KR20180056750A - 리보핵산의 생물학적 활성을 보존하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 단백질(또는 아민) 가교제의 기능을 가진 화합물을 용해물에 첨가하는 단계를 포함하여, 표적 유기체에서 유전자 발현을 전사후 침묵시키기 위해, 세포 용해질에 존재하는 dsRNA의 생물학적 활성을 실질적으로 유지시키거나 그렇지 않으면 보존하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 dsRNA를 포함하는 용해물, 및 단백질 가교제를 포함하는 조성물뿐만 아니라 상기 방법에서의 상기 작용제의 용도를 포함한다.

Description

리보핵산의 생물학적 활성을 보존하는 방법

본 발명은 이중 가닥 RNA에 의한 유전자 발현의 제어에 관한 것이다.　 상세하게는, 본 발명은 표적 유기체에서 유전자 발현을 침묵시키기 위해 외인성으로(즉, 표적 유기체 외부 및 상대적으로 가혹한 환경 조건하에서) 투입된 이중 가닥 RNA의 능력을 향상시키는 방법에 관한 것이다.　 본 발명은 또한 상기 방법에 사용하기 위한 조성물, 및 공지된 특정 가교제의 상기 방법에서의 용도에 관한 것이다.

잠재적으로 유전자 발현을 침묵시키는 RNA 간섭 현상은 널리 공지되어 있다.

RNA는 비교적 불안정하고 예를 들어 세포 외부에 편재하는 리보뉴클레아제에 의해 빠르게 분해될 수 있다.　 표적 유기체에 직접 또는 그들이 존재하는 장소에 외인성 투입을 통한 dsRNA의 살포시의 문제는 RNA의 빈약한 안정성을 우려하게 만든다.　 외인성 살포는, 유기체가 그것을 혼입할 수 있거나, dsRNA가 표적 유기체와는 다른 제1 유기체에서 생산되고 표적 유기체가 제1 유기체, 또는 dsRNA를 포함하는 그의 일부를 혼입하여 상기 dsRNA가 dsRNA에 의해 포함된 것에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 전사후 침묵에 영향을 끼칠 수 있도록 하는 방식으로 표적 유기체에 살포되는 것을 의미한다. 외인성 살포는 내인성 생산과 구별된다(내인성 생산은 표적화된 유전자를 전사후적으로 침묵시킬 수 있는 이중 가닥 RNA의 표적 유기체의 세포에서의 (일반적으로 적합한 이종성 서열로부터의 발현을 통해) 생산을 의미함).

외인성으로 살포된 dsRNA는 일반적으로 단기간 내에(아마 살포후 최대 수일동안) 관련있는 생물학적 효과를 발휘할 수 있는 반면에, 상기 효과는 투입되는 세부 환경 조건에 의존하는 것에 더하여, 예를 들어 토양에서 전형적으로 단지 약 12 내지 24시간의 반감기를 갖는 dsRNA로 인해 일반적으로 급속히 감소한다.　 캡슐화에 의한 dsRNA의 안정화 또는 그렇지 않으면 그를 그의 안정성을 향상시키는 중합체에 결합시킴으로써 증가된 작용 지속시간을 부여하는 것을 포함하여, 이 문제에 대한 다양한 해결방안이 제안되어 왔다.　 효과의 지속에 대한 2가지 양태가 있다. 유전자 침묵 자체는 관련한 단백질의 회전율에 의존하여 소멸할 것이다. 주변 조건에서 토양과 함께 인큐베이션 시에, dsRNA는 약 2일의 기간 내에 분해된다. dsRNA가 이보다 실질적으로 더 오래 효과를 갖도록 하는 것은 가능하지만, 본 발명의 장점은 dsRNA의 상기 환경에서의 지속성을 증가시키는 것이다.

