WO2006093083A1 - 架橋剤、架橋法、遺伝子発現調節法及び遺伝子機能調査法 - Google Patents

架橋剤、架橋法、遺伝子発現調節法及び遺伝子機能調査法 Download PDF

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WO2006093083A1
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carbon
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Toshiaki Furuta
Natsuyo Imaizumi
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Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
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    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention has the following configuration.
  • a method for investigating gene function including the following steps.
  • FIG. 1 shows the results of electrophoresis of each sample obtained in Example 4.
  • FIG. 4 shows the expression level of EGFP in each sample as a relative value when the expression ratio obtained when co-transformed EGFP and DsRed obtained in Example 7 is 100%.
  • FIG. 6 shows the results of observation of fluorescent images of EGFP and DsRed in cells obtained in Example 8.
  • FIG. 7 shows the expression level of EGFP in each sample as a relative value when the expression ratio when co-transformed EGFP and DsRed obtained in Example 9 is 100%.
  • FIG. 8 shows the results of Western plot obtained in Example 10.
  • FIG. 9 shows the expression level of EGFP in each sample as a relative value when the expression ratio when co-transformed EGFP and DsRed obtained in Example 10 is 100%.
  • the lower limit of the distance of the leaving group of the photodegradable protecting group bonded to both ends is usually 8A or more, preferably 15A.
  • the distance of the leaving group of the photodegradable protecting group is usually 8A or more, preferably 15A or more, more preferably 25A or more, and the upper limit is usually 50A or less, preferably 35A or less.
  • the lower limit of the distance of the leaving group of the photodegradable protecting group bonded to both ends is usually 10 A or more, preferably Is 25A or more, and the upper limit is usually 100A or more, preferably 80A or more.
  • the compound of the present invention is represented by the general formula (1).
  • photodegradable protecting groups represented by the following general formulas (3), (3 '), (3 ") and (3"') can be mentioned.
  • Ci group 1-20 carbon thioalkoxy group, 1-20 carbon alkylsulfol group, 4-16 carbon arylol group, total number of carbon and heteroatoms 2-20 heteroalkyl Total number of groups, carbon and heteroatoms 2-20 heteroalkyl groups, 3-8 carbon cycloalkyl groups, 3-8 carbon cycloalkyl groups, 4-16 carbon aryl groups, carbon And the total number of heteroatoms 4-16 heteroaryl groups, the total number of carbon and heteroatoms 2-30 heterocyclyl groups are substituted or unsubstituted functional groups, X 1 and A, X 2 and A or X 1 and Y 2 together — 0— (CH 2) — 0— group, —C— (CH 2) — 0— group, — 0—
  • n 1 or 2.
  • R 24 and R 25 are hydrogen atoms R 22 and R 23 may be joined together to form a (CH 2) — group.
  • R 23 and R 24 together — — (CH) — 0— group, (CH) — C group and — (CH) — N—
  • R 3 ° and R 34 may be combined together — (CH) — O group, (CH) — C—
  • examples of the substituent include a carboxyl group, a hydroxyl group, a sulfonic acid group, such as a methyl group, an ethyl group, an npropyl group, an isopropyl group, an nbutyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, and a tert-butyl group.
  • C1-C4 lower alkyl group such as butyl group, for example, fluoromethyl group, difluoromethyl group, trifluoromethyl group, chloromethyl group, dichloromethyl group, trichloromethyl group, bromomethyl group, dibromomethyl group, tribromomethyl Group, odomethyl group, jodomethyl group, triodomethyl group, trifluoroethyl group, trichloroethyl group, tribromoethyl group, pentafluoroethyl group, pentachloroethyl group, pentabromoethyl group, heptafluoropropyl Group, heptachloropropyl group, nonafluorobutyl group, nonachlorobutyl group Halo-lower alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms, such as methoxy group, ethoxy group, n-propoxy group, isopropoxy group, n butoxy group,
  • leaving group is a group capable of leaving from a substrate (compound to which the leaving group is bound) together with a covalently bonded electron pair between the leaving group and the substrate (compound to which the leaving group is bound).
  • Preferred leaving groups include groups in which the electron pair is stabilized by the presence of electron withdrawing, aromatic, resonant structures, or combinations thereof, such as halides, carboxylates, carbonates, and the like. Examples thereof include a group having a salt, amide, carbamate, phosphate, sulfonate, amide aryloxide or thiolate group bonded thereto.
  • the alkoxy group may be linear, branched or cyclic, but is preferably a linear one, usually having 1 to 20 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms.
  • substituent of the substituted aryloxy group examples include a neurogen atom (F, Cl, Br or I), a -tro group, a perfluoroalkyl group having 1 to 3 carbon atoms (a trifluoromethyl group, Pentafluoroethyl group, heptafluoropropyl group) and the like.
  • the alkyl group having 1 to 20 carbon atoms represented by R 21 in the general formula (3 ") and the alkyl group having 1 to 20 carbon atoms represented by R 3Q in the general formula (3"') are linear It may be in the form of a chain or a branch, but a straight chain is preferred, and a C1-C5 is preferred.
  • etule 1-probe, 2-probe, 1-methyl-2-propenore, 1-methinore 1-propenore, 2-methinore 1-prop Ninole, 2-Methylol 2-Propenyl, 2-Ethyl-2-Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 1-Methyl Lou 2-Butenyl, 1-Methyl-1-Butenyl, 3-Methyl-2-Butenyl, 1-Yeth Lou 2-butenyl, 3-butenyl, 1-methyl-3-butenyl, 2-methyl-3-butenyl 1-ethyl 3-butenyl, 1-pentyl, 2-pentyl, 1-methyl 2-pentenyl, 2-methyl-2-pentenyl, 3-pentenyl, 1-methyl-3-pentenyl, 2-methyl-3-pentenyl, 4-pentenyl, 1 -Methyl-4 pentenyl, 2-methenole 4 pentenole, 1 hex
  • the 20 alkylsulfonyl group may be linear, branched or cyclic, but is preferably linear, and preferably has 2 to 5 carbon atoms.
  • R 4 to C 16 allylsulfol groups represented by R U to R 16 carbon numbers represented by R 21 to R 23 in general formula (3 ') 4-16 aryl group, represented by R 21 in general formula (3 ′ ′) 4-16 aryl group and general formula (3 ′′ ′), V and R 3Q
  • the arylsulfonyl group having 4 to 16 carbon atoms may be monocyclic or condensed polycyclic, and preferably has 5 to 14 carbon atoms.
  • the total number of carbon and heteroatoms represented by R U to R 16 is 2-20 heteroalkyl groups, represented by R 21 to R 23 in the general formula (3 ').
  • the total number of carbon and heteroatoms represented by R 3Q is 2-20 heteroalkyl groups having at least one heteroatom selected from 0, S, N and P forces as the main chain residue.
  • the number of heteroatoms contained is 1 to 5.
  • the total number of carbon and heteroatoms represented by R U to R 16 is 2-20 heteroalkyl groups, and in the general formula (3 '), R 21 to R 23
  • the total number of carbon and heteroatoms represented by R 3Q in general formula (3 "') 2-20 heteroalkenyl groups are mainly composed of at least one heteroatom selected from 0, S, N and P
  • a alkenyl group as described above or a cycloalkenyl group described later, which is included in the chain residue, may be linear, branched or cyclic, and preferably has a total number of carbon and heteroatoms of 2 to 10.
  • cyclopropyl group examples include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl group, a cyclooctyl group, and the like.
  • the 3-8 carbon cycloalkenyl group represented by 3Q is a cycloalkyl group containing a double bond, and preferably has 5 to 14 carbon atoms.
  • cyclopentale methylcyclopentale, cyclohexene, methinorecyclohexenore, dimethinorecyclohexenore, ethinorecyclohexenore, butinorecyclohexenore, cycloheptenore, cyclodecenole, cyclodeninole A dodecenyl group etc. are mentioned.
  • the 16 aryl group, the 4-16 carbon atom group represented by R 21 in the general formula (3 "), and the 4-16 carbon atom group represented by R 3Q in the general formula (3"') Aromatic monocyclic or condensed polycyclic, preferably those having 5 to 14 carbon atoms.
  • the photodegradable protecting groups Q 1 and Q 2 may be the same or different.
  • ⁇ is a halogen atom, an imidazolyl group or a 4-nitrophenoxy group
  • Q, A, Y is a halogen atom, an imidazolyl group or a 4-nitrophenoxy group
  • halogen atom represented by Zeta 11 in the general formula (5), F, Cl, is Br or I mentioned It is done.
  • Q is —0—
  • A is a bond bonded to A 1 or Z and A 2 in the general formula (1)
  • X 2 is —H
  • Y 1 is —H
  • Y 2 is —H
  • Z is — OC (O) — (4-diphenyl), — OC (0) 0— (4--trope), — NR 15 C (0) R 16 , — OC ( Particularly preferred are those in which 0) NR 15 R 16 , —OP (0) R 15 R 16 , —OC (0) Z U or M 2 ⁇ N.
  • the photodegradable protecting group of the present invention as described above is disclosed in, for example, WO00 / 31588 International Publication Pamphlet, JP 2002-315576, T. Furuta, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , USA., Vol. 96, pp. 1193-1200, February 1999, Chemistry, Neurobiology, RS Givens, CH Park, Tetrahedron Lett. 37, 6259-6262 (1996), CH Park, RS Givens, J. Am. Chem. Soc. 119, 2453-2463 (1997), J. Engels, EJ Schlaeger. J. Med. Chem. 20, 907 (1977), JH Kaplan, G.
  • the structural part represented by — ⁇ 1 —! 4 — ⁇ — is a part of the linker for binding the photodegradable protecting group represented by Q 1 and Q 2 .
  • ⁇ 1 of a part of the linker is bonded to the photodegradable protective group Q 1 as described above, and ⁇ 2 is bonded to the photodegradable protective group Q 2 as described above, whereby two photodegradable protective groups are bonded.
  • any one of 1 , R 26 , R 2 R 28 and R 29 in the general formula (3") becomes a bond and A 1 or / and A 2 of the linker part binds to the site.
  • R 28 is preferably a bond, and A 1 or Z and A 2 as a part of the linker are bonded to the R 28 site.
  • any one of R 3 °, R 32 , R 33 , R 34 and R 35 in the general formula (3"') is bonded.
  • a 1 or Z and A 2 of a part of the linker bind to the site by hand.
  • R 3Q is preferably a bond, and A 1 or Z and A 2 of the linker are bonded to the R 3Q position.
  • the length of a part of the linker is, for example, a lower limit is usually 2 A or more, preferably 9 A or more, and an upper limit is usually 94 A or less, preferably 74 A or less.
  • the lower limit of the length of some linkers is usually 2A or more, preferably 9A or more, More preferably, it is 19 A or more, and the upper limit is usually 44 A or less, preferably 29 A or less.
  • the lower limit of the length of some linkers is usually 4A or more, preferably 19A or more, and the upper limit is Usually 94 A or more, preferably 74 A or more.
  • the alkylene group represented by AA 2 and T 1 may be linear, branched or cyclic, and usually has 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 8 carbon atoms.
  • methylene group ethylene group, methylmethylene group, ethethyleneethylene group, trimethylene group, propylene group, tetramethylene group, butylene group, 1-methyltrimethylene group, 2-methyltrimethylene group, pentamethylene group, Pentylene group, 2,2-dimethylpropylene group, 2-methylpropylene group, 2-ethylpropylene group, 1-methyltetramethylene group, 2-methyltetramethylene group, 1,1-dimethylethylene group, 1,2 -Dimethylethylene group, 1,3 dimethyltrimethylene group, 2,2 dimethyltrimethylene group, 2 ethyltrimethylene group, hexamethylene group, hexylene group, heptylene group, octylene group, 2-ethylhexylene group, Nonamethylene group, norene group, decamethylene group, decylene group, 1,4 dimethyltetramethylene group, 2,3 dimethyltetra Tylene group, 1, 2, 3
  • Ariren group in the general formula (1) indicated by T 1 is a monocyclic, fused polycyclic, or non-fused either Yogu usual number of carbon atoms in the polycyclic 5-14 can be mentioned.
  • Ararukiren group represented by T 1 in the general formula (1) include a group formed by combining an alkylene group and Ariren group, in Yogu usually 7 to 10 carbon atoms in the branched be linear is there.
  • Formula alkylene group containing a hetero atom indicated (1) in at T 1 Ararukiren group containing a heteroatom heteroatom to including Ariren group or an alkylene group such as described above, the Ariren group and Ararukiren group A carbon atom at any position substituted by a divalent group having a heteroatom, in other words, a group having a heteroatom at any position in the chain of an alkylene group, arylene group or aralkylene group as described above; It contains a valent group and has no or very low reaction activity with respect to the leaving group, phosphoric acid, carboxyl group, hydroxyl group, amino group, etc. shown by ⁇ .
  • the lower limit of the number of atoms constituting the main chain in A 1 —! 4 — A 2 — is usually 5 or more, preferably 7 or more, and the upper limit is usually 80. In the following, preferably 70 or less.
  • a 3 and A 4 are each independently an alkylene group, 1 0—, — NR 1 —, — 0— CO 1, 1 C 0— 0—, 1 C— 0— C, 1 NR 2 —C 00— 1C0—NR 2 —, 1 NR 3 —C0 —, —CO—NR 3 or — 0—COO— (Ri to R 3 are the same as above), T 2 and T 3 are independent of each other.
  • An alkylene group, E represents a bond, a nitrogen atom, a sulfur atom, an oxygen atom, 0—C 0— or —CO—0—.
  • P is an integer greater than 1, and p (T 2 — E) — may be the same or different.
  • the alkylene group represented by A 3 , A 4 , T 2, and T 3 may be linear, branched, or cyclic, and usually has 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 8 carbon atoms. It is done. Specific examples are: It is the same as the alkylene group represented by AA 2 and T 1 above.
  • the lower limit of ⁇ is 1 or more, and the upper limit is usually 6 or less, preferably 4 or less, more preferably 2 or less.
  • [rho number one (f-E) -! Is may be the same or different, bonded to the A 3 (adjacent) to T 2 are are preferably of those the same as T 3 /,.
  • Some of the above linkers are the atoms that make up the main chain of — A 3 — (T 2 — E) —T 3 —A 4 —
  • the lower limit of the number is usually 5 or more, preferably 7 or more, and the upper limit is usually 80 or less, preferably 70 or less.
  • Ri to R 3 are as described above, and m represents an integer of 3 or more.
  • two R 1 s may be the same or different.
  • Two R 2 s may be the same or different.
  • Two R 3 s may be the same or different.
  • the compound (crosslinking agent) of the present invention has a photodegradable protecting group bonded to both ends of the linker, and is represented by the general formula (1), preferably the general formula (2). It is a compound.
  • crosslinking agent those that bind to the phosphate group of the target object (nucleic acid, protein or polypeptide) and crosslink the target object include, for example, the following general formula (7) The thing shown by is mentioned.
  • crosslinking agents those which bind to the carboxyl group, hydroxyl group or amino group of the target object (nucleic acid, protein or polypeptide) to crosslink the target object include, for example, the following general formula: The thing shown by (8) is mentioned.
  • crosslinking agents those which bind to the phosphate group and carboxyl group, hydroxyl group or amino group of the target object (nucleic acid, protein or polypeptide) to crosslink the target object, ie
  • One of the two photodegradable protecting groups is bonded to the phosphate group of the target object, and the other is bonded to the carboxyl group, hydroxyl group or amino group of the target object, thereby cross-linking the target object.
  • the following general formula (9) Can be mentioned.
  • the compound (crosslinking agent) of the present invention represented by the general formula (1) can be easily synthesized, for example, according to the following synthesis scheme.
  • the compound of the present invention (crosslinking agent) has a group capable of binding to a group selected from the group such as a phosphate group, a carboxyl group, a hydroxyl group and an amino group in the photodegradable protective group.
  • the target object (nucleic acid, protein or polypeptide) constituting the complex according to the present invention binds to a group selected from among a phosphate group, a carboxyl group, a hydroxyl group and an amino group according to the present invention.
  • the composite can be crosslinked.
  • the complex according to the present invention (two target objects constituting the complex) is bonded to the compound (cross-linked) of the present invention via its phosphate residue, carboxyl group, hydroxyl group or amino group.
  • Agent a group, preferably a compound represented by the general formula (1), more preferably a compound represented by the general formula (2), more preferably a general formula (6 It is characterized by being crosslinked with a compound represented by
  • DNA synthesized by a known amplification method such as plasmid DNA, genomic DNA, PCR or the like
  • DNA such as cDNA
  • RNA such as mRNA or antisense RNA
  • cyclic nucleotide force or the like is also selected.
  • examples include those having two nucleic acid forces (for example, double-stranded DNA, double-stranded RNA, DNA-RNA hybrid, etc.). Of these, double-stranded RNA is preferred.
  • the polypeptide to be crosslinked is not particularly limited as long as it can form a complex with a nucleic acid as described above, or can form a complex with another polypeptide or protein.
  • examples include PKC ⁇ VI-2 inhibitor peptide, RGD peptide, Zn finger peptide, leucine zipper peptide, bHLH peptide and the like.
  • the compound (crosslinking agent) of the present invention and the complex according to the present invention are brought into contact with each other. Just do it.
  • the method for bringing the compound of the present invention (crosslinking agent) into contact with the complex according to the present invention include, for example, a solution containing the compound of the present invention (crosslinking agent) and a solution containing the complex according to the present invention.
  • the lower limit is usually 1 hour or more, preferably 4 hours or more, more preferably 8 hours or more, the upper limit is 36 hours or less, preferably 24 hours or less, and the lower limit is usually 10 ° C or more, preferably Is 15 ° C or higher, more preferably 20 ° C or higher, and the upper limit is usually 40 ° C or lower, preferably 35 ° C or lower, more preferably 25 ° C or lower!
  • the other target object (nucleic acid, protein or polypeptide) to be formed has a reactive group to which the other of the two photodegradable protecting groups of the compound of the present invention (crosslinking agent) can bind (for example, Phosphate group, carboxyl group, hydroxyl group and amino A group selected from the group).
  • crosslinking agent for example, Phosphate group, carboxyl group, hydroxyl group and amino A group selected from the group.
  • the complex according to the present invention obtained by binding the compound of the present invention (crosslinking agent) obtained as described above is generally subjected to a purification method known per se such as column chromatography and unreacted. It is desirable to remove the compound of the present invention (crosslinking agent) and purify the complex according to the present invention to which the compound of the present invention (crosslinking agent) is bound.
  • a complex according to the present invention to which the compound of the present invention (crosslinking agent) is bound (crosslinked), that is, the compound of the present invention (crosslinking agent) is bound (by Cross-linked) double stranded nucleic acids, nucleic acid protein complexes, nucleic acid polypeptide complexes, two proteins, protein-polypeptide complexes, and two polypeptides are also included.
  • the compound of the present invention crosslinking agent crosslinks the complex according to the present invention, whereby the complex according to the present invention, that is, double-stranded DNA, double-stranded RNA, DNA-RNA hybrid, etc. Double-stranded nucleic acid, nucleic acid protein complex, nucleic acid polypeptide complex, protein complex, The function originally possessed by the polypeptide complex or protein polypeptide complex is suppressed.
  • the complex according to the present invention is a nucleic acid protein complex
  • transcription of a nucleic acid molecule downstream of the nucleic acid molecule is suppressed or activated in a host having a transcription system, and as a result, gene expression is suppressed or activated. Activated.
  • the complex according to the present invention is a nucleic acid polypeptide complex
  • transcription of a nucleic acid molecule downstream of the nucleic acid molecule is suppressed or activated in a host having a transcription system, resulting in gene expression. Is suppressed or activated.
  • the function of the protein is suppressed or activated in the cell.
  • the composite according to the present invention cross-linked by the compound of the present invention is irradiated with light such as ultraviolet rays or visible light from the composite according to the present invention.
  • the compound (crosslinking agent) can be eliminated. Thereby, the function suppression of the complex according to the present invention can be released.
  • the complex according to the present invention crosslinked by the compound of the present invention has a function that the complex originally has been suppressed, but the complex according to the present invention and the present complex are irradiated with light. Since the bond with the compound (crosslinking agent) of the invention is lost (because the crosslinking with the compound (crosslinking agent) of the invention is lost), the function of the complex is restored.
  • the light irradiated in the present invention means an electromagnetic wave having a wavelength range of about 1 to 900 nm longer than X-rays.
  • light on the long wavelength side for example, in the range of 350 to 400 nm is preferable, and light having a wavelength of about 365 ⁇ 6 nm is more preferable.
  • the lower limit of light of 4 mj / cm 2 s is 1 minute or more
  • the upper limit is usually 10 minutes or less, preferably 3 minutes or less, or light of 376 mj / cm 2 s
  • the lower limit is usually 0.1 seconds or longer, preferably 1 second or longer
  • the upper limit is usually 30 seconds or shorter, preferably 10 seconds or shorter.
  • the function of the complex according to the present invention can be controlled at any time and place.
  • Recovery in other words, the function of the complex according to the present invention can be controlled at any time and place.
  • double-stranded nucleic acid such as double-stranded DNA, double-stranded RNA, DNA-RNA hybrid, nucleic acid protein complex, nucleic acid polypeptide complex, protein complex, polypeptide complex, or protein polypeptide complex It is possible to specifically express an unknown function possessed at an arbitrary time, to be expressed specifically at an arbitrary place, or to be expressed specifically at an arbitrary time and place.
  • crosslinking agent crosslinking agent
  • crosslinking method using the same can be used for purposes other than those described above.
  • the complex according to the present invention has a medicinal effect (for example, a so-called RNAi drug using RNAi)
  • the complex is crosslinked with the compound of the present invention (crosslinking agent) to suppress the medicinal effect.
  • crosslinking agent for example, a so-called RNAi drug using RNAi
  • irradiation with light can restore the suppressed medicinal effect and treat the disease.
  • this method by controlling the range and time of light irradiation, a specific medicinal effect is produced at a specific target site (lesion, etc.) or a medicinal effect is produced at an arbitrary time (time). It becomes possible.
  • the compound (crosslinking agent) of the present invention and the crosslinking method using the compound are useful for various applications as described above, and particularly useful for RNAi methods using double-stranded RNA.
  • the gene expression regulation method of the present invention is characterized by irradiating light to the double-stranded RNA to which the compound of the present invention (crosslinking agent) as described above is bound in advance.
  • RNA gene expression inhibitory action decomposition action of target mRNA complementary to the double-stranded RNA. That is, by binding the double-stranded RNA (siRNA) by binding the compound of the present invention (cross-linking agent) to double-stranded RNA (siRNA) against a predetermined gene (target mRNA), the cell or organism can be cross-linked.
  • the gene (target mRNA) can be expressed.
  • the compound (crosslinking agent) of the present invention is eliminated from the complex by irradiating the double-stranded RNA crosslinked with the compound (crosslinking agent) of the present invention with light, and is suppressed. It is possible to restore the gene expression inhibitory action of double-stranded RNA (decomposition action of target mRNA complementary to the double-stranded RNA) and, as a result, suppress the expression of the gene (target mRNA). it can. As a result, the expression of a specific gene (target mRNA) can be regulated (controlled) at an arbitrary time and place.
  • the gene expression regulation method of the present invention is a double-stranded gene used in comparison with a gene expression regulation method known per se using a double-stranded RNA, such as an RNAi method using a double-stranded RNA.
  • a gene expression regulation method known per se using a double-stranded RNA such as an RNAi method using a double-stranded RNA.
  • crosslinking agent When RNA is pre-crosslinked with the compound of the present invention (crosslinking agent) and gene expression is regulated, that is, when the expression of the gene is suppressed, double-stranded RNA crosslinked with the compound of the present invention (crosslinking agent) is added. Except for irradiating light, materials, reagents, etc. that can be used according to a method known per se can be used as well.
  • the gene expression regulation method of the present invention comprises the following steps (a) to (c).
  • Uridine or cytidine for example adenosine and guanosine modified at position 8 such as 8-bromoguanosine, diazanucleotides such as 7-diaza adenosine, eg O and N alkylated nucleotides such as N6-methyladenosine), sugars Modified ribonucleotide (eg H, OR, halogen atom, SH, SR 41 , NH
  • Atoms that are F, Cl, Br or I backbone modified ribonucleotides (eg, adjacent A phosphoester group that binds to the ribonucleotide to be substituted, for example, with a phosphothioate group-modifying group), and a ribonucleotide combined with these.
  • the double-stranded RNA sequence used in the method of the present invention must have sufficient identity to the target mRNA.
  • this sequence has at least 50%, preferably at least 70%, more preferably at least 85%, particularly preferably 100% identity to the target mRNA in the double-stranded portion of the double-stranded RNA Is.
  • the length of the double-stranded RNA is not particularly limited as long as it is a length capable of mediating RNAi (having the ability to generate RNAi).
  • each RNA strand has a lower limit of usually 19 bases or more, preferably 20 bases or more, more preferably 25 bases or more, and an upper limit of usually 1500 bases or less, preferably 1000 bases or less.
  • the length is preferably 500 bases or less.
  • the upper limit is preferably 30 bases or less, more preferably 27 bases or less.
  • double-stranded RNA examples include those described in JP-T 2003-529374, JP-T 2004-526422, JP-T 2002-516112, JP-A 2004-261002, and the like.
  • the double-stranded RNA as described above is usually used in this field, and is a method known per se [eg, Special Table 2003-529374, Special Table 2004-526422, Special Table 2002-516112, Special No. 2004-26 1002 etc.], and can also be obtained by using a commercially available kit.
  • Double-stranded RNA generally has a lower limit of usually 1 ⁇ m or more, preferably 10 ⁇ m or more, more preferably 20 ⁇ m or more in an appropriate solvent, and an upper limit of usually 100 ⁇ m or less. It is prepared as a double-stranded RNA-containing solution having a concentration of preferably 50 ⁇ or less, more preferably 30 ⁇ or less.
  • the solution containing the compound of the present invention (crosslinking agent) and double-stranded RNA are contained.
  • the lower limit is usually 1 hour or more, preferably 4 hours or more, more preferably 8 hours or more
  • the upper limit is 36 hours or less, preferably 24 hours or less
  • the lower limit is usually 10 ° C.
  • the reaction may be performed at 15 ° C or higher, more preferably 20 ° C or higher
  • the upper limit is usually 40 ° C or lower, preferably 35 ° C or lower, more preferably 25 ° C or lower.
  • crosslinking agent As the compound (crosslinking agent) of the present invention used in the above method, a crosslinking agent having a photodegradable protective group having a group capable of binding to phosphoric acid at both ends is preferred. Particularly preferred are compounds represented by (crosslinking agents).
  • the amount of the compound of the present invention (crosslinking agent) used in the above cannot be generally specified depending on the type of the compound of the present invention (crosslinking agent) used, etc., but the lower limit is usually a double-stranded RNA that is subject to crosslinking 1 More than 1 mole per mole, preferably more than 1 mole per mole of double-stranded RNA and capable of crosslinking in double-stranded RNA (phosphate group, carboxyl group, hydroxyl group, 1Z4 or more of the number of combinations of amino groups and the like, more preferably a molar amount corresponding to the number of combinations of reactive groups capable of crosslinking in double-stranded RNA.
  • the upper limit is usually 10 times the number of crosslinkable reactive group combinations in double stranded RNA, preferably 5 times the number of crosslinkable reactive group combinations in double stranded RNA. is there.
  • the combination of reactive groups capable of crosslinking in double-stranded RNA refers to two photodegradable protecting groups possessed by the compound of the present invention (crosslinking agent) possessed by one RNA strand that forms double-stranded RNA.
