Ｐ又はＡであり、Ｘ１０はＸ又はＰであり、Ｘ１１はＸ又はＤであり、Ｘ１２はＲ又はＫであり、Ｘ１３はＭ又はＴであり、Ｘ１４はＭ又はＬであり、Ｘ１５はＩ又はＮであり、Ｘ１６はＩ又はＳであり、Ｘ１７はＲ又はＫであり、Ｘ１８はＩ又はＬであり、Ｘ１９はＡ又はＳであり、Ｘ２０はＳ、Ｎ、Ａ又はＴであり、Ｘ２１はＴ又はＳであり、Ｘ２２はＡ、Ｐ又はＴであり、Ｘ２３はＩ又はＹであり、Ｘ２４はＫ又はＮであり、Ｘ２５はＭ、Ｉ又はＬである）を含むペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
本発明のコンジュゲートのより好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は、マウスＳｇｋ１のMTVKAEAARSTLTYSRMRGMVAILIAFMKQRRMGLNDFIQKIASNTYACKHAEVQSILKM（配列番号１９３）、ヒトＳｇｋ１のMTVKTEAAKGTLTYSRMRGMVAILIAFMKQRRMGLNDFIQKIANNSYACKHPEVQSILKI（配列番号１９７）、ヒトＳｇｋ１のMTVKTEAAKGTLTYSRMRGMVAILIAFMKQ（配列番号１９９）、ラットＳｇｋ１のMTVKTEAARSTLTYSRMRGMVAILIAFMKQRRMGLNDFIQKLANNSYACKHPEVQSYLKI（配列番号２０１）（Ｉｇｈ６とも称される、アクセッション番号ＡＡＩ０５８２６）、ウサギＳｇｋ１のMTVKTEAARGPLTYSRMRGMVAILIAFMKQRRMGLNDFIQKIANNSYACKHTEVQSILKI（配列番号２０２）、ニワトリＳｇｋ１のMTVKAAEASGPALTYSKMRGMVAILIAFMKQRRMGLNDFIQKIATNSYACKHPEVQSILK（配列番号２０３）、又はゼブラフィッシュＳｇｋ１のMTIQTETSVSAPDLTYSKTRGLVANLSAFMKQRKMGLNDFIQKLSANSYACKHPEVQSIL（配列番号２０４）のアミノ酸配列を含むペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
本発明のコンジュゲートのより好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は、Ｓｇｋ１のMTVKTEAAKGTLTYSRMRGMVAILIAFMKQ（配列番号１９９）、MRGMVAILIAFMKQRRMGLNDFIQKIASNTYACKHAEVQSILKM（配列番号２０５）、MRGMVAILIAFMKQ（配列番号２０６）、GMVAILIAF（配列番号２０７）、MRGMVAILIAFMKQRRM（配列番号２０８）、GMVAILI（配列番号２０９）又はMRGMVAILIAFMKQRRMGLNDFIQKIANNSYACKHPEVQSILKI（配列番号２１０）のアミノ酸配列を含むペプチド（Ｓｇｋ１ペプチド断片と表される）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、酵母由来のＭＡＴα２ペプチド（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００９８６８）（配列番号２１１）のペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）がアミノ酸１〜アミノ酸１００（配列番号２１２）を含む、酵母由来のＭＡＴα２ペプチドのＮ末端ペプチド断片を含むか又はそれからなるのが特に好ましい。より好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、ＭＡＴα２のアミノ酸１〜アミノ酸６２（配列番号２１３、Ｄｅｇ１分解シグナルとも称される）を含む、酵母由来のＭＡＴα２タンパク質のＮ末端ペプチド断片を含むか、本質的にそれからなるか又はそれからなる。
本発明のコンジュゲートの特に好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は、ＭＡＴα２のアミノ酸配列MNKIPIKDLLNPQITDEFKSSILDINKKLFSICCNLPKLPESVTTEEEVELRDILX1FLSRAN（配列番号２１４）（ここでＸ１はＧ、Ｖ又はＬである）を含むペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
本発明のコンジュゲートのより好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は、ＭＡＴα２のアミノ酸配列MNKIPIKDLLNPQITDEFKSSILDINKKLFSICCNLPKLPESVTTEEEVELRDILGFLSRAN（配列番号２１３）、MNKIPIKDLLNPQITDEFKSSILDINKKLFSICCNLPKLPESVTTEEEVELRDILVFLSRAN（配列番号２１５）、又はMNKIPIKDLLNPQITDEFKSSILDINKKLFSICCNLPKLPESVTTEEEVELRDILLFLSRAN（配列番号２１６）を含むペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
本発明のコンジュゲートのより好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は、ＭＡＴα２のアミノ酸配列ITDEFKSSILDINKKLFSI（配列番号２１７）又はITDEFKSSILDINKKLFSICCNLPKLPESV（配列番号２１８）を含むペプチド（ＭＡＴα２ペプチド断片と表される）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、酵母のＭＦα１ペプチド（配列番号２１９［９］、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１１４９、アクセッション番号ＣＡＡ２５７３８、ＡＡＡ８８７２７）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
本発明のコンジュゲートの特に好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は、ＭＦα１のアミノ酸配列MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVX1TTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFSX1STNNGLLFIX1TTIASIAAKEEGVSLDKREAEAWHWLQLKPGQPMYKREAEAEAWHWLQLKPGQPMYKREADAEAWHWLQLKPGQPMYKREADAEAWHWLQLKPGQPMY（配列番号２２０）（ここでＸ１はＮ又はＱである）を含むペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
本発明のコンジュゲートのより好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は、ＭＦα１のアミノ酸配列MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVQTTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFSQSTNNGLLFIQTTIASIAAKEEGVSLDKREAEAWHWLQLKPGQPMYKREAEAEAWHWLQLKPGQPMYKREADAEAWHWLQLKPGQPMYKREADAEAWHWLQLKPGQPMY（配列番号２２１）、MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKREAEAWHWLQLKPGQPMYKREAEAEAWHWLQLKPGQPMYKREADAEAWHWLQLKPGQPMYKREADAEAWHWLQLKPGQPMY（配列番号２１９）、MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFIQTTIASIAAKEEGVSLDKREAEAWHWLQLKPGQPMYKREAEAEAWHWLQLKPGQPMYKREADAEAWHWLQLKPGQPMYKREADAEAWHWLQLKPGQPMY（配列番号２２２）、又はMRFPSIFTAVLFAASSALAAPVQTTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKREAEAWHWLQLKPGQPMYKREAEAEAWHWLQLKPGQPMYKREADAEAWHWLQLKPGQPMYKREADAEAWHWLQLKPGQPMY（配列番号２２３）を含むペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、酵母のＣＰＹタンパク質（アクセッション番号Ｐ５２７１０、配列番号２２４）のペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
別の好ましい実施形態では、ＣＰＹタンパク質のペプチド断片は、そのＮ末端に、そのＣ末端に及び／又は内部に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３５個、１４０個、１４８個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２２０個、２５０個、２７０個、３００個、３５０個、３７０個、４００個、４２０個、４５０個、４７０個、５００個、５０５個、５１０個、５１５個、５２０個までのアミノ酸の欠失を有する。
好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、毒素タンパク質のペプチドを含むか、本質的にそれからなるか又はそれからなる。毒素タンパク質のペプチド断片は好ましくは、そのＮ末端に、そのＣ末端に及び／又は内部に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３５個、１４０個、１４８個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２２０個、２５０個、２５１個、２５８個、２５９個、２７０個、３００個、３１５個、３１９個、３５０個、３７０個、４００個、４２０個、４５０個、４７０個、５００個、５０５個、５１０個、５１５個、５２０個、５４１個までのアミノ酸の欠失を有する。
好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、リシン毒素Ｂ−サブユニット、コレラ毒素Ｂ−サブユニット、志賀毒素（ＳＴｘ）Ｂ−サブユニット、志賀様毒素（ＳＬＴ）Ｂ−サブユニット（ベロ毒素（ＶＴ）Ｂ−サブユニット）、大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）Ｂ−サブユニット、及びアブリン毒素Ｂ−サブユニットからなる群から選択される毒素タンパク質のペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。好ましくは、モジュール（ｃ）は、リシン毒素Ｂ−サブユニットペプチド、組換えにより生成されたリシン毒素Ｂ−サブユニット由来のペプチド（例えば国際公開第２００８／１５７２６３号に記載のような）、コレラ毒素Ｂ−サブユニットペプチド、Ｓｔｘ Ｂ−サブユニットペプチド、ＳＴｘ１（ＳＬＴ−Ｉ又はＶＴ１）Ｂ−サブユニットペプチド、ＳＬＴ−Ｉｂ Ｂ−サブユニットペプチド、ＳＬＴ−Ｉｃ Ｂ−サブユニットペプチド（ＶＴ１ｃペプチド）、ＳＬＴ−ＩＩｂ−サブユニットペプチド（ＶＴ２ペプチド）、ＳＬＴ−ＩＩｃ Ｂ−サブユニットペプチド（ＶＴ２ｃペプチド）、ＳＬＴ−ＩＩｄ Ｂ−サブユニットペプチド（ＶＴ２ｄペプチド）、ＳＬＴ−ＩＩｅ Ｂ−サブユニットペプチド（ＶＴ２ｅペプチド）、ＳＬＴ−ＩＩｆ Ｂ−サブユニットペプチド（ＶＴ２ｆペプチド）、ＬＴ Ｂ−サブユニットペプチド、ＬＴＩＩａ Ｂ−サブユニットペプチド、ＬＴＩＩｂ Ｂ−サブユニットペプチド、又はアブリン毒素Ｂ−サブユニットペプチドを含む。
リシン毒素Ｂ−サブユニットのペプチドは好ましくは、配列番号１２４によるアミノ酸配列FSVYDVSILIPIIALMVYRCAPPPSSQF（配列番号２２５）又はその断片若しくは変異体を含むか又はそれからなる、好ましくはそれからなる。
コレラ毒素Ｂ−サブユニットのペプチドは好ましくは、配列番号１２５によるアミノ酸配列YGLAGFPPPEHRAWREEPWIHHAPPGCGNAPRSS（配列番号２２６）又はその断片若しくは変異体を含むか又はそれからなる、好ましくはそれからなる。
志賀毒素（Ｓｔｘ）Ｂ−サブユニット（Ｓｔｘ）のペプチドは好ましくは、配列番号１２６によるアミノ酸配列ISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR（配列番号２２７）又はその断片若しくは変異体を含むか又はそれからなる、好ましくはそれからなる。
Ｓｔｘ１ Ｂ−サブユニットのペプチドは好ましくは、配列番号１２７によるアミノ酸配列又はその断片若しくは変異体を含むか又はそれからなる、好ましくはそれからなる。
Ｓｌｔ−Ｉｂ Ｂ−サブユニットのペプチドは好ましくは、配列番号１２８によるアミノ酸配列又はその断片若しくは変異体を含むか又はそれからなる、好ましくはそれからなる。
Ｓｌｔ−Ｉｃ Ｂ−サブユニットのペプチドは好ましくは、配列番号１２９によるアミノ酸配列又はその断片若しくは変異体を含むか又はそれからなる、好ましくはそれからなる。
Ｓｌｔ−ＩＩ Ｂ−サブユニットのペプチドは好ましくは、ISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVRによるアミノ酸配列（配列番号２２８）又はその断片若しくは変異体を含むか又はそれからなる、好ましくはそれからなる。
Ｓｌｔ−ＩＩｂ Ｂ−サブユニットのペプチドは好ましくは、配列番号１３０によるアミノ酸配列又はその断片若しくは変異体を含むか又はそれからなる、好ましくはそれからなる。
Ｓｌｔ−ＩＩｃ Ｂ−サブユニットのペプチドは好ましくは、配列番号１３１によるアミノ酸配列又はその断片若しくは変異体を含むか又はそれからなる、好ましくはそれからなる。
Ｓｌｔ−ＩＩｄ Ｂ−サブユニットのペプチドは好ましくは、配列番号１３２によるアミノ酸配列又はその断片若しくは変異体を含むか又はそれからなる、好ましくはそれからなる。
Ｓｌｔ−ＩＩｅ Ｂ−サブユニットのペプチドは好ましくは、配列番号１３３によるアミノ酸配列又はその断片若しくは変異体を含むか又はそれからなる、好ましくはそれからなる。
Ｓｌｔ−ＩＩｆ Ｂ−サブユニットのペプチドは好ましくは、配列番号１３４を含むアミノ酸配列又はその断片若しくは変異体を含む。
ＬＴ−Ｂ Ｂ−サブユニットのペプチドは好ましくは、配列番号１３５、配列番号１３６によるアミノ酸配列又はその断片若しくは変異体を含むか又はそれからなる、好ましくはそれからなる。
ＬＴ−ＩＩａ Ｂ−サブユニットのペプチドは好ましくは、配列番号１３７によるアミノ酸配列又はその断片若しくは変異体を含むか又はそれからなる、好ましくはそれからなる。
ＬＴ−ＩＩｂ Ｂ−サブユニットのペプチドは好ましくは、配列番号１３８によるアミノ酸配列又はその断片若しくは変異体を含むか又はそれからなる、好ましくはそれからなる。
アブリン毒素Ｂ−サブユニットのペプチドは好ましくは、配列番号１３９によるアミノ酸配列又はその断片若しくは変異体を含むか又はそれからなる、好ましくはそれからなる。
別の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、毒素のＡサブユニット又はＡ１サブユニットのペプチド（該ペプチドは非毒性であるのが好ましい）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるモジュール（ｃ）を含む。好ましくは、モジュール（ｃ）は、リシン毒素Ａ−サブユニット、コレラ毒素Ａ−サブユニット、志賀毒素（ＳＴｘ）Ａ−サブユニット、志賀様毒素（ＳＬＴ）Ａ−サブユニット（ベロ毒素（ＶＴ）Ａ−サブユニット）、大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）Ａ−サブユニット、アブリン毒素Ａ−サブユニット、百日咳毒素Ａ−サブユニット、モデシンＡ−サブユニット、ボルケンシンＡ−サブユニット及びシュードモナス外毒素Ａサブユニットからなる群から選択される毒素タンパク質又はペプチド（該毒素タンパク質又はペプチドは非毒性であるのが好ましい）を含むか又はそれからなる。好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、リシン毒素、コレラ毒素、志賀毒素（Ｓｔｘ）、志賀様毒素（ＳＬＴ）Ｉ（ＳＴｘ１、ＳＬＴ−Ｉ又はＶＴ１）、ＳＬＴ−Ｉｂ、ＳＬＴ−Ｉｃ（ＶＴ１ｃ）、ＳＬＴ−ＩＩｂ（Ｓｔｘ２又はＶＴ２）、ＳＬＴ−ＩＩｃ（Ｓｔｘ２ｃ又はＶＴ２ｃ）、ＳＬＴ−ＩＩｄ（Ｓｔｘ２ｄ又はＶＴ２ｄ）、ＳＬＴ−ＩＩｅ（Ｓｔｘ２ｅ又はＶＴ２ｅ）、ＳＬＴ−ＩＩｆ（Ｓｔｘ２ｆ又はＶＴ２ｆ）、ＬＴ、ＬＴＩＩａ、ＬＴＩＩｂ若しくはアブリン毒素のＡ又はＡ１サブユニットの非毒性ペプチドを含むか又はそれからなる。より好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、志賀毒素（Ｓｔｘ）、志賀様毒素（ＳＬＴ）又は大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）のＡ又はＡ１サブユニットの非毒性ペプチドを含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）はリシン毒素Ａ１−サブユニット（配列番号２８２、リシン毒素Ａ）の非毒性ペプチドを含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）はコレラ毒素Ａ１−サブユニット（配列番号２８３、コレラ毒素Ａ）の非毒性ペプチドを含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は志賀毒素（ＳＴｘ）Ａ１−サブユニット（配列番号２２９、ＳＴｘ Ａ１）の非毒性ペプチドを含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は志賀様毒素Ｉ Ａ１−サブユニット（配列番号２３０、ＳＴｘ１ Ａ１（ＳＩｔ−Ｉ Ａ１又はＶＴ１ Ａ１）［４３］）の非毒性ペプチドを含むか又はそれからなる。好ましくは、ＳＩｔ−Ｉ Ａ１のペプチドは、ISFGSINAILGSVALILNCHHHASRVAR（配列番号２３１、ＳＩｔ−Ｉ Ａ１のアミノ酸２２４〜アミノ酸２５１）、ISFGSINAILGSVALILNCHHH（配列番号２３２、ＳＩｔ−Ｉ Ａ１アミノ酸２２４〜アミノ酸２４５）、ISFGSINAILGSVALIL（配列番号２３３、ＳＩｔ−Ｉ Ａ１のアミノ酸２２４〜アミノ酸２４０）によるアミノ酸配列、又はその断片若しくは変異体を含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は志賀様毒素Ｉｃ Ａ−サブユニットペプチド（配列番号２３４、ＶＴ１ｃ Ａ）の非毒性ペプチドを含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は志賀様毒素ＩＩｂ Ａ１−サブユニット（配列番号２３５、ＳＬＴ−ＩＩｂ Ａ１、Ｓｔｘ２ Ａ１、又はＶＴ２ Ａ１）の非毒性ペプチドを含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は志賀様毒素ＩＩｄ Ａ−サブユニット（配列番号２３６、ＳＬＴ−ＩＩｄ Ａ、Ｓｔｘ２ｄ Ａ、又はＶＴ２ｄ Ａ）の非毒性ペプチドを含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は志賀様毒素ＩＩｅ Ａ−サブユニット（配列番号２３７、ＳＬＴ−ＩＩｅ Ａ、Ｓｔｘ２ｅ Ａ、又はＶＴ２ｅ Ａ）の非毒性ペプチドを含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は志賀様毒素ＩＩｆ Ａ−サブユニット（配列番号２３８、ＳＬＴ−ＩＩｆ Ａ、Ｓｔｘ２ｆ Ａ、又はＶＴ２ｆ Ａ）の非毒性ペプチドを含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は、大腸菌易熱性エンテロトキシンＬＴ Ａ−サブユニット（配列番号２３９（ＬＴ Ａヒト株）又は配列番号２４０（ＬＴ Ａブタ株））の非毒性ペプチドを含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は、大腸菌易熱性エンテロトキシンＬＴ−ＩＩａ Ａ−サブユニット（配列番号２４１、ＬＴ−ＩＩａ Ａ）の非毒性ペプチドを含むか又はそれからなる。好ましくは、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）は、YQLAGFPSNFPAWREMPWSTFAPEQCVPNNK（配列番号２４２）によるアミノ酸配列を含むＬＴ−ＩＩａ Ａを含む非毒性ペプチドを含むか又はそれからなる。
好ましい実施形態では、モジュール（ｃ）は大腸菌易熱性エンテロトキシンＬＴ−ＩＩｂ Ａ−サブユニット（配列番号２４３、ＬＴ−ＩＩｂ Ａ）の非毒性ペプチドを含むか又はそれからなる。
別の実施形態では、本発明のコンジュゲートのモジュール（ｃ）はＥＲからサイトゾルへの転位を容易にするウイルスペプチドを含むか又はそれからなる。好ましくは、上記ウイルスペプチドはポリオーマウイルス由来である。より好ましくは、上記ウイルスペプチドはＳＶ４０、ネズミポリオーマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、ＫＩウイルス、ＷＵウイルス及びメルケル細胞ポリオーマウイルス由来である。更に好ましくは、上記ウイルスペプチドはＳＶ４０又はネズミポリオーマウイルス由来である。ポリオーマウイルス（例えばｍＰｙＶ及びＳＶ４０）はＥＲ関連の分解機構によりＥＲ内でミスフォオールドしたタンパク質として認識され、続いてＥＲＡＤによりサイトゾルへと輸送されることが分かっている［３７］。このため、ＳＶ４０、ネズミポリオーマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、ＫＩウイルス、ＷＵウイルス又はメルケル細胞ポリオーマウイルス由来のウイルスペプチド、断片又は変異体を本発明のコンジュゲートにおいてモジュール（ｃ）として使用することができる。
当業者は本発明によるモジュール（ｃ）を作製する方法を熟知している。例えば、モジュール（ｃ）を例えば液相又は固相ペプチド合成により化学合成することができるか、又はペプチドを組換えＤＮＡ技法及び細胞発現系、例えば細菌、例えば大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞等、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系を用いて遺伝子操作することができる。
好ましい実施形態では、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）が単一の連続ペプチド内に含まれる。好ましくは、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含む単一の連続ペプチドはNASSSRSGLDDINPTVLLKERSTEL（ＣＸ１ａ、配列番号１７７）、NASSSRSGLDDINPTVLLKAKDEL（ＣＸ２ａ、配列番号２４４）、及びGKPTLYQVSLIMSDTGGTSYKDEL（配列番号２４５）からなる群から選択される。
本発明との関連では、「少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）及び少なくとも１つのモジュール（ｃ）」は本発明の「送達担体」としても規定されている。好ましくは、送達担体は少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）及び少なくとも１つのモジュール（ｃ）を含み、ここで少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）及び少なくとも１つのモジュール（ｃ）が任意の配置で互いに結合する。より好ましくは、本発明の送達担体は、ＲＴＢ、ＲＴＢ−ＣＯＸ２ペプチド、ＲＴＢ−ＣＯＸ２ペプチド−ＡＫＤＥＬペプチド、ＲＴＢ−ＡＫＤＥＬペプチド、ＲＴＢ−Ｓｇｋ１ペプチド−ＡＫＤＥＬペプチド、ＴｆＲペプチド−ＣＯＸ２ペプチド−ＡＫＤＥＬペプチド、Ｓｇｋ１ペプチド−ＴｆＲペプチド−ＡＫＤＥＬペプチド、ＴｆＲペプチド−ＡＫＤＥＬペプチド−ＩｇＭ（μ）ペプチド、又はＴｆＲペプチド−ＩｇＭ（μ）ペプチド−ＡＫＤＥＬペプチドを含む。
本発明のコンジュゲートは少なくとも１つの化合物（ｄ）を含む。該化合物（ｄ）は核酸、ペプチド、タンパク質、医薬品、細胞毒性剤、放射性作用物質、又は別の治療成分若しくは診断成分であるのが好ましい。
好ましい実施形態では、化合物（ｄ）は核酸である。好ましくは、核酸は、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、一本鎖若しくは二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、モルホリノ修飾ｉＲＮＡ（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００７６０５６号、米国特許第７，７４５，６０８号に記載のようなもの）、アンチジーンＲＮＡ（ａｇＲＮＡ、例えば［４４］）等である。
好ましくは、本発明のコンジュゲートは、ＲＴＢ−ｓｉＲＮＡ、リジン結合によりｓｉＲＮＡと結合したＲＴＢ（例えば図４を参照されたい）、システイン結合によりｓｉＲＮＡと結合したＲＴＢ（例えば図５を参照されたい）、ＲＴＢ−ＣＯＸ２ペプチド−ｓｉＲＮＡ（例えば図６Ａ及び図６Ｂを参照されたい）、ＲＴＢ−ＣＯＸ２ペプチド−ＡＫＤＥＬペプチド−ｓｉＲＮＡ（例えば図７を参照されたい）、ＲＴＢ−ＡＫＤＥＬペプチド−ｓｉＲＮＡ（例えば図８を参照されたい）、ＲＴＢ−Ｓｇｋ１ペプチド−ＡＫＤＥＬペプチド−ｓｉＲＮＡ（例えば図９を参照されたい）、ＴｆＲペプチド−ＣＯＸ２ペプチド−ＡＫＤＥＬペプチド−ｓｉＲＮＡ（例えば図１０Ａ及び図１０Ｂを参照されたい）、Ｓｇｋ１ペプチド−ＴｆＲペプチド−ＡＫＤＥＬペプチド−ｓｉＲＮＡ（例えば図１１を参照されたい）、ＴｆＲペプチド−ＡＫＤＥＬペプチド−ＩｇＭ（μ）ペプチド−ｓｉＲＮＡ（例えば図１２を参照されたい）、ＴｆＲペプチド−ＩｇＭ（μ）ペプチド−ＡＫＤＥＬペプチド−ｓｉＲＮＡ（例えば図１３を参照されたい）、又はＲＴＢ−ＣＯＸ２ペプチド−ＡＫＤＥＬペプチド−２つのｓｉＲＮＡ（例えば図１４を参照されたい）を含むように構成される。
好ましくは、本発明のコンジュゲートは図４、図５、図６Ａ、図６Ｂ、図７、図８、図９、図１０Ａ、図１０Ｂ、図１１、図１２、図１３、又は図１４に示されるような構成を含む。
先に述べられるように、核酸分子を細胞へと送達するには課題があることが多い。本発明のコンジュゲートの使用により、核酸分子を細胞へと、好ましくは細胞の細胞質へと送達するのに好適な送達システムが提供される。本発明のコンジュゲートにより送達される核酸分子を、例えば植物からヒト細胞までの広範な実験系において標的化遺伝子サイレンシングを達成するのに使用することができる。好ましくは、本発明のコンジュゲートにより送達される核酸分子は、例えば生物（該生物は哺乳動物、好ましくはヒトである）において標的化遺伝子サイレンシングを達成するのに使用することができる治療用の核酸分子である。
ＲＮＡｉ、すなわちＲＮＡ媒介性の干渉は、植物からヒト細胞までの広範な実験系において標的化遺伝子サイレンシングを達成するために選択される方法である。ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを細胞の細胞質へ導入すると、これらの二本鎖ＲＮＡ構築物はＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質に結合することができる。ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのセンス鎖がＲＩＳＣ複合体から外れ、結合したｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの配列に相補的な配列を有するｍＲＮＡを認識し、結合することができる鋳型がＲＩＳＣ内に与えられる。相補的なｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ複合体はｍＲＮＡを切断し、切断された鎖を放出する。ＲＮＡｉは、タンパク質合成をコードする対応するｍＲＮＡの特異的な破壊を標的とすることにより特異的なタンパク質の下方調節をもたらすことができる。
好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートはｓｉＲＮＡである化合物（ｄ）を含む。より好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、ｓｉＲＮＡである化合物（ｄ）を少なくとも２つ含む。好ましくは、コンジュゲートは少なくとも２個〜２０個のｓｉＲＮＡ、すなわち少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個のｓｉＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは少なくとも２個〜１０個のｓｉＲＮＡを含む。別の好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは２個〜１０個、すなわち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のｓｉＲＮＡを含む。本発明の或る特定の好ましい実施形態内では、当該技術分野で利用可能な方法を用いて、本発明のコンジュゲート内に含まれる少なくとも２個〜２０個のｓｉＲＮＡの電荷を中和する必要があることもある。
上述のように、本発明の好ましいコンジュゲートは化合物（ｄ）を少なくとも２つ含む。好ましい実施形態では、コンジュゲートは少なくとも２つの化合物（ｄ）（少なくとも２つの化合物（ｄ）のうちの一部（first）がｓｉＲＮＡであり、少なくとも２つの化合物（ｄ）のうちの残り（second）がＲＩＳＣ構成要素である）を含む。この好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートにおける化合物（ｄ）としての少なくとも１つの標的化ｓｉＲＮＡ及び少なくとも１つのＲＩＳＣ構成要素の同時送達は、標的細胞において、特にＲＮＡｉ機構が内因的に又は複数のｓｉＲＮＡ／コンジュゲートが標的細胞に送達された結果として制限された標的細胞においてＲＮＡｉの効率を高めるのに有効である。