따라서 본 발명은, 전형적으로, 일반적으로 dsRNA의 급속한 분해 또는 불활성화를 조장하는 현장 조건하에서 유기체에 외인성으로 살포되는 dsRNA의 상대적인 급속한 불활성화의 문제에 대한 해결방안에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 단백질(또는 아민) 가교제의 기능을 가진 화합물을 용해물에 첨가하는 단계를 포함하여, 표적 유기체에서 유전자 발현을 전사후 침묵시키기 위해, 세포 용해질에 존재하는 dsRNA의 생물학적 활성을 실질적으로 유지시키거나 그렇지 않으면 보존하는 방법이 제공된다.

"용해물"은 간단히 세포 용해의 산물을 의미한다. 그러나, 바람직하게는, 용해는 반드시 100%일 필요는 없으며, 즉 용해물은 세포 전체의 용해 산물을 포함하지 않을 수도 있다. 다른 한편으로, 어느 것도 용해되지 않는다는 것은 단지 상대적으로 적은 세포(예를 들어 10% 미만을 말함)의 용해 산물을 포함함을 의미한다. 그러므로, 당업자는 용해물이 실질적으로 온전한 세포의 상대적으로 낮은 백분율을 포함하는 경우 조차도 여전히 용해물로 인식할 것이다.

세포 용해물은, 박테리아 세포가 예를 들어 저온멸균(pasteurization) 또는 열이나 화학적 불활성화를 포함하는 어떤 다른 공정에 의해 불활성화될 때 전형적으로 일어나는 것처럼, 세포 불활성화 공정의 일부로서도 생산될 수 있음에도 불구하고, 세포를 기계적으로 분해하거나 전단함으로써 전형적으로 생산될 수 있다.

용해물이 형성될 때(즉, 용해물 형성 공정의 일부로서) 세포에 또는 용해물이 형성된 이후 용해물에 작용제가 첨가될 수도 있다. 대안적으로, 작용제는 용해물이 투입되는 장소에 첨가될 수도 있다. 장소는, 선택적으로 작용제를 포함하는 용해물이 투입되는 위치를 의미하며, 식물이 자라고 있거나 재배된 식물의 종자가 파종된 현장 또는 이러한 종자 또는 식물이 배치될 토양, 또는 심지어 현장, 토양, 종자 및/또는 식물 그 자체를 포함한다. 용해물의 투입전에 상기 장소에 작용제를 첨가하는 것이 가능하다.

상기 방법의 바람직한 구현예에서, 장소는 토양이고, 조성물은, 예를 들어 옥수수 뿌리벌레와 같은 해충의 필수 유전자에 대한 dsRNA를 표적화함으로써 보호하기에 바람직하도록 식물 부근의 그 곳에 살포된다.

가교제는 폴리알데히드, 디알데히드, 디-에폭시드, 폴리 에폭시드, 피리딜 디설피드, 카르보디이미드, 디- 또는 폴리-이소시아네이트, 다기능성 말레이미드, 디- 또는 폴리-이미도에스테르, 비스-디아조니움, n-히드록시석신이미드 에스테르 및 할로아세탈, 및 심지어 적어도 2개의 기능기(이는 동일하거나 상이할 수 있음)를 포함하는 임의의 기타 공지된 가교제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 가교제는, 그들이 적합한 용매 중의 용액, 또는 물과 그러한 용매의 혼합물로 편리하게 활용될 수 있는 경우에, 빈약하게 수용성이다. 보다 바람직하게는, 작용제는 폴리알데히드 및 디알데히드로 구성된 군, 및 더욱 더 바람직하게는 디알데히드로부터 선택된다. 특히 가장 바람직한 디알데히드는, 아래에 예시된 본 발명의 방법에서의 용도에 특이적인 글루타르알데히드이다. 글루타르알데히드는, 그의 반응성은 반응이 적당히 빠르지만 다루기 곤란할 만큼 빠르지는 않기 때문에 바람직하다. 이것은 비교적 비독성이고 적당히 수용성이어서 용이하게 사용 가능하고 저렴하다.

상기 방법의 특정 구현예에서, 조류 및 심지어 식물 또는 다른 진핵 세포를 포함하여, 다른 세포가 용해물의 원천이 될 수 있음에도 불구하고, 용해물이 형성된 세포는 박테리아 세포이다.

