JP2018529386A - リボ核酸の生物活性を保存する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
T7駆動性dsRNA発現カセットを含有するプラスミドをHT115(DE3)大腸菌(E.coli)細胞内に形質転換した。
土壌安定性アッセイにおいて。活性土壌環境中の細菌産生dsRNAの安定性に対するグルタルアルデヒドの添加の効果を評価した。コーンルートワーム標的Dvs006.5に対するdsRNAを含有する細菌培養物を生成させた。熱処理したDvs006.5サンプルは0時点及び12時間後では目に見えたが、dsRNAは急速に分解し、24時間後のゲルでは見えなかった(図1−A)。細菌溶解物の土壌安定性に対するグルタルアルデヒドの効果を評価するために、不活性化細菌ブロスを異なる量のグルタルアルデヒドと混合することにより異なるアリコートを調製した。このアッセイでは、23%、7%、2.3%、0.7%及び0.2%の最終濃度に達するようにグルタルアルデヒドを添加した(図1−B)。サンプルを土壌に適用し、25℃で0、12、24、48、72、96、120及び144時間インキュベートした。次に、RNA抽出及びその後のLiCl沈殿を用いて、dsRNAを記載されるように抽出した。
図1:土壌へ暴露した後の細菌産生dsRNAの定性的評価。(A)0、12、24、48又は72時間の土壌曝露後の熱的不活性化された細菌産生dsRNA。(B)0、12、24、48、72、96、120及び144時間の土壌曝露後の、23%、7%、2.3%、0.7%及び0.2%のグルタルアルデヒドが補充された、熱的不活性化された細菌産生dsRNA。サンプルをマーカー(M;1kbラダー)と比較した。白色矢印は、無傷のdsRNAに相当するバンドを示す。
Claims (14)
- 標的生物内の遺伝子の発現を転写後に停止させるために、細胞溶解物中に存在するdsRNAの生物活性を実質的に保持するか又は他に保存する方法であって、タンパク質架橋剤又はアミン架橋剤の機能を有する化合物を前記溶解物に添加する工程を含む方法。
- 前記架橋剤が、前記溶解物が形成されるときに前記細胞へ添加されるか、又は前記溶解物が形成された後に前記溶解物へ添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記架橋剤が、前記溶解物が投与される場所へ添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記架橋剤が、前記溶解物の投与前に前記場所へ添加される、請求項3に記載の方法。
- 前記場所が、土壌である、請求項3に記載の方法。
- 前記架橋剤が、ポリアルデヒド、ジアルデヒド、ジエポキシド、ポリエポキシド、ピリジルジスルフィド、多官能性カルボジイミド、多官能性マレイミド、多官能性イミドエステル、多官能性n−ヒドロキシスクシンイミドエステル及び多官能性ハロアセタールからなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記架橋剤が、グルタルアルデヒドである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記溶解物が調製される前記細胞が、熱的不活性化によって任意に事前に不活性化された細菌細胞である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、転写されたときに、二本鎖RNAであって、その少なくとも一部が、真核生物細胞内の遺伝子のmRNAの配列と実質的に同一である配列を含む二本鎖RNAをもたらすDNA配列を含むように操作されている、請求項8に記載の方法。
- 真核生物が、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ(Diabrotica virgifera virgifera)(ウェスタンコーンルートワーム)、ディアブロティカ・バルベリ(Diabrotica barberi)(ノーザンコーンルートワーム)、ディアブロティカ・ウンデキムプンクタタ・ホワルディ(Diabrotica undecimpunctata howardi)(サザンコーンルートワーム)、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ(Diabrotica virgifera zeae)(メキシカンコーンルートワーム)、ディアブロティカ・スペキオサ(Diabrotica speciosa)(ウリムシ)からなる群から選択される昆虫、線虫、ハリガネムシ及び地虫、ならびに細菌及び真菌などの適切な土壌病原体である、請求項9に記載の方法。
- 前記溶解物が、細菌細胞の溶解物であり、前記架橋剤が、グルタルアルデヒドであり、前記グルタルアルデヒドが、前記溶解物の体積に関して0.7〜0.2%の量で土壌に適用され、前記生物活性が、少なくとも14日間の期間中に実質的に保持される、請求項1に記載の方法。
- 細胞溶解物及びタンパク質架橋剤を含む物質の組成物であって、土壌を含み、前記溶解物が、dsRNAを含み、かつ前記架橋剤が、グルタルアルデヒドであることを特徴とする組成物。
- 細胞内で異種的に発現されたdsRNAの生物活性を保持する目的で添加されたタンパク質架橋剤を含む細胞溶解物。
- 細胞溶解物中に存在するdsRNAの生物活性を実質的に安定化するか又は他に保存するための、タンパク質架橋剤又はアミン架橋剤の使用。
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