「ＲＩＳＣ構成要素」という用語はＲＩＳＣ複合体の構成要素又は関連するタンパク質である任意のタンパク質又はペプチドを意味する。本発明のコンジュゲートに使用されるＲＩＳＣ構成要素の例としては、Ｄｉｃｅｒ（例えばＤｉｃｅｒ−１、Ｄｉｃｅｒ−２等）、Ａｒｇｏｎａｕｔｅファミリータンパク質（例えばＡｒｇｏｎａｕｔｅ ２等）、トランス活性化応答ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）、二本鎖ＲＮＡ結合ドメインタンパク質及びペプチド（例えばＲ２Ｄ２、Ｒ３Ｄ１等）、タンパク質キナーゼＲのタンパク質活性化因子（ＰＡＣＴ）、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ関連タンパク質（例えばＰｉｗｉ等）、ヘリカーゼ及びヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
アンチセンス構築物はｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害することもできる。アンチセンス構築物は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、非コードである。これらの一本鎖オリゴヌクレオチドは、標的タンパク質のｍＲＮＡの配列と相補的な配列を有し、ワトソン・クリック塩基対合によりそのｍＲＮＡと結合することができる。この結合がアンチセンス構築物に使用される化学修飾のタイプに応じて、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨げ、かつ／又はｍＲＮＡ転写産物のＲＮａｓｅ Ｈ分解を誘起する。結果として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、作用の特異性（すなわち特定の疾患関連タンパク質の下方調節）に関して大きな可能性を有する。これまで、これらの化合物は一部のｉｎ ｖｉｔｒｏモデル、並びに炎症性疾患、がん及びＨＩＶのモデルを含むｉｎ ｖｉｖｏモデルでは有望であった（［４５］に掲載される）。アンチセンス構築物は染色体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることによっても細胞活性に影響を与えることができる。
コーディング核酸分子も使用することができる。関連のＲＮＡポリメラーゼ又はリボソームの基質として機能し、その配列内に含まれるコードされた産物の転写又は翻訳を直接誘導するように設計されたコーディング核酸分子（例えばＤＮＡ）は通常、オープンリーディングフレームと適切な調節モチーフ（例えばプロモータ配列、開始シグナル、停止シグナル、ポリＡシグナル等）とを含有する。
好ましくは、本発明のコンジュゲートの核酸は化学修飾される。ホスホジエステル骨格の、又は骨格、糖、及び／若しくは核酸塩基の単一又は複合的な修飾を含む核酸が本発明に使用されるのが好ましい。これらの化学修飾（chemically modification）は核酸を安定化させるという正の効果を有し、かつそれらの活性にはほとんど影響を与えない。さらにこれらの化学修飾は、ＴＬＲ及び／又はインターフェロン経路を介して免疫反応のような核酸の望ましくない副作用又は意図されない標的遺伝子の発現調節（すなわち、オフターゲット効果（ＯＴＥ））を防ぐことができる。
ホスホジエステル骨格の好ましい修飾としては、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチルホスホネート及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ホスホロセレネート、メチルホスホネート、又はＯ−アルキルホスホトリエステル結合、並びに通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合した類似体、及び反対の極性を有するもの（ここでヌクレオシド単位の隣接対は３’−５’から５’−３’又は２’−５’から５’−２’結合している）が挙げられる。
修飾された核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−Ｍｅ−Ｃ又はｍ５Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル誘導体及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル誘導体及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及び５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシン、６−アザウラシル、６−アザシトシン及び６−アザチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニン等の他の合成及び天然の核酸塩基が含まれる。
修飾された核酸は、１つ又は複数の置換糖部分も含有していてもよい。例えば本発明は、２’位に以下のうちの１つを含む核酸を包含する：ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル若しくはＮ−アルキル、Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル若しくはＮ−アルケニル、又はＯ−アルキニル、Ｓ−アルキニル若しくはＮ−アルキニル（ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る）。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（ここでｎ及びｍは１〜約１０である）が特に好ましい。他の好ましい修飾された核酸は、２’位に以下のうちの１つを含む核酸を包含する：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断群、レポーター基、挿入因子、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、同様の特性を有する他の置換基。更なる糖修飾には、例えば２’−Ｏ−メチル、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’−Ｆ、アンロックド核酸（ＵＮＡ）等が含まれる。好ましい骨格修飾には、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ等が含まれる。
本発明による「ロックド核酸」（ＬＮＡ）（接近不可能なＲＮＡと称されることも多い）は修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分が２’酸素と４’炭素とを連結する追加の架橋で修飾される。架橋が３’内（-endo）（Ｎｏｒｔｈ）立体構造にリボースを「固定する」。
本発明による「アンロックド核酸」（ＵＮＡ）は、ＲＮＡのリボース環のＣ２’−Ｃ３’結合を欠くＲＮＡの非環式誘導体であるモノマーから構成される。
本発明による「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）はペプチド結合により結合した反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から構成される骨格を有する。
別の好ましい実施形態では、化合物（ｄ）はタンパク質又はペプチドである。送達することができるタンパク質及びペプチドには好ましくは、一本鎖抗体、キナーゼ、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、炎症性タンパク質、抗感染性タンパク質、抗血管形成タンパク質、抗炎症性タンパク質、又は細胞、好ましくは細胞のサイトゾルへと送達されるのが望まれる任意の他のタンパク質若しくはペプチド若しくは小分子が含まれる。
好ましくは、タンパク質又はペプチドを含む化合物（ｄ）は、上記及び実施例内に記載のｓｉＲＮＡと同じようにジスルフィド結合によりモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）とカップリングし、細胞質に到達すると、コンジュゲートの送達モジュールからタンパク質又はペプチドが切断され、標的細胞内でその意図される機能を発揮することができる。代替的な好ましい実施形態では、上記のような酵素切断部位が、標的細胞の所望のコンパートメント、小器官若しくはサイトゾルでの化合物（ｄ）の放出を可能にする、又は化合物（ｄ）をコンジュゲートモジュールと分離するように、コンジュゲート内に存在するのが好ましい。特に好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートはタンパク質又はペプチドを含む化合物（ｄ）（該化合物（ｄ）はジスルフィド結合によりモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）とカップリングする）を含み、酵素切断部位がコンジュゲート内に位置し、酵素により切断されると、コンジュゲートから化合物（ｄ）を放出する。
好ましい実施形態では、化合物（ｄ）はサイトゾルへと送達されるのが望ましい抗原である。この実施形態内では、酵素切断部位が、標的細胞のサイトゾルにおける抗原の放出を可能にするようにコンジュゲート内に存在するのが好ましい。好ましくは、化合物（ｄ）が抗原である場合、モジュール（ａ）は毒素のＢ−サブユニット、又はその断片若しくは変異体を含む。好ましくは、毒素のＢ−サブユニットはリシンＢ−サブユニット（ＲＴＢ）又は志賀毒素Ｂ−サブユニットである。本発明のコンジュゲートを含むこのようなＢ−サブユニット毒素−抗原は動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを免疫化するワクチンとして有用である（例えば［４６、４７］を参照されたい）。
別の好ましい実施形態では、モジュール（ａ）は非毒性ホロトキシンを含む。非毒性ホロトキシンは非毒性リシンホロトキシン又は非毒性志賀ホロトキシンであるのが好ましい。好ましくは、非毒性ホロトキシンはホロトキシンの毒性を排除するか又は大きく低減させる突然変異を含むＡ−サブユニットを含む。突然変異したＡ−サブユニットを含む非毒性ホロトキシンは本発明のコンジュゲートのモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）の機能性を与えることが可能である。好ましくは、非毒性ホロトキシンは非毒性リシンホロトキシンであり、リシンＡ−サブユニットはリシンＡ−サブユニット（配列番号２８２）のアミノ酸１８０でのＲ→Ｈ置換突然変異（Ｒ１８０Ｈ突然変異）を含む。
好ましくは、モジュール（ａ）及びモジュール（ｂ）の機能性が非毒性ホロトキシンＢ−サブユニット内に含まれ、モジュール（ｃ）の機能性が非毒性ホロトキシン突然変異Ａ−サブユニット内に含まれる。好ましくは、化合物（ｄ）は非毒性ホロトキシンの突然変異Ａ−サブユニット（モジュール（ａ）＋モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ））とカップリングする抗原である。本発明のコンジュゲートを含むホロトキシン−抗原を含むこのような突然変異Ａ−サブユニットは、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを免疫化するワクチンとして有用である（例えば［４８］を参照されたい）。
本発明を用いた送達が考慮される抗原としては、ＮＳＰ４、インフルエンザ核タンパク質ＮＰ、ＬＣＭＶ糖タンパク質１、ｈＴＲＴ、ＣＹＦＲＡ ２１−１、ｐ５３、ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、ＣＤＣ２７、αアクチニン−４、チロシナーゼ、ＴＲＰ１／ｇｐ７５、ＴＲＰ２、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ１、ガングリオシド、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２、ＷＴ１、ＥｐｈＡ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１及びスルビビンが挙げられるが、これらに限定されない。
別の好ましい実施形態では、化合物（ｄ）はタンパク質又はペプチドを含む。該タンパク質又はペプチドは標的細胞のプロテアソームによる分解のリスクを避ける又は大きく低減するために組換えられている。好ましくは、化合物（ｄ）は、活性部位がサイトゾルに、又は本発明のコンジュゲートが通る標的細胞のコンパートメント若しくは小器官のうちの１つにあるタンパク質又はペプチドを含む。この実施形態内では、酵素切断部位は、標的細胞の所望のコンパートメント、小器官又はサイトゾルでのタンパク質又はペプチドの放出を可能にするようにコンジュゲート内に存在するのが好ましい。
本発明の別の実施形態では、小分子（すなわち薬物）、治療用分子、診断／画像化分子等が、特定の細胞のサイトゾルに、又は本発明のコンジュゲートが通る標的細胞のコンパートメント若しくは小器官のうちの１つに送達されることが望まれる。この実施形態内では、上記のように、酵素切断部位は、標的細胞の所望のコンパートメント、小器官又はサイトゾルでの小分子、治療用分子、診断用分子等の放出を可能にするようにコンジュゲート内に存在するのが好ましい。
本発明を用いて送達されることが考慮される小分子としては、タモキシフェン、デキサメタゾン、タキソール、パクリタキセル、シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明を用いて送達されることが考慮される治療用分子としては、抗体、抗体断片、ペプチド、ペプトイド及びデコイオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明を用いて送達されることが考慮される診断又は画像化分子としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ、すなわち腫瘍細胞診断／画像化用）、蛍光色素、量子ドット（超）（常）磁性ナノ粒子、標識化抗体、標識化抗体断片、分子指標、バイオセンサ（例えば炭酸脱水酵素）、プロテアーゼ活性検出用のオリゴペプチドベースのプローブ、タンパク質キナーゼ活性のペプチドベースの蛍光センサ、放射標識化代謝産物及びＤ２Ｒが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明に従って送達することができる腫瘍抑制タンパク質及びペプチドとしては、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１５、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＩＲＦ−１、ＰＴＥＮ、ＲＢ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ｚａｃｌ、ｐ７３、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１、ＦＣＣ及びＭＣＣペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
様々な酵素も対象であり、本発明を用いて送達することができる。このような酵素としては、シトシンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ガラクトース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、ａ−Ｌ−イズロニダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ＨＳＶチミジンキナーゼ及びヒトチミジンキナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明を用いて送達されることが考慮される別の群のタンパク質には、インターロイキン（ＩＬ）及びサイトカインが含まれる。これらとしては、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、Ｐ−インターフェロン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ及び腫瘍壊死因子が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞周期調節因子も本発明を用いて送達することができる。このような細胞周期調節因子としては、ｐ２７、ｐ１６、ｐ２１、ｐ５７、ｐ１８、ｐ７３、ｐ１９、ｐ１５、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２、Ｅ２Ｆ−３、ｐ１０７、ｐ１３０及びＥ２Ｆ−４が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは核局在化シグナルを更に含む。化合物（ｄ）の核への送達が望まれる場合、本発明のコンジュゲート内での核局在化シグナルペプチドの使用が好ましい。本発明のコンジュゲートに使用される核局在化シグナルの例としては、ＳＶ４０ラージＴ−抗原のPKKKRKV（配列番号２４６）又はヌクレオプラスミンのKRPAATKKAGQAKKKK（配列番号２４７）が挙げられるが、これらに限定されない［４９］。コンジュゲート内の切断部位での酵素的切断又は化学的切断によりコンジュゲートから送達担体モジュール（ａ）、送達担体モジュール（ｂ）又は送達担体モジュール（ｃ）のいずれかが放出される場合、核局在化シグナルが化合物（ｄ）と結合したままとなるように、核局在化シグナルがコンジュゲート内に位置しているのが好ましい。別の好ましい実施形態では、コンジュゲート内の切断部位での酵素的切断又は化学的切断によりコンジュゲートから化合物（ｄ）が放出される場合、核局在化シグナルが化合物（ｄ）と結合したままとなるように、核局在化シグナルがコンジュゲート内に位置している。
別の好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートを調製し、ＥＲ及び核の結合膜を利用することにより、ＥＲから直接核へと化合物（ｄ）を送達するのに使用することができる（例えば［５０］を参照されたい）。好ましくは、コンジュゲートはＤＮＡ分子、転写因子又は転写を変調する小分子を包含する化合物（ｄ）を含む。特に好ましい実施形態では、コンジュゲートは少なくとも２つの化合物（ｄ）（第１の化合物（ｄ）がＤＮＡ分子であり、第２の化合物（ｄ）が転写因子又は転写を変調する小分子である）を含む。
第３の態様では、本発明は本発明の送達システム又はコンジュゲートを調製する方法に関する。好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートを調製する方法は、少なくとも１つのモジュール（ａ）（細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にする）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）（小胞体（ＥＲ）への輸送を容易にする）、少なくとも１つのモジュール（ｃ）（ＥＲからサイトゾルへの転位を媒介する）、及び少なくとも１つの化合物（ｄ）のカップリング（すなわち、共有結合又は非共有結合、合成、組換えによる生成等）を含み、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）が任意の配置及び任意の化学量論で互いに結合する。本発明は本発明のコンジュゲートの少なくとも１つの構成要素を含むキットも提供する。好ましくは、本発明のキットはモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）、モジュール（ｃ）、及び／又は化合物（ｄ）を含む。キットは任意でペプチドリンカー及び／又は切断部位を含むペプチドを含む。
第４の態様では、本発明は医薬品としての本発明の送達システム又はコンジュゲートの使用に関する。
第５の態様では、本発明は本発明のコンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な賦形剤、担体及び／又は希釈剤とを含む医薬組成物に関する。好ましくは、医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、担体及び／又は希釈剤と、少なくとも１つのモジュール（ａ）、少なくとも１つのモジュール（ｂ）、少なくとも１つのモジュール（ｃ）及び少なくとも１つの化合物（ｄ）を含む本発明のコンジュゲートとを含み、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）が任意の配置及び任意の化学量論で互いに結合する。
任意の本発明のコンジュゲートを薬学的に許容可能な賦形剤、担体若しくは希釈剤、又はその混合物と混ぜ合わせることができる。本発明のコンジュゲート（その薬学的に許容可能な塩、エステル及び薬学的に許容可能な溶媒和物を含む）は単独で投与することができるが、一般的に特にヒト治療では、医薬バッファー、希釈剤又は賦形剤と混ぜ合わせて投与する。
「賦形剤」という用語は、本明細書で使用される場合、医薬品製剤における、例えば結合剤、滑剤、増粘剤、界面活性剤、保存剤、乳化剤、バッファー、放電剤（decharging agents）、香料添加剤又は着色剤等の活性成分ではない全ての物質を示すことが意図される。本明細書に記載の様々な異なる形態の医薬組成物に好適なこのような賦形剤の例がこれまでに記載されている［５１］。好ましくは、本発明のコンジュゲート内で核酸の高い負電荷を中和するために、ヒトプロタミン、スペルミン、スペルミジン又は他のポリカチオンを本発明のコンジュゲート又は本発明のコンジュゲートの製剤に添加することができる。
医薬品担体、賦形剤又は希釈剤を意図される投与経路及び標準的な薬務に応じて選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤若しくは希釈剤として、又は担体、賦形剤若しくは希釈剤に加えて任意の好適な結合剤（複数も可）、滑剤（複数も可）、懸濁化剤（複数も可）、コーティング剤（複数も可）、可溶化剤（複数も可）を含むことができる。好適な結合剤の例には、デンプン、ゼラチン、グルコース等の天然糖、無水ラクトース、易流動性（free-flow）ラクトース、β−ラクトース、コーンシロップ、天然ゴム及び合成ゴム、例えばアカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース及びポリエチレングリコールが含まれる。好適な滑剤の例には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が含まれる。保存剤、安定化剤、染料及び更には香料添加剤を医薬組成物に加えることができる。保存剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。抗酸化剤及び懸濁化剤も使用することができる。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」には、コンジュゲートと組合せてもコンジュゲートの活性を保持し、被験体の免疫系と非反応性である任意の物質が含まれる。例としては、リン酸緩衝生理食塩溶液等の標準的な医薬担体、水、油／水エマルション等のエマルション、グリセロール、エタノール及び様々なタイプの湿潤剤のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。他の担体には、滅菌溶液、コーティング錠を含む錠剤及びカプセルも含まれ得る。通常、このような担体は、デンプン、ミルク、糖、グルコース、ラクトース、或る特定のタイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸若しくはその塩、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトール、ステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸カルシウム、タルク、植物油脂、ゴム、グリコール、又は他の既知の賦形剤等の賦形剤を含有する。このような担体には、香り及び色の添加剤又は他の成分も含まれ得る。このような担体を含む組成物は既知の従来方法により配合される。
「薬学的に許容可能な塩」という用語は本発明のコンジュゲートの塩を表す。好適な薬学的に許容可能な塩には、本発明のコンジュゲートの溶液を塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸又はリン酸等の薬学的に許容可能な酸の溶液と混合することにより形成することができる酸付加塩が含まれる。薬学的に許容可能な塩の例示的な例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、二塩酸塩、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート（estolate）、エシレート（esylate）、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプテート（gluceptate）、グルコヘプトン酸塩、グルコン酸塩、グルタル酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアルサニレート（glycolylarsanilate）、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシルレゾルシネート（hexylresorcinate）、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオネート（isothionate）、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ムケート（mucate）、２−ナフタレンスルホン酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボネート（embonate））、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ナトリウム、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド（triethiodide）、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が挙げられるが、これらに限定されない（例えば［５２］を参照されたい）。本発明のコンジュゲートの化合物（ｄ）が核酸である場合、薬学的に許容可能な塩はナトリウム塩であるのが好ましい。
本発明の医薬品組成物は多種多様の薬物送達システムに使用するのに好適である。本発明に使用するのに好適な製剤（治療的使用に許容可能な担体又は希釈剤を含む）が医薬分野で既知であり、薬物送達方法が説明されている（例えば［５３及び５４］を参照されたい）。
医薬組成物を、生物、好ましくは哺乳動物、更に好ましくはヒトへの任意の適切な投与様式で配合することができる。本明細書で使用される場合、「投与（administering）」には、被験体への局所投与、経皮投与、皮内投与、経口投与、経鼻投与、吸入投与、経粘膜投与、静脈内投与、動脈内投与、血管内投与、心内投与、骨内投与、髄腔内投与、頭蓋内投与、硬膜外投与、脳内投与、脳室内投与、嚢内投与、腹腔内投与、病巣内投与、膀胱内投与、硝子体内投与、空洞内投与、膣内投与、膣投与、子宮内投与、直腸投与、皮下投与又は筋内投与、及び持続放出装置、例えば浸透圧ポンプの手段又はその埋め込みが含まれる。医薬組成物における本発明のコンジュゲートの濃度は特定の用途、疾患の性質、投与頻度等によって変わる。
一般的に、医薬組成物は非経口投与、例えば静脈内投与される。このため、本発明は許容可能な担体、好ましくは水性担体、例えば水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、アルコール等に溶解又は懸濁させた本発明のコンジュゲートを含む非経口投与用の医薬組成物を提供する。医薬組成物は、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤（tonicity adjusting agents）、湿潤剤、洗浄剤等の生理条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容可能な補助物質を更に含むことができる。
これらの医薬組成物を従来の滅菌技法により滅菌しても、又は濾過滅菌してもよい。得られた水溶液をそのままパッケージングしても、又は凍結乾燥して、投与前に凍結乾燥した調製物を滅菌水性担体と合わせてもよい。調製物のｐＨは通常３〜１１、より好ましくは５〜９、最も好ましくは７〜８である。
幾つかの実施形態では、本発明のコンジュゲートを標準的な小胞形成脂質から形成されるリポソームへと組み込むことができる。例えば［５５〜５７］、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号及び同第４，８３７，０２８号に記載のような多種多様な方法がリポソームを調製するのに利用可能である。多種多様な標的化剤を用いたリポソームの標的化が当該技術分野で既知である（例えば米国特許第４，９５７，７７３号及び同第４，６０３，０４４号を参照されたい）。標的化剤をリポソームとカップリングさせる標準的な方法を使用することができる。これらの方法は一般的に脂質成分、例えばホスファチジルエタノールアミン（標的化剤、又は誘導体化された脂溶性化合物、例えば本発明の脂質により誘導体化されたペプチドの結合に対して活性化させることができる）のリポソームへの組み込みを伴う。標的化機構は一般的に、標的部分が標的、例えば細胞表面受容体との相互作用に利用可能となるように、標的化剤がリポソームの表面上に位置することを要求する。ｓｉＲＮＡを送達するのに一般的に使用される脂質送達方法はこれまでに説明されており、本発明のコンジュゲートと共に使用することができる［５８〜６１］。
好ましい実施形態では、特に化合物（ｄ）としてｓｉＲＮＡを含む本発明のコンジュゲートは、治療用ｓｉＲＮＡで現在使用されている方法を用いてｉｎ ｖｉｖｏで投与される。このような方法としては、コンジュゲートとのコレステロールのコンジュゲーション、標的細胞上の受容体と結合する細胞表面リガンドを介してコンジュゲートを標的細胞へと送達するためのポリカチオンナノ粒子の使用、拡散性ＰＥＧ−脂質コンジュゲートによりコーティングされたＳＮＡＬＰ（安定した核酸脂質粒子）、特異的な細胞に対してコンジュゲートを標的化するためのリガンドを含む遮蔽エンドソーム分解剤（maskedendosomolytic agent）（ＭＥＡ）−動的ポリコンジュゲート（ＤＰＣ）を使用するカチオン性又は中性脂質二重層へのコンジュゲートの封入、受容体媒介性の取り込みのために特異的な細胞に対してコンジュゲートを標的化するためのプロタミンによりタグ付けられた（又は任意の他の正に荷電した分子によりタグ付けられた）特異的抗体の使用、特異的な細胞に対してコンジュゲートを標的化するためのＲＮＡアプタマーの使用、免疫リポソーム、Ｔｒａｎｓ−ＩＴ ＴＫＯ、ＬＦ２０００等の使用が挙げられるが、これらに限定されない［６２〜６４］。