상기한 바와 같이, 세포가 박테리아 세포인 경우, 용해물은 그들을 불활성화시키는 공정의 (적어도 일정 크기로) 결과로서 생성될 수 있다. (온도 및 지속시간의 매우 광범한 여러 조건하에서) 열에 의한 불활성화, 과산화아세트산, 아스코르브산 구리, 하이포염소산 나트륨, 과산화수소, 구아니디늄 티오시안산염, 포름알데히드 및 기타 모노-알데히드 등에 의한 화학적 불활성화 및 그들을 전리 방사선으로 처리하는 것을 포함하여, 다양한 불활성화 방법들이 당분야에 공지되어 있다. 어떤 공정이 사용되든 간에, 상기한 바와 같은 용해물은 실질적으로 온전한 박테리아 일부를 함유할 수 있으며, 생물학적으로 생활성인 어떠한 박테리아도 함유하지 않는다. 따라서, 용해물은 박테리아 세포의 불활성화 공정의 일부로서 제조될 수 있거나, 세포는 실질적으로 불활성화되었지만 또한 실질적으로 온전할 수도 있으며 용해물은 그로부터 후속적으로 생산된다.

용해물이 생산된 세포는, 그들이 원핵이든 진핵이든 간에, 진핵 세포, 상세하게는 예를 들어 곤충과 같은 식물 해충의 세포에서의 유전자의 mRNA의 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 이중 가닥 RNA, 적어도 그의 일부를 전사시에 생성하는 DNA 서열을 포함하도록 조작된다. 그러한 해충의 전형적인 예에는 디아브로티카 비르기페라 비르기페라(Diabrotica virgifera virgifera)(웨스턴 옥수수 뿌리벌레(Western corn rootworm)), 디아브로티카 바르베리(Diabrotica barberi(노던 옥수수 뿌리벌레(Northern corn rootworm)), 디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디(Diabrotica undecimpunctata howardi)서던 옥수수 뿌리벌레(Southern corn rootworm)), 디아브로티카 비르기페라 제아에(Diabrotica virgifera zeae)멕시코 옥수수 뿌리벌레(Mexican corn rootworm)) 및 디아브로티카 스페티오사(Diabrotica speciosa)(조롱박 벌레(cucurbit beetle))가 포함된다. 상기 dsRNA가 효과적일 수 있는 해충에는 또한 선충류(nematodes), 방아벌레(wireworm) 및 유충(grub) 및 적합한 토양 병원균, 예를 들어 박테리아 및 진균과 같은, 농학자에게 널리 공지된 다양한 해충들이 포함된다.

세포 용해물에 존재하거나 그에 첨가되는 가교제의 농도는 상대적으로 중요하다. 만약 용해물에 너무 많거나 너무 적은 가교제가 존재하거나 첨가되거나 그렇지 않으면 용해물이 첨가되는 장소에 존재하면, 전사후 유전자 침묵 효과를 나타낼 수 있는 dsRNA가 효과적이지 않게 된다. 작용제가 글루타르알데히드이고 발효 브로쓰가, 예를 들어 약 40 g/L 바이오매스(원심분리 펠렛으로서 수집됨)를 함유하는 경우, 작용제는 6 내지 0.1%, 더욱 바람직하게는 2.5 내지 0.15%, 및 더욱 더 바람직하게는 0.7 내지 0.2%의 양으로 용해물/장소에 존재하며, 여기서 %는 용해물의 최종 부피를 기준으로 한 것이다. 글루타르알데히드의 이러한 양들은 다양한 영양 배지 및 성장 조건에 따라 달라지는 발효 브로쓰의 농도에 비례하여 조정될 것이다.

본 방법의 특히 바람직한 구현예에서, 용해물은 박테리아 세포의 용해물이고, 작용제는 용해물의 최종 부피를 기준으로 0.7 내지 0.2%의 양으로 용해물에 존재하는 글루타르알데히드이다. 작용 기작에 대한 어떤 특정한 해석에 제한됨이 없이, 과도한 가교제는 dsRNA의 생활성을 감소시키는 반면 너무 적은 가교제는 요망되는 안정성 향상을 부여하지 못하는 것으로 이해된다.