  • One of the reactive groups for example, a group selected from a phosphate group, a hydroxyl group and an amino group
  • the compound of the present invention crosslinking
  • It means a combination with a reactive group (for example, a group selected from a phosphate group, a hydroxyl group, and an amino group) to which the other of two photodegradable protecting groups possessed by the agent can be bonded.
  • the number of reactive group combinations capable of crosslinking in double-stranded RNA refers to the total number of reactive groups as described above that can be bound by the compound of the present invention (crosslinking agent) possessed by double-stranded RNA (all combinations).
  • one of the two photodegradable protecting groups of the compound of the present invention (crosslinking agent) possessed by one RNA strand forming a double-stranded RNA can be bound.
  • a reactive group to which the other of the two photodegradable protecting groups of the compound (crosslinking agent) of the present invention possessed by the reactive group to which the group can bind and the other RNA strand forming the double strand can bind The number is the smaller of the two.
  • the solution (solvent) containing the double-stranded RNA or Z and the compound (crosslinking agent) of the present invention is not particularly limited as long as it is usually used in this field.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • buffer solution for example, Tris buffer solution, Good buffer solution, TE buffer solution, TAE buffer solution, TBE buffer solution, TBS buffer solution, etc.
  • the reaction solution is subjected to a purification method known per se such as column chromatography, the unreacted compound (crosslinking agent) of the present invention is removed, and the compound (crosslinking agent) of the present invention is bound. Desirable to purify single-stranded RNA U ,.
  • the double-stranded RNA to which the compound of the present invention (crosslinking agent) obtained as described above is bound is introduced (transfected) into cells or organisms.
  • Examples of such cells include eukaryotic cells or cell lines such as plant cells or animal cells (mammalian cells such as humans and rats, nematode cells, insect cells, etc.), such as embryonic cells (early African cells in early development). EL embryo cells, zebrafish embryo cells, Drosophila cells, etc.), pluripotent stem cells, tumor cells such as teratocarcinoma cells or virus-infected cells, monolayer-like cultured cells derived from various organisms, etc. .
  • plant cells or animal cells such as human cells such as humans and rats, nematode cells, insect cells, etc.
  • embryonic cells eyely African cells in early development
  • EL embryo cells zebrafish embryo cells, Drosophila cells, etc.
  • pluripotent stem cells such as teratocarcinoma cells or virus-infected cells, monolayer-like cultured cells derived from various organisms, etc.
  • organisms examples include eukaryotes, plants or animals (for example, mammals such as humans and rats, nematodes, insects, etc.).
  • a method for introducing (transfecting) the double-stranded RNA having the compound of the present invention (crosslinking agent) bound into the cells or organisms as described above a method known per se can be used. Examples of such methods include calcium phosphate method, DEAE-dextran method, electroporation and microinjection, virus method, method using cationic ribosome (eg, Tfx50 (Promega), Lipofectamine 2000 (Life Technologies), etc.), etc. (Graham, F ⁇ . And van der Eb, AJ (1973) Virol. 52, 456, McCutchan, JH and Pagano, JS (1968) J. Natl. Cancer Inst. 41, 351, Chu, G. (1987) Nuc 1. Acids Res.
  • the compound (crosslinker) of the present invention is bound.
  • the double-stranded RNA can be easily introduced (transferred) into cells or organisms, or can be easily performed using a commercially available kit for transfection.
  • RNAi the ability to generate RNAi
  • the ability to cause the ability to degrade the target mRNA
  • the same gene the target mRNA complementary to the double-stranded RNA
  • the double-stranded RNA to which the compound of the present invention (crosslinking agent) is bound is introduced, the double-stranded RNA to which the compound of the present invention (crosslinking agent) is bound is The compound of the present invention (crosslinking agent) is eliminated.
  • the gene expression inhibitory effect of double-stranded RNA that has been suppressed by the binding of the compound of the present invention (crosslinking agent) (decomposition of target mRNA complementary to the double-stranded RNA) can be achieved by irradiation with light.
  • the binding of the compound of the present invention (crosslinking agent) and double-stranded RNA is removed and recovered, thereby suppressing the expression of the gene (target mRNA).
  • the light used is the same as described above, and is an electromagnetic wave in the wavelength range of about 1 to 900 nm, preferably on the long wavelength side, for example, in the range of 350 to 400 nm, more preferably, the wavelength is about 365 ⁇ 6 nm. Light.
  • the compound (crosslinking agent) of the present invention may not be sufficiently detached, so care must be taken.
  • the irradiation with light may be performed on the whole (or whole) or part of the cells or organisms into which the double-stranded RNA to which the compound of the present invention (crosslinking agent) is bound is introduced.
  • the cell or organism when irradiating the whole cell or organism (entire), the cell or organism may be opposed to a light source or a light irradiation means (for example, ultraviolet irradiation means such as a mercury lamp).
  • a light source or a light irradiation means for example, ultraviolet irradiation means such as a mercury lamp.
  • the expression of a specific gene can be regulated (controlled) at an arbitrary time and place.
  • the expression of the target mRNA (target gene) complementary to the double-stranded RNA is suppressed.
  • the gene expression can be specifically suppressed by irradiating light at a desired time or Z and place thereafter.
  • target mRNA a specific target gene
  • target mRNA the expression of a specific target gene (target mRNA) is carried out by subjecting a cell or organism introduced with double-stranded RNA to which the compound of the present invention (crosslinking agent) bound after light irradiation to the cell or organism according to a conventional method.
  • the compound of the present invention cross-linking agent
  • cross-linking agent is removed by light irradiation when the gene in the cell or organism is expressed by culturing or growing under an appropriate condition under which the organism can grow, the double-stranded RNA It is suppressed by the RNAi effect produced in the cell or organism by action.
  • the gene expression regulation method including the steps (a) to (c) of the present invention is performed after the step (c). And (c ′) a step of expressing a gene in a light-irradiated cell or organism.
  • Such controls include, for example, (cells or organisms into which 0 cross-linked double-stranded RNA has been introduced and irradiated with light! /, Genes expressed in cells or organisms ( It is the same type of cell or organism into which the crosslinked double-stranded RNA has been introduced, and the crosslinked double-stranded RNA has been introduced into the cell or organism, but the cell or organism has been irradiated with light.
  • the comparison between the gene expressed in step (1) and the control is, for example, after light irradiation.
  • target gene target mRNA complementary to double-stranded RNA
  • crosslinking agent crosslinking agent
  • Increase / decrease (expression amount) or presence / absence of expression increase / decrease (protein amount) of expression product (protein, etc.) of target gene (target mRNA) or presence / absence of expression product (protein, etc.)
  • the phenotype is measured and observed according to a method known per se, and the results are compared.
  • a cell or organism into which a double-stranded RNA to which a compound of the present invention (crosslinking agent) is bound is introduced or Z and a control cell or organism are treated according to a conventional method.
  • the gene in the cell or organism may be expressed by culturing or growing under suitable conditions under which the organism can grow.
  • Specific examples of the gene function investigation method of the present invention include the following steps (a) to (d).
  • step (d) A step of comparing the gene expressed in step (1) with the gene expressed in step (c ").
  • the cells or organisms that are irradiated with light in the step (c) and the cells or organisms that are not irradiated with light in the step (c ") are the same [one (group) of cells 'individuals']. May be of the same species (different cells' individuals'), but generally these are of the same species and different cells' individuals.
  • step (d) A step of comparing the gene expressed in step (b ′) with the gene expressed in step (d)
  • step (c ) is the same type as the cell or organism into which the double-stranded RNA crosslinked in step (b) has been introduced (different cell ⁇ individual>, ie, the same type. Different cells and individuals.
  • the compound of the present invention crosslinking agent
  • double-stranded RNA double-stranded RNA
  • method of contacting the compound of the present invention crosslinking agent
  • double-stranded RNA double-stranded RNA
  • two cross-linked RNAs Preference is given to the constituent requirements of cells or organisms into which strand RNA is introduced, methods of introducing double-stranded RNA cross-linked into the cells or organisms, methods of light or light irradiation, methods of expressing genes in cells or organisms, and the like. New embodiments and specific examples are the same as described above.
  • irradiation with light is performed on all cells or organisms into which double-stranded RNA to which a compound of the present invention (crosslinking agent) has been bound ( All) or a part thereof.
  • the function of the gene only in a predetermined region in the cell or organism into which the double-stranded RNA to which the compound of the present invention (crosslinking agent) is bound is investigated. be able to. Specific examples of such a case include those including the following steps (a) to (d).
  • the cell or organism in the above is one (group) of cells / individuals.
  • the compound of the present invention crosslinking agent
  • a compound represented by the general formula (1) more preferably a compound represented by the general formula (2), more preferably A compound represented by the general formula (6), particularly preferably a compound represented by the general formula (7), a compound represented by the general formula (8) and a compound power represented by the general formula (9)
  • it comprises a compound represented by the general formula (7).
  • Preferred embodiments and specific examples of these constituent elements are as described above.
  • reagents other than those described above can be added to form the kit of the present invention.
  • examples of such reagents include, but are not limited to, transfection reagents for introducing double-stranded RNA into cells or organisms.
  • instructions for use in the crosslinking method, gene expression regulation method, or gene function regulation method of the present invention as described above may be included.
  • the “instructions” are the instruction manuals, package inserts, pamphlets (leaflets), etc. of the kits in which the features, principles, operation procedures, etc. in the method of the present invention are substantially described in text or diagrams. means.
  • the method of the present invention has the following effects, for example. (1) By destroying the mRNA of a target gene whose sequence is known (target mRNA), it is possible to search for the function of that gene, which is effective for functional analysis of the target gene.
  • RNAi drugs that use RNAi to treat diseases.
  • an RNAi drug capable of producing a drug effect in a tissue or site-specific manner can be developed.
  • 6-Bromo-7-hydroxy-4-diazomethylcoumarin was synthesized according to the method described in WO00 / 31588 International Publication Pamphlet.
  • ⁇ 1.15 (12H, s, 3 '-2CH3, 10' -2CH3), 2.48 (4H, s, 2H ,, 2H), 2.51 (4H, s, 2H ,, 2H
  • 6-Bromo-7-hydroxy-4-diazomethylcoumarin was synthesized according to the method described in WO00 / 31588 International Publication Pamphlet.
  • a solution obtained by dissolving Compound 3 of the present invention obtained in Example 3 in DMSO solution to a concentration of 21.1 ⁇ was used as a crosslinking agent solution.
  • Cross-linking agent solution or DMSO and siRNA (double-stranded RNA) solution so that it has the composition shown in Table 1 below.
  • (20 M siRNA-containing TE interference solution) was mixed and allowed to stand for 8 hours under light-shielding conditions.
  • Sample Nos. 5 and 6 were irradiated with UV (350 nm) for 3 minutes using a Rayonet Phostochemical Reactor apparatus manufactured by Southern NE Ultraviolet.
  • the siRNA used was 22 bp (QIAGEN) consisting of the following base sequence targeting GFP.
  • sample buffer prepared by mixing 3 ml of glycerin, 0.1 ml of 0.5ME DTA-HC1 aqueous solution (pH 8.0) and 6.9 ml of purified water.
  • electrophoresis was performed at 7 mA (constant current) for 1 hour using a MODEL BE-211 electrophoresis apparatus manufactured by BIO CRAFT, 20% polyacrylamide gel, and XI TBE buffer. Thereafter, the gel was stained with SYBR GOLD (Molecular Probes) and observed with a transilluminator (Funakoshi).
  • Lane No. 1 shows the results when Sample No. 6 is used
  • Lane No. 2 shows the results when Sample No. 4 is used
  • Lane No. 3 shows the results when Sample No. 5 is used.
  • results for sample No. 3 lane No. 5 for sample No. 2
  • lane No. 6 for sample No. show the results of using l
  • “DsRNA ⁇ ” indicates the migration position of double-stranded RNA
  • ssRNA ⁇ indicates the migration position of single-stranded RNA.
  • the compound (cross-linking agent) of the present invention cross-links double-stranded RNA (siRNA), and the cross-linking is released by UV irradiation. It can be seen that the thermal stability of RNA is increased.
  • HeLa cells American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)
  • DMEM medium manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Dulbecco's modified Eagle medium-Susii 2
  • the pEGFP—N1 vector (CLONTEC, BD Living colors) dissolved in TE buffer so as to be 1714 g / ml was used.
  • the pDsRed2-N1 vector (CL Living Corporation, BD Living colors) dissolved in TE buffer so as to be 1612 ⁇ gZml was used.
  • RNA having the following sequence power (targeted with the EGFP gene) dissolved in water to a concentration of 200 nM was used. 5 GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU-3 '
  • HeLa cells Hela cells and 10% FBS-containing DMEM medium 500 ⁇ were spread on a 24-well plate at 3 ⁇ 10 4 Zwell. After 24 hours, the old medium was removed, and the Hela cells were washed with a PBS ( ⁇ ) solution. Then, the PBS ( ⁇ ) solution was removed, and 10% FBS-containing DMEM medium 5001 was added per lwell. This was used as a Hela cell plate for transfection.
  • crosslinker solution 1 and siRNA solution 0.201 were mixed and allowed to stand for 8 hours under light shielding conditions.
  • No. 2, 4 and 6 were irradiated with UV (350 nm) for 3 minutes using a Rayonet Photochemical Reactor device manufactured by Southern N.E.Ultravio let.
  • Opti-MEM medium 90 ⁇ 1, pRGFP vector solution 0.36 ⁇ 1, pDsRed vector solution 0.60 1 and reaction solution 0.401 prepared in i) above were mixed and allowed to stand for 15 minutes.
  • an siRNA solution V-double-stranded RNA crosslinked with the compound of the present invention 0.20 ⁇ 1 was used, and the same operation as above was performed as a control. A sample was used.
  • pEGFP 0.36 contains 617 ng pEGFP
  • pDsRed 0.601 contains 985 ng pDsRed
  • 200 nM siRNA 0.20 ⁇ 1 contains 62.6 pg siRNA.
  • Fig. 2 uses the analysis software to count the area of EGFP-expressing cells and the area of DsRed-expressing cells per fixed area, and the expression ratio when EGFP and DsRed are co-transformed is 100%.
  • the expression level of EGFP in each sample is shown as a relative value.
  • Example 5 The same crosslinking agent solution as in Example 5 was used except that the compound 3 of the present invention obtained in Example 3 was dissolved in DMSO solution to a concentration of 4 M.
  • Crosslinker solution 0.21 and siRNA solution 0.201 were mixed and allowed to stand under light-shielding conditions for 0 hour, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 8 hours, or 24 hours.
  • Opti-MEM medium 90 ⁇ 1, pRGFP vector solution 0.36 ⁇ 1, pDsRed vector solution 0.60 1 and reaction solution 0.401 prepared in i) above were mixed and allowed to stand for 15 minutes. was used as a sample for transfection.
  • siRNA solution V-double-stranded RNA crosslinked with the compound of the present invention 0.20 ⁇ 1 was used, and the same operation as above was performed as a control. A sample was used.
  • pEGFP 0.36 contains 617 ng pEGFP
  • pDsRed 0.60 1 contains 985 ng pDsRed
  • 200 nM siRNA 0.20 ⁇ 1 contains 62.6 pg siRNA. Yes.
  • Meta Morph analysis software (Meta Imaging Software) the total area of each fluorescent area of EGFP and DsRed was determined, and the EGFPZDsRed ratio was determined.
  • 6-Bromo-7-hydroxy-4-methylcoumarin is produced by T. Furuta, H. Takeuchi, M. Isozaki, Y. Takahashi, ⁇ . Sugimoto, ⁇ . Kanehara, ⁇ . Watanabe, ⁇ . Noguchi, ⁇ . Re. Dore, ⁇ . Iwamura, R. ⁇ . Tsien, Bhc— cNMPs as either water-soluble or membrane— permea nt photo— releasable cyclic nucleotides for both one and two-photon excitation, and he mBioChem, 5, 1119-1128 (2004).
  • crosslinking agent solution the same solution as in Example 5 was used except that the following was used. • Compound 3 containing crosslinker solution of the present invention
  • Example 3 The compound 3 of the present invention obtained in Example 3 was dissolved in DMSO solution to a concentration of 4 ⁇ ⁇ .
  • Bhc-diazo dissolved in DMSO solution to a concentration of 8 ⁇ was used.
  • crosslinker solution 1 and siRNA solution 0.201 were mixed and allowed to stand for 8 hours under light shielding conditions.
  • Nos. 2, 4 and 6 were irradiated with UV (350 nm) for 3 minutes using a Rayonet Photochemical Reactor apparatus manufactured by Southern N.E.
  • Opti-MEM medium 90 ⁇ 1, pRGFP vector solution 0.36 ⁇ 1, pDsRed vector solution 0.60 1 and reaction solution 0.401 prepared in i) above were mixed and allowed to stand for 15 minutes. was used as a sample for transfection.
  • siRNA solution V-double-stranded RNA crosslinked with the compound of the present invention 0.20 ⁇ 1 was used, and the same operation as above was performed as a control. A sample was used.
  • pEGFP 0.36 contains 617 ng pEGFP
  • pDsRed 0.601 contains 985 ng pDsRed
  • 200 nM siRNA 0.20 ⁇ 1 contains 62.6 pg siRNA.
  • Fig. 4 the area of EGFP-expressing cells and the area of DsRed-expressing cells per certain area was counted using the analysis software, and the expression ratio when cotransfection of EGFP and DsRed was taken as 100%.
  • the expression level of EGFP in each sample is shown as a relative value.
  • Compound 3 of the present invention can suppress the siRNA action unless UV irradiation is performed, and the suppression is restored by UV irradiation.
  • bis-Bhc-CH has a methyl group instead of an azo group that can be covalently bound to siRNA.
  • Bhc-diazo has a azo group that can be covalently bound to siRNA, but does not have a linker moiety, so it cannot crosslink the double strand of siRNA, and the siRNA has almost no action. It turns out that it can be suppressed.
  • the photodegradable protecting group has a group capable of binding to double-stranded RNA, and two photodegradable protecting groups have two. It is important to have a structure located at both ends of the linker part so that the strand RNA can be cross-linked.
  • HeLa cells Hela cells and 10% FBS-containing DMEM 500 ⁇ were seeded in a 24-well plate at 5 ⁇ 10 3 cells / well. After 24 hours, the old medium was removed, and Hela cells were washed with PBS (—) solution. Then, the PBS (—) solution was removed, and 500 ⁇ l of DMEM containing 10% FBS was added per lwell. This was used as a Hela cell plate for transfection.
  • Opti-MEM medium 90 ⁇ 1, pRGFP vector solution 0.36 ⁇ 1, pDsRed The vector solution 0.601 and the reaction solution 0.401 prepared in i) above were mixed and allowed to stand for 15 minutes, which was used as a sample for transfection.
  • siRNA solution V-double-stranded RNA crosslinked with the compound of the present invention 0.20 ⁇ 1 was used, and the same operation as above was performed as a control. A sample was used.
  • pEGFP 0.36 contains 617 ng pEGFP
  • pDsRed 0.601 contains 985 ng pDsRed
  • 200 nM siRNA 0.20 ⁇ 1 contains 62.6 pg siRNA.
  • Lipofectamine 2000 0.8 ⁇ 1 was placed in 9.2 ⁇ 1 of Opti-MEM medium and allowed to stand for 10 minutes. Next, mix this with the sample for transfection obtained in ii) above and let stand for 20 minutes.
  • Meta Morph analysis software (Meta Imaging Software) the total area of each fluorescent area of EGFP and DsRed was determined, and the EGFPZDsRed ratio was determined.
  • FIG. 5 shows the results of observation of fluorescent images of EGFP and DsRed when using Compound 3 of the present invention.
  • the siRNA cross-linking by the compound 3 of the present invention was not released in the UV-irradiated part, and the RNAi effect of the siRNA was suppressed.
  • the siRNA cross-linking by the compound 3 of the invention is released, and the RNAi effect of the siRNA is restored.
  • the compound 3 of the present invention obtained in Example 3 dissolved in DMSO solution so as to have a concentration of 4 M was used.
  • the same one as in Example 5 was used, except that a control siRNA solution in which double-stranded RNA squeezed from the sequence (targeting luciferase) was dissolved in water to a concentration of 200 nM was used.
  • crosslinker solution 0.21 and siRNA solution 0.201 or control siRNA solution 0.201 were mixed and allowed to stand for 8 hours under light-shielding conditions.
  • siRNA solution cross-linked with the compound of the present invention, double-stranded RNA 0.20 ⁇ 1 or control siRNA solution (cross-linked with the compound of the present invention)
  • a control sample was prepared by performing the same operation as described above using 0.20 ⁇ l of double-stranded RNA).
  • pEGFP 0.36 contains 617 ng pEGFP
  • pDsRed 0.601 contains 985 ng pDsRed
  • 200 nM siRNA 0.20 ⁇ 1 contains 62.6 pg siRNA.
  • Lipofectamine 2000 0.8 ⁇ 1 was placed in 9.2 ⁇ 1 of Opti-MEM medium and allowed to stand for 10 minutes. Next, this was mixed with the transfection sample or control sample obtained in ii) above and allowed to stand for 20 minutes.
  • Meta Morph analysis software (Meta Imaging Software) the total area of each fluorescent area of EGFP and DsRed was determined, and the EGFPZDsRed ratio was determined.
  • FIG. 7 the area of EGFP-expressing cells and the area of DsRed-expressing cells per certain area was counted using the analysis software, and the expression ratio when EGFP and DsRed were co-transformed was 100%.
  • the expression level of EGFP in each sample is shown as a relative value.
  • HeLa cells American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)
  • Compound 3 of the present invention obtained in Example 3 was dissolved in DMSO solution to a concentration of 40 ⁇ 40.
  • the solution was used as a crosslinking agent solution.
  • HeLa cells Hela cells and 10% FBS-containing DMEM 500 ⁇ were spread on a 24-well plate at 1 ⁇ 10 3 cells / well. After 24 hours, the old medium was removed, and Hela cells were washed with PBS (—) solution. Then, the PBS (—) solution was removed, and 500 ⁇ l of DMEM containing 10% FBS was added per lwell. This was used as a Hela cell plate for transfection.
  • Opti-MEM medium 901 and reaction solution 5.061 prepared in i) above were mixed and allowed to stand for 15 minutes, which was used as a sample for transfection.
  • siRNA solution cross-linked with the compound of the present invention, V-double-stranded RNA 0.46 ⁇ 1 was used for the same operation as above. A sample was used.
  • Lamnin Bl protein was quantified by Western blotting.
  • lane No. 1 uses the results when sample No. 1 is used
  • lane No. 2 uses the results when sample No. 2 is used
  • lane No. 3 uses the sample No. 3.
  • Lane No. 4 shows the results when Hela cells were used in which no siRNA and compound 3 of the present invention were introduced and UV irradiation was performed.
  • Lamnin Bl protein The amount of Lamnin Bl protein in each sample was quantified from the results of Western blotting.
  • FIG. 9 shows the relative amount of Lamnin Bl protein in each sample, with the amount of Laminin Bl protein being 100% after transfection of only siRNA.
  • 13-actin which is not a siRNA control gene, does not depend on the presence or absence of siRNA, the presence or absence of compound 3 of the present invention, and the presence or absence of UV irradiation. In this case, it can be seen that the gene is expressed.
  • Lamin Bl the siRNA control, suppresses its expression to 12% by siRNA (lane No. 3) and suppresses the RNAi effect of siRNA by binding compound 3 of the present invention to siRNA. It can be seen (lane No. 2) that RNA control by the compound 3 of the present invention can be restored by UV irradiation (lane No. 1).
  • crosslinking agent by using the compound of the present invention (crosslinking agent), it is possible to control the expression of endogenous genes not only by the genes that are introduced from outside but overexpressed by the presence or absence of light irradiation.
  • the present invention relates to a cross-linking agent that cross-links between double-stranded nucleic acids, between nucleic acid proteins or polypeptides, or between proteins or polypeptides, particularly between double-stranded RNAs, their cross-linking method, and gene expression regulation method.
  • a method for investigating gene function is also provided.
  • it is possible to directly crosslink and release crosslinks between double-stranded nucleic acids, between nucleic acid proteins or polypeptides, or between proteins or polypeptides, particularly between double-stranded RNAs,
  • the expression of the target gene can be controlled at any time and place.
  • the RNAi effect of double-stranded RNA (siRNA) which was difficult to suppress with conventional cage compounds, can be suppressed, and the expression of the target gene can be easily controlled at any time and place. .