本発明のコンジュゲートの投与に関する投与量範囲は、治療対象の疾患又は病態の症状が或る程度の緩和を示すという所望の効果を生じるのに十分大きいものである。投与量は有害な副作用を引き起こすほどには大きくないものとする。一般的には、投与量は被験体又は患者の年齢、状態、性別及び疾患の程度に応じて変わり、当業者が決定することができる。投与計画を最適な所望の応答（例えば治療応答）を与えるように調整する。例えば、単回ボーラス投与を行っても、何回かに分けて徐々に投与を行っても、又は用量を治療状況に応じて比例的に増減させてもよい。投与の簡便性及び投与量の均一性のために、単位剤形において非経口組成物を配合することが特に有益である。
好ましくは、本発明のコンジュゲートは、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約３０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜２０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約３０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約３０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約３０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約３０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約３０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２０００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２０００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約３０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３０００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約４００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約３ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約３ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、又は約３ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約４ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲の用量で静脈投与される。
好ましくは、本発明のコンジュゲートは、約０．００１ｎｍｏｌ〜約１０ｎｍｏｌ、約０．００１ｎｍｏｌ〜約５ｎｍｏｌ、約０．００１ｎｍｏｌ〜約３ｎｍｏｌ、約０．００１ｎｍｏｌ〜約２ｎｍｏｌ、約０．００１ｎｍｏｌ〜約１ｎｍｏｌ、約０．００１ｎｍｏｌ〜約０．５ｎｍｏｌ、約０．００１ｎｍｏｌ〜約０．３ｎｍｏｌ、約０．００１ｎｍｏｌ〜約０．２ｎｍｏｌ、約０．００１ｎｍｏｌ〜約０．１ｎｍｏｌ、約０．００１ｎｍｏｌ〜約０．０５ｎｍｏｌ、約０．００１ｎｍｏｌ〜約０．０３ｎｍｏｌ、約０．００１ｎｍｏｌ〜約０．０２ｎｍｏｌ、約０．００１ｎｍｏｌ〜約０．０１ｎｍｏｌ、約０．００１ｎｍｏｌ〜約０．００５ｎｍｏｌ、約０．００１ｎｍｏｌ〜約０．００３ｎｍｏｌ、約０．００１ｎｍｏｌ〜約０．００２ｎｍｏｌ、約０．００２ｎｍｏｌ〜約１０ｎｍｏｌ、約０．００２ｎｍｏｌ〜約５ｎｍｏｌ、約０．００２ｎｍｏｌ〜約３ｎｍｏｌ、約０．００２ｎｍｏｌ〜約２ｎｍｏｌ、約０．００２ｎｍｏｌ〜約１ｎｍｏｌ、０．００２ｎｍｏｌ〜約０．５ｎｍｏｌ、約０．００２ｎｍｏｌ〜約０．３ｎｍｏｌ、約０．００２ｎｍｏｌ〜約０．２ｎｍｏｌ、約０．００２ｎｍｏｌ〜約０．１ｎｍｏｌ、約０．００２ｎｍｏｌ〜約０．０５ｎｍｏｌ、約０．００２ｎｍｏｌ〜約０．０３ｎｍｏｌ、約０．００２ｎｍｏｌ〜約０．０２ｎｍｏｌ、約０．００２ｎｍｏｌ〜約０．０１ｎｍｏｌ、約０．００２ｎｍｏｌ〜約０．００５ｎｍｏｌ、約０．００２ｎｍｏｌ〜約０．００３ｎｍｏｌ、約０．００３ｎｍｏｌ〜約１０ｎｍｏｌ、約０．００３ｎｍｏｌ〜約５ｎｍｏｌ、約０．００３ｎｍｏｌ〜約３ｎｍｏｌ、約０．００３ｎｍｏｌ〜約２ｎｍｏｌ、約０．００３ｎｍｏｌ〜約１ｎｍｏｌ、０．００３ｎｍｏｌ〜約０．５ｎｍｏｌ、約０．００３ｎｍｏｌ〜約０．３ｎｍｏｌ、約０．００３ｎｍｏｌ〜約０．２ｎｍｏｌ、約０．００３ｎｍｏｌ〜約０．１ｎｍｏｌ、約０．００３ｎｍｏｌ〜約０．０５ｎｍｏｌ、約０．００３ｎｍｏｌ〜約０．０３ｎｍｏｌ、約０．００３ｎｍｏｌ〜約０．０２ｎｍｏｌ、約０．００３ｎｍｏｌ〜約０．０１ｎｍｏｌ、約０．００３ｎｍｏｌ〜約０．００５ｎｍｏｌ、約０．００５ｎｍｏｌ〜約１０ｎｍｏｌ、約０．００５ｎｍｏｌ〜約５ｎｍｏｌ、約０．００５ｎｍｏｌ〜約３ｎｍｏｌ、約０．００５ｎｍｏｌ〜約２ｎｍｏｌ、約０．００５ｎｍｏｌ〜約１ｎｍｏｌ、０．００５ｎｍｏｌ〜約０．５ｎｍｏｌ、約０．００５ｎｍｏｌ〜約０．３ｎｍｏｌ、約０．００５ｎｍｏｌ〜約０．２ｎｍｏｌ、約０．００５ｎｍｏｌ〜約０．１ｎｍｏｌ、約０．００５ｎｍｏｌ〜約０．０５ｎｍｏｌ、約０．００５ｎｍｏｌ〜約０．０３ｎｍｏｌ、約０．００５ｎｍｏｌ〜約０．０２ｎｍｏｌ、約０．００５ｎｍｏｌ〜約０．０１ｎｍｏｌ、約０．０１ｎｍｏｌ〜約１０ｎｍｏｌ、約０．０１ｎｍｏｌ〜約５ｎｍｏｌ、約０．０１ｎｍｏｌ〜約３ｎｍｏｌ、約０．０１ｎｍｏｌ〜約２ｎｍｏｌ、約０．０１ｎｍｏｌ〜約１ｎｍｏｌ、約０．０１ｎｍｏｌ〜約０．５ｎｍｏｌ、約０．０１ｎｍｏｌ〜約０．３ｎｍｏｌ、約０．０１ｎｍｏｌ〜約０．２ｎｍｏｌ、約０．０１ｎｍｏｌ〜約０．１ｎｍｏｌ、約０．０１ｎｍｏｌ〜約０．０５ｎｍｏｌ、約０．０１ｎｍｏｌ〜約０．０３ｎｍｏｌ、約０．０１ｎｍｏｌ〜約０．０２ｎｍｏｌ、約０．０２ｎｍｏｌ〜約１０ｎｍｏｌ、約０．０２ｎｍｏｌ〜約５ｎｍｏｌ、約０．０２ｎｍｏｌ〜約３ｎｍｏｌ、約０．０２ｎｍｏｌ〜約２ｎｍｏｌ、約０．０２ｎｍｏｌ〜約１ｎｍｏｌ、約０．０２ｎｍｏｌ〜約０．５ｎｍｏｌ、約０．０２ｎｍｏｌ〜約０．３ｎｍｏｌ、約０．０２ｎｍｏｌ〜約０．２ｎｍｏｌ、約０．０２ｎｍｏｌ〜約０．１ｎｍｏｌ、約０．０２ｎｍｏｌ〜約０．０５ｎｍｏｌ、約０．０２ｎｍｏｌ〜約０．０３ｎｍｏｌ、約０．０３ｎｍｏｌ〜約１０ｎｍｏｌ、約０．０３ｎｍｏｌ〜約５ｎｍｏｌ、約０．０３ｎｍｏｌ〜約３ｎｍｏｌ、約０．０３ｎｍｏｌ〜約２ｎｍｏｌ、約０．０３ｎｍｏｌ〜約１ｎｍｏｌ、約０．０３ｎｍｏｌ〜約０．５ｎｍｏｌ、約０．０３ｎｍｏｌ〜約０．３ｎｍｏｌ、約０．０３ｎｍｏｌ〜約０．２ｎｍｏｌ、約０．０３ｎｍｏｌ〜約０．１ｎｍｏｌ、約０．０３ｎｍｏｌ〜約０．０５ｎｍｏｌ、約０．０５ｎｍｏｌ〜約１０ｎｍｏｌ、約０．０５ｎｍｏｌ〜約５ｎｍｏｌ、約０．０５ｎｍｏｌ〜約３ｎｍｏｌ、約０．０５ｎｍｏｌ〜約２ｎｍｏｌ、約０．０５ｎｍｏｌ〜約１ｎｍｏｌ、約０．０５ｎｍｏｌ〜約０．５ｎｍｏｌ、約０．０５ｎｍｏｌ〜約０．３ｎｍｏｌ、約０．０５ｎｍｏｌ〜約０．２ｎｍｏｌ、約０．０５ｎｍｏｌ〜約０．１ｎｍｏｌ、約０．１ｎｍｏｌ〜約１０ｎｍｏｌ、約０．１ｎｍｏｌ〜約５ｎｍｏｌ、約０．１ｎｍｏｌ〜約３ｎｍｏｌ、約０．１ｎｍｏｌ〜約２ｎｍｏｌ、約０．１ｎｍｏｌ〜約１ｎｍｏｌ、約０．１ｎｍｏｌ〜約０．５ｎｍｏｌ、約０．１ｎｍｏｌ〜約０．３ｎｍｏｌ、約０．１ｎｍｏｌ〜約０．２ｎｍｏｌ、約０．２ｎｍｏｌ〜約１０ｎｍｏｌ、約０．２ｎｍｏｌ〜約５ｎｍｏｌ、約０．２ｎｍｏｌ〜約３ｎｍｏｌ、約０．２ｎｍｏｌ〜約２ｎｍｏｌ、約０．２ｎｍｏｌ〜約１ｎｍｏｌ、約０．２ｎｍｏｌ〜約０．５ｎｍｏｌ、約０．２ｎｍｏｌ〜約０．３ｎｍｏｌ、約０．３ｎｍｏｌ〜約１０ｎｍｏｌ、約０．３ｎｍｏｌ〜約５ｎｍｏｌ、約０．３ｎｍｏｌ〜約３ｎｍｏｌ、約０．３ｎｍｏｌ〜約２ｎｍｏｌ、約０．３ｎｍｏｌ〜約１ｎｍｏｌ、約０．３ｎｍｏｌ〜約０．５ｎｍｏｌ、約０．５ｎｍｏｌ〜約１０ｎｍｏｌ、約０．５ｎｍｏｌ〜約５ｎｍｏｌ、約０．５ｎｍｏｌ〜約３ｎｍｏｌ、約０．５ｎｍｏｌ〜約２ｎｍｏｌ、約０．５ｎｍｏｌ〜約１ｎｍｏｌ、約１ｎｍｏｌ〜約１０ｎｍｏｌ、約１ｎｍｏｌ〜約５ｎｍｏｌ、約１ｎｍｏｌ〜約３ｎｍｏｌ、約１ｎｍｏｌ〜約２ｎｍｏｌ、約２ｎｍｏｌ〜約１０ｎｍｏｌ、約２ｎｍｏｌ〜約５ｎｍｏｌ、約２ｎｍｏｌ〜約３ｎｍｏｌ、約３ｎｍｏｌ〜約１０ｎｍｏｌ、約３ｎｍｏｌ〜約５ｎｍｏｌ、又は約５ｎｍｏｌ〜約１０ｎｍｏｌの範囲の用量で頭蓋内に又は浸透圧ポンプにより投与される。
より好ましくは、本発明のコンジュゲートは、浸透圧ポンプにより投与される場合、約３ｎｍｏｌの１日用量で投与される。
更なる調剤方法を、作用期間を制御するのに利用することができる。制御放出調製物は、本発明のコンジュゲートをコンジュゲートする、複合体化する（complex）又は吸着させるのにポリマーを使用することにより得ることができる。制御送達は、放出を制御するために適切な巨大分子（例えばポリエステル、ポリアミノカルボキシメチルセルロース及び硫酸プロタミン）及び巨大分子の濃度、並びに組み込み方法を選択することにより行うことができる。制御放出調製物により作用期間を制御するための可能な別の方法は、コンジュゲートをポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）又はエチレン酢酸ビニルコポリマー等のポリマー物質の粒子に組み込むことである。
本発明のコンジュゲート、及び上記コンジュゲート内に含まれるペプチド又はタンパク質を血漿タンパク質との結合から保護するためには、コンジュゲートが、例えばコアセルベーション技法により若しくは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート（methymethacrylate））マイクロカプセルに、又はコロイド薬物送達システム、例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセルに、又はマクロエマルションに封入されているのが好ましい。このような教示はこれまでに説明されている［５３］。
本発明のコンジュゲートは、巨大分子の複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア又はビーズ、メソ粒子（meso-particles）の形態の合成ポリマー又は天然ポリマー等の標的化可能な薬物送達システム、及び水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、リポソーム及び再封（resealed）赤血球を含む脂質ベースのシステムに使用するのに十分に適している。これらのシステムはまとめて、コロイド薬物送達システムとして知られている。通常、分散したコンジュゲートを含有するこのようなコロイド粒子の直径は約５０ｎｍ〜２μｍである。このコロイド粒子のサイズにより、コロイド粒子を注射等により静脈投与するか、又はエアロゾルとして投与することができる。コロイドシステムの調製に使用される物質（例えばアルブミン、エチルセルロース、カゼイン、ゼラチン、レシチン、リン脂質及びダイズ油）は通常、濾過滅菌により滅菌可能であり、非毒性でかつ生分解性である。重合コロイドシステムはマイクロ封入のコアセルベーションと同様のプロセスにより調製される。標的化送達システム−封入コンジュゲートを必要に応じて他の化合物を含む製剤、及び生理学的に許容可能な水性媒体、例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等に加えることができる。
例示的な実施形態では、本発明のコンジュゲートは標的化送達システムとして使用されるリポソームの構成要素である。リン脂質は水性媒体に徐々に分散させると、膨張し、水和して、脂質二重層を隔てる水性媒体層を備える多層の同心円状の二重層小胞を自然形成する。このようなシステムは通常、多層リポソーム又は多層小胞（ＭＬＶ）と称され、直径が約１００ｎｍ〜約４μｍの範囲である。ＭＬＶを超音波分解すると、直径が約２０ｎｍ〜約５０ｎｍの範囲である小単層小胞（ＳＵＶ）が形成され、ＳＵＶのコアには水溶液が含有されている。
リポソーム作製に有用な脂質の例としては、ホスファチジル化合物、例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。ジアシルホスファチジルグリセロール（脂質部分が１４個〜１８個の炭素原子、特に１６個〜１８個の炭素原子を含み、飽和状態である）が特に有用である。例示的なリン脂質には、卵黄ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。
第６の態様では、本発明のコンジュゲートは診断用試薬として有用であり得る。例えば、標識化された化合物を、炎症を有する疑いのある患者において炎症又は腫瘍転移の領域を特定するのに使用することができる。この使用に関して、化合物を１２５Ｉ、１４Ｃ又はトリチウムで標識化することができる。
第７の態様では、本発明は薬剤（すなわち医薬組成物）の製造のための本発明の送達システム又はコンジュゲートの使用に関する。医薬組成物を、人間医学及び獣医学それぞれにおいてヒト又は動物を治療するのに使用することができる。
第８の態様では、本発明は、細胞に化合物（ｄ）を送達する方法であって、
（ａ）細胞を準備する工程と、
（ｂ）本発明のコンジュゲートを上記細胞に、該細胞により該コンジュゲートが内部移行され、それにより化合物（ｄ）が該細胞に送達される条件下で接触させる工程と、
を含む、細胞に化合物（ｄ）を送達する方法に関する。一実施形態では、細胞は単離細胞又は培養細胞である。
好ましくは、細胞は真核細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、線形動物細胞、真菌細胞、アスペルギルス属の細胞、酵母細胞、サッカロミセス属（Sacchromyces）細胞、ピチア属の細胞、昆虫細胞、Ｓｆ９細胞、動物細胞、非ヒト動物細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、ヒト細胞又は植物細胞である。好ましい実施形態では、細胞に化合物（ｄ）を送達する方法により、細胞における遺伝子発現及び／又はタンパク質生成の増減がもたらされる。
特に好ましい実施形態では、細胞に化合物（ｄ）を送達する方法は、
（ａ）細胞を準備する工程と、
（ｂ）本発明のコンジュゲートを上記細胞に、該細胞により該コンジュゲートが内部移行され、それにより化合物（ｄ）が送達される条件下で接触させる工程であって、上記細胞の遺伝子発現が変更され（すなわち増大又は低減し）かつ／又は上記細胞におけるタンパク質生成が変更される（すなわち増大又は低減する）、接触させる工程とを含む。これにより、本発明の送達システム又はコンジュゲートを用いて細胞における遺伝子発現及び／又はタンパク質生成を変更する方法も提供される。好ましくは、細胞は単離細胞又は培養細胞である。より好ましくは、細胞は、組換え遺伝子発現、タンパク質生成、及び／又は薬物、小分子若しくは生体分子のスクリーニングに用いられる単離細胞又は培養細胞である。好ましくは、単離細胞又は培養細胞は、真核細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、線形動物細胞、真菌細胞、アスペルギルス属の細胞、酵母細胞、サッカロミセス属の細胞、ピチア属の細胞、昆虫細胞、昆虫細胞、動物細胞、非ヒト動物細胞、ＣＨＯ細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、ヒト細胞又は植物細胞である。
第９の態様では、本発明は、生物に化合物（ｄ）を送達する方法であって、
（ａ）十分量の本発明のコンジュゲートを患者に投与し、それにより化合物（ｄ）が生物に送達される、投与する工程を含む、生物に化合物（ｄ）を送達する方法に関する。
好ましくは、生物は動物、哺乳動物、ヒト又は植物である。好ましい実施形態では、生物に化合物（ｄ）を送達する方法により、生物の細胞における遺伝子発現及び／又はタンパク質生成の増減がもたらされる。別の好ましい実施形態では、生物に化合物（ｄ）を送達する方法により、生物において免疫の増大又は免疫応答の増大がもたらされる。
第１０の態様では、本発明は、患者に化合物（ｄ）を送達する方法であって、
（ａ）十分量の本発明のコンジュゲートを患者に投与し、それにより化合物（ｄ）が患者に送達される、投与する工程を含む、生物に化合物（ｄ）を送達する方法に関する。
本明細書で使用される場合、「患者」は障害、疾患又は病態を患う、及び／又はその治療を受ける生物を表す。患者は任意の動物であり得るが、好ましくは哺乳動物、例えばウシ、ウマ、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ又は霊長類である。好ましい実施形態では、患者はヒトである。好ましくは、患者は動物、非ヒト動物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物又はヒトである。より好ましくは、患者は、増大した、低減した、不十分な、異常な又は望ましくない標的遺伝子発現又はタンパク質生成により媒介される障害、疾患又は病態を患う、及び／又はその治療を受けるヒトである。別の実施形態では、患者は免疫の低下、不十分な免疫、又は免疫の喪失により媒介される障害、疾患又は病態を患う、及び／又はその治療を受ける。
好ましい実施形態では、患者に化合物（ｄ）を送達する方法は、十分量の
（ａ）細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にする少なくとも１つのモジュール（ａ）と、
（ｂ）小胞体（ＥＲ）への輸送を容易にする少なくとも１つのモジュール（ｂ）と、
（ｃ）ＥＲからサイトゾルへの転位を媒介する少なくとも１つのモジュール（ｃ）と、
（ｄ）少なくとも１つの化合物（ｄ）と、
を含む、それから本質的になる、又はそれからなる、コンジュゲートを患者に投与する工程であって、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）が任意の配置で互いに結合し、コンジュゲートが任意で核局在化シグナルを含む、投与する工程と、それにより
患者に化合物（ｄ）を送達する工程と、
を含む。
好ましくは、本発明による方法を用いて患者に送達される化合物（ｄ）はｓｉＲＮＡである。
更なる態様では、本発明は少なくとも１つの化合物（ｄ）の送達により予防又は治療することができる疾患の治療及び予防に使用される本発明のコンジュゲートに関する。
「疾患」は、生物が恒常性を維持できず、疾患が緩和されなければ、生物の健康が悪化し始めるか、又は悪化し続ける生物の健康状態である。
ＲＮＡｉ媒介性のサイレンシングは化合物（ｄ）としてｓｉＲＮＡを含む本発明によるコンジュゲートを投与した後、数日間持続することが期待されるので、多くの場合１日につき１回未満の頻度で、又は場合によっては治療計画全体を通して１回だけ本発明のコンジュゲートを投与することが可能である。例えば、一部のがん細胞の治療が単回ボーラス投与により媒介され得る一方、慢性ウイルス感染では、規則的な、例えば１週間に１回又は１ヶ月に１回の投与が要求され得る。
本発明は、全ての細胞内で遍在的に起こる内因性プロセスを用いることにより、生物学的に活性のある巨大分子、核酸又は特にペプチド等の化合物を、培養物中の又は生物内の細胞へと効果的に送達することができるコンジュゲートを提供する。
本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の様々な修正形態及び変更形態が当業者にとって明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明されているが、クレームされる発明がこのような特定の実施形態に過度に限定されないものとすることを理解されたい。実際に、関連分野の当業者にとって明らかである、本発明を実施するための記載の様式の様々な修正形態が本発明に包含されることが意図される。
これより本発明を以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は例示目的のみで提示され、本発明がこれらの実施例に限定されるとは解釈されず、むしろ本明細書で提示される教示により明らかになるあらゆる変更形態を包含すると解釈されるものとする。
本明細書で使用される略語には、キログラム（ｋｇ）、ミリグラム（ｍｇ）、ミリリットル（ｍＬ）、マイクロリットル（μＬ）、モーラー（Ｍ）、ミリモーラー（ｍＭ）、マイクロモーラー（μＭ）、マイクロモル（μｍｏｌ）、ナノモル（ｎｍｏｌ）、時間（ｈ）、キロダルトン（ｋＤａ）、セルシウス度（℃）、分（ｍｉｎ）、ミリメートル（ｍｍ）、ミクロン（μｍ）、ナノメートル（ｎｍ）、アミノ酸（ａａ）、野生型（ｗｔ）、重力（ｇ）及び腹腔内（ｉ．ｐ．）が含まれる。
実施例１：ＤＡＲＥ（商標）送達システムの送達モジュールの合成、及びモジュール−ｓｉＲＮＡコンジュゲートのＤＡＲＥ（商標）−Ｒ−ＣＸ（図２、ＤＡＲＥ（商標）２．０１）及びＤＡＲＥ（商標）−Ｒ−ＡＫ−ＣＸ（ＤＡＲＥ（商標）Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｄｅｓｉｇｎ ２．０３）の調製
（ｉ）送達モジュール（ｂ）及び送達モジュール（ｃ）を含有する結合分子の合成：
２つの（「モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）」＋リンカー）分子：Ｈ２Ｎ−Ｃ（ＮＰｙＳ）（Ｓ−Ｇ）３（ＤｐｒＡｏａ）（Ｓ−Ｇ）３ＮＡＳＳＳＲＳＧＬＤＤＩＮＰＴＶＬＬＫＥＲＳＴＥＬ−ＯＨ（「モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）」官能基が配列番号１７７（ＣＸ１）を含むアミノ酸配列を含むヒトＣＯＸ２ペプチドにより与えられる）及びＨ２Ｎ−Ｃ（ＮＰｙＳ）（Ｓ−Ｇ）３（ＤｐｒＡｏａ）（Ｓ−Ｇ）３ＮＡＳＳＳＲＳＧＬＤＤＩＮＰＴＶＬＬＫＡＫＤＥＬ−ＯＨ（「モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）」が配列番号２４４（ＣＸ２ａ）を含む）を、標準的な固相Ｆｍｏｃペプチド化学により商業的に合成し、標準的なやり方で脱保護し、逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により純度が９５％を超えるまで精製する。構成単位としてＢｏｃ−Ｃｙｓ（ＮＰｙｓ）−ＯＨ（Bachem、製品番号Ａ−２８２５）を用いて活性化システイン残基を導入する。Ｆｍｏｃ−Ｄｐｒ（Ｂｏｃ−Ａｏａ）−ＯＨ（Novabiochem、製品番号０４−１２−１１８５）を用いて、Ｎ−β−アミノオキシアセチルＬ−ジアミノプロピオニル残基を導入する。精製ペプチドの品質管理（ＱＣ）を、アミノ酸分析、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）及び分析逆相ＨＰＬＣにより行う。
（ｉｉ）モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びにリンカーを含む送達担体の合成：
モジュール（ａ）を調製するために、組換えリシン毒素Ｂサブユニット（配列番号１２４を含むリシンＢ、Vector Laboratories, Inc.からカタログ番号Ｌ−１２９０で商業的に得られ、又は組換えにより調製され、０．０８％アジ化ナトリウムと５０ｍＭの２−メルカプトエタノールとを含有する、１０ｍＭのリン酸ナトリウム水溶液、０．１５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）における１ｍｇ／ｍＬ溶液として供給又は調製される）に、５０ｍＭの新たな２−メルカプトエタノールを添加し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートして、Ｃ末端から４位にあるＣｙｓ残基を完全に完全還元型にする。それから溶液を分子量カットオフ値１０ｋＤａ、容量０．５ｍＬ〜３ｍＬのＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Pierce、番号６６３８０）において１０ｍＭの脱気したリン酸ナトリウムバッファー、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）に対して透析する。室温で各２時間２回の透析を行った後、４℃で一晩最後の透析を行った。リシンＢを含有する溶液を１．１モル当量の上記の実施例１（ｉ）のモジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含有する結合分子を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液と窒素下で室温で一晩反応させる。それから所望の担体（モジュール（ａ）＋モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ））を、流速１ｍＬ／分で５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウムバッファー、１００ｍＭのＮａＣｌ、２μＭのＥＤＴＡ（ｐＨ５．０）で溶出させるＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５調製用（prep grade）カラム（GE Healthcare、商品番号１７−１０６８−０１）を用いて分取ゲル濾過（サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ））により精製する。所望の担体ピークの同定は、実施例１（ｉ）のリシンＢ及びリンカー−ペプチドエンティティを用いてＳＥＣカラムを較正することにより可能となる。生成物をＥＳＭＳにより、及びネイティブゲル電気泳動（native gel electrophoresis）により分析し、リシンＢ及びリンカー−ペプチドと比較する。
（ｉｉｉ）送達物化合物（ｄ）（ｓｉＲＮＡ）の調製：
１９ヌクレオチド長の二本鎖領域と、各鎖の３’末端に突出し、グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を標的とする、２つのヌクレオチドとを有する、２つの２１ｍｅｒ鎖から構成される二本鎖ＲＮＡ分子（ここではセンス鎖がCCAuCUUCCAGGAGCgAGAuu（配列番号２４８）（ここで、小文字のｕ又はｇは２’−Ｏ−Ｍｅ−修飾ヌクレオチドを表す）を含み、アンチセンス鎖がUCUCGCUCCUGgAAGAuGGdTdG（配列番号２４９）（ここで小文字のｕ又はｇは２’−Ｏ−Ｍｅ−修飾ヌクレオチドを表す）を含み、アンチセンス鎖がその３’末端に５’−ホスフェートとデオキシヌクレオチドとを有する（ｄＮｄＮ））を、センス鎖の５’末端が５’−（Ｃ６アミノリンカー）−ホスフェート−（Ｃ６−ＳＳ−Ｃ６スペーサー）−ホスフェート−Ｃｙ３により修飾されるように合成する。Ｃｙ３色素は蛍光による追跡を目的とし、ジスルフィド結合により、最終的に送達物を細胞の還元環境内で放出させることができる。一本鎖をＱＣのためにＥＳＭＳ及び分析ＨＰＬＣにより分析した後、アニーリングを行った。脱塩処理した凍結乾燥ｓｉＲＮＡを滅菌四ホウ酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）に溶解し、室温で３時間、１０体積％のＤＭＳＯに溶解させた、１０モル当量のアダプタ分子ＳＦＢ（スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエート、Thermo Scientific、カタログ番号２２４１９）と反応させる。ベンズアルデヒド官能基（function）を有するｓｉＲＮＡを、分子量カットオフ値３．５ｋＤａ、容量０．５ｍＬ〜３ｍＬのＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Pierce、番号６６３３０）を用いた５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、２μＭのＥＤＴＡ（ｐＨ５）に対する透析により単離する。室温で各２時間２回の透析を行った後、４℃で一晩３回目の透析を行う。最終的な溶液を、小型限外濾過セルを用いておよそ１ｍＬの最終体積まで濃縮する。アダプタ修飾ｓｉＲＮＡのＱＣをＥＳＭＳ及び分析ＨＰＬＣにより行う。少量のサンプルを一定量、バッファー（ｐＨ５）中で過剰量のＣａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅヒドラジド（Molecular Probes、カタログ番号Ｃ−６８７）との反応により、アルデヒド部分の存在に関して分析し、エタノール沈殿により脱塩処理して、多波長検出（ＲＮＡに関しては２６０ｎｍ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅに関しては３９９ｎｍ及びＣｙ３に関しては５５０ｎｍ）を用いたＭｏｎｏＱカラム（GE Healthcare）上でのネイティブアニオン交換ＨＰＬＣにより分析する。
（ｉｖ）送達物（化合物（ｄ））と送達担体（モジュール（ａ）＋モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）及びリンカー）とのカップリング：
上記の実施例１（ｉｉ）の担体を、およそ等モル量の上記の実施例１（ｉｉｉ）のアダプタ−ｓｉＲＮＡ構成要素（送達物）と混合し、室温で数時間維持した。所望のコンジュゲートを、滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により１ｍＬ／分で溶出させるＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５調製用カラム（GE Healthcare、商品番号１７−１０６８−０１）上での分取ＳＥＣにより精製する。カラム溶出液を２６０ｎｍ及び５５０ｎｍでモニタリングする。カラムの較正を行った後に、個々の反応構成要素を用いて予備精製を行う。コンジュゲートを含有するこれらの画分を合わせて、限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ装置）により濃縮し、最終濃縮物を４℃で保存する。ＱＣをネイティブゲル電気泳動及びＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（GE Healthcare、商品番号１７−５１７４−０１）上での分析ＳＥＣにより行う。