토양에 투입되나 가교제가 사용되지 않은 용해물에 존재하는 dsRNA와 비교할 때, 본 발명의 방법의 사용은 용해물 내에 존재하는 dsRNA와 관련된 생물학적 활성의 지속기간을 매우 현저하게 연장한다(전형적으로 14일까지 및 14일을 초과하는 기간동안, 및 심지어 최대 12주동안 약 섭씨 12도 초과의 온도에서 토양 환경에서 활성을 유지함).

본 발명은 또한 세포 용해물 및 단백질 가교제를 포함하는 물질의 조성물을 포함하며, 상기 조성물은 토양을 포함하고 상기 용해물은 dsRNA를 포함하며 상기 작용제는 글루타르알데히드인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 세포에서 이종성으로 발현된 dsRNA의 생물학적 활성을 유지하려는 목적으로 첨가된 단백질 가교제를 포함하는 세포 용해물뿐만 아니라 세포 용해물 내에 존재하는 dsRNA의 생물학적 활성을 실질적으로 안정화시키거나 그렇지 않으면 보존하기 위한 단백질 가교제의 용도를 포함한다.

본 발명은 하기의 비제한적인 실시예로부터 더욱 명백해 질 것이며 상기 실시예에서 도 1은 토양에 노출된 후에 박테리아에 의해 생산된 dsRNA의 정량적 평가를 보여준다. 도 2는 표적 Dvs006.5(이는 트리포닌 I이며 이는 옥수수 뿌리벌레의 잠재적 필수 유전자로 공지되어 있음)에 대해 열 불활성화(백색 막대) 또는 열 불활성화 + 글루타르알데히드 박테리아 물질(흑색 막대)을 사용하여 처리된 토양의 감염(infestation) 후 7일에 유충의 치사율을 보여준다.

실시예

시험 샘플의 생성 - 발효

T7이 작동되는 dsRNA 발현 카세트를 함유하는 플라스미드를 HT115(DE3) 이. 콜라이 세포 내로 형질전환시켰다.

dsRNA의 생산을 위해, 단일 콜로니로부터 배양물을 접종하고 적합한 항생제를 함유하는 LB 배지에서 밤새 성장시켰다.

그런 다음, 밤새 성장시킨 배양물을, 적합한 항생제를 함유하는 LB를 사용하여 OD₆₀₀=1까지 희석시켰다. dsRNA의 전사를 유도하기 위해, 최종 농도 1.0 mM이 되도록 IPTG를 첨가하였다. 그런 다음, 배양물을 250 rpm으로 교반하면서 37℃에서 3.5시간동안 인큐베이션시켰다.

유도 후에, 배양물을 원심분리시키고, 적절한 OD₆₀₀, 전형적으로 50 내지 100 유닛/ml(1 유닛은 OD₆₀₀=1에서 1 ml의 세포에 상응함)에서 재현탁시키고 상층액을 폐기하였다. 그런 다음, 펠렛을 추가 실험을 위해 불활성화시켰다.

열 불활성화. 열처리, 전형적으로 저온 살균법에 대해 널리 공지된 바와 같이, 관류(flow-through) 중에 박테리아 브로쓰를 가열하는 것으로 구성된 HTST 처리("고온단시간" 공정)에 의해 박테리아를 사멸시켰다. 처리된 브로쓰의 분취액을 LB 플레이트 상에 스트리킹하고 37℃에서 밤새 인큐베이션시킴으로써 박테리아의 비-생활성을 확인하였다.

증가된 토양 안정성을 위한 제형. 토양 안정성 또는 토양 생활성 검정을 설정하기 직전에, 요구량의 글루타르알데히드를 액체 브로쓰에 피펫팅하고 튜브를 볼텍싱하여 혼합함으로써 샘플에 글루타르알데히드(H2O중에 70%, G7776 Sigma)를 첨가하였다.