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Description

明 細 書
架橋剤、架橋法、遺伝子発現調節法及び遺伝子機能調査法
技術分野
[0001] 本発明は、光分解性保護基を両末端に有する架橋剤、それを用いた二本鎖核酸、 特に二本鎖 RNA等を架橋する方法、および遺伝子発現調節方法並びに遺伝子機能 調査方法に関する。
背景技術
[0002] 近年、遺伝子の機能を解析するための手法として、解析対象の目的遺伝子の発現 を調節する様々な方法が提案されて!ヽる。
なかでも、二本鎖 RNA (dsRNA)が相補的な標的 mRNAの特異的な分解を促進する ことにより標的タンパク質の発現を特異的に抑制する現象を利用した、 RNA干渉 (RN Ai)法は、簡便でし力も強力な遺伝子機能阻害法として広く用いられている（Fire, A. et. al" (1998), Nature 391, 806—811、 Svobada, P. et al" (2000) Development 127, 4 147-4156、 Elbashir, S. M., Lendeckel, W. and Tuschl, T" (2001) Genes and Dev. 1 5, 188 -200、 Zamore, P. D. et al., (2000) Cell, 101, 25 33、 Bernstein, E. et al" (20 01) Nature, 409, 363— 366等）。
[0003] 一方、標的物質の活性を光で調節できるように設計された、所謂ケージドィ匕合物が 種々開発されている。ケージド化合物は、光分解性の保護基力もなるものであり、標 的物質に結合することによって、標的物質の活性を止めておくことができ (ケージング )、これに光を照射すればケージが外れて標的物質が持っている本来の活性が回復 する（アンケージング）という性質を有するものである（R. S. Givens, C. H. Park, Tetra hedron Lett., 37, 6259—6262 (1996)、 C. H. Park, R. S. Givens, J. Am. Chem. Soc, 119, 2453-2463 (1997)、 J. Engels, E. J. Schlaeger, J. Med. Chem. 20, 907 (1977)、 J . H. Kaplan, G. Forbush III, J. F. Hoffman, Biochemistry 17, 1920-1935 (1978)、 W 000/31588等）。
[0004] 生物学の分野では早くからその特性に注目し、最近、このようなケージド化合物を 遺伝子発現の調節に利用する試みが行われている（特開 2002-315576号、生化学 第 75卷第 9号， pp. 1251-1254, 2003等）。
この方法は、 mRNA (—本鎖）をケージドィ匕合物でケージングし、細胞内に導入後、 任意の時期および部位にピンポイントで光等を照射することによって目的の RNAの翻 訳 (即ちタンパク質の発現)をコンデイショナルに誘導する方法である。
[0005] し力しながら、上記方法は、一本鎖の mRNAにケージド化合物を直接結合させて目 的とする遺伝子の発現を抑制するものであり、例えば上記した如き RNAi等にぉ 、て 用 ヽられる二本鎖の RNA (siRNA)等の二本鎖のヌクレオチド鎖を架橋することによつ て、 siRNAが有する RNAi効果を抑制して目的とする遺伝子の発現を調節すること〖こ つ!、ての報告は未だなされて!/、な!/、。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、二本鎖核酸間、核酸 タンパク質又はポリペプチド間、或いはタンパク 質又はポリペプチド間、特に二本鎖 RNA間を架橋する架橋剤、これらの架橋方法、 及び目的遺伝子の発現を任意の時期と場所で制御し得る簡便な遺伝子発現調節方 法並びに遺伝子機能調査方法を提供する。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明は、以下の構成よりなる。
1.下記一般式（1)で示される化合物。
Q1— A1— T1一 A2— Q2 ( 1 )
〔式中、 Q1及び Q2はそれぞれ独立して光分解性保護基を示し、 A1及び A2はそれぞ れ独立してアルキレン基、 一 0—、— NR1—、— 0— CO—、— CO— 0—、 -C-0 - C一、 一NR2—COO 、 一OCO—NR2—、 一NR3—CO 、 一CO—NR3— U¾ 0— COO- (尺1〜!?3はそれぞれ独立して H又はアルキル基を示す。）を、 T1はアルキレン 基、ァリーレン基、ァラルキレン基、ヘテロ原子を含むアルキレン基、ヘテロ原子を含 むァリーレン基又はへテロ原子を含むァラルキレン基をそれぞれ示す。〕
2.二本鎖核酸間、核酸—タンパク質又はポリペプチド間、或いはタンパク質又はポリ ペプチド間を、上記 1に記載の化合物で架橋する方法。 3.上記 1に記載の化合物を予め結合させた二本鎖 RNAに対して、紫外線を照射す ることを特徴とする遺伝子発現調節方法。
4.以下の工程を含む遺伝子発現調節方法。
(a)上記 1に記載の化合物と二本鎖 RNAとを接触させて、二本鎖 RNAを架橋する工程
(b)架橋された二本鎖 RNAを細胞又は生物に導入する工程、及び
(c)導入された細胞又は生物に紫外線を照射する工程。
5.以下の工程を含む遺伝子の機能の調査方法。
(a)上記 1に記載の化合物と二本鎖 RNAとを接触させて、二本鎖 RNAを架橋する工程
(b)架橋された二本鎖 RNAを細胞又は生物に導入する工程、
(c)導入された細胞又は生物に紫外線を照射する工程、
(c')光照射された細胞又は生物中の遺伝子を発現させる工程、及び
(d)工程 ( で発現した遺伝子と対照とを比較する工程。
6.上記 1の化合物力もなる、核酸間、核酸—タンパク質又はポリペプチド間、或いは タンパク質又はポリペプチド間の架橋剤。
即ち、本発明者等は、従来知られているケージドィ匕合物は、一本鎖のヌクレオチド 鎖、特に RNAに結合させて目的とする遺伝子の発現を抑制するには有効であるもの の、二本鎖の RNA(siRNA)に結合させて RNAi法を行った場合には、当該 siRNAが有 する RNAi効果を殆ど抑制することができず、目的とする遺伝子の発現を制御すること ができないとの知見を得た。
このような状況の下、本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、 光分解性保護基を両末端に有する架橋剤を用いて二本鎖 RNA(siRNA)を架橋して R NAiを行えば、目的遺伝子の発現を任意の時期と場所で簡便に且つ高効率に制御 し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
尚、このような架橋剤やこれを用いた架橋方法及び遺伝子調製方法は全く行われ て！、な 、し、このような発想も全く知られて 、な！/、。
発明の効果 [0009] 本発明の架橋剤を用いて二本鎖 RNAを架橋することにより、 目的遺伝子の発現を 任意の時期と場所で簡便に且つ高効率に制御することが可能であり、その結果、時 期や場所で特異的に発現する遺伝子の機能調査又は Z及び同定を行うことが可能 となる。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]実施例 4で得られた、各試料の電気泳動の結果を示す。
[図 2]実施例 5で得られた、 EGFPと DsRedをコトランスフエクシヨンした際の発現比率を 100 %とした場合の、各試料における EGFPの発現量を相対値で示したものである。
[図 3]実施例 6で得られた、 EGFPと DsRedをコトランスフエクシヨンした際の発現比率を 100 %とした場合の、各試料における EGFPの発現量を相対値で示したものである。
[図 4]実施例 7で得られた、 EGFPと DsRedをコトランスフエクシヨンした際の発現比率を 100 %とした場合の、各試料における EGFPの発現量を相対値で示したものである。
[図 5]実施例 8で得られた、 EGFPと DsRedをコトランスフエクシヨンした際の発現比率を 100 %とした場合の、各試料における EGFPの発現量を相対値で示したものである。
[図 6]実施例 8で得られた、細胞における EGFP及び DsRedの蛍光像の観察を行った 結果を示す。
[図 7]実施例 9で得られた、 EGFPと DsRedをコトランスフエクシヨンした際の発現比率を 100 %とした場合の、各試料における EGFPの発現量を相対値で示したものである。
[図 8]実施例 10で得られた、ウェスタンプロットの結果を示す。
[図 9]実施例 10で得られた、 EGFPと DsRedをコトランスフエクシヨンした際の発現比率 を 100 %とした場合の、各試料における EGFPの発現量を相対値で示したものである。 発明を実施するための最良の形態
[0011] 1.本発明の化合物
本発明の化合物は、光分解性保護基を両末端に有するものであり、核酸間、核酸 タンパク質又はポリペプチド間、或いはタンパク質又はポリペプチド間の架橋剤で ある。
光分解性保護基としては、リン酸基、カルボキシル基、ヒドロキシル基又はアミノ基 等に結合し、光の照射により脱保護反応がおこる基を形成し得る基 (以下、脱離基と 略記する。）を有する保護基が挙げられ、リン酸基、カルボキシル基、ヒドロキシル基 及びアミノ基力 選ばれる基に結合し得る基を有するものが好ましぐなかでもリン酸 に結合し得る基を有するものが特に好ま 、。
また、両末端に結合した光分解性保護基の脱離基は、核酸間、核酸—タンパク質 又はポリペプチド間、或いはタンパク質又はポリペプチド間に結合するのに充分な距 離、即ち、二本鎖核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれ、核酸とタンパク質 又はポリペプチドのそれぞれ、 2つのタンパク質又はポリペプチド（タンパク質間、タン パク質 ポリペプチド間又はポリペプチド間）のそれぞれを架橋し得る距離で、本発 明の化合物 (架橋剤）の両末端に結合しているのが好ましい。特に、その距離は、二 本鎖 RNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖に結合するのに充分な距離であるのが好ま しい。
より具体的には、架橋させる対象物質の種類により異なるため、一概には言えない 力 両末端に結合した光分解性保護基の脱離基の距離は、例えば下限が通常 8A 以上、好ましくは 15A以上であり、上限が通常 100A以下、好ましくは 80A以下である 例えば、核酸間（二本鎖 DNA、二本鎖 RNA又は DNAと RNAとの二本鎖ハイブリッド） を架橋する場合、両末端に結合した光分解性保護基の脱離基の距離は、下限が通 常 8A以上、好ましくは 15A以上、より好ましくは 25A以上であり、上限が通常 50A以 下、好ましくは 35 A以下である。
核酸とタンパク質又はポリペプチドを架橋する場合、或 、は 2つのタンパク質又はポ リペプチドを架橋する場合、両末端に結合した光分解性保護基の脱離基の距離は、 下限が通常 10A以上、好ましくは 25A以上であり、上限が通常 100A以上、好ましく は 80A以上である。
本発明の化合物としては、具体的には一般式（1)で示されるものである。 Q1— A1— T1— A2-Q2 ( 1 )
〔式中、 Q1及び Q2はそれぞれ独立して光分解性保護基を示し、 A1及び A2はそれぞ れ独立してアルキレン基、 一 0—、— NR1—、— 0— CO—、— CO— 0—、 -C-0 - C一、 一NR2—COO 、 一OCO—NR2—、 一NR3—CO 、 一CO—NR3— U¾ 0— COO- (Ri〜R3はそれぞれ独立して H又はアルキル基を示す。）を、 T1はアルキレン 基、ァリーレン基、ァラルキレン基、ヘテロ原子を含むアルキレン基、ヘテロ原子を含 むァリーレン基又はへテロ原子を含むァラルキレン基をそれぞれ示す。〕
[0013] 本発明の一般式（1)で示される化合物は、
(a)光分解性保護基： Q1及び Q2
(b)リンカ一部：— A1— T1— A2—
の 2つの構成部分に分けることができる。
[0014] 1 1.光分解性保護基
一般式（1)において、 Q1及び Q2で示される光分解性保護基としては、脱離基を有 し、光の照射により脱保護反応がおこる保護基が挙げられ、、なかでもリン酸に結合 し得る基を有するものが好まし 、。
[0015] より具体的には、下記一般式 (3)、 （3')、 （3")及び (3"')で示される光分解性保護 基が挙げられる。
Figure imgf000008_0001
〔一般式（3)中、
Figure imgf000008_0002
X1 Χ2Α及び Μ1の中の 1つは、一般式（1)における Α1又は Α2と結合する結合手を表し、残りは下記を表す。
Qはー0— —ΝΗ— -NCH を、 Αは水酸基、置換アルコキシ基、非置換アルコ
3
キシ基、— 0C(0)RU -NH -NHCH — NRUR12を、 X1及び X2はそれぞれ独立し
2 3
て— Η、水酸基、置換アルコキシ基、非置換アルコキシ基、—OC(0)RU基、—NH基
3 NRUR12基、 RU F Cl Br 1 COOH NO C(=0)NHRU -
2
CN CH0 C(=0)Ru -SO Hを、 Y1は一 H Cl Br 1 C(0)0H N
3
0 C(0)NHRU — CN C(0)H C(0)CH、ベンゾキサゾール -2-ィル基、
2 3
ベンゾチアゾール -2-ィル、 ンズイミダゾール- 2-ィルを、 Y2は— H C(0)0H -SO Hを、 M1は— H — CH — NR12R13基、 C(0)NR12R13基、 COOHを、 Zは脱 離基をそれぞれ示す。また、 M2は—H或いは Zと共に =N、 =0又は = NNHRUであ
2
ることを示す。ここで、 RU、 R12及び R13はそれぞれ独立して炭素数 1-20のアルキル基 、炭素数 2-20のアルケニル基、炭素数 2-20のアルキニル基、炭素数 1-20のアルコキ シ基、炭素数 1-20のチォアルコキシ基、炭素数 1-20のアルキルスルホ-ル基、炭素 数 4-16のァリールスルホ-ル基、炭素及びへテロ原子の総数 2-20のへテロアルキル 基、炭素及びへテロ原子の総数 2-20のへテロアルケ-ル基、炭素数 3-8のシクロア ルキル基、炭素数 3-8のシクロアルケ-ル基、炭素数 4-16のァリール基、炭素及びへ テロ原子の総数 4-16のへテロァリール基、炭素及びへテロ原子の総数 2-30のへテロ シクリル基カゝら選ばれる置換官能基又は非置換官能基を示し、 X1及び A、 X2及び A 又は X1及び Y2は一緒になつて— 0— (CH )— 0—基、 -C-(CH )— 0—基、— 0—
2 n 2 n
(CH )—C一基、 -O-(CH )—N 基、 -N-(CH ) 0—基、 N— (CH )— N—
2 n 2 n 2 n 2 n 基、 C— (CH )— N 基及び— N— (CH )—C 基力ら選ばれる基を形成してもよ
2 n 2 n
い。ここで、 nは 1又は 2である。〕
Figure imgf000009_0001
〔一般式（3')中、 R22〜R25の中の 1つは、一般式（1)における A1又は A2と結合する結 合手を表し、残りは下記を表す。
R21は水素原子、 C00H、炭素数 1-20のアルキル基、炭素数 2-20のアルケニル基 、炭素数 2-20のアルキニル基、炭素数 1-20のアルコキシ基、炭素数 1-20のチォアル コキシ基、炭素数 1-20のアルキルスルホ-ル基、炭素数 4-16のァリールスルホ-ル 基、炭素及びへテロ原子の総数 2-20のへテロアルキル基、炭素及びへテロ原子の 総数 2-20のへテロアルケニル基、炭素数 3-8のシクロアルキル基、炭素数 3-8のシク ロアルケ-ル基、炭素数 4-16のァリール基、炭素及びへテロ原子の総数 4-16のへテ ロアリール基、炭素及びへテロ原子の総数 2-30のへテロシクリル基から選ばれる置換 官能基又は非置換官能基を、 R22及び R23はそれぞれ独立して炭素数ト 20のアルキ ル基、炭素数 2-20のアルケニル基、炭素数 2-20のアルキニル基、炭素数 1-20のァ ルコキシ基、炭素数 1-20のチォアルコキシ基、炭素数 1-20のアルキルスルホ -ル基 、炭素数 4-16のァリールスルホ-ル基、炭素及びへテロ原子の総数 2-20のへテロァ ルキル基、炭素及びへテロ原子の総数 2-20のへテロアルケ-ル基、炭素数 3-8のシ クロアルキル基、炭素数 3-8のシクロアルケニル基、炭素数 4-16のァリール基、炭素 及びへテロ原子の総数 4-16のへテロァリール基、炭素及びへテロ原子の総数 2-30 のへテロシクリル基力も選ばれる置換官能基又は非置換官能基を、 R24及び R25は水 素原子をそれぞれ示し、 R22及び R23は一緒になつて— (CH )—基を形成してもよぐ
2 n
R23及び R24は一緒になつて— (CH )— 0—基、 (CH )— C 基及び— (CH )— N—
2 n 2 n 2 n 基力 選ばれる基を形成してもよぐ R22及び R25は一緒になつて— 0— (CH )—基、
2 n
— C— (CH )—基及び一 N— (CH )—基力 選ばれる基を形成してもよい。ここで、 n
2 n 2 n
は 1又は 2である。〕
Figure imgf000010_0001
〔一般式（3")中、 R21及び R2°〜R29の中の 1つは、一般式（1)における A1又は A2と結 合する結合手を表し、残りは下記を表す。
R21は水素原子、 COOH、炭素数 1-20のアルキル基、炭素数 2-20のアルケニル基 、炭素数 2-20のアルキニル基、炭素数 1-20のアルコキシ基、炭素数 1-20のチォアル コキシ基、炭素数 1-20のアルキルスルホ-ル基、炭素数 4-16のァリールスルホ-ル 基、炭素及びへテロ原子の総数 2-20のへテロアルキル基、炭素及びへテロ原子の 総数 2-20のへテロアルケニル基、炭素数 3-8のシクロアルキル基、炭素数 3-8のシク ロアルケ-ル基、炭素数 4-16のァリール基、炭素及びへテロ原子の総数 4-16のへテ ロアリール基、炭素及びへテロ原子の総数 2-30のへテロシクリル基から選ばれる置換 官能基又は非置換官能基を、 R26〜R29は水素原子をそれぞれ示し、 R27及び R28、 R28 及び R29又は R27及び R26は、一緒になつて— 0— (CH )— 0—基、 -C-(CH )—0
2 n 2 n 一基、 -O-(CH ) C一基、 -O-(CH ) N 基、 -N-(CH ) 0—基、 N—(
2 n 2 n 2 n
CH )— N 基、 -C-(CH )— N 基及び— N— (CH )—C 基力ら選ばれる基を形
2 n 2 n 2 n 成してもよい。ここで、 nは 1又は 2である。。〕
Figure imgf000011_0001
〔一般式（3"')中、 R3Q及び R32〜R35の中の 1つは、一般式（1)における 又は A2と結 合する結合手を表し、残りは下記を表す。
R3°は炭素数 1-20のアルキル基、炭素数 2-20のアルケニル基、炭素数 2-20のアルキ ニル基、炭素数 1-20のアルコキシ基、炭素数 1-20のチォアルコキシ基、炭素数 1-20 のアルキルスルホ-ル基、炭素数 4-16のァリールスルホ-ル基、炭素及びへテロ原 子の総数 2-20のへテロアルキル基、炭素及びへテロ原子の総数 2-20のへテロアル ケニル基、炭素数 3-8のシクロアルキル基、炭素数 3-8のシクロアルケニル基、炭素数 4-16のァリール基、炭素及びへテロ原子の総数 4-16のへテロァリール基、炭素及び ヘテロ原子の総数 2-30のへテロシクリル基から選ばれる置換官能基又は非置換官 能基を、 R31はハロゲン原子を、 R32〜R35は水素原子をそれぞれ示し、 R33及び R3°は 一緒になつて— 0— (CH )—基、 C— (CH )—基及び— N— (CH )—基力ら選ばれ
2 n 2 n 2 n
る基を形成してもよぐ R3°及び R34は一緒になつて— (CH )— O 基、 (CH )— C—
2 n 2 n 基及び— (CH )—N 基カゝら選ばれる基を形成してもよぐ R32及び R33は一緒になつ
2 n
て 〇一(CH )—〇一基、 -C-(CH )ー〇一基、 -O-(CH )—C一基、 -0-(CH
2 n 2 n 2 n
) 一 N 基、 -N-(CH ) 一〇一基、 -N-(CH ) 一 N 基、一 C一 (CH )— N 基及
2 n 2 n 2 n 2 n
び N— (CH )—C一基から選ばれる基を形成してもよい。ここで、 nは 1又は 2である
2 n
o ]
[0019] 一般式（3)にお!/、て A、 X1及び X2で示される置換アルコキシ基、非置換アルコキシ 基のアルコキシ基としては、直鎖状、分枝状又は環状でもよいが、直鎖状のものが好 ましぐ通常炭素数 1〜20、好ましくは炭素数 1〜5のものが挙げられる。
具体的には、例えばメトキシ基、エトキシ基、 n プロポキシ基、イソプロポキシ基、 n ブトキシ基、イソブトキシ基、 sec ブトキシ基、 tert ブトキシ基、 n ペンチルォ キシ基、イソペンチルォキシ基、 sec ペンチルォキシ基、 tert ペンチルォキシ基、 ネオペンチルォキシ基、 2—メチルブトキシ基、 1 ェチルプロポキシ基、 n キシ ルォキシ基、イソへキシルォキシ基、 sec へキシルォキシ基、 tert へキシルォキ シ基、ネオへキシルォキシ基、 2—メチルペンチルォキシ基、 3 メチルペンチルォキ シ基、 1, 2—ジメチルブトキシ基、 2, 2—ジメチルブトキシ基、 1 ェチルブトキシ基、 2—ェチルブトキシ基、 n プチルォキシ基、イソへプチルォキシ基、 sec へプチ ルォキシ基、 tert プチルォキシ基、ネオへプチルォキシ基、 n—ォクチルォキシ 基、イソォクチルォキシ基、 sec ォクチルォキシ基、 tert ォクチルォキシ基、ネオ ォクチルォキシ基、 n ノ-ルォキシ基、イソノ-ルォキシ基、 sec ノ-ルォキシ基、 tert ノ-ルォキシ基、ネオノ-ルォキシ基、 n—デシルォキシ基、イソデシルォキシ 基、 sec デシルォキシ基、 tert デシルォキシ基、ネオデシルォキシ基、 n—ゥン デシルォキシ基、イソゥンデシルォキシ基、 sec ゥンデシルォキシ基、 tert ゥンデ シルォキシ基、ネオゥンデシルォキシ基、 n—ドデシルォキシ基、イソドデシルォキシ 基、 sec ドデシルォキシ基、 tert—ドデシルォキシ基、ネオドデシルォキシ基、 n— トリデシルォキシ基、イソトリデシルォキシ基、 sec トリデシルォキシ基、 tert トリデ シルォキシ基、ネオトリデシルォキシ基、 n—テトラデシルォキシ基、イソテトラデシル ォキシ基、 sec テトラデシルォキシ基、 tert テトラデシルォキシ基、ネオテトラデシ ルォキシ基、 n ペンタデシルォキシ基、イソペンタデシルォキシ基、 sec ペンタデ シルォキシ基、 tert ペンタデシルォキシ基、ネオペンタデシルォキシ基、 n キ サデシルォキシ基、 sec へキサデシルォキシ基、 tert へキサデシルォキシ基、ネ ォへキサデシルォキシ基、 n プタデシルォキシ基、イソへプタデシルォキシ基、 s ec へプタデシルォキシ基、 tert へプタデシルォキシ基、ネオへプタデシルォキ シ基、 n—ォクタデシルォキシ基、イソォクタデシルォキシ基、 sec—ォクタデシルォキ シ基、 tert—ォクタデシルォキシ基、ネオォクタデシルォキシ基、シクロプロピルォキ シ基、シクロブチルォキシ基、シクロペンチルォキシ基、シクロへキシルォキシ基、シ クロへプチルォキシ基、シクロォクチルォキシ基、シクロノ-ルォキシ基、シクロデシ ルォキシ基、シクロドデシルォキシ基、シクロウンデシルォキシ基、シクロトリデシルォ キシ基、シクロテトラデシルォキシ基、シクロペンタデシルォキシ基、シクロへキサデシ ルォキシ基、シクロへプタデシルォキシ基、シクロォクタデシルォキシ基等が挙げら れる。
[0020] また、置換基としては、例えばカルボキシル基、ヒドロキシル基、スルホン酸基、例え ばメチル基、ェチル基、 n プロピル基、イソプロピル基、 n ブチル基、イソブチル 基、 sec-ブチル基、 tert-ブチル基等の炭素数 1〜4の低級アルキル基、例えばフル ォロメチル基、ジフルォロメチル基、トリフルォロメチル基、クロロメチル基、ジクロロメ チル基、トリクロロメチル基、ブロモメチル基、ジブロモメチル基、トリブロモメチル基、 ョードメチル基、ジョードメチル基、トリョードメチル基、トリフルォロェチル基、トリクロ 口ェチル基、トリブロモェチル基、ペンタフルォロェチル基、ペンタクロロェチル基、 ペンタブロモェチル基、ヘプタフルォロプロピル基、ヘプタクロロプロピル基、ノナフ ルォロブチル基、ノナクロロブチル基、ノナブロモブチル基、ノナョードブチル基等の 炭素数 1〜4のハロ低級アルキル基、例えばメトキシ基、エトキシ基、 n—プロポキシ 基、イソプロポキシ基、 n ブトキシ基、イソブトキシ基、 sec-ブトキシ基、 tert-ブトキシ 基等の炭素数 1〜4の低級アルコキシ基等が挙げられる。
[0021] 一般式（3)にお 、て Zで示される脱離基は、リン酸基、カルボキシル基、ヒドロキシ ル基又はアミノ基等と結合して、光分解により脱離し得る基となるもの（光の照射によ り脱保護反応がおこる基を形成し得る基)である。
一般に、脱離基と基質 (当該脱離基が結合している化合物)の間の共有結合の電 子対と共に基質（当該脱離基が結合している化合物)から脱離する基である。好まし い脱離基としては、電子求引性、芳香族性、共鳴構造又はそれらの組合せの存在に よって電子対が安定化される基が挙げられ、例えばハロゲン化物、あるいはカルボン 酸塩、炭酸塩、アミド、カーバメート、リン酸塩、スルホン酸塩、アミ入ァリールォキサ イド又はチォレート基が結合した基等が挙げられる。
Zで示される脱離基としては、より具体的には、ハロゲン原子、アルコキシ基、ァリー ルォキシ基、置換ァリールォキシ基、 NR15R16、— OC(0)R14、— OP(0)R15R16、—OP (0)(OH)R15、—OC(0)NR15R16、—NR15C(0)OR16、—SR14、—NR15C(0)R16、—O SR14
3 又は O- NN(0)(NR15R16)が挙げられる。
尚、ここで、 R14、 R15及び R16はそれぞれ独立して炭素数 1-20のアルキル基、炭素数 2-20のァルケ-ル基、炭素数 2-20のアルキ-ル基、炭素数 1-20のアルコキシ基、炭 素数 1-20のチォアルコキシ基、炭素数 1-20のアルキルスルホ-ル基、炭素数 4-16の ァリールスルホ-ル基、炭素数 2-20のへテロアルキル基、炭素数 2-20のへテロアル ケニル基、炭素数 3-8のシクロアルキル基、炭素数 3-8のシクロアルケニル基、炭素数 4-16のァリール基、炭素数 4-16のへテロァリール基、炭素数 2-30のへテロシクリル基 力も選ばれる置換官能基又は非置換官能基であり、 R15及び R16は一緒になつて炭素 数 1-20のアルキレン基を形成して!/、てもよ!/、。
Zで示されるハロゲン原子としては、 F、 Cl、 Brまたは Iが挙げられる。
また、アルコキシ基としては、直鎖状、分枝状又は環状でもよいが、直鎖状のものが 好ましぐ通常炭素数 1〜20、好ましくは炭素数 1〜5のものが挙げられる。