ＤＡＲＥ（商標）構築物がともに（ほとんどの場合、２つのジスルフィド結合により）共有結合した幾つかの構成要素を含み、かつポリペプチド及び送達物分子を含むため、これらをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ又はＥＳＭＳ等の標準的なＭＳ技法を用いて分子量により単一のエンティティとして特徴付けることは困難であり得る。ＰＡＧＥ又はゲル濾過による特徴づけにより、確実にその均一性の一般的指標が与えられ、それにより単離した分子が期待される構成要素部分を全て含むことが確認されるが、ＤＡＲＥ（商標）構築物をジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）等の還元剤とインキュベートし、接近可能なジスルフィド結合を全て切断するのが好ましい。これにより、２つのジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合の場合に３つの分子が生成し、これはイオン対逆相ＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）により分離し、またＥＳＭＳにより特徴付けることができる。必要に応じて、個々の構成要素をＭＳ−ＭＳによりシークエンシングしてもよいが、ほとんどの場合、構成要素の測定質量が期待（算出）質量に適合させるのに十分であるとする。
また、少量の生成物を一定量、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理し、２つの接近可能なジスルフィド結合を還元して、３つの反応生成物（すなわち、リシンＢ、リンカー−ペプチド構築物＋アダプタ、及びＨＳ−（ＣＨ２）６−ＯＰ（Ｏ２）−Ｏ−Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ）を生成し、これをＥＳＭＳ及びＰＢＳで溶出させるＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラムを用いる分析ＳＥＣにより分析する。
本実施例に記載のアプローチを用いて、他の送達物、例えば二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ｍｉＲＮＡアンタゴニスト（アンタゴｍｉｒ（antagomir））、アンチセンスオリゴヌクレオチド等を本発明の送達担体（すなわち（モジュール（ａ）＋モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）））に結合させることができることは当業者にとって明らかであろう。一本鎖送達物を３’末端で結合させるのが有益であり得る。３’修飾された一本鎖は当業者にとって標準的な手順により作製される。
実施例１に記載のようなコンジュゲートＤＡＲＥ（商標）−Ｒ−ＡＫ−ＣＸの詳細図をＣｙ３を有しないＤＡＲＥ（商標）−Ｒ−ＡＫ−ＣＸ／２．０３として図２Ａに、またＣｙ３を有するＤＡＲＥ（商標）−Ｒ−ＡＫ−ＣＸ／２．０３として図２Ｂに示す。
実施例２：ＤＡＲＥ（登録商標）送達モジュールの合成及び送達ｓｉＲＮＡコンジュゲートＤＡＲＥ（商標）−Ｒ−ＣＸｐｅｇ（ＤＡＲＥ（商標）Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｄｅｓｉｇｎ ２．０）の調製
（ｉ）モジュール及びモジュール（ｃ）を含有する結合分子の合成：
モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）＋リンカーペプチドＨ２Ｎ−Ｃ（ＮＰｙＳ）（ｄＰＥＧ１２）（ＤｐｒＡｏａ）（ｄＰＥＧ１２）ＮＡＳＳＳＲＳＧＬＤＤＩＮＰＴＶＬＬＫＥＲＳＴＥＬ−ＯＨ（「モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）」官能基が配列番号１７７（ＣＸｐｅｇ）を含むアミノ酸配列を含むヒトＣＯＸ２ペプチドにより与えられる）を、標準的な固相Ｆｍｏｃペプチド化学により商業的に合成し、標準的なやり方で脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより純度が９５％を超えるまで精製する。構成単位としてＢｏｃ−Ｃｙｓ（ＮＰｙｓ）−ＯＨ（Bachem、製品番号Ａ−２８２５）を用いて活性化システイン残基を導入する。Ｆｍｏｃ−Ｄｐｒ（Ｂｏｃ−Ａｏａ）−ＯＨ（Novabiochem、製品番号０４−１２−１１８５）を用いて、Ｎ−β−アミノオキシアセチルＬ−ジアミノプロピオニル残基を導入する。ｄＰＥＧ１２を、Ｆｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２酸（Quanta BioDesign、製品番号１０２８３）を用いて導入する。精製ペプチドのＱＣを、アミノ酸分析、ＥＳＭＳ及び分析逆相ＨＰＬＣにより行う。
（ｉｉ）送達担体（リンカー＋モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ））の合成：
リシンＢからの送達担体及び上記の実施例２（ｉ）のリンカー−ペプチドの合成は上記の１（ｉｉ）に記載されている。簡潔にいうと、リシンＢ（モジュール（ａ））を実施例１（ｉｉ）に記載のように調製した後、窒素下で室温で一晩、１．１モル当量の実施例２（ｉ）の（リンカー−モジュール（ｃ）−モジュール（ｂ））生成物を含有するＰＢＳ溶液と反応させる。送達担体（モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）、並びにリンカー）を上記の実施例１（ｉｉ）に記載のように精製及び分析する。
（ｉｉｉ）送達物ｓｉＲＮＡ（化合物（ｄ））の調製：
送達物ｓｉＲＮＡ（化合物（ｄ））を上記の実施例１（ｉｉｉ）に記載のように調製する。
（ｉｖ）化合物（ｄ）と担体モジュールとのカップリング：
上記の実施例２（ｉｉ）及び実施例２（ｉｉｉ）の構成要素を合わせて、ＤＡＲＥ（商標）−Ｒ−ＣＸｐｅｇコンジュゲートを上記の実施例１（ｉｖ）に記載のように単離及び分析する。
実施例３：ｓｉＲＮＡ送達物を送達するモジュール（ａ）としてＴｅｔ１ペプチドを有するＤＡＲＥ（商標）Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｄｅｓｉｇｎ ３．１の合成
本実施例はモジュール（ａ）として神経細胞標的化ペプチドＴｅｔ１［６５、６６］を含むコンジュゲートの調製を説明する。Ｔｅｔ１タンパク質はニューロンを標的とし、破傷風毒素と同じ結合特徴を有する［６５、６６］。
（ｉ）Ｔｅｔ１ペプチドベースのモジュール（ａ）の合成：
Ｔｅｔ１ペプチドＨＬＮＩＬＳＴＬＷＫＹＲ−（柔軟性リンカー）−Ｃ（配列番号２５０）（ここで柔軟性リンカーはＧＧＧ、ＳＧＳＧ又はＳＧＳＧＳＧである）を、標準的な固相Ｆｍｏｃペプチド化学により合成し、標準的なやり方で脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより純度が９５％を超えるまで精製する。精製ペプチドのＱＣをアミノ酸分析、ＥＳＭＳ及び分析逆相ＨＰＬＣにより行う。
（ｉｉ）モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含有する結合分子の合成：
（モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）＋リンカー）ペプチドＨ２Ｎ−Ｃ（ＮＰｙＳ）（ｄＰＥＧ１２）（ＤｐｒＡｏａ）（ｄＰＥＧ１２）ＮＡＳＳＳＲＳＧＬＤＤＩＮＰＴＶＬＬＫＡＫＤＥＬ−ＯＨ（「モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）」を含むペプチドは配列番号２４４を含むアミノ酸配列を含む）を、標準的な固相Ｆｍｏｃペプチド化学により合成し、標準的なやり方で脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより純度が９５％を超えるまで精製する。構成単位としてＢｏｃ−Ｃｙｓ（ＮＰｙｓ）−ＯＨ（Bachem、製品番号Ａ−２８２５）を用いて活性化システイン残基を導入する。Ｆｍｏｃ−Ｄｐｒ（Ｂｏｃ−Ａｏａ）−ＯＨ（Novabiochem、製品番号０４−１２−１１８５）を用いて、Ｎ−β−アミノオキシアセチルＬ−ジアミノプロピオニル残基を導入する。ｄＰＥＧ１２を、Ｆｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２酸（Quanta BioDesign、製品番号１０２８３）を用いて導入する。精製ペプチドのＱＣを、アミノ酸分析、ＥＳＭＳ及び分析逆相ＨＰＬＣにより行う。
（ｉｉｉ）モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びにリンカーを含む送達担体の合成：
上記の実施例３（ｉ）のモジュール（ａ）を１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中に含有する溶液を、窒素下で室温で一晩、同じバッファー中に上記の実施例３（ｉｉ）のモジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含有する１．１モル当量の結合分子を含有する溶液と反応させる。それから所望の担体を、流速１ｍＬ／分で１００ｍＭのリン酸二水素ナトリウムバッファー、１００ｍＭのＮａＣｌ、２μＭのＥＤＴＡ（ｐＨ５．０）で溶出させるＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５調製用カラム（GE Healthcare、商品番号１７−１０６８−０１）を用いた分取ゲル濾過（ＳＥＣ）により調製する。所望の担体ピークの同定は、２つの個々の出発材料を用いてＳＥＣカラムを較正することにより可能となる。生成物をＥＳＭＳ、ネイティブゲル電気泳動及び分析逆相ＨＰＬＣにより分析する。
（ｉｖ）送達物ｓｉＲＮＡ（化合物（ｄ））の調製：
センス鎖の５’末端が５’−（Ｃ６アミノリンカー）−ホスフェート−（Ｃ６−ＳＳ−Ｃ６スペーサー）−ホスフェート−Ｃｙ３で修飾された、ＴｕｓｃｈｌスタイルのｓｉＲＮＡ標的化ＧＡＰＤＨを、実施例１（ｉｉｉ）に記載のように合成、精製及び分析する。
（ｖ）化合物（ｄ）と送達担体とのカップリング：
上記の実施例３（ｉｉｉ）の送達担体を、およそ等モル量の上記の実施例３（ｉｖ）のアダプタ−ｓｉＲＮＡ構成要素（送達物）と混合し、室温で数時間維持した。所望のコンジュゲートを、滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により１ｍＬ／分で溶出させるＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５調製用カラム（GE Healthcare、商品番号１７−１０６８−０１）上での分取ＳＥＣにより精製する。カラム溶出液を２６０ｎｍ及び５５０ｎｍでモニタリングする。カラムの較正を行った後に、個々の反応構成要素を用いて予備精製を行う。コンジュゲートを含有するこれらの画分を合わせて、限外濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ装置）により濃縮し、最終濃縮物を４℃で保存する。ＱＣをネイティブゲル電気泳動及びＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（GE Healthcare、商品番号１７−５１７４−０１）上での分析ＳＥＣにより行う。また、少量の生成物を一定量、ＤＴＴで処理し、２つの接近可能なジスルフィド結合を還元して、３つの反応生成物（すなわち、モジュール（ａ）、リンカー−ペプチド構築物＋アダプタ、及びＨＳ−（ＣＨ２）６−ＯＰ（Ｏ２）−Ｏ−Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ）を生成し、これをＥＳＭＳ、ＰＢＳで溶出させるＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラムを用いる分析ＳＥＣ、及び分析逆相ＨＰＬＣにより分析する。
実施例４：モジュール（ａ）として一本鎖抗体とｓｉＲＮＡ送達物とを有するＤＡＲＥ（商標）Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｄｅｓｉｇｎ ３．２の合成
（ｉ）モジュール（ａ）の合成：
Ｃ末端に更なるシステインを有する抗ＥＧＦＲ一本鎖抗体（配列番号２５１）を、固相Ｆｍｏｃ化学を用いて合成し、標準的なやり方で脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより純度が９５％を超えるまで精製する。精製ペプチドのＱＣを、アミノ酸分析、ＥＳＭＳ及び分析逆相ＨＰＬＣにより行う。
（ｉｉ）モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含有する結合分子の合成：
（モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）＋リンカー）ペプチドＮ−アセチル−Ｃ（ＮＰｙＳ）（ｄＰＥＧ１２）（ＤｐｒＡｏａ）（ｄＰＥＧ１２）ＮＡＳＳＳＲＳＧＬＤＤＩＮＰＴＶＬＬＫＡＫＤＥＬ−ＯＨ（「モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）」を含むペプチドは配列番号２４４を含むアミノ酸配列を含む）を、標準的な固相Ｆｍｏｃペプチド化学により合成し、標準的なやり方で脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより純度が９５％を超えるまで精製する。構成単位としてＢｏｃ−Ｃｙｓ（ＮＰｙｓ）−ＯＨ（Bachem、製品番号Ａ−２８２５）を用いて活性化システイン残基を導入する。Ｆｍｏｃ−Ｄｐｒ（Ｂｏｃ−Ａｏａ）−ＯＨ（Novabiochem、製品番号０４−１２−１１８５）を用いて、Ｎ−β−アミノオキシアセチルＬ−ジアミノプロピオニル残基を導入する。ｄＰＥＧ１２を、Ｆｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２酸（Quanta BioDesign、製品番号１０２８３）を用いて導入する。精製ペプチドのＱＣを、アミノ酸分析、ＥＳＭＳ及び分析逆相ＨＰＬＣにより行う。
（ｉｉｉ）モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）、モジュール（ｃ）及びリンカーを含む送達担体の合成：
１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中に上記の実施例４（ｉ）のモジュール（ａ）を含有する溶液を、窒素下で室温で一晩、同じバッファー中に上記の実施例４（ｉｉ）のモジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含有する１．１モル当量の結合分子を含有し、また両方の構成要素の溶解性を確保するのに十分なＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含有する溶液と反応させる。それから所望の担体を、流速１ｍＬ／分で１００ｍＭのクエン酸バッファー、２μＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）で溶出させるＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５調製用カラム（GE Healthcare、商品番号１７−１０６８−０１）を用いて分取ゲル濾過（ＳＥＣ）により精製する。所望の担体ピークの同定は、２つの個々の出発材料を用いてＳＥＣカラムを較正することにより可能となる。生成物をＥＳＭＳ、ネイティブゲル電気泳動及び分析逆相ＨＰＬＣにより分析する。
（ｉｖ）送達物ｓｉＲＮＡ（化合物（ｄ））の調製：
ＴｕｓｃｈｌスタイルのｓｉＲＮＡ標的化ＧＡＰＤＨを、センス鎖の５’末端が５’−（Ｃ６アミノリンカー）−ホスフェート−（Ｃ６−ＳＳ−Ｃ６スペーサー）−ホスフェート−Ｃｙ３で修飾された、実施例１（ｉｉｉ）に記載のように合成、精製及び分析する。
（ｖ）化合物（ｄ）と送達担体とのカップリング：
上記の実施例４（ｉｉｉ）の担体を、およそ等モル量の上記の実施例４（ｉｖ）のアダプタ−ｓｉＲＮＡ（送達物）と混合し、室温で一晩維持する。所望のコンジュゲートを上記の実施例３（ｖ）に記載のように精製及び分析する。少量の生成物を一定量、ＤＴＴで処理し、２つの接近可能なジスルフィド結合を還元して、３つの反応生成物、すなわちモジュール（ａ）、リンカー−ペプチド構築物＋アダプタ、及びＨＳ−（ＣＨ２）６−ＯＰ（Ｏ２）−Ｏ−Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡを生成する。これらをＥＳＭＳ、ＰＢＳで溶出させるＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラムを用いる分析ＳＥＣ、及び分析逆相ＨＰＬＣにより分析する。
実施例５：非共有結合したｓｉＲＮＡ送達物を送達するためのＤＡＲＥ（商標）Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｄｅｓｉｇｎ ３．３ａの合成
（ｉ）モジュール（ａ）としてのアルデヒド修飾トランスフェリンの構築
ヒト血清トランスフェリン（配列番号２５２、Sigma,Invitrogen）を穏和な条件下で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させ、d'Alessandro et al.［６７］の公開プロトコルを用いて炭水化物部分上で反応性のアルデヒド官能基を生成する。ペルオキシダーゼヒドラジドとアルデヒド修飾トランスフェリンとのコンジュゲーションにより、抗トランスフェリン抗体と抗ペルオキシダーゼ抗体との両方により完全に認識可能なバイオコンジュゲートが得られることがこれまでに分かっている［６７］。
（ｉｉ）モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含有する分岐ペプチド部分を含む結合分子の合成
（モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）＋リンカー）ペプチド構築物１２−（アミノオキシ）ドデカノイル−（ｄＰＥＧ１２）−ｂＬｙｓ−（ｄＰＥＧ１２）ＮＡＳＳＳＲＳＧＬＤＤＩＮＰＴＶＬＬＫＡＫＤＥＬ−ＯＨを含有するＰＥＧ（「モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）」を含むペプチドは配列番号２４４を含むアミノ酸配列を包含する）（また分岐リジン（ｂＬｙｓ）残基の側鎖アミンは配列（ｄＰＥＧ１２）Ｃｙｓ（ＮＰｙｓ）を有する）を、標準的な固相Ｆｍｏｃペプチド化学により商業的に合成し、標準的なやり方で脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより純度が９５％を超えるまで精製する。Ｎ末端の１２−（アミノオキシ）ドデカノイル部分を１２−（Ｂｏｃ−アミノオキシ）−ドデカン酸（Bachem、カタログ番号Ａ−４７２０）を用いて導入する。ｄＰＥＧ１２を、Ｆｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２酸（Quanta BioDesign、製品番号１０２８３）を用いて導入する。分岐点のリジン残基を、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ（Merck Novabiochem、製品番号０４−１２１１９３）構成単位を用いて導入する。精製ペプチドのＱＣを、アミノ酸分析、ＥＳＭＳ及び分析逆相ＨＰＬＣにより行う。
（ｉｉｉ）Ｎ末端システインを有する遺伝子操作したＤＲＢＤの作製：
二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ＤＲＢＤ）：FFMEELNTYRQKQGVVLKYQELPNSGPPHDRRFTFQVIIDGREFPEGEGRSKKEAKNAAAKLAVEILNKE（配列番号８）を、Ｎ末端のＣｙｓ残基による組換え操作により遺伝的に生成するか（CFFMEELNTYRQKQGVVLKYQELPNSGPPHDRRFTFQVIIDGREFPEGEGRSKKEAKNAAAKLAVEILNKE（配列番号２５３））、又は代替的にＣ末端の更なるシステインにより、固相Ｆｍｏｃペプチド化学を用いて合成し（FFMEELNTYRQKQGVVLKYQELPNSGPPHDRRFTFQVIIDGREFPEGEGRSKKEAKNAAAKLAVEILNKEC（配列番号２５４））、標準的なやり方で脱保護して、逆相ＨＰＬＣにより純度が９５％を超えるまで精製する。精製ペプチドのＱＣを、アミノ酸分析、ＥＳＭＳ及び分析逆相ＨＰＬＣにより行う。
（ｉｖ）識別モジュール（（ｂ）及び（ｃ））及びＤＲＢＤアダプタと結合した標的化モジュール（ａ）を含むｓｉＲＮＡ送達物結合構築物の調製：
上記の実施例５（ｉ）のアルデヒド修飾トランスフェリンを初めに、ｐＨ６の脱気した１００ｍＭのクエン酸バッファー中で上記の実施例５（ｉｉ）のモジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含有する２モル当量のアミノオキシ保持結合分子と反応させ、４℃で一晩維持する。所望の中間体を、滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により１ｍＬ／分で溶出させるＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５調製用カラム（GE Healthcare、商品番号１７−１０６８−０１）上での分取ＳＥＣにより調製する。それからこの中間体を、４℃のＰＢＳ中での一晩の反応におけるＣｙｓ（ＮＰｙｓ）残基とのジスルフィド交換により、上記の実施例５（ｉｉｉ）のＮ末端システインを含有するＤＲＢＤにコンジュゲートさせる。所望の送達物結合モダリティ（modality）を、滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により１ｍＬ／分で溶出させるＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００調製用カラム（GE Healthcare、商品番号１７−１０６９−０１）上での分取ＳＥＣにより精製する。最後のＱＣ分析を、ゲル電気泳動及びＥＳＭＳ、更にＤＴＴによる構築物の切断及び２つの構成要素の分析により行う。
実施例６：非共有結合したｄｓＤＮＡ送達物を送達するためのＤＡＲＥ（商標） Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｄｅｓｉｇｎ ３．３ｂの合成
（ｉ）モジュール（ａ）としてのアルデヒド修飾トランスフェリンの構築
ヒト血清トランスフェリン（配列番号２５２、Sigma,Invitrogen）を、穏和な条件下で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させ、d'Alessandro et al.［６７］の公開プロトコルを用いて炭水化物部分上で反応性のアルデヒド官能基を生成する。ペルオキシダーゼヒドラジドとアルデヒド修飾トランスフェリンとのコンジュゲーションにより、抗トランスフェリン抗体と抗ペルオキシダーゼ抗体との両方により完全に認識可能なバイオコンジュゲートが得られることがこれまでに分かっている［６７］。
（ｉｉ）モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含有する分岐ペプチド部分を含む結合分子の合成
（モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）＋リンカー）ペプチド構築物１２−（アミノオキシ）ドデカノイル−（ｄＰＥＧ１２）−ｂＬｙｓ−（ｄＰＥＧ１２）ＮＡＳＳＳＲＳＧＬＤＤＩＮＰＴＶＬＬＫＡＫＤＥＬ−ＯＨを含有するＰＥＧ（「モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）」を含むペプチドは配列番号２４４を含むアミノ酸配列を包含する）（また分岐リジン（ｂＬｙｓ）残基の側鎖アミンは配列（ｄＰＥＧ１２）を有する）を、標準的な固相Ｆｍｏｃペプチド化学により合成し、標準的なやり方で脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより純度が９５％を超えるまで精製する。Ｎ末端の１２−（アミノオキシ）ドデカノイル部分を１２−（Ｂｏｃ−アミノオキシ）−ドデカン酸（Bachem、カタログ番号Ａ−４７２０）を用いて導入する。ｄＰＥＧ１２を、Ｆｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２酸（Quanta BioDesign、製品番号１０２８３）を用いて導入する。分岐点のリジン残基を、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ（Merck Novabiochem、製品番号０４−１２１１９３）構成単位を用いて導入する。精製ペプチドのＱＣを、アミノ酸分析、ＥＳＭＳ及び分析逆相ＨＰＬＣにより行う。
（ｉｉｉ）識別モジュール（（ｂ）及び（ｃ））及びリンカーと結合した標的化モジュール（ａ）を含むアリールヒドラジン含有構築物の調製：
上記の実施例６（ｉ）のアルデヒド修飾トランスフェリンを初めに、ｐＨ６の脱気した１００ｍＭのクエン酸バッファー中で上記の実施例６（ｉｉ）のモジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含有する２モル当量のアミノオキシ保持結合分子と反応させ、４℃で一晩維持する。所望の中間体を、滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により１ｍＬ／分で溶出させるＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５調製用カラム（GE Healthcare、商品番号１７−１０６８−０１）上での分取ＳＥＣにより精製する。それからこの中間体のｄＰＥＧ１２上の第１級アミノ基を、１００ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中の４モル当量のスルホスクシンイミジル６−ヒドラジンニコチン酸アセトンヒドラゾン（スルホ−Ｓ−ＨｙＮｉｃ、スルホ−ＳＡＮＨ、SoluLink、製品番号Ｓ−１０１１−０１０）と室温で２時間反応させ、アセトンヒドラゾンとして保護されたアリールヒドラジン官能基を導入する。それから活性化構築物をＶｉｖａｓｐｉｎ ２ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）限外濾過スピンカラム（分子量カットオフ値 ５ｋＤａ、Sartorius Stedim Biotech、商品番号ＶＳ０２１１）を用いて脱塩処理し、１００ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）にバッファーを交換する。
（ｉｖ）Ｎ末端にＳＶ４０ ＮＬＳを有する、ヒト高移動度群タンパク質ＨＭＧＢ２（ＤＤＢＰ）に由来する芳香族アルデヒド修飾アダプタ分子の合成
ＳＶ４０ＮＬＳ−ＨＭＧＢ２１８６をSloots et al.［６８］（その全体が参照により本明細書に援用される）の公開プロトコルを用いて大腸菌で発現させる。精製タンパク質を室温で２時間、１００ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で２モル当量のＭＴＦＢ（SoluLink、製品番号Ｓ−１０３５）と反応させ、これによりシステインチオールが（ＰＥＧ）３スペーサーを介して４−ホルミルベンズアミド部分で官能基化される。それから所望の活性化構築物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）限外濾過スピンカラム（分子量カットオフ値 ５ｋＤａ、Sartorius Stedim Biotech、商品番号ＶＳ０２１１）を用いて脱塩処理し、１００ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いて洗浄する。
（ｖ）識別モジュール（ｂ）及び識別モジュール（ｃ）と、ＮＬＳタグ付きＤＤＢＰアダプタとに結合するモジュール（ａ）を含むｄｓＤＮＡ送達物結合送達構築物の合成
上記の実施例６（ｉｉｉ）のアリールヒドラジン修飾された標的化及び識別構築物を１００ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で、等モル量の上記の実施例６（ｉｖ）のアルデヒド修飾アダプタ構築物と混合し、室温で一晩インキュベートして、安定したビス−アリールヒドラゾン結合により２つの構成要素を連結させる。所望のｄｓＤＮＡ送達物結合送達構築物を、滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により１ｍＬ／分で溶出させるＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００調製用カラム（GE Healthcare、商品番号１７−１０６９−０１）上での分取ＳＥＣにより精製する。最終的なＱＣ分析をゲル電気泳動により行う。
（ｖｉ）ｄｓＤＮＡ送達物を有するｄｓＤＮＡ送達物結合送達構築物による充填
上記の実施例６（ｖ）のｄｓＤＮＡ送達物結合送達構築物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でｄｓＤＮＡ（例えば転写因子デコイ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。結合することができるｄｓＤＮＡの量は配列の長さによって変わり、滴定実験及びＰＡＧＥによる反応のモニタリングにより求めることができる。最終的なＤＡＲＥ（商標）構築物を分取ゲル上で又はイオン交換ＨＰＬＣにより精製する。
任意的な生分解性ジスルフィド結合を、第１級アミンを修飾するための芳香族アルデヒド含有エンティティとして、例えばＳ−ＳＳ−４ＦＢ（SoluLink、製品番号Ｓ−１０３７−０１０）を使用することにより、標的化又は識別構成要素とＤＤＢＰアダプタとを共有結合的に連結させるヒドラゾンリンカー断片に含有させることもできる。
実施例７：培養した哺乳動物細胞中でのｓｉＲＮＡ誘導性のサイレンシングを誘発するための本発明の標的化送達担体−送達物コンジュゲートの使用
（ｉ）タンパク質モジュール蛍光標識化