토양 내 안정성 검정. 본 검정법은, 토양에 존재할 시 dsRNA의 안정성을 평가하기 위해 개발되었다. 본 정성적 검정법을 위해, 전형적으로 2 ml 에펜도르프 튜브에서 0,5 g 토양을 10 유닛에 상응하는 불활성화된 박테리아 재료와 혼합하였다. dsRNA 안정성에 대한 토양 노출의 효과를 평가하기 위해, dsRNA를 토양으로부터 추출하고 아가로스 겔 상에서 분석하였다. 이를 위해, 우선 총 RNA 추출을 수행한 다음 LiCl 침전법을 사용하여 이중 가닥 RNA를 부화시켰다.

RNA 추출. 1 ml TRIreagent(TR118-200, Brunschwig Chemie)를, 토양 및 박테리아 용액을 함유하는 튜브에 첨가하였다. 혼합 후에, 용액을 5분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하고 용액을 다시 혼합하였다. 3분 동안 실온에서의 인큐베이션 후에, 원심분리에 의해 상(phase)을 분리하였다. 상층의 상을 새 튜브로 옮기고 이후 과정에 사용하였다. 이소프로판올을 사용한 침전 후에, 70% EtOH을 사용하여 펠렛을 세척하였다. DEPC수 중에 용해시키기 전에 건조하기 위해 남아있는 EtOH를 펠렛으로부터 제거하였다.

LiCl 침전. TriReagent 추출로부터 수득된 총 RNA를 2회 연속으로 LiCl 침전시켰다. 2 M의 최종 농도에서 LiCl을 사용하여 제1 침전 단계를 수행하였다. 그런 다음, 4 M의 최종 농도에서 LiCl을 사용하여 상층액을 다시 침전시켰다. 그런 다음, 수득된 펠렛을 70% EtOH를 사용하여 세척하고 후속하여 DEPC수에 용해시켰다.

그런 다음, 수득된 dsRNA를 2% 아가로스 겔 상에서 정성적으로 분석하였다.

토양 내 생활성 검정. 본 검정법은, 토양에 노출 후 박테리아에 의해 생산된 dsRNA의 생활성을 평가하는 데 최적화되어 있다. 300 ㎕ 아가 층 및 상기 아가 상단에 250 mg의 토양을 함유하도록 48-웰 플레이트를 준비하였다. 관심있는 50 ㎕의 샘플을 상기 토양 상에 국소적으로 살포하였다. 토양 내 샘플의 인큐베이션 후에, 플레이트를 웰당 50마리의 유충을 사용하여 감염시켰다. 유충을 26℃의 암소에서 토양 플레이트 상에 24시간 동안 유지시켰다. 그 후에, 유충을 추가의 후속조치를 위해 인공 식이 플레이트로 옮겼다(웰당 1마리 유충). 생존을 감염후 최대 7일까지 매일 평가하였다.

결과

토양 내 안정성 검정. 활성 토양 환경에서 박테리아에 의해 생산된 dsRNA의 안정성에 대한 글루타르알데히드 첨가의 효과를 평가하였다. 옥수수 뿌리벌레의 표적 Dvs006.5에 대한 dsRNA를 함유하는 박테리아 배양물을 생산하였다. 열처리된 Dvs006.5 샘플은 0 및 12시간 후의 시점에서 가시적이었으나, dsRNA는 빠르게 분해되었고 24시간 후에 겔 상에서 보이지 않았다(도 1의 A). 박테리아 용해물의 토양 안정성에 대한 글루타르알데히드의 효과를 평가하기 위해, 불활성화된 박테리아 브로쓰와 다양한 양의 글루타르알데히드를 혼합함으로써 여러 분취액들을 제조하였다. 본 검정에서, 글루타르알데히드는 최종 농도 23%, 7%, 2.3%, 0.7% 및 0.2%에 도달하도록 첨가되었다(도 1의 B). 샘플들을 토양에 살포하고 0, 12, 24, 48, 72, 96, 120 및 144시간 동안 25℃에서 인큐베이션시켰다. 그런 다음, RNA 추출에 이은 LiCl 침전을 사용하여, 기술된 바와 같이 dsRNA를 추출하였다.

dsRNA를 2% 아가로스 겔 상에 로딩하였다(도 1의 A 및 도 1의 B).