具体的には、例えばメトキシ基、エトキシ基、 n プロポキシ基、イソプロポキシ基、 n ブトキシ基、イソブトキシ基、 sec ブトキシ基、 tert ブトキシ基、 n ペンチルォ キシ基、イソペンチルォキシ基、 sec ペンチルォキシ基、 tert ペンチルォキシ基、 ネオペンチルォキシ基、 2—メチルブトキシ基、 1 ェチルプロポキシ基、 n—へキシ ルォキシ基、イソへキシルォキシ基、 sec へキシルォキシ基、 tert へキシルォキ シ基、ネオへキシルォキシ基、 2—メチルペンチルォキシ基、 3 メチルペンチルォキ シ基、 1, 2—ジメチルブトキシ基、 2, 2—ジメチルブトキシ基、 1 ェチルブトキシ基、 2—ェチルブトキシ基、 n—へプチルォキシ基、イソへプチルォキシ基、 sec へプチ ルォキシ基、 tert—へプチルォキシ基、ネオへプチルォキシ基、 n—ォクチルォキシ 基、イソォクチルォキシ基、 sec ォクチルォキシ基、 tert ォクチルォキシ基、ネオ ォクチルォキシ基、 n ノ-ルォキシ基、イソノ-ルォキシ基、 sec ノ-ルォキシ基、 tert ノ-ルォキシ基、ネオノ-ルォキシ基、 n—デシルォキシ基、イソデシルォキシ 基、 sec デシルォキシ基、 tert デシルォキシ基、ネオデシルォキシ基、 n—ゥン デシルォキシ基、イソゥンデシルォキシ基、 sec ゥンデシルォキシ基、 tert ゥンデ シルォキシ基、ネオゥンデシルォキシ基、 n—ドデシルォキシ基、イソドデシルォキシ 基、 sec ドデシルォキシ基、 tert—ドデシルォキシ基、ネオドデシルォキシ基、 n— トリデシルォキシ基、イソトリデシルォキシ基、 sec トリデシルォキシ基、 tert トリデ シルォキシ基、ネオトリデシルォキシ基、 n—テトラデシルォキシ基、イソテトラデシル ォキシ基、 sec テトラデシルォキシ基、 tert テトラデシルォキシ基、ネオテトラデシ ルォキシ基、 n—ペンタデシルォキシ基、イソペンタデシルォキシ基、 sec—ペンタデ シルォキシ基、 tert—ペンタデシルォキシ基、ネオペンタデシルォキシ基、 n—へキ サデシルォキシ基、 sec—へキサデシルォキシ基、 tert—へキサデシルォキシ基、ネ ォへキサデシルォキシ基、 n—へプタデシルォキシ基、イソへプタデシルォキシ基、 s ec—へプタデシルォキシ基、 tert—へプタデシルォキシ基、ネオへプタデシルォキ シ基、 n—ォクタデシルォキシ基、イソォクタデシルォキシ基、 sec—ォクタデシルォキ シ基、 tert—ォクタデシルォキシ基、ネオォクタデシルォキシ基、シクロプロピルォキ シ基、シクロブチルォキシ基、シクロペンチルォキシ基、シクロへキシルォキシ基、シ クロへプチルォキシ基、シクロォクチルォキシ基、シクロノ-ルォキシ基、シクロデシ ルォキシ基、シクロドデシルォキシ基、シクロウンデシルォキシ基、シクロトリデシルォ キシ基、シクロテトラデシルォキシ基、シクロペンタデシルォキシ基、シクロへキサデシ ルォキシ基、シクロへプタデシルォキシ基、シクロォクタデシルォキシ基等が挙げら れる。
Zで示されるァリールォキシ基、置換ァリールォキシ基のァリールォキシ基としては 、炭素数 4-16、好ましくは 5-14の芳香族性単環又は縮合多環が挙げられ、具体的に は、例えばフエ-ルォキシ基、トリルォキシ基、キシリルォキシ基、メシチルォキシ基、 ナフチルォキシ基、アントリルォキシ基、フエナントリルォキシ基等が挙げられる。 また、置換ァリールォキシ基の置換基としては、例えばノヽロゲン原子 (F、 Cl、 Brま たは I)、-トロ基、炭素数 1-3のパーフルォロアルキル基（トリフルォロメチル基、ペン タフルォロェチル基、ヘプタフルォロプロピル基）等が挙げられる。
一般式（3)にお 、て RU〜R16で示される炭素数 1-20のアルキル基、一般式（3')に おいて R21〜R23で示される炭素数 1-20のアルキル基、一般式（3")において R21で示 される炭素数 1-20のアルキル基、及び一般式 (3"')において R3Qで示される炭素数 1 -20のアルキル基は、直鎖状又は分枝状でもよいが、直鎖状のものが好ましぐ好まし くは炭素数 1〜5のものが挙げられる。
具体的には、例えばメチル基、ェチル基、 n—プロピル基、イソプロピル基、 n—ブ チル基、イソブチル基、 sec-ブチル基、 tert-ブチル基、 n—ペンチル基、イソペンチ ル基、 sec-ペンチル基、 tert-ペンチル基、ネオペンチル基、 n—へキシル基、イソへ キシル基、 sec-へキシル基、 tert-へキシル基、ネオへキシル基、 n プチル基、ィ ソへプチル基、 sec-ヘプチル基、 tert-ヘプチル基、ネオへプチル基、 n_ォクチル基 、イソォクチル基、 sec-ォクチル基、 tert-ォクチル基、ネオォクチル基、 n—ノ-ル基 、イソノニル基、 sec-ノニル基、 tert-ノニル基、ネオノニル基、 n—デシル基、イソデシ ル基、 sec-デシル基、 tert-デシル基、ネオデシル基、 n—ゥンデシル基、イソゥンデシ ル基、 sec-ゥンデシル基、 tert-ゥンデシル基、ネオゥンデシル基、 n—ドデシル基、ィ ソドデシル基、 sec-ドデシル基、 tert-ドデシル基、ネオドデシル基、 n—トリデシル基、 イソトリデシル基、 sec-トリデシル基、 tert-トリデシル基、ネオトリデシル基、 n—テトラ デシル基、イソテトラデシル基、 sec-テトラデシル基、 tert-テトラデシル基、ネオテトラ デシル基、 n—ペンタデシル基、イソペンタデシル基、 sec-ペンタデシル基、 tert-ぺ ンタデシル基、ネオペンタデシル基、 n キサデシル基、イソへキサデシル基、 sec -へキサデシル基、 tert-へキサデシル基、ネオへキサデシル基、 n プタデシル基 、イソへプタデシル基、 sec-ヘプタデシル基、 tert-ヘプタデシル基、ネオへプタデシ ル基、 n—ォクタデシル基、イソォクタデシル基、 sec-ォクタデシル基、 tert -オタタデ シル基、ネオォクタデシル基、 n—ノナデシル基、イソノナデシル基、 sec-ノナデシル 基、 tert-ノナデシル基、ネオノナデシル基、 n—ィコシル基、イソィコシル基、 sec-ィコ シル基、 tert-ィコシル基、ネオィコシル基等が挙げられる。
一般式（3)にお!/、て RU〜R16で示される炭素数 2-20のァルケ-ル基、一般式（3') において R21〜R23で示される炭素数 2-20のァルケ-ル基、一般式（3")において 1 で示される炭素数 2-20のァルケ-ル基及び一般式（3"')において R3Qで示される炭 素数 2-20のアルケニル基は、少なくとも 1つの二重結合を有する、直鎖状又は分枝 状、好ましくは直鎖状の炭化水素基であり、好ましくは炭素数 2〜5のものが挙げられ る。
具体的には、例えばェテュル、 1—プロべ-ル、 2—プロべ-ル、 1—メチル— 2— プロぺニノレ、 1—メチノレ一 1—プロぺニノレ、 2—メチノレ一 1—プロぺニノレ、 2—メチノレ一 2—プロぺニル、 2—ェチルー 2—プロぺニル、 1ーブテニル、 2—ブテニル、 1ーメチ ルー 2—ブテニル、 1ーメチルー 1ーブテニル、 3—メチルー 2—ブテニル、 1ーェチ ルー 2—ブテニル、 3—ブテニル、 1ーメチルー 3—ブテニル、 2—メチルー 3—ブテニ ル、 1—ェチル 3 ブテュル、 1—ペンテ-ル、 2 ペンテ-ル、 1—メチル 2 ぺ ンテニル、 2—メチルー 2 ペンテニル、 3 ペンテニル、 1ーメチルー 3 ペンテニル 、 2—メチルー 3 ペンテニル、 4 ペンテニル、 1ーメチルー 4 ペンテニル、 2—メ チノレー 4 ペンテ二ノレ、 1一へキセニノレ、 2 へキセニノレ、 3 へキセニノレ、 4一へキ セニノレ、 5—へキセニノレ、ヘプテニノレ、ォクテ二ノレ、テセニノレ、ドアセニノレ、テトラァセ -ル、へキサデセ -ル、ヘプタデセ -ル、ヘプタデカジエ-ル、ヘプタデカトリェ-ル 、ォクタデセ -ル、ノナデセ -ル、エイコセ-ル等が挙げられる。
[0025] 一般式（3)にお!/、て RU〜R16で示される炭素数 2-20のアルキ-ル基、一般式（3') において R21〜R23で示される炭素数 2-20のアルキ-ル基、一般式（3")において 1 で示される炭素数 2-20のアルキ-ル基及び一般式（3"')において R3Qで示される炭 素数 2-20のアルキニル基は、少なくとも 1つの三重結合を有する、直鎖状、分枝状又 は環状、好ましくは直鎖状の脂肪族炭化水素基であり、好ましくは炭素数 2〜5のもの が挙げられる。
具体的には、例えばェチュル基、 1 プロビュル、 2—プロピ-ル基、プロパルギル 、 1 プチ-ル基、 2—プチ-ル基、ペンチ-ル基、へキシュル基、ォクチ-ル基、 2 ェチルへキシュル基、デシ-ル基、ドデシ-ル基、ォクタデシニル基等が挙げられ る。
[0026] 一般式（3)にお!/、て RU〜R16で示される炭素数 1-20のアルコキシ基、一般式（3') において R21〜R23で示される炭素数 1-20のアルコキシ基、一般式（3")において R21 で示される炭素数 1-20のアルコキシ基及び一般式（3"')において R3Qで示される炭 素数ト 20のアルコキシ基は、直鎖状、分枝状又は環状でもよいが、好ましくは直鎖状 であり、好ましくは炭素数 2〜5のものが挙げられる。
具体的には、例えばメトキシ基、エトキシ基、 n プロポキシ基、イソプロポキシ基、 n ブトキシ基、イソブトキシ基、 sec ブトキシ基、 tert ブトキシ基、 n ペンチルォ キシ基、イソペンチルォキシ基、 sec ペンチルォキシ基、 tert ペンチルォキシ基、 ネオペンチルォキシ基、 2—メチルブトキシ基、 1 ェチルプロポキシ基、 n—へキシ ルォキシ基、イソへキシルォキシ基、 sec へキシルォキシ基、 tert へキシルォキ シ基、ネオへキシルォキシ基、 2—メチルペンチルォキシ基、 3 メチルペンチルォキ シ基、 1, 2—ジメチルブトキシ基、 2, 2—ジメチルブトキシ基、 1 ェチルブトキシ基、 2—ェチルブトキシ基、 n プチルォキシ基、イソへプチルォキシ基、 sec へプチ ルォキシ基、 tert プチルォキシ基、ネオへプチルォキシ基、 n—ォクチルォキシ 基、イソォクチルォキシ基、 sec ォクチルォキシ基、 tert ォクチルォキシ基、ネオ ォクチルォキシ基、 n ノ-ルォキシ基、イソノ-ルォキシ基、 sec ノ-ルォキシ基、 tert ノ-ルォキシ基、ネオノ-ルォキシ基、 n—デシルォキシ基、イソデシルォキシ 基、 sec デシルォキシ基、 tert デシルォキシ基、ネオデシルォキシ基、 n—ゥン デシルォキシ基、イソゥンデシルォキシ基、 sec ゥンデシルォキシ基、 tert ゥンデ シルォキシ基、ネオゥンデシルォキシ基、 n—ドデシルォキシ基、イソドデシルォキシ 基、 sec ドデシルォキシ基、 tert—ドデシルォキシ基、ネオドデシルォキシ基、 n— トリデシルォキシ基、イソトリデシルォキシ基、 sec トリデシルォキシ基、 tert トリデ シルォキシ基、ネオトリデシルォキシ基、 n—テトラデシルォキシ基、イソテトラデシル ォキシ基、 sec テトラデシルォキシ基、 tert テトラデシルォキシ基、ネオテトラデシ ルォキシ基、 n ペンタデシルォキシ基、イソペンタデシルォキシ基、 sec ペンタデ シルォキシ基、 tert ペンタデシルォキシ基、ネオペンタデシルォキシ基、 n キ サデシルォキシ基、 sec へキサデシルォキシ基、 tert へキサデシルォキシ基、ネ ォへキサデシルォキシ基、 n プタデシルォキシ基、イソへプタデシルォキシ基、 s ec へプタデシルォキシ基、 tert へプタデシルォキシ基、ネオへプタデシルォキ シ基、 n—ォクタデシルォキシ基、イソォクタデシルォキシ基、 sec—ォクタデシルォキ シ基、 tert—ォクタデシルォキシ基、ネオォクタデシルォキシ基、シクロプロピルォキ シ基、シクロブチルォキシ基、シクロペンチルォキシ基、シクロへキシルォキシ基、シ クロへプチルォキシ基、シクロォクチルォキシ基、シクロノ-ルォキシ基、シクロデシ ルォキシ基、シクロドデシルォキシ基、シクロウンデシルォキシ基、シクロトリデシルォ キシ基、シクロテトラデシルォキシ基、シクロペンタデシルォキシ基、シクロへキサデシ ルォキシ基、シクロへプタデシルォキシ基、シクロォクタデシルォキシ基等が挙げら れる。
一般式（3)にお 、て RU R16で示される炭素数 1-20のチォアルコキシ基、一般式（ 3')において R21 R23で示される炭素数 1-20のチォアルコキシ基、一般式（3")にお いて R21で示される炭素数 1-20のチォアルコキシ基及び一般式（3"')において R3°で 示される炭素数 1-20のチォアルコキシ基は、直鎖状、分枝状又は環状でもよいが、 好ましくは直鎖状であり、好ましくは炭素数 2〜5のものが挙げられる。
具体的には、例えば具体的には、例えばチオメトキシ基、チォエトキシ基、チォプロ ポキシ基、チォブトキシ基、チォペンチルォキシ基、チオメチルブトキシ基、チォェチ ルプロポキシ基、チォへキシルォキシ基、チオメチルペンチルォキシ基、チォジメチ ルブトキシ基、チォェチルブトキシ基、チォヘプチルォキシ基、チォォクチルォキシ 基、チオノニルォキシ基、チォデシルォキシ基、チォゥンデシルォキシ基、チォドデ シルォキシ基、チォトリデシルォキシ基、チォテトラデシルォキシ基、チオペンタデシ ルォキシ基、チォへキサデシルォキシ基、チォヘプタデシルォキシ基、チォォクタデ シルォキシ基、チオシクロプロピルォキシ基、チオシクロブチルォキシ基、チオシクロ ペンチルォキシ基、チオシクロへキシルォキシ基、チオシクロへプチルォキシ基、チ オシクロォクチルォキシ基、チオシクロノ-ルォキシ基、チオシクロデシルォキシ基、 チオシクロドデシルォキシ基、チオシクロウンデシルォキシ基、チオシクロトリデシルォ キシ基、チオシクロテトラデシルォキシ基、チオシクロペンタデシルォキシ基、チオシ クロへキサデシルォキシ基、チオシクロへプタデシルォキシ基、チオシクロォクタデシ ルォキシ基等が挙げられる。
一般式（3)にお!/、て RU〜R16で示される炭素数 1-20のアルキルスルホ-ル基、一 般式（3')において R21〜R23で示される炭素数 1-20のアルキルスルホ-ル基、一般式 (3")において R21で示される炭素数 1-20のアルキルスルホ -ル基及び一般式（3' ") において R3Qで示される炭素数 1-20のアルキルスルホ -ル基は、直鎖状、分枝状又 は環状でもよいが、好ましくは直鎖状であり、好ましくは炭素数 2〜5のものが挙げられ る。
具体的には、例えばメチルスルホ -ル基、ェチルスルホ -ル基、プロピルスルホ二 ル基、ブチルスルホ -ル基、ペンチルスルホ -ル基、へキシルスルホ -ル基、へプチ ルスルホニル基、ォクチルスルホ -ル基、ノ-ルスルホ -ル基、デシルスルホ -ル基 、ゥンデシルスルホ -ル基、ドデシルスルホ -ル基、トリデシルスルホニル基、テトラデ シルスルホ-ル基、ペンタデシルスルホ-ル基、へキサデシルスルホ -ル基、ヘプタ デシルスルホ -ル基、ォクタデシルスルホ -ル基、ノナデシルスルホ -ル基、ィコシル スルホニル基等が挙げられる。
[0029] 一般式（3)にお!/、て RU〜R16で示される炭素数 4-16のァリールスルホ-ル基、一般 式（3')において R21〜R23で示される炭素数 4-16のァリールスルホ-ル基、一般式（3' ')において R21で示される炭素数 4-16のァリールスルホ -ル基及び一般式（3"')にお V、て R3Qで示される炭素数 4-16のァリールスルホニル基は、単環又は縮合多環でもよ ぐ好ましくは炭素数 5〜14のものが挙げられる。
具体的には、例えばフエ-ルスルホ-ル基、トリルスルホ-ル基、キシリルスルホ- ル基、メシチルスルホ -ル基、ナフチルスルホ-ル基、アントリルスルホ-ル基、フエ ナントリルスルホ -ル基等が挙げられる。
[0030] 一般式（3)にお 、て RU〜R16で示される炭素及びへテロ原子の総数 2-20のへテロ アルキル基、一般式（3')において R21〜R23で示される炭素及びへテロ原子の総数 2- 20のへテロアルキル基、一般式（3")において R21で示される炭素及びへテロ原子の 総数 2-20のへテロアルキル基及び一般式（3"')にお 、て R3Qで示される炭素及びへ テロ原子の総数 2-20のへテロアルキル基は、 0、 S、 N及び P力 選ばれる少なくとも 1個のへテロ原子を主鎖残基の中に含む、上記した如きアルキル基又は後述のシク 口アルキル基であり、直鎖状、分枝状又は環状でもよぐ好ましくは炭素及びへテロ 原子の総数力 ¾〜10のものが挙げられる。また、含まれるヘテロ原子の数は、 1〜5個 である。
[0031] 一般式（3)にお 、て RU〜R16で示される炭素及びへテロ原子の総数 2-20のへテロ ァルケ-ル基、一般式（3')において R21〜R23で示される炭素及びへテロ原子の総数 2-20のへテロアルケ-ル基、一般式（3")において R21で示される炭素及びへテロ原 子の総数 2-20のへテロアルケ-ル基及び一般式（3"')において R3Qで示される炭素 及びへテロ原子の総数 2-20のへテロアルケ-ル基は、 0、 S、 N及び Pから選ばれる 少なくとも 1個のへテロ原子を主鎖残基の中に含む、上記した如きァルケ-ル基又は 後述のシクロアルケニル基であり、直鎖状、分枝状又は環状でもよぐ好ましくは炭素 及びへテロ原子の総数が 2〜10のものが挙げられる。また、含まれるヘテロ原子の数 は、 1〜5個である。 [0032] 一般式（3)にお!/、て RU〜R16で示される炭素数 3-8のシクロアルキル基、一般式（3' )において R21〜R23で示される炭素数 3-8のシクロアルキル基、一般式（3")において R21で示される炭素数 3-8のシクロアルキル基及び一般式（3"')にお 、て R3°で示され る炭素数 3-8のシクロアルキル基としては、好ましくは炭素数 5〜14のものが挙げられ る。
具体的には、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロ へキシル基、シクロへプチル基、シクロォクチル基等が挙げられる。
[0033] 一般式（3)にお!/、て RU〜R16で示される炭素数 3-8のシクロアルケ-ル基、一般式（ 3')において R21〜R23で示される炭素数 3-8のシクロアルケ-ル基、一般式（3")にお V、て R21で示される炭素数 3-8のシクロアルケ-ル基及び一般式（3"')にお!/、て R3Qで 示される炭素数 3-8のシクロアルケ-ル基は、二重結合を含むシクロアルキル基であ り、好ましくは炭素数 5〜14のものが挙げられる。
具体的には、例えばシクロペンテ-ル、メチルシクロペンテ-ル、シクロへキセ-ル 、メチノレシクロへキセニノレ、ジメチノレシクロへキセニノレ、ェチノレシクロへキセニノレ、ブ チノレシクロへキセニノレ、シクロへプテニノレ、シクロォクテ二ノレ、シクロデセニノレ、シクロ ドデセニル基等が挙げられる。
[0034] 一般式（3)にお 、て RU〜R16で示される炭素数 4- 16のァリール基、一般式（3')に おいて R21〜R23で示される炭素数 4- 16のァリール基、一般式（3")において R21で示 される炭素数 4-16のァリール基及び一般式 (3"')において R3Qで示される炭素数 4-1 6のァリール基は、芳香族性単環又は縮合多環であり、好ましくは炭素数 5〜14のも のが挙げられる。
具体的には、例えばフエ-ル基、 o—トリル基、 m—トリル基、 p—トリル基、 2, 3—キ シリル基、 2, 4—キシリル基、 2, 5—キシリル基、 2, 6—キシリル基、 3, 5—キシリル 基、メシチル基、ナフチル基、アントリル基、フエナントリル基等が挙げられる。
[0035] 一般式（3)にお 、て RU〜R16で示される炭素及びへテロ原子の総数 4-16のへテロ ァリール基、一般式（3')において R21〜R23で示される炭素及びへテロ原子の総数 4- 16のへテロァリール基、一般式（3")において R21で示される炭素及びへテロ原子の 総数 4- 16のへテロァリール基及び一般式（3' ")において R3Qで示される炭素及びへ テロ原子の総数 4-16のへテロァリール基は、 0、 S、 N及び P力 選ばれる少なくとも 1 個のへテロ原子を環の中に含む、上記した如きァリール基であり、単環又は縮合多 環でもよぐ好ましくは炭素及びへテロ原子の総数力 〜 14のものが挙げられる。また 、含まれるヘテロ原子の数は、 1〜5個である。
具体的には、例えば、フリル基、チェ-ル基、ピロリル基、ァゼピ-ル基、ピラゾリル 基、イミダゾリル基、ォキサゾリル基、イソキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル 基、 1, 2, 3—ォキサジァゾリル基、トリァゾリル基、テトラゾリル基、チアジアゾリル基、 ビラニル基、ピリジル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジュル基、モルホリニル 基、チオモルホリニル基、ピロリジニル基、ピロリニル基、イミダゾリジニル基、イミダゾ リニル基、ビラゾリジ-ル基、ビラゾリニル基、ピペリジル基、ピペラジ-ル等の単環、 例えば、シンノリ-ル基、ベンゾフラ-ル基、イソべンゾフラ-ル基、クロメ-ル基、キ サンテュル基、フ ノキサチイ-ル基、インドリジ-ル基、イソインドリル基、インドリル 基、インダゾリル基、プリニル基、キノリジニル基、イソキノリル基、キノリル基、フタラジ ニル基、ナフチリジニル基、キノキサリニル基、キナゾリニル基、カルバゾリル基、カル ボリ-ル基、アタリジ-ル基、イソインドリ-ル基、ベンゾキサゾリル基 (ベンゾキサゾー ル -2-ィル基）、ベンゾチアゾリル基（ベンゾチアゾール -2-ィル基）、ベンゾイミダゾリ ル基 (ベンゾイミダゾール -2-ィル基）、プテリジニル基等の上記単環と他の環式基が 縮環した基等が挙げられる。
一般式（3)にお 、て RU〜R16で示される炭素及びへテロ原子の総数 2-30のへテロ シクリル基、一般式（3')において R21〜R23で示される炭素及びへテロ原子の総数 2-3 0のへテロシクリル基、一般式（3")において R21で示される炭素及びへテロ原子の総 数 2-30のへテロシクリル基及び一般式（3"')において R3°で示される炭素及びへテロ 原子の総数 2-30のへテロシクリル基は、 0、 S及び Nから選択される少なくとも 1個の ヘテロ原子を含む、飽和、部分的に不飽和又は芳香族の 5〜 10員の複素環であり、 単環又は縮合多環でもよぐ好ましくは炭素及びへテロ原子の総数が 5〜14のものが 挙げられる。
具体的には、例えば、フリル基、チェ-ル基、ピロリル基、ァゼピ-ル基、ピラゾリル 基、イミダゾリル基、ォキサゾリル基、イソキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル 基、 1, 2, 3 ォキサジァゾリル基、トリァゾリル基、テトラゾリル基、チアジアゾリル基、 ビラニル基、ピリジル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジュル基、モルホリニル 基、チオモルホリニル基、ピロリジニル基、ピロリニル基、イミダゾリジニル基、イミダゾ リニル基、ビラゾリジ-ル基、ビラゾリニル基、ピペリジル基、ピペラジ-ル等の単環、 例えば、シンノリ-ル基、ベンゾフラ-ル基、イソべンゾフラ-ル基、クロメ-ル基、キ サンテュル基、フ ノキサチイ-ル基、インドリジ-ル基、イソインドリル基、インドリル 基、インダゾリル基、プリニル基、キノリジニル基、イソキノリル基、キノリル基、フタラジ ニル基、ナフチリジニル基、キノキサリニル基、キナゾリニル基、カルバゾリル基、カル ボリ-ル基、アタリジ-ル基、イソインドリ-ル基、ベンゾキサゾリル基 (ベンゾキサゾー ル -2-ィル基）、ベンゾチアゾリル基（ベンゾチアゾール -2-ィル基）、ベンゾイミダゾリ ル基 (ベンゾイミダゾール -2-ィル基）、プテリジニル基等の上記単環と他の環式基が 縮環した基等が挙げられる。
一般式（3)にお 、て R15及び R16が一緒になつて形成される炭素数 1-20のアルキレ ン基は、直鎖状、分枝状或いは環状でもよぐ好ましくは炭素数 1〜3のものが挙げら れる。
具体的には、メチレン基、エチレン基、メチルメチレン基，ェチルメチレン基，トリメチ レン基、プロピレン基、 2—プロピレン基，プロピルメチレン基，イソプロピルメチレン基 ,ジメチルメチレン基，テトラメチレン基、ブチレン基、 2—メチルプロピレン基、ペンタ メチレン基、ペンチレン基、 1—メチルトリメチレン基、 2—メチルトリメチレン基、 3—メ チルトリメチレン基， 1 ェチルエチレン基， 2—ェチルエチレン基，ェチルメチルェ チレン基、 1ーメチルテトラメチレン基、 2—メチルテトラメチレン基、 3—メチルテトラメ チレン基， 4ーメチルテトラメチレン基， 1, 1ージメチルトリメチレン基、 1, 2 ジメチル トリメチレン基、 1, 3 ジメチルトリメチレン基、 2, 2 ジメチルトリメチレン基、 2 ェ チルトリメチレン基、へキサメチレン基、へキシレン基、 1ーェチルトリメチレン基，ゥン デカメチレン基， 1ーメチルデカメチレン基， 1ーメチルペンタメチレン基、 2—メチル ペンタメチレン基、 3—メチルペンタメチレン基、 1, 2 ジメチルテトラメチレン基、 1, 3 ジメチルテトラメチレン基、 2, 3 ジメチルテトラメチレン基、 1, 1ージメチルテトラ メチレン基、 1ーェチルテトラメチレン基、 2—ェチルテトラメチレン基、 1ーェチルー 2 ーメチルトリメチレン基、 1 メチルへキサメチレン基、 1 メチルヘプタメチレン基、 1 メチルオタタメチレン基、 1 メチルノナメチレン基、ヘプタメチレン基、ヘプチレン 基、オタタメチレン基、オタチレン基、 2—ェチルへキシレン基、ノナメチレン基、ノ-レ ン基、デカメチレン基、デシレン基、ヘンデカメチレン基、ドデカメチレン基、トリデカメ チレン基，テトラデカメチレン基，ペンタデカメチレン基，へキサデカメチレン基，ォプ タデカメチレン基，ォクタデカメチレン基，ノナデカメチレン基，エイコサメチレン基、シ クロプロピレン基、シクロペンチレン基、シクロへキシレン基、シクロへプチレン基、シ クロオタチレン基、シクロノ-レン基、シクロデシレン基等が挙げられ、中でもエチレン 基が好ましい。
[0038] 一般式（3"')において R31で示されるハロゲン原子としては、 F、 Cl、 Brまたは Iが挙 げられる。
[0039] 本発明において、上記した如き光分解性保護基のうち、一般式 (3)で示されるもの が好ましぐ特に下記一般式 (4)及び（5)で示されるものが好ま 、。
尚、光分解性保護基である Q1と Q2は、同じであっても、また異なっていても良い。
Figure imgf000024_0001
[0041] 〔式中、 Ζ はハロゲン原子、イミダゾリル基又は 4-ニトロフエノキシ基であり、 Q、 A、 Y
、 Μ2、 Χ1及び Χ2は前記と同じである。〕
[0042] 一般式（5)において Ζ11で示されるハロゲン原子としては、 F、 Cl、 Brまたは Iが挙げ られる。
[0043] 上記一般式（3)、（4)及び（5)の化合物としては、
Figure imgf000025_0001
X1、 Χ2Α及び Μ1の中の 1 つが一般式（1)における Α1又は Ζ及び Α2と結合する結合手であって、 Qがー 0—、 Αが水酸基、 -0CH又は— OC H、 X2が— H、 Y1が— H、 Y2が— H、 X1が— Br、 Zが
3 2 5
— 0C(0)— (4-二トロフエ-ル)、— OC(0)0— (4- -トロフエ-ル)、— NR15C(0)R16、 - OC(0)NR15R16、— OP(0)R15R16、— OC(0)ZU又は M2と共に =Nであるものが好ましく
2
、なかでも Qが— 0—、 Aが一般式（1)における A1又は Z及び A2と結合する結合手、 X2が— H、 Y1が— H、 Y2が— H、 X1が— Br、 Zが— OC(O)— (4-二トロフエ-ル)、— OC (0)0— (4--トロフエ-ル)、— NR15C(0)R16、— OC(0)NR15R16、— OP(0)R15R16、— OC (0)ZU又は M2と共に =Nであるものが特に好ましい。
2