顕微鏡検査によりモジュール（ａ）単独、並びにモジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を伴うモジュール（ａ）の細胞内輸送（trafficking）をモニタリングするために、ペプチド又はタンパク質のモジュール（ａ）を蛍光色素で標識化することができる。例えば、リシンＢを、製造業者のプロトコルに従ってＣｙ３ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ｍｏｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ色素（GE Healthcare、ＰＡ２３０３１）で標識化する。簡潔にいうと、１ｍｇ／ｍＬの完全長リシンＢ−サブユニット（Vector Laboratories）を１ｍＭのＥＤＴＡを添加したＰＢＳに対して透析する。リシンＢ上の末端スルフヒドリル基は１００×モル過剰量のＴＣＥＰによる還元により利用可能となる。バイアルを窒素ガスでフラッシングし、蓋を閉じる。サンプルを十分に混合し、室温で１０分間インキュベートする。１ｍｇのタンパク質の標識に十分な一定量のＣｙ３ ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ色素を無水ジメチルホルムアミドに溶解する。バイアルを窒素ガスでフラッシングし、蓋を閉じる。サンプルを十分に混合し、室温で２時間インキュベートし、３０分毎に混合する。反応を４℃で一晩放置する。遊離色素からのリシンＢの分離をＰＢＳに対する多段階透析により行う。５５２ｎｍ及び２８０ｎｍでのサンプルの吸光を分光光度計で読み取り、最終的な色素／タンパク質又は色素／ペプチド比を算出する。
（ｉｉ）色素で標識化したモジュール（ａ）＋モジュール（ｂ）構築物の調製
リシンＢサブユニット（配列番号１２４、モジュール（ａ））をＣｙ３ ＮＨＳエステルで標識化し、それからジスルフィド結合により遊離Ｃ末端を有するＫＤＥＬペプチド（配列番号１６０）を含むモジュール（ｂ）と結合させる。簡潔にいうと、５０ｍＭの２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を含有するＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍＬの完全長リシンＢサブユニット（Vector Laboratories）０．５ｍＬを脱塩処理し、それからＶｉｖａｓｐｉｎ ２ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）限外濾過スピンカラム（分子量カットオフ値 ５ｋＤａ、Sartorius Stedim Biotech、商品番号ＶＳ０２１１）を用いて、５ｍＭのラクトースを含有する滅菌した１００ｍＭの四ホウ酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）にバッファーを交換し、それから空気中で撹拌し、二量体化することにより、続く反応においてチオールが潜在的にＣｙ３ ＮＨＳエステルと反応するのを防ぐ。それからリシンＢ二量体を、１０℃で３時間、２５μＬの純粋なＤＭＳＯ中に溶解した４モル当量（リシンＢモノマーに対して）のＣｙ３ ＮＨＳエステル（GE Healthcare、カタログ番号ＰＡ１３１０１）との反応により蛍光標識化する。それから該溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ ２ ＰＥＳ（５ｋＤａ 分子量カットオフ値）スピンカラム上で脱塩処理し、５ｍＭのラクトースと１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７）とを含有するＰＢＳに移す。Ｃｙ３で標識化したリシンＢ二量体を新たな５０ｍＭの２−ＭＥで還元し、室温で１時間インキュベートする。Ｃｙ３で標識化したリシンＢをＶｉｖａｓｐｉｎ ２ ＰＥＳ（５ｋＤａ 分子量カットオフ値）スピンカラムを用いて回収し、バッファーを５ｍＭのラクトースと１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７）とを含有する脱気ＰＢＳに交換し、それから標準的な固相Ｆｍｏｃペプチド化学により調製した１．１モル当量のモジュール（ｂ）ペプチド、Ｈ２Ｎ−Ｃｙｓ（ＮＰｙｓ）−（ＳＧ）３−ＫＤＥＬ−ＯＨとアルゴン雰囲気下で１０℃で一晩反応させる。色素で標識化したモジュール（ａ）＋モジュール（ｂ）構築物をゲル電気泳動により精製する。
（ｉｉｉ）培養細胞におけるＤＡＲＥ（商標）モジュールの細胞内識別のモニタリング
以下のモジュール及びコンジュゲートをモニタリングする：
上記の実施例７（ｉ）に記載のようにＣｙ３で蛍光標識化したリシンＢ（モジュール（ａ））、
上記の実施例７（ｉｉ）に記載のように調製し、かつＣｙ３で蛍光標識化したリシンＢ（モジュール（ａ））（Ｃ末端に結合したＫＤＥＬ配列（配列番号１６０、モジュール（ｂ））を含む）、
上記の実施例７（ｉｉ）に記載のようにＣｙ３で蛍光標識化したリシンＢ（モジュール（ａ））（実施例１（ｉ）及び実施例１（ｉｉ）に記載のようにモジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含む）、
実施例１に記載のようにｓｉＲＮＡ分子とコンジュゲートしたリシンＢ（モジュール（ａ））（モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含む）、ここでｓｉＲＮＡは、
特異的でＧＡＰＤＨを標的とする、又は
非特異的でホタルルシフェラーゼｆＬｕｃを含む：
センス：５’−CUUACgCUGAGuACUUCGAuu−３’（配列番号２５５）、及び
アンチセンス：５’−UCGAAGUACUCAgCGUAAgdTdG−３’（配列番号２５６）
（ここで小文字ｕ又はｇは２’−Ｏ−Ｍｅ−修飾ヌクレオチドを表し、アンチセンス鎖はその３’末端に５’−ホスフェートと２つのデオキシヌクレオチドとを有する（ｄＴｄＴ））である。
ＨｅＬａ細胞（ヒト）、Ｕ２−ＯＳ細胞（ヒト）及びＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ネズミ）を、それぞれ標準的な条件下で４ｍＭのグルタミン（Invitrogen）と１０％ウシ胎児血清（Invitrogen）とを添加したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて顕微鏡検査に好適なコラーゲンでコーティングした３８４ウェルプレート（Aurora Biotechnologies）上で成長させる。ＤＡＲＥ（商標）モジュール及びコンジュゲートの内部移行及び細胞内輸送をモニタリングするために、細胞を１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの範囲の蛍光標識化したモジュール／コンジュゲートで氷上で３０分間処理し、続いて冷培地で２回〜３回の洗浄工程を行った後、３０分から数時間（例えば０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１６時間）及び数日（例えば１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日）までの様々な期間、３７℃まで温める。代替的に細胞を、先の氷上での結合及び洗浄工程を行わず、指定期間、３７℃で同量のモジュール／コンジュゲートとインキュベートする。指定時間で、細胞をＰＢＳで５回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで４５分間固定する。細胞膜を、室温で最大３０分間、ＰＢＳ中での０．１％〜０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．０１％〜０．０２％のサポニンとのインキュベーションにより透過処理する。非特異的な結合部位を、３０分間、ＰＢＳ中での１０％ウシ胎児血清（Invitrogen）とのインキュベーションによりブロッキングする。この工程を任意で透過処理と組み合わせることができる。透過処理した細胞を以下で挙げられる一次抗体とインキュベートする。抗体のインキュベーションを４℃で最大１６時間、ブロッキングバッファー中で行う。それから細胞をＰＢＳで洗浄し、室温で２時間、一次抗体に指向性を有する適切に（好ましくはＦＩＴＣ又はＡｌｅｘａ ４８８により）蛍光標識化した標準二次抗体とインキュベートし、それからＰＢＳで洗浄する。モジュール／コンジュゲートの細胞内識別を以下の細胞内コンパートメントに対する細胞の同時染色により求める：
エンドソーム：
初期及び回収エンドソームコンパートメントを、モジュール及びコンジュゲートに関して記載されたものと同じ実験条件を用いて、１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬでの蛍光標識化したトランスフェリン（Invitrogen、Ａｌｅｘａ−６３３コンジュゲート、カタログ番号Ｔ−２３３６２）の同時内部移行により同定する。
後期エンドソームコンパートメントを、モジュール及びコンジュゲートに関して記載されたものと同じ実験条件を用いて、５μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬでの蛍光標識化したＬＤＬ粒子（ＬＤＬ−ＤｉＩ、bti inc. Stoughton MA, USA）の同時内部移行により同定する。
リソソーム：
リソソームを０．１μｇ／ｍＬ〜０．５μｇ／ｍＬでネズミＬＡＭＰ１（リソソーム関連膜タンパク質１）に対するラットモノクローナル抗体（１Ｄ４Ｂ、ABCAM, Cambridge UK）を用いた抗体染色により同定する。ヒトＬＡＭＰ１を１：５００でウサギポリクローナル抗体（Abcam、ａｂ２４１７０）を用いた染色により検出することができる。
トランスゴルジネットワーク：
トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）を１：１００〜１：５００の希釈率でＴＧＮ４６（４６ｋＤａのトランスゴルジネットワークタンパク質）に対するマウスモノクローナル抗体（２Ｆ７．１、ABCAM, Cambridge UK）を用いた抗体染色により同定する。
ゴルジ装置：
ゴルジ装置をマウス細胞において１：１００〜１：１０００の希釈率でマンノシダーゼＩＩに対する抗体（ａｂ１２２７７、ABCAM, Cambridge UK）を用いた抗体染色により同定する。ヒト細胞において、ゴルジ装置をおよそ１μｇ／ｍＬでＧｏｌｇｉｎ−９７に対するマウスモノクローナル抗体（Invitrogen、Ａ−２１２７０）を用いた染色により検出することができる。
小胞体（ＥＲ）：
ＥＲを１：５００の希釈率でカルレチクリンに対するニワトリポリクローナル抗体（ABCAM, Cambridge UK、ａｂ１４２３４）を用いた抗体染色により同定する。代替的に、ＥＲ出口部位を１：２００の希釈率でＤｅｒｌｉｎ−１に対するウサギポリクローナル抗体（Sigma、Ｄ４４４３）を用いることにより染色することができる。
カベオラ：
カベオラを１：５００の希釈率でＣａｖｅｏｌｉｎ−１に対するウサギモノクローナル抗体（New England Biolabs、Ｄ４６Ｇ３）を用いた抗体染色により同定する。代替的に、カベオラの内部移行を、蛍光標識化したＡＭＦ（alias GPI、ＧｅｎｅＩＤ：１００００８７４４）との同時内部移行により視覚化することができる。ＡＭＦ標識化をフルオレセイン−ＥＸ標識化キット（Invitrogen）を用いて行う。細胞を５０μｇ／ｍＬで標識化したＡＭＦとインキュベートする［６９、７０］。
細胞質
ｓｉＲＮＡ（化合物（ｄ））の細胞質への送達を、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端に結合した蛍光色素により顕微鏡検査で追跡する。好ましくは蛍光色素はＣｙ３又はＣｙ５である。
画像を自動顕微鏡（ＩｍａｇｅＥｘｐｒｅｓｓ、MolecularDevices）又はＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡（Zeiss）を用いて取得し、モジュール／コンジュゲート及び様々な細胞の小器官／コンパートメント間の共局在化を自動画像分析（Ｃｅｌｌｅｎｇｅｒ、Definiens）により求める。
代替的に、多変数（multiparametric）アプローチが、本発明のコンジュゲート及び／又はモジュール及び／又は化合物（ｄ）の共局在化を検出するのに用いられ、３つの異なる分析技法を伴う。共局在化を同定するための基礎的な定性的アプローチに加えて、２つの統計的方法がDefiniens Enterprise社の画像分析ソフトウェアを用いて共局在化を定量化するのに利用される。
共局在化の定性的分析のために、グレースケールをカラーに変換するため（灰色の色合いｘが色ｙと等しい）、捕捉チャネルに、画像分析ソフトウェアを備えた適切なカラー・ルックアップ・テーブルを用いて、擬似的に色を付ける。Definiensのシステムは例えば、グレースケール画像を赤色、緑色、青色、黄色、紫色又は青緑色に変換することができる。このためピクセルを赤色及び緑色で同時染色する場合、黄色に色が付いたピクセルが共局在化を示す。
また強度相関係数ベースの技法を用いた定量的な統計分析を、２つのアプローチ、ピアソン係数の改良版であるマンデル係数及びLiのアプローチを用いて行う。係数の算出の前に、初めに蛍光強度閾値を用いてバックグラウンドを排除し、それにより対象の領域を同定する。このバックグラウンド閾値は各アッセイに対して手動で設定する。それから各画像において残りのピクセル全てに対してマンデル係数（ｍ１及びｍ２）を算出する：
Figure 2012533587
 （式中、Ｓ１ｉ，ｃｏｌｏｃはチャネル２と共局在化するチャネル１の強度の合計であり、Ｓ１ｉはチャネル１の強度の合計である。同様に、Ｓ２ｉ，ｃｏｌｏｃはチャネル１と共局在化するチャネル２の強度の合計であり、Ｓ２ｉはチャネル２の強度の合計である。算出した際、マンデル係数が１であると完全な共局在化を示し、係数が０であると完全な排除を示す）。
これに対して、Liのアプローチにより、Ｎ個のピクセルのランダム染色強度の２つのセットに関して、それらの差の積和は０へと近づくと推測される：
Figure 2012533587
 （式中、ａ又はｂはそれぞれ個々のピクセルの強度であるＮ個のＡｉ又はＢｉの値の平均分布強度である）。そのため各画像での各ピクセルに対する強度のカウント数を０〜１の値を与えるように正規化し、各ピクセルに対する（Ａｉ−ａ）（Ｂｉ−ｂ）の積（これは−１〜＋１の間で変動する）に対してグラフにプロットする。これらのグラフでは、ｘ＝０の右側のピクセルが共局在化を示し、ｘ＝０の左側のピクセルが完全な排除を示す。
上記の３つの方法全てを用いた正の結果が共局在化の非常に良好な評価をもたらす［７１〜７４］。
（ｉｖ）送達担体モジュールの分解に関する試験
細胞を１日〜７日の範囲の様々な期間、上記の実施例７（ｉｉｉ）に記載の一連の滴定した（titrations）モジュール／コンジュゲートで処理する。指定時間（１時間、８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日）、細胞を溶解し、同量の総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離する。送達担体モジュールの分解をウェスタンブロッティング及びリシンＢに指向性を有する抗体（ABCAM（Cambridge, UK）から入手、ａｂ４８４１５、１：１００〜１：１０００の希釈率で使用する）によるプロービングによってモニタリングする。
（ｖ）ＤＡＲＥ（商標）送達の機能的試験
細胞を１日〜７日の範囲の様々な期間、上記の実施例７（ｉｉｉ）に記載の一連の滴定したモジュール／コンジュゲートで処理する。比較のために、細胞を等モル量の標的化ｓｉＲＮＡ及び非標的化対照で、市販のトランスフェクション試薬、例えばＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（ThermoFisher）又はＲＮＡｉＭａｘ（Invitrogen）を用いてトランスフェクトする。指示期間（１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日）後、細胞を溶解し、製造業者の推奨に従って、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）（これは遺伝子特異的な有効なＴａｑＭａｎプローブ（Applied Biosystems）又は遺伝子特異的なプライマーを用いてＳＤＳ７９００ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Applied Biosystems）で行う）及びＳｙＢｒ−Ｇｒｅｅｎ法により標的遺伝子のサイレンシングに関して試験する。遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子（例えば１８ＳリボソームＲＮＡ、ＲＰＬ１３Ａ、又は必要に応じてハウスキーピング遺伝子の特異的に選択されたセット［７５］）に対して正規化する。
（ｖｉ）ＤＡＲＥ（商標）送達により引き起こされるインターフェロン応答に関する試験
インターフェロン経路の活性化を、上記の実施例７（ｖ）に記載のようにｑＲＴ−ＰＣＲにより非処理細胞と比較して処理細胞においてＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＳＴＡＴ１、ＩＦＮＢ１及びＩＦＩＴ２の発現レベルを求めることによりモニタリングする。ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＳＴＡＴ１、ＩＦＮ−β及びＩＦＩＴ２のｑＲＴ−ＰＣＲによりインターフェロン応答を検出するのに使用されるプライマー配列には、市販のヒトＴａｑＭａｎプローブ：ＯＡＳ１（Ｈｓ００９７３６３７＿ｍ１）、ＯＡＳ２（Ｈｓ００９４２６４３＿ｍ１）、ＳＴＡＴ１（Ｈｓ０１０１４００２＿ｍ１）、ＩＦＮ−β（Ｈｓ００２７７１８８＿ｓ１）、ＩＦＩＴ１（Ｈｓ０１９１１４５２＿ｓ１）及びＩＦＩＴ２（Ｈｓ００５３３６６５＿ｍ１）、並びにマウスＴａｑＭａｎプローブ：ＯＡＳ１（Ｍｍ００４４９２９７＿ｍ１）、ＯＡＳ２（Ｍｍ００４６０９６１＿ｍ１）、ＳＴＡＴ１（Ｍｍ００４３９５１８＿ｍ１）、ＩＦＮ−β（Ｍｍ００４３９５５２＿ｓ１）、ＩＦＩＴ１（Ｍｍ００５１５１５３＿ｍ１）及びＩＦＩＴ２（Ｍｍ００４９２６０６＿ｍ１）（Applied Biosystems/LifeTechnologies, Inc.）が含まれる。
本実施例は本発明のリシンＢ（モジュール（ａ））標的化コンジュゲートの調製、使用及び特性化を説明するが、本実施例の教示は本発明のいずれのコンジュゲートにも適用可能である。したがって当業者は過度の実験を行うことなく実施例の教示をどのように修正すべきか認識しているであろう。
実施例８：化合物（ｄ）として標的ｓｉＲＮＡを有するが、細胞の標的化／取り込みモジュール（ａ）を有しないＤＡＲＥ（商標）送達構築物の合成
（ｉ）モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含む結合分子の合成
（モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）＋リンカー）ペプチドＨ２Ｎ−（ＳＧ）３−Ｃ−（ＳＧ）３−ＮＡＳＳＳＲＳＧＬＤＤＩＮＰＴＶＬＬＫＡＫＤＥＬ−ＯＨ（「モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）」は配列番号２４４を含む）を、標準的な固相Ｆｍｏｃペプチド化学により合成し、標準的なやり方で脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより純度が９５％を超えるまで精製する。ペプチドのＱＣをアミノ酸分析、質量分析及び分析逆相ＨＰＬＣにより行う。精製ペプチドの遊離チオールの活性化を、ピリジンにおける１．５モル当量の２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）（ＤＴＮＰ、Sigma-Aldrich、製品番号１５８１９４）との反応により行い、Ｈ２Ｎ−（ＳＧ）３−Ｃ（ｐＮｐｙｓ）−（ＳＧ）３−ＮＡＳＳＳＲＳＧＬＤＤＩＮＰＴＶＬＬＫＡＫＤＥＬ−ＯＨを得て、これを分取逆相ＨＰＬＣにより純度が９５％を超えるまで精製し、上述のように分析する。
（ｉｉ）送達物ｓｉＲＮＡ（化合物（ｄ））の調製
ＴｕｓｃｈｌスタイルのｓｉＲＮＡ標的化ＧＡＰＤＨを、センス鎖の５’末端を５’−（Ｃ６−ＳＳ−Ｃ６）−ホスフェート−Ｃｙ３エンティティで修飾したことを除いて、実施例１（ｉｉｉ）に記載のように合成、精製及び分析する。
（ｉｉｉ）（モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）＋モジュール（ｄ））構築物（（ｄ）がｓｉＲＮＡである）の調製
上記の実施例８（ｉｉ）の送達物ｓｉＲＮＡを３７℃で１時間、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中で１００ｍＭのＤＴＴで処理し、ジスルフィド結合を切断する。それからｓｉＲＮＡを含有する遊離チオールを、溶出液として１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７）を含有する脱気ＰＢＳを用いて、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２ポリエーテルスルホン（３ｋＤａ 分子量カットオフ値）限外濾過スピンカラム（Sartorius Stedim Biotech、商品番号ＶＳ０２９２）で脱塩処理する。続いてチオール−ｉＲＮＡをアルゴン下で一晩、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７）を含有するＰＢＳ中で上記の実施例８（ｉ）のモジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含有する１．１モル当量の結合分子と反応させる。所望のモジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）＋モジュール（ｄ）構築物を逆相ＨＰＬＣにより精製する。生成物をＥＳＭＳ、ネイティブゲル電気泳動及び分析ＨＰＬＣにより分析する。更なる分析を、ＤＴＴ切断を用いて行い、２つの断片、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含む分子と、ＨＳ−（ＣＨ２）６−ＯＰ（Ｏ２）−Ｏ−Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡとが得られる（それぞれＭＳにより別々に同定することができる）。
この具体例はＥＲＡＤ標的化モジュール（ｃ）としてのＣＯＸ２ペプチド、ＥＲ転位モジュール（ｂ）としてのＡＫＤＥＬペプチド（配列番号１６１）の使用、及びジスルフィド結合によるｓｉＲＮＡとシステイン残基との結合を説明しているが、当業者は、他のペプチド（複数も可）を含み、異なる結合及び／又は異なる構成を用いるコンジュゲートを過度な実験（expeirmentation）を行うことなく想定し、作製することができる。このコンジュゲートも本発明の実施形態である。例えば、（ＳＧ）３（配列番号７）をｄＰＥＧ１２に置き換えることができ、ｓｉＲＮＡをＤｐｒＡｏａ残基上でアミノオキシ基を用いてオキシム結合により（すなわち、本実施例でのシステインの代わりに）結合することができる。
実施例９：ＤＡＲＥ（商標）送達コンジュゲートの薬効
本発明のＤＡＲＥ（商標）送達コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価するため、全身適用後に薬効を試験する。本発明のＤＡＲＥ（商標）送達構築物を、マウスの尾静脈に静脈内（又は代替的に腹腔内）投与する。生体分布を２つの異なるマウスモデルで求める。１つのモデルでは、内因的に発現した遺伝子（ＧＡＰＤＨ）を標的とし、第２のモデルでは、外から導入されたレポーター導入遺伝子（ホタルルシフェラーゼ、ｆＬｕｃ）を標的とする。また非サイレンシングｓｉＲＮＡコンジュゲート及び非標的化（すなわちモジュール（ａ）がない）コンジュゲートを対照として調製する。
（ｉ）コンジュゲートの合成
全てのコンジュゲートを実施例１及び実施例６に記載のように調製し、好ましくは以下のｓｉＲＮＡ配列を用いる：
ＧＡＰＤＨ：
センス：配列番号２４８、及び
アンチセンス：配列番号２４９
ｆＬｕｃ：
センス：配列番号２５５、及び
アンチセンス：配列番号２５６
非サイレンシング対照（インフルエンザウイルスの核タンパク質であるＮＰ番号２を標的とする）：
センス：5'-GGAuCUUAUUUCUuCGGAGuu-3'（配列番号２５７）、及び
アンチセンス：5'-CUCCGAAGAAAuAAGAuCCdTdT-3'（配列番号２５８）（ここで、「ｕ」及び「ｇ」は２’−Ｏ−Ｍｅ−修飾ヌクレオチドを表し、全てのアンチセンス鎖が５’−ホスフェートを有する）。
（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｖｏ試験
ＧＡＰＤＨ標的化コンジュゲートをＢａｌｂ／ｃマウス（JacksonLaboratories（www.jax.org）、CharlesRiver（www.criver.com）、Taconic（www.taconic.com）又はHarlan（www.harlan.com）から入手可能）においてＧＡＰＤＨ特異的なノックダウンに関して試験するのに対し、ルシフェラーゼノックダウンを、ホタルルシフェラーゼ（Promega、ｐＧＬ３）を遺伝子導入し、ほぼ全ての組織で高いレベルの酵素を発現するマウス株で評価する［７６］。性別を適合させた６週齢〜１０週齢のマウスを使用する。
例えば１００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜２０００ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲を用いて、ＤＡＲＥ（商標）送達構築物の用量の漸増を行う。それからＤＡＲＥ（商標）送達構築物の用量を、容量１００μＬ〜３００μＬのＰＢＳ（又は他の生理学的バッファー）に注入する。本実施例内に記載されるように、致死を回避しつつもｆＬｕｃの最大のノックダウンが達成される用量を求める。この用量は続いて全ての他の全身適用に使用するのが好ましい。
各実験は、ｎ＝１０（マウス／群）である以下の群からなる。
１．実施例１に記載のように調製された、化合物（ｄ）として標的ｓｉＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ又はルシフェラーゼに指向性を有し、使用されるｉｎ ｖｉｖｏモデルに対応する）を有するＤＡＲＥ（商標）送達構築物、
２．実施例１に記載のように調製された、化合物（ｄ）として非標的ｓｉＲＮＡを有するＤＡＲＥ（商標）送達構築物、
３．上記の実施例８に記載のように調製された、化合物（ｄ）として標的ｓｉＲＮＡを有するが、細胞の標的化／取り込みモジュール（ａ）を有しないＤＡＲＥ（商標）送達構築物。
マウスをＤＡＲＥ（商標）送達構築物の用量注射の２４時間後〜７２時間後に安楽死させ、対象の組織（例えば脳、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、卵巣、子宮、乳腺、膵臓、リンパ節、骨、及び任意の他の対象の組織）をサンプリングし、下記のように分析する。
ルシフェラーゼ測定：
ルシフェラーゼタンパク質測定のために、組織溶解／混合（lyser/mixer）ミル（Qiagen）、金属ビーズ及びルシフェラーゼ細胞培養物溶解試薬（例えばPromega、ＰＲ−Ｅ１５３１）を用いて組織をホモジナイズし、それから卓上遠心分離機において最大速度（約１３０００ｇ）で５分間遠心分離した後、上清を新しい反応管に移す。上清を−８０℃で保存するか、又はすぐに使用して、製造業者の取扱説明書に従ってルシフェラーゼアッセイシステム（例えばPromega）を用いて照度計でルシフェラーゼタンパク質レベルを測定する。
ＲＮＡ単離：
組織サンプルを、続くｑＲＴ−ＰＣＲ及び５’−ＲＡＣＥ分析のためにＲＮＡｌａｔｅｒ（Qiagen）で保存するか、又は続くルシフェラーゼ及び組織タンパク質の定量化（タンパク質１ｍｇ当たりのルシフェラーゼ活性について正規化するため）のために液体窒素で凍結する。安楽死の後、対象の組織／器官を取り出し、すぐに液体窒素で凍結する。ＲＮＡを製造業者の取扱説明書に従ってＲＮｅａｓｙキット（Qiagen）を用いて組織サンプルから単離し、ＲＮＡの質を、製造業者の取扱説明書に従ってＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏキット（Agilent）を用いてＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより求める。
５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ：
５’ＲＡＣＥを、ＲＮＡｉ特異的なＲＮＡ分解産物を検出するために行う。検出は以前に記載されたように修正ＧｅｎｅＲａｃｅｒ ＰＣＲ（Invitrogen, Calsbad, CA）により行う［７７〜７９］。簡潔にいうと、予め設計されたキット構成要素（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）ＲＮＡ Ｏｌｉｇｏ）である４４ｍｅｒ ＲＮＡ−オリゴを、５’末端にキャップのない（uncapped）分解されたＲＮＡにライゲートした後、逆転写を行う。この後に、ｓｉＲＮＡ認識部位の遺伝子特異的な３’プライマーと、４４ｍｅｒ ＲＮＡ−Ｏｌｉｇｏ配列と結合する相補的プライマーとからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う。
ＧＡＰＤＨ（ヒト及びマウス）に関して、配列は以下の通りである：
ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ標的配列：5'-GGTCATCCATGACAACTTT-3'（配列番号２５９）、
ＧｅｎｅＲａｃｅｒ ５’プライマー：5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'（配列番号２６０）、
ＧＡＰＤＨ ３’プライマー：5'-ACGCCTGCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3'（配列番号２６１）、
ＧｅｎｅＲａｃｅｒ ５’ネステッドプライマー：5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3'（配列番号２６２）、及び
ＧＡＰＤＨ ３’ネステッドプライマー：5'-AGGCCATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3'（配列番号２６３）。
それから増幅ＤＮＡのアガロースゲル分析及びシークエンシングを用いて、対象の遺伝子のＲＮＡｉ特異的な分解産物として得られるＤＮＡ断片を同定する。分解産物があまり豊富ではない場合、一次ＰＣＲの後に、ネステッドＰＣＲを行う。
ＲＴ−ｑＰＣＲ：
ＲＴ−ｑＰＣＲを、製造業者の推奨に従って遺伝子特異的な有効なＴａｑＭａｎプローブ（Applied Biosystems）を用いてＳＤＳ７９００ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（AppliedBiosystems）で行う。遺伝子発現を、ｉｎ ｖｉｖｏでの自然の発現変化に対して正規化するために、マウス組織における遺伝子発現分析に関して選択されたハウスキーピング遺伝子（例えば、１８Ｓ ｒＲＮＡ、ＲＰＬＰＯ、Ｈｍｂｓ、Ｐｐｉｂ及び／又はＰｇｋ１）のプールに対して正規化する［７５］。