고농도의 글루타르알데히드(23% 및 7%)는 0 시점부터 토양으로부터의 dsRNA의 회복을 손상시키는 것으로 나타났으나, 2.3% 또는 0.7% 글루타르알데히드의 존재하에서는, dsRNA는 최대 144시간(6일) 동안 토양과 함께 인큐베이션된 박테리아 용해물로부터 추출될 수 있었다. 더 낮은 농도의 글루타르알데히드(0.2%)는 최대 72시간 동안 증가된 안정성을 제공하였다.

토양 내 생활성 검정. 토양 안정성 검정에서 시험된 것과 동일한 샘플들을 사용하여 검정법을 설정하였다(상기 기술됨). 요약하면, 활성 성분의 다양한 분취액들을, 불활성화된 박테리아 브로쓰(GFP dsRNA 대조군 또는 활성 Dvs006.5 dsRNA를 발현함)를 글루타르알데히드와 혼합함으로써 제조하였다. 토양 안정성 검정의 결과에 기초하여, 이 실험을 위해 0.7% 농도의 글루타르알데히드를 선택하였다. 2.5 μg, 25 ㎍ 또는 50 ㎍과 등가인 dsRNA의 최종 농도에 도달하도록 다양한 양의 샘플들을 48-웰 플레이트 중의 토양에 살포하였다. 유충으로 감염시키기 전에, 플레이트를 0, 3, 7 및 14일 동안 25℃에서 인큐베이션시켰다.

토양 플레이트 상에서 24시간 인큐베이션 후에, 처리당 적어도 30마리의 유충을 인공 식이 플레이트로 ?グ若?(웰당 1마리 유충). 유충의 치사율을 7일 동안 매일 평가하였다. 감염 후 7일에 유충의 치사율에 대한 데이터를 제시하였다(도 2). 유충 감염일(0일)에 활성 성분을 토양 플레이트에 첨가하는 경우, 열 불활성화 및 열 불활성화 + 글루타르알데히드 재료 둘 모두에 의해 현저한 치사가 유도되었다. 열처리된 샘플로부터의 dsRNA가 12시간 후 토양으로부터 추출될 수 없었던 토양 안정성 검정으로부터 예상된 바와 같이(도 2), 3, 7 및 14일 동안 토양에서의 활성 성분의 인큐베이션은 생활성의 명백한 감소를 초래하였다. 대조적으로, 0.7% 글루타르알데히드의 존재하에서, 활성 성분의 생활성은 토양에서 최대 14일의 인큐베이션 동안 변화없이 남아있었다(80 내지 100%).

데이터는, 0.7% 글루타르알데히드가 보충된 박테리아 용해물 중의 dsRNA가 14일 동안 안정하였고; 글루타르알데히드 처리는 토양에서 분해에 대해 활성 성분을 보호함으로써 dsRNA의 지속성을 연장시키는 방법을 제공하였음을 보여준다.

도면 설명

도 1: 토양에 노출된 후 박테리아에 의해 생산된 dsRNA의 정성적 평가 (A) 0, 12, 24, 48 또는 72시간 동안 토양에 노출된 후, 열 불활성화된 박테리아에 의해 생산된 dsRNA. (B) 토양에 노출된 지 0, 12, 24, 48, 72, 96, 120 및 144시간 후에 23%, 7%, 2.3%, 0.7% 및 0.2% 글루타르알데히드가 보충된, 열 불활성화된 박테리아에 의해 생산된 dsRNA. 샘플들을 마커(M; 1 kb 래더)와 비교하였다. 백색 화살표는 온전한 dsRNA에 상응하는 밴드를 나타낸다.