[0044] 上記した如き本発明の光分解性保護基は、例えば WO00/31588国際公開パンフレ ット、特開 2002— 315576号公報、 T. Furuta, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., vol. 96, pp. 1193-1200, February 1999, Chemistry, Neurobiology、 R. S. Givens, C. H. P ark, Tetrahedron Lett. 37, 6259-6262 (1996)、 C. H. Park, R. S. Givens, J. Am. Che m. Soc. 119, 2453-2463 (1997)、 J. Engels, E. J. Schlaeger. J. Med. Chem. 20, 907 ( 1977)、 J. H. Kaplan, G. Forbush III, J. F. Hoffinan, Biochemistry 17, 1920—1935 (19 78)等の記載に準じて適宜合成することができ、また、市販品を用いてもよい。特に上 記一般式（3)、（4)及び（5)の化合物は、例えば WO00/31588国際公開パンフレット 、特開 2002- 315576号公報、 T. Furuta, et al" Proc. Natl. Acad. Sci., USA., vol. 96, pp. 1193-1200, February 1999, Chemistry, Neurobiologyに記載の方法に準じて合 成することができる。
[0045] 1 - 2.リンカ一部
一般式（1)において、—Α1—!4—^—で示される構造部分は、 Q1及び Q2で示さ れる光分解性保護基を結合するためのリンカ一部である。
即ち、当該リンカ一部の Α1が上記した如き光分解性保護基 Q1に結合し、 Α2が上記 した如き光分解性保護基 Q2に結合することによって、 2つの光分解性保護基 Q1と Q2 を Τ1を介して結合した化合物を形成する。
より具体的には、例えば光分解性保護基が一般式 (3)である場合には、一般式 (3)
Figure imgf000026_0001
X1、 X2 A及び M1の中のいずれか 1つが結合手となって当該部位に 、当該リンカ一の A1又は Z及び A2が結合する。一般式（3)における Aが結合手とな つて Aの部位に当該リンカ一部の A1又は/及び A2が結合するのが好ましい。
光分解性保護基が一般式 (3')である場合には、一般式 (3')における 、 R22、 R23 、 R24及び R25の中のいずれか 1つが結合手となって当該部位に、当該リンカ一部の A 1又は Z及び A2が結合する。一般式（3')における R23が結合手となって R23の部位に 当該リンカ一部の A1又は Z及び A2が結合するのが好ましい。
光分解性保護基が一般式 (3")である場合には、一般式 (3")における 1、 R26、 R2 R28及び R29の中のいずれか 1つが結合手となって当該部位に、当該リンカ一部の A1又は/及び A2が結合する。一般式 (3")における R28が結合手となって R28の部位 に当該リンカ一部の A1又は Z及び A2が結合するのが好ましい。
光分解性保護基が一般式 (3"')である場合には、一般式 (3"')における R3°、 R32、 R33、 R34及び R35の中のいずれか 1つが結合手となって当該部位に、当該リンカ一部 の A1又は Z及び A2が結合する。一般式（3"')における R3Qが結合手となって R3Qの部 位に当該リンカ一の A1又は Z及び A2が結合するのが好ましい。
当該リンカ一の長さは、両末端に結合した Q1及び Q2が核酸間、核酸—タンパク質 又はポリペプチド間、或いはタンパク質又はポリペプチド間に結合するのに充分な長 さ、即ち、二本鎖核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれ、核酸とタンパク質 又はポリペプチドのそれぞれ、 2つのタンパク質又はポリペプチド（タンパク質間、タン パク質 ポリペプチド間又はポリペプチド間）のそれぞれを架橋し得る長さが好ま U、 。特に、二本鎖 RNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖に結合するのに充分な長さであ るのが好ましい。
より具体的には、架橋させる対象物質の種類により異なるため、一概には言えない が、リンカ一部の長さが、例えば下限が通常 2A以上、好ましくは 9A以上であり、上 限が通常 94 A以下、好ましくは 74 A以下である。
例えば、核酸間（二本鎖 DNA、二本鎖 RNA又は DNAと RNAとの二本鎖ハイブリッド） を架橋する場合は、リンカ一部の長さは、下限が通常 2A以上、好ましくは 9A以上、 より好ましくは 19A以上であり、上限が通常 44A以下、好ましくは 29 A以下である。 核酸とタンパク質又はポリペプチドを架橋する場合、或 、は 2つのタンパク質又はポ リペプチドを架橋する場合は、リンカ一部の長さは、下限が通常 4A以上、好ましくは 19 A以上であり、上限が通常 94 A以上、好ましくは 74 A以上である。
[0047] A A2及び T1で示されるアルキレン基は、直鎖状でも分枝状でも或 ヽは環状でもよ ぐ通常炭素数 1〜10、好ましくは 1〜8のものが挙げられる。
具体的には、例えばメチレン基、エチレン基、メチルメチレン基，ェチルエチレン基 ,トリメチレン基、プロピレン基、テトラメチレン基、ブチレン基、 1—メチルトリメチレン 基、 2—メチルトリメチレン基、ペンタメチレン基、ペンチレン基、 2, 2—ジメチルプロピ レン基、 2—メチルプロピレン基、 2—ェチルプロピレン基、 1ーメチルテトラメチレン基 、 2—メチルテトラメチレン基、 1,1-ジメチルエチレン基， 1,2-ジメチルエチレン基， 1, 3 ジメチルトリメチレン基、 2, 2 ジメチルトリメチレン基、 2 ェチルトリメチレン基、 へキサメチレン基、へキシレン基、ヘプチレン基、オタチレン基、 2—ェチルへキシレ ン基、ノナメチレン基、ノ-レン基、デカメチレン基、デシレン基、 1, 4 ジメチルテト ラメチレン基、 2, 3 ジメチルテトラメチレン基、 1, 2, 3 トリメチルトリメチレン基、 1, 2 ジェチルエチレン基、ヘプタメチレン基、 1, 5 ジメチルペンタメチレン基、 3— ェチルペンタメチレン基、オタタメチレン基、 1, 6 ジメチルへキサメチレン基、シクロ プロピレン基、シクロペンチレン基、シクロへキシレン基、シクロへプチレン基、シクロ オタチレン基、シクロノ-レン基、シクロデシレン基、シクロプロパン一 1, 2—ジメチレ ン基、シクロペンタン 1, 3 ジメチレン基、シクロへキサン一 1, 4ージメチレン基、 シクロへキサン一 1, 4ージエチレン基、シクロオクタン 1, 5 ジメチレン基、ァダマ ンタンジィル基、卜リシクロ [5. 2. 1. 02. 6]デカンジィル基、ノルボルナンジィル基、 メチルノルボルナンジィル基、イソボルナンジィル基、デカリンジィル基等が挙げられ る。
[0048] 一般式（1)において T1で示されるァリーレン基は、単環、縮合多環或いは非縮合 多環の何れでもよぐ通常炭素数 5〜 14が挙げられる。
具体的には、例えばフヱ-レン基、トリル基、キシリル基、メシチル基、ナフチレン基 、アントラセンジィル基、フエナントラセンジィル基、ビフエ-ルジィル基等が挙げられ る。 [0049] 一般式（1)において T1で示されるァラルキレン基は、アルキレン基とァリーレン基と を組み合わせてなる基が挙げられ、直鎖状でも分枝状でもよぐ通常炭素数 7〜10 である。
具体的には、例えば— CH— C Η―、 -CH CH— C Η―、— CH— C Η— CH
2 6 4 2 2 6 4 2 6 4 2 -CH CH C H -CH -CH CH CH— C Η CH(CH )-CH C H
2 2 6 4 2 2 2 2 6 4 3 2 6 4 CH CH CH CH― C H CH CH CH(CH )— C H—等が挙げられる。
2 2 2 2 6 4 2 2 3 6 4
[0050] 一般式（1)において T1で示されるヘテロ原子を含むアルキレン基、ヘテロ原子を含 むァリーレン基又はへテロ原子を含むァラルキレン基は、上記した如きアルキレン基 、ァリーレン基及びァラルキレン基の任意の位置の炭素原子がヘテロ原子を有する 二価の基に置換されたもの、換言すれば、上記した如きアルキレン基、ァリーレン基 及びァラルキレン基の鎖中の任意の位置にへテロ原子を有する二価の基を含むもの であり、且つ Ζで示される脱離基、リン酸、カルボキシル基、ヒドロキシル基又はアミノ 基等との対する反応活性を有さな 、若しくは極めて低 ヽものである。ヘテロ原子を有 する二価の基としては、例えば窒素原子、硫黄原子、酸素原子等のへテロ原子を有 する、 Ζで示される脱離基、リン酸、カルボキシル基、ヒドロキシル基又はアミノ基等と の反応活性を有さない若しくは極めて低い基が挙げられる。具体的には、例えば力 ルポ-ル基，チォカルボ-ル基，イミノ基，マロ-ル基， ― S— , —0— , ― Ν
[0051] 0
― s—
ο
― s—
ο
ο
II
― C— 0—
Η 0
I I I
― N-C—
/ ~~ \
― Ν Ν—
\ /
等が挙げられる。
[0052] 一般式（1)にお 、て 、 R2及び R3で示されるアルキル基は、アルキル基としては、 直鎖状でも分枝状でも或いは環状でもよぐ通常炭素数 1〜12、好ましくは 1〜6、よ り好ましくは 1〜4のものが挙げられる。
具体的には、例えばメチル基、ェチル基、 n—プロピル基、イソプロピル基、 n—ブ チル基、イソブチル基、 sec ブチル基、 tert ブチル基、 n ペンチル基、イソペン チル基、 sec ペンチル基、 tert ペンチル基、ネオペンチル基、 n—へキシル基、 イソへキシル基、 sec へキシル基、 tert へキシル基、ネオへキシル基、 n ヘプ チル基、イソへプチル基、 sec へプチル基、 tert へプチル基、ネオへプチル基、 n—ォクチル基、イソォクチル基、 sec—ォクチル基、 tert—ォクチル基、ネオォクチ ル基、 n ノ-ル基、イソノ-ル基、 sec ノ-ル基、 tert ノ-ル基、ネオノ-ル基、 n デシル基、イソデシル基、 sec デシル基、 tert デシル基、ネオデシル基、 n—ゥ ンデシル基、イソゥンデシル基、 sec ゥンデシル基、 tert ゥンデシル基、ネオゥン デシル基、 n—ドデシル基、イソドデシル基、 sec ドデシル基、 tert—ドデシル基、 ネオドデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシ ル基、シクロへプチル基、シクロォクチル基、シクロノ-ル基、シクロデシル基、シクロ ゥンデシル基、シクロドデシル基等が挙げられる。
[0053] 本発明のリンカ一部は、 A1—!4— A2—における主鎖を構成する原子数が下限 が通常 5個以上、好ましくは 7個以上であって、上限が通常 80個以下、好ましくは 70 個以下であるものが好ましい。
[0054] 上記した本発明のリンカ一部— A1— T1— A2 は、— A3— (T2— E) — T3— A4—で
P
示されるものが好ましい。
ここで、 A3及び A4はそれぞれ独立してアルキレン基、 一 0—、— NR1—、— 0— CO 一、 一C0— 0—、 一C— 0— C 、 一NR2—C00—、 一0C0—NR2—、 一NR3—C0 ―、— CO— NR3 又は— 0— COO— (Ri〜R3は前記と同じ。）を、 T2及び T3はそれぞ れ独立してアルキレン基を、 Eは結合手、窒素原子、硫黄原子、酸素原子、 0— C 0—又は— CO— 0—を示す。また、 pは 1以上の整数を示し、 p個の (T2— E)—は 同じでも異なって ヽてもよ ヽ。
[0055] A3、 A4、 T2及び T3で示されるアルキレン基は、直鎖状でも分枝状でも或いは環状 でもよぐ通常炭素数 1〜10、好ましくは 1〜8のものが挙げられる。その具体例は、 上記 A A2及び T1で示されるアルキレン基と同じである。
[0056] ρは、下限が 1以上であり、上限が通常 6以下、好ましくは 4以下、より好ましくは 2以 下である。
また、 ρ個の一 (f—E)—は同じでも異なっていてもよいが、 A3に結合（隣接)する T 2は T3と同じでものであるのが好まし!/、。
[0057] 上記のリンカ一部は、— A3— (T2— E) —T3—A4—における主鎖を構成する原子
P
数が下限が通常 5個以上、好ましくは 7個以上であって、上限が通常 80個以下、好ま しくは 70個以下であるものが好まし 、。
[0058] 本発明のリンカ一としては、より具体的には下記一般式で示されるものが挙げられ る。
Figure imgf000030_0001
[0060] 〔式中、 Ri〜R3は前記した通りであり、 mは 3以上の整数を示す。ここで、 2つの R1は それぞれ同じでも異なっていてもよぐ 2つの R2はそれぞれ同じでも異なっていてもよ い。また、 2つの R3はそれぞれ同じでも異なっていてもよい。〕
尚、 mは下限が通常 3以上、好ましくは 5以上であり、上限が通常 78以下、好ましく は 68以下である。
Figure imgf000031_0001
[0062] 1 - 3.具体的化合物 (架橋剤）
前記した通り、本発明の化合物 (架橋剤）は、光分解性保護基がリンカ一の両末端 に結合してなるものであり、一般式（1)、好ましくは一般式（2)で示される化合物であ る。
( 2
Figure imgf000031_0002
E及び pは前記と同じである。〕
[0065] 本発明の化合物 (架橋剤）としては、具体的には、例えば下記一般式 (6)で示され るものが挙げられる。
Figure imgf000031_0003
〔式中、 Q、
Figure imgf000032_0001
Τ2、 Τ3、 Ε及び ρは前記と同じである
。〕
また、本発明の化合物 (架橋剤）のうち、 目的対象物 (核酸、タンパク質又はポリべ プチド)のリン酸基に結合して目的対象物を架橋するものとしては、例えば下記一般 式（7)で示されるものが挙げられる。
Figure imgf000032_0002
〔式中、 Q
Figure imgf000032_0003
ZU、 M2、 X1、 X2、 A3、 T3、 E及び pは前記と同じであ る。〕
本発明の化合物 (架橋剤）のうち、 目的対象物 (核酸、タンパク質又はポリペプチド) のカルボキシル基、ヒドロキシル基又はアミノ基に結合して目的対象物を架橋するも のとしては、例えば下記一般式 (8)で示されるものが挙げられる。
Figure imgf000032_0004
〔式中、 Q、
Figure imgf000032_0005
Τ3、 Ε及び ρは前記と同じであ る。〕
本発明の化合物 (架橋剤）のうち、 目的対象物 (核酸、タンパク質又はポリペプチド) のリン酸基と、カルボキシル基、ヒドロキシル基又はアミノ基とに結合して目的対象物 を架橋するもの、即ち、 2つの光分解性保護基のうち一方が目的対象物のリン酸基と 結合し、他方が目的対象物のカルボキシル基、ヒドロキシル基又はアミノ基と結合す ること〖こよって目的対象物を架橋するものとしては、例えば下記一般式（9)で示され るものが挙げられる。
Figure imgf000033_0001
〔式中、 Q
Figure imgf000033_0002
Τ2 Τ3 Ε及び ρは前記と同じであ る。〕
1 4.本発明の化合物 (架橋剤）の合成
一般式（1)で示される本発明の化合物 (架橋剤）は、例えば以下の合成スキームに 従えば容易に合成することができる。
尚、下記合成スキーム中、 Q
Figure imgf000033_0003
Ζ ZU Μ2 X1 X2 R2 R3及び m は前記と同じである。また、下記合成スキームにおいて使用RさIれる略称の正式名は下 記の通りである。
EtN:トリエチノレアミン
3
DMF:N, N ジメチルホルムアミド
X'
Figure imgf000033_0004
(R2が Hの場合、例えば上記の合成スキームに従えば合成し得る。 )
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
2.本発明の架橋方法
本発明の化合物 (架橋剤)を用いれば、二本鎖核酸間、核酸 タンパク質又はポリ ペプチド間、或いはタンパク質又はポリペプチド間〔即ち、二本鎖核酸のセンス鎖及 びアンチセンス鎖のそれぞれ、核酸とタンパク質又はポリペプチドのそれぞれ、 2つの タンパク質又はポリペプチド (タンパク質間、タンパク質—ポリペプチド間又はポリべ プチド間）のそれぞれ (以下、「本発明に係る複合体」と略記する場合がある。；)〕を、 容易に架橋することができる。
即ち、本発明の化合物 (架橋剤）は、光分解性保護基中に、リン酸基、カルボキシ ル基、ヒドロキシル基及びアミノ基等力 選ばれる基に結合し得る基を有して 、るため 、本発明に係る複合体を構成する目的対象物 (核酸、タンパク質又はポリペプチド） が有するリン酸基、カルボキシル基、ヒドロキシル基及びアミノ基カゝら選ばれる基に結 合して本発明に係る複合体を架橋することができる。
換言すれば、本発明の化合物 (架橋剤）が有する 2つの光分解性保護基のうちの 一方が本発明に係る複合体を形成する一方の目的対象物 (核酸、タンパク質又はポ リペプチド）のリン酸基、カルボキシル基、ヒドロキシル基及びアミノ基カゝら選ばれる基 に結合し、他方の光分解性保護基が他方の目的対象物のリン酸基、カルボキシル基 、ヒドロキシル基及びアミノ基力 選ばれる基と結合することによって本発明に係る複 合体（当該複合体を構成する 2つの目的対象物）を架橋することができる。
その結果、本発明に係る複合体（当該複合体を構成する 2つの目的対象物）は、そ のリン酸残基、カルボキシル基、ヒドロキシル基又はアミノ基を介して、本発明の化合 物 (架橋剤)で、架橋されることとなる。 従って、本発明の架橋方法は、二本鎖核酸間、核酸—タンパク質又はポリペプチド 間、或いはタンパク質又はポリペプチド間を、当該複合体のリン酸基、カルボキシル 基、ヒドロキシル基及びアミノ基力 選ばれる基を介して上記した如き本発明の化合 物 (架橋剤）、好ましくは一般式（1)で示される化合物、より好ましくは一般式 (2)で示 される化合物、更に好ましくは一般式 (6)で示される化合物で架橋することを特徴と する。
より具体的には、本発明の架橋方法は、 1)本発明に係る複合体 (特に二本鎖 RNA) を、当該複合体 (特に二本鎖 RNA)のリン酸残基を介してリン酸に結合し得る基を有 する光分解性保護基を両末端に有する架橋剤又は一般式 (7)で示される化合物で 架橋すること、 2)本発明に係る複合体を、当該複合体のリン酸残基と、カルボキシル 基、ヒドロキシル基又はアミノ基とを介して一般式 (8)で示される化合物で架橋するこ と、及び 3)本発明に係る複合体を、当該複合体のカルボキシル基、ヒドロキシル基又 はアミノ基を介して一般式 (9)で示される化合物で架橋することを特徴とする。
[0081] 上記方法において、架橋対象となる二本鎖核酸としては、二本鎖を形成したもので あればよぐ特に限定されない。
具体的には、例えばプラスミド DNA、ゲノム DNA、 PCR等の自体公知の増幅方法で 合成された合成 DNA、 cDNA等の DNA、例えば mRNA、アンチセンス RNA等の RNA、 例えばサイクリックヌクレオチド等力も選ばれる 2つの核酸力もなるもの（例えば二本 鎖 DNA、二本鎖 RNA、 DNA— RNAハイブリッド等）が挙げられる。なかでも、二本鎖 R NAが好ましい。
[0082] また、架橋対象となるタンパク質としては、上記した如き核酸との複合体を形成し得 るもの、又は他のタンパク質或いはポリペプチドと複合体を形成し得るものであればよ ぐ特に限定されない。
具体的には、例 NF K B, NFAT, STATなどの転写因子， RNAポリメラーゼ等が挙げ られる。
[0083] 架橋対象となるポリペプチドとしては、上記した如き核酸との複合体を形成し得るも の、又は他のポリペプチド或いはタンパク質と複合体を形成し得るものであればよぐ 特に限定されない。 具体的には、例 PKC ε VI— 2 inhibitor peptide, RGD peptide, Zn finger peptide, le ucine zipper peptide, bHLH peptide等力 S挙げられ 。
[0084] 本発明は、上記した如き架橋対象のなかでも、特に二本鎖 RNAに対して有用であ る。
[0085] 本発明の化合物 (架橋剤）を用いて、上記した如き本発明に係る複合体を架橋する には、本発明の化合物 (架橋剤）と本発明に係る複合体とを、接触させればよい。 本発明の化合物 (架橋剤）と本発明に係る複合体とを接触させる方法としては、例 えば、本発明の化合物 (架橋剤)を含有する溶液と本発明に係る複合体を含有する 溶液とを混合し、下限が通常 1時間以上、好ましくは 4時間以上、より好ましくは 8時 間以上であり、上限が 36時間以下、好ましくは 24時間以下で、下限が通常 10°C以 上、好ましくは 15°C以上、より好ましくは 20°C以上であり、上限が通常 40°C以下、好ま しくは 35°C以下、より好ましくは 25°C以下で反応させればよ!、。
尚、上記において使用される本発明の化合物 (架橋剤）の使用量は、使用する本 発明の化合物 (架橋剤）の種類や架橋対象とする本発明に係る複合体の種類により 一概に言えないが、下限は通常架橋対象 (本発明に係る複合体） 1モルに対して 1モ ル以上、好ましくは通常架橋対象 (本発明に係る複合体） 1モルに対して 1モルを超 える量であって且つ架橋対象中の架橋し得る反応基 (リン酸基、カルボキシル基、ヒ ドロキシル基、アミノ基等）の組合せの数の 1Z4以上、より好ましくは架橋対象中の 架橋し得る反応基の組合せの数に対応するモル量である。上限は通常架橋対象中 の架橋し得る反応基の組合せの数の 10倍のモル量、好ましくは架橋対象中の架橋し 得る反応基の組合せの数の 5倍のモル量である。
ここで、架橋対象中の架橋し得る反応基の組合せとは、本発明に係る複合体を形 成する一方の目的対象物 (核酸、タンパク質又はポリペプチド)が有する、本発明の 化合物 (架橋剤)が有する 2つの光分解性保護基のうちの一方が結合し得る反応基（ 例えばリン酸基、カルボキシル基、ヒドロキシル基及びアミノ基カゝら選ばれる基）と、本 発明に係る複合体を形成する他方の目的対象物 (核酸、タンパク質又はポリべプチ ド）が有する、本発明の化合物 (架橋剤）が有する 2つの光分解性保護基のうちの他 方が結合し得る反応基 (例えばリン酸基、カルボキシル基、ヒドロキシル基及びアミノ 基から選ばれる基)との組合せを意味する。
また、架橋対象中の架橋し得る反応基の組合せの数とは、架橋対象が有する、本 発明の化合物 (架橋剤）が結合し得る上記した如き反応基の総数 (全ての組合せの 数)であり、換言すれば、本発明に係る複合体を形成する一方の目的対象物が有す る、本発明の化合物 (架橋剤）が有する 2つの光分解性保護基のうちの一方が結合し 得る反応基が結合し得る反応基と、本発明に係る複合体を形成する他方の目的対 象物が有する、本発明の化合物 (架橋剤）が有する 2つの光分解性保護基のうちの 他方が結合し得る反応基のどちらか少ない方の数である。
また、上記において、本発明の化合物 (架橋剤)又は Z及び本発明に係る複合体 を含有させる溶液としては、通常この分野で用いられるものであればよく特に限定さ れないが、例えば水、 DMSO、緩衝液（例えばトリス緩衝液、グッド緩衝液、 TE緩衝液 、 TAE緩衝液、 TBE緩衝液、 TBS緩衝液等）等が挙げられる。
尚、上記の如くして得られた、本発明の化合物 (架橋剤）が結合した本発明に係る 複合体は、一般的には、カラムクロマトグラフィー等の自体公知の精製法に供し、未 反応の本発明の化合物 (架橋剤)を除去し、本発明の化合物 (架橋剤）が結合した本 発明に係る複合体を精製することが望まし ヽ。
[0086] 尚、本発明には、本発明の化合物 (架橋剤）が結合した（によって架橋された)本発 明に係る複合体、即ち、本発明の化合物 (架橋剤)が結合した (によって架橋された） 二本鎖核酸、核酸 タンパク質複合体、核酸 ポリペプチド複合体、 2つのタンパク 質、タンパク質—ポリペプチド複合体、及び 2つのポリペプチドも包含される。
なかでも、本発明の化合物 (架橋剤）が結合した（によって架橋された)本発明に係 る複合体としては、本発明の化合物 (架橋剤）が結合した（によって架橋された）二本 鎖核酸が好ましぐ特に本発明の化合物 (架橋剤）が結合した（によって架橋された） 二本鎖 RNAが好ま Uヽ。尚、本発明の化合物 (架橋剤）の好まし!/ヽ例は上記した通り である。
[0087] 本発明の化合物 (架橋剤）が、本発明に係る複合体を架橋することによって、本発 明に係る複合体、即ち、二本鎖 DNA、二本鎖 RNA、 DNA— RNAハイブリッド等の二本 鎖核酸、核酸 タンパク質複合体、核酸 ポリペプチド複合体、タンパク質複合体、 ポリペプチド複合体、又はタンパク質 ポリペプチド複合体が元々有する機能が抑 制される。
例えば、本発明に係る複合体が二本鎖 DNAである場合には、転写系を有する宿主 内において、当該核酸分子の転写が抑制され、その結果、遺伝子の発現が抑制され る。
また、本発明に係る複合体が二本鎖 RNAである場合には、 RNAiにおいて、 siRNA が有する相補的な標的 mRNAの特異的分解作用が抑制される。
本発明に係る複合体が核酸 タンパク質複合体である場合には、転写系を有する 宿主内において，当該核酸分子下流の核酸分子の転写が抑制または活性化され， その結果，遺伝子の発現が抑制または活性化される。
本発明に係る複合体が核酸 ポリペプチド複合体である場合には、転写系を有す る宿主内において，当該核酸分子下流の核酸分子の転写が抑制または活性化され ,その結果，遺伝子の発現が抑制または活性化される。
本発明に係る複合体力タンパク質複合体である場合には、タンパク質複合体である 場合には，細胞内において当該タンパク質の機能が抑制または活性化される。
[0088] 本発明の化合物 (架橋剤）によって架橋された本発明に係る複合体に対して、紫外 線又は可視光等の光を照射することによって、当該本発明に係る複合体から本発明 の化合物 (架橋剤）を脱離させることができる。これにより、当該本発明に係る複合体 の機能抑制を解除することができる。
即ち、本発明の化合物 (架橋剤）により架橋された本発明に係る複合体は、当該複 合体が元々有する機能が抑制されているが、光を照射することにより本発明に係る複 合体と本発明の化合物 (架橋剤）との結合がはずれるため〔本発明の化合物 (架橋剤 )による架橋がはずれるため〕、当該複合体の機能が回復する。
[0089] 本発明において照射される光とは、波長が X線より長ぐ l〜900nm程度の波長範囲 の電磁波を意味する。なかでも、長波長側の、例えば、 350〜400nmの範囲の光が好 ましぐ更に好ましくは、波長が 365 ±6nm程度の光である。
また、当該光の照射時間としては、使用される本発明の化合物 (架橋剤)の種類や 架橋対象の本発明に係る複合体の種類等により異なるため一概には言えないが、照 射時間が長いと核酸分子に突然変異を誘発したり、本発明の化合物 (架橋剤）によつ て架橋された本発明に係る複合体を導入する細胞又は生物を損傷する虞があり、逆 に照射時間が短いと本発明の化合物 (架橋剤)を充分に脱離させられない虞がある。 具体的には、例えば 4 mj/cm2sの光を下限が 1分以上であり、上限が通常 10分以下、 好ましくは 3分以下照射する力、或いは、 376 mj/cm2sの光を下限が通常 0.1秒以上、 好ましくは 1秒以上であり、上限が通常 30秒以下、好ましくは 10秒以下照射すればよ い。
上述したように、本発明の化合物 (架橋剤)及びそれを用いた架橋方法によれば、 各種機能を有する本発明に係る複合体（二本鎖 DNA、二本鎖 RNA、 DNA— RNAノ、ィ ブリツド等の二本鎖核酸、核酸 タンパク質複合体、核酸 ポリペプチド複合体、タ ンパク質複合体、ポリペプチド複合体、又はタンパク質 ポリペプチド複合体)の機 能を抑制することができる。