ＧＡＰＤＨ ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法：
ＧＡＰＤＨタンパク質の発現を、標準的なＧＡＰＤＨ特異的なＥＬＩＳＡアッセイ（例えばBIOO Scientific製）を用いて求める。組織をＲＩＰＡ（放射免疫沈降アッセイ、SigmaAldrich）バッファーの添加により溶解させ、総タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（ビシンコニン酸、Perbio）により測定した後、製造業者の取扱説明書に従ってＥＬＩＳＡによる分析、又は標準的な手順に従ってウェスタンブロット分析を行う。
ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：
ｉｎ ｓｉｔｕでのＲＮＡ検出を、プロテイナーゼＫ消化及び無水酢酸の前処理を含む確立された手順に従って行う。抽出後２４時間〜３０時間、組織サンプルを４％のＰＦＡに固定し、その後２４時間〜３０時間、３０％スクロースに浸漬させる。それからこれをイソペンタンで−７０℃まで冷却させ、５μｍ厚の切片を低温槽−ミクロトームで切り出す。ＧＡＰＤＨ特異的なジゴキシゲニンで標識化したプローブを、製造業者の推奨に従って、以前に記載されたように、ＤＩＧ ＲＮＡ標識化キット（Roche Applied Science）を用いてＳＰ６又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによりＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡを含有するプラスミドから調製する［８０］。該プローブを６５℃で一晩、加湿チャンバにおいて組織切片上でインキュベートする。ＤＩＧで標識化したプローブをアルカリホスファターゼ（ＡＰ、Roche）とコンジュゲートしたヒツジ抗ＤＩＧ抗体を用いて検出する。それから切片をＢＭパープル（Roche）又は別のＡＰ基質の添加により発色させる。
免疫組織化学検査及び組織学的検査：
蛍光（例えばＣｙ３）標識化したＤＡＲＥ（商標）送達構築物の分布分析及び免疫組織化学検査による標的タンパク質の発現の分析のために、組織を２４時間、ＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒド、０．０５％のグルタルアルデヒドで固定し、それから３６時間、３０％のスクロースに浸漬させる。それから保存のために組織を−８０℃で凍結し、７μｍの切片を−２０℃で切り出し、スライド上に置く。顕微鏡分析を上記の実施例７に記載のように行う。
抗体染色及び組織学的検査のために、組織を１０％の緩衝ホルマリンで一晩固定した後、パラフィン包埋及びミクロトームでの切片化を行う。ＧＡＰＤＨタンパク質の発現を、ＧＡＰＤＨ特異的抗体（ウサギｍＡＢ １４Ｃ１０（Cell Signaling）等）を用いて検出する。クエン酸バッファーを用いるマイクロ波による（microwave assisted）抗原回復の後、抗原検出を製造業者の推奨に従って行う。一次抗体の検出を抗ウサギＨＲＰ又はフルオロフォアで標識化した二次抗体（Abcam）を用いて行った後、標準的なプロトコルを用いて、又はフルオロフォアで標識化した二次抗体の場合、上記の実施例７に記載のように、顕微鏡検査分析を行う。
実施例１０：ＤＡＲＥ（商標）送達構築物の薬物動態
経時的なノックダウン効果を求めるために、凝血因子である第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）を本発明によるＤＡＲＥ（商標）送達構築物を用いて肝臓で標的化する。ＦＶＩＩに対して公開されたｓｉＲＮＡ配列［８１］又はこれまでにＦＶＩＩに対してｉｎ ｖｉｔｒｏで最適化したｓｉＲＮＡを、ＤＡＲＥ（商標）送達構築物における化合物（ｄ）として使用し、上記の実施例に記載のように作製する。得られるＤＡＲＥ（商標）−ＦＶＩＩコンジュゲートの最適なノックダウン用量を、実施例９に記載のような実験において肝臓で求める。それからＤＡＲＥ（商標）−ＦＶＩＩコンジュゲートを、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてこの最適なノックダウン用量で試験する。
全ての手順を、正常なＣ５７ＢＬ／６マウス又はＢａｌｂ／ｃマウス（性別及び年齢を適合させた６週齢〜１０週齢のもの、Charles Riverから入手）で行う。ＤＡＲＥ（商標）−ＦＶＩＩの最適なノックダウン用量を、尾静脈注射によりマウスに静脈内投与する。対照マウスは、対照ＤＡＲＥ（商標）構築物がＦＶＩＩに対するｓｉＲＮＡの代わりに化合物（ｄ）として対照の非標的化ｓｉＲＮＡを含むこと以外は、ＤＡＲＥ（商標）−ＦＶＩＩと同じＤＡＲＥ（商標）送達構築物を尾静脈に注射する。ＤＡＲＥ（商標）−ＦＶＩＩで処理したマウス及び対照処理マウスの後眼窩から繰返し、１週間に２回、注射後４０日まで血液サンプルを採取し、ＦＶＩＩタンパク質の血清レベルを活性ベースの発色アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ、Aniara, Mason, OH）［８１］を用いて測定して、ＦＶＩＩタンパク質レベルが対照マウスのもの未満にノックダウンされた状態である時間の長さを求める。ＤＡＲＥ（商標）−ＦＶＩＩで処理したマウスの循環ＦＶＩＩタンパク質レベルが対照処理マウスの循環ＦＶＩＩタンパク質レベル（すなわち、ベースラインのＦＶＩＩレベル）に達するのにかかる時間の長さに基づき、反復投与時間を算出することができる。例えば、ＤＡＲＥ（商標）−ＦＶＩＩで処理したマウスの循環ＦＶＩＩタンパク質レベルが注射の３０日後にベースラインのＦＶＩＩレベルに達した場合、ＤＡＲＥ（商標）−ＦＶＩＩの用量の反復注射液を３０日毎に作製し、後眼窩の血液サンプルを１週間に２回取得し、分析する。循環ＦＶＩＩレベルがＤＡＲＥ（商標）−ＦＶＩＩの２回目及び３回目の注射の後に同様に増減する場合、これはＤＡＲＥ（商標）−ＦＶＩＩに対する強い免疫応答が存在しないことを示す。
実施例１１：ＤＡＲＥ（商標）送達コンジュゲートの免疫刺激効果に関する試験
ｓｉＲＮＡ分子は、ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ３、ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８との相互作用により免疫系を刺激することが分かっている［８２］。ＴＬＲ７／８に対する免疫応答はｓｉＲＮＡを化学修飾することにより克服するか、又は少なくとも最小限に抑えることができる。このような相互作用により生じる免疫応答を、ヒトＰＢＭＣ（末梢血単球）で記載のように調べることができる［８３、８４］。簡潔にいうと、軟膜はヒトドナーの血液から得る。ＰＢＭＣをフィコール密度遠心分離により軟膜から精製する。それから精製ＰＢＭＣを、２×１０５細胞／ウェル又は様々なこれまでに最適化された密度で９６ウェルプレートに播種する。それから細胞を３７℃でｓｉＲＮＡと共にインキュベートし、これがトランスフェクション試薬と複合体を形成するか、又はトランスフェクションを可能にする他の分子、すなわちＤＡＲＥ（商標）送達コンジュゲート（最終濃度：最大１μＭ）と結び付く。様々な時点で（例えばトランスフェクションの４時間及び２４時間後）、上清を取り出し、ＴＮＦα及び／又はＩＦＮα濃度をＥＬＩＳＡにより求め、非処理ＰＢＭＣと比較する。ＥＬＩＳＡを、市販のＥＬＩＳＡキット（ＴＮＦα Ｅｌｉｓａ Ｊｕｍｂｏキット、番号ＩＭ１１１２１、Beckman Coulter、及びヒトＩＦＮａ ＥＬＩＳＡ（多種）、番号３１６９０１６、Thermo Fisher Scientific）を用いて行う。
ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、先天性免疫応答の活性化により引き起こされる炎症応答を媒介する［８２］。ＴＬＲ８（ヒト細胞における非特異的なｓｉＲＮＡ免疫効果の重要な媒介因子である）は、マウスでは十分に機能的ではない［８３］。結果として、ＴＬＲ８に関連する効果はマウス研究とは関連がない。可能性のあるＴＬＲ８媒介性の効果を評価するために、ヒトＰＢＭＣを上記のように使用することができる。これらの細胞は、オリゴヌクレオチドがＴＬＲ８のみを刺激し、ＴＬＲ７を刺激しない場合であっても、ＴＮＦαを産生するであろう［８３］。このため、ヒトＰＢＭＣをＤＡＲＥ（商標）構築物（最大１μＭの最終濃度）と共にインキュベートした後でＴＮＦα ＥＬＩＳＡを行うことが、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８媒介性の応答を評価するのに十分であろう。
また、免疫応答は、ｓｉＲＮＡを輸送するＤＡＲＥ（商標）モジュール（複数も可）によっても生じ得る。即時型の免疫応答では、ｓｉＲＮＡに関して上で記載のものと同じアッセイがこれらの特性化に十分であろう。例えば抗体により媒介される遅延型の免疫応答が起こる場合、これは、動物実験においておよそ３０日後に２回目のＤＡＲＥ（商標）コンジュゲートが投与され、ノックダウン効果が顕著に低減すると、検出される（実施例９及び実施例１０の（re:）ｉｎ ｖｉｖｏノックダウンを参照されたい）。
上記、及び本発明のＤＡＲＥ（商標）送達コンジュゲートで観察される効果がＤＡＲＥ（商標）−送達コンジュゲートのｓｉＲＮＡ（化合物（ｄ））により配列特異的に媒介され、ｓｉＲＮＡ又はＤＡＲＥ（商標）モジュール若しくは送達コンジュゲートに対する標的非関連の反応によっては媒介されないことを更に確認することに加えて、関連するＴＬＲ３受容体及びＴＬＲ７受容体のノックアウト（ｋ．ｏ．）マウスを使用することができる（ＴＬＲ３ ｋ．ｏ．マウス：Ｂ６；１２９Ｓ１−Ｔｌｒ３ｔｍ１Ｆｌｖ／Ｊ、http://jaxmice.jax.org/strain/005217.html及びＴＬＲ７ ｋ．ｏ．マウス：Ｂ６．１２９Ｓ１−Ｔｌｒ７ｔｍ１Ｆｌｖ／Ｊ、http://jaxmice.jax.org/strain/008380.html（両方ともJackson Laboratories））。ＤＡＲＥ（商標）送達コンジュゲートのｓｉＲＮＡによる特異的な効果は、同じ株のＴＬＲに関してはｗｔマウスとｋ．ｏ．マウスとで同じである（Ｃ５７ＢＬ／６は、Jackson Laboratories（www.jax.org）、Charles River（www.criver.com）、Taconic（www.taconic.com）又はHarlan（www.harlan.com）から入手可能な上記のｋ．ｏ．株に対応するｗｔ株である）。全ての実験で、性別及び年齢を適合させたマウス（６週齢〜１０週齢）を使用する。これらの動物実験は、ｓｉＲＮＡ（化合物（ｄ））に起因する効果と、免疫系により生じ得る効果又は抗血管形成効果とを区別するのを助ける。
特に、ＧＡＰＤＨ（又は別の内因性遺伝子）を、本発明によるＤＡＲＥ（商標）送達構築物のｓｉＲＮＡ（化合物（ｄ））で標的化する。上記のｋ．ｏ．マウス又は細胞を用いて、ＴＬＲにより媒介される効果を評価する。マウス又は細胞実験結果を、ＧＡＰＤＨ発現に関してｑＲＴ−ＰＣＲ、５’ＲＡＣＥ、ウェスタンブロット法及び／又は酵素アッセイ（例えばInvitrogen/Life TechnologiesのＫＤａｌｅｒｔ（商標） ＧＡＰＤＨアッセイキット）により上記の実施例に記載のように分析する。
本発明の異なるバージョンのモジュールＤＡＲＥ（商標）コンジュゲートを実施例１に従って調製し、マウスへの尾静脈注射により全身に送達する。各実験群は１０匹の動物からなる。各実験には以下の群が含まれる：
１．化合物（ｄ）として非標的ｓｉＲＮＡを有するＤＡＲＥ（商標）送達構築物
２．化合物（ｄ）として標的ｓｉＲＮＡを有するＤＡＲＥ（商標）送達構築物
３．ｓｉＲＮＡを有しない（すなわち化合物（ｄ）がない）ＤＡＲＥ（商標）送達構築物
４．ネイキッド標的ｓｉＲＮＡ（すなわち化合物（ｄ）のみ）。
上記の実施例９で求められるような最適なＤＡＲＥ（商標）用量を、本発明のＤＡＲＥ（商標）構築物の観察される効果のいずれもがＴＬＲにより媒介されるかを判断するために本明細書で用いる。マウス（又は細胞）は、ｓｉＲＮＡ媒介性の効果が生じることが期待される時間（when）に応じて２日間〜６０日間維持される。ＧＡＰＤＨを用いる場合、マウスを４８時間後に分析し、その時点でマウスを安楽死させ、組織サンプルを主要器官（すなわち肝臓、脾臓、腎臓、脳、心臓）から回収する。腫瘍モデルを使用する場合、マウスを最大６０日間観察する。各時点で、動物を安楽死させ、対象の組織及び腫瘍サンプルを回収する。回収した組織及び腫瘍サンプルを処理し、上記の実施例９に記載のように、ｑＲＴ−ＰＣＲ、５’ＲＡＣＥ及びウェスタンブロット分析により、標的化遺伝子（すなわちＧＡＰＤＨ）のノックダウン発現に関して分析する。
実施例１２：ＤＡＲＥ（商標）送達コンジュゲートの毒性の分析
本発明のＤＡＲＥ（商標）送達コンジュゲートの潜在的な毒性を、注射の４８時間後まで繰り返して肝臓酵素及びサイトカインの血清レベルを測定することにより評価する。化合物（ｄ）として非標的化ｓｉＲＮＡを有するＤＡＲＥ（商標）構築物、及びｓｉＲＮＡを有しない（すなわち化合物（ｄ）がない）ＤＡＲＥ（商標）構築物をＰＢＳ注入に対して比較する。ＤＡＲＥ（商標）送達構築物を上記の実施例９に記載のように尾静脈注射により注入する。血液サンプルを注射後４８時間まで繰り返してマウスの後眼窩から回収し、血清を得る。マウスサイトカインＴＮＦ−α及びＩＬ−６の血清レベルを、製造業者の取扱説明書（R&D Systems, Minneapolis, MN）による試薬を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定する。マウスＩＦＮ−αの血清レベルを、製造業者の取扱説明書（PBL Biomedical, Piscataway, NJ）に従ってサンドイッチＥＬＩＳＡキットを使用することにより測定する。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清レベルを、獣医診断研究所で自動化されたシステムを用いることにより測定する。肝臓酵素及び／又はサイトカインの任意の統計的に有意な増大が検出される場合、コンジュゲートの毒物学的影響を完全に求めるために、更なる研究を実施するものとする。
実施例１３：ｉｎ ｖｉｖｏでの化合物（ｄ）としてＶＥＧＦ特異的なｓｉＲＮＡを有するＤＡＲＥ（商標）送達コンジュゲートの調製及び投与：腫瘍学の異種移植モデル
腫瘍モデルにおいて本発明のＤＡＲＥ（商標）送達構築物の有効性を実証するために、十分に確立された異種移植腫瘍モデルを用いて、腫瘍関連標的のノックダウンを研究する。
本実施例では、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）の発現をノックダウンし、腫瘍の血管新生及び成長に対するこのノックダウンの効果を評価する［８５〜９２］。実験は性別及び年齢を適合させた（６週齢〜１０週齢）免疫インコンピテント（immunoincompetent）マウス（好ましくは胸腺欠損ヌードマウス、Harlan-Winkelmann）の２つの独立した腫瘍モデルにおいて行う。ＰＣ−３前立腺腺癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３５）を、血清無含有Ｆ−１２Ｋ培地（Invitrogen）０．１ｍＬ中３×１０６個でマウスの背側（dorsalflank）部に皮下注射する。腫瘍がはっきりと確立され、体積が５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３に達した後、対照ｓｉＲＮＡ及びＤＡＲＥ（商標）送達コンジュゲート製剤を、独立した実験において尾静脈注射により全身に又は腫瘍内に送達する。
以下の構築物及びコンジュゲートを実施例１及び実施例５の教示に従って調製する。各実験は５つの群（ｎ＝１４（マウス／群））からなる：
１．ｓｉＲＮＡを有しない（すなわち化合物（ｄ）がない）ＤＡＲＥ（商標）送達構築物
２．5'-GGAGUACCCUGAUGAGAUCdTdT-3'（配列番号２６４）を含むセンス鎖と、5'-GAUCUCAUCAGGGUACUCCdTdT-3'（配列番号２６５）を含むアンチセンス鎖とを含むネイキッドＶＥＧＦ標的ｓｉＲＮＡ配列
３．配列番号２５５を含むセンス鎖と、配列番号２５６を含むアンチセンス鎖とを含むネイキッド非標的（ルシフェラーゼ）ｓｉＲＮＡ
４．配列番号２６４を含むセンス鎖と、配列番号２６５を含むアンチセンス鎖とを含むＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡを含む、化合物（ｄ）を有するＤＡＲＥ（商標）送達構築物
５．配列番号２５７を含むセンス鎖と、配列番号２５８を含むアンチセンス鎖とを含む非標的ｓｉＲＮＡを含む、化合物（ｄ）を有するＤＡＲＥ（商標）送達構築物
ＶＥＧＦを標的とするｓｉＲＮＡ配列を公開配列に基づき選択する［９２、９３］。用量は、全身送達では１００μＬ中１００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜２０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、及び局所腫瘍内送達では２５μＬ中０．０５ｎｍｏｌ〜５ｎｍｏｌの範囲である。
以前に報告されたように血管新生に対する免疫原性効果を最小限に抑えるために［９４］、２’−Ｏ−Ｍｅヌクレオシドのアンチセンス鎖への選択的導入を含む化学修飾ｓｉＲＮＡ配列を使用する［９５、９６］。ＶＥＧＦ標的化ｓｉＲＮＡの免疫刺激効果を適合させるために、非標的化ｓｉＲＮＡ対照をこのシステムに最適化させる［９７］。ｓｉＲＮＡの免疫刺激能を評価するために、マウス血清及び標的組織由来のサイトカイン及びサイトカインにより誘起されるｍＲＮＡのパネルをそれぞれ測定する。免疫マーカーとしては、インターフェロン−α（ＩＦＮα）、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）、ＩＬ−１２及びインターフェロン誘導性のテトラトリコペプチド反復タンパク質１（ＩＦＩＴ−Ｉ又はｐ５６）ｍＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない［９８、９９］。マウス血清を、ｓｉＲＮＡ注射後１時間〜４８時間で標準的な手順に従って市販のＥＬＩＳＡアッセイを用いてサイトカインに関して分析する。ＩＦＩＴ ｍＲＮＡレベルを、実施例９に記載のように市販のＴａｑＭａｎプローブを用いたＲＴ−ｑＰＣＲによりｓｉＲＮＡ注入後１時間〜４８時間で評価する。
この研究の第１部では、１群当たり６匹の動物を分子分析に使用する。動物を処理の２日後に安楽死させる。この研究の第２部では、腫瘍成長／寛解及び血管新生を分析するのに、１群当たり８匹の動物を使用する。動物を最大３ヶ月間、又は瀕死になるまで観察する。分子分析を以下のように、又は実施例９に記載のように行う。
ＲＮＡ単離：
安楽死させた後、腫瘍を取り出し、すぐに液体窒素で凍結させる。ＲＮＡを製造業者のマニュアルに従ってＲＮｅａｓｙキット（Qiagen）を用いて腫瘍組織から単離し、ＲＮＡの質を製造業者の取扱説明書に従ってＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏキット（Agilent）を用いたＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより求める。
５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ：
５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲを、ＶＥＧＦ特異的な５’プライマー及び３’プライマー並びにネステッドプライマーを用いて上記の実施例９に記載のように個々の腫瘍サンプルに対して行う。
ＲＴ−ｑＰＣＲ：
ＲＴ−ｑＰＣＲを、製造業者の推奨に従って、遺伝子特異的な有効なＶＥＧＦ ＴａｑＭａｎプローブ（Ｈｓ００９０００５５＿ｍ１、Applied Biosystems）によりＳＤＳ７９００ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（AppliedBiosystems）を用いて個々の腫瘍サンプルで行う。遺伝子発現を、過去に記載されたように、ｉｎ ｖｉｖｏでの自然の発現変化について正規化するために、ＰＣ３腫瘍における遺伝子発現分析に関して選択されるハウスキーピング遺伝子（例えば、１８Ｓ ｒＲＮＡ、ＲＰＬＰＯ、Ｈｍｂｓ、Ｐｐｉｂ及び／又はＰｇｋ１）のプールに対して正規化する［７５］。
ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ：
ＶＥＧＦタンパク質の発現を、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて個々の腫瘍サンプルで求める。腫瘍組織をＲＩＰＡバッファー（Sigma Aldrich）の添加により溶解し、製造業者の取扱説明書に従って、濃度をＢＣＡアッセイ（Perbio）により測定する。ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡを、製造業者の取扱説明書に従って市販のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＶＥＧＦイムノアッセイキット（R&D systems）を用いて行う。
ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：
ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために、腫瘍を取り出し、すぐに液体窒素で凍結する。１０μｍのミクロトーム切片を顕微鏡スライド上に置き、４％のＰＦＡで固定する。検出を、プロテイナーゼＫ消化及び無水酢酸の前処理を含む確立された手順に従って行う。ＶＥＧＦ特異的ＤＩＧ標識化プローブを、前に公開されたように製造業者の推奨に従ってＤＩＧ ＲＮＡ標識化キット（Roche Applied Science）を用いてＶＥＧＦ ｃＤＮＡを含有するプラスミドから調製する［８０］。プローブを６５℃で一晩加湿チャンバにおいて組織切片上でインキュベートする。ＤＩＧで標識化したプローブを、アルカリホスファターゼ（ＡＰ、Roche）とコンジュゲートしたヒツジ抗ＤＩＧ抗体を用いて検出する。それから切片をＢＭパープル（Roche）又は別のＡＰ基質の添加により発色させる。
有効性の研究：
化合物（ｄ）としてＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡを含むＤＡＲＥ（商標）送達コンジュゲートの有効性を求めるために、処理後の腫瘍サイズ及び腫瘍の血管新生の程度を求める。全ての対照群を、比較のために同様にモニタリングする。
腫瘍成長／寛解：
腫瘍サイズを、処理日から始めて１日おきにノギスを用いて測定する。
腫瘍の血管新生：
ＤＡＲＥ（商標）−ｓｉＲＮＡ処理に応答する腫瘍成長を評価する実験の終了後、腫瘍の血管新生の程度を、前に記載のように評価する［８６、１００］。腫瘍を１０％の緩衝ホルマリンで固定した後、パラフィン包埋し、ミクロトームで切り出して、５μｍ〜１５μｍの切片を得る。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色並びにＣＤ３１（血管を視覚化するために）発現に関する免疫組織化学検査を行う。腫瘍組織切片を３７℃で１０分間〜１５分間、０．１％のトリプシンで前処理した後、４℃で一晩、１：５００の希釈率でラット抗マウスＣＤ３１（ｍＡｂ ＭＥＣ１３．３、PharMingen, San Diego, CA）と共にインキュベーションを行う。免疫反応性を、色原体としてジアミノベンジジンを含むＶｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Vector Laboratories, Burlingame, CA）を用いたアビジン−ビオチン複合体技法、又は代替的には免疫蛍光により可視化するのが好ましい。血管新生の比較のために、視野１つ当たりの腫瘍内のＣＤ３１陽性の血管数を計測する。
実施例１４：ｉｎ ｖｉｖｏでの化合物（ｄ）としてＢｃｌ−ｘＬ特異的ｓｉＲＮＡを有するＤＡＲＥ（商標）送達コンジュゲートの調製及び投与：腫瘍学の異種移植モデル
本実施例では、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ｘＬの発現を十分に確立した異種移植腫瘍モデルにおいてノックダウンし、腫瘍成長及びアポトーシスに対するその効果を求める［１０１、１０２］。実験を、上記の実施例１３に記載のようにＰＣ−３前立腺腺癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３５）を用いて性別及び年齢を適合させた免疫インコンピテントマウスにおいて行う。
構築物及びコンジュゲートを実施例１及び実施例５の教示に従って調製する。各実験は５つの群（ｎ＝１４（マウス／群））からなる：
１．ｓｉＲＮＡを有しない（すなわち化合物（ｄ）がない）ＤＡＲＥ（商標）送達構築物
２．5'-GGUAUUGGUGAGUCGGAUCdTdT-3'（配列番号２６６）を含むセンス鎖と、5'-GAUCCGACUCACCAAUACCdTdT-3'（配列番号２６７）を含むアンチセンス鎖とを含むネイキッド標的Ｂｃｌ−ｘＬ ｓｉＲＮＡ
３．配列番号２５５を含むセンス鎖と、配列番号２５６を含むアンチセンス鎖とを含むネイキッド非標的（ルシフェラーゼ）ｓｉＲＮＡ
４．配列番号２６６を含むセンス鎖と、配列番号２６７を含むアンチセンス鎖とを含む標的Ｂｃｌ−ｘＬ ｓｉＲＮＡを含む、化合物（ｄ）を有するＤＡＲＥ（商標）送達構築物
５．配列番号２５７を含むセンス鎖と、配列番号２５８を含むアンチセンス鎖とを含む非標的ｓｉＲＮＡを含む、化合物（ｄ）を有するＤＡＲＥ（商標）送達構築物
用量は、全身送達では１００μＬ中１００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜２０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、及び局所腫瘍内送達では２５μＬ中０．０５ｎｍｏｌ〜５ｎｍｏｌの範囲である。
この研究の第１部では、１群当たり６匹の動物を分子ノックダウン分析に使用し、動物を処理の２日後に安楽死させる。この研究の第２部では、腫瘍成長／寛解及びアポトーシスを分析するのに、１群当たり８匹の動物を使用する。動物を、少なくとも週２回、最大３ヶ月間、又は瀕死になるまで観察する。分子分析を、以下のように、又は実施例９及び実施例１３に記載のように行う。
ＲＮＡ単離：
安楽死させた後、腫瘍を取り出し、すぐに液体窒素で凍結させる。ＲＮＡを製造業者のマニュアルに従ってＲＮｅａｓｙキット（Qiagen）を用いて腫瘍組織から単離し、ＲＮＡの質を製造業者の取扱説明書に従ってＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏキット（Agilent）を用いたＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより求める。
５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ：
５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲを、Ｂｃｌ−ｘＬ特異的な５’プライマー及び３’プライマー並びにネステッドプライマーを用いて上記の実施例９に記載のように個々の腫瘍サンプルで行う。
ＲＴ−ｑＰＣＲ：
ＲＴ−ｑＰＣＲを、製造業者の推奨に従って、遺伝子特異的な有効なＢｃｌ−ｘＬ ＴａｑＭａｎプローブ（Ｈｓ００２３６３２９＿ｍ１、Applied Biosystems）によりＳＤＳ７９００ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（AppliedBiosystems）を用いて個々の腫瘍サンプルで行う。遺伝子発現を、過去に記載されたように、ｉｎ ｖｉｖｏでの自然の発現変化について正規化するために、ＰＣ−３腫瘍における遺伝子発現分析に関して選択されるハウスキーピング遺伝子（例えば、１８Ｓ ｒＲＮＡ、ＲＰＬＰＯ、Ｈｍｂｓ、Ｐｐｉｂ及び／又はＰｇｋ１）のプールに対して正規化する［７５］。
Ｂｃｌ−ｘＬ ＥＬＩＳＡ：
Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の発現を、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて個々の腫瘍サンプルで求める。腫瘍組織をＲＩＰＡバッファー（Sigma Aldrich）の添加により溶解し、製造業者の取扱説明書に従って、濃度をＢＣＡアッセイ（Perbio）により測定する。腫瘍中のＢｃｌ−ｘＬタンパク質レベルを、製造業者の取扱説明書に従って市販のｈｕｍａｎ Ｔｏｔａｌ Ｂｃｌ−ｘＬ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（R&D systems）を使用して求める。
ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：
ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために、腫瘍を取り出し、すぐに液体窒素で凍結する。１０μｍのミクロトーム切片を顕微鏡スライド上に置き、４％のＰＦＡで固定する。検出を、プロテイナーゼＫ消化及び無水酢酸の前処理を含む確立された手順に従って行う。Ｂｃｌ−ｘＬ特異的ＤＩＧ標識化プローブを、Ｂｃｌ−ｘＬ ｃＤＮＡを含有するプラスミドから調製する。これは、前に記載されたように製造業者の推奨に従ってＤＩＧ ＲＮＡ標識化キット（Roche Applied Science）を用いて行う［８０］。プローブを、６５℃で一晩加湿チャンバにおいて組織切片上でインキュベートする。ＤＩＧで標識化したプローブを、アルカリホスファターゼ（ＡＰ、Roche）とコンジュゲートしたヒツジ抗ＤＩＧ抗体を用いて検出する。それから切片を、ＢＭパープル（Roche）又は別のＡＰ基質の添加により発色させる。
有効性の研究：
化合物（ｄ）としてＢｃｌ−ｘＬ ｓｉＲＮＡを含むＤＡＲＥ（商標）送達コンジュゲートの有効性を求めるために、処理後の腫瘍サイズ及び腫瘍細胞のアポトーシスの程度を求める。全ての対照群を比較のために同様にモニタリングする。
腫瘍成長／寛解：
腫瘍サイズを、処理日から始めて１日おきにノギスを用いて測定する。
腫瘍細胞のアポトーシス：