도 2: 표적 Dvs006.5에 대해 열 불활성화된(백색 막대) 또는 열 불활성화된 + 글루타르알데히드 박테리아 물질(검정색 막대)을 사용하여 처리된 토양의 감염 후 7일에 유충의 치사율. 줄무늬 막대는 글루타르알데히드의 존재 또는 부재하에, 음성 대조군 dsRNA를 사용하여 처리된 토양에서 인큐베이션된 유충의 치사율을 나타낸다. 샘플은 유충에 감염되기 0일, 3일, 7일 및 14일 전에 토양에 살포되었다.

Claims (14)

1. 단백질(또는 아민) 가교제의 기능을 가진 화합물을 용해물에 첨가하는 단계를 포함하여, 표적 유기체에서 유전자 발현을 전사후 침묵시키기 위해, 세포 용해물에 존재하는, dsRNA의 생물학적 활성을 실질적으로 유지시키거나 그렇지 않으면 보존하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 작용제는, 용해물이 형성될 때 세포에 첨가되거나 용해물이 형성된 후에 용해물에 첨가되는, 방법.
3. 제1항에 있어서, 작용제는, 용해물이 투입되는 장소에 첨가되는, 방법.
4. 제3항에 있어서, 작용제는, 용해물의 투입 이전에 장소에 첨가되는, 방법.
5. 제3항에 있어서, 장소는 토양인, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 가교제는 폴리알데히드, 디알데히드, 디-엑폭시드, 폴리 에폭시드, 피리딜 디설피드, 다관능 카르보디이미드, 다관능 말레이미드, 다관능 이미도에스테르, 다관능 n-히드록시석신이미드 에스테르 및 다관능 할로아세탈로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제는 글루타르알데히드인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 용해물이 제조되는 세포는, 선택적으로 열 불활성화에 의해 불활성화되기 이전의 박테리아 세포인 방법.
9. 제8항에 있어서, 박테리아 세포는, 진핵 세포에서의 유전자의 mRNA의 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 이중 가닥 RNA, 적어도 그의 일부를, 전사시에, 생성하는 DNA 서열을 포함하도록 조작된, 방법.
10. 제9항에 있어서, 진핵생물은 디아브로티카 비르기페라 비르기페라(Diabrotica virgifera virgifera)(웨스턴 옥수수 뿌리벌레(Western corn rootworm)), 디아브로티카 바르베리(Diabrotica barberi)(노던 옥수수 뿌리벌레(Northern corn rootworm)), 디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디(Diabrotica undecimpunctata howardi)(서던 옥수수 뿌리벌레(Southern corn rootworm)), 디아브로티카 비르기페라 제아제(Diabrotica virgifera zeae)(멕시코 옥수수 뿌리벌레(Mexican corn rootworm)), 디아브로티카 스페시오사(Diabrotica speciosa)(조롱박 벌레(cucurbit beetle)), 선충류(nematodes), 방아벌레(wireworm) 및 유충(grub) 및 적합한 토양 병원균, 예를 들어 박테리아 및 진균으로 구성된 군으로부터 선택된 곤충인, 방법.
11. 제1항에 있어서, 용해물은 박테리아 세포의 용해물이고, 작용제는 글루타르알데히드이고, 글루타르알데히드는 용해물의 부피에 대하여 0.7 내지 0.2%의 양으로 토양에 살포되고, 상기 생물학적 활성은 적어도 14일 동안 실질적으로 유지되는, 방법.
12. 세포 용해물 및 단백질 가교제를 포함하는 물질의 조성물로서, 조성물은 토양을 포함하고, 용해물은 dsRNA를 포함하고, 작용제는 글루타르알데히드인 것을 특징으로 하는, 조성물.
13. 세포에서 이종성으로 발현된 dsRNA의 생물학적 활성을 유지시키려는 목적을 위해 첨가된 단백질 가교제를 포함하는 세포 용해물.
14. 세포 용해물에 존재하는 dsRNA의 생물학적 활성을 실질적으로 안정화시키거나 그렇지 않으면 보존하기 위한 단백질(또는 아민) 가교제의 용도.
    

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