更に、本発明の化合物 (架橋剤)で架橋された本発明に係る複合体に対して光を 照射することによって、抑制されていた本発明に係る複合体の機能を、任意の時期と 場所で回復すること、換言すれば、任意の時期と場所で本発明に係る複合体の機能 を制御することができる。
例えば、二本鎖 DNA、二本鎖 RNA、 DNA— RNAハイブリッド等の二本鎖核酸、核酸 タンパク質複合体、核酸 ポリペプチド複合体、タンパク質複合体、ポリペプチド 複合体、又はタンパク質 ポリペプチド複合体が有する未知の機能を任意の時期で 特異的に発現させたり、任意の場所で特異的に発現させたり、又は任意の時期及び 場所で特異的に発現させることが可能となる。
本発明の化合物 (架橋剤)及びそれを用いた架橋方法は、上記した如き用途以外 にも使用できる。
例えば、 In vivo, in vitro等で形成された本発明に係る複合体（二本鎖 DNA、二本 鎖 RNA、 DNA— RNAハイブリッド等の二本鎖核酸、核酸 タンパク質複合体、核酸 ポリペプチド複合体、タンパク質複合体、ポリペプチド複合体、又はタンパク質 ポリ ペプチド複合体)を本発明の化合物 (架橋剤)で架橋し、架橋された複合体を単離し た後に当該複合体に光を照射すれば、当該複合体を構成する各成分 (核酸鎖、タン パク質、ポリペプチド)を、変化させることなぐその機能を保持させたまま、単離する ことができる。従って、この方法によれば、複合体を構成する成分を明らかにするだけ でなぐ各構成成分の機能が保持されているので、細胞'組織'生体内等の複合体の 形成作用（各構成成分の相互作用）やその機能の解析等に極めて有用である。 また、例えば、本発明に係る複合体が薬効を有する場合 (例えば RNAiを利用した 所謂 RNAi医薬品等）には、当該複合体を本発明の化合物 (架橋剤)で架橋してその 薬効を抑制しておき、架橋された複合体を細胞 ·組織，生体内等に投与した後、光を 照射することにより、抑制されていた薬効を回復させて病気の治療等を行うことができ る。この方法によれば、光照射の範囲や時間をコントロールすることにより、目的とす る特定の部位 (病巣等）に特異的に薬効を生じさせたり、任意の時期（時間）に薬効 を生じさせることが可能となる。
[0091] 3.本発明の遺伝子発現調節方法
本発明の化合物 (架橋剤)及びそれを用いた架橋方法は、上述したような種々の用 途に使用することができる力 特に、二本鎖 RNAを用いた RNAi法に有用である。
[0092] 本発明の遺伝子発現調節方法は、上記した如き本発明の化合物 (架橋剤）を予め 結合させた二本鎖 RNAに対して、光を照射することを特徴とする。
即ち、先ず、二本鎖 RNAに本発明の化合物 (架橋剤）を結合させることによって、換 言すれば、二本鎖 RNAを本発明の化合物 (架橋剤)で架橋することによって、二本鎖 RNAの遺伝子発現阻害作用（当該二本鎖 RNAと相補的な標的 mRNAの分解作用）を 抑制することができる。即ち、本発明の化合物 (架橋剤）を所定の遺伝子 (標的 mRNA )に対する二本鎖 RNA(siRNA)に結合させて二本鎖 RNA(siRNA)を架橋することによ つて、細胞又は生物内における当該遺伝子 (標的 mRNA)を発現させることができる。 次 ヽで、本発明の化合物 (架橋剤)で架橋された二本鎖 RNAに対して光を照射する ことによって、当該複合体から本発明の化合物 (架橋剤）を脱離させ、抑制されてい た二本鎖 RNAの遺伝子発現阻害作用（当該二本鎖 RNAと相補的な標的 mRNAの分 解作用）を回復させることができ、その結果、当該遺伝子 (標的 mRNA)の発現を抑制 することができる。これにより、特定の遺伝子 (標的 mRNA)の発現を任意の時期と場 所で調節 (制御)することができる。 [0093] 本発明の遺伝子発現調節方法は、例えば二本鎖 RNAを用いた RNAi法等の二本鎖 RNAを用いた自体公知の遺伝子発現調節方法にお!ヽて、使用される二本鎖 RNAを 予め本発明の化合物 (架橋剤)で架橋し、遺伝子の発現調節を行う際、即ち遺伝子 の発現を抑制する際に当該本発明の化合物 (架橋剤)で架橋された二本鎖 RNAに対 して光を照射する以外は、自体公知の方法に従って実施すれば良ぐ使用される材 料、試薬類等も自体公知の方法で用いられて ヽるものを使用すればよ!、。
[0094] 本発明の遺伝子発現調節方法は、具体的には以下の工程 (a)〜(c)を含むものであ る。
(a)本発明の化合物 (架橋剤）と二本鎖 RNAとを接触させて、二本鎖 RNAを架橋する 工程、
(b)架橋された二本鎖 RNAを細胞又は生物に導入する工程、及び
(c)導入された細胞又は生物に光を照射する工程。
[0095] 3- 1.二本鎖 RNA架橋工程〔工程 〕
(1)二本鎖 RNA
本発明の方法で用いられる二本鎖 RNAは、 RNAiを媒介し得るもの（RNAiを生じる 能力を有するもの）、即ち、当該二本鎖 RNAが相補的な標的 mRNAの特異的な分解 を促進することにより標的タンパク質の発現を特異的に抑制する現象を引き起こすも の（標的 mRNAを分解する能力を有するもの）であれば良ぐ各種細胞、生物、組織 等の天然物カゝら抽出した RNA、合成 RNA、組み換え RNA等何れも使用可能である。 尚、二本鎖 RNAを構成するリボヌクレオチドは、例えば天然に存在しない核酸塩基 を含むリボヌクレオチド（例えば、 5— (2—ァミノ）プロピルゥリジン、 5—ブロモウリジン 等の 5位置で修飾されたゥリジンまたはシチジン、例えば 8—ブロモグアノシン等の 8 位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば 7—デァザ アデノシン等のデ ァザヌクレオチド、例えば N6—メチルアデノシン等の O および N アルキル化ヌク レオチド）、糖修飾リボヌクレオチド（例えば H、 OR、ハロゲン原子、 SH、 SR41、 NH
2
、 NHR41、 NR41または CN力 なる群より選択される基で糖の 2'OH基が置換された
2
ものであって、 R41は、 C〜Cアルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロゲ
1 6
ン原子は、 F、 Cl、 Brまたは Iであるもの）、骨格鎖修飾リボヌクレオチド (例えば、隣接 するリボヌクレオチドを結合するホスホエステル基を、例えばホスホチォエート基の修 飾基で置換したもの）、及びこれらを組み合わせたリボヌクレオチド等を含んでいても よい。
また、本発明の方法で用いられる二本鎖 RNAの配列は、標的 mRNAに対し十分な 同一性を有していなければならない。好ましくは、この配列は、二本鎖 RNAの二本鎖 部分における標的 mRNAに対して、少なくとも 50%、好ましくは少なくとも 70%、より 好ましくは少なくとも 85%、特に好ましくは 100%の同一性を有するものである。 当該二本鎖 RNAの長さは、 RNAiを媒介し得る（RNAiを生じる能力を有する）長さで あれば良ぐ特に限定されない。具体的には、各 RNA鎖が、下限が通常 19塩基長以 上、好ましくは 20塩基長以上、より好ましくは 25塩基長以上、上限が通常 1500塩基長 以下、好ましくは 1000塩基長以下、より好ましくは 500塩基長以下である。尚、二本鎖 RNAが導入される細胞又は生物が動物である場合には、好ましくは上限が 30塩基長 以下、より好ましくは 27塩基長以下である。
このような二本鎖 RNAとしては、例えば特表 2003-529374号、特表 2004-526422号、 特表 2002-516112号、特開 2004-261002号等に記載されたものが挙げられる。
[0096] 上記した如き二本鎖 RNAは、通常この分野で用いられて 、る自体公知の方法〔例 えば特表 2003-529374号、特表 2004-526422号、特表 2002-516112号、特開 2004-26 1002号等〕により得ることができ、また、市販のキットを用いても得ることができる。
[0097] 二本鎖 RNAは、一般的には、適当な溶媒に下限が通常 1 μ Μ以上、好ましくは 10 Μ以上、より好ましくは 20 μ Μ以上であり、上限が通常 100 μ Μ以下、好ましくは 50 μ Μ 以下、より好ましくは 30 Μ以下の濃度の二本鎖 RNA含有溶液として調製される。
[0098] (2)本発明の化合物 (架橋剤）と二本鎖 RNAとの接触
本発明の化合物 (架橋剤）と二本鎖 RNAとを接触させて、二本鎖 RNAを架橋するに は、例えば、本発明の化合物 (架橋剤）を含有する溶液と二本鎖 RNAを含有する溶 液とを混合し、下限が通常 1時間以上、好ましくは 4時間以上、より好ましくは 8時間以 上であり、上限が 36時間以下、好ましくは 24時間以下で、下限が通常 10°C以上、好 ましくは 15°C以上、より好ましくは 20°C以上であり、上限が通常 40°C以下、好ましくは 35°C以下、より好ましくは 25°C以下で反応させればよい。 尚、上記方法において使用される本発明の化合物 (架橋剤）としては、リン酸に結 合し得る基を有する光分解性保護基を両末端に有する架橋剤が好ましぐ一般式 (7 )で示される化合物 (架橋剤）が特に好ま ヽ。
上記において使用される本発明の化合物 (架橋剤）の使用量は、使用する本発明 の化合物 (架橋剤)の種類等により一概に言えないが、下限は通常架橋対象である 二本鎖 RNA 1モルに対して 1モル以上、好ましくは二本鎖 RNA 1モルに対して 1モル を超える量であって且つ二本鎖 RNA中の架橋し得る反応基 (リン酸基、カルボキシル 基、ヒドロキシル基、アミノ基等）の組合せの数の 1Z4以上、より好ましくは二本鎖 RN A中の架橋し得る反応基の組合せの数に対応するモル量である。上限は通常二本 鎖 RNA中の架橋し得る反応基の組合せの数の 10倍のモル量、好ましくは二本鎖 RN A中の架橋し得る反応基の組合せの数の 5倍のモル量である。
ここで、二本鎖 RNA中の架橋し得る反応基の組合せとは、二本鎖 RNAを形成する 一方の RNA鎖が有する、本発明の化合物 (架橋剤）が有する 2つの光分解性保護基 のうちの一方が結合し得る反応基 (例えばリン酸基、ヒドロキシル基及びアミノ基から 選ばれる基)と、当該二本鎖 RNAを形成する他方の RNA鎖が有する、本発明の化合 物 (架橋剤）が有する 2つの光分解性保護基のうちの他方が結合し得る反応基 (例え ばリン酸基、ヒドロキシル基及びアミノ基カゝら選ばれる基）との組合せを意味する。 また、二本鎖 RNA中の架橋し得る反応基の組合せの数とは、二本鎖 RNAが有する 、本発明の化合物 (架橋剤）が結合し得る上記した如き反応基の総数 (全ての組合せ の数)であり、換言すれば、二本鎖 RNAを形成する一方の RNA鎖が有する、本発明 の化合物 (架橋剤）が有する 2つの光分解性保護基のうちの一方が結合し得る反応 基が結合し得る反応基と、二本鎖を形成する他方の RNA鎖が有する、本発明の化合 物 (架橋剤）が有する 2つの光分解性保護基のうちの他方が結合し得る反応基のどち らか少な 、方の数である。
また、上記において、二本鎖 RNA又は Z及び本発明の化合物 (架橋剤）を含有さ せる溶液 (溶媒）としては、通常この分野で用いられるものであればよく特に限定され ないが、例えば水、 DMSO、緩衝液（例えばトリス緩衝液、グッド緩衝液、 TE緩衝液、 TAE緩衝液、 TBE緩衝液、 TBS緩衝液等）等が挙げられる。 尚、上記方法においては、反応液をカラムクロマトグラフィー等の自体公知の精製 法に供し、未反応の本発明の化合物 (架橋剤)を除去し、本発明の化合物 (架橋剤） が結合した二本鎖 RNAを精製することが望ま U、。
[0099] 3 - 2.二本鎖 RNA導入工程〔工程 (b)〕
上記の如くして得られた本発明の化合物 (架橋剤）が結合した二本鎖 RNAを細胞又 は生物内に導入（トランスフエタト）する。
[0100] (1)細胞又は生物
本発明にお 、て用いられる細胞又は生物としては、照射する光を透過することがで き、導入（トランスフエタト）された二本鎖 RNAに対して当該光のエネルギーが供給さ れるものであればよぐ特に限定されない。
このような細胞としては、例えば真核細胞又は細胞系、例えば植物細胞又は動物 細胞 (ヒト、ラット等の哺乳動物細胞、線虫細胞、昆虫細胞等）、例えば胚細胞 (発生 初期のアフリカッメガエルの胚細胞、ゼブラフィッシュの胚細胞、ショウジヨウバエ細胞 等）、多能性幹細胞、腫瘍細胞、例えば奇形癌細胞又はウィルス感染細胞、各種生 物由来の単一層様の培養細胞等が挙げられる。
生物としては、真核生物、植物又は動物（例えばヒト、ラット等の哺乳動物、線虫、 昆虫等)が挙げられる。
[0101] (2)細胞又は生物への二本鎖 RNAの導入
上記した如き細胞又は生物内に本発明の化合物 (架橋剤）が結合した二本鎖 RNA を導入（トランスフエタト)する方法としては、自体公知の方法を使用することができる。 このような方法としては、例えばリン酸カルシウム法、 DEAE—デキストラン法、エレク トロポレーシヨンおよびマイクロインジェクション、ウィルス法、カチオンリボソーム〔例え ば Tfx50 (Promega)、リポフエクトァミン 2000 (Life Technologies)等〕を用いる方法等 が挙げられる（Graham, F丄.および van der Eb, A.J. (1973) Virol. 52, 456、 McCutcha n, J.H.および Pagano, J.S. (1968) J. Natl. Cancer Inst. 41, 351、 Chu, G.ら（1987) Nuc 1. Acids Res. 15, 1311、 Fraley, Rら（1980) J. Biol. Chem. 255, 10431、 Capechi, M.R. (1980) Cell 22, 479、 Feigner, P丄.ら（1987) , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413) 0 上記した如き自体公知の方法に従って、本発明の化合物 (架橋剤）が結合した二 本鎖 RNAを細胞又は生物内に容易に導入（トランスフエタト)することができ、また、巿 販のトランスフエクシヨン用キットを用いても容易に行うことができる。
[0102] 本発明の化合物 (架橋剤）が結合した二本鎖 RNAが導入された細胞又は生物内に おいては、本発明の化合物 (架橋剤）によって、二本鎖 RNAが本来有している RNAiを 媒介し得る能力（RNAiを生じる能力）、即ち、当該二本鎖 RNAが相補的な標的 mRNA の特異的な分解を促進することにより標的タンパク質の発現を特異的に抑制する現 象を引き起こす能力（標的 mRNAを分解する能力）が抑制されており、二本鎖 RNAが 導入されていない状態 (通常の状態)と同様の遺伝子（当該二本鎖 RNAと相補的な 標的 mRNA)が発現して 、ることとなる。
[0103] 3- 3.光照射工程〔工程 (c)〕
次 、で、本発明の化合物 (架橋剤）が結合した二本鎖 RNAが導入された細胞又は 生物に光を照射することによって、本発明の化合物 (架橋剤）が結合した二本鎖 RNA から本発明の化合物 (架橋剤）を脱離させる。
即ち、本発明の化合物 (架橋剤）が結合することにより抑制されていた二本鎖 RNA の遺伝子発現阻害作用（当該二本鎖 RNAと相補的な標的 mRNAの分解作用）を、光 の照射により本発明の化合物 (架橋剤）と二本鎖 RNAとの結合をはずして回復させ、 当該遺伝子 (標的 mRNA)の発現を抑制する。
[0104] (1)光の照射
使用される光は、前述と同様であり、 l〜900nm程度の波長範囲の電磁波、好ましく は長波長側の、例えば、 350〜400nmの範囲の光、更に好ましくは、波長が 365±6nm 程度の光である。
また、当該光の照射時間も前述と同様であり、具体的には、例えば 4mJ/cm2Sの光 を下限が 1分以上であり、上限が通常 10分以下、好ましくは 3分以下照射するか、或 いは、 376mJ/cm2sの光を下限が通常 0.1秒以上、好ましくは 1秒以上であり、上限が 通常 30秒以下、好ましくは 10秒以下照射すればよい。尚、照射時間が長いと二本鎖 RNAに突然変異を誘発したり、本発明の化合物 (架橋剤）によって架橋された二本鎖 RNAを導入する細胞又は生物を損傷する虞があり、逆に照射時間が短いと本発明の 化合物 (架橋剤）を充分に脱離させられな 、虞があるので注意が必要である。 [0105] 光の照射は、本発明の化合物 (架橋剤）が結合した二本鎖 RNAが導入された細胞 又は生物の全部（全体)でも、また、その一部であってもよい。
光を本発明の化合物 (架橋剤）が結合した二本鎖 RNAが導入された細胞又は生物 の全部（全体)又は一部に照射することによって、当該細胞又は生物の全部（全体） 又は一部における遺伝子の発現を抑制するができる。
尚、当該細胞又は生物の全部 (全体）に光を照射する場合には、光源、光照射手 段 (例えば水銀灯等の紫外線照射手段等）に対して当該細胞又は生物を対向させ ればよい。これにより、本発明の化合物 (架橋剤）が結合した二本鎖 RNAが導入され た細胞又は生物の全体にお!/、て目的遺伝子 (標的遺伝子)の発現を抑制することが できる。
また、当該細胞又は生物の一部に光を照射する場合には、光源、光照射手段 (例 えば水銀灯等の紫外線照射手段等)から出射した光を、対物レンズ等を含む光学系 によりスポット光とし、当該細胞又は生物の所定の領域のみに光スポットを照射すれ ばよい。これにより、本発明の化合物 (架橋剤）が結合した二本鎖 RNAが導入された 細胞又は生物における所定の領域のみで (標的遺伝子)の発現を抑制することがで きる。
[0106] 上記したように、本発明の工程 (a)〜(c)を行うことにより、特定の遺伝子 (標的 mRNA )の発現を任意の時期と場所で調節 (制御)することができる。
即ち、本発明の化合物 (架橋剤）が結合した二本鎖 RNAがその細胞内又は生物内 に存在していても、その二本鎖 RNAに相補的な標的 mRNA (標的遺伝子）の発現は 抑制されておらず、その後における所望の時期又は Z及び場所に、光を照射するこ とによって当該遺伝子の発現を特異的に抑制することができる。
尚、特定の標的遺伝子 (標的 mRNA)の発現は、光照射後の、本発明の化合物 (架 橋剤）が結合した二本鎖 RNAが導入された細胞又は生物を、常法に従って当該細胞 又は生物が成育し得る適当な条件下で培養又は生育して当該細胞又は生物中の遺 伝子を発現させる際に、光照射によって本発明の化合物 (架橋剤）が外れた二本鎖 R NAの作用による当該細胞又は生物内で生じる RNAi効果により抑制される。
従って、本発明の工程 (a)〜(c)を含む遺伝子発現調節方法は、工程 (c)の後に、更 に工程 (c')光照射された細胞又は生物中の遺伝子を発現させる工程、を含むものが 好ましい。
[0107] 4.本発明の遺伝子機能調査方法
上記した如き方法において、光照射の前後における本発明の化合物 (架橋剤）が 結合した二本鎖 RNAが導入された細胞又は生物中の遺伝子の発現を比較すること により、遺伝子の機能の解析、特定、同定等を行うことができる。
従って、本発明の遺伝子機能調査方法は、（a)本発明の化合物 (架橋剤)と二本鎖 RNAとを接触させて、二本鎖 RNAを架橋する工程、（b)架橋された二本鎖 RNAを細胞 又は生物に導入する工程、（c)導入された細胞又は生物に光を照射する工程、（c')光 照射された細胞又は生物中の遺伝子を発現させる工程、及び (d)工程 (c')で発現した 遺伝子と対照とを比較する工程、を含むことを特徴とする。
[0108] 本発明において、対照とは、架橋された二本鎖 RNAが光照射によって当該二本鎖 RNA (光照射によって本発明の化合物 (架橋剤）が脱離した二本鎖 RNA)の作用によ り生じる RNAi効果によって発現が抑制される遺伝子 (標的遺伝子）と同じ遺伝子、即 ち、当該二本鎖 RNAと相補的な標的 mRNAを有する細胞又は生物における、当該二 本鎖 RNAにより実質的に発現が抑制されていない当該遺伝子を意味する。
このような対照としては、例えば (0架橋された二本鎖 RNAが導入された細胞又は生 物であって、光照射されて!/、な 、細胞又は生物にお 、て発現された遺伝子 (架橋さ れたニ本鎖 RNAが導入された細胞又は生物と同種のものであって、架橋された二本 鎖 RNAが導入されて 、るが光が照射されて 、な 、当該細胞又は生物にお 、て発現 された遺伝子、光が照射される細胞又は生物における光照射前の当該細胞又は生 物において発現された遺伝子等）、 GO架橋された二本鎖 RNAが導入された細胞又は 生物と同種のものであって、架橋された二本鎖 RNAが導入されていない細胞又は生 物にお!ヽて発現された遺伝子、（iii)架橋された二本鎖 RNAが導入された細胞又は生 物であって、光が照射される細胞又は生物における、光照射されていない部分 (領域 )において発現された遺伝子等が挙げられる。
尚、これらの対照は、単独で用いても良いが、適宜組み合わせて用いても良い。
[0109] 本発明にお 、て、工程 ( で発現した遺伝子と対照との比較は、例えば光照射後 の本発明の化合物 (架橋剤）が結合した二本鎖 RNAが導入された細胞又は生物と対 照の細胞又は生物における、標的遺伝子（二本鎖 RNAと相補的な標的 mRNA)の発 現の増減 (発現量)又は発現の有無、標的遺伝子 (標的 mRNA)の発現産物 (タンパ ク質等)の増減 (タンパク質量)又は発現産物 (タンパク質等)の有無 的遺伝子（ 標的 mRNA)の発現で生じる表現型等を、自体公知の方法に従い測定、観察し、その 結果を比較することにより行う。
尚、本発明において、遺伝子を発現させるには、本発明の化合物 (架橋剤）が結合 した二本鎖 RNAが導入された細胞又は生物又は Z及び対照の細胞又は生物を、常 法に従って当該細胞又は生物が成育し得る適当な条件下で培養又は生育して当該 細胞又は生物中の遺伝子を発現させればよい。
[0110] 本発明の遺伝子機能調査方法は、具体的には例えば以下の工程 (a)〜(d)を含むも のが挙げられる。
(a)本発明の化合物 (架橋剤）と二本鎖 RNAとを接触させて、二本鎖 RNAを架橋する 工程、
(b)架橋された二本鎖 RNAを細胞又は生物に導入する工程、
(c)導入された細胞又は生物に光を照射する工程、
(c')光照射された細胞又は生物中の遺伝子を発現させる工程、
(c")導入された細胞又は生物に光を照射せずに、当該細胞又は生物中の遺伝子を 発現させる工程、及び
(d)工程 ( で発現した遺伝子と工程 (c")で発現した遺伝子とを比較する工程。
尚、工程 (c)における光照射される細胞又は生物と、工程 (c")における光照射されな い細胞又は生物とは、同一のもの〔一つ（群）の細胞 '個体〕であっても、同種のもの〔 異なる細胞 '個体〕であってもよいが、一般的には、これらは同種のものであって異な る細胞'個体である。
[0111] その他の具体例としては、例えば以下の工程 (a)〜(d)を含むものが挙げられる。
(a)本発明の化合物 (架橋剤）と二本鎖 RNAとを接触させて、二本鎖 RNAを架橋する 工程、
(b)架橋された二本鎖 RNAを細胞又は生物に導入する工程、 (b')光を照射する前に、導入された細胞又は生物中の遺伝子を発現させる工程、
(c)導入された細胞又は生物に光を照射する工程、
(c')光照射された細胞又は生物中の遺伝子を発現させる工程、及び
(d)工程 (b')で発現した遺伝子と工程 ( で発現した遺伝子とを比較する工程。
尚、工程 (b')における細胞又は生物と、工程 ( における細胞又は生物とは、同一 のもの〔一つ（群）の細胞'個体〕である。
[0112] その他の具体例としては、例えば以下の工程 (a)〜(d)を含むものが挙げられる。
(a)本発明の化合物 (架橋剤）と二本鎖 RNAとを接触させて、二本鎖 RNAを架橋する 工程、
(b)架橋された二本鎖 RNAを細胞又は生物に導入する工程、
(c)導入された細胞又は生物に光を照射する工程、
(c')光照射された細胞又は生物中の遺伝子を発現させる工程、
(c")架橋された二本鎖 RNAが導入されて 、な 、細胞又は生物中の遺伝子を発現さ せる工程、及び
(d)工程 (b')で発現した遺伝子と工程 ( で発現した遺伝子とを比較する工程。
尚、工程 (c")における細胞又は生物は、工程 (b)において架橋された二本鎖 RNAが 導入された細胞又は生物と同種のもの〔異なる細胞《個体〕、即ち、同種のものであつ て異なる細胞，個体である。
[0113] 尚、上記方法において、使用される本発明の化合物 (架橋剤）、二本鎖 RNA、本発 明の化合物 (架橋剤）と二本鎖 RNAとの接触方法、架橋された二本鎖 RNAを導入す る細胞又は生物、当該細胞又は生物へ架橋された二本鎖 RNAを導入する方法、光、 光の照射方法、細胞又は生物中の遺伝子を発現させる方法、これら構成要件の好ま しい態様、具体例等は前記と同様である。
[0114] また、前記した如ぐ本発明の遺伝子機能調査方法においても、光の照射は、本発 明の化合物 (架橋剤）が結合した二本鎖 RNAが導入された細胞又は生物の全部 (全 体)でも、また、その一部であってもよい。当該細胞又は生物の一部に光を照射する ことにより、本発明の化合物 (架橋剤）が結合した二本鎖 RNAが導入された細胞又は 生物における所定の領域のみでの遺伝子の機能を調査することができる。 このような場合の具体例としては、例えば以下の工程 (a)〜(d)を含むものが挙げられ る。
(a)本発明の化合物 (架橋剤）と二本鎖 RNAとを接触させて、二本鎖 RNAを架橋する 工程、
(b)架橋された二本鎖 RNAを細胞又は生物に導入する工程、
(c)導入された細胞又は生物の所定の領域に光を照射する工程、
(c')光照射された細胞又は生物中の遺伝子を発現させる工程、及び
(d)工程 (b')で発現した光が照射された領域における遺伝子と光が照射されて 、な ヽ 領域における遺伝子とを比較する工程。
尚、上記における細胞又は生物は、一つ (群）の細胞 ·個体である。
[0115] 5.本発明のキット
本発明のキットは、上記した如き本発明の架橋方法、遺伝子発現調節方法又は遺 伝子機能調査方法を実施するために使用されるものである。
このようなキットとしては、少なくとも先述した如き本発明の化合物 (架橋剤）、好まし くは一般式（1)で示される化合物、より好ましくは一般式 (2)で示される化合物、更に 好ましくは一般式 (6)で示される化合物、特に好ましくは一般式（7)で示される化合 物、一般式 (8)で示される化合物及び一般式（9)で示される化合物力 選ばれる 1つ の化合物、最も好ましくは一般式（7)で示される化合物を含んでなるものである。 これら構成要件の好ましい態様と具体例は上で述べた通りである。
[0116] 更に、上記以外の試薬類を加えて、本発明のキットとすることもできる。このような試 薬類としては、例えば二本鎖 RNAを細胞又は生物に導入するためのトランスフエクシ ヨン用試薬等が挙げられるが、これらに限定されない。
[0117] また、前述した如き本発明の架橋方法、遺伝子発現調節方法又は遺伝子機能調 查方法での使用のための説明書等を含ませておいても良い。当該「説明書」とは、本 発明の方法における特徴 ·原理 ·操作手順等が文章又は図表等により実質的に記載 されている当該キットの取り扱い説明書、添付文書、或いはパンフレット（リーフレット） 等を意味する。
[0118] 本発明の方法は、例えば以下のような効果を奏する。 (1)配列が知られている標的遺伝子の mRNA (標的 mRNA)を破壊することにより、そ の遺伝子の機能を探索することができるので、標的遺伝子の機能解析に有効である
(2)未知遺伝子 (例えば疾患関連遺伝子)の探索や候補標的遺伝子の絞り込み等 に有効である。
(3)遺伝子の機能と当該遺伝子が発現して!/ヽな ヽ状態での表現型の迅速な解析が 可能である。