ＤＡＲＥ（商標）−ｓｉＲＮＡ処理に応答する腫瘍成長を評価する実験の終了後、腫瘍細胞のアポトーシスを、以前に記載されたようにＴＵＮＥＬアッセイ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性のｄＵＴＰニック末端標識化）を用いて分析する［１０２、１０３］。このために、腫瘍を抽出後すぐに凍結させる。４μｍの切片を低温槽で切り出し、アセトンで固定した後、ＴＵＮＥＬ染色を行う。総細胞数をＤＡＰＩ（Invitrogen）核染色により求め、切片の画像を蛍光顕微鏡検査法により取得する。アポトーシス（ＴＵＮＥＬ陽性）細胞の断片を、Definiens社のソフトウェア（Definiens）を用いた自動化分析により算出する。
実施例１５：ｉｎ ｖｉｖｏでの化合物（ｄ）を送達するためのＤＡＲＥ（商標）送達コンジュゲートの投与：腫瘍学の同系モデル
実施例１３及び実施例１４における異種移植モデルに加えて、本発明のＤＡＲＥ（商標）送達コンジュゲートを同系腫瘍モデルで調べ、異種移植モデルと比較してより自然な血管新生を伴う免疫コンピテントマウスモデルにおけるその活性及び分布を評価する。このために、ＦＶＢ／Ｎマウスに、ホタルルシフェラーゼを発現するＤＢ７腫瘍細胞を接種する。ＤＢ７腫瘍細胞は元々、ＦＶＢ／ＮＴｇ（ＭＭＴＶ−ＰｙＶｍＴ Ｙ３１５Ｆ／Ｙ３２２Ｆ）マウスに由来し、以前に記載されている［１０４］。腫瘍の取り込み（take）を増大させるために、埋め込み前に、ＦＶＢ／Ｎマウスにおいて細胞を継代する。画像化のため、ＤＢ７細胞を、β−アクチンプロモータ及びサイトメガロウイルスエンハンサ（ＣＡＧＳ）からなるハイブリッドプロモータにより駆動される、ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で構成された二元機能レポーター遺伝子（Ｌ２Ｇ）を発現するレトロウイルスベクター［１０５］で形質導入した。形質導入細胞をＩＶＩＳ ５０システム（Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA）を用いてｆＬｕｃ発現に関してスクリーニングし、２５個の陽性クローンを選択して、これらを組み合わせることにより、親集団を代表する集団を得る（ＤＢ７ｌｕｃ＋）。
本発明のＤＡＲＥ（商標）−ｓｉＲＮＡ送達コンジュゲートの腫瘍浸透及び有効性を研究するために、性別及び年齢を適合させたマウス（６週齢〜１０週齢）に２．５×１０６個のＤＢ７ｌｕｃ＋細胞を皮下注射する。腫瘍を２週間定着させた後、コンジュゲートを注入する。
ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ配列をｉｎ ｖｉｔｒｏで最適化するか、又は既に記載の配列［７６］を使用する。ｓｉＲＮＡを実施例１１に記載のように免疫刺激効果に関して制御する。
ｓｉＲＮＡ及びＤＡＲＥ（商標）構築物製剤を実施例１及び実施例５に記載のように調製し、独立した実験において尾静脈注射により全身に又は腫瘍内に送達する。各実験は５つの群（ｎ＝５（マウス／群））からなる：
１．ｓｉＲＮＡを有しない（すなわち化合物（ｄ）がない）ＤＡＲＥ（商標）送達構築物、
２．配列番号２５５を含むセンス鎖と、配列番号２５６を含むアンチセンス鎖とを含むネイキッドｆＬｕｃ ｓｉＲＮＡ、
３．配列番号２５７を含むセンス鎖と、配列番号２５８を含むアンチセンス鎖とを含むネイキッド非標的ｓｉＲＮＡ、
４．配列番号２５５を含むセンス鎖と、配列番号２５６を含むアンチセンス鎖とを含むｆＬｕｃ ｓｉＲＮＡを化合物（ｄ）として有するＤＡＲＥ（商標）送達構築物、及び
５．配列番号２５７を含むセンス鎖と、配列番号２５８を含むアンチセンス鎖とを含む非標的ｓｉＲＮＡを化合物（ｄ）として有するＤＡＲＥ（商標）送達構築物。
使用される用量は、全身送達では１００μＬ中１００ｎｍｏｌ／ｋｇ〜２０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、及び局所腫瘍内送達では２５μＬ中０．０５ｎｍｏｌ〜５ｎｍｏｌの範囲である。マウスをＤＡＲＥ（商標）注入後様々な時点（１日〜７日の範囲）で安楽死させ、腫瘍を以下のように又は上記の実施例９に記載のように分子分析のために取り出す。腫瘍を、ｑＲＴ−ＰＣＲによるｆＬｕｃ ｍＲＮＡレベル、並びにｆＬｕｃ特異的な５’プライマー及び３’プライマー並びにネステッドプライマーを用いた５’−ＲＡＣＥによるｆＬｕｃ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ特異的な分解に関するその後の分析のためにＲＮＡｌａｔｅｒ（Qiagen）で保存する。ルシフェラーゼ及び総組織タンパク質レベルの定量化のため（タンパク質組織１つ当たりのルシフェラーゼ量を得るため）、腫瘍を液体窒素で凍結させる。ルシフェラーゼ酵素活性の測定のために、組織溶解／混合ミル（Qiagen）、金属ビーズ及びルシフェラーゼ細胞培養物溶解試薬（Promega、ＰＲ−Ｅ１５３１）を用いて腫瘍をホモジナイズし、卓上遠心分離機において最大速度（約１３０００ｇ）で５分間遠心分離した後、上清を新しい反応管に移す。上清を−８０℃で保存するか、又はすぐに使用して、製造業者の取扱説明書に従ってルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を用いて照度計でルシフェラーゼを測定する。
実施例１６：ｉｎ ｖｉｖｏでのＤＡＲＥ（商標）コンジュゲート送達の実証：中枢神経系（ＣＮＳ）への局所送達
本発明の種々のバージョンのモジュールＤＡＲＥ（商標）送達コンジュゲートを、マウスモデルにおいて脳に送達する。
以下のｓｉＲＮＡ配列を用いるのが好ましい：
ＧＡＰＤＨ：
センス：配列番号２４８、及び
アンチセンス：配列番号２４９
非サイレンシング対照：
センス：配列番号２５７、及び
アンチセンス：配列番号２５８
構築物及びコンジュゲートを実施例１に記載のように調製する。ＧＡＰＤＨ特異的なノックダウンをＢａｌｂ／ｃマウスで試験する。性別及び年齢を適合させたマウス（６週齢〜１０週齢）を使用する。単回注射及び長期注入を行う。各実験には、以下の群（ｎ＝１０（マウス／群））が含まれる：
１．ｓｉＲＮＡを有しない（すなわち化合物（ｄ）がない）ＤＡＲＥ（商標）送達構築物、
２．配列番号２４８を含むセンス鎖と、配列番号２４９を含むアンチセンス鎖とを含むネイキッドＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ、
３．配列番号２５７を含むセンス鎖と、配列番号２５８を含むアンチセンス鎖とを含むネイキッド非標的ｓｉＲＮＡ、
４．配列番号２４８を含むセンス鎖と、配列番号２４９を含むアンチセンス鎖とを含むＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを化合物（ｄ）として有するＤＡＲＥ（商標）送達構築物、及び
５．配列番号２５７を含むセンス鎖と、配列番号２５８を含むアンチセンス鎖とを含む非標的ｓｉＲＮＡを化合物（ｄ）として有するＤＡＲＥ（商標）送達構築物。
尾状核被殻への局所送達のために、ＰＢＳ中で１μＬのＤＡＲＥ（商標）の単回注射（総用量は０．０５ｎｍｏｌ〜５ｎｍｏｌの範囲である）を行う。注射の前に、好ましくはＨ２Ｏ中での３．６％の抱水クロラール（１０ｍＬ／ｋｇ）の腹腔内注射により動物を麻酔し、動物が覚醒し始めた場合は半分の用量で再適用する。その後、注射に備えて、動物を定位固定装置（Axel Semrau, Sprockhoevel, Germany）に位置付ける。外科用メスによる切開により皮膚を開いた後、頭蓋骨を洗浄し、ハミルトンシリンジによる注射に備えて微細ドリル（０．５ｍｍ径）を用いて穴を開ける。穿孔及び注射を、以前に記載された定位固定座標に従って行う［１０６、１０７］。尾状核被殻への注射では、シリンジの先端の座標は（ブレグマから）、側方に−１．６ｍｍ、背腹側に−３．８ｍｍ、前後に−０．５ｍｍである。
長期送達のために、本発明のＤＡＲＥ（商標）コンジュゲートを、以前に記載されたように、浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ脳注入キット）により、ブレグマに対してＡＰ：−０．５ｍｍ、ＭＬ：０ｍｍ、ＤＶ：−３ｍｍで第３脳室へと送達する［１０８、１０９］。簡潔にいうと、動物を単回注射に関して上述のように準備した後、適切な座標にカニューレ端（ending）を埋め込み、頭蓋骨に固定する。浸透圧ポンプを本発明のＤＡＲＥ（商標）コンジュゲートで満たし、２週間の注入期間、１日の容量５μＬ中で０．０１ｎｍｏｌ／日〜０．５ｎｍｏｌ／日の送達速度を達成する。ポンプを動物の頸部に皮下から埋め込み、シリコーンチューブを介してカニューレと連結する。
単回注射の後、動物を注射後１日目〜７日目に安楽死させる。注入の場合、動物を２週間の注入の直後に安楽死させる。各動物の脳をすぐに取り出し、以下のように又は上記の実施例７及び実施例９に記載のように、ＤＡＲＥ（商標）分布及び有効性の分析のために処理する。ＲＮＡ及びタンパク質分析のために、脳を動物の死亡後すぐに解剖し、対象の様々な領域から組織を回収し、すぐに液体窒素で凍結する。ＲＮＡを製造業者のマニュアルに従ってQiagenのＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ組織キットを用いて単離する。ＲＴ−ＰＣＲ及び５’−ＲＡＣＥを上記の実施例９に記載のように行う。
免疫組織化学検査：
Ｃｙ３により標識化したＤＡＲＥ（商標）構築物の分布分析及び免疫組織化学検査によるタンパク質の発現の分析のために、各動物の脳を２４時間、ＰＢＳ中の４％のＰＦＡ、０．０５％のグルタルアルデヒドで固定した後、３６時間、３０％のスクロースに浸漬させる。それから保存のために脳組織を−８０℃で凍結し、７μｍの切片を−２０℃で切り出し、顕微鏡分析のためにスライド上に置く。ＧＡＰＤＨタンパク質の発現を、ＧＡＰＤＨ特異的抗体（ウサギｍＡＢ １４Ｃ１０（Cell Signaling）等）を用いて検出する。クエン酸バッファーを用いてマイクロ波による抗原回復を行った後、製造業者の推奨に従って抗原検出を行う。一次抗体の検出を抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はフルオロフォアで標識化した二次抗体（Abcam）を用いて行った後、標準的なプロトコルを用いて、又はフルオロフォアで標識化した二次抗体の場合、上記の実施例７に記載のように、顕微鏡検査により分析する。
ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：
ｉｎ ｓｉｔｕでのＲＮＡ検出を、プロテイナーゼＫ消化及び無水酢酸の前処理を含む確立された手順に従って行う。抽出後２４時間〜３０時間、脳組織を４％のＰＦＡに固定し、その後２４時間〜３０時間、３０％スクロースに浸漬する。それからこれをイソペンタン中で−７０℃まで冷却し、５μｍ厚の切片を低温槽−ミクロトームで切り出す。標的特異的なジゴキシゲニンで標識化したプローブを、製造業者の推奨に従って、以前に記載されたように、ＤＩＧ ＲＮＡ標識化キット（Roche Applied Science）を用いてＳＰ６又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによりＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡを含有するプラスミドから調製する［１１０］。プローブを６５℃で一晩、加湿チャンバにおいて組織切片上でインキュベートする。ＤＩＧで標識化したプローブを、アルカリホスファターゼ（ＡＰ、Roche）とコンジュゲートしたヒツジ抗ＤＩＧ抗体を用いて検出する。それから切片を、ＢＭパープル（Roche）又は別のＡＰ基質の添加により発色させる。
本実施例は、化合物（ｄ）としてＧＡＰＤＨで標的化したｓｉＲＮＡを送達するために、本発明の特異的なリシンＢ（すなわちモジュール（ａ））標的化コンジュゲートの調製、使用及び特性化を説明するが、本実施例の教示は、本発明の任意のコンジュゲートに適用可能である。とりわけ当業者は、ＧＡＰＤＨで標的化したｓｉＲＮＡをＣＮＳ遺伝子発現ノックダウンが望まれる標的に指向性を有する別のｓｉＲＮＡに置き換えることができる。また当業者は、本実施例に記載のコンジュゲートのＧＡＰＤＨで標的化したｓｉＲＮＡを、ＣＮＳにおいて細胞に送達されることが望まれる別の化合物（ｄ）に置き換えることができる。したがって上記のように、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を、意図される目的及びＣＮＳ内の標的細胞に適するように当業者が変更することもできる。これらの実施形態は、過度の実験を行うことなく準備することができ、本発明の範囲内に包含される。
実施例１７：逆行性輸送によるＤＡＲＥ（商標）コンジュゲート送達をモニタリングするための逆行性経路の化学的阻害剤の使用
逆行性輸送によるＤＡＲＥ（商標）コンジュゲート送達をモニタリングするために、これらの経路に干渉する化学的阻害剤又は薬物を使用することができる。これらの薬物は、文献において一般的に使用されており、ブレフェルジンＡ（ゴルジ体を破壊する）及びモネンシン（ゴルジ体への輸送を変調する、例えば低濃度ではリシン毒性が増大し、より高濃度ではリシン毒性に対して保護する）を含む［１１１］。このため、様々な小器官に対する同時染色により細胞を通るＤＡＲＥ（商標）コンジュゲートを追跡することができる。
逆行性経路阻害剤は、エンドソームからゴルジ体への輸送を妨げることが期待される。阻害剤が実際に本発明のコンジュゲートの輸送を阻害する（すなわち蛍光標識化したＤＡＲＥ（商標）構築物がもはやＥＲに達することができない）場合（このことはＲＮＡｉ効果の低減により及び／又は共焦点顕微鏡検査により示される）、この結果は、ＤＡＲＥ（商標）コンジュゲートにより逆行性経路が使用され、それによりその化合物（ｄ）をサイトゾルへと送達することを示す。このため、本発明によるＤＡＲＥ（商標）コンジュゲートが逆行性経路を通って輸送され、ＥＲに到達する場合、ＤＡＲＥ（商標）コンジュゲート添加前の逆行性経路阻害剤による細胞の前処理により、細胞のＥＲにおいて蛍光標識化したＤＡＲＥ（商標）コンジュゲートの低減がもたらされるものとする。さらに、阻害剤による前処理がＲＮＡｉ効果の低減をもたらす場合、ＤＡＲＥ（商標）コンジュゲートは、逆行性経路を使用することにより、その化合物（ｄ）（すなわちｓｉＲＮＡ送達物）をサイトゾルへと送達する可能性が最も高い。
ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ、Sigma-Aldrich、製品番号Ｂ５９３６）を、最終濃度５μｇ／ｍＬで細胞に添加する。この濃度が３０分以内のゴルジ体とＥＲとの迅速な融合をもたらす［１１１、１１２］。しかしながら、０．５μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬのより低濃度のＢＦＡであっても細胞株によっては、１日間〜３日間の細胞生存を高めつつも逆行性輸送を阻害するのに十分である［１１１、１１２］。ＢＦＡは、初期エンドソーム及びＴＧＮの融合も引き起こす。
代替的に、リポキシゲナーゼ阻害剤であるノルジヒドログアイアレト酸（ＮＤＧＡ、Sigma-Aldrich、製品番号７４５４０）を、２５μＭの最終濃度で細胞に（血清無含有培地中で）添加する。この濃度が、３０分以内のゴルジ体とＥＲとの迅速な融合をもたらす［１１３〜１１５］。
代替的に、非ステロイド系エストロゲンであるシクロフェニルジフェノール（ＣＦＤ、Sigma-Aldrich、製品番号Ｃ３４９０−１０ＭＧ）を、２５μＭの最終濃度で細胞に添加する。この濃度が３０分以内のゴルジ体とＥＲとの迅速な融合をもたらす。
代替的に、Ｒｅｔｒｏ−１又はＲｅｔｒｏ−２（Chembridge、www.chembridge.com）を２５μＭの最終濃度で細胞に添加する。これらの先の２つの阻害剤は細胞小器官の融合を引き起こさないが、毒素（シリン、志賀毒等）がエンドソームからＴＧＮへと輸送されるのを特異的に阻害する［１１６］。
上記の阻害剤の更なる代替として、ゴルギシドＡ（Sigma-Aldrich、製品番号Ｇ０９２３−５ＭＧ、［１１７］）又は逆行性輸送の他の阻害剤を使用することができる。
逆行性輸送の阻害剤を、ＤＡＲＥ（商標）−ｓｉＲＮＡ構築物の添加の３０分前に添加する。標的ｍＲＮＡ及び標的タンパク質（例えばＧＡＰＤＨ又はルシフェラーゼ）のノックダウンを、実施例９に記載のように、ＲＴ−ｑＰＣＲ及び適切なタンパク質アッセイ、例えば標準的なＧＡＰＤＨ酵素活性アッセイ又はルシフェラーゼ活性アッセイを使用して６時間後、２４時間後及び４８時間後に評価する。阻害剤が過剰な細胞毒性を示す場合、インキュベーション期間が終わる前に培地を交換することにより阻害剤とのインキュベーションを停止させることができる。例えば培地を交換することにより阻害剤を６時間後（又はそれより早く）に取り除いても、ＲＴ−ｑＰＣＲ及びタンパク質アッセイは２４時間後及び４８時間後に行われる。
上記のＲＮＡｉ実験に加えて又はその代わりに、逆行性輸送を免疫組織化学分析により実証することもできる。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞株、ＨｅＬａ細胞株又は他の適切な細胞株を、Ｃｙ３等のフルオロフォアを有するＤＡＲＥ（商標）−ｓｉＲＮＡ構築物と共に１５分間〜６０分間インキュベートし、その後培地を交換する。その後幾つかの時点（例えば３０分、１時間、２時間、４時間、６時間及び２４時間）で、細胞を固定し、様々な細胞小器官に対する抗体により染色して、共焦点顕微鏡検査により調べる。ＤＡＲＥ（商標）−ｓｉＲＮＡとのインキュベーション中に、阻害剤を半分のウェルに加え、ＤＡＲＥ（商標）−ｓｉＲＮＡの輸送のために逆行性経路が使用されることを実証する。小器官マーカーに関しては、以下のものを使用する：初期及び回収エンドソームを染色するためのフルオロフォアとコンジュゲートしたトランスフェリン（ＤＡＲＥ（商標）−ｓｉＲＮＡを添加する際に細胞に添加する）；リソソームを染色するためのＬＡＭＰ１抗体；ゴルジ装置を染色するためのマンノシダーゼＩＩ抗体；ＥＲを染色するための、カルレチクリン、カルネキシリン（又はＤｅｒｌｉｎ−１）抗体；及び、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素（Invitrogen）により核を染色することができる。
実施例１８：逆行性経路の重要な遺伝子に対するｓｉＲＮＡ
これらの重要な構成要素を標的とするｓｉＲＮＡ（複数も可）による逆行性経路及びＥＲＡＤの重要な構成要素のノックダウンを用いて、本発明のコンジュゲートの経路を追跡することもできる。逆行性経路の化学的阻害剤の実施例１７での使用の代わりに、ＤＡＲＥ（商標）−ｓｉＲＮＡの逆行性輸送に重要なタンパク質もｓｉＲＮＡでノックダウンすることができる。これらの分析は上記の実施例１７に記載のものと同一である、すなわちＤＡＲＥ（商標）−ｓｉＲＮＡによるノックダウンを低減し、ＤＡＲＥ（商標） ｓｉＲＮＡの逆行性輸送を阻害する。ＤＡＲＥ（商標）−ｓｉＲＮＡの細胞への添加の１〜２日前、細胞を以下の遺伝子のうちの１つ又は幾つかに対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトする：ＫＤＥＬＲ−１（アクセッション番号１０９４５）、ＫＤＥＬＲ−２（アクセッション番号１１０１４）、ＫＤＥＬＲ−３（アクセッション番号１１０１５）、Ｓｅｃ６１ａ１（アクセッション番号２９９２７）、Ｄｅｒｌｉｎ−１（ＤＥＲＬ−１とも称される、アクセッション番号７９１３９）、ＰＤＩＡ２（アクセッション番号６４７１４）及びＥｒｏ１Ｌ（アクセッション番号３０００１）（当業者により調製されるような以下のｓｉＲＮＡ配列（複数又は単数）のうちの１つを含む）：
ＫＤＥＬＲ−１：
センス：5'-CUACCUCUAUAUCACCAAATT-3'（配列番号２６８）、
アンチセンス：5'-UUUGGUGAUAUAGAGGUAGAA-3'（配列番号２６９）、
ＫＤＥＬＲ−２：
センス：5'-AUAGGAGCAGGCAAGGUAGAT-3'（配列番号２７０）、
アンチセンス：5'-CUACCUUGCCUGCUCCUAUTT-3'（配列番号２７１）、
ＫＤＥＬＲ−３：
センス：5’-ACUGAUUCCAGAUAGAUAGAG-3'（配列番号２７２）、
アンチセンス：5'-CUAUCUAUCUGGAAUCAGUTT-3'（配列番号２７３）、
Ｓｅｃ６１ａ：
センス：5'-GGAAUUUGCCUGCUAAUCATT-3'（配列番号２７４）、
アンチセンス：5'-UGAUUAGCAGGCAAAUUCCAG-3'（配列番号２７５）、
Ｄｅｒｌｉｎ−１：
センス：5'-GCUUAGCAAUGGAUAUGCATT-3'（配列番号２７６）、
アンチセンス：5'-UGCAUAUCCAUUGCUAAGCCA-3'（配列番号２７７）、
ＰＤＩＡ２：
センス：5'-GUCGGAAGGUGAUUGAAUATT-3'（配列番号２７８）、
アンチセンス：5'-UAUUCAAUCACCUUCCGACCT-3'（配列番号２７９）、
Ｅｒｏ１Ｌ：
センス：5'-GGAAUGUCAUCUACGAAGATT-3'（配列番号２８０）、及び
アンチセンス：5'-UCUUCGUAGAUGACAUUCCAT-3'（配列番号２８１）。
実施例１９：コンジュゲート１つ当たり少なくとも２つの化合物（ｄ）分子を含むＤＡＲＥ（商標）コンジュゲート
本実施例は、２つの化合物（ｄ）（２つの同じ標的ｓｉＲＮＡである）を含むコンジュゲートの調製を説明する（図１４を参照されたい）。当業者は、本発明のコンジュゲートとコンジュゲートした化合物（ｄ）分子の数を増大させることにより、本発明のコンジュゲート、ひいては送達システムの効力を増大することができることを理解することができる。少なくとも２つの化合物（ｄ）がｓｉＲＮＡである場合、複数のｓｉＲＮＡによる負電荷の増大を補うため、正に荷電した分子（すなわちスペルミン、スペルミジン又は正に荷電したペプチド）を、製剤に添加する必要があることがある、又は単一の本発明のｓｉＲＮＡ−コンジュゲートで要求される濃度よりも製剤においてより高い濃度で使用する必要があることがある。
（ｉ）モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含む結合分子の合成：
（モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）＋２つのリンカー）ペプチドＨ２Ｎ−Ｃ（ＮＰｙｓ）−（ＳＧ）３−（ＤｐｒＡｏａ）（ｄＰＥＧ１２）（ＤｐｒＡｏａ）−（ＳＧ）３−ＮＡＳＳＳＲＳＧＬＤＤＩＮＰＴＶＬＬＫＡＫＤＥＬ−ＯＨ（「モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）」を含むペプチドは、配列番号２４４を含むアミノ酸配列を含む）を、標準的な固相Ｆｍｏｃペプチド化学により商業的に合成し、標準的な方法で脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより純度が９５％を超えるまで精製する。ペプチドのＱＣを、アミノ酸分析、質量分析及び分析用逆相ＨＰＬＣにより行う。構成単位としてＢｏｃ−Ｃｙｓ（ＮＰｙｓ）−ＯＨ（Bachem、製品番号Ａ−２８２５）を用いて活性化システイン残基を導入する。Ｆｍｏｃ−Ｄｐｒ（Ｂｏｃ−Ａｏａ）−ＯＨ（Novabiochem、製品番号０４−１２−１１８５）を用いて、Ｎ−β−アミノオキシアセチルＬ−ジアミノプロピオニル残基を導入する。ｄＰＥＧ１２を、Ｆｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２酸（Quanta BioDesign、製品番号１０２８３）を用いて導入する。精製ペプチドのＱＣを、ＥＳＭＳ及び分析用逆相ＨＰＬＣにより行う。
（ｉｉ）モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）と２つのリンカーとを含む送達担体の合成：
モジュール（ａ）を調製するために、組換えリシン毒素Ｂサブユニット（配列番号１２４、Vector Laboratories, Inc.、カタログ番号Ｌ−１２９０）（０．０８％アジ化ナトリウムと５０ｍＭの２−ＭＥとを含有する、１０ｍＭのリン酸ナトリウム水溶液、０．１５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）における１ｍｇ／ｍＬ溶液として供給される）に、新たな５０ｍＭの２−ＭＥを添加し、室温で１時間インキュベートして、確実に、４位のＣｙｓ残基を完全に還元する。サンプルを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）限外濾過スピンカラム（分子量カットオフ値 ５ｋＤａ、Sartorius Stedim Biotech、商品番号ＶＳ０２１１）を用いて脱塩処理し、脱気した１０ｍＭのリン酸バッファー、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７）にバッファーを交換する。得られるリシンＢ溶液を、アルゴン下で１０℃で一晩、上記の実施例１９（ｉ）によるモジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含有する、１．１モル当量の結合分子と反応させる。それから所望の送達担体を、流速１ｍＬ／分で５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウムバッファー、１００ｍＭのＮａＣｌ、２μＭのＥＤＴＡ（ｐＨ５．０）で溶出させるＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５分取用カラム（GE Healthcare、商品番号１７−１０６８−０１）を用いて分取ゲル濾過により精製する。所望の担体ピークの同定は、実施例１９（ｉ）のリシンＢ及びリンカー−ペプチドエンティティを用いてＳＥＣカラムを予め較正することにより可能となる。生成物を、ネイティブゲル電気泳動により及び２つの構成要素（そのそれぞれを個々に分析する）へのＤＴＴ切断により分析する。
（ｉｉｉ）送達物ｓｉＲＮＡ（化合物（ｄ））の調製：
ＴｕｓｃｈｌスタイルのｓｉＲＮＡ標的化ＧＡＰＤＨを、センス鎖の５’末端を５’−（Ｃ６−アミノリンカー）−ホスフェート−（Ｃ６−ＳＳ−Ｃ６）−ホスフェート−Ｃｙ３エンティティで修飾したことを除いて、実施例１（ｉｉｉ）に記載されるのと全く同様に合成、精製及び分析する。第１級アミンを、実施例１（ｉｉｉ）の手順に従ってアダプタ分子ＳＦＢと更に反応させ、脱塩処理して、バッファーを交換する。
（ｉｖ）二重のｓｉＲＮＡ送達物（２つの化合物（ｄ））と送達担体（モジュール（ａ）＋モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）及び２つのリンカー）とのカップリング：
上記の実施例１９（ｉｉ）由来の送達担体を、１０℃で一晩、リン酸バッファー（ｐＨ５）中で上記の実施例１９（ｉｉｉ）由来の３モル当量のアダプタ−ｓｉＲＮＡ送達物と反応させる。所望のモジュール（ａ）＋モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）＋化合物（ｄ）コンジュゲートを、滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて１ｍＬ／分で溶出させるＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５分取用カラム（GE Healthcare、商品番号１７−１０６８−０１）上での分取ＳＥＣにより精製する。ＱＣを、ネイティブゲル電気泳動及びＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（GE Healthcare、商品番号１７−５１７４−０１）上での分析用ＳＥＣにより行う。更なる分析を、生成物をＤＴＴ又はＴＣＥＰと共にインキュベートすることにより行い、２つの接近可能なジスルフィド結合を切断し、３つの分子を得て、それらのそれぞれをＨＰＬＣにより単離し、ＥＳＭＳにより個々に特徴付けて、必要に応じてシークエンシグすることができる。
本実施例内に記載のアプローチを用いて、他の送達物、例えば核酸、タンパク質、ペプチド、治療成分等を本発明の送達担体（すなわち（モジュール（ａ）＋モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ））に結合させることができることは当業者にとって明らかであろう。
実施例２０：それぞれｆＬｕｃ及びＧＡＰＤＨ標的化ｓｉＲＮＡを有する、ＤＡＲＥ（商標）３．０２構築物（ＤＡＲＥ（商標）−Ｔ−ＡＫ−ＳＧＫ）、Ｓｇｋ１−ＴｆＲ−ＡＫＤＥＬ−ｓｉＲＮＡ（図１１を参照されたい）の合成
（ｉ）モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）、すなわちＳｇｋ１−ＴｆＲ−ＡＫＤＥＬを含有する結合分子の合成
配列ＭＴＶＫＴＥＡＡＫＧＴＬＴＹＳＲＭＲＧＭＶＡＩＬＩＡＦＭＫＱ−（Ｓ−Ｇ）３−Ｃｙｓ−（Ｓ−Ｇ）３−ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰＡＫＤＥＬの（モジュール（ａ）（配列番号１２１）＋モジュール（ｂ）（配列番号１６１）＋モジュール（ｃ）（配列番号１９９）＋リンカーペプチド（配列番号７））を、標準的な固相Ｆｍｏｃ化学により合成し、標準的な方法で脱保護し、分取逆相ＨＰＬＣにより２回精製する。純度は、１ｍＬ／分で溶出される、０．１％のＴＦＡ水溶液から６０％アセトニトリル中の０．１％のＴＦＡまでの４０分間の勾配を用いるＶｙｄａｃ ２１８ＴＰ５４カラム上の分析用逆相ＨＰＬＣにより５７％〜８４％（ピーク前後のショルダーによる）と推定された。陽イオンモードでのマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）により測定された質量は、Ｍ＋Ｈ＋に関して６３４６．８１Ｄａであった。Ｃ２７５Ｈ４４２Ｎ７８Ｏ８２Ｓ６の算出質量は６３４５．４１Ｄａである。それからシステインチオールを、撹拌しながら室温で２時間の、ピリジン（５ｍＬ）中での精製ペプチド（５０ｍｇ、約７μｍｏｌ）と５−二トロ−２−［（５−二トロピリジン−２−イル）ジスルファニル］ピリジン（６.２ｍｇ、２０μｍｏｌ、Sigma-Aldrich、カタログ番号４３７６５）との反応により活性化し、２回の分取ＲＰ−ＨＰＬＣ精製後に１１ｍｇの所望のＭＴＶＫＴＥＡＡＫＧＴＬＴＹＳＲＭＲＧＭＶＡＩＬＩＡＦＭＫＱ−（Ｓ−Ｇ）３−Ｃｙｓ（ｐＮＰｙｓ）−（Ｓ−Ｇ）３−ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰＡＫＤＥＬを得た。活性化ペプチドの純度は逆相ＨＰＬＣにより７８．８％であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳはｍ／ｚ ６５００．６４での正確なＭ＋Ｈ＋イオンを示した。Ｃ２８０Ｈ４４４Ｎ８０Ｏ８４Ｓ７の算出質量は６４９９．５６Ｄａである。
（ｉｉ）ｓｉＲＮＡ送達物化合物（ｄ）の調製