(4)病気を治療するための RNAiを利用した所謂 RNAi医薬品の開発にも使用できる。 特に本発明によれば組織又は部位特異的に薬効を生じさせることが可能な RNAi医 薬品を開発し得る。
[0119] 以下に実施例及び比較例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら により何等限定されるものではな 、。
実施例
[0120] 実施例 1 グルタル酸ビス（6-ブロモ -4-ジァゾメチル -2-ォキソ -2H-クロメン -7-ィル) エスァノレ (Pentanedioic acid bis(6— bromo— 4— diazomethy卜 2— oxo— 2H— chromen— 7— yl) ester) (本発明の化合物 1)の合成
Figure imgf000052_0001
本発明の化合物 1
[0121] 10 mlナスフラスコに、 24.9 mg (0.0898 mmol)の 6-ブロモ -7-ヒドロキシ- 4-ジァゾメ チルクマリン、ジクロロメタン 1 ml、トリェチルァミン 17.4 1(0.1078 mmol),グルタリル クロライド 5.726 μ 1(0.0449 mmol)を入れ、室温で 1日間攪拌した。その後、クロ口ホル ムで希釈し、有機層を蒸留水で洗い、反応を停止させた。硫酸マグネシウムで乾燥さ せた後、溶媒を除去し、本発明の化合物 1の粗成生物を得た (0.2753 mg , 0.0418 m mol, yield 93%,黄色固体)。
尚、 6-ブロモ -7-ヒドロキシ- 4-ジァゾメチルクマリンは、 WO00/31588国際公開パン フレットに記載の方法に準じて合成した。 H NMR (270 MHz, DMSO— d )
6
S 2.21(2H,q,H3，）、 2.89(4H,t,2H2，，2H4，）、 6.00(H,S,— CH =N), 6.73(H,S,H3)、 7.54 (H,S,H8)、 8.23(H,S,H5)
[0122] 実施例 2 グルタル酸（6-ブロモ -4-ジァゾメチル -2-ォキソ -2H-クロメン) -7-ィル 2-[ 4-(6-ブロモ -4-ジァゾメチル -2-ォキソ -2H-クロメン -7-ィルォキシカルボニル)ブチリ ルォキシ]ェチルエステル (Pentanedioic acid (6- bromo- 4- diazomethyト 2- oxo- 2H-c hromen)- 7- yl 2- [4- (6- bromo- 4- diazomethyl- 2- oxo- 2H- chromen- 7- yloxycarbonyl) butyryloxylethyl ester) (本発明の化合物 2)の合成
[0123] (1)グルタル酸モノ〔2- (4-カルボキシブチリルォキシ)ェチル〕エステル (Pentanedioic acid mono[2-(4-carboxybutyryloxy)ethyl] ester; (ィ匕合物 1)の合成
Figure imgf000053_0001
化合物 1
[0124] 50 mlナスフラスコに、無水グルタル酸 2.5668 g (22.496 mmol)、ジクロロメタン 20 ml、エチレングリコール 564.5 μ 1 (10.12 mmol),トリェチルァミン 3.245 ml (23.28 mm ol)を順次加え、室温で 2時間攪拌後、 40°Cで 18.5時間攪拌した。その後、イオン交換 榭脂〔ダウケミカル社製、 00\^ 1 2 (50-100メッシュ）〕4.1907 g, 9.7724 g, 1.4920 g を 3回に分けて加え、 1回目添加後にジクロロメタンで濾過し、 2回目添加後にジクロ ロメタンで、 3回目添加後にメタノールでそれぞれ濾過した。次いで、溶媒を除去し、 化合物 1の粗生成物を得た（3.036 g, 10.46 mmol, 93% yield from JH NMR)。
JH NMR(270 MHz, CDC1 )
3
δ 1.97(4H,tt,2H3，，2H10，）、 2.43(4H,t,2H2 ' ,2H11 ' , J=7.3Hz), 2.47(4H,t,2H4' ,2H9 ， ,J=7.3Hz)、 4.31(4H,S,2H6' ,2H7' )
[0125] (2) 4-クロ口カルボ-ル酪酸〔2-(4-クロ口カルボ-ルブチリルォキシ)ェチル〕エステ ノレ (4- chlorocarbonylbutyric acid [2-(4-chlorocarbonylbutyryloxy)ethyl] ester) (ィ匕合 物 2)の合成
Figure imgf000054_0001
化合物 2
[0126] 100 mlナスフラスコに、 268.8 mg(0.9260 mmol)の上記（1)で得られた化合物 1、チ ォ-ルクロライド 168.8 1(2.3151 mmol), DMF ldropをカ卩え、 70〜80°Cで 2時間攪 拌した。その後、チォユルク口ライド、 DMF、 HC1を除去し、 JH NMRから化合物 2の粗 生成物を得た (296.9 g, 0.9075 mmol, 98 %, 白色固体)。
JH NMR(270 MHz, CDC1 )
3
S 2.05(4H,tt,2H3，，2H10，）、 2.45(4H,t,2H2' ,2Η11 ' , J=7.3Hz), 2.75(4H,t,2H4' ,2H9 ， ,J=7.3Hz)、 4.31(4H,S,2H6' ,2H7')
[0127] (3)グルタル酸（6-ブロモ -4-ジァゾメチル -2-ォキソ -2H-クロメン) -7-ィル 2-[4-(6- ブロモ -4-ジァゾメチル -2-ォキソ -2H-クロメン -7-ィルォキシカルボニル)ブチリルォ =Τン]ェチノレエスァノレ (Pentanedioic acid (り— bromo— 4— diazometnyi— 2— oxo— 2H— chro men)- 7- yi 2- [4- (6- bromo- 4- diazomethyト 2- oxo- 2H- chromen- 7- yloxycarbonyl)but yryloxylethyl ester) (本発明の化合物 2)の合成
Figure imgf000054_0002
10 mlナスフラスコに、 61.6 mg (0.219 mmol)の 6-ブロモ -7-ヒドロキシ- 4-ジァゾメチ ルクマリン、ジクロロメタン 3 mlをカ卩えた。この溶液にトリェチルァミン 33.6 μ 1(0.241 m mol),上記（2)で得られた化合物 2 33.5 μ g(0.0991 mmol)を入れ、室温で 1日間攪 拌した。その後、クロ口ホルムで希釈し、有機層を蒸留水で洗い、反応を停止させた。 硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒を除去し、本発明の化合物 2の粗生成物を 得た (82.4 mg, 0.101 mmol, yield 92%,黄色固体)。
尚、 6-ブロモ -7-ヒドロキシ- 4-ジァゾメチルクマリンは、 WO00/31588国際公開パン フレットに記載の方法に準じて合成した。
JH NMR (270 MHz, DMSO— d )
6
S 2.05(4H,tt,2H3，，2H10，）、 2.45(4H,t,2H2' ,2Η11 ' , J=7.3Hz), 2.75(4H,t,2H4' ,2H9 ' ,J=7.3Hz), 4.31(4H,S,2H6，，2H7，）、 5.95(H,S, -CH=N), 6.69(H,S,H3)、 7.45(H,S,H 8)、 8.17(H,S,H5)
[0129] 実施例 3 3,3-ジメチルダルタル酸（6-ブロモ -4-ジァゾメチル -2-ォキソ -2H-クロメン) -7-ィル 2-[4-(6-ブロモ - 4-ジァゾメチル - 2-ォキソ -2H-クロメン -7-ィルォキシカルボ ニル) -3,3-ジメチルブチリルォキシ]ェチルエステル (3 , 3-dimethylpentanedioic acid (6- bromo- 4- diazomethyト 2- oxo- 2H- chromen)- 7- yi 2- [4- (6- bromo- 4- diazomethyト 2— oxo— 2H— chromen— 7— yloxycarbonyl)— 3,3— dimethylbutyryloxy]ethyl ester) (本発明 の化合物 3)の合成
[0130] (1) 3, 3-ジメチルダルタル酸モノ〔2- (4-カルボキシ- 3, 3-ジメチルブチリルォキシ)ェ チノレ」エス "ノレ (3,3-dimetnyipentanedioic acid mono[2— (4— carboxy— 3,ύ— dimethylbut yryloxy)ethyl] ester) (ィ匕合物 3)の合成
Figure imgf000055_0001
化合物 3
[0131] 50 mlナスフラスコに、無水ジメチルダルタル酸 4.3785 g (30.799 mmol)を入れ、ジ クロロメタン 20 ml、エチレングリコール 837.0 μ 1 (15.00 mmol),トリェチルァミン 4.93 9 ml (35.42 mmol)を順次カ卩え、室温で 2時間攪拌後、 40°Cで 24時間攪拌した。その 後、室温に戻し、イオン交換榭脂〔ダウケミカル社製、 Dowexl X 2 (50- 100メッシュ）〕 6 gを加え、ジクロロメタンで濾過した。次いで、溶媒を除去し、化合物 3の粗生成物を 得た（4.5085 g , 13.009 mmol, 88% yield from H NMR)。
1H NMR(270 MHz, CDC1 )
3
δ = 1.15(12H,s,3 ' -2CH3, 10' -2CH3), 2.48(4H,s,2H，，2H )、 2.51(4H,s,2H，，2H
2 11 4
，）ゝ 4.28(4H,s,2H，，2H，）
9 6 7
[0132] (2) 4-クロ口カルボ-ル- 3,3-ジメチル酪酸 〔2-(4-クロ口カルボ-ル- 3,3-ジメチルブ チリノレオキシ)ェチノレ〕エステノレ (4-chlorocarbonyl-3 , 3-dimethylbutyric acid [2- (4- ch lorocarbonyl-3 , 3-dimethylbutyryloxy)ethyl] ester) (ィ匕合物 4)の合成
Figure imgf000056_0001
化合物 4
[0133] 100 mlナスフラスコに、 299.7 mg(0.9260 mmol)の上記（1)で得られた化合物 3、チ ォ-ルクロライド 158 1(2.3151 mmol), DMF ldropをカ卩え、 70〜80°Cで 2時間攪拌し た。その後、チォユルク口ライド、 DMF、 HC1を除去し、化合物 4の粗生成物を得た (30 9.1 mg , 13.009 mmol, 88% yield from JH NMR)。
1H NMR(270 MHz, CDC1 )
3
δ = 1.15(12H,s,3，— 2CH3, 10，— 2CH3)、 2.47(4H,s,2H，，2H ，）、 3.15(4H,s,2H，，2H
2 11 4 9
，）、 4.29(4H,s,2H，，2H，）
6 7
[0134] (3) 3, 3-ジメチルダルタル酸（6-ブロモ -4-ジァゾメチル -2-ォキソ -2H-クロメン) -7-ィ ル 2-[4-(6-ブロモ - 4-ジァゾメチル - 2-ォキソ -2H-クロメン -7-ィルォキシカルボ-ル） —3,3—ンメチノレフチリノレオキン」ェテノレエスァノレ (3,«3— dimethylpentanedioic acid (り— br omo- 4- diazometnyl- 2- oxo- 2H- cnromen)- 7- yl 2- [4- (6- bromo- 4- aiazomethyl- 2- ox o—2H— chromen— 7— yloxycarbonyl)— 3,3— dimethylbutyryloxy]ethyl ester) (本発明のィ匕 合物 3)の合成
Figure imgf000057_0001
[0135] 10 mlナスフラスコに、 28.27 mg(0.0737 mmol)の上記（2)で得られた化合物 4、ジク ロロメタン 1 ml、トリェチルァミン 33.9 μ 1(0.243 mmol), 6-ブロモ -7-ヒドロキシ- 4-ジ ァゾメチルクマリン 62.2 mg(0.2213 mmol)をカ卩え、 40 °Cで 24時間攪拌した。その後、 室温に戻し、水を 1 ml加え、クロ口ホルムとジクロロメタンで交互に抽出し、有機層を 硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒を除去し、本発明の化合物 3の粗生成物を 得た（55.5 mg , 0.0636 mmol, 87% yield from 1H NMR)。
尚、 6-ブロモ -7-ヒドロキシ- 4-ジァゾメチルクマリンは、 WO00/31588国際公開パン フレットに記載の方法に準じて合成した。
1H NMR(270 MHz, DMSO)
δ = 1.08 (12H,s,3' -2CH and 10'— 2CH ), 2.68 (4H,s,H and H ), 3.22 (4H,s,H
3 3 2' 11'
and H ), 4.19 (4H,s,H and H ), 5.85 (H,s,— CH=N) 6.60 (H,s,H ), 7.30 (H,s,H
4' 9' 6' T 3 8
), 8.06 (H,s,H )
5
[0136] 実施例 4 本発明の化合物による二本鎖 RNAの架橋
本発明の化合物が二本鎖 RNAを架橋するか否かについて確認した。
(1)架橋剤溶液
実施例 3で得られた本発明の化合物 3を 21.1 μ Μの濃度となるように DMSO溶液に 溶解したものを架橋剤溶液とした。
(2)試料
下表 1の組成となるように、架橋剤溶液若しくは DMSOと、 siRNA (二本鎖 RNA)溶液 (20 M siRNA含有 TE干渉液）とを混合し、 8時間遮光条件で静置した。これらの試 料のうち、試料 No.5及び 6については、 Southern N.E. Ultraviolet社製 Rayonet Pho tochemical Reactor 装置を用いて 3分間 UV (350nm)を照射した。
その後、各試料に 5%ホルムアミド 2 μ 1を加え、試料 Νο.2、 4及び 6については、こ れを 65°Cで 15分間加熱した後、 10分間氷中で静置したものを試料とした。
尚、 siRNAは GFPをターゲットとする下記の塩基配列からなる 22 bpのもの（QIAGEN 社製)を使用した。
5し GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU-3'
3 -GCCGUUCGACUGGGACUUCAAG - 5'
[0137] [表 1]
Figure imgf000058_0001
[0138] (3)電気泳動
上記（2)で得られた各試料に、 2 μ 1のサンプルバッファー（グリセリン 3ml、 0.5M E DTA-HC1水溶液 (pH8.0) 0.1ml及び精製水 6.9mlを混合して調製したもの）を加え混 合した後、 BIO CRAFT社製の MODEL BE- 211電気泳動装置、 20%ポリアクリルアミ ドゲル及び X I TBEバッファーを用いて、 7mA (定電流)で 1時間電気泳動した。 その後、当該ゲルを SYBR GOLD (Molecular Probes社製）で染色し、トランスイルミ ネーター (フナコシ社製)で観察した。
[0139] (4)結果
結果を図 1に示す。尚、図中のレーン No.lは試料 No.6を用いた場合の結果を、レ ーン No.2は試料 No.4を用いた場合の結果を、レーン No.3は試料 No.5を用いた場合 の結果を、レーン No.4は試料 No.3を用いた場合の結果を、レーン No.5は試料 No.2を 用いた場合の結果を、レーン No.6は試料 No.lを用いた場合の結果をそれぞれ示し、 「dsRNA→」は二本鎖 RNAの泳動位置を、また、「ssRNA→」は一本鎖 RNAの泳動位 置をそれぞれ示す。
[0140] 図 1から明らかなように、レーン No.5及び 6の結果から、本発明の化合物 (架橋剤）と 反応させていない二本鎖 RNA(siRNA) (レーン No.5 :試料 No.2)は熱変性に耐えられ ず、一本鎖に解離していることが判る。これに対して、本発明の化合物 (架橋剤）と反 応させた二本鎖 RNA(siRNA) (レーン No.2 :試料 No.4)は、 UVを照射しなければ熱変 性させたにもかかわらず二本鎖を保っていることが、本発明の化合物 (架橋剤）と反 応させた後、 UVを照射し、更に加熱したもの（レーン No.l :試料 No.6)は一本鎖に解 離して 、ることがそれぞれ判る。
以上のことから、本発明の化合物 (架橋剤）は二本鎖 RNA(siRNA)を架橋し、 UVを 照射することによりその架橋が外れることが明らかであり、更に、この架橋によって、二 本鎖 RNAの熱安定性が高まることが判る。
[0141] 実施例 5 本発明の化合物による RNAi効果抑制能力の確認
(1)試薬
•HeLa細胞（American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD))
• DMEM培地（日水製薬 (株)製、ダルベッコ改変イーグル培地-ッスィ 2)
• Opti- MEM培地（GIBCO社製）
•トリプシン溶液（2.5mgトリプシン含有 0.38mg/ml EDTA水溶液： GIBCO社製） •リポフエクトァミン 2000 (Invitrogen社製）
•pEGFP- N1ベクター溶液
pEGFP— N1ベクター（CLONTEC社製、 BD Living colors)が 1714 g/mlとなるよう に TE緩衝液に溶解したものを使用した。
•pDsRed2- N1ベクター溶液
pDsRed2— N1ベクター（CLONTEC社製、 BD Living colors)が 1612 μ gZmlとなる ように TE緩衝液に溶解したものを使用した。
•siRNA溶液：
下記の配列力 なる二本鎖 RNA (EGFP遺伝子を標的としたもの）を 200nMの濃度と なるように水に溶解したものを使用した。 5し GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU-3'
3 -GCCGUUCGACUGGGACUUCAAG - 5'
'架橋剤溶液：
実施例 1〜3で得られた本発明の化合物 1〜3を、それぞれ 4 /z Mの濃度となるよう に DMSO溶液に溶解したものを架橋剤溶液とした。
[0142] (2)トランスフエクシヨン用 Hela細胞の調製
24穴プレートに 3 X 104個 Zwellとなるように HeLa細胞（Hela細胞及び 10% FBS含 有 DMEM培地 500 μ ΐ)をまいた。 24時間後に、古い培地を除去し、 Hela細胞を PBS( ―)溶液で洗浄した後、当該 PBS (—)溶液を除去し、 lwellあたり 10% FBS含有 DMEM 培地 500 1を加えた。これをトランスフエクシヨン用 Hela細胞プレートとした。
[0143] (3)トランスフエクシヨン用試料の調製
i) siRNAの架橋
下表 2に示すように、架橋剤溶液 1及び siRNA溶液 0.20 1を混合し、 8時間遮 光条件で静置した。これらのうち、 No.2、 4及び 6については、 Southern N.E. Ultravio let社製 Rayonet Photochemical Reactor装置を用いて 3分間 UV (350nm)を照射した
[0144] [表 2]
Figure imgf000060_0001
[0145] ii)試料の調製
下表 3に示すように、 Opti- MEM培地 90 μ 1、 pRGFPベクター溶液 0.36 μ 1、 pDsRed ベクター溶液 0.60 1及び上記 i)で調製した反応液 0.40 1を混合し、 15分間静置し 、これをトランスフエクシヨン用試料とした。 また、 i)で調製した反応液の代わりに、 siRNA溶液 (本発明の化合物で架橋されて Vヽな 、二本鎖 RNA) 0.20 μ 1を用いて上記と同様の操作を行ったものを対照試料とし た。
尚、ここで、 pEGFP 0.36 中には 617 ngの pEGFPが、 pDsRed 0.60 1中には 985 ngの pDsRedが、 200nM siRNA 0.20 μ 1中には 62.6 pgの siRNAがそれぞれ含有して いる。
[表 3]
Figure imgf000061_0001
[0147] (4)トランスフエクシヨン
Opti- MEM培地 9.2 μ 1にリポフエクトァミン 2000 0.8 μ 1をカ卩えて 10分間静置した。 次いで、これと、上記 ii)で得られたトランスフエクシヨン用試料を混合し、 20分間静 し 7こ。
得られた混合液を、上記（2)で調製したトランスフエクシヨン用 Hela細胞プレート〖こ 加え、 COインキュベーター（NAPCO社製、 Automatic CO Incubators 5400)を用い
2 2
て、 37°Cで 48時間で培養した。
[0148] (5)結果
培養後、細胞の透過像、 EGFP及び DsRedの蛍光像の観察を行った。
Meta Morph解析ソフト（Meta Imaging Software社製）を用いて、 EGFP及び DsRedそ れぞれの蛍光エリアのトータル面積を求め、 EGFPZDsRed比を求めた。 その結果を図 2に示す。
尚、図 2は、当該解析ソフトを用いて一定面積あたりの EGFP発現細胞の面積と DsR ed発現細胞の面積をカウントし、 EGFPと DsRedをコトランスフエクシヨンした際の発現 比率を 100 %とし、各試料における EGFPの発現量を相対値で示したものである。
[0149] 図 2の結果から明らかなように、本発明の化合物は何れも siRNAと結合することによ つて、 siRNAの RNAi効果を抑制し得ること、更に、 UVの照射によってその RNAi抑制 を回復し得ることが判る。なかでも本発明の化合物 2及び 3は RNAi効果の抑制作用 が高ぐその作用は本発明の化合物 3が最も高いことが判る。
[0150] 実施例 6 本発明の化合物と siRNAとの反応時間の検討
(1)試薬
架橋剤溶液として、実施例 3で得られた本発明の化合物 3を 4 Mの濃度となるよう に DMSO溶液に溶解したものを使用した以外は、実施例 5と同じものを使用した。
[0151] (2)トランスフエクシヨン用 Hela細胞の調製
実施例 5と同じ方法で調製した。
[0152] (3)トランスフエクシヨン用試料の調製
i) siRNAの架橋
架橋剤溶液 0.2 1及び siRNA溶液 0.20 1を混合し、 0時間、 1時間、 2時間、 4時間 、 8時間又は 24時間遮光条件で静置した。
[0153] ii)試料の調製
下表 4に示すように、 Opti- MEM培地 90 μ 1、 pRGFPベクター溶液 0.36 μ 1、 pDsRed ベクター溶液 0.60 1及び上記 i)で調製した反応液 0.40 1を混合し、 15分間静置し 、これをトランスフエクシヨン用試料とした。
また、 i)で調製した反応液の代わりに、 siRNA溶液 (本発明の化合物で架橋されて Vヽな 、二本鎖 RNA) 0.20 μ 1を用いて上記と同様の操作を行ったものを対照試料とし た。
尚、ここで、 pEGFP 0.36 中には 617 ngの pEGFPが、 pDsRed 0.60 1中には 985 ngの pDsRedが、 200nM siRNA 0.20 μ 1中には 62.6 pgの siRNAがそれぞれ含有して いる。
[0154] [表 4]
Figure imgf000063_0001
[0155] (4)トランスフエクシヨン
実施例 5と同様に行った。
[0156] (5)結果
培養後、細胞の透過像、 EGFP及び DsRedの蛍光像の観察を行った。
Meta Morph解析ソフト（Meta Imaging Software社製）を用いて、 EGFP及び DsRedそ れぞれの蛍光エリアのトータル面積を求め、 EGFPZDsRed比を求めた。
その結果を図 3に示す。
尚、図 3は、当該解析ソフトを用いて一定面積あたりの EGFP発現細胞の面積と DsR ed発現細胞の面積をカウントし、 EGFPと DsRedをコトランスフエクシヨンした際の発現 比率を 100 %とし、各試料における EGFPの発現量を相対値で示したものである。
[0157] 図 3の結果から明らかなように、 siRNAにより EGFPの発現は 9.0 %まで抑制されること が判った。また、 siRNAと本発明の化合物 3との反応時間が短いと反応が進まず、 siR NAを充分に架橋できないこと、更に、反応時間 8時間と 24時間の間では有意差が認 められないことから、 siRNAと本発明の化合物 3との反応時間は 8時間前後でプラトー に達することが判った。
[0158] 実施例 7 本発明の化合物の有効性の確認
(1)光分解性保護基
(a) :本発明の化合物 3
(b)： 3,3-ジメチルダルタル酸ビス (6-ブロモ -4-メチル -2-ォキソ -2H-クロメン) -7-ィル 2-[4-(6-ブロモ -4-メチル - 2-ォキソ -2H-クロメン -7-ィルォキシカルボ-ル) -3,3-ジメ チノレブチリノレオキシ]ェチノレエステノレ（3,3- Dimethylpentanedioic acid (6- bromo- 4- m ethyト 2-oxo- 2H- chromen)- 7- yl 2- [4- (6- bromo- 4- methyト 2- oxo- 2H- chromen- 7- yi oxycarbonyl)-3,3-dimethylbutyryloxy]ethyl ester) (以下、 bis— Bhc— CHと略記す 。 )
Figure imgf000064_0001
[0159] 6-ブロモ -7-ヒドロキシ -4-メチルクマリンを用いた以外は実施例 3の方法に従って 合成した。
尚、 6-ブロモ -7-ヒドロキシ- 4-メチルクマリンは、 T. Furuta, H. Takeuchi, M. Isozaki , Y. Takahashi, Μ. Sugimoto, Μ. Kanehara, Τ. Watanabe, Κ. Noguchi, Τ. Μ. Dore, Μ. Iwamura, R. Υ. Tsien, Bhc— cNMPs as either water-soluble or membrane— permea nt photo— releasable cyclic nucleotides for both one and two-photon excitation, し he mBioChem, 5, 1119-1128 (2004)に記載の方法に準じて合成した。
JH NMR (CD30D) δ 2.13 (4h, quintet, J=7.3 Hz), 2.41 (6H, s), 2.55 (4H, t, J=7.3 Hz), 2.76 (4H, t, J=7.3 Hz), 4.34 (4H, s), 6.29 (2H, s), 7.15 (2H, s), 7.81 (2H, s); 13 C NMR (DMSO-d6) δ 18.65 (q), 19.75 (t), 32.81 (t), 32.95 (t), 62.24 (t), 111.56 (s ), 112.57 (d), 115.46 (d), 119.45 (d), 150.17 (s), 150.81 (s), 153.02 (s), 159.68 (s), 1 69.92 (s), 172.43 (s); IR (ATR) 2953, 1770, 1727, 1396, 1384, 1360, 1147, 1114 [0160] (c)： 6-ブロモ -7-ヒドロキシ- 4-ジァゾメチルクマリン（以下、 Bhc- diazoと略記する。 )
WO00/31588国際公開パンフレットに記載の方法に準じて合成した。
Figure imgf000065_0001
[0161] (2)試薬
架橋剤溶液として、以下のものを使用した以外は実施例 5と同じものを使用した。 •本発明化合物 3含有架橋剤溶液
実施例 3で得られた本発明の化合物 3を 4 μ Μの濃度となるように DMSO溶液に溶 解したものを使用した。
•bis-Bhc-CH含有架橋剤溶液
3
bis-Bhc-CHを 4 /z Mの濃度となるように DMSO溶液に溶解したものを使用した。
3
. Bhc- diazo含有架橋剤溶液
Bhc-diazoを 8 μ Μの濃度となるように DMSO溶液に溶解したものを使用した。
[0162] (3)トランスフエクシヨン用 Hela細胞の調製
実施例 5と同じ方法で調製した。
(4)トランスフエクシヨン用試料の調製
i) siRNAの架橋
下表 5に示すように、架橋剤溶液 1及び siRNA溶液 0.20 1を混合し、 8時間遮 光条件で静置した。これらのうち、 No.2、 4及び 6については、 Southern N.E. Ultravio let社製 Rayonet Photochemical Reactor 装置を用いて 3分間 UV (350nm)を照射し た。
[0163] [表 5] siRNA 架橋剤溶液
uv照射
( 200π ) (4 μ )
1 0.2 μΙ 本発明の化合物 3 (4 ) ： 0.2 μΙ
2 0.2 μΙ 本発明の化合物 3 (4 ) ： 0.2 μΙ 1
3 0.2 μΙ bis-Bhc-CH3 (4 μ ) ： 0.2 μΙ
4 0.2 μΙ bis-Bhc-CH3 (4 μ ) ： 0.2 μΙ 1
5 0.2 μΙ Bhc-diazo (8 μ ) ： 0.2 μΙ
ό 0.2 μΙ Bhc-diazo (8 μ ) ： 0.2 μΙ 1 [0164] ii)試料の調製
下表 6に示すように、 Opti- MEM培地 90 μ 1、 pRGFPベクター溶液 0.36 μ 1、 pDsRed ベクター溶液 0.60 1及び上記 i)で調製した反応液 0.40 1を混合し、 15分間静置し 、これをトランスフエクシヨン用試料とした。
また、 i)で調製した反応液の代わりに、 siRNA溶液 (本発明の化合物で架橋されて Vヽな 、二本鎖 RNA) 0.20 μ 1を用いて上記と同様の操作を行ったものを対照試料とし た。
尚、ここで、 pEGFP 0.36 中には 617 ngの pEGFPが、 pDsRed 0.60 1中には 985 ngの pDsRedが、 200nM siRNA 0.20 μ 1中には 62.6 pgの siRNAがそれぞれ含有して いる。
[0165] [表 6]
Figure imgf000066_0001
[0166] (5)トランスフエクシヨン
実施例 5と同様に行った。
[0167] (6)結果
培養後、細胞の透過像、 EGFP及び DsRedの蛍光像の観察を行った。
Meta Morph解析ソフト（Meta Imaging Software社製）を用いて、 EGFP及び DsRedそ れぞれの蛍光エリアのトータル面積を求め、 EGFPZDsRed比を求めた。 その結果を図 4に示す。
尚、図 4は、当該解析ソフトを用いて一定面積あたりの EGFP発現細胞の面積と DsR ed発現細胞の面積をカウントし、 EGFPと DsRedをコトランスフエクシヨンした際の発現 比率を 100 %とし、各試料における EGFPの発現量を相対値で示したものである。
[0168] 図 4から明らかなように、本発明の化合物 3は、 UV照射を行わなければ siRNA作用 を抑制することができ、 UV照射によってその抑制が回復することが判る。これに対し て、 bis-Bhc-CHは、 siRNAと共有結合し得るァゾ基の代わりにメチル基を有している
3
ため、 siRNAに結合することができず、 UV照射の前後にかかわらず、 siRNAの作用を 殆ど抑制し得ないことが判る。また、 Bhc-diazoは、 siRNAと共有結合し得るァゾ基を 有しているものの、リンカ一部分を有していないので、 siRNAの二本鎖を架橋すること ができず、 siRNAの作用を殆ど抑制し得な ヽことが判る。
以上のことから、 siRNAの作用を抑制するためには、光分解性保護基は二本鎖 RN Aに結合し得る基を有するものであって、且つ、 2つの光分解性保護基が二本鎖 RNA を架橋し得るようにリンカ一部分の両末端に配置された構造を有していることが重要 であることが半 Uる。
[0169] 実施例 8 in cellでの検討
(1)試薬
実施例 6と同じものを使用した。
[0170] (2)トランスフエクシヨン用 Hela細胞の調製
24穴プレートに 5 X 103個/ wellとなるように HeLa細胞（Hela細胞及び 10% FBS含 有 DMEM 500 μ ΐ)をまいた。 24時間後に、古い培地を除去し、 Hela細胞を PBS (—)溶 液で洗浄した後、当該 PBS (―)溶液を除去し、 lwellあたり 10% FBS含有 DMEM 500 μ 1を加えた。これをトランスフエクシヨン用 Hela細胞プレートとした。
[0171] (3)トランスフエクシヨン用試料の調製
i) siRNAの架橋
架橋剤溶液 0.2 1及び siRNA溶液 0.20 1を混合し、 8時間遮光条件で静置した。 ii)試料の調製
下表 7に示すように、 Opti- MEM培地 90 μ 1、 pRGFPベクター溶液 0.36 μ 1、 pDsRed ベクター溶液 0.60 1及び上記 i)で調製した反応液 0.40 1を混合し、 15分間静置し 、これをトランスフエクシヨン用試料とした。
また、 i)で調製した反応液の代わりに、 siRNA溶液 (本発明の化合物で架橋されて Vヽな 、二本鎖 RNA) 0.20 μ 1を用いて上記と同様の操作を行ったものを対照試料とし た。
尚、ここで、 pEGFP 0.36 中には 617 ngの pEGFPが、 pDsRed 0.60 1中には 985 ngの pDsRedが、 200nM siRNA 0.20 μ 1中には 62.6 pgの siRNAがそれぞれ含有して いる。
[0172] [表 7]
Figure imgf000068_0001
[0173] (4)トランスフエクシヨン
Opti- MEM培地 9.2 μ 1にリポフエクトァミン 2000 0.8 μ 1をカ卩えて 10分間静置した。 次いで、これと、上記 ii)で得られたトランスフエクシヨン用試料を混合し、 20分間静 し 7こ。
得られた混合液を、上記（2)で調製したトランスフエクシヨン用 Hela細胞プレート〖こ 加え、 COインキュベーター（NAPCO社製、 Automatic CO Incubators 5400)を用い
2 2
て、 37°Cで 6時間で培養した。
[0174] (5) UV照射
培養後、培地を除去し、 Hela細胞を PBS (—)溶液で洗浄した後、当該 PBS (—)溶液 を除去し、 lwellあたり Opti- MEM培地 500 1を加えた。次いで、 wellの中央にォリン パス (株)社製、倒立型蛍光顕微鏡 1X71 (対物レンズ: UPLAPO X 10)を用いて 1秒間 UV (335-385nm)を照射した。 UV照射後、 Opti-MEM培地を除去し、 lwellあたり 10% FBS含有 DMEM 500 j lを 加え、 COインキュベーター（NAPCO社製、 Automatic CO Incubators 5400)を用い
2 2
て、 37°Cで 42時間で培養した。
[0175] (6)結果
培養後、細胞の透過像、 EGFP及び DsRedの蛍光像の観察を行った。
Meta Morph解析ソフト（Meta Imaging Software社製）を用いて、 EGFP及び DsRedそ れぞれの蛍光エリアのトータル面積を求め、 EGFPZDsRed比を求めた。
その結果を図 5に示す。
尚、図 5は、当該解析ソフトを用いて一定面積あたりの EGFP発現細胞の面積と DsR ed発現細胞の面積をカウントし、 EGFPと DsRedをコトランスフエクシヨンした際の発現 比率を 100 %とし、各試料における EGFPの発現量を相対値で示したものである。 また、本発明の化合物 3を用いた場合の EGFP及び DsRedの蛍光像の観察を行った 結果を図 6に示す。
[0176] 図 5及び 6から明らかなように、 UV未照射部分では本発明の化合物 3による siRNA の架橋が解除されず、 siRNAの RNAi効果が抑制されている力 一方、 UV照射部分で は本発明の化合物 3による siRNAの架橋が解除され、 siRNAの RNAi効果が回復して 、ることが半 IJる。
以上のことから、 UV照射部位を絞って、局所的に照射することにより、任意の場所 で特異的に本発明の化合物による siRNAの架橋を解除することができること、即ち、 任意の場所で特異的に遺伝子の発現を抑制し得ることが判る。
[0177] 実施例 9 本発明の化合物 (架橋剤）と光照射が RNAiに与える影響の確認
本発明の化合物と反応させた siRNAを導入したものは、 EGFPのみトランスフエクショ ンしたものに比べ、発現量が低い。この原因を探るため、本発明の化合物が原因でト ランスフエクシヨン効率を低下させて ヽるためなのか、あるいは siRNAをトランスフエク シヨンすることですでにトランスフエクシヨンの効率が低下するのかを確認した。
[0178] ( 1)試薬
架橋剤溶液として、実施例 3で得られた本発明の化合物 3を 4 Mの濃度となるよう に DMSO溶液に溶解したものを使用し、 siRNAの他にコントロール siRNAとして下記の 配列から鳴る二本鎖 RNA (ルシフェラーゼを標的としたもの）を 200nMの濃度となるよ うに水に溶解したコントロール siRNA溶液を使用した以外は、実施例 5と同じものを使 用した。
5'- UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'
3 '-dTdTAAGAGGCUUGCACAGUGCA -5'
[0179] (2)トランスフエクシヨン用 Hela細胞の調製
実施例 5と同じ方法で調製した。
[0180] (3)トランスフエクシヨン用試料の調製
i) siRNAの架橋
下表 8に示すように、架橋剤溶液 0.2 1及び siRNA溶液 0.20 1又はコントロール si RNA溶液 0.20 1を混合し、 8時間遮光条件で静置した。
[0181] [表 8]
Figure imgf000070_0001
[0182] ii)試料の調製
下表 9に示すように、 Opti- MEM培地 90 μ 1、 pRGFPベクター溶液 0.36 μ 1、 pDsRed ベクター溶液 0.60 1及び上記 i)で調製した反応液 0.40 1を混合し、 15分間静置し 、これをトランスフエクシヨン用試料とした。
また、 i)で調製した反応液の代わりに、 siRNA溶液 (本発明の化合物で架橋されて Vヽな 、二本鎖 RNA) 0.20 μ 1又はコントロール siRNA溶液（本発明の化合物で架橋さ れて 、な 、二本鎖 RNA) 0.20 μ 1を用いて上記と同様の操作を行ったものを対照試 料とした。
尚、ここで、 pEGFP 0.36 中には 617 ngの pEGFPが、 pDsRed 0.60 1中には 985 ngの pDsRedが、 200nM siRNA 0.20 μ 1中には 62.6 pgの siRNAがそれぞれ含有して いる。
[0183] [表 9] トランスフエクシヨン用試料 （ 0.40 μΙ )
Op†i- EM pDsRed
( 90 μΙ ) ( 0.60 μΙ ] si NA コントロール siRNA 架橋剤 α + + +
+
b + + + 200μΜ siRNA溶液 - - ( 0.20 μΙ )のみ添加
+
200μ コント口一ル c + 十 + - - siRNA溶液
( 0.20 μΙ )のみ添加 d + 十 + + + e + 十 + + + f + + + + g + 十 + - +
[0184] (4)トランスフエクシヨン
Opti- MEM培地 9.2 μ 1にリポフエクトァミン 2000 0.8 μ 1をカ卩えて 10分間静置した。 次いで、これと、上記 ii)で得られたトランスフエクシヨン用試料又は対照試料とを混 合し、 20分間静置した。
得られた混合液を、上記（2)で調製したトランスフエクシヨン用 Hela細胞プレート〖こ 加え、 COインキュベーター（NAPCO社製、 Automatic CO Incubators 5400)を用い
2 2
て、 37°Cで 6時間で培養した。
[0185] (5) UV照射
培養後、培地を除去し、 Hela細胞を PBS (—)溶液で洗浄した後、当該 PBS (—)溶液 を除去し、 lwellあたり Opt卜 MEM培地 500 1を加えた。次いで、トランスフエクシヨン 用試料 dが導入された Hela細胞及びトランスフエクシヨン用試料 S導入された Hela細 胞をそれぞれ培養した wellにォリンパス (株)社製、倒立型蛍光顕微鏡 1X71 (対物レン ズ： UPLAPO X 10)を用いて 1秒間 UV (335- 385nm)を照射した。
UV照射後、 Opti-MEM培地を除去し、 lwellあたり 10% FBS含有 DMEM 500 j lを 加え、 COインキュベーター（NAPCO社製、 Automatic CO Incubators 5400)を用い
2 2
て、 37°Cで 42時間で培養した。 [0186] (6)結果
培養後、細胞の透過像、 EGFP及び DsRedの蛍光像の観察を行った。
Meta Morph解析ソフト（Meta Imaging Software社製）を用いて、 EGFP及び DsRedそ れぞれの蛍光エリアのトータル面積を求め、 EGFPZDsRed比を求めた。
その結果を図 7に示す。
尚、図 7は、当該解析ソフトを用いて一定面積あたりの EGFP発現細胞の面積と DsR ed発現細胞の面積をカウントし、 EGFPと DsRedをコトランスフエクシヨンした際の発現 比率を 100 %とし、各試料における EGFPの発現量を相対値で示したものである。
[0187] 図 7から明らかなように、コントロール siRNAのみをトランスフエタトした場合の発現率 と、コントロール siRNAを本発明の化合物 3で架橋した場合の発現率は同程度である ことが判る。このことから、発現量の低下は、本発明の化合物や siRNAのトランスフエク ト自体によるトランスフエクシヨン効率の低下に起因するものではないこと、即ち、 SiRN Aが特異的に効果を示すこと、トランスフエクシヨンの効率は siRNA、さらに本発明の化 合物によって低下しないことが確認できた。
[0188] 実施例 10 本発明の化合物 3による内因性遺伝子の光制御の検討
(1)試薬
•HeLa細胞（American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD))
• DMEM培地（日水製薬 (株)製、ダルベッコ改変イーグル培地-ッスィ 2)
• Opti- MEM培地（GIBCO社製）
•トリプシン溶液（2.5mgトリプシン含有 0.38mg/ml EDTA水溶液： GIBCO社製） •リポフエクトァミン 2000 (Invitrogen社製）
•siRNA溶液：
下記の配列からなる二本鎖 RNA(Lamin B1遺伝子を標的としたもの）を 20nMの濃度 となるように水に溶解したものを使用した。
5'— CGCGCUUGGUAGAGGUGGAdTdT-3'
3'-dTdTGCGCGAACCAUCUCCACCU - 5'
'架橋剤溶液：
実施例 3で得られた本発明の化合物 3を 40 μ Μの濃度となるように DMSO溶液に溶 解したものを架橋剤溶液とした。
[0189] (2)トランスフエクシヨン用 Hela細胞の調製
24穴プレートに 1 X 103個/ wellとなるように HeLa細胞（Hela細胞及び 10% FBS含 有 DMEM 500 μ ΐ)をまいた。 24時間後に、古い培地を除去し、 Hela細胞を PBS (—)溶 液で洗浄した後、当該 PBS (―)溶液を除去し、 lwellあたり 10% FBS含有 DMEM 500 μ 1を加えた。これをトランスフエクシヨン用 Hela細胞プレートとした。
[0190] (3)トランスフエクシヨン用試料の調製
i) siRNAの架橋
架橋剤溶液 1及び siRNA溶液 0.46 1を混合し、 8時間遮光条件で静置した。 ii)試料の調製
下表 10に示すように、 Opti-MEM培地 90 1及び上記 i)で調製した反応液 5.06 1 を混合し、 15分間静置し、これをトランスフエクシヨン用試料とした。
また、 i)で調製した反応液の代わりに、 siRNA溶液 (本発明の化合物で架橋されて Vヽな 、二本鎖 RNA) 0.46 μ 1を用いて上記と同様の操作を行ったものを対照試料とし た。
尚、ここで、 20nM siRNA 0.46 μ 1中には 62.6 pgの siRNAが含有している。
[0191] [表 10]
Figure imgf000073_0001
[0192] (4)トランスフエクシヨン
実施例 8と同様に行った。
[0193] (5) UV照射
実施例 8と同様に行った。 [0194] (6)結果
培養後、ウェスタンブロット法により、各試料における Lamnin Blタンパク質量を定量 した。
各試料における Lamin Blタンパク質をウェスタンブロットした結果、及びコントロー ルとして各試料における β -actinタンパク質をウェスタンブロットした結果を併せて図 8に示す。尚、図中のレーン No.lは試料 No.lを用いた場合の結果を、レーン No.2は 試料 No.2を用いた場合の結果を、レーン No.3は試料 No.3を用いた場合の結果を、レ ーン No.4は siRNA及び本発明の化合物 3が導入されておらず且つ UVが照射されて Vヽな 、Hela細胞を用いた場合の結果をそれぞれ示す。
また、ウェスタンブロットの結果から、各試料における Lamnin Blタンパク質量を定量 した。
その結果を図 9に示す。尚、図 9は、 siRNAのみをトランスフエクシヨンしたものの Lam nin Blタンパク質量を 100 %とし、各試料における Lamnin Blタンパク質量を相対値で 示したものである。
[0195] 図 8および図 9の結果から明らかなように、 siRNAの対照ではない遺伝子である 13 -a ctinは siRNAの有無、本発明の化合物 3の有無及び UV照射の有無にかかわらず何 れの場合もその遺伝子が発現されているのが判る。一方、 siRNAの対照である Lamin Blは、その発現が siRNAによって 12%まで抑制されること（レーン No.3)、本発明の化 合物 3が siRNAと結合することによって siRNAの RNAi効果を抑制し得ること（レーン No. 2)、更に UVの照射によって本発明の化合物 3による RNA御制が回復し得ること（レー ン No.1)が判る。
以上のことから、本発明の化合物 (架橋剤）を用いることによって、外部から導入し て過剰発現した遺伝子だけでなぐ内因性遺伝子の発現も光照射の有無により制御 し得ることが半 Uる。
産業上の利用可能性
[0196] 本発明は、二本鎖核酸間、核酸 タンパク質又はポリペプチド間、或いはタンパク 質又はポリペプチド間、特に二本鎖 RNA間を架橋する架橋剤、これらの架橋方法、 及び遺伝子発現調節方法並びに遺伝子機能調査方法を提供するものである。 本発明によれば、二本鎖核酸間、核酸 タンパク質又はポリペプチド間、或いはタ ンパク質又はポリペプチド間、特に二本鎖 RNA間の架橋及び架橋の解除を直^^行 うことができ、 目的遺伝子の発現を任意の時期と場所で制御し得る。また、従来のケ ージド化合物では抑制することが困難であった二本鎖 RNA (siRNA)の RNAi効果を抑 制することができ、 目的遺伝子の発現を任意の時期と場所で簡便に制御し得る。

Claims

請求の範囲
[1] 下記一般式（1)で示される化合物。
Q1— A1— T1— A2— Q2 ( 1 )
〔式中、 Q1及び Q2はそれぞれ独立して光分解性保護基を示し、 A1及び A2はそれぞ れ独立してアルキレン基、 一 0—、— NR1—、— 0— CO—、— CO— 0—、 -C-0 - C一、 一NR2—C00—、 一0C0—NR2—、 一NR3—C0—、 一CO—NR3— U¾ 0— COO- (尺1〜!?3はそれぞれ独立して H又はアルキル基を示す。）を、 T1はアルキレン 基、ァリーレン基、ァラルキレン基、ヘテロ原子を含むアルキレン基、ヘテロ原子を含 むァリーレン基又はへテロ原子を含むァラルキレン基をそれぞれ示す。〕
[2] 下記一般式（1)で示される化合物が下記一般式 (2)で示される化合物である請求項
1に記載の化合物。 ( 2 )
Figure imgf000076_0001
〔式中、 Q1及び Q2はそれぞれ独立して光分解性保護基を示し、 A3及び A4はそれぞ れ独立してアルキレン基、 一 0—、— NR1—、— 0— CO—、— CO— 0—、 -C-0 - C一、 一NR2—C00—、 一0C0—NR2—、 一NR3—C0—、 一CO—NR3— U¾ 0— COO- (Ri〜R3はそれぞれ独立して H又はアルキル基を示す。）を、 T2及び T3はそれ ぞれ独立してアルキレン基を、 Eは結合手、窒素原子、硫黄原子、酸素原子、 0— CO 又は— CO— 0—を示す。また、 pは 1以上の整数を示し、 p個の (T2— E)— は同じでも異なっていてもよい。〕
[3] 光分解性保護基が下記一般式 (3)で示されるものである請求項 1又は 2に記載の化 合物
Figure imgf000076_0002
〔式中、 Υ1
Figure imgf000077_0001
X1、 X2、 Α及び Μ1の中の 1つは、一般式（1)における Α1又は Α2と結 合する結合手、或いは一般式（2)における Α3又は Α4と結合する結合手を表し、残り は下記を表す。
Qはー0—、—ΝΗ—、 -NCH を、 Αは水酸基、置換アルコキシ基、非置換アルコ
3
キシ基、 OC(0)RU、 -NH、 -NHCH、— NRUR12を、 X1及び X2はそれぞれ独立し
2 3
て— Η、水酸基、置換アルコキシ基、非置換アルコキシ基、—OC(0)RU基、—NH基
3
、一NRUR12基、一RU、一 F、一Cl、一Brゝ 1、一C〇〇H、一NO、一C(=〇)NHRU、一
2
CNゝ一 CH〇、一 C(=〇)RU、 -SO Hを、 Y1は一 H、一 Cl、一Brゝ一1、一 C(〇)〇H、一 N
3
〇、一 C(0)NHRU、一 CN、一 C(0)H、一 C(0)CH、ベンゾキサゾール -2-ィル基、
2 3
ベンゾチアゾール -2-ィル、一ベンズイミダゾール- 2-ィルを、 Y2は一 H、一 C(0)〇H、 - SO Hを、 M1は一 H、— CH、一 NR12R13基、 C(〇)NR12R13基、 C〇〇Hを、 Zは脱
3 3
離基をそれぞれ示す。また、 M2は—H或いは Zと共に =N、 =0又は = NNHRUであ
2
ることを示す。ここで、 RU、 R12及び R13はそれぞれ独立して炭素数 1-20のアルキル基 、炭素数 2-20のアルケニル基、炭素数 2-20のアルキニル基、炭素数 1-20のアルコキ シ基、炭素数 1-20のチォアルコキシ基、炭素数 1-20のアルキルスルホ-ル基、炭素 数 4-16のァリールスルホ-ル基、炭素及びへテロ原子の総数 2-20のへテロアルキル 基、炭素及びへテロ原子の総数 2-20のへテロアルケ-ル基、炭素数 3-8のシクロア ルキル基、炭素数 3-8のシクロアルケ-ル基、炭素数 4-16のァリール基、炭素及びへ テロ原子の総数 4-16のへテロァリール基、炭素及びへテロ原子の総数 2-30のへテロ シクリル基カゝら選ばれる置換官能基又は非置換官能基を示し、 X1及び A、 X2及び A 又は X1及び Y2は一緒になつて— 0— (CH ) — 0—基、 - C - (CH ) — 0—基、— 0—
2 n 2 n
(CH ) —C一基、 - O - (CH ) —N 基、 -N - (CH ) 0—基、 N— (CH ) — N—
2 n 2 n 2 n 2 n 基、 C— (CH ) — N 基及び— N— (CH ) —C 基力ら選ばれる基を形成してもよ
2 n 2 n
い。ここで、 nは 1又は 2である。〕
Zで示される脱離基がハロゲン原子、アルコキシ基、ァリールォキシ基、置換ァリール ォキシ基、 NR15R16、— 0C(0)R14、— OP(0)R15R16、一 0P(0)(0H)R15、— 0C(0)NR15 Ri6、—NR15C(0)OR16、—SR14、—NR15C(0)R16、—0 SR14又は—0- NN(0)(NR15R16)で
3
ある請求項 3に記載の化合物。ここで、 R"、 R15及び R16はそれぞれ独立して炭素数 1 -20のアルキル基、炭素数 2-20のァルケ-ル基、炭素数 2-20のアルキ-ル基、炭素 数 1-20のアルコキシ基、炭素数 1-20のチォアルコキシ基、炭素数 1-20のアルキルス ルホニル基、炭素数 4-16のァリールスルホ-ル基、炭素及びへテロ原子の総数 2-20 のへテロアルキル基、炭素及びへテロ原子の総数 2-20のへテロアルケニル基、炭素 数 3-8のシクロアルキル基、炭素数 3-8のシクロアルケ-ル基、炭素数 4-16のァリール 基、炭素及びへテロ原子の総数 4-16のへテロァリール基、炭素及びへテロ原子の総 数 2-30のへテロシクリル基力 選ばれる置換官能基又は非置換官能基であり、 R15及 び R16は一緒になつて炭素数 1-20のアルキレン基を形成してもよ 、。〕
一般式（3)で示される化合物が下記一般式 (4)又は（5)である請求項 3又は 4に記 載の化合物
Figure imgf000078_0001
〔式中、 Ζ11はハロゲン原子、イミダゾリル基又は 4-ニトロフエ-ル基であり、 Q、 Α、
Figure imgf000078_0002
Figure imgf000078_0003
Χ1及び Χ2は前記と同じである。〕
下記一般式（1)で示される化合物が下記一般式 (6)で示される化合物である請求項 1に記載の化合物
Figure imgf000079_0001
Figure imgf000079_0002
〔式中、 Q、 γ1,
Figure imgf000079_0003
Ε及び ρは前記と同じであ る。〕
二本鎖核酸間、核酸—タンパク質又はポリペプチド間、或いはタンパク質又はポリべ プチド間を、請求項 1〜7の何れかに記載の化合物で架橋する方法。
請求項 1〜7の何れかに記載の化合物を予め結合させた二本鎖 RNAに対して、光を 照射することを特徴とする遺伝子発現調節方法。
以下の工程を含む遺伝子発現調節方法。
(a)請求項 1〜7の何れかに記載の化合物と二本鎖 RNAとを接触させて、二本鎖 RNA を架橋する工程、
(b)架橋された二本鎖 RNAを細胞又は生物に導入する工程、及び
(c)導入された細胞又は生物に光を照射する工程。
前記 (c)の工程の次に、（c')光照射された細胞又は生物中の遺伝子を発現させる工程 、を含む請求項 10に記載の遺伝子発現調節方法。
光力 導入された細胞又は生物の所定の領域に照射される、請求項 11に記載の方 法。
以下の工程を含む遺伝子の機能の調査方法。
(a)請求項 1〜7の何れかに記載の化合物と二本鎖 RNAとを接触させて、二本鎖 RNA を架橋する工程、
(b)架橋された二本鎖 RNAを細胞又は生物に導入する工程、
(c)導入された細胞又は生物に光を照射する工程、
(c')光照射された細胞又は生物中の遺伝子を発現させる工程、及び
(d)工程 ( で発現した遺伝子と対照とを比較する工程。
光力 導入された細胞又は生物の所定の領域に照射される、請求項 13に記載の方 法。
請求項 1〜7の何れかの化合物力もなる、核酸間、核酸—タンパク質又はポリべプチ ド間、或いはタンパク質又はポリペプチド間の架橋剤。
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