１９ヌクレオチド長の二本鎖領域と、各鎖の３’末端で突出し、グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を標的とする、２つのヌクレオチドとを有する、２つの２１ｍｅｒ鎖から構成される二本鎖ＲＮＡ分子（ここではセンス鎖が5'-CCAuCUUCCAGGAGCgAGAuu（配列番号２４８）（ここで、小文字のｕ又はｇは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを表す）を含み、アンチセンス鎖が5'-UCUCGCUCCUGgAAGAuGGdTdT（配列番号２４９）（ここで小文字のｕ又はｇは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを表す）を含み、アンチセンス鎖がその３’末端に５’−ホスフェート及びデオキシヌクレオチドを有する（ｄＮｄＮ））を、センス鎖の５’末端が５−（Ｃ６−ＳＳ−Ｃ６スペーサー）−ホスフェート−Ｃｙ３部分により修飾されるように合成した。また、１９ヌクレオチド長の二本鎖領域と、各鎖の３’末端で突出し、ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）を標的とする、２つのヌクレオチドとを有する、２つの２１ｍｅｒ鎖から構成される二本鎖ＲＮＡ分子（ここではセンス鎖が5'-CUUACgCUGAGuACUUCGAuu（配列番号２５５）（ここで、小文字のｕ又はｇは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを表す）を含み、アンチセンス鎖が5'-UCGAAGUACUCAgCGUAAgdTdG（配列番号２５６）（ここで小文字のｇは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを表す）を含み、アンチセンス鎖がその３’末端に５’−ホスフェート及びデオキシヌクレオチドを有する（ｄＮｄＮ））を、センス鎖の５’末端が５−（Ｃ６−ＳＳ−Ｃ６スペーサー）−ホスフェート−Ｃｙ３部分により修飾されるように合成した。４つのＨＰＬＣで精製した個々の一本鎖を、全てＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）を含有する活性化結合分子を用いて、ジスルフィド交換反応のための２つの二本鎖を調製するために、５０個のＡ２６０ユニットの各二本鎖を、１００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する０．５ｍＬの０.２Ｍの滅菌酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６）に溶解し、３７℃で２時間維持して、ジスルフィド結合を切断した。それから溶液を、溶出液として脱気した水を用いて脱塩処理し、凍結乾燥した。
（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡ送達物（化合物（ｄ））と送達担体（モジュール（ａ）＋モジュール（ｂ）＋モジュール（ｃ）及びリンカー）とのカップリング
上記の実施例２０（ｉｉ）由来のｆＬｕｃ−ｓｉＲＮＡ（１０個のＡ２６０ユニット、約２５ｎｍｏｌ）を、アルゴン下で１００μＬの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中の８Ｍの塩化グアニジンに溶解した。上記の実施例２０（ｉ）由来のＭＴＶＫＴＥＡＡＫＧＴＬＴＹＳＲＭＲＧＭＶＡＩＬＩＡＦＭＫＱ−（Ｓ−Ｇ）３−Ｃｙｓ（ｐＮＰｙｓ）−（Ｓ−Ｇ）３−ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰＡＫＤＥＬ（０．５ｍｇ、約７２ｎｍｏｌ）を、１００μＬの脱気した滅菌水中の８Ｍの塩化グアニジンに溶解した。ペプチド溶液をｆＬｕｃ−ｓｉＲＮＡ溶液に添加し、反応を２２℃で１７時間、進行させた。それから溶液を５０ｍＭの滅菌酢酸アンモニウムで１ｍＬまで希釈し、スピンカラム（０．５ｍＬ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ １０ｋＤａメンブレンを備えたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）に充填した。カラムを５０ｍＭの酢酸アンモニウムで１回、その後水で洗浄した。脱塩処理したサンプルを取り出し、凍結乾燥し、それから６Ｍの尿素（バッファーＡ）を含有する２５ｍＭの滅菌トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）０．５ｍＬに溶解し、１ｍＬのＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑアニオン交換ＨＰＬＣカラム（GE Healthcare、商品番号１７−１１７７−０１）に充填した。カラムを、流速３ｍＬ／分を用いて１８０カラム容積（ＣＶ）中で０％から８０％までのバッファーＢの線形勾配で溶出した。バッファーＢは、Ａｋｔａ ｐｕｒｉｆｉｅｒ ＨＰＬＣ（GE Healthcare）を用いて、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１Ｍの臭化ナトリウム及び６Ｍの尿素（ｐＨ７．４）とした。カラム溶出液を２６０ｎｍ及び５５０ｎｍ（Ｃｙ３吸収）でモニタリングし、３つのピークを観察し、第１の（主要）ピークを、質量分析により所望のコンジュゲートと同定した。分取アニオン交換ＨＰＬＣ追跡結果を図１５に示す。同一の実験をＧＡＰＤＨ−ｓｉＲＮＡに関して行い、分取アニオン交換ＨＰＬＣ追跡結果を図１６に示す。ピークを含有する産物をスピンカラムを用いて十分に脱塩処理し、それから凍結乾燥した。２つの精製ＤＡＲＥ（商標）３．０２構築物の収率は、３ｎｍｏｌ〜７ｎｍｏｌの範囲であった。図１７は、プレキャスト８ｃｍ×６．５ｃｍのゲル（Biostep、商品番号９５−７０−１８１）と、６Ｍの尿素を含有する標準的なトリスホウ酸塩泳動バッファーとを使用して１時間〜１．５時間の泳動時間で２２０Ｖ及び２５ｍＡで行った、ｆＬｕｃ−ｓｉＲＮＡを含有するＤＡＲＥ（商標）３．０２構築物及びＧＡＰＤＨ−ｓｉＲＮＡを含有するＤＡＲＥ（商標）３．０２構築物の１５％ＰＡＧＥゲルを示す。構築物の同一性の確認を、Voyagerの機器でのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により行った。図１８（３．０３−ｆＬｕｃ）及び図１９（３．０２−ＧＡＰＤＨ）を参照されたい。
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Claims (29)

  1. 細胞に化合物を送達するためのコンジュゲートであって、
    （ａ）細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にする少なくとも１つのモジュールと、
    （ｂ）小胞体（ＥＲ）への輸送を容易にする少なくとも１つのモジュールと、
    （ｃ）ＥＲからサイトゾルへの転位を媒介する少なくとも１つのモジュールと、
    （ｄ）少なくとも１つの化合物と、
    を含むか又はそれらからなり、モジュール（ａ）〜モジュール（ｃ）及び化合物（ｄ）が任意の配置で互いに結合する、細胞に化合物を送達するためのコンジュゲート。
  2. モジュール及び化合物が、以下の配置：（ａ）ｘ、（ｂ）ｙ、（ｃ）ｚ及び（ｄ）ｎ；（ｂ）ｙ、（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ及び（ｄ）ｎ；（ｂ）ｙ、（ｃ）ｚ、（ａ）ｘ及び（ｄ）ｎ；（ｃ）ｚ、（ｂ）ｙ、（ａ）ｘ及び（ｄ）ｎ；（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｂ）ｙ及び（ｄ）ｎ；（ｃ）ｚ、（ａ）ｘ、（ｂ）ｙ及び（ｄ）ｎ；（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ、（ｂ）ｙ及び（ａ）ｘ；（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ、（ｂ）ｙ及び（ａ）ｘ；（ｂ）ｙ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ａ）ｘ；（ｄ）ｎ、（ｂ）ｙ、（ｃ）ｚ及び（ａ）ｘ；（ｂ）ｙ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ａ）ｘ；（ｃ）ｚ、（ｂ）ｙ、（ｄ）ｎ及び（ａ）ｘ；（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ、（ａ）ｘ及び（ｂ）ｙ；（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ、（ａ）ｘ及び（ｂ）ｙ；（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ；（ｄ）ｎ、（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ；（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ；（ｃ）ｚ、（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ；（ｂ）ｙ、（ｄ）ｎ、（ａ）ｘ及び（ｃ）ｚ；（ｄ）ｎ、（ｂ）ｙ、（ａ）ｘ及び（ｃ）ｚ；（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｂ）ｙ及び（ｃ）ｚ；（ｄ）ｎ、（ａ）ｘ、（ｂ）ｙ及び（ｃ）ｚ；（ａ）ｘ、（ｂ）ｙ、（ｄ）ｎ及び（ｃ）ｚ；又は（ｂ）ｙ、（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ及び（ｃ）ｚ（ここで
    ｘは１〜５、又は１の整数であり、
    ｙは１〜５、又は１の整数であり、
    ｚは１〜５、又は１の整数であり、
    ｎは１〜５０、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０の整数である）のうちの１つで互いに結合する、請求項１に記載のコンジュゲート。
  3. モジュール及び化合物が互いに結合する該配置が、
    （ｉ）（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここでｘは１の整数であり、ｚは１の整数であり、ｎは１の整数であり、ｙは１の整数である）、
    （ｉｉ）（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここでｘは１の整数であり、ｚは１の整数であり、ｎは２の整数であり、ｙは１の整数である）、
    （ｉｉｉ）（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここでｘは１の整数であり、ｚは１の整数であり、ｎは３の整数であり、ｙは１の整数である）、
    （ｉｖ）（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここでｘは１の整数であり、ｎは１の整数であり、ｚは１の整数であり、ｙは１の整数である）、
    （ｖ）（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここでｘは１の整数であり、ｎは２の整数であり、ｚは１の整数であり、ｙは１の整数である）、
    （ｖｉ）（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここでｘは１の整数であり、ｎは３の整数であり、ｚは１の整数であり、ｙは１の整数である）、
    である、請求項２に記載のコンジュゲート。
  4. モジュール及び化合物が、
    （ｉ）共有結合により互いに結合する、
    （ｉｉ）非共有結合により互いに結合する、
    （ｉｉｉ）少なくとも１つのアダプタ分子を介して互いに結合する、及び／又は
    （ｉｖ）少なくとも１つのアダプタ分子を任意で含む少なくとも１つのリンカー分子を介して互いに結合する、請求項１又は３に記載のコンジュゲート。
  5. モジュール及び化合物が互いに結合する該配置が、
    （ｉ）（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎが（ｂ）ｙと共有結合する）、
    （ｉｉ）（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎが（ｂ）ｙと非共有結合する）、
    （ｉｉｉ）（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘが（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｂ）ｙと共有結合する）、
    （ｉｖ）（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘが（ｄ）ｎと非共有結合し、（ｄ）ｎが（ｃ）ｚと非共有結合し、（ｃ）ｚが（ｂ）ｙと共有結合する）、
    （ｖ）（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する）、
    （ｖｉ）（ａ）ｘ、（ｃ）ｚ、（ｄ）ｎ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎが（ｂ）ｙと非共有結合する）、
    （ｖｉｉ）（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｄ）ｎと共有結合し、（ｄ）ｎがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する）、
    （ｖｉｉｉ）（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘが（ｄ）ｎと非共有結合し、（ｄ）ｎが（ｃ）ｚと非共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する）、又は
    （ｉｘ）（ａ）ｘ、（ｄ）ｎ、（ｃ）ｚ及び（ｂ）ｙ（ここで（ａ）ｘが（ａ）ｘと共有結合するアダプタ分子を介して（ｄ）ｎと非共有結合し、（ｄ）ｎが（ｃ）ｚと共有結合するアダプタ分子を介して（ｃ）ｚと非共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する）、
    である、請求項２〜４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  6. モジュール及び化合物が以下の配置で互いに結合する、請求項１及び４に記載のコンジュゲート：
    （ｉ）（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｄ）ｎと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｂ）ｙと共有結合する；
    （ｉｉ）（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｄ）ｎと非共有結合し、（ｃ）ｚが（ｂ）ｙと共有結合する；
    （ｉｉｉ）（ａ）ｘが（ｄ）ｎと共有結合し、（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｂ）ｙと共有結合する；
    （ｉｖ）（ａ）ｘが（ｄ）ｎと非共有結合し、（ａ）ｘが（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｂ）ｙと共有結合する；
    （ｖ）（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｄ）ｎと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する；
    （ｖｉ）（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚが（ｃ）ｚと共有結合するアダプタ分子を介して（ｄ）ｎと非共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する；
    （ｖｉｉ）（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｄ）ｎと共有結合し、（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する；又は
    （ｖｉｉｉ）（ａ）ｘが（ａ）ｘと共有結合するアダプタ分子を介して（ｄ）ｎと非共有結合し、（ａ）ｘがリンカー分子を介して（ｃ）ｚと共有結合し、（ｃ）ｚがリンカー分子を介して（ｂ）ｙと共有結合する。
  7. 共有結合が、ジスルフィド結合、アミド結合、オキシム結合又はヒドラゾン結合であり、非共有結合が、イオン結合又は疎水性結合である、請求項４〜６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  8. リンカー分子がペプチド若しくは修飾ペプチド、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と共有結合したペプチドであり、アダプタ分子が二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（ＤＲＢＰ）又はその変異体である、請求項４〜６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  9. リンカー分子が、
    （ｉ）少なくとも１つの分岐点、若しくはリジン側鎖、システイン側鎖、若しくは側鎖上にアミノオキシ部分を含有する非天然アミノ酸、及び／又は
    （ｉｉ）少なくとも１つの切断部位、若しくはフューリン切断部位若しくはカルパイン切断部位、
    を含む、請求項４〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  10. 切断部位が、モジュール（ａ）とモジュール（ｃ）との間、又はモジュール（ａ）と化合物（ｄ）との間に存在する、請求項９に記載のコンジュゲート。
  11. 化合物が、該分岐点と共有結合する、又は該リジン側鎖とのアミド結合により、該システイン側鎖とのジスルフィド結合により、若しくは側鎖上にアミノオキシ部分を含有する非天然アミノ酸を介して該分岐点と共有結合する、請求項９又は１０に記載のコンジュゲート。
  12. 化合物が、該システイン側鎖とのジスルフィド結合により共有結合したＤＲＢＤ又はその変異体とのイオン結合又は疎水性結合により該分岐点と非共有結合する、請求項９又は１０に記載のコンジュゲート。
  13. （ｉ）モジュール（ａ）が細胞表面受容体リガンド、抗体、糖、脂質又はナノ粒子を含み、
    （ｉｉ）モジュール（ｂ）がアミノ酸配列X1X2X3X4（配列番号１４０）（ここで、
    Ｘ１がＥ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ若しくはＳ、又はＫ若しくはＲであり、
    Ｘ２がＤ、Ｅ、Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｇ、Ｓ若しくはＮ、又はＤ若しくはＥであり、
    Ｘ３がＥ若しくはＤ、又はＥであり、
    Ｘ４がＬ若しくはＦ、又はＬである）を１つ又は複数含むオリゴペプチドを含み、任意でＮ末端及び／又はＣ末端が１個〜３個の更なるアミノ酸残基を含み、
    （ｉｉｉ）モジュール（ｃ）が、
    （ａ）ＣＯＸ２、ＩｇＭ（μ）、Ｓｇｋ１、ＭＡＴα２、ＭＦ（α）１、ＣＰＹ、毒素サブユニットＡ、その断片若しくはその変異体からなる群から選択されるタンパク質のペプチド、又は
    （ｂ）ＣＬ１（配列番号１６４）、ＣＬ２（配列番号１６５）、ＣＬ６（配列番号１６６）、ＣＬ９（配列番号１６７）、ＣＬ１０（配列番号１６８）、ＣＬ１１（配列番号１６９）、ＣＬ１２（配列番号１７０）、ＣＬ１５（配列番号１７１）、ＣＬ１６（配列番号１７２）若しくはＳＬ１７（配列番号１７３）を含むアミノ酸配列、
    を含み、
    （ｉｖ）化合物（ｄ）が核酸又はペプチドを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  14. （ｉ）細胞表面受容体リガンドが、成長因子、リポタンパク質、トランスフェリン、表面結合レクチン、ガレクチン、ｃ型レクチン、毒素、その断片及びその変異体からなる群から選択され、
    （ｉｉ）抗体が、抗ＴＧＮ３８／４６、抗トランスフェリン受容体及び抗成長因子受容体からなる群から選択され、
    （ｉｉｉ）脂質が、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質及びステロール脂質からなる群から選択され、
    （ｉｖ）ナノ粒子が、金属、シリケート及びポリマーからなる群から選択される、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  15. 細胞表面受容体リガンドが、リシンのＢ鎖、アブリンのＢ鎖、モデシンのＢ鎖、ボルケンシンのＢ鎖、コレラ毒素のＢ鎖、志賀毒素のＢ鎖、ベロ毒素のＢ鎖、シュードモナス外毒素ＡのドメインＩ、ドメインＩＩ及びドメインＩＶ、並びに大腸菌の易熱性腸毒素のＢ鎖からなる群から選択される毒素である、請求項１４に記載のコンジュゲート。
  16. モジュール（ｃ）が、
    （ｉ）NX1SX2X3X4X5X6X7X8X9INPTX10X11X12X13（配列番号１７８）（ここでＸ１がＡ、Ｓ又はＶであり、Ｘ２がＳ、Ａ又はＴであり、Ｘ３がＳ又はＶであり、Ｘ４がＲ、Ｈ又はＮであり、Ｘ５がＳ又はＴであり、Ｘ６がＧ、Ｒ、Ｔ又はＡであり、Ｘ７がＬ、Ｖ又はＭであり、Ｘ８がＤ、Ｎ又はＥであり、Ｘ９がＤ又はＮであり、Ｘ１０がＶ又はＬであり、Ｘ１１がＬ又はＶであり、Ｘ１２がＬ又はＩであり、Ｘ１３がＫ又はＮである）、
    （ｉｉ）GKPTLYX1VSLX2MSDTX3GTX4Y（配列番号１９０）（ここでＸ１がＮ又はＱであり、Ｘ２がＩ又はＶであり、Ｘ３がＧ又はＡであり、Ｘ４がＣ又はＳである）、
    （ｉｉｉ）MTX1X2X3X4EX5X6X7X8X9X10X11LTYSX12X13RGX14VAX15LX16AFMKQRX17MGLNDFIQKX18X19X20NX21YACKHX22EVQSX23LX24X25（配列番号２００）（ここでＸ１がＶ又はＩであり、Ｘ２がＫ又はＱであり、Ｘ３がＡ又はＴであり、Ｘ４がＸ（Ｘは０個のアミノ酸である）又はＡであり、Ｘ５がＡ又はＴであり、Ｘ６がＡ又はＳであり、Ｘ７がＲ、Ｋ、Ｇ又はＶであり、Ｘ８がＳ、Ｇ又はＰであり、Ｘ９がＴ、Ｐ又はＡであり、Ｘ１０がＸ又はＰであり、Ｘ１１がＸ又はＤであり、Ｘ１２がＲ又はＫであり、Ｘ１３がＭ又はＴであり、Ｘ１４がＭ又はＬであり、Ｘ１５がＩ又はＮであり、Ｘ１６がＩ又はＳであり、Ｘ１７がＲ又はＫであり、Ｘ１８がＩ又はＬであり、Ｘ１９がＡ又はＳであり、Ｘ２０がＳ、Ｎ、Ａ又はＴであり、Ｘ２１がＴ又はＳであり、Ｘ２２がＡ、Ｐ又はＴであり、Ｘ２３がＩ又はＹであり、Ｘ２４がＫ又はＮであり、Ｘ２５がＭ、Ｉ又はＬである）、
    （ｉｖ）MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVX1TTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFSX1STNNGLLFIX1TTIASIAAKEEGVSLDKREAEAWHWLQLKPGQPMYKREAEAEAWHWLQLKPGQPMYKREADAEAWHWLQLKPGQPMYKREADAEAWHWLQLKPGQPMY（配列番号２２０）（ここでＸ１がＮ又はＱである）、並びに
    （ｖ）MNKIPIKDLLNPQITDEFKSSILDINKKLFSICCNLPKLPESVTTEEEVELRDILX1FLSRAN（配列番号２１４）（ここでＸ１がＧ、Ｖ又はＬである）、
    からなる群から選択される、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  17. モジュール（ｃ）が、
    （ｉ）NASSSRSGLDDINPTVLLK（配列番号１７６）、
    （ｉｉ）NASASHSRLDDINPTVLIK（配列番号１７９）、
    （ｉｉｉ）NASSSHSGLDDINPTVLLK（配列番号１８０）、
    （ｉｖ）GKPTLYNVSLIMSDTGGTCY（配列番号１８４）、
    （ｖ）GKPTLYNVSLVMSDTAGTCY（配列番号１８５）、
    （ｖｉ）GKPTLYQVSLIMSDTGGTCY（配列番号１８６）、
    （ｖｉｉ）GKPTLYQVSLIMSDTGGTSY（配列番号１８７）、
    （ｖｉｉｉ）MTVKAEAARSTLTYSRMRGMVAILIAFMKQRRMGLNDFIQKIASNTYACKHAEVQSILKM（配列番号１９３）、
    （ｉｘ）MTVKTEAAKGTLTYSRMRGMVAILIAFMKQRRMGLNDFIQKIANNSYACKHPEVQSILKI（配列番号１９７）、
    （ｘ）MNKIPIKDLLNPQITDEFKSSILDINKKLFSICCNLPKLPESVTTEEEVELRDILGFLSRAN（配列番号２１２）、
    （ｘｉ）MNKIPIKDLLNPQITDEFKSSILDINKKLFSICCNLPKLPESVTTEEEVELRDILVFLSRAN（配列番号２１５）、又は
    （ｘｉｉ）MNKIPIKDLLNPQITDEFKSSILDINKKLFSICCNLPKLPESVTTEEEVELRDILLFLSRAN（配列番号２１６）、
    である、請求項１６に記載のコンジュゲート。
  18. モジュール（ｃ）が、
    （ｉ）MRGMVAILIAFMKQRRMGLNDFIQKIASNTYACKHAEVQSILKM（配列番号２０５）、
    （ｉｉ）MRGMVAILIAFMKQ（配列番号２０６）、
    （ｉｉｉ）GMVAILIAF（配列番号２０７）、
    （ｉｖ）MRGMVAILIAFMKQRRMGLNDFIQKIANNSYACKHPEVQSILKI（配列番号２１０）、
    （ｖ）ITDEFKSSILDINKKLFSI（配列番号２１７）、又は
    （ｖｉ）ITDEFKSSILDINKKLFSICCNLPKLPESV（配列番号２１８）、
    である、請求項１７に記載のコンジュゲート。
  19. 核酸が、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又はモルホリノ修飾ｉＲＮＡである、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  20. 核酸が化学修飾されている、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  21. 医薬品として使用される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  22. 医薬組成物であって、
    （ｉ）請求項１〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、
    （ｉｉ）薬学的に許容可能な賦形剤、担体及び／又は希釈剤と、
    を含む、医薬組成物。
  23. 細胞に化合物（ｄ）を送達する方法であって、
    （ａ）細胞を準備する工程と、
    （ｂ）化合物（ｄ）を含む請求項１〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲートを前記細胞に、該細胞により該コンジュゲートが内部移行され、それにより該化合物（ｄ）が該細胞に送達される条件下で接触させる工程と、
    を含む、細胞に化合物（ｄ）を送達する方法。
  24. 細胞が、真核細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、線形動物細胞、真菌細胞、アスペルギルス属の細胞、酵母細胞、サッカロミセス属の細胞、ピチア属の細胞、昆虫細胞、Ｓｆ９細胞、動物細胞、非ヒト動物細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ＣＨＯ、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、ヒト細胞又は植物細胞である、請求項２３に記載の方法。
  25. 患者に化合物（ｄ）を送達する方法であって、
    （ａ）十分量の請求項１〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲートを患者に投与し、それにより該化合物（ｄ）が該患者に送達される、投与する工程を含む、患者に化合物（ｄ）を送達する方法。
  26. 細胞における遺伝子発現を変更する方法であって、
    （ａ）細胞を準備する工程と、
    （ｂ）化合物（ｄ）を含む請求項１〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲートを前記細胞に、該細胞により該コンジュゲートが内部移行され、該コンジュゲートの該化合物（ｄ）が該細胞のサイトゾル又は核に送達される条件下で接触させる工程であって、該化合物（ｄ）が該細胞における遺伝子発現を変更することが可能な核酸又はペプチドである、接触させる工程と、
    を含み、
    （ｃ）該化合物（ｄ）が、該細胞のサイトゾル又は核に達すると、該細胞における遺伝子発現を変更する、
    細胞における遺伝子発現を変更する方法。
  27. コンジュゲートを調製する方法であって、細胞の標的化を媒介し、細胞取り込みを容易にする少なくとも１つのモジュール（ａ）と、小胞体（ＥＲ）への輸送を容易にする少なくとも１つのモジュール（ｂ）と、ＥＲからサイトゾルへの転位を媒介する少なくとも１つのモジュール（ｃ）と、少なくとも１つの化合物（ｄ）とをカップリングすることを含み、モジュール（ａ）、モジュール（ｂ）及びモジュール（ｃ）並びに化合物（ｄ）が任意の配置で及び任意の化学量論で互いに結合する、コンジュゲートを調製する方法。
  28. 請求項１〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲートを調製するための構成要素を含むキットであって、該キットがモジュール（ａ）、モジュール（ｂ）、モジュール（ｃ）及び／又は化合物（ｄ）を含み、該キットが任意的なペプチドリンカー及び／又は切断部位を含む任意的なペプチドを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲートを調製するための構成要素を含むキット。
  29. 請求項１〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む送達システムを含むキット。
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